妊娠中毒症の検知方法及び検知キット
【課題】妊娠中毒症やその重症度等を鋭敏かつ正確に検知できる方法及びキットを提供すること。
【解決手段】検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との複合体」及び／又はビクニンを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法。次の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット；（Ａ）ヒアルロン酸結合性タンパク質、（Ｂ）抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体。次の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット；（Ａ）ビクニン、（Ｂ）抗ビクニン抗体。検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との複合体」又はビクニンの量が多ければ、妊娠中毒症である又は妊娠中毒症である可能性が高いと関連づけることができる。
【解決手段】検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との複合体」及び／又はビクニンを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法。次の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット；（Ａ）ヒアルロン酸結合性タンパク質、（Ｂ）抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体。次の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット；（Ａ）ビクニン、（Ｂ）抗ビクニン抗体。検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との複合体」又はビクニンの量が多ければ、妊娠中毒症である又は妊娠中毒症である可能性が高いと関連づけることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠中毒症の新規な検知方法及び検知キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類中で使用する略号は以下の通りである。
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin）
ＨＡ：ヒアルロン酸（hyaluronic acid；hyaluronan）
ＨＡＢＰ：ヒアルロン酸結合性タンパク質（hyaluronan binding protein）
ＨＲＰ：ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）
ＩＴＩ：インター−α−トリプシンインヒビター（inter-alpha-trypsin inhibitor）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩液（phosphate buffered saline）
ＰＢＳ−Ｔ：0.1％のTween 20を含有するＰＢＳ
ＲＯＣ曲線：受診者動作特性曲線（receiver operating characteristic curve）
ＳＨＡＰ：血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質（serum-derived hyaluronan associated protein）
ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体：ＳＨＡＰとＨＡとの複合体
ＴＭＢ：3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine）
ＵＴＩ：ビクニン（bikunin）
妊娠中毒症は、妊娠に高血圧、蛋白尿、浮腫の一つ又は二つ以上の症状がみられ、かつこれらの症状が単なる妊娠偶発合併症によるものでないもので、妊娠２０週以降に発症し分娩後１２週までに正常に復するものをいう。妊娠中毒症は、子宮内胎児発育遅延を合併したりすることがあるため、早期にこれを検知し、食事療法や薬物療法を施す必要がある。また妊娠においては母子ともに安全であることが強く求められるため、妊娠中毒症と診断された場合には、その妊娠中毒症が軽症か重症かなどの適切な評価が重要になる。
【０００３】
以下、本発明に最も近いと考えられる先行技術について説明する。
【０００４】
非特許文献１には、子癇前症（preeclampsia）を伴う妊婦において、血清中のＨＡ濃度が上昇することが記載されている。
【０００５】
しかし、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体やＵＴＩを測定することによって、妊娠中毒症の有無やその重症度を検知すること等については記載も示唆もない。
【０００６】
特許文献１には、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を、抗ＩＴＩ抗体と反応させて抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）の複合体を形成させ、この複合体を測定することを特徴とする検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の測定方法やこれに供するキットが記載されている。また同文献には、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定し、それによって関節炎や肝疾患を診断することが記載されている。
【０００７】
しかし、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体やＵＴＩを測定することによって、妊娠中毒症の有無やその重症度を検知すること等については記載も示唆もない。
【０００８】
【非特許文献１】オスメルス、Ｒ．Ｇ．Ｗ．（Osmers, R.G.W.）ら，１９９８年，アメリカン ジャーナル オブ オブステトリクス アンド ガイネコロジー（American Journal of Obstetrics and Gynecology），第１７８巻，第２号，ｐ．３４１−３４５
【特許文献１】特開平１０−８２７８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、妊娠中毒症を鋭敏かつ正確に検知できる方法及びキットを提供することを課題とする。さらに本発明は、妊娠中毒症の重症度を鋭敏かつ正確に検知できる方法及びキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体や、ＵＴＩを測定することによって、妊娠中毒症を鋭敏かつ正確に検知できることを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を測定することによって、妊娠中毒症の重症度を鋭敏かつ正確に検知できることも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び／又はＵＴＩを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法（以下、「本発明方法」という。）を提供する。
また本発明は、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法（以下、「本発明方法１」という。）を提供する。この検体は、血液由来の検体であることが好ましい。
またこのＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定は、免疫測定法によって行われることが好ましい。この免疫測定法は、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることが好ましい。
（１）ＨＡＢＰが固着された固相に、検体を接触させるステップ。
（２）固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出するステップ。
【００１２】
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット（以下、「本発明キット１」という。）を提供する。
（Ａ）ＨＡＢＰ
（Ｂ）抗ＩＴＩ抗体
また本発明は、検体中のＵＴＩを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法（以下、「本発明方法２」という。）を提供する。この検体は、尿であることが好ましい。
【００１３】
またこのＵＴＩの測定は、免疫測定法によって行われることが好ましい。この免疫測定法は、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることが好ましい。
（１）ＵＴＩが固着された固相に、検体と「ＵＴＩに結合するポリペプチド」とを接触さ
せるステップ。
（２）固相に結合した「ＵＴＩに結合するポリペプチド」を検出するステップ。
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット（以下、「本発明キット２」という。）を提供する。
（Ａ）ＵＴＩ
（Ｂ）抗ＵＴＩ抗体
【発明の効果】
【００１４】
本発明方法は、妊娠中毒症を簡便、迅速、鋭敏かつ正確に検知し判別することができることから極めて有用である。なかでも本発明方法１は、妊娠中毒症の有無のみならず、妊娠中毒症の重症度をも簡便、迅速、鋭敏かつ正確に検知し判別することができることから極めて有用である。また本発明キット１及び２は、このような妊娠中毒症の検知や判別をさらに簡便かつ迅速に実施することができることから極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明方法
本発明方法は、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び／又はＵＴＩを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法である。本発明方法においては、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体とＵＴＩの両方を測定してもよく、いずれか一方のみを測定してもよい。以下、本発明方法１と２とに分けて説明する。
＜１＞−１ 本発明方法１
本発明方法１は、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法である。
本発明方法１は、妊娠中毒症の動物の検体中ではＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が有意に増加することが本発明により明かとなったことから、これを妊娠中毒症の検知方法として応用したものである。
ここにいう「検体」は、妊娠中毒症によって当該検体に含まれるＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の量が変動するものである限りにおいて特に限定されない。このような検体としては、妊娠中毒症によってＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の量が変動する生体組織に由来するものや、体液に由来するもの等が例示される。
体液に由来するものとしては、例えば血液由来の検体を例示することができる。ここにいう「血液由来の検体」の用語には、血液そのものや、血液に何らかの処理を施して得られる検体等が包含される。「血液に何らかの処理を施して得られる検体」としては、例えば、血液の血球成分から分離することにより得られるもの（例えば血清や血漿等）や、血液から精製されたＳＨＡＰ−ＨＡ複合体画分等が例示される。なかでも血清又は血漿であることが好ましく、血清であることが特に好ましい。
また、検体が由来する動物は、妊娠中毒症を引き起こす可能性がある哺乳動物である限りにおいて特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定の方法は、検体中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出し測定しうる方法である限りにおいて特に限定されない。なお、本発明における「測定」の用語は、ある物質を定量的に測定することのみならず、定性的に測定すること（ある物質の存否を検出すること）をも含む概念である。
このような検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定は、例えば物理化学的方法（例えばクロマトグラフィー法など）や、生物学的方法（例えば免疫測定法など）によって行うことができる。なかでも、簡便性や迅速性等の観点から、免疫測定法によって行うことが好ましい。免疫測定法としては、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）や、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等が例示されるが、いずれの方法も採用することができる。
【００１６】
なお、本出願書類における「免疫測定法」の用語には、抗原抗体反応を利用した測定法のみならず、生体分子同士の親和性（例えば、ＨＡＢＰとＨＡとの親和性等）を利用した測定法も包含される。
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を免疫測定法によって測定する場合には、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることが好ましい。
（１）ＨＡＢＰが固着された固相に、検体を接触させるステップ。
（２）固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出するステップ。
以下、これらのステップごとに説明する。
ステップ（１）：
ステップ（１）は、ＨＡＢＰが固着された固相に、検体を接触させるステップである。
【００１７】
ＨＡＢＰが固着される固相は、ＨＡＢＰを固着させることができ、かつ、水、検体や反応液に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウエル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、微粒子状固相担体（ゼラチン粒子、カオリン粒子、ラテックス等の合成ポリマー粒子等）等を例示することができる。なかでも、正確な定量性と使用上の簡便性の点から、マイクロプレートが望ましい。
【００１８】
固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリアロマー、ポリエチレン、ガラス、アガロース等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
【００１９】
このような固相の表面にＨＡＢＰを固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法などの一般的な方法（例えば、固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を応用することができる。
【００２０】
これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
【００２１】
ＨＡＢＰの物理的吸着の具体的方法の一例として、例えば、ＨＡＢＰの緩衝液溶液を固相に接触させ、０℃〜１０℃程度、好ましくは０℃〜５℃程度で、６時間〜２４時間程度、好ましくは１０時間〜２０時間程度静置する方法が例示される。
【００２２】
また、ＨＡＢＰを固着させた固相の表面には、ＨＡＢＰが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこに検体中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が非特異的に固着すると正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よって、検体を固相に接触させる前に固相にブロッキング物質を接触させ、ＨＡＢＰが固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン（例えばＢＳＡ等）、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、プルロニック等が挙げられる。また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
【００２３】
ブロッキングの具体的方法の一例として、例えば、ＢＳＡの緩衝液溶液を固相に接触させ、０℃〜３７℃程度、好ましくは１０℃〜３０℃程度で、１５分間〜２時間程度、好ましくは３０分間〜２時間程度静置する方法が例示される。
【００２４】
固相と検体との接触方法は、当該固相に固着されたＨＡＢＰ分子と、検体中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ複合体分子とが接触する限りにおいて特に限定されない。例えば、固相に検体を添加して接触させても良く、また検体に固相を添加して接触させても良く、別体の容器に両者を同時に添加しても良い。接触の方法はこれらに限定されるものではなく、固相の形状や材質等に応じて当業者が適宜決定することができる。
【００２５】
これら両者を接触させた後、固相に固着されたＨＡＢＰと検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体とを十分に結合させるために、例えば０℃〜３７℃程度で、３０分間〜２時間程度インキュベートすることが好ましい。
【００２６】
この反応後に固相と液相を分離する。必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄し、非特異的吸着物や反応しなかった検体中の成分を除去することが好ましい。
【００２７】
洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Tween）系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液（例えばＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等）等を用いることができる。
ＨＡＢＰが固着された固相に検体を接触させることにより、検体中に存在するＳＨＡＰ
−ＨＡ複合体におけるＨＡ部分が固相に固着されたＨＡＢＰに結合し、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体がＨＡＢＰを介して固相に結合する。そして、検体中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の量が多ければ、これに対応して、ＨＡＢＰを介して固相に多くのＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が結合することになる。
ステップ（２）：
ステップ（２）は、固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出するステップである。この固相に結合したＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の検出方法も特に限定されず、固相に結合したＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を物理化学的に直接検出してもよく、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合するポリペプチド等を使って検出してもよい。このポリペプチドは、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に特異的に結合するものであることが好ましい。
【００２８】
「ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合するポリペプチド」の一例として、例えば抗ＩＴＩ抗体が例示される。抗ＩＴＩ抗体は、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体のＳＨＡＰ部分に結合する。
ここにいう「ポリペプチド」は、このような抗体自体はもちろん、その抗原結合部位（
Ｆａｂ）を保持するポリペプチド等も包含される。「抗体のＦａｂを保持するポリペプチド」としては、例えば、抗体のＦａｂを含むフラグメント等が例示される。
【００２９】
またここにいう「抗体」は、ポリクローナル、モノクローナルのいずれであってもよいが、特異性、均質性、再現性、大量かつ永続的な生産性等の観点からすると、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３０】
例えば抗ＩＴＩ抗体の製造は、ＩＴＩやＳＨＡＰ−ＨＡ複合体等を抗原として抗体の一般的な製造手法によって行うこともでき、また市販のものを利用することもできる。
【００３１】
抗ＩＴＩ抗体に代表される「ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合するポリペプチド」は、検出を容易とするために標識物質で標識されているか又は標識されるものであってもよい。標識に用いることができる標識物質は、通常のタンパク質の標識に使用可能なものであれば特に限定されないが、例えば酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性同位元素（125I、131I、3Ｈなど）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸(AMCA)、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン(DTAF)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、リスアミンローダミンＢ(Lissamine Rhodamine B)、テキサスレッド(Texas Red)、フィコエリスリン(Phycoerythrin；PE)、ウンベリフェロン、ユーロピウム、フィコシアニン、トリカラー、シアニンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）、ハプテン（ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸(AMP)、２，４−ジニトロアニリンなど）、特異的結合対（ビオチンとアビジン類（ストレプトアビジンなど）、レクチンと糖鎖、アゴニストとアゴニストの受容体、ヘパリンとアンチトロンビンIII(ATIII)のいずれか一方の物質等が例示される。
【００３２】
また、抗ＩＴＩ抗体に代表される「ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合するポリペプチド」を、固相に結合したＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合させた後、さらに当該ポリペプチドに結合する第２のポリペプチド（例えば二次抗体等）を用いて検出してもよい。この第２のポリペプチドは、前記のような標識物質で予め標識されていることが好ましい。
このような「ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合するポリペプチド」や、これに結合する第２のポリペプチドに結合している標識物質を検出することによって、固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出することができる。
【００３３】
標識物質を検出する方法は、標識物質の種類に応じた公知の検出手段を適宜選択することができる。例えば、標識物質として特異的結合対の一方の物質（例えばビオチン）を使用した場合には、これに特異的に結合する他方の物質（例えばストレプトアビジン）を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加して、特異的結合対を形成せしめる。次いで、これに該酵素の基質（例えば過酸化水素（酵素がペルオキシダーゼの場合））及び発色物質（例えばＴＭＢや、ジアミノベンチジン等）を添加して、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度で測定することによって、標識物質を検出することができる。
【００３４】
また、例えば標識物質として放射性同位元素、蛍光色素又は化学発光物質を使用した場合には、放射能のカウント、蛍光強度、蛍光偏光、発光強度等を測定する方法などが例示される。
【００３５】
このような標識物質の検出を介して、固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出することができ、これによって検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を測定することができる。この方法はいわゆるサンドイッチ法であることから、標識物質が多く検出されたとすれば、それだけサンドイッチ状複合体の量が多いこと、すなわち検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が多いこと意味することになる。
【００３６】
ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の定性的な測定（ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の存否の検出）を望む場合には、標識物質の検出の有無をそのまま測定結果とすることができる。また、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の定量的な測定（ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の濃度の測定など）を望む場合には、吸光度、放射能のカウント、蛍光強度、発光強度などをそのままＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の量の指標とすることができる。また、既知濃度のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の標準溶液を用いて予め検量線又は関係式を作成しておき、これを用いて検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体濃度を求めることもできる。
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定結果と妊娠中毒症との関連づけは、以下の通り行うことができる。
【００３７】
本発明により、妊娠中毒症の動物の検体中ではＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が有意に増加することが明かとなった。したがって、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定結果（検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体量）が、健常動物（妊娠中毒症でない動物）における測定結果に比して高い場合には、「妊娠中毒症である」又は「妊娠中毒症である可能性が高い」と関連づけることができる。また、この測定結果が、健常動物における測定結果と同等もしくはそれよりも低ければ、「妊娠中毒症ではない」又は「妊娠中毒症である可能性は低い」と関連づけることができる。
【００３８】
また、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定結果と妊娠中毒症とを関連づけは、「妊娠中毒症の可能性の有無」のみでなく、妊娠中毒症の重症度や、病態の進行の程度の検知も含まれる。本発明により、重症の妊娠中毒症において検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が有意に増加することが明かとなったことから、例えばある個体の検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体量を測定し、これがある一定のレベルよりも高い時には「重症の妊娠中毒症である」又は「重症の妊娠中毒症である可能性が高い」と関連づけることができ、逆に検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体量がある一定レベルよりも低いときには、「軽症の妊娠中毒症である」又は「軽症の妊娠中毒症である可能性が高い」と関連づけることができる。ここにいう「一定レベル」は、後述の実施例に示した「表２」の結果その他に基づいて、当業者が適宜決定することができる。
また、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を定期的に測定し、その量が増加傾向にある場合には「妊娠中毒症が進行している」又は「妊娠中毒症が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。逆に減少傾向にある場合には「妊娠中毒症が改善方向にある」又は「妊娠中毒症が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。また量的に変化がない場合には「妊娠中毒症の進行（改善）に変化がない」又は「妊娠中毒症の進行（改善）に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。これにより、妊娠中毒症のモニタリング等に応用することもできる。
【００３９】
なお、妊娠中毒症との関連づけの基準となる測定結果（検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の量）は、前記の検量線又は関係式を用いて求めた濃度であっても良く、健常動物の検体中における量に対する比であっても良い。
【００４０】
なお本発明は妊娠中毒症の「検知方法」であるが、「スクリーニング方法」や「診断方法」としての思想も包含することはいうまでもない。
＜１＞−２ 本発明方法２
本発明方法２は、検体中のＵＴＩを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法である。
本発明方法２は、妊娠中毒症の動物の検体中ではＳＨＡＰ−ＨＡ複合体のみならず、ＵＴＩも有意に増加することが本発明により明かとなったことから、これを妊娠中毒症の検知方法として応用したものである。
本発明方法２における「検体」は、本発明方法１で説明したものと同様のものを用いることができるが、特に尿であることが好ましい。その他の説明は、前記の本発明方法１におけるＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を「ＵＴＩ」と、ＩＴＩを「ＵＴＩ」とそれぞれ読み替えたものと同じである。
【００４１】
ただし、本発明方法２におけるＵＴＩの測定を免疫測定法によって行う場合には、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることが好ましい。
（１）ＵＴＩが固着された固相に、検体と「ＵＴＩに結合するポリペプチド」とを接触させるステップ。
（２）固相に結合した「ＵＴＩに結合するポリペプチド」を検出するステップ。
以下、これらのステップごとに説明する。
ステップ（１）：
ステップ（１）は、ＵＴＩが固着された固相に、検体と「ＵＴＩに結合するポリペプチド」とを接触させるステップである。
【００４２】
ここにいう「ＵＴＩが固着された固相」、「ＵＴＩに結合するポリペプチド」等の説明については、前記の通り本発明方法１におけるＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を「ＵＴＩ」と、ＩＴＩを「ＵＴＩ」を読み替えたものと同じである。
なお、ステップ（１）における接触は、三者同時であってもよく、ＵＴＩが固着された固相と検体とを接触させた後これに「ＵＴＩに結合するポリペプチド」を接触させてもよく、検体と「ＵＴＩに結合するポリペプチド」とを接触させた後これを「ＵＴＩが固着された固相」に接触させてもよい。接触させた後の処理についても、本発明方法１と同様である。
これら三者を接触させることにより、「検体中に存在するＵＴＩ」と「固相に固着されたＵＴＩ」とが「ＵＴＩに結合するポリペプチド」を奪い合うことになる。その結果、検体に存在するＵＴＩの量が多ければ、固相に結合する「ＵＴＩに結合するポリペプチド」は減少する。逆に検体に存在するＵＴＩの量が少なければ、固相に結合する「ＵＴＩに結合するポリペプチド」は増加することになる。
【００４３】
ステップ（２）：
（２）固相に結合した「ＵＴＩに結合するポリペプチド」を検出するステップ。
固相に結合した「ＵＴＩに結合するポリペプチド」の検出も、前記の本発明方法１における「固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の検出」と同様に行うことができる。したがって、このポリペプチドの検出方法も特に限定されず、物理化学的に直接検出してもよく、この「ＵＴＩに結合するポリペプチド」に結合する第２のポリペプチド等（例えば二次抗体等）を使って検出してもよい。「ＵＴＩに結合するポリペプチド」としては抗ＵＴＩ抗体が例示される（前記の通り、本発明方法１における抗ＩＴＩ抗体を、抗ＵＴＩ抗体と読み替えれば良い）。
固相に結合した「ＵＴＩに結合するポリペプチド」や、これに結合する第２のポリペプチドに結合している標識物質を検出することによって、検体中のＵＴＩを測定することができる。前記の記載から理解されるように、この方法はいわゆる阻害法であることから、固相から標識物質が多く検出されたとすれば、それだけ検体中のＵＴＩが少ないこと意味することになる。
【００４４】
なお、本発明方法１と、本発明方法２を併せて実施することにより、妊娠中毒症の検知の精度をより高めることもできる。
＜２＞本発明キット１
本発明キット１は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キットである。
（Ａ）ＨＡＢＰ
（Ｂ）抗ＩＴＩ抗体
本発明キット１は、前記の本発明方法１に従って妊娠中毒症の有無の検知や、重症度の検知等に用いることができる。
本発明キット１の構成成分であるＨＡＢＰは、前記の通り固相に結合させるために用い
られる。このＨＡＢＰは、予め固相に固着した状態で本発明キット１の構成成分としてもよい。
【００４５】
また、本発明キット１の構成成分である抗ＩＴＩ抗体は、前記の通り、固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出するために用いられる。
【００４６】
本発明キット１に関するその他の説明は、前記の本発明方法１と同様である。なお、本発明キット１は、前記の構成成分を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに検量線や関係式作成の標準となる既知濃度のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の標準品や、標識物質の検出試薬等を構成として加えることができる。また、これらの構成の他に、前記ブロッキング物質、前記洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。さらに本発明キットには、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール（ＱＣコントロール）を含有させることもできる。
【００４７】
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明方法１に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【００４８】
なお本発明キットは、妊娠中毒症の「検知キット」であるが、「スクリーニングキット」や「診断キット」としての思想も包含することはいうまでもない。
＜３＞本発明キット２
本発明キット２は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キットである。
（Ａ）ＵＴＩ
（Ｂ）抗ＵＴＩ抗体
本発明キット２は、前記の本発明方法２に従って妊娠中毒症の検知に用いることができる。本発明キット２の構成成分であるＵＴＩは、前記の通り固相に結合させるために用いられる。このＵＴＩは、予め固相に固着した状態で本発明キット２の構成成分としてもよい。
【００４９】
また、本発明キット２の構成成分である抗ＵＴＩ抗体は、本発明方法２における「ＵＴＩに結合するポリペプチド」に相当するものである。その他の説明は、本発明キット１と同様である。
【００５０】
なお、本発明キット１と、本発明キット２を併せて１つのキットにしてもよい。このキットを用いることにより、妊娠中毒症の検知の精度をより高めることもできる。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
＜１＞材料
以下に、本実施例で用いた材料を説明する。
１．検体
検体（血清及び尿）は、単胎妊娠で正常な妊婦６０名、及び、妊娠中毒症の妊婦２０名（そのうち重症の妊娠中毒症７名、軽症の妊娠中毒症１３名）の母体から採取した。採取は、いずれも書面によるインフォームドコンセントを取得した上で行った。
【００５２】
妊娠２０週目以降に高血圧（収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上又は拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上であること）及びタンパク尿（３００ｍｇ／日）が生じている場合を「妊娠中毒症」であると判定した。そのなかで、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上かつ１６０ｍｍＨｇ未満又は拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上かつ１１０ｍｍＨｇ未満であって、さらにタンパク尿（３００ｍｇ／日以上かつ２ｇ／日未満）が生じている場合を「軽症の妊娠中毒症」と判定した。また、収縮期血圧が１６０ｍｍＨｇ以上又は拡張期血圧が１１０ｍｍＨｇ以上であって、さらにタンパク尿（２ｇ／日以上）が生じている場合を「重症の妊娠中毒症」と判定した。
２．その他の試薬
その他の試薬は、以下のものを用いた。
・ＨＡ測定キット（Hyaluronan Assay Kit）（生化学工業株式会社）
・ＴＭＢ溶液（TMB microwell peroxidase substrate；KPL社）
・ＨＡＢＰ（生化学工業株式会社）
・ウサギ抗ヒトＩＴＩ抗体（DAKO社）
・ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（Jackson社）
・ヒトＵＴＩ（持田製薬株式会社）
・ウサギ抗ヒトＵＴＩ抗体（愛知医科大学分子医科学研究所より分与）
＜２＞方法
１．ＨＡの測定
検体中のＨＡ濃度は、ＨＡ測定キットを用いて測定した。まず当該キットに含まれているＨＡＢＰ固相化マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、検体希釈液（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで５倍〜１０倍に希釈した血清）５０μｌ、および前記キットに含まれているビオチン標識ＨＡＢＰ溶液５０μｌをそれぞれのウエルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、前記キットに含まれているＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液をそれぞれのウエルに１００μｌ添加して、さらに３７℃で１時間インキュベートした。
【００５３】
ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ＴＭＢ溶液をそれぞれのウエルに１００μｌ添加して、３７℃で３０分間インキュベートすることにより発色させた。発色反応は、１ＭのHClをそれぞれのウエルに１００μｌ添加することによって停止させた。その後、各ウエルについて４５０／６３０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍにおける吸光度−６３０ｎｍにおける吸光度）を測定した。この測定は、それぞれの検体について３回行った。
２．ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の濃度は、J. Biol. Chem., 278, p32710-32718 (2003)に記載の方法に従って測定した。ＨＡＢＰ（0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）で4μg/mlに調製したもの）をマイクロタイタープレートのウエルに添加して、４℃で１５時間静置することにより、ＨＡＢＰをウエルの表面にコートした。その後、ウエルを200μlのＰＢＳで２回洗浄し、次いでウエルに３％ＢＳＡ（ＰＢＳ−Ｔで溶解したもの）を200μl添加して室温で１時間静置することによってブロッキングした。その後、200μlのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、検体希釈液（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで５倍〜１０倍に希釈した血清）をそれぞれのウエルに５０μｌ添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
その後ウエルを洗浄し、ウサギ抗ヒトＩＴＩ抗体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで３０００倍に希釈したもの）及びＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで３０００倍に希釈したもの）を、いずれも、それぞれのウエルに２５μｌ添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
その後ウエルを３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液をそれぞれのウエルに５０μｌ添加して、３７℃で１０分間インキュベートすることにより発色させた。発色反応は、１ＭのHClをそれぞれのウエルに５０μｌ添加することによって停止させた。その後、各ウエルについて４５０／６５０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍにおける吸光度−６５０ｎｍにおける吸光度）を測定した。この測定は、それぞれの検体について３回行った。
３．ＵＴＩの測定
検体中のＵＴＩの濃度は、以下の通り測定した。
ヒトＵＴＩ（0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）で2μg/mlに調製したもの）をマイクロタイタープレートのウエルに添加して、４℃で一晩静置することにより、ＵＴＩをウエルの表面にコートした。次いでウエルに２％ＢＳＡを添加して４℃で静置することによってブロッキングした。その後ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、検体（ＰＢＳで５倍〜１０倍に希釈した尿）及びウサギ抗ヒトＵＴＩ抗体を、いずれも、それぞれのウエルに５０μｌ添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
その後ウエルを洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで３０００倍に希釈したもの）を、それぞれのウエルに１００μｌ添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
その後ウエルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液をそれぞれのウエルに５０μｌ添加して、３７℃で１０分間インキュベートすることにより発色させた。発色反応は、１ＭのHClをそれぞれのウエルに５０μｌ添加することによって停止させた。その後、各ウエルについて４５０／６５０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍにおける吸光度−６５０ｎｍにおける吸光度）を測定した。この測定は、それぞれの検体について３回行った。
４．統計解析
有意差の解析は、対応のないｔ検定（unpaired t-test）、χ２検定、及び二元配置分散分析（two-way analysis of variance；ANOVA）によって行った。Ｐ＜０．０５の場合、統計学的に有意であると考えられる。血清中のＨＡ、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び尿中のＵＴＩの測定による妊娠中毒症検知の正確性は、ＲＯＣ曲線によって解析した。
＜３＞結果
正常妊婦及び妊娠中毒症の妊婦における、血清中のＨＡ、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合
体及び尿中のＵＴＩ濃度を測定した結果を、表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
表１より、妊娠中毒症の妊婦の血清中のＨＡ濃度、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体濃度及び尿中のＵＴＩ濃度は、いずれも正常の妊婦より有意に高いことが示された。妊娠中毒症によって血清中の濃度が上昇する知見は、非特許文献１における知見と一致するものである。なお、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び尿中のＵＴＩの測定結果は、血清中のＨＡの測定結果に比してＰ値が低かった。したがって、血中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体や尿中のＵＴＩは、血中のＨＡに比して、より妊娠中毒症であることを反映しやすい優れたパラメータとなることが示された。
また、重症及び軽症の妊娠中毒症の妊婦における、血清中のＨＡ、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び尿中のＵＴＩ濃度を測定した結果を、表２に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表２より、重症の妊娠中毒症の妊婦の血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体濃度は、軽症の妊婦より有意に高いことが示された。これに対し、血清中のＨＡ及び尿中のＵＴＩの濃度は、重症と軽症との間で有意差がみられなかった。したがって、血中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体は、妊娠中毒症の重症と軽症とを判別することができ、重症度や病態進行等を反映する優れたパラメータであることが示された。
【００５８】
さらに重症及び軽症の妊娠中毒症の妊婦における、血清中のＨＡ、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び尿中のＵＴＩの測定による妊娠中毒症検知の正確性を、ＲＯＣ曲線で解析した。結果を図１に示す。なお図１中の横軸は特異性を、縦軸は感度を示す。
【００５９】
図１からも、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体は、妊娠中毒症の重症度を特に正確に検知することができるパラメータであることが示された。
【００６０】
以上の結果から、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体やＵＴＩを測定することによって、ＨＡを測定した場合に比して妊娠中毒症であるか否かをより鋭敏に検知できることが示された。さらにＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を測定することによって、妊娠中毒症の重症度も鋭敏かつ正確に検知できることが示された。
＜４＞本発明キット１の作製
以下の構成からなる本発明キット１を作製した。このキットは、サンドイッチ法によるＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定を通じて、妊娠中毒症の有無の検知や重症度等の検知等に用いることができる。
１．ＨＡＢＰが固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．ウサギ抗ヒトＩＴＩ抗体
３．ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体
４．ＴＭＢ溶液 １本
５．反応停止液（1M HCl） １本
６．洗浄液（ＰＢＳ−Ｔ）
７．ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体標準溶液 １セット
＜５＞本発明キット２の作製
以下の構成からなる本発明キット２を作製した。このキットは、阻害法によるＵＴＩの測定を通じて、妊娠中毒症の検知等に用いることができる。
１．ヒトＵＴＩが固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．ウサギ抗ヒトＵＴＩ抗体
３．ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体
４．ＴＭＢ溶液 １本
５．反応停止液（1M HCl） １本
６．洗浄液（ＰＢＳ−Ｔ）
７．ＵＴＩ複合体標準溶液 １セット
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明方法や本発明のキットは、妊娠中毒症の有無の検知や重症度の検知等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】重症及び軽症の妊娠中毒症妊婦の血清中のＨＡ、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び尿中のＵＴＩ測定に関するＲＯＣ曲線を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠中毒症の新規な検知方法及び検知キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類中で使用する略号は以下の通りである。
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin）
ＨＡ：ヒアルロン酸（hyaluronic acid；hyaluronan）
ＨＡＢＰ：ヒアルロン酸結合性タンパク質（hyaluronan binding protein）
ＨＲＰ：ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）
ＩＴＩ：インター−α−トリプシンインヒビター（inter-alpha-trypsin inhibitor）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩液（phosphate buffered saline）
ＰＢＳ−Ｔ：0.1％のTween 20を含有するＰＢＳ
ＲＯＣ曲線：受診者動作特性曲線（receiver operating characteristic curve）
ＳＨＡＰ：血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質（serum-derived hyaluronan associated protein）
ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体：ＳＨＡＰとＨＡとの複合体
ＴＭＢ：3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine）
ＵＴＩ：ビクニン（bikunin）
妊娠中毒症は、妊娠に高血圧、蛋白尿、浮腫の一つ又は二つ以上の症状がみられ、かつこれらの症状が単なる妊娠偶発合併症によるものでないもので、妊娠２０週以降に発症し分娩後１２週までに正常に復するものをいう。妊娠中毒症は、子宮内胎児発育遅延を合併したりすることがあるため、早期にこれを検知し、食事療法や薬物療法を施す必要がある。また妊娠においては母子ともに安全であることが強く求められるため、妊娠中毒症と診断された場合には、その妊娠中毒症が軽症か重症かなどの適切な評価が重要になる。
【０００３】
以下、本発明に最も近いと考えられる先行技術について説明する。
【０００４】
非特許文献１には、子癇前症（preeclampsia）を伴う妊婦において、血清中のＨＡ濃度が上昇することが記載されている。
【０００５】
しかし、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体やＵＴＩを測定することによって、妊娠中毒症の有無やその重症度を検知すること等については記載も示唆もない。
【０００６】
特許文献１には、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を、抗ＩＴＩ抗体と反応させて抗ＩＴＩ抗体−（ＳＨＡＰ−ＨＡ結合体）の複合体を形成させ、この複合体を測定することを特徴とする検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体の測定方法やこれに供するキットが記載されている。また同文献には、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体を測定し、それによって関節炎や肝疾患を診断することが記載されている。
【０００７】
しかし、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体やＵＴＩを測定することによって、妊娠中毒症の有無やその重症度を検知すること等については記載も示唆もない。
【０００８】
【非特許文献１】オスメルス、Ｒ．Ｇ．Ｗ．（Osmers, R.G.W.）ら，１９９８年，アメリカン ジャーナル オブ オブステトリクス アンド ガイネコロジー（American Journal of Obstetrics and Gynecology），第１７８巻，第２号，ｐ．３４１−３４５
【特許文献１】特開平１０−８２７８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、妊娠中毒症を鋭敏かつ正確に検知できる方法及びキットを提供することを課題とする。さらに本発明は、妊娠中毒症の重症度を鋭敏かつ正確に検知できる方法及びキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体や、ＵＴＩを測定することによって、妊娠中毒症を鋭敏かつ正確に検知できることを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を測定することによって、妊娠中毒症の重症度を鋭敏かつ正確に検知できることも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び／又はＵＴＩを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法（以下、「本発明方法」という。）を提供する。
また本発明は、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法（以下、「本発明方法１」という。）を提供する。この検体は、血液由来の検体であることが好ましい。
またこのＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定は、免疫測定法によって行われることが好ましい。この免疫測定法は、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることが好ましい。
（１）ＨＡＢＰが固着された固相に、検体を接触させるステップ。
（２）固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出するステップ。
【００１２】
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット（以下、「本発明キット１」という。）を提供する。
（Ａ）ＨＡＢＰ
（Ｂ）抗ＩＴＩ抗体
また本発明は、検体中のＵＴＩを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法（以下、「本発明方法２」という。）を提供する。この検体は、尿であることが好ましい。
【００１３】
またこのＵＴＩの測定は、免疫測定法によって行われることが好ましい。この免疫測定法は、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることが好ましい。
（１）ＵＴＩが固着された固相に、検体と「ＵＴＩに結合するポリペプチド」とを接触さ
せるステップ。
（２）固相に結合した「ＵＴＩに結合するポリペプチド」を検出するステップ。
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット（以下、「本発明キット２」という。）を提供する。
（Ａ）ＵＴＩ
（Ｂ）抗ＵＴＩ抗体
【発明の効果】
【００１４】
本発明方法は、妊娠中毒症を簡便、迅速、鋭敏かつ正確に検知し判別することができることから極めて有用である。なかでも本発明方法１は、妊娠中毒症の有無のみならず、妊娠中毒症の重症度をも簡便、迅速、鋭敏かつ正確に検知し判別することができることから極めて有用である。また本発明キット１及び２は、このような妊娠中毒症の検知や判別をさらに簡便かつ迅速に実施することができることから極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明方法
本発明方法は、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び／又はＵＴＩを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法である。本発明方法においては、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体とＵＴＩの両方を測定してもよく、いずれか一方のみを測定してもよい。以下、本発明方法１と２とに分けて説明する。
＜１＞−１ 本発明方法１
本発明方法１は、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法である。
本発明方法１は、妊娠中毒症の動物の検体中ではＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が有意に増加することが本発明により明かとなったことから、これを妊娠中毒症の検知方法として応用したものである。
ここにいう「検体」は、妊娠中毒症によって当該検体に含まれるＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の量が変動するものである限りにおいて特に限定されない。このような検体としては、妊娠中毒症によってＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の量が変動する生体組織に由来するものや、体液に由来するもの等が例示される。
体液に由来するものとしては、例えば血液由来の検体を例示することができる。ここにいう「血液由来の検体」の用語には、血液そのものや、血液に何らかの処理を施して得られる検体等が包含される。「血液に何らかの処理を施して得られる検体」としては、例えば、血液の血球成分から分離することにより得られるもの（例えば血清や血漿等）や、血液から精製されたＳＨＡＰ−ＨＡ複合体画分等が例示される。なかでも血清又は血漿であることが好ましく、血清であることが特に好ましい。
また、検体が由来する動物は、妊娠中毒症を引き起こす可能性がある哺乳動物である限りにおいて特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定の方法は、検体中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出し測定しうる方法である限りにおいて特に限定されない。なお、本発明における「測定」の用語は、ある物質を定量的に測定することのみならず、定性的に測定すること（ある物質の存否を検出すること）をも含む概念である。
このような検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定は、例えば物理化学的方法（例えばクロマトグラフィー法など）や、生物学的方法（例えば免疫測定法など）によって行うことができる。なかでも、簡便性や迅速性等の観点から、免疫測定法によって行うことが好ましい。免疫測定法としては、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）や、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等が例示されるが、いずれの方法も採用することができる。
【００１６】
なお、本出願書類における「免疫測定法」の用語には、抗原抗体反応を利用した測定法のみならず、生体分子同士の親和性（例えば、ＨＡＢＰとＨＡとの親和性等）を利用した測定法も包含される。
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を免疫測定法によって測定する場合には、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることが好ましい。
（１）ＨＡＢＰが固着された固相に、検体を接触させるステップ。
（２）固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出するステップ。
以下、これらのステップごとに説明する。
ステップ（１）：
ステップ（１）は、ＨＡＢＰが固着された固相に、検体を接触させるステップである。
【００１７】
ＨＡＢＰが固着される固相は、ＨＡＢＰを固着させることができ、かつ、水、検体や反応液に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウエル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、微粒子状固相担体（ゼラチン粒子、カオリン粒子、ラテックス等の合成ポリマー粒子等）等を例示することができる。なかでも、正確な定量性と使用上の簡便性の点から、マイクロプレートが望ましい。
【００１８】
固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリアロマー、ポリエチレン、ガラス、アガロース等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
【００１９】
このような固相の表面にＨＡＢＰを固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法などの一般的な方法（例えば、固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を応用することができる。
【００２０】
これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
【００２１】
ＨＡＢＰの物理的吸着の具体的方法の一例として、例えば、ＨＡＢＰの緩衝液溶液を固相に接触させ、０℃〜１０℃程度、好ましくは０℃〜５℃程度で、６時間〜２４時間程度、好ましくは１０時間〜２０時間程度静置する方法が例示される。
【００２２】
また、ＨＡＢＰを固着させた固相の表面には、ＨＡＢＰが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこに検体中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が非特異的に固着すると正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よって、検体を固相に接触させる前に固相にブロッキング物質を接触させ、ＨＡＢＰが固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン（例えばＢＳＡ等）、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、プルロニック等が挙げられる。また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
【００２３】
ブロッキングの具体的方法の一例として、例えば、ＢＳＡの緩衝液溶液を固相に接触させ、０℃〜３７℃程度、好ましくは１０℃〜３０℃程度で、１５分間〜２時間程度、好ましくは３０分間〜２時間程度静置する方法が例示される。
【００２４】
固相と検体との接触方法は、当該固相に固着されたＨＡＢＰ分子と、検体中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ複合体分子とが接触する限りにおいて特に限定されない。例えば、固相に検体を添加して接触させても良く、また検体に固相を添加して接触させても良く、別体の容器に両者を同時に添加しても良い。接触の方法はこれらに限定されるものではなく、固相の形状や材質等に応じて当業者が適宜決定することができる。
【００２５】
これら両者を接触させた後、固相に固着されたＨＡＢＰと検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体とを十分に結合させるために、例えば０℃〜３７℃程度で、３０分間〜２時間程度インキュベートすることが好ましい。
【００２６】
この反応後に固相と液相を分離する。必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄し、非特異的吸着物や反応しなかった検体中の成分を除去することが好ましい。
【００２７】
洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Tween）系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液（例えばＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等）等を用いることができる。
ＨＡＢＰが固着された固相に検体を接触させることにより、検体中に存在するＳＨＡＰ
−ＨＡ複合体におけるＨＡ部分が固相に固着されたＨＡＢＰに結合し、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体がＨＡＢＰを介して固相に結合する。そして、検体中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の量が多ければ、これに対応して、ＨＡＢＰを介して固相に多くのＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が結合することになる。
ステップ（２）：
ステップ（２）は、固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出するステップである。この固相に結合したＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の検出方法も特に限定されず、固相に結合したＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を物理化学的に直接検出してもよく、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合するポリペプチド等を使って検出してもよい。このポリペプチドは、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に特異的に結合するものであることが好ましい。
【００２８】
「ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合するポリペプチド」の一例として、例えば抗ＩＴＩ抗体が例示される。抗ＩＴＩ抗体は、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体のＳＨＡＰ部分に結合する。
ここにいう「ポリペプチド」は、このような抗体自体はもちろん、その抗原結合部位（
Ｆａｂ）を保持するポリペプチド等も包含される。「抗体のＦａｂを保持するポリペプチド」としては、例えば、抗体のＦａｂを含むフラグメント等が例示される。
【００２９】
またここにいう「抗体」は、ポリクローナル、モノクローナルのいずれであってもよいが、特異性、均質性、再現性、大量かつ永続的な生産性等の観点からすると、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３０】
例えば抗ＩＴＩ抗体の製造は、ＩＴＩやＳＨＡＰ−ＨＡ複合体等を抗原として抗体の一般的な製造手法によって行うこともでき、また市販のものを利用することもできる。
【００３１】
抗ＩＴＩ抗体に代表される「ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合するポリペプチド」は、検出を容易とするために標識物質で標識されているか又は標識されるものであってもよい。標識に用いることができる標識物質は、通常のタンパク質の標識に使用可能なものであれば特に限定されないが、例えば酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性同位元素（125I、131I、3Ｈなど）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸(AMCA)、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン(DTAF)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、リスアミンローダミンＢ(Lissamine Rhodamine B)、テキサスレッド(Texas Red)、フィコエリスリン(Phycoerythrin；PE)、ウンベリフェロン、ユーロピウム、フィコシアニン、トリカラー、シアニンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）、ハプテン（ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸(AMP)、２，４−ジニトロアニリンなど）、特異的結合対（ビオチンとアビジン類（ストレプトアビジンなど）、レクチンと糖鎖、アゴニストとアゴニストの受容体、ヘパリンとアンチトロンビンIII(ATIII)のいずれか一方の物質等が例示される。
【００３２】
また、抗ＩＴＩ抗体に代表される「ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合するポリペプチド」を、固相に結合したＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合させた後、さらに当該ポリペプチドに結合する第２のポリペプチド（例えば二次抗体等）を用いて検出してもよい。この第２のポリペプチドは、前記のような標識物質で予め標識されていることが好ましい。
このような「ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体に結合するポリペプチド」や、これに結合する第２のポリペプチドに結合している標識物質を検出することによって、固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出することができる。
【００３３】
標識物質を検出する方法は、標識物質の種類に応じた公知の検出手段を適宜選択することができる。例えば、標識物質として特異的結合対の一方の物質（例えばビオチン）を使用した場合には、これに特異的に結合する他方の物質（例えばストレプトアビジン）を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加して、特異的結合対を形成せしめる。次いで、これに該酵素の基質（例えば過酸化水素（酵素がペルオキシダーゼの場合））及び発色物質（例えばＴＭＢや、ジアミノベンチジン等）を添加して、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度で測定することによって、標識物質を検出することができる。
【００３４】
また、例えば標識物質として放射性同位元素、蛍光色素又は化学発光物質を使用した場合には、放射能のカウント、蛍光強度、蛍光偏光、発光強度等を測定する方法などが例示される。
【００３５】
このような標識物質の検出を介して、固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出することができ、これによって検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を測定することができる。この方法はいわゆるサンドイッチ法であることから、標識物質が多く検出されたとすれば、それだけサンドイッチ状複合体の量が多いこと、すなわち検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が多いこと意味することになる。
【００３６】
ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の定性的な測定（ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の存否の検出）を望む場合には、標識物質の検出の有無をそのまま測定結果とすることができる。また、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の定量的な測定（ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の濃度の測定など）を望む場合には、吸光度、放射能のカウント、蛍光強度、発光強度などをそのままＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の量の指標とすることができる。また、既知濃度のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の標準溶液を用いて予め検量線又は関係式を作成しておき、これを用いて検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体濃度を求めることもできる。
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定結果と妊娠中毒症との関連づけは、以下の通り行うことができる。
【００３７】
本発明により、妊娠中毒症の動物の検体中ではＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が有意に増加することが明かとなった。したがって、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定結果（検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体量）が、健常動物（妊娠中毒症でない動物）における測定結果に比して高い場合には、「妊娠中毒症である」又は「妊娠中毒症である可能性が高い」と関連づけることができる。また、この測定結果が、健常動物における測定結果と同等もしくはそれよりも低ければ、「妊娠中毒症ではない」又は「妊娠中毒症である可能性は低い」と関連づけることができる。
【００３８】
また、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定結果と妊娠中毒症とを関連づけは、「妊娠中毒症の可能性の有無」のみでなく、妊娠中毒症の重症度や、病態の進行の程度の検知も含まれる。本発明により、重症の妊娠中毒症において検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が有意に増加することが明かとなったことから、例えばある個体の検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体量を測定し、これがある一定のレベルよりも高い時には「重症の妊娠中毒症である」又は「重症の妊娠中毒症である可能性が高い」と関連づけることができ、逆に検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体量がある一定レベルよりも低いときには、「軽症の妊娠中毒症である」又は「軽症の妊娠中毒症である可能性が高い」と関連づけることができる。ここにいう「一定レベル」は、後述の実施例に示した「表２」の結果その他に基づいて、当業者が適宜決定することができる。
また、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を定期的に測定し、その量が増加傾向にある場合には「妊娠中毒症が進行している」又は「妊娠中毒症が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。逆に減少傾向にある場合には「妊娠中毒症が改善方向にある」又は「妊娠中毒症が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。また量的に変化がない場合には「妊娠中毒症の進行（改善）に変化がない」又は「妊娠中毒症の進行（改善）に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。これにより、妊娠中毒症のモニタリング等に応用することもできる。
【００３９】
なお、妊娠中毒症との関連づけの基準となる測定結果（検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の量）は、前記の検量線又は関係式を用いて求めた濃度であっても良く、健常動物の検体中における量に対する比であっても良い。
【００４０】
なお本発明は妊娠中毒症の「検知方法」であるが、「スクリーニング方法」や「診断方法」としての思想も包含することはいうまでもない。
＜１＞−２ 本発明方法２
本発明方法２は、検体中のＵＴＩを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法である。
本発明方法２は、妊娠中毒症の動物の検体中ではＳＨＡＰ−ＨＡ複合体のみならず、ＵＴＩも有意に増加することが本発明により明かとなったことから、これを妊娠中毒症の検知方法として応用したものである。
本発明方法２における「検体」は、本発明方法１で説明したものと同様のものを用いることができるが、特に尿であることが好ましい。その他の説明は、前記の本発明方法１におけるＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を「ＵＴＩ」と、ＩＴＩを「ＵＴＩ」とそれぞれ読み替えたものと同じである。
【００４１】
ただし、本発明方法２におけるＵＴＩの測定を免疫測定法によって行う場合には、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることが好ましい。
（１）ＵＴＩが固着された固相に、検体と「ＵＴＩに結合するポリペプチド」とを接触させるステップ。
（２）固相に結合した「ＵＴＩに結合するポリペプチド」を検出するステップ。
以下、これらのステップごとに説明する。
ステップ（１）：
ステップ（１）は、ＵＴＩが固着された固相に、検体と「ＵＴＩに結合するポリペプチド」とを接触させるステップである。
【００４２】
ここにいう「ＵＴＩが固着された固相」、「ＵＴＩに結合するポリペプチド」等の説明については、前記の通り本発明方法１におけるＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を「ＵＴＩ」と、ＩＴＩを「ＵＴＩ」を読み替えたものと同じである。
なお、ステップ（１）における接触は、三者同時であってもよく、ＵＴＩが固着された固相と検体とを接触させた後これに「ＵＴＩに結合するポリペプチド」を接触させてもよく、検体と「ＵＴＩに結合するポリペプチド」とを接触させた後これを「ＵＴＩが固着された固相」に接触させてもよい。接触させた後の処理についても、本発明方法１と同様である。
これら三者を接触させることにより、「検体中に存在するＵＴＩ」と「固相に固着されたＵＴＩ」とが「ＵＴＩに結合するポリペプチド」を奪い合うことになる。その結果、検体に存在するＵＴＩの量が多ければ、固相に結合する「ＵＴＩに結合するポリペプチド」は減少する。逆に検体に存在するＵＴＩの量が少なければ、固相に結合する「ＵＴＩに結合するポリペプチド」は増加することになる。
【００４３】
ステップ（２）：
（２）固相に結合した「ＵＴＩに結合するポリペプチド」を検出するステップ。
固相に結合した「ＵＴＩに結合するポリペプチド」の検出も、前記の本発明方法１における「固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の検出」と同様に行うことができる。したがって、このポリペプチドの検出方法も特に限定されず、物理化学的に直接検出してもよく、この「ＵＴＩに結合するポリペプチド」に結合する第２のポリペプチド等（例えば二次抗体等）を使って検出してもよい。「ＵＴＩに結合するポリペプチド」としては抗ＵＴＩ抗体が例示される（前記の通り、本発明方法１における抗ＩＴＩ抗体を、抗ＵＴＩ抗体と読み替えれば良い）。
固相に結合した「ＵＴＩに結合するポリペプチド」や、これに結合する第２のポリペプチドに結合している標識物質を検出することによって、検体中のＵＴＩを測定することができる。前記の記載から理解されるように、この方法はいわゆる阻害法であることから、固相から標識物質が多く検出されたとすれば、それだけ検体中のＵＴＩが少ないこと意味することになる。
【００４４】
なお、本発明方法１と、本発明方法２を併せて実施することにより、妊娠中毒症の検知の精度をより高めることもできる。
＜２＞本発明キット１
本発明キット１は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キットである。
（Ａ）ＨＡＢＰ
（Ｂ）抗ＩＴＩ抗体
本発明キット１は、前記の本発明方法１に従って妊娠中毒症の有無の検知や、重症度の検知等に用いることができる。
本発明キット１の構成成分であるＨＡＢＰは、前記の通り固相に結合させるために用い
られる。このＨＡＢＰは、予め固相に固着した状態で本発明キット１の構成成分としてもよい。
【００４５】
また、本発明キット１の構成成分である抗ＩＴＩ抗体は、前記の通り、固相に結合した検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を検出するために用いられる。
【００４６】
本発明キット１に関するその他の説明は、前記の本発明方法１と同様である。なお、本発明キット１は、前記の構成成分を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに検量線や関係式作成の標準となる既知濃度のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の標準品や、標識物質の検出試薬等を構成として加えることができる。また、これらの構成の他に、前記ブロッキング物質、前記洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。さらに本発明キットには、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール（ＱＣコントロール）を含有させることもできる。
【００４７】
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明方法１に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【００４８】
なお本発明キットは、妊娠中毒症の「検知キット」であるが、「スクリーニングキット」や「診断キット」としての思想も包含することはいうまでもない。
＜３＞本発明キット２
本発明キット２は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キットである。
（Ａ）ＵＴＩ
（Ｂ）抗ＵＴＩ抗体
本発明キット２は、前記の本発明方法２に従って妊娠中毒症の検知に用いることができる。本発明キット２の構成成分であるＵＴＩは、前記の通り固相に結合させるために用いられる。このＵＴＩは、予め固相に固着した状態で本発明キット２の構成成分としてもよい。
【００４９】
また、本発明キット２の構成成分である抗ＵＴＩ抗体は、本発明方法２における「ＵＴＩに結合するポリペプチド」に相当するものである。その他の説明は、本発明キット１と同様である。
【００５０】
なお、本発明キット１と、本発明キット２を併せて１つのキットにしてもよい。このキットを用いることにより、妊娠中毒症の検知の精度をより高めることもできる。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
＜１＞材料
以下に、本実施例で用いた材料を説明する。
１．検体
検体（血清及び尿）は、単胎妊娠で正常な妊婦６０名、及び、妊娠中毒症の妊婦２０名（そのうち重症の妊娠中毒症７名、軽症の妊娠中毒症１３名）の母体から採取した。採取は、いずれも書面によるインフォームドコンセントを取得した上で行った。
【００５２】
妊娠２０週目以降に高血圧（収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上又は拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上であること）及びタンパク尿（３００ｍｇ／日）が生じている場合を「妊娠中毒症」であると判定した。そのなかで、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上かつ１６０ｍｍＨｇ未満又は拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上かつ１１０ｍｍＨｇ未満であって、さらにタンパク尿（３００ｍｇ／日以上かつ２ｇ／日未満）が生じている場合を「軽症の妊娠中毒症」と判定した。また、収縮期血圧が１６０ｍｍＨｇ以上又は拡張期血圧が１１０ｍｍＨｇ以上であって、さらにタンパク尿（２ｇ／日以上）が生じている場合を「重症の妊娠中毒症」と判定した。
２．その他の試薬
その他の試薬は、以下のものを用いた。
・ＨＡ測定キット（Hyaluronan Assay Kit）（生化学工業株式会社）
・ＴＭＢ溶液（TMB microwell peroxidase substrate；KPL社）
・ＨＡＢＰ（生化学工業株式会社）
・ウサギ抗ヒトＩＴＩ抗体（DAKO社）
・ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（Jackson社）
・ヒトＵＴＩ（持田製薬株式会社）
・ウサギ抗ヒトＵＴＩ抗体（愛知医科大学分子医科学研究所より分与）
＜２＞方法
１．ＨＡの測定
検体中のＨＡ濃度は、ＨＡ測定キットを用いて測定した。まず当該キットに含まれているＨＡＢＰ固相化マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、検体希釈液（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで５倍〜１０倍に希釈した血清）５０μｌ、および前記キットに含まれているビオチン標識ＨＡＢＰ溶液５０μｌをそれぞれのウエルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、前記キットに含まれているＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液をそれぞれのウエルに１００μｌ添加して、さらに３７℃で１時間インキュベートした。
【００５３】
ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ＴＭＢ溶液をそれぞれのウエルに１００μｌ添加して、３７℃で３０分間インキュベートすることにより発色させた。発色反応は、１ＭのHClをそれぞれのウエルに１００μｌ添加することによって停止させた。その後、各ウエルについて４５０／６３０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍにおける吸光度−６３０ｎｍにおける吸光度）を測定した。この測定は、それぞれの検体について３回行った。
２．ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の濃度は、J. Biol. Chem., 278, p32710-32718 (2003)に記載の方法に従って測定した。ＨＡＢＰ（0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）で4μg/mlに調製したもの）をマイクロタイタープレートのウエルに添加して、４℃で１５時間静置することにより、ＨＡＢＰをウエルの表面にコートした。その後、ウエルを200μlのＰＢＳで２回洗浄し、次いでウエルに３％ＢＳＡ（ＰＢＳ−Ｔで溶解したもの）を200μl添加して室温で１時間静置することによってブロッキングした。その後、200μlのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、検体希釈液（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで５倍〜１０倍に希釈した血清）をそれぞれのウエルに５０μｌ添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
その後ウエルを洗浄し、ウサギ抗ヒトＩＴＩ抗体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで３０００倍に希釈したもの）及びＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで３０００倍に希釈したもの）を、いずれも、それぞれのウエルに２５μｌ添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
その後ウエルを３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液をそれぞれのウエルに５０μｌ添加して、３７℃で１０分間インキュベートすることにより発色させた。発色反応は、１ＭのHClをそれぞれのウエルに５０μｌ添加することによって停止させた。その後、各ウエルについて４５０／６５０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍにおける吸光度−６５０ｎｍにおける吸光度）を測定した。この測定は、それぞれの検体について３回行った。
３．ＵＴＩの測定
検体中のＵＴＩの濃度は、以下の通り測定した。
ヒトＵＴＩ（0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）で2μg/mlに調製したもの）をマイクロタイタープレートのウエルに添加して、４℃で一晩静置することにより、ＵＴＩをウエルの表面にコートした。次いでウエルに２％ＢＳＡを添加して４℃で静置することによってブロッキングした。その後ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、検体（ＰＢＳで５倍〜１０倍に希釈した尿）及びウサギ抗ヒトＵＴＩ抗体を、いずれも、それぞれのウエルに５０μｌ添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
その後ウエルを洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで３０００倍に希釈したもの）を、それぞれのウエルに１００μｌ添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
その後ウエルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液をそれぞれのウエルに５０μｌ添加して、３７℃で１０分間インキュベートすることにより発色させた。発色反応は、１ＭのHClをそれぞれのウエルに５０μｌ添加することによって停止させた。その後、各ウエルについて４５０／６５０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍにおける吸光度−６５０ｎｍにおける吸光度）を測定した。この測定は、それぞれの検体について３回行った。
４．統計解析
有意差の解析は、対応のないｔ検定（unpaired t-test）、χ２検定、及び二元配置分散分析（two-way analysis of variance；ANOVA）によって行った。Ｐ＜０．０５の場合、統計学的に有意であると考えられる。血清中のＨＡ、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び尿中のＵＴＩの測定による妊娠中毒症検知の正確性は、ＲＯＣ曲線によって解析した。
＜３＞結果
正常妊婦及び妊娠中毒症の妊婦における、血清中のＨＡ、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合
体及び尿中のＵＴＩ濃度を測定した結果を、表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
表１より、妊娠中毒症の妊婦の血清中のＨＡ濃度、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体濃度及び尿中のＵＴＩ濃度は、いずれも正常の妊婦より有意に高いことが示された。妊娠中毒症によって血清中の濃度が上昇する知見は、非特許文献１における知見と一致するものである。なお、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び尿中のＵＴＩの測定結果は、血清中のＨＡの測定結果に比してＰ値が低かった。したがって、血中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体や尿中のＵＴＩは、血中のＨＡに比して、より妊娠中毒症であることを反映しやすい優れたパラメータとなることが示された。
また、重症及び軽症の妊娠中毒症の妊婦における、血清中のＨＡ、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び尿中のＵＴＩ濃度を測定した結果を、表２に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表２より、重症の妊娠中毒症の妊婦の血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体濃度は、軽症の妊婦より有意に高いことが示された。これに対し、血清中のＨＡ及び尿中のＵＴＩの濃度は、重症と軽症との間で有意差がみられなかった。したがって、血中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体は、妊娠中毒症の重症と軽症とを判別することができ、重症度や病態進行等を反映する優れたパラメータであることが示された。
【００５８】
さらに重症及び軽症の妊娠中毒症の妊婦における、血清中のＨＡ、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び尿中のＵＴＩの測定による妊娠中毒症検知の正確性を、ＲＯＣ曲線で解析した。結果を図１に示す。なお図１中の横軸は特異性を、縦軸は感度を示す。
【００５９】
図１からも、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体は、妊娠中毒症の重症度を特に正確に検知することができるパラメータであることが示された。
【００６０】
以上の結果から、検体中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体やＵＴＩを測定することによって、ＨＡを測定した場合に比して妊娠中毒症であるか否かをより鋭敏に検知できることが示された。さらにＳＨＡＰ−ＨＡ複合体を測定することによって、妊娠中毒症の重症度も鋭敏かつ正確に検知できることが示された。
＜４＞本発明キット１の作製
以下の構成からなる本発明キット１を作製した。このキットは、サンドイッチ法によるＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の測定を通じて、妊娠中毒症の有無の検知や重症度等の検知等に用いることができる。
１．ＨＡＢＰが固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．ウサギ抗ヒトＩＴＩ抗体
３．ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体
４．ＴＭＢ溶液 １本
５．反応停止液（1M HCl） １本
６．洗浄液（ＰＢＳ−Ｔ）
７．ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体標準溶液 １セット
＜５＞本発明キット２の作製
以下の構成からなる本発明キット２を作製した。このキットは、阻害法によるＵＴＩの測定を通じて、妊娠中毒症の検知等に用いることができる。
１．ヒトＵＴＩが固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．ウサギ抗ヒトＵＴＩ抗体
３．ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体
４．ＴＭＢ溶液 １本
５．反応停止液（1M HCl） １本
６．洗浄液（ＰＢＳ−Ｔ）
７．ＵＴＩ複合体標準溶液 １セット
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明方法や本発明のキットは、妊娠中毒症の有無の検知や重症度の検知等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】重症及び軽症の妊娠中毒症妊婦の血清中のＨＡ、血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ複合体及び尿中のＵＴＩ測定に関するＲＯＣ曲線を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との複合体」及び／又はビクニンを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法。
【請求項２】
検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との複合体」を測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法。
【請求項３】
検体が、血液由来の検体であることを特徴とする、請求項２に記載の検知方法。
【請求項４】
「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との複合体」の測定が、免疫測定法によって行われることを特徴とする、請求項２又は３に記載の検知方法。
【請求項５】
免疫測定法が、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることを特徴とする、請求項４に記載の検知方法。
（１）ヒアルロン酸結合性タンパク質が固着された固相に、検体を接触させるステップ。
（２）固相に結合した検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸
との複合体」を検出するステップ。
【請求項６】
下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット。
（Ａ）ヒアルロン酸結合性タンパク質
（Ｂ）抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体
【請求項７】
検体中のビクニンを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法。
【請求項８】
検体が、尿であることを特徴とする、請求項７に記載の検知方法。
【請求項９】
ビクニンの測定が、免疫測定法によって行われることを特徴とする、請求項７又は８に記載の検知方法。
【請求項１０】
免疫測定法が、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることを特徴とする、請求項９に記載の検知方法。
（１）ビクニンが固着された固相に、検体と「ビクニンに結合するポリペプチド」とを接
触させるステップ。
（２）固相に結合した「ビクニンに結合するポリペプチド」を検出するステップ。
【請求項１１】
下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット。
（Ａ）ビクニン
（Ｂ）抗ビクニン抗体
【請求項１】
検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との複合体」及び／又はビクニンを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法。
【請求項２】
検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との複合体」を測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法。
【請求項３】
検体が、血液由来の検体であることを特徴とする、請求項２に記載の検知方法。
【請求項４】
「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との複合体」の測定が、免疫測定法によって行われることを特徴とする、請求項２又は３に記載の検知方法。
【請求項５】
免疫測定法が、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることを特徴とする、請求項４に記載の検知方法。
（１）ヒアルロン酸結合性タンパク質が固着された固相に、検体を接触させるステップ。
（２）固相に結合した検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸
との複合体」を検出するステップ。
【請求項６】
下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット。
（Ａ）ヒアルロン酸結合性タンパク質
（Ｂ）抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体
【請求項７】
検体中のビクニンを測定し、その測定結果と妊娠中毒症とを関連づけるステップを少なくとも含む、妊娠中毒症の検知方法。
【請求項８】
検体が、尿であることを特徴とする、請求項７に記載の検知方法。
【請求項９】
ビクニンの測定が、免疫測定法によって行われることを特徴とする、請求項７又は８に記載の検知方法。
【請求項１０】
免疫測定法が、以下のステップ（１）及び（２）を少なくとも含む方法で行われることを特徴とする、請求項９に記載の検知方法。
（１）ビクニンが固着された固相に、検体と「ビクニンに結合するポリペプチド」とを接
触させるステップ。
（２）固相に結合した「ビクニンに結合するポリペプチド」を検出するステップ。
【請求項１１】
下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むことを特徴とする、妊娠中毒症の検知キット。
（Ａ）ビクニン
（Ｂ）抗ビクニン抗体
【図１】
【公開番号】特開２００６−２５０８６２（Ｐ２００６−２５０８６２Ａ）
【公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−７０８９６（Ｐ２００５−７０８９６）
【出願日】平成１７年３月１４日（２００５．３．１４）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１４日（２００５．３．１４）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
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