本発明は、（ａ）ポリペプチドの第１のレパートリを準備するステップであって、各々のポリペプチドが、分子足場と共有結合する能力のある２以上の反応性基、および２つの反応性基間に内在する２以上のアミノ酸からなる配列を含む少なくとも一つのループを含む、ステップと、（ｂ）（ａ）に記載されるポリペプチドの第２のレパートリを準備するステップと、（ｃ）第１のレパートリの１以上のメンバーの少なくとも一つのループを、第２のレパートリの１以上のメンバーの少なくとも一つのループと連結して、２つのループを含む少なくとも一つのポリペプチドを形成するステップ、および（ｄ）複合ポリペプチド（１または複数）を、少なくとも３つのアミノ酸位置で分子足場にコンジュゲートするステップを含む、３以上のアミノ酸残基で分子足場と共有結合し、かつ２以上の別個の標的と結合する能力のあるポリペプチドを含む、多重特異性ペプチドリガンドを提供するための方法に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
３以上のアミノ酸残基で分子足場と共有結合し、かつ２以上の別個の標的と結合する能力のあるポリペプチドを含む、多重特異性ペプチドリガンドを提供するための方法であって、
（ａ）ポリペプチドの第１のレパートリを準備するステップであって、各々のポリペプチドが、分子足場と共有結合する能力のある２以上の反応性基、および２つの前記反応性基間に内在する２以上のアミノ酸からなる配列を含む少なくとも一つのループを含む、ステップと、
（ｂ）（ａ）に記載されるポリペプチドの第２のレパートリを準備するステップと、
（ｃ）前記第１のレパートリの１以上のメンバーの少なくとも一つのループを、前記第２のレパートリの１以上のメンバーの少なくとも一つのループと連結して、２つのループを含む少なくとも一つのポリペプチドを形成するステップと、
（ｄ）前記複合ポリペプチド（１または複数）を、少なくとも３つのアミノ酸位置で分子足場にコンジュゲートするステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１および第２のレパートリを、第１および第２の標的との結合についてスクリーニングして、ステップ（ｃ）で用いた前記１以上のメンバーを単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）前記第１または第２のレパートリの前記メンバーを分子足場にコンジュゲートし、前記第１または第２の標的に対する結合についてスクリーニングするステップ、または
（ｉｉ）前記第１または第２のレパートリの前記メンバーを、前記反応性基によって架橋するステップと、
前記第１または第２の標的に対する結合についてスクリーニングするステップと
により、前記第１および第２のレパートリが、結合についてスクリーニングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１および／または第２のレパートリの前記メンバーが、分子足場にコンジュゲートされて単一ループを形成する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のレパートリの前記メンバーが、分子足場にコンジュゲートされて２以上のループを形成し、かつ、その単一ループが、前記第２のレパートリの前記メンバーの少なくとも一つのループに連結されている、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）により、ペプチドリガンドの第３のレパートリの形成がもたらされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および第２のレパートリのうち一つが未処理である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
３以上のアミノ酸残基で分子足場と共有結合し、かつ２以上の別個の標的と結合する能力のあるポリペプチドを含む、多重特異性ペプチドリガンドを提供するための方法であって、
（ａ）ポリペプチドの第１のレパートリを準備するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドを、少なくとも一つのループを形成する２以上のアミノ酸残基で前記ポリペプチドに結合する分子足場にコンジュゲートして、ポリペプチド抱合体の第１のレパートリを形成するステップと、
（ｃ）前記第１のレパートリを第１の標的に対する結合についてスクリーニングし、前記第１の標的に結合する前記第１のレパートリのメンバーを選択するステップと、
（ｄ）ポリペプチドの第２のレパートリを用いてステップ（ａ）〜（ｃ）を反復するステップであって、第２の標的に結合するポリペプチド抱合体の第２のレパートリを得るステップと、
（ｅ）前記第１および前記第２のレパートリのメンバーからループを単離し、それらを合わせて前記ポリペプチドが前記分子足場と少なくとも３つのアミノ酸で結合しているポリペプチド抱合体の第３のレパートリを形成し、前記第１と前記第２の標的の両方と結合する能力のある分子を選択するステップと
を含む、方法。
【請求項９】
１以上のレパートリのポリペプチド抱合体を、プロテアーゼで処理する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
１以上のレパートリの前記ポリペプチド抱合体が、還元剤およびプロテアーゼで処理される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドの１以上の前記レパートリが、核酸分子の１以上のライブラリによりコードされる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記レパートリの前記スクリーニングが、遺伝子ディスプレイ系を用いて行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子ディスプレイ系が、ファージディスプレイである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多重特異性ペプチドリガンドが、二重特異性である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第３のレパートリのメンバーによる前記第１および第２の標的との結合が、同時に起こり得る、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第３のレパートリのメンバーによる前記第１および第２の標的との結合が、同時に起こり得ない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第３のレパートリのメンバーを、前記第１の標的に対してスクリーニングし、次に結合するものを前記第２の標的に対してスクリーニングする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の標的との結合についての前記第１のスクリーニングの後に、前記第３のレパートリを増幅し、次に前記第２の標的に対してスクリーニングする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
２以上の標的と結合することが可能である、少なくとも３つのアミノ酸位置で分子足場と共有結合したポリペプチドを含む多重特異性ペプチドリガンド。
【請求項２０】
２以上の標的と同時に結合することが可能である、請求項１９に記載の多重特異性リガンド
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により得られる、請求項１９または請求項２０に記載の多重特異性ペプチドリガンド。
【請求項２２】
１以上の官能基にコンジュゲートした、分子足場と共有結合したポリペプチドを含むペプチドリガンド。
【請求項２３】
１以上の官能基にコンジュゲートした、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドのＮ末端、前記ポリペプチドのＣ末端、および前記分子足場から選択される１以上の位置で前記官能基が結合している、請求項２２または請求項２３に記載のペプチドリガンド。
【請求項２５】
前記官能基が、インビボで前記ペプチドリガンドの半減期を延長する分子に結合するリガンドである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
【請求項２６】
インビボで前記ペプチドリガンドの半減期を延長する前記分子が、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質である、請求項２５に記載のペプチドリガンド。
【請求項２７】
インビボで前記ペプチドリガンドの半減期を延長する分子に結合する前記リガンドが、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質に特異的な抗体または抗体フラグメントである、請求項２６に記載のペプチドリガンド。
【請求項２８】
前記官能基が、分子足場と共有結合したポリペプチド、１０００ダルトン未満の化学基、および抗体または抗体フラグメントからなる群から選択されるリガンドである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
【請求項２９】
前記官能基が、エフェクター基である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
【請求項３０】
前記エフェクター基が、抗体Ｆｃ領域である、請求項２９に記載のペプチドリガンド。
【請求項３１】
前記エフェクター基が、細胞透過性ペプチドである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
【請求項３２】
前記細胞透過性ペプチドが、ポリアルギニン、ＶＰ−２２、アンテナペディア、ＨＩＶ−ｔａｔおよびペネトラチンからなる群から選択される、請求項３１に記載のペプチドリガンド。
【請求項３３】
請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のペプチドリガンドを調製するための方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを製造するステップと、
（ｂ）それを前記分子足場にコンジュゲートするステップと、
（ｃ）前記１以上の官能基を前記ポリペプチドの前記Ｎ末端またはＣ末端に結合するステップと
を含む、方法。
【請求項３４】
前記官能基が、ＦＭＯＣである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のペプチドリガンドを調製するための方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを製造するステップと、
（ｂ）それを前記分子足場にコンジュゲートするステップと、
（ｃ）前記１以上の官能基を前記分子足場に結合するステップと
を含む、方法。
【請求項３６】
分子量が３０００ダルトン未満である、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
【請求項３７】
分子量が５０００ダルトン未満である、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。
【請求項３８】
前記ポリペプチドと前記分子足場の任意の２つの隣接する結合点間に内在する前記ポリペプチドループの長さが、０〜９アミノ酸の間であり、前記結合点の最初と最後の間の前記ポリペプチド配列の長さが２７アミノ酸より短い、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載のペプチドリガンド。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ−７Ｂ】

【図７Ｃ−７Ｅ】

【図８】

【図９】

【公表番号】特表２０１３−５１８８０７（Ｐ２０１３−５１８８０７Ａ）
【公表日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４８６０５（Ｐ２０１１−５４８６０５）
【出願日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０００６８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８９１１５
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５９７１６６５７８）メディカル　リサーチ　カウンシル (60)
【Ｆターム（参考）】