多重遺伝子ベクターによってコードされる組換えウイルス様粒子
本発明は、産生のための組換えＤＮＡ技術および細胞培養技術に基づいて、ワクチン、診断ツールおよびＲ＆Ｄツールとして使用するための新たなウイルス様粒子を記載する。本発明の組換えウイルス様粒子は、（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、いくつかの、特に２個以上の異なるエピトープを取り込んだポリペプチド鎖によって会合されている。その後、これらのエピトープは粒子表面上にディスプレイされる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、異なるウイルス株に由来するエピトープを含む組換えウイルス様粒子、およびこれらをコードするベクターに関する。
【０００２】
発明の背景
小さな天然の生体分子を、異なる局面で、生物医学、ナノテクノロジーおよび材料科学において使用することに関心が高まっている。ウイルスシミュレーター、ウイルスカプシドまたはウイルス様粒子は、その規則的な構造、その均一な粒子サイズ、その安定性、生産のし易さ、および操作についての可能性から、非常に魅力的である。ウイルス様粒子は動的な構造を有し、その内部に近づくことができ、そしてさらに外被は修飾可能である。適用に依存して、ウイルス様粒子はエンベロープを有してもまたは有していなくてもよく、そしてウイルスシミュレーターとして選択され得る。これらの態様を、薬物送達および生体結合のための、新たな生物学的な実体またはターゲットとして、ワクチンとして、抗体産生のための抗原として、研究ツールとして、診断ツールとして使用し得る。これらのウイルスシミュレーターは、多くのウイルスのエンベロープおよびまたはカプシドタンパク質の自己会合によって形成される。サイズは特定のウイルスの形態に依存して２２〜１５０nmの間で変動する。ウイルスシミュレーターは非感染性である。なぜなら、それらは遺伝子材料を取り込まずに会合しているからである。適用に依存して外来遺伝子材料を本明細書において記載したウイルスシミュレーターに含めることができる。
【０００３】
これらのウイルスシミュレーターの期待される適用は、種々の疾病に対するワクチンの生産である。なぜなら、その反復的で高密度なエピトープのディスプレイは強力な免疫応答を誘起することが多いからである。粒子の小さなサイズは樹状細胞による取り込みに有利である。キメラウイルスシミュレーターはしばしば、選択的な多重エピトープの、多重タンパク質の、多重血清型の、多重株の、または多重種の提示において非常に大きな可能性を与える。
【０００４】
ウイルスシミュレーターの産生のための多くの発現系が存在し、これには、バキュロウイルス／昆虫細胞系、ウイルス発現ベクターで安定にまたは一過性にトランスフェクションまたは形質導入された種々の哺乳動物細胞株、さらに酵母の種々の種（Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastorisを含む）、並びにEscherichia colおよび他の細菌が挙げられる。
【０００５】
ワクチン接種は、感染症から防御するに十分な免疫の発生に依存する。最も使用される弱毒化ウイルスワクチンは、免疫化後の宿主におけるウイルスの少ない複製に依拠する。しかしこの種類のワクチン接種は、いくらかの患者において重度の反応を引き起こす可能性がある。それ故、サブユニットワクチンとしてのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の開発が有益である。なぜなら、この粒子は一般的にＤＮＡまたはＲＮＡゲノムを欠失しているが、天然ウイルスの真正のコンフォメーションを有しているからである。
【０００６】
ワクチン接種は、例えば季節性またはパンデミックなインフルエンザ大流行などの脅威に対する最も強力で対費用効果の高い対応策の１つである。エアロゾルとして蔓延し易いことおよび特に感受性のあるヒトの重度の病気の原因であることが、なぜインフルエンザが最も壊滅的なウイルス疾病の１つであるかの主要な理由である。現在認可されている季節性ワクチンはほんの部分的に防御性であり、そして卵に基づいた生産は非常に時間がかかり費用が大きい。この戦略は、ワクチンとあまり一致していないか全く一致していない流行株の予期せぬ出現に対して脆弱である。トリインフルエンザまたは他の起源のインフルエンザ株が出現する危険性に因り、新たなワクチンアプローチが必要である。
【０００７】
別の局面において、ＨＣＶ、ＨＩＶ、エボラなどのいくつかの重要なウイルスの分野の研究は、バイオセイフティー問題から非常に困難である。現在までにウイルス侵入およびウイルス輸送の調査のためのモデルは僅かしか存在しない。診断ツールは、適切な非感染性ウイルスモデルがないために、これらのウイルスのゲノムに基づく。
【０００８】
現在市販されているヒトインフルエンザワクチンは、その唯一のまたは主要なウイルス抗原として赤血球凝集素を含む。その生産は、発育鶏卵上で、またはより最近では哺乳動物細胞の組織培養液中で増殖させたウイルスから始まる。卵中での生産は、高い収量のリアソータントウイルス株の選択を必要とし、容量が少なく、時間がかかり（６〜８カ月）、そして費用が高い。その他にそれは卵タンパク質に対してアレルギーのあるワクチン接種を受けるヒトに問題を引き起こす可能性がある。生産は、非致死性のトリ株でのみ可能である。卵に基づいた生産の最も重要な欠点の１つは少ない容量である。パンデミックの場合、長期でさらにより致死的な事象をもたらし得るパンデミックインフルエンザワクチンの生産を優先するために、季節性インフルエンザワクチンの生産を停止しなければならない。
【０００９】
ウイルス疾病に対するワクチンは、伝統的に、弱毒化ウイルス株または感染性ウイルスの不活性化に依拠する。適切な環境が、高度に病原性または出血性のウイルスのために必要であり、このためバイオセーフティレベル（例えばＢＬ３／ＢＬ４）のために生産能が制約される。ヒトパピローマウイルスのようないくつかのウイルスでは、前記ウイルスはin vitroにおいて増殖できないために、弱毒化は十分ではないだろう。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）様粒子に基づいたワクチン（ガーダシル、サーバリックス）の生産能が、女性の子宮頸癌の予防に対する見通しを変化させた。
【００１０】
トリインフルエンザまたは他の起源の株が出現する危険性に因り、増強された防御をもたらす新たなワクチンアプローチが必要である。
【００１１】
発明の要約
本発明は、（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、２個以上の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、組換えウイルス様粒子に関する。これらの組換えウイルス様粒子はワクチンとして有用であり、そして本発明はこれらのワクチンに関する。
【００１２】
さらに、本発明は、（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質をコードする２個以上のポリヌクレオチドを含むベクター、並びにこれらのベクターを含む宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】多重エピトープウイルス様粒子を発現するベクター構築物の図解。（Ａ）（配列番号１）Ｈ１Ｎ１ウイルス株（Ｍ１、Ｍ２）並びにＨ３Ｎ２（ＨＡ、ＮＡ）ウイルス株に由来する異なるエピトープを含む多価インフルエンザＡ型ウイルスシミュレーター。（Ｂ）（配列番号２）血清型ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に由来するエピトープ（Ｌ１）を含むキメラヒトパピローマウイルス様粒子。（Ｃ）（配列番号３）インフルエンザＢ型／フロリダ単離株に由来する包埋されたエピトープ（ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２）を有する発現ベクター構築物。（Ｄ）（配列番号４）ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８血清型のエピトープ（Ｌ１）の発現のためのベクター構築物（両方の遺伝子が異なるプロモーターの制御下にある）（Ｅ）（配列番号５）プロモーターｐ１０の欠失した（Ｂ）と同じベクター構築物。ベクターは、ｐｏｌｈから選択される２つのプロモーターＰ１およびＰ２
【数１】
、ｐ１０およびｐＸＩＶ超後期バキュロウイルスプロモーター、ｖｐ３９バキュロウイルス後期プロモーター、ｖｐ３９ｐｏｌｈバキュロウイルス後期／超後期ハイブリッドプロモーター、ｐｃａ／ｐｏｌｈ、ｐｃｎａ、ｅｔｌ、ｐ３５、ｅｇｔ、ｄａ２６バキュロウイルス初期プロモーター；ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＵＢｃ．ＥＦ−１、ＲＳＶＬＴＲ、ＭＴ、ＰＤＳ４７、Ａｃ５、ＰＧＡＬおよびＰＡＤＨを含む。転写終結配列Ｔ１およびＴ２（Ｔ）は、ＳＶ４０、ＨＳＶｔｋまたはＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）から選択される。さらにベクターは、ＭｕｌｔｉＢａｃｂａｃｍｉｄの生成のためのトランスポゾン部位ＴｎＬおよびＴｎＲ（Ｌ、Ｒ）、部位特異的相同的組換え（プラスミド融合）のためのｌｏｘＰ部位（ＬＰ）、複製起点（Ｏ）、アンピシリン（Ａ）およびゲンタマイシン（Ｇ）耐性遺伝子、並びに規定の制限酵素部位を含む。
【図２】発現されたキメラインフルエンザウイルス様粒子の分析。（Ａ）分泌ＶＬＰ（Ａ、レーン２）並びに細胞内ＶＬＰ（配列番号１から調製、レーン１）のコンフォメーションを、タンパク質ＨＡ（Ｈ３）、ＮＡ（Ｈ３）およびＭ２（Ｈ１）に対する特異的な抗体を使用したイムノブロットによって確認する。レーン３＝ラダー、タンパク質サイズ（ｋＤａ）。エピトープは同じ場所に局在し、これはそれらが１つの粒子に会合していることを意味する。（Ｂ）酢酸ウラニルを用いての陰性染色を使用した電子顕微鏡によるキメラインフルエンザウイルス様粒子（配列番号３から調製）の可視化。エピトープＨＡを示すスパイクが見える。粒子のサイズは５０〜８０nmの範囲である。
【図３】配列番号１から調製された分泌された多重エピトープインフルエンザウイルス様粒子のクロマトグラフィーによる精製および分析。（Ａ）ゲルろ過精製のクロマトグラム。最初のピーク（１）はウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。他のピーク（２〜６）はコンタミタンパク質を示す。（Ｂ）クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＶＬＰを含むピークの最初の部分（レーン１）、中間の部分（レーン２）および最後の部分（レーン３）を示す最初のピーク（１）に由来する異なる画分を分析することによってウイルス様粒子の多重エピトープが確認される。ラダー［ｋＤａ］を最初のレーンの左に示す。エピトープの検出を矢印によって示す。（Ｃ）抗ＨＡ抗体を使用してクーマシー染色したゲルによるウェスタンブロット分析。
【図４】天然様インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の機能性。精製ＶＬＰ（配列番号３から調製）の２倍連続希釈シリーズ（１：２から１：２０４８）を、標準的な赤血球凝集アッセイによって分析する。５０μLの精製した粒子溶液を、赤血球（red blood cells）（赤血球、erythrocytes）と共にインキュベーションした９６ウェルプレート上にコーティングする。インフルエンザＶＬＰ（１、上の部分）は用量依存的に赤血球を凝集させることができる。最も高い希釈度は１：１０２４である。これとは対照的に、対照（Ｃ）として使用したＰＢＳでは赤血球の沈降だけが起こり、ウェルの中央に「ドット」として見える。
【図５】多重エピトープインフルエンザウイルス様粒子のin vivoにおける評価。マウスに、配列番号３から調製された５０ng（マウス１〜５）または１００ng（マウス６〜１０）の精製ＶＬＰのいずれかを用いて、そして対照としてＰＢＳ（マウス１１〜１２）を用いて免疫化する。初回注射後（注射から３週間後）の抗体力価を白いボックスとして示し、ブースト注射後（注射から６週間後）の力価を黒いボックスとして示す。力価を、マウス血清の希釈度（ｙ軸）として示す。ＶＬＰは抗体免疫応答を効果的に刺激する。免疫化を１００μl（マウス６〜１０）を用いて実施した場合に最善の結果が得られ、このことは用量依存的な免疫応答を示す。抗ＶＬＰ抗体の量の明確な増加がブースト後に観察される。予期したように、対照動物（マウス１１〜１２）は免疫応答を全く示さなかった。
【図６】赤血球凝集阻害アッセイによる多重エピトープインフルエンザＶＬＰに対する特異的な免疫応答の確認。ＥＬＩＳＡ試験を、注射から６週間後に採取した血清を用いて実施し、特異的な抗ＨＡ抗体の存在を分析した。配列番号３から調製した多重エピトープウイルス様粒子を９６ウェルプレート上にコーティングし、血清と混合し、そして３０分間インキュベーションした。血清を２倍希釈液シリーズ（１：２から１：１０２４）中で試験した。インキュベーション後、赤血球を加え、そしてさらに３０分間インキュベーションした。多重エピトープウイルス様粒子に結合する異なるマウスに由来する特異的な抗インフルエンザＨＡ抗体により、１：１２８（１）の希釈度および１：２５６（２）の希釈度まで赤血球の凝集が阻害され、これはウェルの中央に赤血球の沈降（「ドット」）として見られる。対照マウスの血清試料（Ｃ）では赤血球凝集阻害は観察されない。
【図７】５０mLのバイオリアクターを使用した最善の発現条件のスクリーニング。１〜２×１０６個の細胞／mLの範囲の最初の細胞量（ＴＯＩ、１または２）、ウイルス接種材料（ＭＯＩ、０．０１〜２）および収集時刻（感染後の日数、２日後から６日後）をドットブロット分析によって決定した。（Ａ）対照として使用する唯１つのエピトープＬ１を有する発現構築物の最善の発現パラメーターの決定。特異的な抗ＨＰＶ１８抗体（Abcam）による検出。（Ｂ）異なる血清型に由来する２つのエピトープを有する多重エピトープ発現構築物の最善の発現パラメーターの決定（配列番号２）。２つのエピトープＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１に対する、特異的な抗ＨＰＶ１６抗体（Camvir, Santa Cruz）および抗ＨＰＶ１８（Abcam）抗体による検出。
【図８】配列番号２から調製される多重エピトープヒトパピローマウイルス様粒子のクロマトグラフィーによる精製および分析。（Ａ）ＤＥＡＥ−セファロースカラムを使用した陰イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラム。通過画分（１）、洗浄（２）および溶出ピーク（３〜５）を番号（１〜５）によって示す。溶出緩衝液の増加したイオン強度は線［％］によって示される。３＝３００mM ＮａＣｌを用いての溶出、４＝４２０mM ＮａＣｌを用いての溶出、５＝６８０mM ＮａＣｌを用いての溶出。（Ｂ）クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ウイルス様粒子の多重エピトープの存在を、クロマトグラムの異なる部分を分析することによって確認した。レーン１＝ラダー［ｋＤａ］、レーン２＝精製前のＶＬＰ、レーン３＝洗浄工程、レーン４＝３００mM ＮａＣｌを用いての溶出、レーン５＝４２０mM ＮａＣｌを用いての溶出、レーン６＝５００mM ＮａＣｌを用いての溶出、レーン７＝６８０mM ＮａＣｌを用いての溶出。エピトープを矢印（Ｌ１）によって示す。（Ｃ）矢印（Ｌ１）によって示される２つのエピトープに対する特異的な抗体を使用したクーマシー染色したゲルを用いてのウェスタンブロット分析。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、産生のための組換えＤＮＡ技術および細胞培養技術に基づいて、ワクチン、診断ツールおよびＲ＆Ｄツールとして使用するための新たなウイルス様粒子を産生することを目的とする。本発明の粒子は、可能性のあるパンデミックインフルエンザの大流行と戦うに適したワクチンへの要求を充足する。本発明の組換えウイルス様粒子は、（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、いくつかの、特に２個以上、例えば２個、３個、４個もしくは５個、またはまた３の倍数、例えば６個、９個もしくは１２個の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を取り込んだ、ポリペプチド鎖によってアセンブルされている。その後、これらのエピトープは粒子表面上にディスプレイされる。異なる株、異なる血清型および／または異なる宿主に特異的なウイルスに由来するエピトープの選択により、天然で起こるような、例えば２００９年４月のブタインフルエンザの大流行中に観察されたようなウイルスの天然の変化を模倣した多機能性のウイルス様粒子が得られる。当技術分野において最新技術のウイルス様粒子は、単一のタンパク質から構成されるか、または同じウイルス株に由来する３個までの異なるエピトープを含むかのいずれかである。本発明の粒子は、昆虫細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞などの宿主細胞における産生のために使用される、単一のＤＮＡベクター（ウイルスまたはプラスミドのいずれかに基づく）によってコードされる。好ましい態様において、ＤＮＡベクターはバキュロウイルスベクターであり、そして宿主細胞は昆虫細胞である。
【００１５】
本発明のエピトープは、４〜１０００アミノ酸、好ましくは６〜１００アミノ酸からなる免疫原性ペプチドであり、そして好ましくは中和エピトープである。中和エピトープは、抗体に結合した場合、免疫原性応答の結果として、このような中和エピトープを有するウイルスの中和をもたらすエピトープである。本明細書において理解されるようなエピトープは反復性であり得、そしてより大きなタンパク質の一部、特に抗原の一部、ウイルス表面タンパク質の一部またはウイルス膜タンパク質の一部であり得る。ウイルス表面タンパク質またはウイルス膜タンパク質に取り込まれたこのようなエピトープが好ましい。本発明によるウイルス様粒子の目的とする使用がＲ＆Ｄツール、診断ツールまたはウイルスシミュレーターとしてである場合、エピトープは、完全なウイルス型表面を与える完全なウイルスタンパク質の一部であることが重要である。
【００１６】
本発明の異なるウイルス株は、例えば、インフルエンザウイルスの異なる株、例えば、インフルエンザウイルスＡ型のＨ１Ｎ１株、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ９Ｎ１株、Ｈ１Ｎ２株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ３Ｎ２株もしくはＨ９Ｎ２株、またはまたインフルエンザウイルスＢ型もしくはインフルエンザウイルスＣ型である。
【００１７】
本発明の異なる血清型は、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の異なる血清型、例えば血清型６、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、４８、５２、５８、６２、６６、６８、７０、７３および８２であるが、癌原遺伝子型ＨＰＶ５、８、１４、１７、２０および４７に由来し、またはまたパピローマ関連型ＨＰＶ６、１１、１３、２６、２８、３２および６０に由来する。
【００１８】
異なる宿主に特異的なウイルス株は、対応する宿主に特に適応することを意味し、そしてこれは例えば、ヒトインフルエンザウイルス株、ブタインフルエンザウイルス株およびトリインフルエンザウイルス株である。これに関して、宿主に特異的とは、ウイルスがある宿主から同じタイプの別の宿主へと容易に伝染するが、異なるタイプの宿主には伝染しないことを意味する。例えば、トリウイルス株は、トリから他のトリへと容易に伝染するが、他の動物またはヒトには伝染しない。
【００１９】
好ましい態様において、異なる株、異なる血清型および／または異なる宿主に特異的なウイルスに由来するエピトープを含む粒子を、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープと合わせて、より広範な免疫応答を誘導する。
【００２０】
別の好ましい態様において、ウイルス様粒子は、場合によりさらにカプシドおよびヌクレオポアタンパク質を含む、完全なウイルス様表面を形成するタンパク質からなる。
【００２１】
本発明のウイルス様粒子は、蛍光タンパク質、粒子の精製目的のためにまたは標識を付着するために有用なタンパク質、並びに輸送プロセスおよび安定性のために必要とされるタンパク質性構造をさらに含み得る。
【００２２】
本明細書において記載したポリペプチドおよびウイルス様粒子は、特異的な遺伝子およびプロセス工学ツールの使用に因り、実際のワクチン製造プロセスと比較して、より短い時間および無制限な量で生産される。現代の分子生物学的方法、例えばＭｕｌｔｉＢａｃ技術（WO 2005/085456; I. Berger et al., Nature Biotechnology 22, 1583, 2004）、Ｐｏｌｙｂａｃ技術（WO 2007/054250）、または遺伝子合成などによって必要とされるウイルス遺伝子を会合させる能力は、例えば、コードＤＮＡベクターの迅速な会合を可能とする。これらの技術の使用は、本発明のウイルス様粒子およびワクチンの開発、製造または投与中における、元来の危険な可能性のあるウイルスの物理的な移動を全く必要としない。本発明の粒子の構築のために、感染個体からのヌクレオチド配列を使用することで十分である。これは、種株ウイルスとして遺伝子的に改変されたウイルスを必要とする、古典的な卵に基づいたワクチンを生成するための方法とは大きな違いである。本発明の粒子は、現代の使い捨ての組織培養技術を使用して製造され、これは高い生産能を可能とする。宿主細胞としてのバキュロウイルスベクターおよび昆虫細胞の好ましい態様において、製造プロセスを迅速にセットアップでき、そして生産時間は短く、すなわち、卵に基づいた方法と比較して数カ月ではなく数週間の範囲である。さらに、使い捨て組織培養器具の構築は、卵に基づいた器具をセットアップするのに比べて、時間も費用もあまりかからない。結果として、全人口に対する大量のワクチンを短い時間枠で生産および再生産することができ、そしていくつかの異なるタイプのワクチン、例えば季節性インフルエンザワクチンおよびパンデミックインフルエンザワクチンを容易に並行して生産することができる。卵に基づいたワクチン製造工場の容量限界に因る、あるワクチンまたは他のワクチンにするかの保険衛生当局による困難な決定は必要ない。
【００２３】
本発明は、（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、２個以上、例えば２個、３個、４個もしくは５個、またはまた３の倍数、例えば６個、９個もしくは１２個の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、組換えウイルス様粒子に関する。好ましいのは、３個以上、好ましくは４個以上の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、組換えウイルス様粒子である。同様に好ましいのは、３の倍数、例えば６個、９個もしくは１２個の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、組換えウイルス様粒子である。エピトープは、２個の異なる株、異なる血清型もしくは異なる宿主に特異的なウイルス株から、または３個の異なる株、異なる血清型もしくは異なる宿主に特異的なウイルス株から、または４個の異なる株もしくは血清型から選択される。好ましいのは、３個の異なる株または血清型に由来するいくつかのエピトープを含むウイルス様粒子である。同様に好ましいのは、２個または３個の異なる宿主に特異的なウイルス株に由来するいくつかのエピトープを含むウイルス様粒子である。
【００２４】
さらに、本発明は、（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、エピトープを、またはエピトープを含む異なるタンパク質をコードする、２個以上、例えば２個、３個、４個もしくは５個、またはまた３の倍数、例えば６個、９個もしくは１２個の異なるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００２５】
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」は、１２〜３０００ヌクレオチドの鎖を示し得、一般的に呼称されるオリゴヌクレオチドを含み、そして記載の異なるウイルス源に由来するウイルス遺伝子またはオープンリーディングフレーム、特に、ウイルス表面タンパク質またはウイルス膜タンパク質をコードする遺伝子またはオープンリーディングフレームであり得る。
【００２６】
好ましいのは、本明細書において前記した好ましいウイルス様粒子をコードするベクターである。
【００２７】
最も好ましいのは、配列番号１〜５から選択されるポリヌクレオチド配列を含むベクターである。
【００２８】
好ましい態様において、本発明のウイルス様粒子は、
（１）同じウイルスの２個または３個の異なる株または血清型に由来する、同じ型の表面タンパク質；
（２）異なるウイルス株に由来する、例えばインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１株およびＨ１Ｎ１株に由来する、２個を超える異なる表面タンパク質の混合物；
（３）異なる宿主に特異的なウイルス、例えばブタ、ヒトおよび／またはトリ宿主に特異的なインフルエンザウイルスの合わせられた、異なる表面タンパク質の混合物
を含む。
【００２９】
本発明のウイルス様粒子に含めようとするエピトープ源として考えられるウイルスは、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、デング、ＨＣＶおよびニューカッスル病ウイルスである。エピトープを、他のウイルスからおよび細菌から得てもよい。特に好ましいのはインフルエンザウイルスである。等しく好ましいのはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である。
【００３０】
考えられるベクターはＤＮＡベクターであり、そしてプラスミドベクターまたはウイルスベクターのいずれかであり得る。このようなベクターを会合させる方法は、分子生物学の技術分野の最新技術の標準的な方法である。好ましい方法は、ＣＡＰ（登録商標）技術および当技術分野の最新技術の遺伝子合成技術と合わせた、WO 2005/085456およびI. Berger et al., Nature Biotechnology 22, 1583, 2004に記載のようなＭｕｌｔｉＢａｃ、または例えばWO 2007/054250に記載のようなＰｏｌｙｂａｃ法である。これらの技術は、異なる宿主細胞における発現に適した多重遺伝子同時発現ＤＮＡベクターの会合を可能とする。本発明の好ましいＤＮＡベクターはバキュロウイルスベクターである。
【００３１】
本発明のベクターの発現のために使用される宿主細胞は、原核細胞発現細胞株（例えばE.coli）であっても、または真核細胞発現細胞株であってもよい。好ましいバキュロウイルスベクターの発現のために、昆虫細胞株が好ましい。昆虫細胞株の例は、例えば、ＳＦ９、ＳＦ２１、Ｈｉ−５、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｆ＋およびＳ２シュナイダー細胞である。真核細胞系における発現のために、哺乳動物細胞、特にヒト細胞、例えばＨｅＬａ、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＭＴ−２、骨髄線維芽細胞、一次ニューロン細胞、または胚細胞が好ましい。酵母における発現のためには、S. cerevisiae、S. pombe、C. albicans、またはP. pastoris細胞が使用され得る。
【００３２】
本発明による宿主細胞の培養および増殖を、特定の宿主細胞のための適切な条件を提供する、任意の容器、バイオリアクターまたは使い捨てユニットにおいて行なうことができる。
【００３３】
本発明のウイルス様粒子をワクチンとして使用することができる。さらに、それらを、診断ツールにおける抗原として、抗体生成のための抗原として、並びに研究および開発ツール（例えばウイルス侵入研究およびウイルス−宿主相互作用の研究）のためのウイルスシミュレーターとして使用し得る。
【００３４】
本発明によるワクチンは、当技術分野の最新技術において公知であるような、粘度調節化合物、安定化化合物および／または免疫原性を高めるアジュバントを場合によりさらに含む、水溶液中の組換えウイルス様粒子を含む。
【００３５】
特定の態様において、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス様粒子を、Berger et al., Nature Biotechnology, 2004、WO 2005/085456およびWO 2007/054250の方法およびＣＡＰ（登録商標）技術を使用して構築する。Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ型／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８３４の少なくとも１つのＭ１およびＭ２遺伝子を、ＰＣＲ増幅によって導入ベクターｐＦＬ（WO 2007/054250、図１）に、インフルエンザＡ型／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７のＨＡ遺伝子およびインフルエンザＡ型／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７のＮＡ遺伝子と一緒にクローニングする。構築物をＤＮＡシークエンスによって確認する。
【００３６】
別の特定の態様において、同じクローニング技術を使用して、導入ベクターｐＦＬにクローニングされた、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両血清型、または２、４、６、１１、３１、３３〜３５、３９、４０〜４５、５１〜５３、５５〜５９、６２、６６、６８、７０、７３および７７の群に由来するさらに他の血清型の少なくとも１つのＬ１遺伝子を導入する（図１）。
【００３７】
実験部
E.coli細胞における増殖を可能とするＭｕｌｔｉＢａｃまたはＹＦＰＭｕｌｔｉＢａｃ（WO 2005/085456）と名付けられたバキュロウイルスベクター、およびＣＡＰ（登録商標）技術を、従来のシステム（Fitzgerald et al., Nature Methods, 3, 1021, 2006）を使用して組換えＡｃＮＰＶｓ（Autographa californica核多角体病ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）、バキュロウイルス）を生成するために使用する。１０ngの多重遺伝子ベクターを、ＤＨ１０ＭｕｌｔｉＢａｃおよび／またはＤＨ１０ＹＦＰＭｕｌｔｉＢａｃコンピテント細胞において形質転換する。青色／白色スクリーニングおよびＰＣＲによって陽性クローンを選択する。対応するＭｕｌｔｉＢａｃ ｂａｃｍｉｄＤＮＡを、Birnboim & Doly法を使用して単離する。１μgの多重遺伝子ＭｕｌｔｉＢａｃ ｂａｃｍｉｄを、製造業者のプロトコールに従って、トランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ（Roche）を使用して０．９×１０６個のＳｆ２１（Invitrogen）細胞中にトランスフェクションすることによって、組換えＡｃＮＰＶｓを生成する。ウイルスの増殖は、以前に記載されている通りに行なう（Fitzgerald et al., Nature Methods, 3, 1021, 2006）。全ての組換えＡｃＮＰＶの力価を、Bac-to-Bac-マニュアル(Invitrogen)に記載のプラークアッセイによって決定する。感染効率（ＭＯＩ）、細胞数（ＴＯＩ）および収集時刻（ＴＯＨ）のようなタンパク質産生パラメーターを、小規模な発現研究を用いて分析する。
【００３８】
実施例１：発現ベクター構築物の生成
種々の構築物を製造するために、導入ベクターｐＦＬに存在する増殖モジュールＭを（WO 2005/085456およびＣＡＰ（登録商標）技術）、WO 2005/085456に記載の方法に従って使用する。エピトープのＤＮＡを、元のウイルスからウイルスＲＮＡを単離し、その後、ＰＣＲと合わせた逆転写を行なうことによって（インフルエンザウイルスエピトープについて）、または遺伝子合成によって（Geneart社によって提供）のいずれかで得る。逆転写を、製造業者のプロトコールに従って、RevertAid（登録商標）H Minus First strand cDNA合成キット（Fermentas）を使用して実施する。ｃＤＮＡ（２μL）をＰＣＲ反応のための鋳型として使用する。以下の条件を、製造業者のプロトコールに基づいて使用する。５０μLの全容量の反応のために、０．２mM ｄＮＴＰ（ＮＥＢ）、１．２％ＤＭＳＯ、０．５μM逆方向および正方向プライマー（Microsynth）、１０μlの５×Phusion GC反応緩衝液、並びに２ＵのPhusion Hot Startポリメラーゼ（Finnzyme）を使用する。多重遺伝子会合のために適切な制限酵素部位（BstZ17I、SpeI、PmeI、AvrII）をＰＣＲを使用して導入する。ＰＣＲフラグメントを制限酵素で切断し、その後、ライゲーションおよび形質転換プロセスを行ない、導入ベクターに増殖モジュールを組み込む。ライゲーションを、５００ngの鎖状導入ベクター（ｐＦＬ）、４μLのＰＣＲ産物および１ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Fermentas）を使用して４℃で一晩かけて行なう。プラスミドを生成するために、４μLのライゲーション溶液を、５０μlのコンピテントなＤＨ５α細胞に加え、そして氷上で３０分間インキュベーションする。４２℃で３０秒間の熱ショックおよび４℃で２分間の寒冷ショックの後、２００μlのＬＢ培地を加え、そして３７℃および２２０rpmで１時間インキュベーションする。その後、８０μlの細胞懸濁液を、適切な抗生物質（この場合、１００μgのアンピシリンおよび１００μgのゲンタマイシン）を含むＬＢ寒天プレート上に播く。全手順を、全エピトープが導入ベクターに導入されるまで繰り返す。
【００３９】
インフルエンザエピトープは、ＨＡおよびＮＡ遺伝子から選択され（両方共にＨ３Ｎ２／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７株から選択される）、一方、Ｍ１およびＭ２からのエピトープは、Ｈ１Ｎ１／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８３４株から選択される。Ｍ１エピトープはプロモーターｐ１０によって制御され、全ての他のエピトープはポリヘドリンプロモーターｐｏｌｈによって制御される。全てのエピトープは同じベクター構築物上に存在する（図１Ａ、配列番号１）。インフルエンザＢ型／Ｆｌｏｒｉｄａ／２００６単離株は、遺伝子ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２に由来する複数のエピトープを有する構築物を生成するように選択される（図１Ｃ、配列番号３）。ヒトパピローマウイルスエピトープは、癌関連血清型ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に由来する遺伝子Ｌ１から選択され、そして１つのベクター構築物に一体化される。両方のエピトープが、ポリヘドリンプロモーターｐｏｌｈによって制御される（図１Ｂ、配列番号２）。発現収量を向上させるために、さらに他の構築物においてはｐ１０プロモーターを欠失させる（図１Ｅ、配列番号５）。別の構築物においては、ＨＰＶ１６エピトープはｐ１０プロモーターによって制御されるが、ＨＰＶ１８エピトープのためにはポリヘドリンプロモーターｐｏｌｈが選択される（図１Ｄ、配列番号４）。
【００４０】
実施例２：組換えバキュロウイルスの生成
このウイルスは、複数のエピトープをその表面上に提示するウイルス様粒子またはウイルスシミュレーターを生成するための、前記の複数のエピトープを含む。ウイルス様粒子を、種々の適用のために、例えばインフルエンザ分野におけるワクチンとして使用することができる。ＡｃＮＰＶ由来バキュロウイルスは、２００８／２００９−ＶＬＰワクチン接種キャンペーンのためにＷＨＯによって推奨されるウイルス株に由来する複数の異なるエピトープを含む。導入ベクターの全ての遺伝子は、WO2005/085456のプロトコールによる、ＭｕｌｔｉＢａｃ細胞中への部位特異的相同的組換えによって置き換えられる。
【００４１】
１０ngの導入ベクターを１００μlのＭｕｌｔｉＢａｃコンピテント細胞に加え、そして３０分間４℃でインキュベーションする。４２℃で４５秒間の熱ショックおよび４℃で２分間の寒冷ショックの後、４００μlのＬＢ培地を加え、そして細胞溶液を３７℃および２２０rpmで４時間インキュベーションする。異なる希釈液を、種々の抗生物質耐性を含む適切なＬＢ寒天プレート上に播く。青色／白色およびＰＣＲスクリーニングに基づいて、いくつかの正しいＭｌｕｔｉＢａｃクローンを選択する。対応するＭｕｌｔｉＢａｃ ｂａｃｍｉｄＤＮＡを、Birnboim & Doly法を使用して単離する。少なくとも４個のＭｕｌｔｉＢａｃ ｂａｃｍｉｄクローンを、Ｓｆ９またはＳｆ２１のような昆虫細胞の最初のトランスフェクションのために選択して、組換えＡｃＮＰＶ由来バキュロウイルスを生成する。これは、１μgの多重遺伝子ＭｕｌｔｉＢａｃ ｂａｃｍｉｄを、製造業者のプロトコールに従って、トランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ（Roche）を使用して０．９×１０６個のＳｆ２１（Invitrogen）細胞にトランスフェクションすることによって生成される。ウイルスの増殖を、以前に記載されている通りに行なう（Fitzgerald et al., Nature Methods, 3, 1021, 2006; Bac-to-Bac-マニュアル, Invitrogen）。ウイルスを増殖させて容量を増大させ、そして感染力価を増加させ、これをBac-to-Bac-マニュアル（Invitrogen）に従ってプラークアッセイによって決定する。最善の発現構築物は、５０mLの小規模発現実験、次いでブラッドフォードアッセイ（ADV, Cytosceleton）によるタンパク質収量の決定によって決定される。最善の発現体の発現をさらに、複数の異なるエピトープに対する抗体を用いてのウェスタンブロット分析によって確認する（図２Ａ）。
【００４２】
実施例３：昆虫細胞における多重エピトープインフルエンザウイルス様粒子の産生および精製
最善の発現構築物の決定の後、細胞株、細胞数（ＴＯＩ）、組換えウイルス接種材料の量（感染効率、ＭＯＩ）および収集時刻（ＴＯＨ）のようなバイオテクノロジー産生パラメーターを、５０mLのバイオリアクター中において決定する。異なるＴＯＩ、ＭＯＩおよびＴＯＨのマトリックスを、Eibl、RiesenおよびJohn (Bioforum 03/2009)およびFriesen J. (Bachelor thesis, University of Applied Science, Esslingen, Germany)に従って設計する。分泌または細胞内多重エピトープウイルス様粒子の発現を、毎日の試料採取により６〜８日間観察する。細胞内粒子（例えばＨＰＶ）のために、細胞ペレットを、５０mMトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００mM ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を用いて溶解し、そして４℃および８０００×ｇで１０分間遠心分離にかける。上清中に存在するウイルス様粒子のエピトープを、特異的抗体を用いて、ドットブロット装置（Biometra）、次いでウェスタンブロットを使用してさらに確認する。最も高い収量が得られる条件を発現パラメーターとして規定し、３日間から４日間の収集時刻が好ましい。これらの規定されたパラメーターに従って、ウイルス様粒子を、振とうフラスコまたは揺動培養バッグ中のいずれかのfall armywormのSpodoptera frugiperda細胞Ｓｆ９およびＳｆ２１において産生する。多重エピトープインフルエンザウイルス様粒子発現のための、Ｓｆ２１細胞は、以下の条件を用いて選択される：１．５×１０６個の細胞／mL、ＭＯＩ ０．０５および収集時刻は感染から４日後。細胞を、２７℃で二酸化炭素の非存在下、ウシ胎児血清を補充することなく、増殖させる。規定の収集時刻に従って、分泌されたウイルス様粒子を、４℃で５００〜１０００×ｇで２０分間の遠心分離によって回収する。粒子を含む上清容量を、１００ｋＤａのカットオフを有するカセット（Sartocon-Slice 200、SartoriusおよびCentramateOS, PALL）を使用したタンジェンシャルフローろ過による精製のために減少させる。ウイルス様粒子の精製を、計れるクロマトグラフィー法およびスクロース勾配超遠心分離法を用いて実施する。
【００４３】
クロマトグラフィー精製は、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびゲルろ過クロマトグラフィーを使用する多段階精製である。上清を、５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のＦＰＬＣ−システム（AEKTA purifier, GE Healthcare）に接続したＣａｐｔｏＱカラムにのせる。粒子を、５０mMリン酸、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を使用する線形勾配での漸増塩濃度で溶出する。粒子を含む画分をプールし、そしてさらに、ゲルろ過クロマトグラフィーによって精製する（配列番号１からのＶＬＰ、図３）。精製を、５０mMリン酸、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４の緩衝液中で、ＨｉｇｈＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを使用して実施する。全てのクロマトグラフィー工程をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後、クーマシー染色およびイムノブロットによって分析する。
【００４４】
実施例４：精製インフルエンザウイルス様粒子の分析
異なるエピトープの存在を確認するために、精製した材料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後、クーマシー染色またはウェスタンブロットによって分析する。１５０μlの異なるクロマトグラフィー画分を、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル（Invitrogen）にのせ、１５０Ｖで１５分間および１７５Ｖで４５分間流し、そしてSimplyBlueSafestain (Invitrogen)を使用してクーマシー染色する。イムノブロットのためにタンパク質をニトロセルロース膜（BioRAD）に１９Ｖで４０分間かけて半乾燥装置（BioRAD）を使用して転写する。５％無脂肪ドライミルク−トリスＣｌ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）溶液を用いて３０分間かけて非特異的結合部位を遮断した後、膜を、ＨＡ、ＮＡおよびマトリックスタンパク質に対する抗体と共に一晩かけて４℃でインキュベーションする。膜を数回、トリスＣｌ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）緩衝液を用いて洗浄する。一次抗体の起源に依存して、二次抗体は、検出のためのアルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼと接続された抗マウスまたは抗ウサギのいずれかである。これらのタンパク質の同じ場所における局在は、１つの発現ベクターおよび１つのバキュロウイルスの会合およびそれからの産生を示す（図３Ｂ、配列番号１から）。この同じ場所における局在はまた、遺伝子ＨＡ、ＮＡおよび両方のマトリックスタンパク質Ｍ１およびＭ２（その膜アンカーを含む）を含む発現構築物についても示され得る。
【００４５】
実施例５：インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の機能性
ＶＬＰがその表面に赤血球凝集素タンパク質（ＨＡ）を正しく組み込んだかどうかを分析するために、ニワトリ由来の赤血球（ＲＢＣ）を使用する標準的な赤血球凝集アッセイを実施する（図４、配列番号３のＶＬＰ）。精製ＶＬＰの２倍連続希釈を、Ｖ底９６ウェルプレートにおいてＰＢＳ（１×）を用いて行なう。等量の赤血球（１％溶液）を加え、そして１時間４℃でインキュベーションする。ウェルの底上のＲＢＣ凝集体の外見は、赤血球凝集がないことを示す。力価は、ＲＢＣを凝集させる精製ＶＬＰ溶液の最も高い希釈度の逆数として表現される。得られた結果は、ＶＬＰがニワトリ赤血球を凝集させることができ、そしてＶＬＰ表面上におけるＨＡの存在を間接的に示す。陰性対照（ＰＢＳ）は凝集を全く示さない。
【００４６】
実施例６：インフルエンザＶＬＰのin vivoにおける評価
ＶＬＰ（配列番号３から調製）の免疫原性（免疫系の刺激）をin vivoにおいて、それぞれ０週間目および３週間目にプライム・ブースト計画で皮下免疫化を受ける２群のマウスを使用して試験する。免疫化を、５０または１００μl（５０または１００ng）のＶＬＰ懸濁液を使用して実施する。ＶＬＰ単独の免疫応答の品質を決定するために、アジュバントを全く使用しない。マウスを３週間目および６週間目に出血させ、そして血清を、免疫化ＶＬＰに対する抗体応答について調べるために分析する。得られた結果は、ＶＬＰが、抗体免疫応答を刺激するのに効果的であることを示す。最善の結果は、免疫化を１００μlを用いて実施した場合に得られ、このことは用量依存的な免疫応答を示す。抗ＶＬＰ抗体の量の明瞭な増加が、ブースト後に観察される。予期した通り、ナイーブな動物は免疫応答を全く示さない。
【００４７】
免疫応答の特異性を再確認するために、赤血球凝集阻害試験を６週間目に実施して、特異的な抗ＨＡ抗体の存在を分析する。結果は、特異的な抗インフルエンザＨＡ抗体が、１２８希釈度（マウス６）および２５６希釈度（マウス８）まで赤血球の凝集を阻害することができることを示す。ナイーブマウスの血清試料では赤血球凝集阻害は全く観察されない。新たに生成された多重エピトープインフルエンザＶＬＰは用量依存的に免疫系を刺激することができる。免疫系をブーストを用いて再刺激する場合、免疫応答は少なくとも１５倍増加する。誘起された免疫応答の特異性をＥＬＩＳＡおよび赤血球凝集試験によって分析する。
【００４８】
実施例７：種々の細胞株におけるヒトパピローマウイルスエピトープを有する多重エピトープウイルス様粒子の産生および精製
細胞株、細胞数（ＴＯＩ）、組換えウイルス接種材料の量（感染効率、ＭＯＩ）および収集時刻（ＴＯＨ）のようなバイオテクノロジー産生パラメーターを、Eibl et al. (Bioforum 3/2009)に従って５０mLのバイオリアクター（図７）中で決定する。これらの規定されたパラメーターに従って、ウイルス様粒子を、振とうフラスコまたは揺動培養バッグのいずれかの中のfall armywormのSpodoptera frugiperda細胞Ｓｆ９およびＳｆ２１において産生する。多重エピトープパピローマウイルス様粒子は、２×１０６個の細胞／mL、ＭＯＩ ０．５および感染から３日後の収集時刻を使用して、Ｓｆ２１細胞において配列番号２から発現される。細胞を、２７℃で二酸化炭素の非存在下、ウシ胎児血清を補充することなく、増殖させる。規定の収集時刻に（感染から３日後）、細胞内ウイルス様粒子を５００〜１０００×ｇで２０分間４℃での遠心分離によって回収する。細胞を低浸透圧リン酸緩衝液、その後、超音波を使用することによって溶解する。４℃および２０００×ｇでの遠心分離工程後、上清を回収する。ウイルス様粒子の精製を、計れるクロマトグラフィー法およびスクロース勾配超遠心分離法を用いて実施する。クロマトグラフィー精製は、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを使用する多段階精製である。上清を、５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のＦＰＬＣ−システム（AEKTA purifier, GE Healthcare）に接続したＣａｐｔｏＤＥＡＥカラムにのせる。粒子を、５０mMリン酸、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を使用する線形勾配での漸増塩濃度で溶出する（図８Ａ）。粒子を含む画分をプールし、そしてさらに、ヒドロキシアパタイトカラムを使用して精製する。結合を、２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で実施し、その後、５００mMリン酸、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いての線形勾配溶出を実施する。多重エピトープ粒子を磨くために、ゲルろ過クロマトグラフィーを実施する。精製を、ＨｉｇｈＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを使用して５０mMリン酸、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４緩衝液中で実施する。全てのクロマトグラフィー工程をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、その後、クーマシー染色およびイムノブロットによって分析する。
【００４９】
実施例８：精製キメラヒトパピローマウイルス様粒子の分析
精製された材料における異なるエピトープの存在を確認するために、配列番号２から調製したＶＬＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、その後、クーマシー染色および（図８Ｂ）およびウェスタンブロット（図８Ｃ）によって分析する。イムノブロットのために、異なる血清型のＬ１タンパク質に対する抗体を使用する。１５０μlの異なるクロマトグラフィー画分を４〜１２％Ｂｉｓ−トリスＮｕＰＡＧＥゲル（Invitrogen）にのせ、１５０Ｖで１５分間および１７５Ｖで４５分間流し、そしてSimplyBlueSafestain (Invitrogen)を使用してクーマシー染色する。イムノブロットのために、タンパク質を、半乾燥装置（BioRAD）を使用して１９Ｖで４０分間かけてニトロセルロース膜（BioRAD）上に転写する。５％無脂肪ドライミルク−トリスＣｌ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）溶液を用いて非特異的な結合部位を３０分間かけて遮断した後、膜を、Ｌ１エピトープに対する抗体と共に一晩かけて４℃でインキュベーションする。Ｃａｍｖｉｒ抗体（SantaCruz）をＨＰＶ１６検出のために使用し、そしてＨＰＶ１８検出のために抗ＨＰＶ１８ａｂ（Abcam）を使用する。膜を、トリスＣｌ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）緩衝液を用いて数回洗浄する。膜を、検出のためのアルカリホスファターゼと接続された抗マウス抗体と共に１時間インキュベーションする。エピトープを、ＢＣＩＰ／ＮＰＴ溶液によって検出する。これらのタンパク質の同じ場所での局在は、１つの発現ベクターおよび１つのバキュロウイルスのアセンブルおよびそれからの産生を示す。
【００５０】
実施例９：キメラヒトパピローマウイルス様粒子（ＶＬＰ）の機能性
配列番号２から調製したヒトパピローマウイルス様粒子がその表面にＬ１タンパク質を正しく組み込んだかどうかを分析するために、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施する。精製ＶＬＰの２倍連続希釈を、Ｖ底９６ウェルプレートにおいてＰＢＳ（１×）を用いて行なう。等量の血清型特異的抗体（濃度１：１０００）を加え、そして１時間３７℃でインキュベーションする。Ｌ１タンパク質への抗体の適切な結合を、セイヨウワサビペルオキシダーゼを有する二次抗体および化学発光検出システムを使用して検出する。得られた結果は、用量依存的な組換え発現エピトープへの抗体の結合を示す。陰性対照（ＰＢＳ）は全く結合を示さなかった。
【図１Ａ）】
【図１Ｂ）】
【図１Ｃ）】
【図１Ｄ）】
【図１Ｅ）】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、異なるウイルス株に由来するエピトープを含む組換えウイルス様粒子、およびこれらをコードするベクターに関する。
【０００２】
発明の背景
小さな天然の生体分子を、異なる局面で、生物医学、ナノテクノロジーおよび材料科学において使用することに関心が高まっている。ウイルスシミュレーター、ウイルスカプシドまたはウイルス様粒子は、その規則的な構造、その均一な粒子サイズ、その安定性、生産のし易さ、および操作についての可能性から、非常に魅力的である。ウイルス様粒子は動的な構造を有し、その内部に近づくことができ、そしてさらに外被は修飾可能である。適用に依存して、ウイルス様粒子はエンベロープを有してもまたは有していなくてもよく、そしてウイルスシミュレーターとして選択され得る。これらの態様を、薬物送達および生体結合のための、新たな生物学的な実体またはターゲットとして、ワクチンとして、抗体産生のための抗原として、研究ツールとして、診断ツールとして使用し得る。これらのウイルスシミュレーターは、多くのウイルスのエンベロープおよびまたはカプシドタンパク質の自己会合によって形成される。サイズは特定のウイルスの形態に依存して２２〜１５０nmの間で変動する。ウイルスシミュレーターは非感染性である。なぜなら、それらは遺伝子材料を取り込まずに会合しているからである。適用に依存して外来遺伝子材料を本明細書において記載したウイルスシミュレーターに含めることができる。
【０００３】
これらのウイルスシミュレーターの期待される適用は、種々の疾病に対するワクチンの生産である。なぜなら、その反復的で高密度なエピトープのディスプレイは強力な免疫応答を誘起することが多いからである。粒子の小さなサイズは樹状細胞による取り込みに有利である。キメラウイルスシミュレーターはしばしば、選択的な多重エピトープの、多重タンパク質の、多重血清型の、多重株の、または多重種の提示において非常に大きな可能性を与える。
【０００４】
ウイルスシミュレーターの産生のための多くの発現系が存在し、これには、バキュロウイルス／昆虫細胞系、ウイルス発現ベクターで安定にまたは一過性にトランスフェクションまたは形質導入された種々の哺乳動物細胞株、さらに酵母の種々の種（Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastorisを含む）、並びにEscherichia colおよび他の細菌が挙げられる。
【０００５】
ワクチン接種は、感染症から防御するに十分な免疫の発生に依存する。最も使用される弱毒化ウイルスワクチンは、免疫化後の宿主におけるウイルスの少ない複製に依拠する。しかしこの種類のワクチン接種は、いくらかの患者において重度の反応を引き起こす可能性がある。それ故、サブユニットワクチンとしてのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の開発が有益である。なぜなら、この粒子は一般的にＤＮＡまたはＲＮＡゲノムを欠失しているが、天然ウイルスの真正のコンフォメーションを有しているからである。
【０００６】
ワクチン接種は、例えば季節性またはパンデミックなインフルエンザ大流行などの脅威に対する最も強力で対費用効果の高い対応策の１つである。エアロゾルとして蔓延し易いことおよび特に感受性のあるヒトの重度の病気の原因であることが、なぜインフルエンザが最も壊滅的なウイルス疾病の１つであるかの主要な理由である。現在認可されている季節性ワクチンはほんの部分的に防御性であり、そして卵に基づいた生産は非常に時間がかかり費用が大きい。この戦略は、ワクチンとあまり一致していないか全く一致していない流行株の予期せぬ出現に対して脆弱である。トリインフルエンザまたは他の起源のインフルエンザ株が出現する危険性に因り、新たなワクチンアプローチが必要である。
【０００７】
別の局面において、ＨＣＶ、ＨＩＶ、エボラなどのいくつかの重要なウイルスの分野の研究は、バイオセイフティー問題から非常に困難である。現在までにウイルス侵入およびウイルス輸送の調査のためのモデルは僅かしか存在しない。診断ツールは、適切な非感染性ウイルスモデルがないために、これらのウイルスのゲノムに基づく。
【０００８】
現在市販されているヒトインフルエンザワクチンは、その唯一のまたは主要なウイルス抗原として赤血球凝集素を含む。その生産は、発育鶏卵上で、またはより最近では哺乳動物細胞の組織培養液中で増殖させたウイルスから始まる。卵中での生産は、高い収量のリアソータントウイルス株の選択を必要とし、容量が少なく、時間がかかり（６〜８カ月）、そして費用が高い。その他にそれは卵タンパク質に対してアレルギーのあるワクチン接種を受けるヒトに問題を引き起こす可能性がある。生産は、非致死性のトリ株でのみ可能である。卵に基づいた生産の最も重要な欠点の１つは少ない容量である。パンデミックの場合、長期でさらにより致死的な事象をもたらし得るパンデミックインフルエンザワクチンの生産を優先するために、季節性インフルエンザワクチンの生産を停止しなければならない。
【０００９】
ウイルス疾病に対するワクチンは、伝統的に、弱毒化ウイルス株または感染性ウイルスの不活性化に依拠する。適切な環境が、高度に病原性または出血性のウイルスのために必要であり、このためバイオセーフティレベル（例えばＢＬ３／ＢＬ４）のために生産能が制約される。ヒトパピローマウイルスのようないくつかのウイルスでは、前記ウイルスはin vitroにおいて増殖できないために、弱毒化は十分ではないだろう。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）様粒子に基づいたワクチン（ガーダシル、サーバリックス）の生産能が、女性の子宮頸癌の予防に対する見通しを変化させた。
【００１０】
トリインフルエンザまたは他の起源の株が出現する危険性に因り、増強された防御をもたらす新たなワクチンアプローチが必要である。
【００１１】
発明の要約
本発明は、（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、２個以上の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、組換えウイルス様粒子に関する。これらの組換えウイルス様粒子はワクチンとして有用であり、そして本発明はこれらのワクチンに関する。
【００１２】
さらに、本発明は、（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質をコードする２個以上のポリヌクレオチドを含むベクター、並びにこれらのベクターを含む宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】多重エピトープウイルス様粒子を発現するベクター構築物の図解。（Ａ）（配列番号１）Ｈ１Ｎ１ウイルス株（Ｍ１、Ｍ２）並びにＨ３Ｎ２（ＨＡ、ＮＡ）ウイルス株に由来する異なるエピトープを含む多価インフルエンザＡ型ウイルスシミュレーター。（Ｂ）（配列番号２）血清型ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に由来するエピトープ（Ｌ１）を含むキメラヒトパピローマウイルス様粒子。（Ｃ）（配列番号３）インフルエンザＢ型／フロリダ単離株に由来する包埋されたエピトープ（ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２）を有する発現ベクター構築物。（Ｄ）（配列番号４）ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８血清型のエピトープ（Ｌ１）の発現のためのベクター構築物（両方の遺伝子が異なるプロモーターの制御下にある）（Ｅ）（配列番号５）プロモーターｐ１０の欠失した（Ｂ）と同じベクター構築物。ベクターは、ｐｏｌｈから選択される２つのプロモーターＰ１およびＰ２
【数１】
、ｐ１０およびｐＸＩＶ超後期バキュロウイルスプロモーター、ｖｐ３９バキュロウイルス後期プロモーター、ｖｐ３９ｐｏｌｈバキュロウイルス後期／超後期ハイブリッドプロモーター、ｐｃａ／ｐｏｌｈ、ｐｃｎａ、ｅｔｌ、ｐ３５、ｅｇｔ、ｄａ２６バキュロウイルス初期プロモーター；ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＵＢｃ．ＥＦ−１、ＲＳＶＬＴＲ、ＭＴ、ＰＤＳ４７、Ａｃ５、ＰＧＡＬおよびＰＡＤＨを含む。転写終結配列Ｔ１およびＴ２（Ｔ）は、ＳＶ４０、ＨＳＶｔｋまたはＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）から選択される。さらにベクターは、ＭｕｌｔｉＢａｃｂａｃｍｉｄの生成のためのトランスポゾン部位ＴｎＬおよびＴｎＲ（Ｌ、Ｒ）、部位特異的相同的組換え（プラスミド融合）のためのｌｏｘＰ部位（ＬＰ）、複製起点（Ｏ）、アンピシリン（Ａ）およびゲンタマイシン（Ｇ）耐性遺伝子、並びに規定の制限酵素部位を含む。
【図２】発現されたキメラインフルエンザウイルス様粒子の分析。（Ａ）分泌ＶＬＰ（Ａ、レーン２）並びに細胞内ＶＬＰ（配列番号１から調製、レーン１）のコンフォメーションを、タンパク質ＨＡ（Ｈ３）、ＮＡ（Ｈ３）およびＭ２（Ｈ１）に対する特異的な抗体を使用したイムノブロットによって確認する。レーン３＝ラダー、タンパク質サイズ（ｋＤａ）。エピトープは同じ場所に局在し、これはそれらが１つの粒子に会合していることを意味する。（Ｂ）酢酸ウラニルを用いての陰性染色を使用した電子顕微鏡によるキメラインフルエンザウイルス様粒子（配列番号３から調製）の可視化。エピトープＨＡを示すスパイクが見える。粒子のサイズは５０〜８０nmの範囲である。
【図３】配列番号１から調製された分泌された多重エピトープインフルエンザウイルス様粒子のクロマトグラフィーによる精製および分析。（Ａ）ゲルろ過精製のクロマトグラム。最初のピーク（１）はウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。他のピーク（２〜６）はコンタミタンパク質を示す。（Ｂ）クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＶＬＰを含むピークの最初の部分（レーン１）、中間の部分（レーン２）および最後の部分（レーン３）を示す最初のピーク（１）に由来する異なる画分を分析することによってウイルス様粒子の多重エピトープが確認される。ラダー［ｋＤａ］を最初のレーンの左に示す。エピトープの検出を矢印によって示す。（Ｃ）抗ＨＡ抗体を使用してクーマシー染色したゲルによるウェスタンブロット分析。
【図４】天然様インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の機能性。精製ＶＬＰ（配列番号３から調製）の２倍連続希釈シリーズ（１：２から１：２０４８）を、標準的な赤血球凝集アッセイによって分析する。５０μLの精製した粒子溶液を、赤血球（red blood cells）（赤血球、erythrocytes）と共にインキュベーションした９６ウェルプレート上にコーティングする。インフルエンザＶＬＰ（１、上の部分）は用量依存的に赤血球を凝集させることができる。最も高い希釈度は１：１０２４である。これとは対照的に、対照（Ｃ）として使用したＰＢＳでは赤血球の沈降だけが起こり、ウェルの中央に「ドット」として見える。
【図５】多重エピトープインフルエンザウイルス様粒子のin vivoにおける評価。マウスに、配列番号３から調製された５０ng（マウス１〜５）または１００ng（マウス６〜１０）の精製ＶＬＰのいずれかを用いて、そして対照としてＰＢＳ（マウス１１〜１２）を用いて免疫化する。初回注射後（注射から３週間後）の抗体力価を白いボックスとして示し、ブースト注射後（注射から６週間後）の力価を黒いボックスとして示す。力価を、マウス血清の希釈度（ｙ軸）として示す。ＶＬＰは抗体免疫応答を効果的に刺激する。免疫化を１００μl（マウス６〜１０）を用いて実施した場合に最善の結果が得られ、このことは用量依存的な免疫応答を示す。抗ＶＬＰ抗体の量の明確な増加がブースト後に観察される。予期したように、対照動物（マウス１１〜１２）は免疫応答を全く示さなかった。
【図６】赤血球凝集阻害アッセイによる多重エピトープインフルエンザＶＬＰに対する特異的な免疫応答の確認。ＥＬＩＳＡ試験を、注射から６週間後に採取した血清を用いて実施し、特異的な抗ＨＡ抗体の存在を分析した。配列番号３から調製した多重エピトープウイルス様粒子を９６ウェルプレート上にコーティングし、血清と混合し、そして３０分間インキュベーションした。血清を２倍希釈液シリーズ（１：２から１：１０２４）中で試験した。インキュベーション後、赤血球を加え、そしてさらに３０分間インキュベーションした。多重エピトープウイルス様粒子に結合する異なるマウスに由来する特異的な抗インフルエンザＨＡ抗体により、１：１２８（１）の希釈度および１：２５６（２）の希釈度まで赤血球の凝集が阻害され、これはウェルの中央に赤血球の沈降（「ドット」）として見られる。対照マウスの血清試料（Ｃ）では赤血球凝集阻害は観察されない。
【図７】５０mLのバイオリアクターを使用した最善の発現条件のスクリーニング。１〜２×１０６個の細胞／mLの範囲の最初の細胞量（ＴＯＩ、１または２）、ウイルス接種材料（ＭＯＩ、０．０１〜２）および収集時刻（感染後の日数、２日後から６日後）をドットブロット分析によって決定した。（Ａ）対照として使用する唯１つのエピトープＬ１を有する発現構築物の最善の発現パラメーターの決定。特異的な抗ＨＰＶ１８抗体（Abcam）による検出。（Ｂ）異なる血清型に由来する２つのエピトープを有する多重エピトープ発現構築物の最善の発現パラメーターの決定（配列番号２）。２つのエピトープＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１に対する、特異的な抗ＨＰＶ１６抗体（Camvir, Santa Cruz）および抗ＨＰＶ１８（Abcam）抗体による検出。
【図８】配列番号２から調製される多重エピトープヒトパピローマウイルス様粒子のクロマトグラフィーによる精製および分析。（Ａ）ＤＥＡＥ−セファロースカラムを使用した陰イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラム。通過画分（１）、洗浄（２）および溶出ピーク（３〜５）を番号（１〜５）によって示す。溶出緩衝液の増加したイオン強度は線［％］によって示される。３＝３００mM ＮａＣｌを用いての溶出、４＝４２０mM ＮａＣｌを用いての溶出、５＝６８０mM ＮａＣｌを用いての溶出。（Ｂ）クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ウイルス様粒子の多重エピトープの存在を、クロマトグラムの異なる部分を分析することによって確認した。レーン１＝ラダー［ｋＤａ］、レーン２＝精製前のＶＬＰ、レーン３＝洗浄工程、レーン４＝３００mM ＮａＣｌを用いての溶出、レーン５＝４２０mM ＮａＣｌを用いての溶出、レーン６＝５００mM ＮａＣｌを用いての溶出、レーン７＝６８０mM ＮａＣｌを用いての溶出。エピトープを矢印（Ｌ１）によって示す。（Ｃ）矢印（Ｌ１）によって示される２つのエピトープに対する特異的な抗体を使用したクーマシー染色したゲルを用いてのウェスタンブロット分析。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、産生のための組換えＤＮＡ技術および細胞培養技術に基づいて、ワクチン、診断ツールおよびＲ＆Ｄツールとして使用するための新たなウイルス様粒子を産生することを目的とする。本発明の粒子は、可能性のあるパンデミックインフルエンザの大流行と戦うに適したワクチンへの要求を充足する。本発明の組換えウイルス様粒子は、（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、いくつかの、特に２個以上、例えば２個、３個、４個もしくは５個、またはまた３の倍数、例えば６個、９個もしくは１２個の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を取り込んだ、ポリペプチド鎖によってアセンブルされている。その後、これらのエピトープは粒子表面上にディスプレイされる。異なる株、異なる血清型および／または異なる宿主に特異的なウイルスに由来するエピトープの選択により、天然で起こるような、例えば２００９年４月のブタインフルエンザの大流行中に観察されたようなウイルスの天然の変化を模倣した多機能性のウイルス様粒子が得られる。当技術分野において最新技術のウイルス様粒子は、単一のタンパク質から構成されるか、または同じウイルス株に由来する３個までの異なるエピトープを含むかのいずれかである。本発明の粒子は、昆虫細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞などの宿主細胞における産生のために使用される、単一のＤＮＡベクター（ウイルスまたはプラスミドのいずれかに基づく）によってコードされる。好ましい態様において、ＤＮＡベクターはバキュロウイルスベクターであり、そして宿主細胞は昆虫細胞である。
【００１５】
本発明のエピトープは、４〜１０００アミノ酸、好ましくは６〜１００アミノ酸からなる免疫原性ペプチドであり、そして好ましくは中和エピトープである。中和エピトープは、抗体に結合した場合、免疫原性応答の結果として、このような中和エピトープを有するウイルスの中和をもたらすエピトープである。本明細書において理解されるようなエピトープは反復性であり得、そしてより大きなタンパク質の一部、特に抗原の一部、ウイルス表面タンパク質の一部またはウイルス膜タンパク質の一部であり得る。ウイルス表面タンパク質またはウイルス膜タンパク質に取り込まれたこのようなエピトープが好ましい。本発明によるウイルス様粒子の目的とする使用がＲ＆Ｄツール、診断ツールまたはウイルスシミュレーターとしてである場合、エピトープは、完全なウイルス型表面を与える完全なウイルスタンパク質の一部であることが重要である。
【００１６】
本発明の異なるウイルス株は、例えば、インフルエンザウイルスの異なる株、例えば、インフルエンザウイルスＡ型のＨ１Ｎ１株、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ９Ｎ１株、Ｈ１Ｎ２株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ３Ｎ２株もしくはＨ９Ｎ２株、またはまたインフルエンザウイルスＢ型もしくはインフルエンザウイルスＣ型である。
【００１７】
本発明の異なる血清型は、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の異なる血清型、例えば血清型６、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、４８、５２、５８、６２、６６、６８、７０、７３および８２であるが、癌原遺伝子型ＨＰＶ５、８、１４、１７、２０および４７に由来し、またはまたパピローマ関連型ＨＰＶ６、１１、１３、２６、２８、３２および６０に由来する。
【００１８】
異なる宿主に特異的なウイルス株は、対応する宿主に特に適応することを意味し、そしてこれは例えば、ヒトインフルエンザウイルス株、ブタインフルエンザウイルス株およびトリインフルエンザウイルス株である。これに関して、宿主に特異的とは、ウイルスがある宿主から同じタイプの別の宿主へと容易に伝染するが、異なるタイプの宿主には伝染しないことを意味する。例えば、トリウイルス株は、トリから他のトリへと容易に伝染するが、他の動物またはヒトには伝染しない。
【００１９】
好ましい態様において、異なる株、異なる血清型および／または異なる宿主に特異的なウイルスに由来するエピトープを含む粒子を、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープと合わせて、より広範な免疫応答を誘導する。
【００２０】
別の好ましい態様において、ウイルス様粒子は、場合によりさらにカプシドおよびヌクレオポアタンパク質を含む、完全なウイルス様表面を形成するタンパク質からなる。
【００２１】
本発明のウイルス様粒子は、蛍光タンパク質、粒子の精製目的のためにまたは標識を付着するために有用なタンパク質、並びに輸送プロセスおよび安定性のために必要とされるタンパク質性構造をさらに含み得る。
【００２２】
本明細書において記載したポリペプチドおよびウイルス様粒子は、特異的な遺伝子およびプロセス工学ツールの使用に因り、実際のワクチン製造プロセスと比較して、より短い時間および無制限な量で生産される。現代の分子生物学的方法、例えばＭｕｌｔｉＢａｃ技術（WO 2005/085456; I. Berger et al., Nature Biotechnology 22, 1583, 2004）、Ｐｏｌｙｂａｃ技術（WO 2007/054250）、または遺伝子合成などによって必要とされるウイルス遺伝子を会合させる能力は、例えば、コードＤＮＡベクターの迅速な会合を可能とする。これらの技術の使用は、本発明のウイルス様粒子およびワクチンの開発、製造または投与中における、元来の危険な可能性のあるウイルスの物理的な移動を全く必要としない。本発明の粒子の構築のために、感染個体からのヌクレオチド配列を使用することで十分である。これは、種株ウイルスとして遺伝子的に改変されたウイルスを必要とする、古典的な卵に基づいたワクチンを生成するための方法とは大きな違いである。本発明の粒子は、現代の使い捨ての組織培養技術を使用して製造され、これは高い生産能を可能とする。宿主細胞としてのバキュロウイルスベクターおよび昆虫細胞の好ましい態様において、製造プロセスを迅速にセットアップでき、そして生産時間は短く、すなわち、卵に基づいた方法と比較して数カ月ではなく数週間の範囲である。さらに、使い捨て組織培養器具の構築は、卵に基づいた器具をセットアップするのに比べて、時間も費用もあまりかからない。結果として、全人口に対する大量のワクチンを短い時間枠で生産および再生産することができ、そしていくつかの異なるタイプのワクチン、例えば季節性インフルエンザワクチンおよびパンデミックインフルエンザワクチンを容易に並行して生産することができる。卵に基づいたワクチン製造工場の容量限界に因る、あるワクチンまたは他のワクチンにするかの保険衛生当局による困難な決定は必要ない。
【００２３】
本発明は、（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、２個以上、例えば２個、３個、４個もしくは５個、またはまた３の倍数、例えば６個、９個もしくは１２個の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、組換えウイルス様粒子に関する。好ましいのは、３個以上、好ましくは４個以上の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、組換えウイルス様粒子である。同様に好ましいのは、３の倍数、例えば６個、９個もしくは１２個の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、組換えウイルス様粒子である。エピトープは、２個の異なる株、異なる血清型もしくは異なる宿主に特異的なウイルス株から、または３個の異なる株、異なる血清型もしくは異なる宿主に特異的なウイルス株から、または４個の異なる株もしくは血清型から選択される。好ましいのは、３個の異なる株または血清型に由来するいくつかのエピトープを含むウイルス様粒子である。同様に好ましいのは、２個または３個の異なる宿主に特異的なウイルス株に由来するいくつかのエピトープを含むウイルス様粒子である。
【００２４】
さらに、本発明は、（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、エピトープを、またはエピトープを含む異なるタンパク質をコードする、２個以上、例えば２個、３個、４個もしくは５個、またはまた３の倍数、例えば６個、９個もしくは１２個の異なるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００２５】
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」は、１２〜３０００ヌクレオチドの鎖を示し得、一般的に呼称されるオリゴヌクレオチドを含み、そして記載の異なるウイルス源に由来するウイルス遺伝子またはオープンリーディングフレーム、特に、ウイルス表面タンパク質またはウイルス膜タンパク質をコードする遺伝子またはオープンリーディングフレームであり得る。
【００２６】
好ましいのは、本明細書において前記した好ましいウイルス様粒子をコードするベクターである。
【００２７】
最も好ましいのは、配列番号１〜５から選択されるポリヌクレオチド配列を含むベクターである。
【００２８】
好ましい態様において、本発明のウイルス様粒子は、
（１）同じウイルスの２個または３個の異なる株または血清型に由来する、同じ型の表面タンパク質；
（２）異なるウイルス株に由来する、例えばインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１株およびＨ１Ｎ１株に由来する、２個を超える異なる表面タンパク質の混合物；
（３）異なる宿主に特異的なウイルス、例えばブタ、ヒトおよび／またはトリ宿主に特異的なインフルエンザウイルスの合わせられた、異なる表面タンパク質の混合物
を含む。
【００２９】
本発明のウイルス様粒子に含めようとするエピトープ源として考えられるウイルスは、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、デング、ＨＣＶおよびニューカッスル病ウイルスである。エピトープを、他のウイルスからおよび細菌から得てもよい。特に好ましいのはインフルエンザウイルスである。等しく好ましいのはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である。
【００３０】
考えられるベクターはＤＮＡベクターであり、そしてプラスミドベクターまたはウイルスベクターのいずれかであり得る。このようなベクターを会合させる方法は、分子生物学の技術分野の最新技術の標準的な方法である。好ましい方法は、ＣＡＰ（登録商標）技術および当技術分野の最新技術の遺伝子合成技術と合わせた、WO 2005/085456およびI. Berger et al., Nature Biotechnology 22, 1583, 2004に記載のようなＭｕｌｔｉＢａｃ、または例えばWO 2007/054250に記載のようなＰｏｌｙｂａｃ法である。これらの技術は、異なる宿主細胞における発現に適した多重遺伝子同時発現ＤＮＡベクターの会合を可能とする。本発明の好ましいＤＮＡベクターはバキュロウイルスベクターである。
【００３１】
本発明のベクターの発現のために使用される宿主細胞は、原核細胞発現細胞株（例えばE.coli）であっても、または真核細胞発現細胞株であってもよい。好ましいバキュロウイルスベクターの発現のために、昆虫細胞株が好ましい。昆虫細胞株の例は、例えば、ＳＦ９、ＳＦ２１、Ｈｉ−５、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｆ＋およびＳ２シュナイダー細胞である。真核細胞系における発現のために、哺乳動物細胞、特にヒト細胞、例えばＨｅＬａ、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＭＴ−２、骨髄線維芽細胞、一次ニューロン細胞、または胚細胞が好ましい。酵母における発現のためには、S. cerevisiae、S. pombe、C. albicans、またはP. pastoris細胞が使用され得る。
【００３２】
本発明による宿主細胞の培養および増殖を、特定の宿主細胞のための適切な条件を提供する、任意の容器、バイオリアクターまたは使い捨てユニットにおいて行なうことができる。
【００３３】
本発明のウイルス様粒子をワクチンとして使用することができる。さらに、それらを、診断ツールにおける抗原として、抗体生成のための抗原として、並びに研究および開発ツール（例えばウイルス侵入研究およびウイルス−宿主相互作用の研究）のためのウイルスシミュレーターとして使用し得る。
【００３４】
本発明によるワクチンは、当技術分野の最新技術において公知であるような、粘度調節化合物、安定化化合物および／または免疫原性を高めるアジュバントを場合によりさらに含む、水溶液中の組換えウイルス様粒子を含む。
【００３５】
特定の態様において、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス様粒子を、Berger et al., Nature Biotechnology, 2004、WO 2005/085456およびWO 2007/054250の方法およびＣＡＰ（登録商標）技術を使用して構築する。Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ型／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８３４の少なくとも１つのＭ１およびＭ２遺伝子を、ＰＣＲ増幅によって導入ベクターｐＦＬ（WO 2007/054250、図１）に、インフルエンザＡ型／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７のＨＡ遺伝子およびインフルエンザＡ型／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７のＮＡ遺伝子と一緒にクローニングする。構築物をＤＮＡシークエンスによって確認する。
【００３６】
別の特定の態様において、同じクローニング技術を使用して、導入ベクターｐＦＬにクローニングされた、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両血清型、または２、４、６、１１、３１、３３〜３５、３９、４０〜４５、５１〜５３、５５〜５９、６２、６６、６８、７０、７３および７７の群に由来するさらに他の血清型の少なくとも１つのＬ１遺伝子を導入する（図１）。
【００３７】
実験部
E.coli細胞における増殖を可能とするＭｕｌｔｉＢａｃまたはＹＦＰＭｕｌｔｉＢａｃ（WO 2005/085456）と名付けられたバキュロウイルスベクター、およびＣＡＰ（登録商標）技術を、従来のシステム（Fitzgerald et al., Nature Methods, 3, 1021, 2006）を使用して組換えＡｃＮＰＶｓ（Autographa californica核多角体病ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）、バキュロウイルス）を生成するために使用する。１０ngの多重遺伝子ベクターを、ＤＨ１０ＭｕｌｔｉＢａｃおよび／またはＤＨ１０ＹＦＰＭｕｌｔｉＢａｃコンピテント細胞において形質転換する。青色／白色スクリーニングおよびＰＣＲによって陽性クローンを選択する。対応するＭｕｌｔｉＢａｃ ｂａｃｍｉｄＤＮＡを、Birnboim & Doly法を使用して単離する。１μgの多重遺伝子ＭｕｌｔｉＢａｃ ｂａｃｍｉｄを、製造業者のプロトコールに従って、トランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ（Roche）を使用して０．９×１０６個のＳｆ２１（Invitrogen）細胞中にトランスフェクションすることによって、組換えＡｃＮＰＶｓを生成する。ウイルスの増殖は、以前に記載されている通りに行なう（Fitzgerald et al., Nature Methods, 3, 1021, 2006）。全ての組換えＡｃＮＰＶの力価を、Bac-to-Bac-マニュアル(Invitrogen)に記載のプラークアッセイによって決定する。感染効率（ＭＯＩ）、細胞数（ＴＯＩ）および収集時刻（ＴＯＨ）のようなタンパク質産生パラメーターを、小規模な発現研究を用いて分析する。
【００３８】
実施例１：発現ベクター構築物の生成
種々の構築物を製造するために、導入ベクターｐＦＬに存在する増殖モジュールＭを（WO 2005/085456およびＣＡＰ（登録商標）技術）、WO 2005/085456に記載の方法に従って使用する。エピトープのＤＮＡを、元のウイルスからウイルスＲＮＡを単離し、その後、ＰＣＲと合わせた逆転写を行なうことによって（インフルエンザウイルスエピトープについて）、または遺伝子合成によって（Geneart社によって提供）のいずれかで得る。逆転写を、製造業者のプロトコールに従って、RevertAid（登録商標）H Minus First strand cDNA合成キット（Fermentas）を使用して実施する。ｃＤＮＡ（２μL）をＰＣＲ反応のための鋳型として使用する。以下の条件を、製造業者のプロトコールに基づいて使用する。５０μLの全容量の反応のために、０．２mM ｄＮＴＰ（ＮＥＢ）、１．２％ＤＭＳＯ、０．５μM逆方向および正方向プライマー（Microsynth）、１０μlの５×Phusion GC反応緩衝液、並びに２ＵのPhusion Hot Startポリメラーゼ（Finnzyme）を使用する。多重遺伝子会合のために適切な制限酵素部位（BstZ17I、SpeI、PmeI、AvrII）をＰＣＲを使用して導入する。ＰＣＲフラグメントを制限酵素で切断し、その後、ライゲーションおよび形質転換プロセスを行ない、導入ベクターに増殖モジュールを組み込む。ライゲーションを、５００ngの鎖状導入ベクター（ｐＦＬ）、４μLのＰＣＲ産物および１ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Fermentas）を使用して４℃で一晩かけて行なう。プラスミドを生成するために、４μLのライゲーション溶液を、５０μlのコンピテントなＤＨ５α細胞に加え、そして氷上で３０分間インキュベーションする。４２℃で３０秒間の熱ショックおよび４℃で２分間の寒冷ショックの後、２００μlのＬＢ培地を加え、そして３７℃および２２０rpmで１時間インキュベーションする。その後、８０μlの細胞懸濁液を、適切な抗生物質（この場合、１００μgのアンピシリンおよび１００μgのゲンタマイシン）を含むＬＢ寒天プレート上に播く。全手順を、全エピトープが導入ベクターに導入されるまで繰り返す。
【００３９】
インフルエンザエピトープは、ＨＡおよびＮＡ遺伝子から選択され（両方共にＨ３Ｎ２／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７株から選択される）、一方、Ｍ１およびＭ２からのエピトープは、Ｈ１Ｎ１／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８３４株から選択される。Ｍ１エピトープはプロモーターｐ１０によって制御され、全ての他のエピトープはポリヘドリンプロモーターｐｏｌｈによって制御される。全てのエピトープは同じベクター構築物上に存在する（図１Ａ、配列番号１）。インフルエンザＢ型／Ｆｌｏｒｉｄａ／２００６単離株は、遺伝子ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２に由来する複数のエピトープを有する構築物を生成するように選択される（図１Ｃ、配列番号３）。ヒトパピローマウイルスエピトープは、癌関連血清型ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に由来する遺伝子Ｌ１から選択され、そして１つのベクター構築物に一体化される。両方のエピトープが、ポリヘドリンプロモーターｐｏｌｈによって制御される（図１Ｂ、配列番号２）。発現収量を向上させるために、さらに他の構築物においてはｐ１０プロモーターを欠失させる（図１Ｅ、配列番号５）。別の構築物においては、ＨＰＶ１６エピトープはｐ１０プロモーターによって制御されるが、ＨＰＶ１８エピトープのためにはポリヘドリンプロモーターｐｏｌｈが選択される（図１Ｄ、配列番号４）。
【００４０】
実施例２：組換えバキュロウイルスの生成
このウイルスは、複数のエピトープをその表面上に提示するウイルス様粒子またはウイルスシミュレーターを生成するための、前記の複数のエピトープを含む。ウイルス様粒子を、種々の適用のために、例えばインフルエンザ分野におけるワクチンとして使用することができる。ＡｃＮＰＶ由来バキュロウイルスは、２００８／２００９−ＶＬＰワクチン接種キャンペーンのためにＷＨＯによって推奨されるウイルス株に由来する複数の異なるエピトープを含む。導入ベクターの全ての遺伝子は、WO2005/085456のプロトコールによる、ＭｕｌｔｉＢａｃ細胞中への部位特異的相同的組換えによって置き換えられる。
【００４１】
１０ngの導入ベクターを１００μlのＭｕｌｔｉＢａｃコンピテント細胞に加え、そして３０分間４℃でインキュベーションする。４２℃で４５秒間の熱ショックおよび４℃で２分間の寒冷ショックの後、４００μlのＬＢ培地を加え、そして細胞溶液を３７℃および２２０rpmで４時間インキュベーションする。異なる希釈液を、種々の抗生物質耐性を含む適切なＬＢ寒天プレート上に播く。青色／白色およびＰＣＲスクリーニングに基づいて、いくつかの正しいＭｌｕｔｉＢａｃクローンを選択する。対応するＭｕｌｔｉＢａｃ ｂａｃｍｉｄＤＮＡを、Birnboim & Doly法を使用して単離する。少なくとも４個のＭｕｌｔｉＢａｃ ｂａｃｍｉｄクローンを、Ｓｆ９またはＳｆ２１のような昆虫細胞の最初のトランスフェクションのために選択して、組換えＡｃＮＰＶ由来バキュロウイルスを生成する。これは、１μgの多重遺伝子ＭｕｌｔｉＢａｃ ｂａｃｍｉｄを、製造業者のプロトコールに従って、トランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ（Roche）を使用して０．９×１０６個のＳｆ２１（Invitrogen）細胞にトランスフェクションすることによって生成される。ウイルスの増殖を、以前に記載されている通りに行なう（Fitzgerald et al., Nature Methods, 3, 1021, 2006; Bac-to-Bac-マニュアル, Invitrogen）。ウイルスを増殖させて容量を増大させ、そして感染力価を増加させ、これをBac-to-Bac-マニュアル（Invitrogen）に従ってプラークアッセイによって決定する。最善の発現構築物は、５０mLの小規模発現実験、次いでブラッドフォードアッセイ（ADV, Cytosceleton）によるタンパク質収量の決定によって決定される。最善の発現体の発現をさらに、複数の異なるエピトープに対する抗体を用いてのウェスタンブロット分析によって確認する（図２Ａ）。
【００４２】
実施例３：昆虫細胞における多重エピトープインフルエンザウイルス様粒子の産生および精製
最善の発現構築物の決定の後、細胞株、細胞数（ＴＯＩ）、組換えウイルス接種材料の量（感染効率、ＭＯＩ）および収集時刻（ＴＯＨ）のようなバイオテクノロジー産生パラメーターを、５０mLのバイオリアクター中において決定する。異なるＴＯＩ、ＭＯＩおよびＴＯＨのマトリックスを、Eibl、RiesenおよびJohn (Bioforum 03/2009)およびFriesen J. (Bachelor thesis, University of Applied Science, Esslingen, Germany)に従って設計する。分泌または細胞内多重エピトープウイルス様粒子の発現を、毎日の試料採取により６〜８日間観察する。細胞内粒子（例えばＨＰＶ）のために、細胞ペレットを、５０mMトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００mM ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を用いて溶解し、そして４℃および８０００×ｇで１０分間遠心分離にかける。上清中に存在するウイルス様粒子のエピトープを、特異的抗体を用いて、ドットブロット装置（Biometra）、次いでウェスタンブロットを使用してさらに確認する。最も高い収量が得られる条件を発現パラメーターとして規定し、３日間から４日間の収集時刻が好ましい。これらの規定されたパラメーターに従って、ウイルス様粒子を、振とうフラスコまたは揺動培養バッグ中のいずれかのfall armywormのSpodoptera frugiperda細胞Ｓｆ９およびＳｆ２１において産生する。多重エピトープインフルエンザウイルス様粒子発現のための、Ｓｆ２１細胞は、以下の条件を用いて選択される：１．５×１０６個の細胞／mL、ＭＯＩ ０．０５および収集時刻は感染から４日後。細胞を、２７℃で二酸化炭素の非存在下、ウシ胎児血清を補充することなく、増殖させる。規定の収集時刻に従って、分泌されたウイルス様粒子を、４℃で５００〜１０００×ｇで２０分間の遠心分離によって回収する。粒子を含む上清容量を、１００ｋＤａのカットオフを有するカセット（Sartocon-Slice 200、SartoriusおよびCentramateOS, PALL）を使用したタンジェンシャルフローろ過による精製のために減少させる。ウイルス様粒子の精製を、計れるクロマトグラフィー法およびスクロース勾配超遠心分離法を用いて実施する。
【００４３】
クロマトグラフィー精製は、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびゲルろ過クロマトグラフィーを使用する多段階精製である。上清を、５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のＦＰＬＣ−システム（AEKTA purifier, GE Healthcare）に接続したＣａｐｔｏＱカラムにのせる。粒子を、５０mMリン酸、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を使用する線形勾配での漸増塩濃度で溶出する。粒子を含む画分をプールし、そしてさらに、ゲルろ過クロマトグラフィーによって精製する（配列番号１からのＶＬＰ、図３）。精製を、５０mMリン酸、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４の緩衝液中で、ＨｉｇｈＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを使用して実施する。全てのクロマトグラフィー工程をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後、クーマシー染色およびイムノブロットによって分析する。
【００４４】
実施例４：精製インフルエンザウイルス様粒子の分析
異なるエピトープの存在を確認するために、精製した材料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後、クーマシー染色またはウェスタンブロットによって分析する。１５０μlの異なるクロマトグラフィー画分を、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル（Invitrogen）にのせ、１５０Ｖで１５分間および１７５Ｖで４５分間流し、そしてSimplyBlueSafestain (Invitrogen)を使用してクーマシー染色する。イムノブロットのためにタンパク質をニトロセルロース膜（BioRAD）に１９Ｖで４０分間かけて半乾燥装置（BioRAD）を使用して転写する。５％無脂肪ドライミルク−トリスＣｌ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）溶液を用いて３０分間かけて非特異的結合部位を遮断した後、膜を、ＨＡ、ＮＡおよびマトリックスタンパク質に対する抗体と共に一晩かけて４℃でインキュベーションする。膜を数回、トリスＣｌ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）緩衝液を用いて洗浄する。一次抗体の起源に依存して、二次抗体は、検出のためのアルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼと接続された抗マウスまたは抗ウサギのいずれかである。これらのタンパク質の同じ場所における局在は、１つの発現ベクターおよび１つのバキュロウイルスの会合およびそれからの産生を示す（図３Ｂ、配列番号１から）。この同じ場所における局在はまた、遺伝子ＨＡ、ＮＡおよび両方のマトリックスタンパク質Ｍ１およびＭ２（その膜アンカーを含む）を含む発現構築物についても示され得る。
【００４５】
実施例５：インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の機能性
ＶＬＰがその表面に赤血球凝集素タンパク質（ＨＡ）を正しく組み込んだかどうかを分析するために、ニワトリ由来の赤血球（ＲＢＣ）を使用する標準的な赤血球凝集アッセイを実施する（図４、配列番号３のＶＬＰ）。精製ＶＬＰの２倍連続希釈を、Ｖ底９６ウェルプレートにおいてＰＢＳ（１×）を用いて行なう。等量の赤血球（１％溶液）を加え、そして１時間４℃でインキュベーションする。ウェルの底上のＲＢＣ凝集体の外見は、赤血球凝集がないことを示す。力価は、ＲＢＣを凝集させる精製ＶＬＰ溶液の最も高い希釈度の逆数として表現される。得られた結果は、ＶＬＰがニワトリ赤血球を凝集させることができ、そしてＶＬＰ表面上におけるＨＡの存在を間接的に示す。陰性対照（ＰＢＳ）は凝集を全く示さない。
【００４６】
実施例６：インフルエンザＶＬＰのin vivoにおける評価
ＶＬＰ（配列番号３から調製）の免疫原性（免疫系の刺激）をin vivoにおいて、それぞれ０週間目および３週間目にプライム・ブースト計画で皮下免疫化を受ける２群のマウスを使用して試験する。免疫化を、５０または１００μl（５０または１００ng）のＶＬＰ懸濁液を使用して実施する。ＶＬＰ単独の免疫応答の品質を決定するために、アジュバントを全く使用しない。マウスを３週間目および６週間目に出血させ、そして血清を、免疫化ＶＬＰに対する抗体応答について調べるために分析する。得られた結果は、ＶＬＰが、抗体免疫応答を刺激するのに効果的であることを示す。最善の結果は、免疫化を１００μlを用いて実施した場合に得られ、このことは用量依存的な免疫応答を示す。抗ＶＬＰ抗体の量の明瞭な増加が、ブースト後に観察される。予期した通り、ナイーブな動物は免疫応答を全く示さない。
【００４７】
免疫応答の特異性を再確認するために、赤血球凝集阻害試験を６週間目に実施して、特異的な抗ＨＡ抗体の存在を分析する。結果は、特異的な抗インフルエンザＨＡ抗体が、１２８希釈度（マウス６）および２５６希釈度（マウス８）まで赤血球の凝集を阻害することができることを示す。ナイーブマウスの血清試料では赤血球凝集阻害は全く観察されない。新たに生成された多重エピトープインフルエンザＶＬＰは用量依存的に免疫系を刺激することができる。免疫系をブーストを用いて再刺激する場合、免疫応答は少なくとも１５倍増加する。誘起された免疫応答の特異性をＥＬＩＳＡおよび赤血球凝集試験によって分析する。
【００４８】
実施例７：種々の細胞株におけるヒトパピローマウイルスエピトープを有する多重エピトープウイルス様粒子の産生および精製
細胞株、細胞数（ＴＯＩ）、組換えウイルス接種材料の量（感染効率、ＭＯＩ）および収集時刻（ＴＯＨ）のようなバイオテクノロジー産生パラメーターを、Eibl et al. (Bioforum 3/2009)に従って５０mLのバイオリアクター（図７）中で決定する。これらの規定されたパラメーターに従って、ウイルス様粒子を、振とうフラスコまたは揺動培養バッグのいずれかの中のfall armywormのSpodoptera frugiperda細胞Ｓｆ９およびＳｆ２１において産生する。多重エピトープパピローマウイルス様粒子は、２×１０６個の細胞／mL、ＭＯＩ ０．５および感染から３日後の収集時刻を使用して、Ｓｆ２１細胞において配列番号２から発現される。細胞を、２７℃で二酸化炭素の非存在下、ウシ胎児血清を補充することなく、増殖させる。規定の収集時刻に（感染から３日後）、細胞内ウイルス様粒子を５００〜１０００×ｇで２０分間４℃での遠心分離によって回収する。細胞を低浸透圧リン酸緩衝液、その後、超音波を使用することによって溶解する。４℃および２０００×ｇでの遠心分離工程後、上清を回収する。ウイルス様粒子の精製を、計れるクロマトグラフィー法およびスクロース勾配超遠心分離法を用いて実施する。クロマトグラフィー精製は、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを使用する多段階精製である。上清を、５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のＦＰＬＣ−システム（AEKTA purifier, GE Healthcare）に接続したＣａｐｔｏＤＥＡＥカラムにのせる。粒子を、５０mMリン酸、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を使用する線形勾配での漸増塩濃度で溶出する（図８Ａ）。粒子を含む画分をプールし、そしてさらに、ヒドロキシアパタイトカラムを使用して精製する。結合を、２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で実施し、その後、５００mMリン酸、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いての線形勾配溶出を実施する。多重エピトープ粒子を磨くために、ゲルろ過クロマトグラフィーを実施する。精製を、ＨｉｇｈＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを使用して５０mMリン酸、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４緩衝液中で実施する。全てのクロマトグラフィー工程をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、その後、クーマシー染色およびイムノブロットによって分析する。
【００４９】
実施例８：精製キメラヒトパピローマウイルス様粒子の分析
精製された材料における異なるエピトープの存在を確認するために、配列番号２から調製したＶＬＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、その後、クーマシー染色および（図８Ｂ）およびウェスタンブロット（図８Ｃ）によって分析する。イムノブロットのために、異なる血清型のＬ１タンパク質に対する抗体を使用する。１５０μlの異なるクロマトグラフィー画分を４〜１２％Ｂｉｓ−トリスＮｕＰＡＧＥゲル（Invitrogen）にのせ、１５０Ｖで１５分間および１７５Ｖで４５分間流し、そしてSimplyBlueSafestain (Invitrogen)を使用してクーマシー染色する。イムノブロットのために、タンパク質を、半乾燥装置（BioRAD）を使用して１９Ｖで４０分間かけてニトロセルロース膜（BioRAD）上に転写する。５％無脂肪ドライミルク−トリスＣｌ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）溶液を用いて非特異的な結合部位を３０分間かけて遮断した後、膜を、Ｌ１エピトープに対する抗体と共に一晩かけて４℃でインキュベーションする。Ｃａｍｖｉｒ抗体（SantaCruz）をＨＰＶ１６検出のために使用し、そしてＨＰＶ１８検出のために抗ＨＰＶ１８ａｂ（Abcam）を使用する。膜を、トリスＣｌ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）緩衝液を用いて数回洗浄する。膜を、検出のためのアルカリホスファターゼと接続された抗マウス抗体と共に１時間インキュベーションする。エピトープを、ＢＣＩＰ／ＮＰＴ溶液によって検出する。これらのタンパク質の同じ場所での局在は、１つの発現ベクターおよび１つのバキュロウイルスのアセンブルおよびそれからの産生を示す。
【００５０】
実施例９：キメラヒトパピローマウイルス様粒子（ＶＬＰ）の機能性
配列番号２から調製したヒトパピローマウイルス様粒子がその表面にＬ１タンパク質を正しく組み込んだかどうかを分析するために、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施する。精製ＶＬＰの２倍連続希釈を、Ｖ底９６ウェルプレートにおいてＰＢＳ（１×）を用いて行なう。等量の血清型特異的抗体（濃度１：１０００）を加え、そして１時間３７℃でインキュベーションする。Ｌ１タンパク質への抗体の適切な結合を、セイヨウワサビペルオキシダーゼを有する二次抗体および化学発光検出システムを使用して検出する。得られた結果は、用量依存的な組換え発現エピトープへの抗体の結合を示す。陰性対照（ＰＢＳ）は全く結合を示さなかった。
【図１Ａ）】
【図１Ｂ）】
【図１Ｃ）】
【図１Ｄ）】
【図１Ｅ）】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、２個以上の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、組換えウイルス様粒子。
【請求項２】
３個以上の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、請求項１記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項３】
４個以上の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、請求項１記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項４】
６個、９個または１２個のエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、請求項１記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項５】
エピトープが、３個以上の異なるウイルス株または血清型に由来する、請求項１〜４のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項６】
Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープをさらに含む、請求項１〜５のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項７】
完全なウイルス様表面を形成するタンパク質並びに場合によりカプシドおよび／またはヌクレオポアタンパク質をさらに含む、請求項１〜６のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項８】
蛍光タンパク質、粒子の精製目的のためにもしくは標識を付着するために有用なタンパク質、および／または輸送プロセスのために必要とされるタンパク質性構造をさらに含む、請求項１〜７のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項９】
ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項１〜８のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項１０】
ウイルスが、ヒトパピローマウイルスである、請求項１〜９のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項１１】
（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質をコードする２個以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか記載の組換えウイルス様粒子をコードする、請求項１１記載のベクター。
【請求項１３】
バキュロウイルスベクターである、請求項１１または１２記載のベクター。
【請求項１４】
配列番号１〜５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか記載の組換えウイルス様粒子を含むワクチン。
【請求項１】
（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、２個以上の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、組換えウイルス様粒子。
【請求項２】
３個以上の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、請求項１記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項３】
４個以上の異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、請求項１記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項４】
６個、９個または１２個のエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質を含む、請求項１記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項５】
エピトープが、３個以上の異なるウイルス株または血清型に由来する、請求項１〜４のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項６】
Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープをさらに含む、請求項１〜５のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項７】
完全なウイルス様表面を形成するタンパク質並びに場合によりカプシドおよび／またはヌクレオポアタンパク質をさらに含む、請求項１〜６のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項８】
蛍光タンパク質、粒子の精製目的のためにもしくは標識を付着するために有用なタンパク質、および／または輸送プロセスのために必要とされるタンパク質性構造をさらに含む、請求項１〜７のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項９】
ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項１〜８のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項１０】
ウイルスが、ヒトパピローマウイルスである、請求項１〜９のいずれか記載の組換えウイルス様粒子。
【請求項１１】
（ａ）同じウイルスの異なるウイルス株および／または（ｂ）同じウイルスの異なる血清型および／または（ｃ）異なる宿主に特異的な異なるウイルス株のいずれかから選択される、異なるエピトープまたはエピトープを含む異なるタンパク質をコードする２個以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか記載の組換えウイルス様粒子をコードする、請求項１１記載のベクター。
【請求項１３】
バキュロウイルスベクターである、請求項１１または１２記載のベクター。
【請求項１４】
配列番号１〜５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか記載の組換えウイルス様粒子を含むワクチン。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【公表番号】特表２０１２−５２５１３３（Ｐ２０１２−５２５１３３Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０７７８３（Ｐ２０１２−５０７７８３）
【出願日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５９４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２５２０１
【国際公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【出願人】（５１１２６５７１８）レッドバイオテック・アーゲー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＤＢＩＯＴＥＣ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５９４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２５２０１
【国際公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【出願人】（５１１２６５７１８）レッドバイオテック・アーゲー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＤＢＩＯＴＥＣ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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