弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株およびその使用
本発明は生菌弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株、安定化されたプラスミド発現系を含む生菌弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株及びこれらの菌株の使用方法に関する。１つの実施形態において、本発明のＳ・パラチフスＡ菌株はｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子における弱毒化突然変異よりなる群から選択される弱毒化突然変異少なくとも１つを有する。好ましい実施形態においては、Ｓ・パラチフスＡ菌株はｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＰ遺伝子において弱毒化突然変異を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、米国仮出願第６０／７３１，３４９号（この全体が、本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
チフス及びパラチフス熱を包含するサルモネラ属のメンバーにより誘発される腸熱は依然として開発途上国の集団に多大な疾患及び死亡率の重積を付しており（非特許文献１）、そして旅行者に対して顕著な危険を呈している（非特許文献２）。サルモネラ・エンテリカの血清型であるチフス及びパラチフスＡ（Ｓ．Ｔｙｐｈｉ及びＳ．Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ）により誘発される腸熱の発生率は抗生物質耐性変異体の出現及び拡大のため上昇中である（非特許文献２）。Ｓ・パラチフスＡにより誘発される臨床疾患は全体としてＳ・チフスによるもの余地幾分軽症であるが、前者はなお、複合的合併症を伴った樹立された腸熱をもたらし、そして、未治療又は不適切な治療の場合には、死亡をもたらす場合がある。サルモネラ感染症に対抗する場合に安全で有効であるワクチンが必要とされている。
【非特許文献１】Ｌａｎｃｅｔ ２００５；３６６：７４９−７６２
【非特許文献２】Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００５；５（１０）：６２３−６２８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株、好ましくは生菌弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株に関する。
【０００４】
１つの実施形態において、本発明のＳ・パラチフスＡ菌株はｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子における弱毒化突然変異よりなる群から選択される弱毒化突然変異少なくとも１つを有する。好ましい実施形態においては、Ｓ・パラチフスＡ菌株はｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＰ遺伝子において弱毒化突然変異を有する。別の好ましい実施形態においては、サルモネラ・パラチフスＡ菌株はｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において弱毒化突然変異を有する。更に別の好ましい実施形態においては、サルモネラ・パラチフスＡ菌株はｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において弱毒化突然変異を有する。
【０００５】
１つの実施形態において、ｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子の弱毒化突然変異は遺伝子座又は遺伝子の発現のレベルを低減するか、遺伝子座又は遺伝子の発現をブロックする弱毒化突然変異である。
【０００６】
別の実施形態において、ｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子の弱毒化突然変異は遺伝子座又は遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を低減するか、遺伝子座又は遺伝子によりコードされるポリペプチドを不活性化する弱毒化突然変異である。
【０００７】
好ましい実施形態においては、サルモネラ・パラチフスＡ菌株はＳ・パラチフスＡ９１５０菌株である。
【０００８】
本発明はまた、ｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子における弱毒化突然変異よりなる群から選択される弱毒化突然変異少なくとも１つを有し、そして更に安定化されたプラスミド発現系を含むＳ・パラチフスＡ菌株を包含する。
【０００９】
好ましい実施形態においては、安定化されたプラスミド発現系は（ａ）制限されたコピー数の複製起点カセット、（ｂ）分離後殺傷（ｐｏｓｔ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ）カセット少なくとも１つ、（ｃ）分配カセット少なくとも１つ；及び、（ｄ）発現カセットを有する発現ベクターを含む。
【００１０】
好ましい実施形態においては、制限されたコピー数の複製起点カセットは、（ｉ）細胞当たり約２〜７５コピーの平均プラスミドコピー数に発現ベクターを制限する複製起点をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）複製起点をコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第１のユニークな制限酵素切断部位、及び、（ｉｉｉ）複製起点をコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第２のユニークな制限酵素切断部位を含む。
【００１１】
同様の実施形態において、分離後殺傷カセットは（ｉ）分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第３のユニークな制限酵素切断部位、及び、（ｉｉｉ）分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第４のユニークな制限酵素切断部位を含む。
【００１２】
同様の実施形態において、分配カセットは（ｉ）分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の５’の５のユニークな制限酵素切断部位、及び、（ｉｉｉ）分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第６のユニークな制限酵素切断部位を含む。
【００１３】
同様の実施形態において、発現カセットは（ｉ）プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第７のユニークな制限酵素切断部位、及び、（ｉｉｉ）プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第８のユニークな制限酵素切断部位を含む。
【００１４】
好ましい実施形態においては、複製起点をコードするヌクレオチド配列は配列番号２８に示すｏｒｉＥ１配列、配列番号３０に示すｏｒｉ１０１配列、及び配列番号２９に示すｏｒｉ１５Ａ配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である。
【００１５】
好ましい実施形態においては、分離後殺傷遺伝子座をコードするヌクレオチド配列はｓｓｂ平衡致死系をコードするヌクレオチド配列、ａｓｄ平衡致死系をコードするヌクレオチド配列、ｐｈｄ−ｄｏｃ蛋白系をコードするヌクレオチド配列及びｈｏｋ−ｓｏｋアンチセンス系をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である。より好ましくは、分離後殺傷遺伝子座はシゲラ・フレクスナーｓｓｂ遺伝子座、サルモネラ・チフスｓｓｂ遺伝子座及びＥ・コリｓｓｂ遺伝子座よりなる群から選択されるｓｓｂ平衡致死系をコードするヌクレオチド配列である。更に好ましくは、ｓｓｂ平衡致死系は、配列番号３４に示すＳ・フレクスナー２ａ菌株ＣＶＤ１２０８ｓのｓｓｂ誘導性プロモーター、ｓｓｂ構成的プロモーター及びｓｓｂコード領域を含むｓｓｂ遺伝子座である。
【００１６】
好ましい実施形態においては分配機能をコードするヌクレオチド配列は配列番号３１に示すＥ・コリｐａｒＡ遺伝子座及び配列番号３２に示すＥ・コリｐＳＣ１０１ｐａｒ遺伝子座よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である。
【００１７】
好ましい実施形態においては、プロモーターは誘導性プロモーターであり、より好ましくはｏｍｐＣプロモーターであり、更に好ましくは配列番号３３に示すｏｍｐＣプロモーターである。
【００１８】
１つの実施形態において、選択された抗原をコードするヌクレオチド配列は同種の抗原をコードするヌクレオチド配列である。別の実施形態においては、選択された抗原をコードするヌクレオチド配列は異種の抗原をコードするヌクレオチド配列である。
【００１９】
好ましい実施形態においては、選択された抗原をコードするヌクレオチド配列はウィルス抗原、細菌抗原、癌抗原及び自己免疫抗原よりなる群から選択される非相同抗原をコードするヌクレオチド配列である。
【００２０】
本発明はまた本発明の弱毒化サルモネラ・パラチフスＡ菌株１つ以上を含む医薬品製剤を包含する。好ましくは、医薬品製剤は経口用医薬品製剤である。
【００２１】
本発明は更に、被験体に本発明の医薬品製剤の免疫学的有効量を投与することを含む被験体において免疫応答を誘導する方法を包含する。好ましくは、免疫応答は防御免疫応答である。
【００２２】
医薬品製剤の免疫学的有効量は医薬品製剤内にＳ・パラチフスＡ菌株の約１０２ｃｆｕ〜約１０１０ｃｆｕ、より好ましくは約１０６ｃｆｕ〜約１０９ｃｆｕを含有する。
【００２３】
１つの実施形態において、免疫応答はサルモネラ・パラチフスＡに対するものである。別の実施形態においては、免疫応答は選択された抗原に対するものである。更に別の実施形態においては、免疫応答はサルモネラ・パラチフスＡ及び選択された抗原の両方に対するものである。
【００２４】
ラムダレッド媒介突然変異誘発系を使用することにより本発明のＳ・パラチフス菌株由来の種々の染色体の遺伝子座及び遺伝子を突然変異又は欠失させてよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
Ａ．弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株
本発明は弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株に関する。このような弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は被験体に疾患を誘発することなく被験体に免疫応答を誘導するために使用してよい。
【００２６】
本発明の出発物質として使用するＳ・パラチフスＡ菌株は何れのＳ・パラチフスＡ菌株であってもよく、そして菌株の実体は重要ではない。好ましいＳ・パラチフスＡ菌株はＳ・パラチフスＡ９１５０菌株である。
【００２７】
本発明のＳ・パラチフスＡ菌株は弱毒化されている。本明細書においては、Ｓ・パラチフスＡの弱毒化菌株とは、被験体において疾患を誘発する能力が低減、減少又は沈静化されているもの、又は、被験体において疾患を誘発する能力を完全に喪失しているものである。弱毒化菌株は遺伝子１つ以上の発現の低減又は消失を呈するか、活性が低減又は消失している蛋白１つ以上を発現するか、生育して分裂する能力の低下を呈するか、又は、これらの特性の２つ以上の組合せを呈してよい。本発明の弱毒化菌株は生存又は死滅していてよい。
【００２８】
本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株の外に、他の腸病原菌（例えばサルモネラ・チフス、サルモネラ・パラチフスＢ、赤痢菌、コレラ菌）、片利共生菌（例えばラクトバチルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）及び認可ワクチン菌株（例えばＢＣＧ）の弱毒化菌株も本発明の範囲に包含される。これらの追加的菌株は本発明のＳ・パラチフスＡ菌株の弱毒化突然変異の全てを有し、本発明の安定化プラスミド発現系で形質転換してよく、そして本明細書に記載する通り免疫化組成物として使用してよい。
【００２９】
好ましい実施形態においては、本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株はＳ・パラチフスＡのｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子の１つ以上において突然変異を有する。例えば、本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は（ｉ）ｇｕａＢ遺伝子及びｃｌｐＰ遺伝子において、（ｉｉ）ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＰ遺伝子において、（ｉｉｉ）ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＰ遺伝子において、（ｉｖ）ｇｕａＢＡ遺伝子座及びｃｌｐＰ遺伝子において、（ｖ）ｇｕａＢ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｖｉ）ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｖｉｉ）ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｖｉｉｉ）ｇｕａＢＡ遺伝子座及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｉｘ）ｇｕａＢ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｘ）ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｘｉ）ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｘｉｉ）ｇｕａＢＡ遺伝子座、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、突然変異を有してよい。
【００３０】
本明細書に記載する遺伝子座及び遺伝子の突然変異は何れかの突然変異、例えば核酸の欠失、挿入又は置換の１つ以上であってよい。突然変異は、遺伝子座又は遺伝子からの発現の低減又は非存在、又は遺伝子座又は遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性の低減又は非存在をもたらす遺伝子座又は遺伝子の何れかの欠失、挿入又は置換であってよい。突然変異は遺伝子座又は遺伝子のコーディング又は非コーディング領域におけるものであってよい。
【００３１】
好ましくは、本発明においては、Ｓ・パラチフスＡ菌株の染色体ゲノムは、ｇｕａＢＡ遺伝子座を除去するか、何らか別の方法で修飾すること、そしてこれによりグアニンヌクレオチドの新規生合成をブロックすることにより修飾される。より好ましくは、ｇｕａＢＡ遺伝子座における突然変異はプリン代謝経路酵素ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（ｇｕａＢによりコードされる）及びＧＭＰ合成酵素（ｇｕａＡによりコードされる）を不活性化する。これらの突然変異の結果、Ｓ・パラチフスＡは新規のＧＭＰ延いてはＧＤＰ及びＧＴＰヌクレオチドを合成できなくなり、このために哺乳類組織における細菌生育が激しく制限される。インビトロにおいては、本発明のΔｇｕａＢＡ Ｓ・パラチフスＡ突然変異体はグアニンを補給しない限り最小培地中で生育することはできない。組織培養においては、本発明のΔｇｕａＢＡ Ｓ・パラチフスＡ突然変異体はその侵襲能力の顕著な低下を示すことがわかっている。ΔｇｕａＢＡ Ｓ・パラチフスＡ突然変異体は哺乳類宿主の組織に由来するグアニンヌクレオチドを捕獲する場合がある。しかしながら、そのＳ・パラチフスＡへの同化は、グアニンサルベージ経路内にヌクレオチド前駆体として取り込まれるべきペリプラズムヌクレオチダーゼによるヌクレオシドへの脱ホスホリル化を予め必要とする。従って、ヌクレオチドは哺乳類宿主の細胞内環境において容易に使用できるため、グアニンヌクレオチドの新規合成による弱毒化はサルベージ経路の不全によるか、又は、依然として不明確な理由の何れかによるものである。
【００３２】
ＧＭＰ合成酵素をコードするＳ・パラチフスＡ９１５０のｇｕａＡ遺伝子は１５７８ｂｐの大きさ（配列番号３６）であり、そしてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴヌクレオチド比較により測定した場合Ｓ・チフスＴｙ２のｇｕａＡ遺伝子に９８％相同である。欠失突然変異体はＧｕａＡの適切な折畳又は活性が防止されるようにＳ・パラチフスＡのｇｕａＡ遺伝子のコーディング領域の一部を排除することにより作成できる。例えばコーディング領域の約２５〜約１５００ｂｐ、約７５〜約１４００ｂｐ、約１００〜約１３００ｂｐ、又は全てを欠失させることができる。或いは、欠失突然変異は遺伝子の適切な読み枠がシフトするようにＳ・パラチフスＡのｇｕａＡ遺伝子の例えば１〜１００ｂｐフラグメントを排除することにより作成できる。後者の例においては、非センスポリペプチドを作成するか、フレームシフト誘導終止コドンによりポリペプチド合成を中断させてよい。欠失の好ましい大きさは約７５〜７５０ｂｐである。ｇｕａＡ遺伝子を超えて伸びるような欠失、即ちリボソーム結合部位におけるもののような、ｇｕａＡ遺伝子の翻訳を制御するエレメントにおける欠失を作成することもできる。
【００３３】
ＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードするＳ・パラチフスＡ９１５０のｇｕａＢ遺伝子は１４６７ｂｐの大きさ（配列番号３５）であり、そしてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴヌクレオチド比較により測定した場合Ｓ・チフスＴｙ２のｇｕａＢ遺伝子に９８％相同である。欠失突然変異体はＧｕａＢの適切な折畳又は活性が防止されるようにＳ・パラチフスＡのｇｕａＢ遺伝子のコーディング領域の一部を排除することにより作成できる。例えばコーディング領域の約２５〜約１４００ｂｐ、約７５〜約１３００ｂｐ、約１００〜約１２００ｂｐ、又は全てを欠失させることができる。或いは、欠失突然変異は遺伝子の適切な読み枠がシフトするようにＳ・パラチフスＡのｇｕａＢ遺伝子の例えば１〜１００ｂｐフラグメントを排除することにより作成できる。後者の例においては、非センスポリペプチドを作成するか、フレームシフト誘導終止コドンによりポリペプチド合成を中断させてよい。欠失の好ましい大きさは約７５〜７５０ｂｐである。ｇｕａＢ遺伝子を超えて伸びるような欠失、即ちプロモーターにおけるもののような、ｇｕａＢ遺伝子の転写を制御するエレメントにおける欠失を作成することもできる。
【００３４】
セリンプロテアーゼをコードするＳ・パラチフスＡ９１５０のｃｌｐＰ遺伝子は６２４ｂｐの大きさ（配列番号３７）であり、そしてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴヌクレオチド比較により測定した場合Ｓ・チフスＴｙ２のｃｌｐＰ遺伝子に９９％相同である。欠失突然変異体はＣｌｐＰの適切な折畳又は活性が防止されるようにＳ・パラチフスＡのｃｌｐＰ遺伝子のコーディング領域の一部を排除することにより作成できる。例えばコーディング領域の約２５〜約６００ｂｐ、約７５〜約５００ｂｐ、約１００〜約４００ｂｐ、又は全てを欠失させることができる。或いは、欠失突然変異は遺伝子の適切な読み枠がシフトするようにＳ・パラチフスＡのｃｌｐＰ遺伝子の例えば１〜１００ｂｐフラグメントを排除することにより作成できる。後者の例においては、非センスポリペプチドを作成するか、フレームシフト誘導終止コドンによりポリペプチド合成を中断させてよい。欠失の好ましい大きさは約２５〜６００ｂｐである。ｃｌｐＰ遺伝子を超えて伸びるような欠失、即ちプロモーターにおけるもののような、ｃｌｐＰ遺伝子の転写を制御するエレメントにおける欠失を作成することもできる。
【００３５】
シャペロンＡＴＰａｓｅをコードするＳ・パラチフスＡ９１５０のｃｌｐＸ遺伝子は１２７２ｂｐの大きさ（配列番号３８）であり、そしてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴヌクレオチド比較により測定した場合Ｓ・チフスＴｙ２のｃｌｐＸ遺伝子に９９％相同である。欠失突然変異体はＣｌｐＸの適切な折畳又は活性が防止されるようにＳ・パラチフスＡのｃｌｐＸ遺伝子のコーディング領域の一部を排除することにより作成できる。例えばコーディング領域の約２５〜約１２００ｂｐ、約７５〜約１１００ｂｐ、約１００〜約１０００ｂｐ、又は全てを欠失させることができる。或いは、欠失突然変異は遺伝子の適切な読み枠がシフトするようにＳ・パラチフスＡのｃｌｐＸ遺伝子の例えば１〜１００ｂｐフラグメントを排除することにより作成できる。後者の例においては、非センスポリペプチドを作成するか、フレームシフト誘導終止コドンによりポリペプチド合成を中断させてよい。欠失の好ましい大きさは約７５〜７５０ｂｐである。ｃｌｐＸ遺伝子を超えて伸びるような欠失、即ちプロモーターにおけるもののような、ｃｌｐＸ遺伝子の転写を制御するエレメントにおける欠失を作成することもできる。
【００３６】
欠失は、本明細書に記載した遺伝子座又は遺伝子のいずれかにおいて、遺伝子座又は遺伝子内に位置する好都合な制限部位を用いるか、又は、オリゴヌクレオチドを用いた部位指向性の突然変異誘発により行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８９））。
【００３７】
遺伝子座又は遺伝子の不活性かはまた、何れかの好都合な制限部位を用いた外来性ＤＮＡの挿入により、又は、オリゴヌクレオチドを用いた部位指向性の突然変異誘発（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上出）により、遺伝子座又は遺伝子の正しい転写を妨害するように行うこともできる。遺伝子座又は遺伝子を不活性化できる挿入の典型的な大きさは１塩基対〜１００ｋｂｐであるが、１００ｋｂｐより小さい挿入が好ましい。挿入は遺伝子座又は遺伝子のコーディング領域の内部、又はコーディング領域とプロモーターとの間の何れかにおいて行うことができる。
【００３８】
遺伝子座及び遺伝子の不活性化のための他の方法は他の腸内細菌のｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＡ、ｇｕａＢ、ｃｌｐＰ及びｃｌｐＸ遺伝子において起こした欠失又は挿入のサルモネラへの転移、トランスポゾン発生欠失及びＤＮＡ挿入部の不正確な切り出しを包含する。
【００３９】
好ましくは、細菌の遺伝子座及び遺伝子はラムダレッド媒介突然変異誘発を用いて突然変異させる（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７：６６４０−６６４５（２０００））。慨すれば工程１において突然変異の為にターゲティングされた宿主細菌をλＲｅｄリコンビナーゼをコードする温度感受性プラスミドで形質転換する。これらの細菌をアラビノースの存在下に生育させることによりλＲｅｄ生産を誘導する。標的配列の染色体突然変異誘発は標的遺伝子が抗生物質耐性マーカーにより置き換えられている線状ＤＮＡによる宿主のエレクトロポレーションにより達成する。このＤＮＡはまたλレッド媒介相同組み換えによる耐性マーカーの染色体組み込みを可能にするフランキング染色体配列の短鎖領域をコードしている。組み換え体は適切な抗生物質を含有する固体培地上で選択し、λＲｅｄリコンビナーゼをコードするプラスミドの消失を促進する温度においてインキュベートする。工程２においては、宿主染色体中にこの時点で存在する抗生物質耐性マーカー内のユニークな配列をターゲティングするＦＬＰリコンビナーゼをコードする温度感受性プラスミドで細菌を形質転換することにより染色体耐性マーカーの除去を促進する。形質転換体は構成的に発現されるＦＬＰリコンビナーゼの存在を可能にする温度において生育させる。突然変異体をＰＣＲによりスクリーニングし、ＦＬＰリコンビナーゼをコードするプラスミドの消失を促進する温度において生育させ、そして選択して保存に付す。
【００４０】
本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は追加的遺伝子１つ以上において突然変異を含有してよい。サルモネラｓｐｐの追加的弱毒化突然変異の広範な考察は米国特許６，６８２，７２９に示されており、例示される遺伝子は種々の生化学的経路、全般的調節系、熱ショック蛋白、他の調節遺伝子、及び推定ビルレンス特性をコードするものを包含する。このような弱毒化突然変異の特定の例は、限定しないが（ｉ）栄養要求性突然変異、例えばａｒｏ、ｇｕａ、ｎａｄ、ｔｈｙ及びａｓｄ突然変異；（ｉｉ）全般的調節機能を不活性化させる突然変異、例えばｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ、ｐｈｏＰｃ及びｏｍｐＲ突然変異；（ｉｉｉ）ストレス応答を改質する突然変異、例えばｒｅｃＡ、ｈｔｒＡ、ｈｔｐＲ、ｈｓｐ及びｇｒｏＥＬ突然変異；（ｉｖ）特定のビルレンス因子における突然変異、例えばｐａｇ及びｐｒｇ；（ｖ）ＤＮＡトポロジーに影響する突然変異、例えばｔｏｐＡ突然変異；（ｖｉ）表面多糖類の生物発生をブロックする突然変異、例えばｒｆｂ、ｇａｌＥ及びｖｉａ突然変異；（ｖｉｉ）自殺系を改質する突然変異、例えばｓａｃＢ、ｍｕｃ、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌ及びｐｈｌＡ突然変異；（ｖｉｉｉ）Ｐ２２によりコードされるリソゲン、λネズミトランスグリコシラーゼ及びＳ−遺伝子のような自殺系を導入する突然変異；及び（ｉｘ）正しい細胞周期を途絶又は改質させる突然変異、例えばｍｉｎＢ突然変異を包含する。
【００４１】
Ｂ．安定化された発現プラスミド系
本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は選択されたポリペプチド（抗原）を発現するように操作された菌株を包含する。このような弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株はＳ・パラチフスそのものへの免疫応答を誘導するため、又は、弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株により発現される選択された抗原に対する免疫応答を油どうするため、又は両方の為に使用できる。
【００４２】
そのような弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は安定化された発現プラスミド系により形質転換される。安定化された発現プラスミド系は選択された抗原をコードする。
【００４３】
安定化された発現プラスミド系はプラスミド維持系（ＰＭＳ）及び選択された抗原をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。
【００４４】
安定化された発現プラスミド系は細菌における発現ベクターの維持を、２つの独立したレベルにおいて、（１）平衡致死維持系に対する単独依存を除去すること；及び（２）プラスミド分画系を取り込むことにより発現ベクターのランダムな分離を防止し、これによりその固有性及び安定性を増強することにより最適化する。
【００４５】
ＰＭＳは（ａ）複製起点、（ｂ）分離後殺傷機能少なくとも１つ、及び（ｃ）分画機能少なくとも１つを包含する。ＰＭＳの記載したエレメントの各々は安定化された発現プラスミド系の個々のカセットであってよい。カセットの各々はカセットの５’及び３’末端に位置するユニークな制限酵素切断部位を含んでよい。
【００４６】
好ましい安定化された発現プラスミド系は参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願１１／５４２，２６４に記載されているものである。
【００４７】
１．複製起点
ＰＭＳは細胞当たり一定範囲のプラスミドコピーにまで発現ベクターを限定する制限コピー数の複製起点を包含する。種々の選択された抗原に伴う毒性は様々な程度（例えばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのような寄生性の生物から誘導される抗原に関するより高い毒性〜破傷風毒素のフラグメントＣに関する実質的無毒性）に渡っているため、本発明の安定化された発現プラスミド系は低又は中コピー数の発現ベクター（プラスミド）の何れかに基づいている。当業者の知る通り、複製起点の選択は毒性の程度に依存することになり、即ちコピー数は細菌株に対する毒性が上昇するに従って低下しなければならない。
【００４８】
複製起点は細胞当たり約２〜約７５コピー、細胞当たり約５〜約６０コピー、細胞当たり約５〜約３０コピー又は細胞当たり約５〜約１５コピーである平均コピー数を与えることが好ましい。本明細書に包含される複製起点はＥ・コリプラスミドｐＡＴ１５３（ｏｒｉＥ１、染色体当たり約６０コピー相当）、Ｅ・コリプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ｏｒｉ１５Ａ、染色体当たり約１５コピー相当）、及び、サルモネラ・ネズミチフス菌プラスミドｐＳＣ１０１（ｏｒｉ１０１、染色体当たり約５コピー相当）から誘導される。ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４及びｐＡＴ１５３に関する複製カセットの操作された起点の構造上組織は構造及び機能において類似している。
【００４９】
本発明の複製起点は天然に存在する複製起点並びに天然に存在する複製起点をコードするヌクレオチド配列に実質的に相同であり、そして天然に存在する複製起点の示す機能を保持しているヌクレオチド配列によりコードされる複製起点の両方を包含する。
【００５０】
好ましい実施形態においては、複製起点をコードするヌクレオチド配列は配列番号２８のｏｒｉＥ１配列、配列番号３０のｏｒｉ１０１配列及び配列番号２９のｏｒｉ１５Ａ配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である。
【００５１】
別の好ましい実施形態においては、複製起点は配列番号２８に示すゲノム当たり約５コピー相当のコピー数を与えるｐＳＣ１０１由来のｏｒｉＥ１遺伝子座である。
【００５２】
２．分配機能
ＰＭＳはまた、当該分野でも知られており、そして本明細書においては「分離系」及び「分配系」とも称する分配機能を包含する。分配機能は、その機能の非存在下における相当するプラスミドの送達の頻度と比較した場合に各新規分裂細菌細胞に対するプラスミドの良好な送達の頻度を増大させる作用を有する何れかのプラスミド安定性増強機能である。分配機能は、例えば等分配系、対部位（ｐａｉｒ−ｓｉｔｅ）分配系、及びＰａｒｔｉｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｂ．Ｅ．Ｆｕｎｎｅｌｌ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｓｌａｖｃｅｖ，Ｐｌａｓｍｉｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，ＢＥ Ｆｕｎｎｅｌｌ ａｎｄ ＧＪ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， ｅｄｓ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣの第５章の表１に記載の系を包含する。
【００５３】
本発明の分配系は天然に存在する分配系、並びに天然に存在する分配系をコードするヌクレオチド配列に実質的に相同であり、そして天然に存在する分配系の示す機能を保持しているヌクレオチド配列によりコードされる分配系の両方を包含する。
【００５４】
例示される分配機能は限定しないがｐＳＣ１０１、Ｆ因子、Ｐ１プロファージ及びＩｎｃＦＩＩ薬剤耐性プラスミドの系を包含する。
【００５５】
特に、ｐａｒ受動分配遺伝子座を使用できる。ｐａｒ遺伝子座の機能はＤＮＡジャイレースの結合部位でも有る複製起点における増大するプラスミドスーパーコイル化に関連していると考えられる。例示されるｐａｒ配列番号は配列番号３２に示すＥ・コリのものである（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｌｏｃｕｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＳＣ１０１，Ｇｅｎｅ ２４：３０９−１５（１９８３）；ゲンバンクアクセッション番号Ｘ０１６５４、ヌクレオチド４５２４〜４８９０））。
【００５６】
活性分配のｐａｒＡ遺伝子座も又使用してよい。例示されるｐａｒＡ遺伝子座配列は配列番号３１に示す。
【００５７】
３．分離後殺傷機能
ＰＭＳは更に分離後殺傷（ＰＳＫ）機能少なくとも１つを誘導する。ＰＳＫ機能は目的のプラスミドを継承しない何れかの新規分裂細菌細胞の死滅をもたらす機能であり、そして特に、平衡致死系、例えばａｓｄ又はｓｓｂ、蛋白性系、例えばｐｈｄ−ｄｏｃ、及びアンチセンス系、例えばｈｏｋ−ｓｏｋを包含する。
【００５８】
本発明のＰＳＫ機能は天然に存在するＰＳＫ機能、並びに天然に存在するＰＳＫ機能をコードするヌクレオチド配列に実質的に相同であり、そして天然に存在するＰＳＫ機能の示す機能を保持しているヌクレオチド配列によりコードされるＰＳＫ機能の両方を包含する。
【００５９】
好ましい実施形態においては、ＰＳＫ機能はｓｓｂ平衡致死系である。Ｓ・チフス由来の１本鎖結合蛋白（ＳＳＢ）を使用することにより染色体ｓｓｂ遺伝子内に導入された他の態様では致死性となる突然変異をトランス補完する。Ｅ・コリＳＳＢ蛋白の生化学的及び代謝的な役割はＬｏｈｍａｎら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６３：５２７，１９９４及びＣｈａｓｅら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５５：１０３，１９８６（参照により本明細書に組み込まれる）において広範に考察されている。
【００６０】
ＰＳＫ昨日がｓｓｂ平衡致死系である安定化された発現プラスミド系を含む本発明のＳ・パラチフスＡ菌株においては、細菌のネイティブのｓｓｂ遺伝子座が不活性化される。ネイティブｓｓｂ遺伝子座は何れかの当該分野で知られた手段、例えば温度感受性複製起点を含む自殺ベクター又はラムダレッド媒介突然変異誘発により不活性化してよい（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７：６６４０−６６４５（２０００））。好ましい態様において、ラムダレッド媒介突然変異誘発を用いることにより本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株のｓｓｂ遺伝子座を不活性化する。
【００６１】
本発明の別の態様において、ＰＳＫ機能は、誘導的及び構成的ｓｓｂ遺伝子プロモーターの両方がｓｓｂ ＰＳＫ機能のプロモーターとして使用されるｓｓｂ遺伝子座である。好ましい実施形態においては、ＰＳＫ機能はｓｓｂ誘導性プロモーター、ｓｓｂ構成的プロモーター及びｓｓｂコード領域を含む。好ましくは、ｓｓｂ遺伝子座はシゲラ・フレクスナー、サルモネラ・チフス及びＥ・コリの何れか１つのｓｓｂ遺伝子座である。１つの実施形態において、ｓｓｂ遺伝子座は配列番号３４に示すＳ・フレクスナー２ａ菌株ＣＶＤ１２０８ｓのｓｓｂ遺伝子座である。
【００６２】
本発明の関連する態様において、突然変異した対立遺伝子、例えばｓｓｂ−１（又はこの対立遺伝子に機能的に同等である何れかの突然変異、例えばＷ５４Ｓ；Ｃａｒｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１０６７−１０７５（１９９３））を安定化された発現プラスミド系内に取り込むことにより、ＳＳＢ１様蛋白の過剰発現により高コピー数プラスミドを増強し、これによりＳＳＢの所望の生物学的に活性な４量体を形成してよい。
【００６３】
別の実施形態において、ＰＭＳは２ＰＳＫ機能を含む。
【００６４】
４．選択された抗原
安定化された発現プラスミド系はまたプロモーター制御下に選択された抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６５】
プロモーターは好ましくはオスモル濃度のような生物学的に該当するシグナルにより制御される環境上調節可能なプロモーターである。好ましい実施形態においては、プロモーターはｏｍｐＣプロモーターである。ｏｍｐＣ遺伝子は細菌細胞の該膜内に３量体として挿入するポーリン蛋白をコードする。ｏｍｐＣの発現及び制御はＰｒａｔｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０：９１１，１９９６及びＥｇｇｅｒら、Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ ２：１６７，１９９７においてかなり詳細に考察されている。好ましい実施形態においては、Ｅ・コリ由来のｏｍｐＣプロモーターフラグメントは配列番号３３において示される。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，７０３，２３３を参照できる。このカセットの転写はｔｒｐＡ転写ターミネーターにより３’遠位領域において終止してよい。
【００６６】
１つの態様において、誘導性プロモーターは突然変異したＰｏｍｐＣ１又はＰｏｍｐＣ３プロモーターである。プロモーターは選択された抗原の下流の転写のみを制御するために使用してよい。
【００６７】
本発明は自身を発現する弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株を破壊せず、そして、抗原を発現している弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株を被験体に投与した場合に免疫応答を誘発する何れかの抗原の発現を包含する。選択された抗原は相同（Ｓ・パラチフスＡ由来）又は非相同であってよい。
【００６８】
選択された抗原の非限定的な例は：シガ毒素１（Ｓｔｘ１）抗原、シガ毒素２（Ｓｔｘ２）抗原、Ｂ型肝炎、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型、Ａ型肝炎、無細胞百日咳（ａｃＰ）、水痘、ロタウィルス、ストレプトコッカス・ニューモニア（ニューモコッカル）及びナイセリア・メニンギティディス（髄膜炎菌）を包含する。Ｅｌｌｉｓら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．，３９：３９３４２３，１９９７を参照できる（参照により本明細書に組み込まれる）。抗原がシガ毒素２抗原である場合、シガ毒素２抗原は例えばＢサブユニット５量体又は遺伝子的に脱毒素化されたＳｔｘ２であることができる。生体防御に関連する別の抗原は、１）炭疽毒素保護抗原ＰＡ８３部分のドメイン１つ以上、例えば限定しないがドメイン４（真核生物細胞結合ドメイン；Ｄ４），ＰＡ８３のプロセシングされた６３ｋＤａの生物学的に活性な形態、又は、完全長ＰＡ８３；及び２）何れかの組合せにおける何れかの神経毒血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧの真核生物細胞結合重鎖フラグメントを含むクロストリジウム・ボツリナム抗原を包含する。他の選択された抗原は参照により本明細書に組み込まれる米国特許６，１９０，６６９に開示されているものの各々を包含する。
【００６９】
１つの態様において、選択された抗原は癌に対する免疫応答を誘導する抗原である。別の態様においては、選択された抗原は自己抗原、自己免疫又は免疫学的疾患に関与するとされているＢ細胞受容体及び／又はＴ細胞受容体に対する免疫応答を誘発するように設計される。例えば身体組織又は環境の抗原に対抗して不適切な免疫応答が生じた場合、本発明の免疫化組成物を用いることにより自己抗原、Ｂ細胞受容体及び／又はＴ細胞受容体に対する免疫応答を誘導し、これにより応答をモジュレートして疾患を緩解してよい。例えばこのような手法は重症筋無力症、全身エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、アレルギー及び喘息を治療する場合に効果的である。
【００７０】
本発明の別の態様において、安定化された発現プラスミド系は選択可能なマーカー又は温度感受性マーカー、例えば薬剤耐性マーカーをコードするポリヌクレオチドを包含してよい。薬剤耐性マーカーの非限定的な例はアミノグリコシドカナマイシン及び／又はネオマイシンに対する耐性を付与することが当該分野で知られているａｐｈを包含する。
【００７１】
本明細書においてヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に言及している場合の「実質的に相同」又は「実質的な相同体」という用語は、核酸配列又はアミノ酸配列が、相当するレファレンス配列と同じ基本的機能をその配列が果たすことができる程度に十分な相同性を、レファレンス配列と比較した場合に有していることを指し；実質的に相同な配列は典型的にはレファレンス配列と比較した場合に少なくとも約７０パーセント配列上同一であり、レファレンス配列と比較した場合に、典型的には少なくとも約８５パーセント配列上同一であり、好ましくは少なくとも約９０又は９５パーセント配列上同一であり、そして最も好ましくは約９６、９６、９８又は９９パーセント配列上同一である。明細書全体を通じて、特定のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列に言及する場合は、そのようなヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列は実質的に相同な配列と置き換えてよい。
【００７２】
Ｃ．免疫応答を誘導する方法
本発明はまた被験体における免疫応答を誘導する方法を包含する。免疫応答は弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株自体、安定化された発現プラスミド系により形質転換された弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株により発現される選択された抗原、又は両方に対するものであってよい。
【００７３】
１つの実施形態において免疫応答を誘導する方法は、本発明の菌株１つ以上を被験体において免疫応答を誘導するために十分な量で被験体に投与することを含む。本明細書においては、本発明の菌株は未形質転換及び形質転換された弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株の両方を包含する。
【００７４】
さらなる実施形態において、免疫応答を誘導する方法は、本発明の菌株１つ以上を含む医薬品製剤を被験体において免疫応答を誘導するために十分な量（免疫学的有効量）で被験体に投与することを含む。
【００７５】
簡便の為に、本発明の菌株及び菌株を含む医薬品製剤を本明細書においては「免疫化組成物」と称する。当業者の知る通り、免疫化組成物はワクチンと同義語である。
【００７６】
本明細書においては、「免疫応答」とは免疫化組成物に対する被験体の免疫系の生理学的応答を指す。免疫応答は先天免疫応答、適応免疫応答又は両方を包含してよい。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態においては、免疫応答は保護免疫応答である。保護免疫応答は被験体に対して免疫学的な細胞記憶を付与するものであり、同じか同様の抗原への二次的曝露が以下の特性、即ち：免疫化組成物への以前の曝露が非存在の場合の選択された抗原への曝露に起因する誘導期より短い誘導期；免疫化組成物への以前の曝露が非存在の場合の選択された抗原への曝露に起因する抗体生産よりも長期間継続する抗体生産；免疫化組成物への以前の曝露が非存在の場合の選択された抗原への曝露により生産される抗体の型及び質と比較した場合に生産された抗体の型及び質が変化していること；免疫化組成物への以前の曝露が非存在の場合の選択された抗原への曝露に応答して生じる場合よりも、ＩｇＧ抗体がＩｇＭより高濃度及び長期持続において生じるクラス応答のシフト；免疫化組成物への以前の曝露が非存在の場合の選択された抗原への曝露に起因する抗原に対する抗体の平均親和性と比較した場合の抗原に対する抗体の増大した平均親和性（結合定数）；及び／又は二次免疫応答を特徴付ける当該分野で知られた他の特性の１つ以上を特徴とする作用を有する。
【００７８】
免疫化組成物を投与してよい被験体は好ましくはヒトであるが、他の哺乳類、例えばサル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ又はブタ、又はトリ、例えばニワトリであってもよい。
【００７９】
１つの実施形態において、被験体はＳ・パラチフスＡ感染症を発症する危険性のある被験体である。別の実施形態においては、被験体はＳ・チフス感染症又はＳ・パラチフスＡ感染症に対して免疫学的にナイーブであるか、又は、既存の免疫を呈する。
【００８０】
さらなる実施形態においては、本発明の菌株を投与する被験体はパラチフス熱に対して保護免疫応答を発生させる。
【００８１】
Ｄ．製剤、用量及び投与様式
本発明の弱毒化菌株は、未形質転換及び安定化された発現プラスミド系で形質転換されたものの両方とも、免疫応答を誘導するために被験体に投与してよい。好ましい実施形態においては本発明の菌株は医薬品製剤において投与する。
【００８２】
本発明の医薬品製剤は製薬上許容しうる担体、賦形剤、他の成分、例えばアジュバントを包含してよい。製薬上許容しうる担体、賦形剤、他の成分は本発明の菌株と適合性があり、そしてそのレシピエントに対して予定外の有害性を呈さない化合物、溶液、物質又は材料である。特に、本発明の担体、賦形剤、他の成分は、一般的に安全、非毒しえ及び生物学的にも他の点においても有害とならず、そして薬理学的に好適なプロファイルを呈する医薬品製剤の調製において有用なものであり、そして、家畜用並びにヒト用の医薬品用途において許容される担体、賦形剤、他の成分を包含する。
【００８３】
適当な製薬上許容しうる担体及び賦形剤は当該分野で良く知られており、そして臨床上今日の必要性に応じて当業者が決定できる。当業者の知る通り、希釈剤は担体及び賦形剤の用語の範囲内に包含される。適当な担体及び賦形剤の例は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、より詳細には（１）約１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミンを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸塩緩衝食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％食塩水（０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ）、（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロース及び（４）水を包含する。
【００８４】
本発明の免疫化組成物の投与の様式は、被験体への免疫応答の誘導をもたらすような何れかの適当な送達手段及び／又は方法であってよい。送達手段は、限定しないが、非経腸投与方法、例えば皮下（ＳＣ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、経皮、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、並びに経腸、例えば、経口、経鼻、膣内、肺（吸入）、眼内、直腸投与、又は粘膜組織に接触する免疫化組成物を生じさせる何れかの他の様式によるものを包含してよい。好ましくは投与は経口である。
【００８５】
本発明の１つの実施形態において、免疫化組成物は吸入による送達のための霧状化分散体として存在する。種々の液体及び粉末の製剤を治療すべき被験体の肺内への吸入のために従来の方法により調製できる。免疫化組成物の霧状化分散体は典型的には霧状化又はエアロゾル化分散体に共通の担体、例えば緩衝食塩水及び／又は当該分野で良く知られている他の化合物を含有する。吸入による免疫化組成物の送達は粘膜組織の広範な領域に免疫化組成物を急速に分散させること、並びに、免疫化組成物の循環のための血液による急速な取り込みという作用を有する。
【００８６】
更に又、免疫化組成物はまた液体形態で存在する。液体は経口投薬用、眼内又は鼻内等薬用に滴下剤として、又は浣腸又は圧注剤としての用途であることができる。免疫化組成物を液体として製剤する場合、液体は免疫化組成物の溶液又は懸濁液の何れかであることができる。当該分野で良く知られている免疫化組成物の溶液又は懸濁液のための適当な製剤はその意図される用途に応じて種々のものが存在する。水又は他の水性ベヒクル中に調製される経口投与用の液体製剤は種々の懸濁剤、例えばメチルセルロース、アルギネート、トラガカント、ペクチン、ケルギン、カラギーナン、アカシア、ポリビニルピロリドン、及びポリビニルアルコールを含有してよい。液体製剤はまた、免疫化組成物と共に水和剤、甘味料及び着色フレーバー剤を含有する溶液、乳液、シロップ及びエリキシルを包含してよい。
【００８７】
経口投薬を介した液体形態における記載した免疫化組成物の送達は、胃腸及び泌尿器の管の粘膜を免疫化組成物に曝露する。胃のｐＨ範囲に抵抗できるように安定化された適当な用量は、胃腸管の全ての部分、特にその上部に対し、免疫化組成物を送達する。組成物の有効な送達が胃腸管に沿って分布するように液体経口剤型の免疫化組成物を安定化させる何れかの方法が本明細書に記載した免疫化組成物と共に使用されることを意図しており、酸性ｐＨに対して弱毒化細菌を保護するためのカプセル及び再懸濁緩衝液が包含される。使用される特定の製薬上許容しうる担体又は希釈剤は本発明にとって重要ではなく、当該分野で慣用的なものである。希釈剤の例は、胃内の胃酸に対して緩衝作用を示すための緩衝液、例えばスクロースを含有するクエン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）、重炭酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）単独又はアスコルビン酸、乳糖及び場合によりアスパルテームを含有する重炭酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を包含する（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｌａｎｃｅｔ，ＩＩ：４６７−４７０（１９８８））。担体の例は、蛋白、例えば脱脂乳中に存在するもの；糖類、例えばスクロース；又はポリビニルピロリドンを包含する。
【００８８】
点眼液を介した液体形態における記載した免疫化組成物の送達は眼及び関連組織の粘膜を免疫化組成物に曝露させる。点眼液用の典型的な液体担体は緩衝性付与され、そしてよく知られた当業者が容易に発見できる他の化合物を含有する。
【００８９】
点鼻薬を介した液体形態における記載した免疫化組成物の送達は鼻及び副鼻腔及び関連組織の粘膜を免疫化組成物に曝露させる。点鼻液用の液体担体は典型的には種々の形態の緩衝食塩水である。
【００９０】
免疫化組成物の注射用製剤は種々の担体、例えば植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）等を含有してよい。生理学的に許容される賦形剤は例えば５％デキストロース、０．９％食塩水、リンゲル液又は他の適当な賦形剤を包含してよい。筋肉内投与用の調製品は製薬用賦形剤、例えば注射用水、０．９％食塩水又は５％グルコース溶液中において投与できる。
【００９１】
本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は他の適当な薬理学的又は生理学的に活性な薬剤、例えば抗原性及び／又は他の生物学的に活性な物質と連携して被験体に投与してよい。
【００９２】
安定化された発現プラスミド系を含む弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は選択された抗原の発現が開始される前、同時、又は後に被験体に投与してよい。例えば、安定化された発現プラスミド系を含む弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は、細菌の投与時に選択された抗原に対して免疫応答が生じるように十分な量の選択された抗原を細菌が生産できるように被験体への投与の前に培養してよい。
【００９３】
本発明の免疫化組成物の投与の量及び速度は例えば従来の抗体力価測定手法及び従来の生物薬効／生体適合性のプロトコルを用いることにより、予定外の実験を行うことなく当業者が容易に決定してよい。投与の量及び速度は被験体の体重及び健康状態、被験体に投与する細菌の実体、選択された抗原を発現するように操作された菌株において発現されるポリペプチドの実体、所望の治療効果、所望の生物活性持続時間、及び、免疫化組成物の投与の様式のような要因に基づいて変動する。
【００９４】
一般的に、被験体に投与する免疫化組成物の量は、Ｓ・パラチフスＡ菌株に対し、又は、Ｓ・パラチフスＡ菌株により発現されるべき選択された抗原に対し、被験体において免疫応答を誘導するために十分な量である（免疫学的有効量）。好ましくは、免疫応答は保護免疫応答である。
【００９５】
一般的に使用される用量はＳ・パラチフスＡ菌株約１０２ｃｆｕ〜１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１０２ｃｆｕ〜１０７ｃｆｕ又は、約１０６ｃｆｕ〜１０９ｃｆｕを含有する。経口投与用の製剤はＳ・パラチフスＡ菌株約１０２ｃｆｕ〜１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１０５ｃｆｕ〜１０９ｃｆｕを含有し、そして製剤は胃内の酸性ｐＨに対して弱毒化細菌を保護するためにカプセル化又は緩衝溶液中に再懸濁する。経鼻投与用の製剤はＳ・パラチフスＡ菌株約１０２ｃｆｕ〜１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１０２ｃｆｕ〜１０７ｃｆｕを含有し、そして点鼻薬中又はエアロゾル中で細菌を与える鼻内投与の為に使用される。
【００９６】
免疫化組成物は単一用量において、又は多用量において、長期間に渡り投与してよい。特に免疫化組成物は１週間、２週間、３週間、１ヶ月、６週間、２ヶ月、１０週間、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年の期間に渡り、又は１年より長期の延長された期間、投与してよい。
【００９７】
免疫化組成物は均一用量及び簡易投薬のための投与単位において提供してよい。各単位剤型は製薬上許容しうる担体、賦形剤又は他の成分と共に、所望の免疫応答をもたらすように計算された本発明の菌株の所定量を含有する。
【００９８】
本発明はまた、本発明の免疫化組成物１つ以上、及び場合により組成物を投与するための手段、及び、組成物を投与するための説明書を含むキットを包含する。
【実施例】
【００９９】
１．細菌株及び培養条件
エシェリシア・コリ菌株ＤＨ５アルファを全プラスミド構築の為に使用した。生菌弱毒化Ｓ・チフス菌株ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡは欠失突然変異を、芳香族化合物生合成経路を中断するａｒｏＣ及びａｒｏＤにおいて、そして、ストレス応答蛋白をコードするｈｔｒＡにおいて保有している（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６０：２（１９９２），ｐｐ．５３６−５４１及びＪ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：１−３（１９９６），ｐｐ．１９３−１９６参照）。Ｓ・パラチフスＡ９１５０ロット番号１１８４８はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より購入し、ＣＶ２２３及びＣＶ２２４として保存した。ＣＶ２２３を全実験において使用した。
【０１００】
Ｅ・コリＤＨ５アルファは必要に応じて、抗生物質カルベニシリン（ｃａｒｂ；５０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（ｋａｎ；５０μｇ／ｍＬ）又はクロラムフェニコール（ｃｍｌ；２５μｇ／ｍＬ）を添加したＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）液体培地又は観点（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ）を用いて生育させた。ＣＤ９０８−ｈｔｒＡ及びＳ・パラチフスＡ ９１５０及びその誘導体はグアニン（０．００１％ｖ／ｖ）及び必要に応じて添加した抗生物質を含有する２ｘダイズ培地（リットル当たり２０ｇＨｙ−ｓｏｙペプトン、１０ｇＨｙ−ｓｏｙコウボエキス、３ｇＮａＣｌ、±１５ｇの顆粒化寒天（Ｄｉｆｃｏ））と共に生育させた。液体培養物は特段の記載が無い限り１６〜２４時間２５０ｒｐｍにおいて３０℃又は３７℃でインキュベートした。
【０１０１】
補完性分析のために使用した変性最小培地（ＭＭＭ）の組成はＭ９塩（Ｋ２ＨＰＯ４、７ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、３ｇ／Ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／Ｌ（ｐＨ７．５））、０．５％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、顆粒化寒天（Ｄｉｆｃｏ）リットル当たり１５ｇ及び１μｇ／ｍＬビタミンＢ１とした。
【０１０２】
２．プラスミド及び分子遺伝子的手法
本発明に記載したプラスミドのコンストラクトのためには標準的な手法を使用した（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）。プラスミドの抽出及びＤＮＡフラグメントのゲル精製は、製造元の指示に従ってそれぞれＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ及びＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて実施した（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。プラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ又はｐＧＥＭ（登録商標）−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、ＶｅｎｔＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて形成したブラント末端のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物をクローニングするための中間体として使用した。プラスミドｐＬｏｗＢｌｕ１８４（Ｅ．Ｍ．Ｂａｒｒｙ，未公開データ；ＣＶＤ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）はｐＡＣＹＣ１８４（ＡＴＣＣ）に基づいた低コピー数プラスミドであるが、ＡｖａＩとＨｉｎｄＩＩＩの間にテトラサイクリン耐性遺伝子の変わりにｐＧＥＭ（登録商標）−５Ｚｆ（＋）由来のラクトースオペロン配列（２７６７−２７３ｂｐ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含有している。Ｔａｑ−ＰｒｏＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉ．，Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、ＮＪ）をラムダレッド媒介突然変異誘発のため、及び、滅菌水２０μＬ中に希釈した細菌単コロニー５μＬを用いた診断ＰＣＲの為に使用した。Ｔａｑ−ＰｒｏＴＭＤＮＡポリメラーゼはまた、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ又はｐＧＥＭ（登録商標）−ＴＥａｓｙ内へのクローニングの前にＶｅｎｔＴＭ ＤＮＡポリメラーゼにより形成した前処理ＰＣＲフラグメントに添加するために使用した。全ての制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより購入した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてブラント末端を有するＤＮＡフラグメントを作成した。菌株のエレクトロポレーションは２．５ｋＶ、２００Ω及び２５μＦに設定したＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において実施した。ＤＮＡゲル電気泳動において使用した分子量マーカーは直ぐに使用できるＯ’ＧｅｎｅＲｕｌｅｒＴＭ １ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（＃ＳＭ１１６３、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ）である。
【０１０３】
３．ラムダレッド媒介突然変異誘発
この手法はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００ Ｊｕｎ ６；９７（１２）：６６４０−５０）に記載の通り、特定の変更を加えながら実施した。慨すれば、レッドヘルパープラスミドｐＫＤ４６（このプラスミドに関する詳細はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒの参考文献を参照）を担持した細菌１０コロニーをカルベニシリン及びＬ−アラビノース（０．２％）を添加した２ｘダイズ培地２０ｍＬに添加し、３時間２５０ｒｐｍで３０℃において生育させた（〜０．６のＯＤ６００ｎｍ）。冷却滅菌水で３回洗浄し、１００倍濃縮することにより細菌を電気コンピテントとした。コンピテント細胞をゲル精製ＰＣＲ産物１００ηｇ〜１μｇでエレクトロポレーションに付した。エレクトロポレーションの後、グアニンの存在下又は非存在下に２ｘダイズ培地を用いながら細菌を修復した。細胞を３時間３７℃で２ｘダイズ培地中インキュベートした後に、一夜、グアニン及びｃｍｌを含有する２ｘダイズ寒天上にプレーティングした。抗生物質耐性コロニーを選択し、目的の染色体領域中の改変があるものをＰＣＲによりスクリーニングした。陽性コロニーをｃｍｌを含有するがカルベニシリンを含有しない２ｘダイズ培地上に再植菌し、ｐＫＤ４６の消失を確認した。ｃｍｌ耐性カセットの除去はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒの記載に従って実施し、ｐＣＰ２０を使用した。所望の遺伝子型を示したコロニーを、抗生物質を含有しない２ｘダイズ培地に再植菌し、抗生物質耐性表現型の消失を確認した。保存の為に選択したものをＰＣＲにより再スクリーニングした後に２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する２ｘダイズ培地中−７０℃で凍結した。
【０１０４】
４．凝集
Ｓ・パラチフスＡ菌株は市販の血清（ＤｉｆｃｏＴＭ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｏ Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ Ｇｒｏｕｐ Ａ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ロット番号＃４０９２２２１）を用いて試験した。慨すれば新しいプレートから採取した細菌の少量種菌をスライドガラス上のＰＢＳ ２０μＬ中に懸濁した。抗血清５μＬを添加し、凝集が観察されるまでスライドを穏やかに振とうした。Ｓ・フレクスナーワクチン菌株ＣＶＤ１２０８（Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００４ Ｎｏｖ １５；１９０（１０）：１７４５−５４）又はＥ・コリＤＨ５アルファを陰性対照細菌として使用した。
【０１０５】
５．マウス腹腔内接種によるビルレンスの試験
サルモネラのビルレンスはＩｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００１ Ａｕｇ；６９（８）：４７３４−４１において報告されている通り試験した。慨すれば、６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ）（群当たりマウス３匹、ワクチン菌株当たり３群）に最終容量０．５ｍＬにおいて１０％（ｗ／ｖ）ブタ胃ムチン（Ｄｉｆｃｏ，ロット番号４０９２０１８）と混合した細菌（必要に応じてグアニン及び抗生物質の存在下に生育させ、そしてリン酸塩緩衝食塩水ＰＢＳに再懸濁した）の種々の１０倍希釈物を腹腔内（ｉｐ）注射した。マウスは接種後７２時間に渡り２４時間毎に極限的瀕死状態（死亡直前）又は死亡に関してモニタリングした。マウス各群に関する５０％致死用量（ＬＤ５０）を直線回帰分析により計算した。
【０１０６】
６．ｇｕａＢＡの欠失の構築
Ｓ・パラチフスＡゲノムの配列決定は本プロジェクト開始時には完了していなかった。従って、ラムダレッド媒介突然変異誘発用の全てのオリゴヌクレオチドプライマー及びその後のＤＮＡ鋳型はアノテーションされているＳ・チフスＴｙ２ゲノム配列（ゲンバンクアクセッション番号ＮＣ＿００４６３１、２００４年１２月１６日バージョン）に基づいて構築した。Ｓ・パラチフスＡにおいて突然変異した領域をＳ・チフスのものと配列比較したところ、９９％超のＤＮＡ配列同一性が判明した。
【０１０７】
イノシン−５’−モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇｕａＢ）及びグアノシンモノホスフェート合成酵素（ｇｕａＡ）をコードする遺伝子はオペロンを形成し、そしてＳ・チフスＴｙ２ゲノム上の４１４０５９〜４１７１７８ｂｐに位置している（配列番号２６；ｇｕａＢＡ遺伝子座に関する詳細な情報は米国特許６，１９０，６６９も参照できる）。プライマーＣＶＯＬ１３およびＣＶＯＬ１５（表１）は突然変異の為に設計された領域の外部の配列に結合する。プライマーＣＶＯＬ２８及びＣＶＯＬ３２はラムダレッド鋳型プラスミドｐＫＤ３の領域に結合するように設計した。得られたＰＣＲ産物はそれぞれＳ・チフスＴｙ２ゲノム上の４１３８４６〜４１３９４５（ＣＶＯＬ２８）及び４１７１０９〜４１７０１０（ＣＶＯＬ３２）の位置においてｇｕａＢＡに相同な配列の１００ｂｐにより何れかの側がフランキングされたｃｍｌ耐性カートリッジをコードしていた。
【０１０８】
【化１】
【０１０９】
【化２】
ａ．プライマーは５’＞３’の方向に列挙し、制限酵素切断部位は下線を付した。ｂ．Ｓ・チフスＴｙ２ゲノム（ゲンバンクアクセッション番号ＮＣ＿００４６３１）又はプラスミドｐＫＤ３（ゲンバンクアクセッション番号ＡＹ０４８７４２）に相同な領域を示す。
【０１１０】
Ｓ・パラチフスＡ９１５０を電気コンピテントとし、ｐＫＤ４６で形質転換することにより、ＣＶ２５０菌株を得た。ラムダレッド突然変異誘発はｃｍｌ耐性マーカーを含有する鋳型ｐＫＤ３と共にプライマーＣＶＯＬ２８及びＣＶＯＬ３２を用いながら形成したＰＣＲ産物を用いてＣＶ２５０上で実施した（このプラスミドに関する追加的情報はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒの参考文献を参照）。形質転換体は３７℃でプレーティングし、ｃｍｌ耐性を示したものをＣＶＯＬ１３及びＣＶＯＬ１５を用いたＰＣＲによりスクリーニングした。Ｓ・パラチフスＡ９１５０から増幅した未修飾のｇｕａＢＡは〜３．５ｋｂ（図１、レーン１）であることが解ったのに対し、〜１．４ｋｂのフラグメントが突然変異したｇｕａＢＡ領域を有する２つのクローンにおいて観察された（図１、レーン２及び３）。これらの突然変異体はそれぞれＣＶ４１１及びＣＶ４１２と命名した。ｐＣＰ２０（このプラスミドに関する追加的情報はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒの参考文献を参照）によるこれらの突然変異体の処理によりｃｍｌ耐性カートリッジが遊離した。４種の欠失株をプライマーＣＶＯＬ１３及びＣＶＯＬ１５を用いたＰＣＲにより分析したところ、ｇｕａＢＡ：：ｃｍｌ先祖（図２、レーン１）と比較して〜０．５ｋｂバンド（図２、レーン２〜４）を有していることが解った。得られたＳ・パラチフスＡ９１５０のｇｕａＢＡ欠失体はＣ４１５〜ＣＶ４１８と命名した。ＣＶ４１５において突然変異したｇｕａＢＡ領域をＣＶＯＬ１３及びＣＶＯＬ１５を用いてＰＣＲ増幅し、産物を配列決定し（ポリヌクレオチド配列、配列番号１）；配列番号１の５’及び３’領域はｇｕａＢＡに相同であるのに対し、中央領域はｐＫＤ３に相同である。後の全ての試験について菌株ＣＶ４１５を選択した。
７．ｇｕａＢＡにおける欠失のインビトロ補完
Ｓ・パラチフスＡ９１５０は明確化されていない栄養要求性を含有しているため、カザミノ酸を添加することなく最小培地上で生育させることはできない。ＡＴＣＣ菌株１１５１１及びＣＶＤ Ｓ・パラチフスＡ単離株５１６もまた最小培地中では生育できず、それらがＳ・パラチフスＡ９１５０で観察されたものと同様の栄養要求性を有していることが示唆される。
【０１１１】
ＣＶ４１５においてｇｕａＢＡのみをラムダレッド媒介突然変異誘発がターゲティングすることを明らかにするために、ラクトースプロモーター（ＰｌａｃＺ）の制御下においてｇｕａＢＡをコードする最小フラグメントを含有するｐＬｏｗＢｌｕ１８４系（低コピー数）プラスミドを設計した。プライマーＣＶＯＬ１３及びＣＶＯＬ４１を用いながら、開始コドンの８ｂｐ上流に最適化リボソーム結合部位（ＧＡＡＧＧＡＧ）を有するｇｕａＢＡをコードする〜３．１ｋｂフラグメントを増幅し、その際、ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡの染色体を鋳型として使用した。このフラグメントをｐＧＥＭ（登録商標）−ＴＥａｓｙにサブクローニングし、ＲｃｏＲＩで切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでブラント末端化し、そしてｐＬｏｗＢｌｕ１８４のＮｏｔＩ部位にクローニングすることによりｐＡＴＧｇｕａＢＡを作成した（ＣＶ２９５中に保存）。
【０１１２】
ＣＶ４１５はｐＡＴＧｇｕａＢＡ又はｐＬｏｗＢｌｕ１８４（対照）の何れかとエレクトロポレーションに付し、そしてグアニン及びｃｍｌを含有する２ｘダイズ培地上にプレーティングすることにより、菌株ＣＶ４８６及びＣＶ４８７をそれぞれ作成した。グアニンを含有しない２ｘダイズ培地はｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡの生育を支援することができない。各々の単コロニーをｃｍｌを含有するＭＭＭ上に再植菌し、一夜３７℃にてインキュベートした。図３に示す通り、ＣＶ４８６は対照（ＣＶ４８７；プレート１）とは対照的にＭＭＭ上で生育することができ（プレート２）、ｐＡＴＧｇｕａＢＡにクローニングされた最小フラグメントがＣＶ４１５の染色体からのｇｕａＢＡの欠失を補完できることを示している。
８．ＣＶ４１５における第２欠失の構築
野生型（ｗｔ）の遺伝子型へのｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡ９１５０の復帰を最小限にするために、第２弱毒化マーカーとして別の遺伝子をターゲティングした。これらの遺伝子はｃｌｐＰ及びｃｌｐＸであり、これらはそれぞれセリンプロテアーゼ及びシャペロンＡＴＰａｓｅをコードしている（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）．２００４ Ｆｅｂ；１２（２）：１７５−８３参照）。ｃｌｐＰ及び／又はｃｌｐＸの欠失はマウスにおいてサルモネラ・ネズミチフス菌のコロニー形成能力を有意に低減することがわかっている（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００１ Ｍａｙ；６９（５）：３１６４−７４）。Ｓ・チフスＴｙ２において、ｃｌｐＸ（配列番号３９）及びｃｌｐＰ（配列番号４０）は両方とも、それぞれ染色体の相補鎖上の２４８３５９７〜２４８５７４３（配列番号２７）の間に位置しており、そして個別のプロモーターから発現される。ｃｌｐＸ又はｃｌｐＰの何れかにおける単一の欠失を含有する突然変異体のビルレンスをマウスにおいて比較できるように野生型Ｓ・パラチフスＡ９１５０もまた突然変異誘発に付した。
【０１１３】
ｃｌｐＸを欠失させるために、ＣＶＯＬ８５及び８６がＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来の開始コドンを欠失したｃｌｐＸをコードする〜１．３ｋｂのフラグメントを増幅するように設計した。このフラグメントをカラム精製し、Ｔａｑ−ＰｒｏＴＭＤＮＡポリメラーゼ処理し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ内にクローニングした（ＣＶ４７２中保存）。得られたベクターｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＸをＮｒｕＩ及びＥｃｏＲＩで消化して〜０．９ｋｂのフラグメントを除去し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することによりブランと末端を作成した。ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯから単離したｃｍｌカートリッジをブラント末端化し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＸ内に挿入した。このｃｍｌカートリッジは鋳型としてのｐＫＤ３と共にＣＶＯＬ２５及びＣＶＯＬ２６を用いたＰＣＲにより予め作成しておいた（ＣＶ１３４中に保存）。ライゲーション及び形質転換の後、プライマーＣＶＯＬ２６及びＣＶＯＬ８５と共にＰＣＲを使用することによりラムダレッド突然変異誘発に関して正しい方向におけるｃｍｌカートリッジの挿入を確認した。陽性クローンを発見し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：（ｃｌｐＸ：：ｃｍｌ）と命名し、ＣＶ４８１中に保存した。
【０１１４】
ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡ（ＣＶ４１５）をｐＫＤ４６で形質転換し、ＣＶ４２１として保存した。ＣＶ４２１及びＣＶ２５０（ｐＫＤ４６で形質転換された野生型Ｓ・パラチフスＡ９１５０）をラムダレッド突然変異誘発に付し、〜１．４ｋｂのＰＣＲ産物をＣＶＯＬ８５及びＣＶＯＬ８６を用いながらｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：（ｃｌｐＸ：：ｃｍｌ）から増幅した。ｃｍｌ耐性突然変異体を単離し、ＣＶＯＬ８５及びＣＶＯＬ８６に相同な領域外の領域に結合するＣＶＯＬ８７及びＣＶＯＬ８８を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。正しいＰＣＲプロファイルを示す突然変異体をｃｍｌカートリッジを除去するためのｐＣＰ２０処理のために選択した。図４は改変されたｃｌｐＸ遺伝子を含有する突然変異体は未改変のＳ・パラチフスＡ９１５０（パネルＡ、レーン７）で観察されたものと比較して、ＰＣＲにより、より小さい〜０．６ｋｂのバンド（パネルＡ、レーン１〜６）を呈したことを示している。ＣＶＯＬ１３及び１５による同じ菌株のＰＣＲ分析ではｇｕａＢＡがＣＶ４１５から誘導された菌株からのみ欠失し、ＣＶ２５０の場合は欠失しなかったことが確認された（パネルＢ、レーン４〜６ｖｓレーン１〜３及び７）。ｃｌｐＸ及びｃｌｐＸとｇｕａＢＡの両方を欠失した突然変異体はそれぞれＣＶ５３２及びＣＶ５３４として保存した。ＣＶ５３２及びＣＶ５３４内の突然変異したｃｌｐＸ領域をプライマーＣＶＯＬ８７及びＣＶＯＬ８８でＰＣＲ増幅し、産物を配列決定（配列番号２）し；配列番号２の５’及び３’領域はｃｌｐＸに相同であるのに対し、中央領域はｐＫＤ３に相同である。
【０１１５】
ｃｌｐＰを欠失させるために、ＣＶＯＬ８９及び９０がＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来の開始コドンを欠失したｃｌｐＰをコードする〜０．７ｋｂのフラグメントを増幅するように設計した。このフラグメントをカラム精製し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ内にクローニングし、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＰを作成した（ＣＶ４７０中保存）。ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＰをＰｓｔＩ及びＮｓｉＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、再ライゲーション（ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＰｍを作成、ＣＶ４８４として保存）することによりベクター骨格からＮｄｅＩ及びＨｉｎｃＩＩ部位を除去した。次にｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＰｍをＮｄｅＩ及びＨｉｎｃＩＩで消化することにより合計〜０．５ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメントを除去し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理した。上記と同様にして、ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯから単離したｃｍｌカートリッジをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理し、そしてｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＰｍから除去したフラグメントを置き換えるために使用した。ライゲーション及び形質転換の後、プライマーＣＶＯＬ２６及びＣＶＯＬ８５と共にＰＣＲを使用することによりラムダレッド突然変異誘発に関して正しい方向におけるｃｍｌカートリッジの挿入を確認した。陽性クローンを発見し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：（ｃｌｐＰｍ：：ｃｍｌ）と命名し、ＣＶ５０１中に保存した。
【０１１６】
野生型及びｐＫＤ４６を含有するｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡ９１５０（それぞれＣＶ２５０及びＣＶ４２１）をラムダレッド突然変異誘発に付し、〜１．４ｋｂのＰＣＲ産物をＣＶＯＬ８９及びＣＶＯＬ９０を用いながらｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：（ｃｌｐＰｍ：：ｃｍｌ）から増幅した。ｃｍｌ耐性突然変異体を単離し、ＣＶＯＬ８９及びＣＶＯＬ９０に相同な領域外の領域に結合するＣＶＯＬ９１及びＣＶＯＬ９２を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。正しいＰＣＲプロファイルを示す突然変異体をｃｍｌカートリッジを除去するためのｐＣＰ２０処理のために選択した。
【０１１７】
図５は改変されたｃｌｐＰ遺伝子を含有する突然変異体は未改変のＳ・パラチフスＡ９１５０（パネルＡ、レーン７）で観察されたものと比較して、ＰＣＲにより、より小さい〜０．４ｋｂのバンド（パネルＡ、レーン１〜６）を呈したことを示している。ＣＶＯＬ１３及び１５による同じ菌株のＰＣＲ分析ではｇｕａＢＡがＣＶ４１５から誘導された菌株からのみ欠失し、ＣＶ２５０によるものの場合は欠失しなかったことが確認された（パネルＢ、レーン４〜６ｖｓレーン１〜３及び７）。ｃｌｐＰ及びｃｌｐＰとｇｕａＢＡの両方を欠失した突然変異体はそれぞれＣＶ５２８及びＣＶ５３０として保存した。ＣＶ５２８及びＣＶ５３０内の突然変異したｃｌｐＰ領域をプライマーＣＶＯＬ８７及びＣＶＯＬ８８でＰＣＲ増幅し、産物を配列決定（ポリヌクレオチド配列、配列番号３）し；配列番号３の５’及び３’領域はｃｌｐＰに相同であるのに対し、中央領域はｐＫＤ３に相同である。
【０１１８】
９．補完性分析のための低コピープラスミドの構築
上記において実施した通り、ラムダレッド媒介突然変異誘発は特定の遺伝子座のみをターゲティングしたことを確認するために、ｃｌｐＸ又はｃｌｐＰ、又はｃｌｐＸ又はｃｌｐＰの何れかの直ぐ下流のｇｕａＢＡをコードするに最小フラグメントを含有するモノ又はビシストロン性のｐＬｏｗＢｌｕ１８４系（低コピー数）プラスミドを設計した。これらのプラスミドにおける遺伝子の構成的発現はＰｌａｃＺにより指向した。
【０１１９】
プライマーＣＶＯＬ６４及びＣＶＯＬ６５を用いることにより、５’及び３’末端においてそれぞれＮｄｅＩ及びＮｓｉＩ制限部位を有する増強されたリボソーム結合部位を含有するＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来のｇｕａＢＡをＰＣＲ増幅した。産物をカラム精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ内にライゲーションし（ＣＶ３９４として保存）、〜３．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＮｓｉＩフラグメントとして切り出し、ｐＬｏｗＢｌｕ １８４内のＮｄｅＩ及びＮｓｉＩ部位にクローニングし、ｐｇｕａＢＡＶ．２を作成した（ＣＶ４８２として保存）。
【０１２０】
ｃｌｐＰをコードする低コピー数プラスミドを作成するために、プライマーＣＶＯＬ１２２及びＣＶＯＬ１２３を用いることにより、５’及び３’末端においてそれぞれＮｏｔＩ及びＮｒｕＩ部位を有するＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来の増強されたリボソーム結合部位を有するｃｌｐＰを増幅した。〜０．７ｋｂの産物をカラム精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ内にライゲーションし（ＣＶ５６７として保存）、ＮｏｔＩ−ＮｒｕＩフラグメントとして切り出し、予めＮｏｔＩ及びＮｄｅＩで切断しておいたｐＬｏｗＢｌｕ １８４内にライゲーションし、ｐＡＴＧｃｌｐＰを作成した（ＣＶ５８４として保存）。ｃｌｐＰ及びｇｕａＢＡを含有するビシストロン性のプラスミドを構築するために、５’及び３’末端の両方においてＮｏｔＩ部位を有するＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来の増強されたリボゾーム結合部位を有するｃｌｐＰを増幅するようにプライマーＣＶＯＬ１２２及びＣＶＯＬ１２８を設計した。〜０．７ｋｂの産物をカラム精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ内にライゲーションし（ＣＶ６００として保存）、ＮｏｔＩフラグメントとして切り出し、予めＮｏｔＩで切断しておいたｐｇｕａＢＡＶ．２内にライゲーションし、ｐＡＴＧｃｌｐＰＡＴＧｇｕａＢＡを作成した（ＣＶ６０３として保存）。
【０１２１】
ｃｌｐＸをコードする低コピープラスミドを作成するために、プライマーＣＶＯＬ１２４及びＣＶＯＬ１２５を用いることにより、５’及び３’末端においてそれぞれＮｏｔＩ及びＮｄｅＩ部位を有するＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来の増強されたリボソーム結合部位を有するｃｌｐＸを増幅した。〜１．３ｋｂの産物をカラム精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ内にライゲーションし（ＣＶ５６９として保存）、ＮｏｔＩ−ＮｄｅＩフラグメントとして切り出し、予めＮｏｔＩ及びＮｄｅＩで切断しておいたｐＬｏｗＢｌｕ １８４又はｐｇｕａＢＡＶ．２内にライゲーションし、ｐＡＴＧｃｌｐＸ（ＣＶ５８２として保存）及びｐＡＴＧｃｌｐＸＡＴＧｇｕａＢＡ（ＣＶ５７３として保存）を作成した。
【０１２２】
１０．マウスにおけるＳ・パラチフスＡ及び突然変異体のビルレンスの試験
野生型Ｓ・パラチフスＡ９１５０のビルレンスを腹腔内注射マウスにおける各突然変異体のものと比較するためにＬＤ５０試験を実施した。
【０１２３】
図６は野生型及びｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスにおいて得られたＬＤ５０データを示す。野生型Ｓ・パラチフスＡはマウス当たり１０細菌未満のＬＤ５０値を有していた。これとは対照的に、ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡは〜４．５対数高値のＬＤ５０値を有していた。ｐＬｏｗＢｌｕ １８４によるｇｕａＢＡ突然変異体の補完はＬＤ５０値を改変しなかったのに対し、ｐＡＴＧｇｕａＢＡによる形質転換は野生型ビルレンスを回復させた。
【０１２４】
図７はＳ・パラチフスＡ、ｃｌｐＸ欠失Ｓ・パラチフスＡ又はｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスにおいて得られたＬＤ５０データを示す。野生型及びｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡのＬＤ５０値は以前に達成されたものと合致していた。ｃｌｐＸ欠失Ｓ・パラチフスＡはｇｕａＢＡ突然変異体と比較して〜１対数高値のＬＤ５０値を示し、ｃｌｐＸにおける欠失がｇｕａＢＡにおけるものほどは弱毒化をもたらさないことを示している。ｐＬｏｗＢｌｕ １８４によるｃｌｐＸ欠失又はｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ欠失菌株の補完は無効であったのに対し、ｐＡＴＧｃｌｐＸ及びｐＡＴＧｃｌｐＸＡＴＧｇｕａＢＡによる形質転換はそれぞれ野生型ビルレンスを回復させた。
【０１２５】
図８は野生型Ｓ・パラチフスＡ、ｃｌｐＰ欠失Ｓ・パラチフスＡ又はｃｌｐＰ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスにおいて得られたＬＤ５０データを示す。野生型及びｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡのＬＤ５０値は以前に達成されたものと合致していた。ｃｌｐＸ欠失菌株の場合と同様、ｃｌｐＰ欠失Ｓ・パラチフスＡはｇｕａＢＡ突然変異体と比較して高値のビルレンスを示した。このことはｃｌｐＰにおける欠失がｇｕａＢＡにおけるものほどは弱毒化をもたらさないことを示している。ｐＬｏｗＢｌｕ １８４によるｃｌｐＸ又はｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ欠失菌株の補完はビルレンスに対する作用を有さなかった。ｐＡＴＧｃｌｐＰ及びｐＡＴＧｃｌｐＰＡＴＧｇｕａＢＡによるこれらの菌株の形質転換はそれぞれ野生型ビルレンスを完全には回復させなかった。如何なる理論にも制約されないが、ｃｌｐＰの調節された発現は、ｐＡＴＧｃｌｐＰ及びｐＡＴＧｃｌｐＰＡＴＧｇｕａＢＡによりコードされた場合の調節不能の発現とは逆に。ｃｌｐＰ突然変異を完全に補完するために必要である。
【０１２６】
（引用された文献）
全ての刊行物、特許、書籍、論文、および他の書類がこの出願で言及されそして全体にわたって示されるように、以下の参考文献の開示は、それらの全体が本明細書に援用される。
【０１２７】
【化３】
【０１２８】
【化４】
【０１２９】
【化５】
【０１３０】
【化６】
【０１３１】
【化７】
【０１３２】
【化８】
【０１３３】
【化９】
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１はｇｕａＢＡ及びｇｕａＢＡ：：ｃｍｌのＰＣＲ増幅産物を示す。レーン１は野生型のｇｕａＢＡ；レーン２及び３はｇｕａＢＡ：：ｃｍｌである。矢印は３ｋｂ（上）及び１．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンドを示す。
【図２】図２はｇｕａＢＡ：：ｃｍｌ及びｇｕａＢＡ欠失のＰＣＲ増幅産物を示す。レーン１はｇｕａＢＡ：：ｃｍｌ；レーン２〜５はｇｕａＢＡ欠失である。矢印は１．５ｋｂ（上）及び０．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンドを示す。
【図３】図３はｇｕａＢＡ欠失の補完性試験の結果を示す。プレート１はｐＬｏｗＢｌｕ１８４で形質転換されたｇｕａＢＡ突然変異体であり；プレート２はｐＡＴＧｇｕａＢＡで形質転換された同じ突然変異体である。
【図４】図４はｗｔ、ｃｌｐＸ及びｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ弱毒化Ｓ・パラチフスＡのＰＣＲ増幅産物を示す。パネルＡはｃｌｐＸに特異的なプライマーを用いて製造したＰＣＲ産物を示し、パネルＢはｇｕａＢＡに特異的なプライマーを用いて製造したＰＣＲ産物を示す。矢印はパネルＡ上の１．５ｋｂ（上）及び０．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンド及びパネルＢ上の３ｋｂ（上）及び０．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンドを示す。
【図５】図５はｗｔ、ｃｌｐＰ及びｃｌｐＰ−ｇｕａＢＡ弱毒化Ｓ・パラチフスＡのＰＣＲ増幅産物を示す。パネルＡはｃｌｐＰに特異的なプライマーを用いて製造したＰＣＲ産物を示し、パネルＢはｇｕａＢＡに特異的なプライマーを用いて製造したＰＣＲ産物を示す。矢印はパネルＡ上の１ｋｂ（上）及び０．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンド及びパネルＢ上の３ｋｂ（上）及び０．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンドを示す。
【図６】図６はｗｔ、ｇｕａＢＡ−欠失Ｓ・パラチフスＡ、ｐＬｏｗＢｌｕ１８４補完のｇｕａＢＡ−欠失、及び、ｐＡＴＧｇｕａＢＡ補完のｇｕａＢＡ−欠失を注射したマウスにおけるＬＤ５０試験から得られたデータのグラフ表示である。
【図７】図７はｗｔ、ｃｌｐＸ欠失Ｓ・パラチフスＡ、ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡ又はｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスにおけるＬＤ５０試験から得られたデータのグラフ表示である。データはｐＬｏｗＢｌｕ１８４又はｐＡＴＧｃｌｐＸ補完のｃｌｐＸ欠失Ｓ・パラチフスＡ、並びにｐＬｏｗＢｌｕ１８４又はｐＡＴＧｃｌｐＸＡＴＧｇｕａＢＡ補完のｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスを包含する。
【図８】図８はｗｔ、ｃｌｐＰ欠失Ｓ・パラチフスＡ、ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡ又はｃｌｐＰ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスにおけるＬＤ５０試験から得られたデータのグラフ表示である。データはｐＬｏｗＢｌｕ１８４又はｐＡＴＧｃｌｐＰ補完のｃｌｐＰ欠失Ｓ・パラチフスＡ、並びにｐＬｏｗＢｌｕ１８４又はｐＡＴＧｃｌｐＰＡＴＧｇｕａＢＡ補完のｃｌｐＰ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスを包含する。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、米国仮出願第６０／７３１，３４９号（この全体が、本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
チフス及びパラチフス熱を包含するサルモネラ属のメンバーにより誘発される腸熱は依然として開発途上国の集団に多大な疾患及び死亡率の重積を付しており（非特許文献１）、そして旅行者に対して顕著な危険を呈している（非特許文献２）。サルモネラ・エンテリカの血清型であるチフス及びパラチフスＡ（Ｓ．Ｔｙｐｈｉ及びＳ．Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ）により誘発される腸熱の発生率は抗生物質耐性変異体の出現及び拡大のため上昇中である（非特許文献２）。Ｓ・パラチフスＡにより誘発される臨床疾患は全体としてＳ・チフスによるもの余地幾分軽症であるが、前者はなお、複合的合併症を伴った樹立された腸熱をもたらし、そして、未治療又は不適切な治療の場合には、死亡をもたらす場合がある。サルモネラ感染症に対抗する場合に安全で有効であるワクチンが必要とされている。
【非特許文献１】Ｌａｎｃｅｔ ２００５；３６６：７４９−７６２
【非特許文献２】Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００５；５（１０）：６２３−６２８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株、好ましくは生菌弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株に関する。
【０００４】
１つの実施形態において、本発明のＳ・パラチフスＡ菌株はｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子における弱毒化突然変異よりなる群から選択される弱毒化突然変異少なくとも１つを有する。好ましい実施形態においては、Ｓ・パラチフスＡ菌株はｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＰ遺伝子において弱毒化突然変異を有する。別の好ましい実施形態においては、サルモネラ・パラチフスＡ菌株はｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において弱毒化突然変異を有する。更に別の好ましい実施形態においては、サルモネラ・パラチフスＡ菌株はｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において弱毒化突然変異を有する。
【０００５】
１つの実施形態において、ｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子の弱毒化突然変異は遺伝子座又は遺伝子の発現のレベルを低減するか、遺伝子座又は遺伝子の発現をブロックする弱毒化突然変異である。
【０００６】
別の実施形態において、ｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子の弱毒化突然変異は遺伝子座又は遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を低減するか、遺伝子座又は遺伝子によりコードされるポリペプチドを不活性化する弱毒化突然変異である。
【０００７】
好ましい実施形態においては、サルモネラ・パラチフスＡ菌株はＳ・パラチフスＡ９１５０菌株である。
【０００８】
本発明はまた、ｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子における弱毒化突然変異よりなる群から選択される弱毒化突然変異少なくとも１つを有し、そして更に安定化されたプラスミド発現系を含むＳ・パラチフスＡ菌株を包含する。
【０００９】
好ましい実施形態においては、安定化されたプラスミド発現系は（ａ）制限されたコピー数の複製起点カセット、（ｂ）分離後殺傷（ｐｏｓｔ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ）カセット少なくとも１つ、（ｃ）分配カセット少なくとも１つ；及び、（ｄ）発現カセットを有する発現ベクターを含む。
【００１０】
好ましい実施形態においては、制限されたコピー数の複製起点カセットは、（ｉ）細胞当たり約２〜７５コピーの平均プラスミドコピー数に発現ベクターを制限する複製起点をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）複製起点をコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第１のユニークな制限酵素切断部位、及び、（ｉｉｉ）複製起点をコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第２のユニークな制限酵素切断部位を含む。
【００１１】
同様の実施形態において、分離後殺傷カセットは（ｉ）分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第３のユニークな制限酵素切断部位、及び、（ｉｉｉ）分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第４のユニークな制限酵素切断部位を含む。
【００１２】
同様の実施形態において、分配カセットは（ｉ）分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の５’の５のユニークな制限酵素切断部位、及び、（ｉｉｉ）分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第６のユニークな制限酵素切断部位を含む。
【００１３】
同様の実施形態において、発現カセットは（ｉ）プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第７のユニークな制限酵素切断部位、及び、（ｉｉｉ）プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第８のユニークな制限酵素切断部位を含む。
【００１４】
好ましい実施形態においては、複製起点をコードするヌクレオチド配列は配列番号２８に示すｏｒｉＥ１配列、配列番号３０に示すｏｒｉ１０１配列、及び配列番号２９に示すｏｒｉ１５Ａ配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である。
【００１５】
好ましい実施形態においては、分離後殺傷遺伝子座をコードするヌクレオチド配列はｓｓｂ平衡致死系をコードするヌクレオチド配列、ａｓｄ平衡致死系をコードするヌクレオチド配列、ｐｈｄ−ｄｏｃ蛋白系をコードするヌクレオチド配列及びｈｏｋ−ｓｏｋアンチセンス系をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である。より好ましくは、分離後殺傷遺伝子座はシゲラ・フレクスナーｓｓｂ遺伝子座、サルモネラ・チフスｓｓｂ遺伝子座及びＥ・コリｓｓｂ遺伝子座よりなる群から選択されるｓｓｂ平衡致死系をコードするヌクレオチド配列である。更に好ましくは、ｓｓｂ平衡致死系は、配列番号３４に示すＳ・フレクスナー２ａ菌株ＣＶＤ１２０８ｓのｓｓｂ誘導性プロモーター、ｓｓｂ構成的プロモーター及びｓｓｂコード領域を含むｓｓｂ遺伝子座である。
【００１６】
好ましい実施形態においては分配機能をコードするヌクレオチド配列は配列番号３１に示すＥ・コリｐａｒＡ遺伝子座及び配列番号３２に示すＥ・コリｐＳＣ１０１ｐａｒ遺伝子座よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である。
【００１７】
好ましい実施形態においては、プロモーターは誘導性プロモーターであり、より好ましくはｏｍｐＣプロモーターであり、更に好ましくは配列番号３３に示すｏｍｐＣプロモーターである。
【００１８】
１つの実施形態において、選択された抗原をコードするヌクレオチド配列は同種の抗原をコードするヌクレオチド配列である。別の実施形態においては、選択された抗原をコードするヌクレオチド配列は異種の抗原をコードするヌクレオチド配列である。
【００１９】
好ましい実施形態においては、選択された抗原をコードするヌクレオチド配列はウィルス抗原、細菌抗原、癌抗原及び自己免疫抗原よりなる群から選択される非相同抗原をコードするヌクレオチド配列である。
【００２０】
本発明はまた本発明の弱毒化サルモネラ・パラチフスＡ菌株１つ以上を含む医薬品製剤を包含する。好ましくは、医薬品製剤は経口用医薬品製剤である。
【００２１】
本発明は更に、被験体に本発明の医薬品製剤の免疫学的有効量を投与することを含む被験体において免疫応答を誘導する方法を包含する。好ましくは、免疫応答は防御免疫応答である。
【００２２】
医薬品製剤の免疫学的有効量は医薬品製剤内にＳ・パラチフスＡ菌株の約１０２ｃｆｕ〜約１０１０ｃｆｕ、より好ましくは約１０６ｃｆｕ〜約１０９ｃｆｕを含有する。
【００２３】
１つの実施形態において、免疫応答はサルモネラ・パラチフスＡに対するものである。別の実施形態においては、免疫応答は選択された抗原に対するものである。更に別の実施形態においては、免疫応答はサルモネラ・パラチフスＡ及び選択された抗原の両方に対するものである。
【００２４】
ラムダレッド媒介突然変異誘発系を使用することにより本発明のＳ・パラチフス菌株由来の種々の染色体の遺伝子座及び遺伝子を突然変異又は欠失させてよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
Ａ．弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株
本発明は弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株に関する。このような弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は被験体に疾患を誘発することなく被験体に免疫応答を誘導するために使用してよい。
【００２６】
本発明の出発物質として使用するＳ・パラチフスＡ菌株は何れのＳ・パラチフスＡ菌株であってもよく、そして菌株の実体は重要ではない。好ましいＳ・パラチフスＡ菌株はＳ・パラチフスＡ９１５０菌株である。
【００２７】
本発明のＳ・パラチフスＡ菌株は弱毒化されている。本明細書においては、Ｓ・パラチフスＡの弱毒化菌株とは、被験体において疾患を誘発する能力が低減、減少又は沈静化されているもの、又は、被験体において疾患を誘発する能力を完全に喪失しているものである。弱毒化菌株は遺伝子１つ以上の発現の低減又は消失を呈するか、活性が低減又は消失している蛋白１つ以上を発現するか、生育して分裂する能力の低下を呈するか、又は、これらの特性の２つ以上の組合せを呈してよい。本発明の弱毒化菌株は生存又は死滅していてよい。
【００２８】
本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株の外に、他の腸病原菌（例えばサルモネラ・チフス、サルモネラ・パラチフスＢ、赤痢菌、コレラ菌）、片利共生菌（例えばラクトバチルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）及び認可ワクチン菌株（例えばＢＣＧ）の弱毒化菌株も本発明の範囲に包含される。これらの追加的菌株は本発明のＳ・パラチフスＡ菌株の弱毒化突然変異の全てを有し、本発明の安定化プラスミド発現系で形質転換してよく、そして本明細書に記載する通り免疫化組成物として使用してよい。
【００２９】
好ましい実施形態においては、本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株はＳ・パラチフスＡのｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子の１つ以上において突然変異を有する。例えば、本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は（ｉ）ｇｕａＢ遺伝子及びｃｌｐＰ遺伝子において、（ｉｉ）ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＰ遺伝子において、（ｉｉｉ）ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＰ遺伝子において、（ｉｖ）ｇｕａＢＡ遺伝子座及びｃｌｐＰ遺伝子において、（ｖ）ｇｕａＢ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｖｉ）ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｖｉｉ）ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｖｉｉｉ）ｇｕａＢＡ遺伝子座及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｉｘ）ｇｕａＢ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｘ）ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｘｉ）ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、（ｘｉｉ）ｇｕａＢＡ遺伝子座、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子において、突然変異を有してよい。
【００３０】
本明細書に記載する遺伝子座及び遺伝子の突然変異は何れかの突然変異、例えば核酸の欠失、挿入又は置換の１つ以上であってよい。突然変異は、遺伝子座又は遺伝子からの発現の低減又は非存在、又は遺伝子座又は遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性の低減又は非存在をもたらす遺伝子座又は遺伝子の何れかの欠失、挿入又は置換であってよい。突然変異は遺伝子座又は遺伝子のコーディング又は非コーディング領域におけるものであってよい。
【００３１】
好ましくは、本発明においては、Ｓ・パラチフスＡ菌株の染色体ゲノムは、ｇｕａＢＡ遺伝子座を除去するか、何らか別の方法で修飾すること、そしてこれによりグアニンヌクレオチドの新規生合成をブロックすることにより修飾される。より好ましくは、ｇｕａＢＡ遺伝子座における突然変異はプリン代謝経路酵素ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（ｇｕａＢによりコードされる）及びＧＭＰ合成酵素（ｇｕａＡによりコードされる）を不活性化する。これらの突然変異の結果、Ｓ・パラチフスＡは新規のＧＭＰ延いてはＧＤＰ及びＧＴＰヌクレオチドを合成できなくなり、このために哺乳類組織における細菌生育が激しく制限される。インビトロにおいては、本発明のΔｇｕａＢＡ Ｓ・パラチフスＡ突然変異体はグアニンを補給しない限り最小培地中で生育することはできない。組織培養においては、本発明のΔｇｕａＢＡ Ｓ・パラチフスＡ突然変異体はその侵襲能力の顕著な低下を示すことがわかっている。ΔｇｕａＢＡ Ｓ・パラチフスＡ突然変異体は哺乳類宿主の組織に由来するグアニンヌクレオチドを捕獲する場合がある。しかしながら、そのＳ・パラチフスＡへの同化は、グアニンサルベージ経路内にヌクレオチド前駆体として取り込まれるべきペリプラズムヌクレオチダーゼによるヌクレオシドへの脱ホスホリル化を予め必要とする。従って、ヌクレオチドは哺乳類宿主の細胞内環境において容易に使用できるため、グアニンヌクレオチドの新規合成による弱毒化はサルベージ経路の不全によるか、又は、依然として不明確な理由の何れかによるものである。
【００３２】
ＧＭＰ合成酵素をコードするＳ・パラチフスＡ９１５０のｇｕａＡ遺伝子は１５７８ｂｐの大きさ（配列番号３６）であり、そしてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴヌクレオチド比較により測定した場合Ｓ・チフスＴｙ２のｇｕａＡ遺伝子に９８％相同である。欠失突然変異体はＧｕａＡの適切な折畳又は活性が防止されるようにＳ・パラチフスＡのｇｕａＡ遺伝子のコーディング領域の一部を排除することにより作成できる。例えばコーディング領域の約２５〜約１５００ｂｐ、約７５〜約１４００ｂｐ、約１００〜約１３００ｂｐ、又は全てを欠失させることができる。或いは、欠失突然変異は遺伝子の適切な読み枠がシフトするようにＳ・パラチフスＡのｇｕａＡ遺伝子の例えば１〜１００ｂｐフラグメントを排除することにより作成できる。後者の例においては、非センスポリペプチドを作成するか、フレームシフト誘導終止コドンによりポリペプチド合成を中断させてよい。欠失の好ましい大きさは約７５〜７５０ｂｐである。ｇｕａＡ遺伝子を超えて伸びるような欠失、即ちリボソーム結合部位におけるもののような、ｇｕａＡ遺伝子の翻訳を制御するエレメントにおける欠失を作成することもできる。
【００３３】
ＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードするＳ・パラチフスＡ９１５０のｇｕａＢ遺伝子は１４６７ｂｐの大きさ（配列番号３５）であり、そしてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴヌクレオチド比較により測定した場合Ｓ・チフスＴｙ２のｇｕａＢ遺伝子に９８％相同である。欠失突然変異体はＧｕａＢの適切な折畳又は活性が防止されるようにＳ・パラチフスＡのｇｕａＢ遺伝子のコーディング領域の一部を排除することにより作成できる。例えばコーディング領域の約２５〜約１４００ｂｐ、約７５〜約１３００ｂｐ、約１００〜約１２００ｂｐ、又は全てを欠失させることができる。或いは、欠失突然変異は遺伝子の適切な読み枠がシフトするようにＳ・パラチフスＡのｇｕａＢ遺伝子の例えば１〜１００ｂｐフラグメントを排除することにより作成できる。後者の例においては、非センスポリペプチドを作成するか、フレームシフト誘導終止コドンによりポリペプチド合成を中断させてよい。欠失の好ましい大きさは約７５〜７５０ｂｐである。ｇｕａＢ遺伝子を超えて伸びるような欠失、即ちプロモーターにおけるもののような、ｇｕａＢ遺伝子の転写を制御するエレメントにおける欠失を作成することもできる。
【００３４】
セリンプロテアーゼをコードするＳ・パラチフスＡ９１５０のｃｌｐＰ遺伝子は６２４ｂｐの大きさ（配列番号３７）であり、そしてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴヌクレオチド比較により測定した場合Ｓ・チフスＴｙ２のｃｌｐＰ遺伝子に９９％相同である。欠失突然変異体はＣｌｐＰの適切な折畳又は活性が防止されるようにＳ・パラチフスＡのｃｌｐＰ遺伝子のコーディング領域の一部を排除することにより作成できる。例えばコーディング領域の約２５〜約６００ｂｐ、約７５〜約５００ｂｐ、約１００〜約４００ｂｐ、又は全てを欠失させることができる。或いは、欠失突然変異は遺伝子の適切な読み枠がシフトするようにＳ・パラチフスＡのｃｌｐＰ遺伝子の例えば１〜１００ｂｐフラグメントを排除することにより作成できる。後者の例においては、非センスポリペプチドを作成するか、フレームシフト誘導終止コドンによりポリペプチド合成を中断させてよい。欠失の好ましい大きさは約２５〜６００ｂｐである。ｃｌｐＰ遺伝子を超えて伸びるような欠失、即ちプロモーターにおけるもののような、ｃｌｐＰ遺伝子の転写を制御するエレメントにおける欠失を作成することもできる。
【００３５】
シャペロンＡＴＰａｓｅをコードするＳ・パラチフスＡ９１５０のｃｌｐＸ遺伝子は１２７２ｂｐの大きさ（配列番号３８）であり、そしてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴヌクレオチド比較により測定した場合Ｓ・チフスＴｙ２のｃｌｐＸ遺伝子に９９％相同である。欠失突然変異体はＣｌｐＸの適切な折畳又は活性が防止されるようにＳ・パラチフスＡのｃｌｐＸ遺伝子のコーディング領域の一部を排除することにより作成できる。例えばコーディング領域の約２５〜約１２００ｂｐ、約７５〜約１１００ｂｐ、約１００〜約１０００ｂｐ、又は全てを欠失させることができる。或いは、欠失突然変異は遺伝子の適切な読み枠がシフトするようにＳ・パラチフスＡのｃｌｐＸ遺伝子の例えば１〜１００ｂｐフラグメントを排除することにより作成できる。後者の例においては、非センスポリペプチドを作成するか、フレームシフト誘導終止コドンによりポリペプチド合成を中断させてよい。欠失の好ましい大きさは約７５〜７５０ｂｐである。ｃｌｐＸ遺伝子を超えて伸びるような欠失、即ちプロモーターにおけるもののような、ｃｌｐＸ遺伝子の転写を制御するエレメントにおける欠失を作成することもできる。
【００３６】
欠失は、本明細書に記載した遺伝子座又は遺伝子のいずれかにおいて、遺伝子座又は遺伝子内に位置する好都合な制限部位を用いるか、又は、オリゴヌクレオチドを用いた部位指向性の突然変異誘発により行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８９））。
【００３７】
遺伝子座又は遺伝子の不活性かはまた、何れかの好都合な制限部位を用いた外来性ＤＮＡの挿入により、又は、オリゴヌクレオチドを用いた部位指向性の突然変異誘発（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上出）により、遺伝子座又は遺伝子の正しい転写を妨害するように行うこともできる。遺伝子座又は遺伝子を不活性化できる挿入の典型的な大きさは１塩基対〜１００ｋｂｐであるが、１００ｋｂｐより小さい挿入が好ましい。挿入は遺伝子座又は遺伝子のコーディング領域の内部、又はコーディング領域とプロモーターとの間の何れかにおいて行うことができる。
【００３８】
遺伝子座及び遺伝子の不活性化のための他の方法は他の腸内細菌のｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＡ、ｇｕａＢ、ｃｌｐＰ及びｃｌｐＸ遺伝子において起こした欠失又は挿入のサルモネラへの転移、トランスポゾン発生欠失及びＤＮＡ挿入部の不正確な切り出しを包含する。
【００３９】
好ましくは、細菌の遺伝子座及び遺伝子はラムダレッド媒介突然変異誘発を用いて突然変異させる（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７：６６４０−６６４５（２０００））。慨すれば工程１において突然変異の為にターゲティングされた宿主細菌をλＲｅｄリコンビナーゼをコードする温度感受性プラスミドで形質転換する。これらの細菌をアラビノースの存在下に生育させることによりλＲｅｄ生産を誘導する。標的配列の染色体突然変異誘発は標的遺伝子が抗生物質耐性マーカーにより置き換えられている線状ＤＮＡによる宿主のエレクトロポレーションにより達成する。このＤＮＡはまたλレッド媒介相同組み換えによる耐性マーカーの染色体組み込みを可能にするフランキング染色体配列の短鎖領域をコードしている。組み換え体は適切な抗生物質を含有する固体培地上で選択し、λＲｅｄリコンビナーゼをコードするプラスミドの消失を促進する温度においてインキュベートする。工程２においては、宿主染色体中にこの時点で存在する抗生物質耐性マーカー内のユニークな配列をターゲティングするＦＬＰリコンビナーゼをコードする温度感受性プラスミドで細菌を形質転換することにより染色体耐性マーカーの除去を促進する。形質転換体は構成的に発現されるＦＬＰリコンビナーゼの存在を可能にする温度において生育させる。突然変異体をＰＣＲによりスクリーニングし、ＦＬＰリコンビナーゼをコードするプラスミドの消失を促進する温度において生育させ、そして選択して保存に付す。
【００４０】
本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は追加的遺伝子１つ以上において突然変異を含有してよい。サルモネラｓｐｐの追加的弱毒化突然変異の広範な考察は米国特許６，６８２，７２９に示されており、例示される遺伝子は種々の生化学的経路、全般的調節系、熱ショック蛋白、他の調節遺伝子、及び推定ビルレンス特性をコードするものを包含する。このような弱毒化突然変異の特定の例は、限定しないが（ｉ）栄養要求性突然変異、例えばａｒｏ、ｇｕａ、ｎａｄ、ｔｈｙ及びａｓｄ突然変異；（ｉｉ）全般的調節機能を不活性化させる突然変異、例えばｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ、ｐｈｏＰｃ及びｏｍｐＲ突然変異；（ｉｉｉ）ストレス応答を改質する突然変異、例えばｒｅｃＡ、ｈｔｒＡ、ｈｔｐＲ、ｈｓｐ及びｇｒｏＥＬ突然変異；（ｉｖ）特定のビルレンス因子における突然変異、例えばｐａｇ及びｐｒｇ；（ｖ）ＤＮＡトポロジーに影響する突然変異、例えばｔｏｐＡ突然変異；（ｖｉ）表面多糖類の生物発生をブロックする突然変異、例えばｒｆｂ、ｇａｌＥ及びｖｉａ突然変異；（ｖｉｉ）自殺系を改質する突然変異、例えばｓａｃＢ、ｍｕｃ、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌ及びｐｈｌＡ突然変異；（ｖｉｉｉ）Ｐ２２によりコードされるリソゲン、λネズミトランスグリコシラーゼ及びＳ−遺伝子のような自殺系を導入する突然変異；及び（ｉｘ）正しい細胞周期を途絶又は改質させる突然変異、例えばｍｉｎＢ突然変異を包含する。
【００４１】
Ｂ．安定化された発現プラスミド系
本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は選択されたポリペプチド（抗原）を発現するように操作された菌株を包含する。このような弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株はＳ・パラチフスそのものへの免疫応答を誘導するため、又は、弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株により発現される選択された抗原に対する免疫応答を油どうするため、又は両方の為に使用できる。
【００４２】
そのような弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は安定化された発現プラスミド系により形質転換される。安定化された発現プラスミド系は選択された抗原をコードする。
【００４３】
安定化された発現プラスミド系はプラスミド維持系（ＰＭＳ）及び選択された抗原をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。
【００４４】
安定化された発現プラスミド系は細菌における発現ベクターの維持を、２つの独立したレベルにおいて、（１）平衡致死維持系に対する単独依存を除去すること；及び（２）プラスミド分画系を取り込むことにより発現ベクターのランダムな分離を防止し、これによりその固有性及び安定性を増強することにより最適化する。
【００４５】
ＰＭＳは（ａ）複製起点、（ｂ）分離後殺傷機能少なくとも１つ、及び（ｃ）分画機能少なくとも１つを包含する。ＰＭＳの記載したエレメントの各々は安定化された発現プラスミド系の個々のカセットであってよい。カセットの各々はカセットの５’及び３’末端に位置するユニークな制限酵素切断部位を含んでよい。
【００４６】
好ましい安定化された発現プラスミド系は参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願１１／５４２，２６４に記載されているものである。
【００４７】
１．複製起点
ＰＭＳは細胞当たり一定範囲のプラスミドコピーにまで発現ベクターを限定する制限コピー数の複製起点を包含する。種々の選択された抗原に伴う毒性は様々な程度（例えばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのような寄生性の生物から誘導される抗原に関するより高い毒性〜破傷風毒素のフラグメントＣに関する実質的無毒性）に渡っているため、本発明の安定化された発現プラスミド系は低又は中コピー数の発現ベクター（プラスミド）の何れかに基づいている。当業者の知る通り、複製起点の選択は毒性の程度に依存することになり、即ちコピー数は細菌株に対する毒性が上昇するに従って低下しなければならない。
【００４８】
複製起点は細胞当たり約２〜約７５コピー、細胞当たり約５〜約６０コピー、細胞当たり約５〜約３０コピー又は細胞当たり約５〜約１５コピーである平均コピー数を与えることが好ましい。本明細書に包含される複製起点はＥ・コリプラスミドｐＡＴ１５３（ｏｒｉＥ１、染色体当たり約６０コピー相当）、Ｅ・コリプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ｏｒｉ１５Ａ、染色体当たり約１５コピー相当）、及び、サルモネラ・ネズミチフス菌プラスミドｐＳＣ１０１（ｏｒｉ１０１、染色体当たり約５コピー相当）から誘導される。ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４及びｐＡＴ１５３に関する複製カセットの操作された起点の構造上組織は構造及び機能において類似している。
【００４９】
本発明の複製起点は天然に存在する複製起点並びに天然に存在する複製起点をコードするヌクレオチド配列に実質的に相同であり、そして天然に存在する複製起点の示す機能を保持しているヌクレオチド配列によりコードされる複製起点の両方を包含する。
【００５０】
好ましい実施形態においては、複製起点をコードするヌクレオチド配列は配列番号２８のｏｒｉＥ１配列、配列番号３０のｏｒｉ１０１配列及び配列番号２９のｏｒｉ１５Ａ配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である。
【００５１】
別の好ましい実施形態においては、複製起点は配列番号２８に示すゲノム当たり約５コピー相当のコピー数を与えるｐＳＣ１０１由来のｏｒｉＥ１遺伝子座である。
【００５２】
２．分配機能
ＰＭＳはまた、当該分野でも知られており、そして本明細書においては「分離系」及び「分配系」とも称する分配機能を包含する。分配機能は、その機能の非存在下における相当するプラスミドの送達の頻度と比較した場合に各新規分裂細菌細胞に対するプラスミドの良好な送達の頻度を増大させる作用を有する何れかのプラスミド安定性増強機能である。分配機能は、例えば等分配系、対部位（ｐａｉｒ−ｓｉｔｅ）分配系、及びＰａｒｔｉｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｂ．Ｅ．Ｆｕｎｎｅｌｌ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｓｌａｖｃｅｖ，Ｐｌａｓｍｉｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，ＢＥ Ｆｕｎｎｅｌｌ ａｎｄ ＧＪ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， ｅｄｓ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣの第５章の表１に記載の系を包含する。
【００５３】
本発明の分配系は天然に存在する分配系、並びに天然に存在する分配系をコードするヌクレオチド配列に実質的に相同であり、そして天然に存在する分配系の示す機能を保持しているヌクレオチド配列によりコードされる分配系の両方を包含する。
【００５４】
例示される分配機能は限定しないがｐＳＣ１０１、Ｆ因子、Ｐ１プロファージ及びＩｎｃＦＩＩ薬剤耐性プラスミドの系を包含する。
【００５５】
特に、ｐａｒ受動分配遺伝子座を使用できる。ｐａｒ遺伝子座の機能はＤＮＡジャイレースの結合部位でも有る複製起点における増大するプラスミドスーパーコイル化に関連していると考えられる。例示されるｐａｒ配列番号は配列番号３２に示すＥ・コリのものである（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｌｏｃｕｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＳＣ１０１，Ｇｅｎｅ ２４：３０９−１５（１９８３）；ゲンバンクアクセッション番号Ｘ０１６５４、ヌクレオチド４５２４〜４８９０））。
【００５６】
活性分配のｐａｒＡ遺伝子座も又使用してよい。例示されるｐａｒＡ遺伝子座配列は配列番号３１に示す。
【００５７】
３．分離後殺傷機能
ＰＭＳは更に分離後殺傷（ＰＳＫ）機能少なくとも１つを誘導する。ＰＳＫ機能は目的のプラスミドを継承しない何れかの新規分裂細菌細胞の死滅をもたらす機能であり、そして特に、平衡致死系、例えばａｓｄ又はｓｓｂ、蛋白性系、例えばｐｈｄ−ｄｏｃ、及びアンチセンス系、例えばｈｏｋ−ｓｏｋを包含する。
【００５８】
本発明のＰＳＫ機能は天然に存在するＰＳＫ機能、並びに天然に存在するＰＳＫ機能をコードするヌクレオチド配列に実質的に相同であり、そして天然に存在するＰＳＫ機能の示す機能を保持しているヌクレオチド配列によりコードされるＰＳＫ機能の両方を包含する。
【００５９】
好ましい実施形態においては、ＰＳＫ機能はｓｓｂ平衡致死系である。Ｓ・チフス由来の１本鎖結合蛋白（ＳＳＢ）を使用することにより染色体ｓｓｂ遺伝子内に導入された他の態様では致死性となる突然変異をトランス補完する。Ｅ・コリＳＳＢ蛋白の生化学的及び代謝的な役割はＬｏｈｍａｎら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６３：５２７，１９９４及びＣｈａｓｅら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５５：１０３，１９８６（参照により本明細書に組み込まれる）において広範に考察されている。
【００６０】
ＰＳＫ昨日がｓｓｂ平衡致死系である安定化された発現プラスミド系を含む本発明のＳ・パラチフスＡ菌株においては、細菌のネイティブのｓｓｂ遺伝子座が不活性化される。ネイティブｓｓｂ遺伝子座は何れかの当該分野で知られた手段、例えば温度感受性複製起点を含む自殺ベクター又はラムダレッド媒介突然変異誘発により不活性化してよい（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７：６６４０−６６４５（２０００））。好ましい態様において、ラムダレッド媒介突然変異誘発を用いることにより本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株のｓｓｂ遺伝子座を不活性化する。
【００６１】
本発明の別の態様において、ＰＳＫ機能は、誘導的及び構成的ｓｓｂ遺伝子プロモーターの両方がｓｓｂ ＰＳＫ機能のプロモーターとして使用されるｓｓｂ遺伝子座である。好ましい実施形態においては、ＰＳＫ機能はｓｓｂ誘導性プロモーター、ｓｓｂ構成的プロモーター及びｓｓｂコード領域を含む。好ましくは、ｓｓｂ遺伝子座はシゲラ・フレクスナー、サルモネラ・チフス及びＥ・コリの何れか１つのｓｓｂ遺伝子座である。１つの実施形態において、ｓｓｂ遺伝子座は配列番号３４に示すＳ・フレクスナー２ａ菌株ＣＶＤ１２０８ｓのｓｓｂ遺伝子座である。
【００６２】
本発明の関連する態様において、突然変異した対立遺伝子、例えばｓｓｂ−１（又はこの対立遺伝子に機能的に同等である何れかの突然変異、例えばＷ５４Ｓ；Ｃａｒｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１０６７−１０７５（１９９３））を安定化された発現プラスミド系内に取り込むことにより、ＳＳＢ１様蛋白の過剰発現により高コピー数プラスミドを増強し、これによりＳＳＢの所望の生物学的に活性な４量体を形成してよい。
【００６３】
別の実施形態において、ＰＭＳは２ＰＳＫ機能を含む。
【００６４】
４．選択された抗原
安定化された発現プラスミド系はまたプロモーター制御下に選択された抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６５】
プロモーターは好ましくはオスモル濃度のような生物学的に該当するシグナルにより制御される環境上調節可能なプロモーターである。好ましい実施形態においては、プロモーターはｏｍｐＣプロモーターである。ｏｍｐＣ遺伝子は細菌細胞の該膜内に３量体として挿入するポーリン蛋白をコードする。ｏｍｐＣの発現及び制御はＰｒａｔｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０：９１１，１９９６及びＥｇｇｅｒら、Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ ２：１６７，１９９７においてかなり詳細に考察されている。好ましい実施形態においては、Ｅ・コリ由来のｏｍｐＣプロモーターフラグメントは配列番号３３において示される。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，７０３，２３３を参照できる。このカセットの転写はｔｒｐＡ転写ターミネーターにより３’遠位領域において終止してよい。
【００６６】
１つの態様において、誘導性プロモーターは突然変異したＰｏｍｐＣ１又はＰｏｍｐＣ３プロモーターである。プロモーターは選択された抗原の下流の転写のみを制御するために使用してよい。
【００６７】
本発明は自身を発現する弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株を破壊せず、そして、抗原を発現している弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株を被験体に投与した場合に免疫応答を誘発する何れかの抗原の発現を包含する。選択された抗原は相同（Ｓ・パラチフスＡ由来）又は非相同であってよい。
【００６８】
選択された抗原の非限定的な例は：シガ毒素１（Ｓｔｘ１）抗原、シガ毒素２（Ｓｔｘ２）抗原、Ｂ型肝炎、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型、Ａ型肝炎、無細胞百日咳（ａｃＰ）、水痘、ロタウィルス、ストレプトコッカス・ニューモニア（ニューモコッカル）及びナイセリア・メニンギティディス（髄膜炎菌）を包含する。Ｅｌｌｉｓら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．，３９：３９３４２３，１９９７を参照できる（参照により本明細書に組み込まれる）。抗原がシガ毒素２抗原である場合、シガ毒素２抗原は例えばＢサブユニット５量体又は遺伝子的に脱毒素化されたＳｔｘ２であることができる。生体防御に関連する別の抗原は、１）炭疽毒素保護抗原ＰＡ８３部分のドメイン１つ以上、例えば限定しないがドメイン４（真核生物細胞結合ドメイン；Ｄ４），ＰＡ８３のプロセシングされた６３ｋＤａの生物学的に活性な形態、又は、完全長ＰＡ８３；及び２）何れかの組合せにおける何れかの神経毒血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧの真核生物細胞結合重鎖フラグメントを含むクロストリジウム・ボツリナム抗原を包含する。他の選択された抗原は参照により本明細書に組み込まれる米国特許６，１９０，６６９に開示されているものの各々を包含する。
【００６９】
１つの態様において、選択された抗原は癌に対する免疫応答を誘導する抗原である。別の態様においては、選択された抗原は自己抗原、自己免疫又は免疫学的疾患に関与するとされているＢ細胞受容体及び／又はＴ細胞受容体に対する免疫応答を誘発するように設計される。例えば身体組織又は環境の抗原に対抗して不適切な免疫応答が生じた場合、本発明の免疫化組成物を用いることにより自己抗原、Ｂ細胞受容体及び／又はＴ細胞受容体に対する免疫応答を誘導し、これにより応答をモジュレートして疾患を緩解してよい。例えばこのような手法は重症筋無力症、全身エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、アレルギー及び喘息を治療する場合に効果的である。
【００７０】
本発明の別の態様において、安定化された発現プラスミド系は選択可能なマーカー又は温度感受性マーカー、例えば薬剤耐性マーカーをコードするポリヌクレオチドを包含してよい。薬剤耐性マーカーの非限定的な例はアミノグリコシドカナマイシン及び／又はネオマイシンに対する耐性を付与することが当該分野で知られているａｐｈを包含する。
【００７１】
本明細書においてヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に言及している場合の「実質的に相同」又は「実質的な相同体」という用語は、核酸配列又はアミノ酸配列が、相当するレファレンス配列と同じ基本的機能をその配列が果たすことができる程度に十分な相同性を、レファレンス配列と比較した場合に有していることを指し；実質的に相同な配列は典型的にはレファレンス配列と比較した場合に少なくとも約７０パーセント配列上同一であり、レファレンス配列と比較した場合に、典型的には少なくとも約８５パーセント配列上同一であり、好ましくは少なくとも約９０又は９５パーセント配列上同一であり、そして最も好ましくは約９６、９６、９８又は９９パーセント配列上同一である。明細書全体を通じて、特定のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列に言及する場合は、そのようなヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列は実質的に相同な配列と置き換えてよい。
【００７２】
Ｃ．免疫応答を誘導する方法
本発明はまた被験体における免疫応答を誘導する方法を包含する。免疫応答は弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株自体、安定化された発現プラスミド系により形質転換された弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株により発現される選択された抗原、又は両方に対するものであってよい。
【００７３】
１つの実施形態において免疫応答を誘導する方法は、本発明の菌株１つ以上を被験体において免疫応答を誘導するために十分な量で被験体に投与することを含む。本明細書においては、本発明の菌株は未形質転換及び形質転換された弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株の両方を包含する。
【００７４】
さらなる実施形態において、免疫応答を誘導する方法は、本発明の菌株１つ以上を含む医薬品製剤を被験体において免疫応答を誘導するために十分な量（免疫学的有効量）で被験体に投与することを含む。
【００７５】
簡便の為に、本発明の菌株及び菌株を含む医薬品製剤を本明細書においては「免疫化組成物」と称する。当業者の知る通り、免疫化組成物はワクチンと同義語である。
【００７６】
本明細書においては、「免疫応答」とは免疫化組成物に対する被験体の免疫系の生理学的応答を指す。免疫応答は先天免疫応答、適応免疫応答又は両方を包含してよい。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態においては、免疫応答は保護免疫応答である。保護免疫応答は被験体に対して免疫学的な細胞記憶を付与するものであり、同じか同様の抗原への二次的曝露が以下の特性、即ち：免疫化組成物への以前の曝露が非存在の場合の選択された抗原への曝露に起因する誘導期より短い誘導期；免疫化組成物への以前の曝露が非存在の場合の選択された抗原への曝露に起因する抗体生産よりも長期間継続する抗体生産；免疫化組成物への以前の曝露が非存在の場合の選択された抗原への曝露により生産される抗体の型及び質と比較した場合に生産された抗体の型及び質が変化していること；免疫化組成物への以前の曝露が非存在の場合の選択された抗原への曝露に応答して生じる場合よりも、ＩｇＧ抗体がＩｇＭより高濃度及び長期持続において生じるクラス応答のシフト；免疫化組成物への以前の曝露が非存在の場合の選択された抗原への曝露に起因する抗原に対する抗体の平均親和性と比較した場合の抗原に対する抗体の増大した平均親和性（結合定数）；及び／又は二次免疫応答を特徴付ける当該分野で知られた他の特性の１つ以上を特徴とする作用を有する。
【００７８】
免疫化組成物を投与してよい被験体は好ましくはヒトであるが、他の哺乳類、例えばサル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ又はブタ、又はトリ、例えばニワトリであってもよい。
【００７９】
１つの実施形態において、被験体はＳ・パラチフスＡ感染症を発症する危険性のある被験体である。別の実施形態においては、被験体はＳ・チフス感染症又はＳ・パラチフスＡ感染症に対して免疫学的にナイーブであるか、又は、既存の免疫を呈する。
【００８０】
さらなる実施形態においては、本発明の菌株を投与する被験体はパラチフス熱に対して保護免疫応答を発生させる。
【００８１】
Ｄ．製剤、用量及び投与様式
本発明の弱毒化菌株は、未形質転換及び安定化された発現プラスミド系で形質転換されたものの両方とも、免疫応答を誘導するために被験体に投与してよい。好ましい実施形態においては本発明の菌株は医薬品製剤において投与する。
【００８２】
本発明の医薬品製剤は製薬上許容しうる担体、賦形剤、他の成分、例えばアジュバントを包含してよい。製薬上許容しうる担体、賦形剤、他の成分は本発明の菌株と適合性があり、そしてそのレシピエントに対して予定外の有害性を呈さない化合物、溶液、物質又は材料である。特に、本発明の担体、賦形剤、他の成分は、一般的に安全、非毒しえ及び生物学的にも他の点においても有害とならず、そして薬理学的に好適なプロファイルを呈する医薬品製剤の調製において有用なものであり、そして、家畜用並びにヒト用の医薬品用途において許容される担体、賦形剤、他の成分を包含する。
【００８３】
適当な製薬上許容しうる担体及び賦形剤は当該分野で良く知られており、そして臨床上今日の必要性に応じて当業者が決定できる。当業者の知る通り、希釈剤は担体及び賦形剤の用語の範囲内に包含される。適当な担体及び賦形剤の例は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、より詳細には（１）約１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミンを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸塩緩衝食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％食塩水（０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ）、（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロース及び（４）水を包含する。
【００８４】
本発明の免疫化組成物の投与の様式は、被験体への免疫応答の誘導をもたらすような何れかの適当な送達手段及び／又は方法であってよい。送達手段は、限定しないが、非経腸投与方法、例えば皮下（ＳＣ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、経皮、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、並びに経腸、例えば、経口、経鼻、膣内、肺（吸入）、眼内、直腸投与、又は粘膜組織に接触する免疫化組成物を生じさせる何れかの他の様式によるものを包含してよい。好ましくは投与は経口である。
【００８５】
本発明の１つの実施形態において、免疫化組成物は吸入による送達のための霧状化分散体として存在する。種々の液体及び粉末の製剤を治療すべき被験体の肺内への吸入のために従来の方法により調製できる。免疫化組成物の霧状化分散体は典型的には霧状化又はエアロゾル化分散体に共通の担体、例えば緩衝食塩水及び／又は当該分野で良く知られている他の化合物を含有する。吸入による免疫化組成物の送達は粘膜組織の広範な領域に免疫化組成物を急速に分散させること、並びに、免疫化組成物の循環のための血液による急速な取り込みという作用を有する。
【００８６】
更に又、免疫化組成物はまた液体形態で存在する。液体は経口投薬用、眼内又は鼻内等薬用に滴下剤として、又は浣腸又は圧注剤としての用途であることができる。免疫化組成物を液体として製剤する場合、液体は免疫化組成物の溶液又は懸濁液の何れかであることができる。当該分野で良く知られている免疫化組成物の溶液又は懸濁液のための適当な製剤はその意図される用途に応じて種々のものが存在する。水又は他の水性ベヒクル中に調製される経口投与用の液体製剤は種々の懸濁剤、例えばメチルセルロース、アルギネート、トラガカント、ペクチン、ケルギン、カラギーナン、アカシア、ポリビニルピロリドン、及びポリビニルアルコールを含有してよい。液体製剤はまた、免疫化組成物と共に水和剤、甘味料及び着色フレーバー剤を含有する溶液、乳液、シロップ及びエリキシルを包含してよい。
【００８７】
経口投薬を介した液体形態における記載した免疫化組成物の送達は、胃腸及び泌尿器の管の粘膜を免疫化組成物に曝露する。胃のｐＨ範囲に抵抗できるように安定化された適当な用量は、胃腸管の全ての部分、特にその上部に対し、免疫化組成物を送達する。組成物の有効な送達が胃腸管に沿って分布するように液体経口剤型の免疫化組成物を安定化させる何れかの方法が本明細書に記載した免疫化組成物と共に使用されることを意図しており、酸性ｐＨに対して弱毒化細菌を保護するためのカプセル及び再懸濁緩衝液が包含される。使用される特定の製薬上許容しうる担体又は希釈剤は本発明にとって重要ではなく、当該分野で慣用的なものである。希釈剤の例は、胃内の胃酸に対して緩衝作用を示すための緩衝液、例えばスクロースを含有するクエン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）、重炭酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）単独又はアスコルビン酸、乳糖及び場合によりアスパルテームを含有する重炭酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を包含する（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｌａｎｃｅｔ，ＩＩ：４６７−４７０（１９８８））。担体の例は、蛋白、例えば脱脂乳中に存在するもの；糖類、例えばスクロース；又はポリビニルピロリドンを包含する。
【００８８】
点眼液を介した液体形態における記載した免疫化組成物の送達は眼及び関連組織の粘膜を免疫化組成物に曝露させる。点眼液用の典型的な液体担体は緩衝性付与され、そしてよく知られた当業者が容易に発見できる他の化合物を含有する。
【００８９】
点鼻薬を介した液体形態における記載した免疫化組成物の送達は鼻及び副鼻腔及び関連組織の粘膜を免疫化組成物に曝露させる。点鼻液用の液体担体は典型的には種々の形態の緩衝食塩水である。
【００９０】
免疫化組成物の注射用製剤は種々の担体、例えば植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）等を含有してよい。生理学的に許容される賦形剤は例えば５％デキストロース、０．９％食塩水、リンゲル液又は他の適当な賦形剤を包含してよい。筋肉内投与用の調製品は製薬用賦形剤、例えば注射用水、０．９％食塩水又は５％グルコース溶液中において投与できる。
【００９１】
本発明の弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は他の適当な薬理学的又は生理学的に活性な薬剤、例えば抗原性及び／又は他の生物学的に活性な物質と連携して被験体に投与してよい。
【００９２】
安定化された発現プラスミド系を含む弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は選択された抗原の発現が開始される前、同時、又は後に被験体に投与してよい。例えば、安定化された発現プラスミド系を含む弱毒化Ｓ・パラチフスＡ菌株は、細菌の投与時に選択された抗原に対して免疫応答が生じるように十分な量の選択された抗原を細菌が生産できるように被験体への投与の前に培養してよい。
【００９３】
本発明の免疫化組成物の投与の量及び速度は例えば従来の抗体力価測定手法及び従来の生物薬効／生体適合性のプロトコルを用いることにより、予定外の実験を行うことなく当業者が容易に決定してよい。投与の量及び速度は被験体の体重及び健康状態、被験体に投与する細菌の実体、選択された抗原を発現するように操作された菌株において発現されるポリペプチドの実体、所望の治療効果、所望の生物活性持続時間、及び、免疫化組成物の投与の様式のような要因に基づいて変動する。
【００９４】
一般的に、被験体に投与する免疫化組成物の量は、Ｓ・パラチフスＡ菌株に対し、又は、Ｓ・パラチフスＡ菌株により発現されるべき選択された抗原に対し、被験体において免疫応答を誘導するために十分な量である（免疫学的有効量）。好ましくは、免疫応答は保護免疫応答である。
【００９５】
一般的に使用される用量はＳ・パラチフスＡ菌株約１０２ｃｆｕ〜１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１０２ｃｆｕ〜１０７ｃｆｕ又は、約１０６ｃｆｕ〜１０９ｃｆｕを含有する。経口投与用の製剤はＳ・パラチフスＡ菌株約１０２ｃｆｕ〜１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１０５ｃｆｕ〜１０９ｃｆｕを含有し、そして製剤は胃内の酸性ｐＨに対して弱毒化細菌を保護するためにカプセル化又は緩衝溶液中に再懸濁する。経鼻投与用の製剤はＳ・パラチフスＡ菌株約１０２ｃｆｕ〜１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１０２ｃｆｕ〜１０７ｃｆｕを含有し、そして点鼻薬中又はエアロゾル中で細菌を与える鼻内投与の為に使用される。
【００９６】
免疫化組成物は単一用量において、又は多用量において、長期間に渡り投与してよい。特に免疫化組成物は１週間、２週間、３週間、１ヶ月、６週間、２ヶ月、１０週間、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年の期間に渡り、又は１年より長期の延長された期間、投与してよい。
【００９７】
免疫化組成物は均一用量及び簡易投薬のための投与単位において提供してよい。各単位剤型は製薬上許容しうる担体、賦形剤又は他の成分と共に、所望の免疫応答をもたらすように計算された本発明の菌株の所定量を含有する。
【００９８】
本発明はまた、本発明の免疫化組成物１つ以上、及び場合により組成物を投与するための手段、及び、組成物を投与するための説明書を含むキットを包含する。
【実施例】
【００９９】
１．細菌株及び培養条件
エシェリシア・コリ菌株ＤＨ５アルファを全プラスミド構築の為に使用した。生菌弱毒化Ｓ・チフス菌株ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡは欠失突然変異を、芳香族化合物生合成経路を中断するａｒｏＣ及びａｒｏＤにおいて、そして、ストレス応答蛋白をコードするｈｔｒＡにおいて保有している（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６０：２（１９９２），ｐｐ．５３６−５４１及びＪ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：１−３（１９９６），ｐｐ．１９３−１９６参照）。Ｓ・パラチフスＡ９１５０ロット番号１１８４８はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より購入し、ＣＶ２２３及びＣＶ２２４として保存した。ＣＶ２２３を全実験において使用した。
【０１００】
Ｅ・コリＤＨ５アルファは必要に応じて、抗生物質カルベニシリン（ｃａｒｂ；５０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（ｋａｎ；５０μｇ／ｍＬ）又はクロラムフェニコール（ｃｍｌ；２５μｇ／ｍＬ）を添加したＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）液体培地又は観点（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ）を用いて生育させた。ＣＤ９０８−ｈｔｒＡ及びＳ・パラチフスＡ ９１５０及びその誘導体はグアニン（０．００１％ｖ／ｖ）及び必要に応じて添加した抗生物質を含有する２ｘダイズ培地（リットル当たり２０ｇＨｙ−ｓｏｙペプトン、１０ｇＨｙ−ｓｏｙコウボエキス、３ｇＮａＣｌ、±１５ｇの顆粒化寒天（Ｄｉｆｃｏ））と共に生育させた。液体培養物は特段の記載が無い限り１６〜２４時間２５０ｒｐｍにおいて３０℃又は３７℃でインキュベートした。
【０１０１】
補完性分析のために使用した変性最小培地（ＭＭＭ）の組成はＭ９塩（Ｋ２ＨＰＯ４、７ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、３ｇ／Ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／Ｌ（ｐＨ７．５））、０．５％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、顆粒化寒天（Ｄｉｆｃｏ）リットル当たり１５ｇ及び１μｇ／ｍＬビタミンＢ１とした。
【０１０２】
２．プラスミド及び分子遺伝子的手法
本発明に記載したプラスミドのコンストラクトのためには標準的な手法を使用した（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）。プラスミドの抽出及びＤＮＡフラグメントのゲル精製は、製造元の指示に従ってそれぞれＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ及びＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて実施した（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。プラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ又はｐＧＥＭ（登録商標）−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、ＶｅｎｔＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて形成したブラント末端のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物をクローニングするための中間体として使用した。プラスミドｐＬｏｗＢｌｕ１８４（Ｅ．Ｍ．Ｂａｒｒｙ，未公開データ；ＣＶＤ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）はｐＡＣＹＣ１８４（ＡＴＣＣ）に基づいた低コピー数プラスミドであるが、ＡｖａＩとＨｉｎｄＩＩＩの間にテトラサイクリン耐性遺伝子の変わりにｐＧＥＭ（登録商標）−５Ｚｆ（＋）由来のラクトースオペロン配列（２７６７−２７３ｂｐ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含有している。Ｔａｑ−ＰｒｏＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉ．，Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、ＮＪ）をラムダレッド媒介突然変異誘発のため、及び、滅菌水２０μＬ中に希釈した細菌単コロニー５μＬを用いた診断ＰＣＲの為に使用した。Ｔａｑ−ＰｒｏＴＭＤＮＡポリメラーゼはまた、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ又はｐＧＥＭ（登録商標）−ＴＥａｓｙ内へのクローニングの前にＶｅｎｔＴＭ ＤＮＡポリメラーゼにより形成した前処理ＰＣＲフラグメントに添加するために使用した。全ての制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより購入した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてブラント末端を有するＤＮＡフラグメントを作成した。菌株のエレクトロポレーションは２．５ｋＶ、２００Ω及び２５μＦに設定したＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において実施した。ＤＮＡゲル電気泳動において使用した分子量マーカーは直ぐに使用できるＯ’ＧｅｎｅＲｕｌｅｒＴＭ １ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（＃ＳＭ１１６３、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ）である。
【０１０３】
３．ラムダレッド媒介突然変異誘発
この手法はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００ Ｊｕｎ ６；９７（１２）：６６４０−５０）に記載の通り、特定の変更を加えながら実施した。慨すれば、レッドヘルパープラスミドｐＫＤ４６（このプラスミドに関する詳細はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒの参考文献を参照）を担持した細菌１０コロニーをカルベニシリン及びＬ−アラビノース（０．２％）を添加した２ｘダイズ培地２０ｍＬに添加し、３時間２５０ｒｐｍで３０℃において生育させた（〜０．６のＯＤ６００ｎｍ）。冷却滅菌水で３回洗浄し、１００倍濃縮することにより細菌を電気コンピテントとした。コンピテント細胞をゲル精製ＰＣＲ産物１００ηｇ〜１μｇでエレクトロポレーションに付した。エレクトロポレーションの後、グアニンの存在下又は非存在下に２ｘダイズ培地を用いながら細菌を修復した。細胞を３時間３７℃で２ｘダイズ培地中インキュベートした後に、一夜、グアニン及びｃｍｌを含有する２ｘダイズ寒天上にプレーティングした。抗生物質耐性コロニーを選択し、目的の染色体領域中の改変があるものをＰＣＲによりスクリーニングした。陽性コロニーをｃｍｌを含有するがカルベニシリンを含有しない２ｘダイズ培地上に再植菌し、ｐＫＤ４６の消失を確認した。ｃｍｌ耐性カセットの除去はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒの記載に従って実施し、ｐＣＰ２０を使用した。所望の遺伝子型を示したコロニーを、抗生物質を含有しない２ｘダイズ培地に再植菌し、抗生物質耐性表現型の消失を確認した。保存の為に選択したものをＰＣＲにより再スクリーニングした後に２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する２ｘダイズ培地中−７０℃で凍結した。
【０１０４】
４．凝集
Ｓ・パラチフスＡ菌株は市販の血清（ＤｉｆｃｏＴＭ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｏ Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ Ｇｒｏｕｐ Ａ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ロット番号＃４０９２２２１）を用いて試験した。慨すれば新しいプレートから採取した細菌の少量種菌をスライドガラス上のＰＢＳ ２０μＬ中に懸濁した。抗血清５μＬを添加し、凝集が観察されるまでスライドを穏やかに振とうした。Ｓ・フレクスナーワクチン菌株ＣＶＤ１２０８（Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００４ Ｎｏｖ １５；１９０（１０）：１７４５−５４）又はＥ・コリＤＨ５アルファを陰性対照細菌として使用した。
【０１０５】
５．マウス腹腔内接種によるビルレンスの試験
サルモネラのビルレンスはＩｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００１ Ａｕｇ；６９（８）：４７３４−４１において報告されている通り試験した。慨すれば、６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ）（群当たりマウス３匹、ワクチン菌株当たり３群）に最終容量０．５ｍＬにおいて１０％（ｗ／ｖ）ブタ胃ムチン（Ｄｉｆｃｏ，ロット番号４０９２０１８）と混合した細菌（必要に応じてグアニン及び抗生物質の存在下に生育させ、そしてリン酸塩緩衝食塩水ＰＢＳに再懸濁した）の種々の１０倍希釈物を腹腔内（ｉｐ）注射した。マウスは接種後７２時間に渡り２４時間毎に極限的瀕死状態（死亡直前）又は死亡に関してモニタリングした。マウス各群に関する５０％致死用量（ＬＤ５０）を直線回帰分析により計算した。
【０１０６】
６．ｇｕａＢＡの欠失の構築
Ｓ・パラチフスＡゲノムの配列決定は本プロジェクト開始時には完了していなかった。従って、ラムダレッド媒介突然変異誘発用の全てのオリゴヌクレオチドプライマー及びその後のＤＮＡ鋳型はアノテーションされているＳ・チフスＴｙ２ゲノム配列（ゲンバンクアクセッション番号ＮＣ＿００４６３１、２００４年１２月１６日バージョン）に基づいて構築した。Ｓ・パラチフスＡにおいて突然変異した領域をＳ・チフスのものと配列比較したところ、９９％超のＤＮＡ配列同一性が判明した。
【０１０７】
イノシン−５’−モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇｕａＢ）及びグアノシンモノホスフェート合成酵素（ｇｕａＡ）をコードする遺伝子はオペロンを形成し、そしてＳ・チフスＴｙ２ゲノム上の４１４０５９〜４１７１７８ｂｐに位置している（配列番号２６；ｇｕａＢＡ遺伝子座に関する詳細な情報は米国特許６，１９０，６６９も参照できる）。プライマーＣＶＯＬ１３およびＣＶＯＬ１５（表１）は突然変異の為に設計された領域の外部の配列に結合する。プライマーＣＶＯＬ２８及びＣＶＯＬ３２はラムダレッド鋳型プラスミドｐＫＤ３の領域に結合するように設計した。得られたＰＣＲ産物はそれぞれＳ・チフスＴｙ２ゲノム上の４１３８４６〜４１３９４５（ＣＶＯＬ２８）及び４１７１０９〜４１７０１０（ＣＶＯＬ３２）の位置においてｇｕａＢＡに相同な配列の１００ｂｐにより何れかの側がフランキングされたｃｍｌ耐性カートリッジをコードしていた。
【０１０８】
【化１】
【０１０９】
【化２】
ａ．プライマーは５’＞３’の方向に列挙し、制限酵素切断部位は下線を付した。ｂ．Ｓ・チフスＴｙ２ゲノム（ゲンバンクアクセッション番号ＮＣ＿００４６３１）又はプラスミドｐＫＤ３（ゲンバンクアクセッション番号ＡＹ０４８７４２）に相同な領域を示す。
【０１１０】
Ｓ・パラチフスＡ９１５０を電気コンピテントとし、ｐＫＤ４６で形質転換することにより、ＣＶ２５０菌株を得た。ラムダレッド突然変異誘発はｃｍｌ耐性マーカーを含有する鋳型ｐＫＤ３と共にプライマーＣＶＯＬ２８及びＣＶＯＬ３２を用いながら形成したＰＣＲ産物を用いてＣＶ２５０上で実施した（このプラスミドに関する追加的情報はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒの参考文献を参照）。形質転換体は３７℃でプレーティングし、ｃｍｌ耐性を示したものをＣＶＯＬ１３及びＣＶＯＬ１５を用いたＰＣＲによりスクリーニングした。Ｓ・パラチフスＡ９１５０から増幅した未修飾のｇｕａＢＡは〜３．５ｋｂ（図１、レーン１）であることが解ったのに対し、〜１．４ｋｂのフラグメントが突然変異したｇｕａＢＡ領域を有する２つのクローンにおいて観察された（図１、レーン２及び３）。これらの突然変異体はそれぞれＣＶ４１１及びＣＶ４１２と命名した。ｐＣＰ２０（このプラスミドに関する追加的情報はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒの参考文献を参照）によるこれらの突然変異体の処理によりｃｍｌ耐性カートリッジが遊離した。４種の欠失株をプライマーＣＶＯＬ１３及びＣＶＯＬ１５を用いたＰＣＲにより分析したところ、ｇｕａＢＡ：：ｃｍｌ先祖（図２、レーン１）と比較して〜０．５ｋｂバンド（図２、レーン２〜４）を有していることが解った。得られたＳ・パラチフスＡ９１５０のｇｕａＢＡ欠失体はＣ４１５〜ＣＶ４１８と命名した。ＣＶ４１５において突然変異したｇｕａＢＡ領域をＣＶＯＬ１３及びＣＶＯＬ１５を用いてＰＣＲ増幅し、産物を配列決定し（ポリヌクレオチド配列、配列番号１）；配列番号１の５’及び３’領域はｇｕａＢＡに相同であるのに対し、中央領域はｐＫＤ３に相同である。後の全ての試験について菌株ＣＶ４１５を選択した。
７．ｇｕａＢＡにおける欠失のインビトロ補完
Ｓ・パラチフスＡ９１５０は明確化されていない栄養要求性を含有しているため、カザミノ酸を添加することなく最小培地上で生育させることはできない。ＡＴＣＣ菌株１１５１１及びＣＶＤ Ｓ・パラチフスＡ単離株５１６もまた最小培地中では生育できず、それらがＳ・パラチフスＡ９１５０で観察されたものと同様の栄養要求性を有していることが示唆される。
【０１１１】
ＣＶ４１５においてｇｕａＢＡのみをラムダレッド媒介突然変異誘発がターゲティングすることを明らかにするために、ラクトースプロモーター（ＰｌａｃＺ）の制御下においてｇｕａＢＡをコードする最小フラグメントを含有するｐＬｏｗＢｌｕ１８４系（低コピー数）プラスミドを設計した。プライマーＣＶＯＬ１３及びＣＶＯＬ４１を用いながら、開始コドンの８ｂｐ上流に最適化リボソーム結合部位（ＧＡＡＧＧＡＧ）を有するｇｕａＢＡをコードする〜３．１ｋｂフラグメントを増幅し、その際、ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡの染色体を鋳型として使用した。このフラグメントをｐＧＥＭ（登録商標）−ＴＥａｓｙにサブクローニングし、ＲｃｏＲＩで切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでブラント末端化し、そしてｐＬｏｗＢｌｕ１８４のＮｏｔＩ部位にクローニングすることによりｐＡＴＧｇｕａＢＡを作成した（ＣＶ２９５中に保存）。
【０１１２】
ＣＶ４１５はｐＡＴＧｇｕａＢＡ又はｐＬｏｗＢｌｕ１８４（対照）の何れかとエレクトロポレーションに付し、そしてグアニン及びｃｍｌを含有する２ｘダイズ培地上にプレーティングすることにより、菌株ＣＶ４８６及びＣＶ４８７をそれぞれ作成した。グアニンを含有しない２ｘダイズ培地はｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡの生育を支援することができない。各々の単コロニーをｃｍｌを含有するＭＭＭ上に再植菌し、一夜３７℃にてインキュベートした。図３に示す通り、ＣＶ４８６は対照（ＣＶ４８７；プレート１）とは対照的にＭＭＭ上で生育することができ（プレート２）、ｐＡＴＧｇｕａＢＡにクローニングされた最小フラグメントがＣＶ４１５の染色体からのｇｕａＢＡの欠失を補完できることを示している。
８．ＣＶ４１５における第２欠失の構築
野生型（ｗｔ）の遺伝子型へのｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡ９１５０の復帰を最小限にするために、第２弱毒化マーカーとして別の遺伝子をターゲティングした。これらの遺伝子はｃｌｐＰ及びｃｌｐＸであり、これらはそれぞれセリンプロテアーゼ及びシャペロンＡＴＰａｓｅをコードしている（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）．２００４ Ｆｅｂ；１２（２）：１７５−８３参照）。ｃｌｐＰ及び／又はｃｌｐＸの欠失はマウスにおいてサルモネラ・ネズミチフス菌のコロニー形成能力を有意に低減することがわかっている（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００１ Ｍａｙ；６９（５）：３１６４−７４）。Ｓ・チフスＴｙ２において、ｃｌｐＸ（配列番号３９）及びｃｌｐＰ（配列番号４０）は両方とも、それぞれ染色体の相補鎖上の２４８３５９７〜２４８５７４３（配列番号２７）の間に位置しており、そして個別のプロモーターから発現される。ｃｌｐＸ又はｃｌｐＰの何れかにおける単一の欠失を含有する突然変異体のビルレンスをマウスにおいて比較できるように野生型Ｓ・パラチフスＡ９１５０もまた突然変異誘発に付した。
【０１１３】
ｃｌｐＸを欠失させるために、ＣＶＯＬ８５及び８６がＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来の開始コドンを欠失したｃｌｐＸをコードする〜１．３ｋｂのフラグメントを増幅するように設計した。このフラグメントをカラム精製し、Ｔａｑ−ＰｒｏＴＭＤＮＡポリメラーゼ処理し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ内にクローニングした（ＣＶ４７２中保存）。得られたベクターｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＸをＮｒｕＩ及びＥｃｏＲＩで消化して〜０．９ｋｂのフラグメントを除去し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することによりブランと末端を作成した。ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯから単離したｃｍｌカートリッジをブラント末端化し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＸ内に挿入した。このｃｍｌカートリッジは鋳型としてのｐＫＤ３と共にＣＶＯＬ２５及びＣＶＯＬ２６を用いたＰＣＲにより予め作成しておいた（ＣＶ１３４中に保存）。ライゲーション及び形質転換の後、プライマーＣＶＯＬ２６及びＣＶＯＬ８５と共にＰＣＲを使用することによりラムダレッド突然変異誘発に関して正しい方向におけるｃｍｌカートリッジの挿入を確認した。陽性クローンを発見し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：（ｃｌｐＸ：：ｃｍｌ）と命名し、ＣＶ４８１中に保存した。
【０１１４】
ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡ（ＣＶ４１５）をｐＫＤ４６で形質転換し、ＣＶ４２１として保存した。ＣＶ４２１及びＣＶ２５０（ｐＫＤ４６で形質転換された野生型Ｓ・パラチフスＡ９１５０）をラムダレッド突然変異誘発に付し、〜１．４ｋｂのＰＣＲ産物をＣＶＯＬ８５及びＣＶＯＬ８６を用いながらｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：（ｃｌｐＸ：：ｃｍｌ）から増幅した。ｃｍｌ耐性突然変異体を単離し、ＣＶＯＬ８５及びＣＶＯＬ８６に相同な領域外の領域に結合するＣＶＯＬ８７及びＣＶＯＬ８８を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。正しいＰＣＲプロファイルを示す突然変異体をｃｍｌカートリッジを除去するためのｐＣＰ２０処理のために選択した。図４は改変されたｃｌｐＸ遺伝子を含有する突然変異体は未改変のＳ・パラチフスＡ９１５０（パネルＡ、レーン７）で観察されたものと比較して、ＰＣＲにより、より小さい〜０．６ｋｂのバンド（パネルＡ、レーン１〜６）を呈したことを示している。ＣＶＯＬ１３及び１５による同じ菌株のＰＣＲ分析ではｇｕａＢＡがＣＶ４１５から誘導された菌株からのみ欠失し、ＣＶ２５０の場合は欠失しなかったことが確認された（パネルＢ、レーン４〜６ｖｓレーン１〜３及び７）。ｃｌｐＸ及びｃｌｐＸとｇｕａＢＡの両方を欠失した突然変異体はそれぞれＣＶ５３２及びＣＶ５３４として保存した。ＣＶ５３２及びＣＶ５３４内の突然変異したｃｌｐＸ領域をプライマーＣＶＯＬ８７及びＣＶＯＬ８８でＰＣＲ増幅し、産物を配列決定（配列番号２）し；配列番号２の５’及び３’領域はｃｌｐＸに相同であるのに対し、中央領域はｐＫＤ３に相同である。
【０１１５】
ｃｌｐＰを欠失させるために、ＣＶＯＬ８９及び９０がＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来の開始コドンを欠失したｃｌｐＰをコードする〜０．７ｋｂのフラグメントを増幅するように設計した。このフラグメントをカラム精製し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ内にクローニングし、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＰを作成した（ＣＶ４７０中保存）。ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＰをＰｓｔＩ及びＮｓｉＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、再ライゲーション（ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＰｍを作成、ＣＶ４８４として保存）することによりベクター骨格からＮｄｅＩ及びＨｉｎｃＩＩ部位を除去した。次にｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＰｍをＮｄｅＩ及びＨｉｎｃＩＩで消化することにより合計〜０．５ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメントを除去し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理した。上記と同様にして、ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯから単離したｃｍｌカートリッジをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理し、そしてｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：ｃｌｐＰｍから除去したフラグメントを置き換えるために使用した。ライゲーション及び形質転換の後、プライマーＣＶＯＬ２６及びＣＶＯＬ８５と共にＰＣＲを使用することによりラムダレッド突然変異誘発に関して正しい方向におけるｃｍｌカートリッジの挿入を確認した。陽性クローンを発見し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：（ｃｌｐＰｍ：：ｃｍｌ）と命名し、ＣＶ５０１中に保存した。
【０１１６】
野生型及びｐＫＤ４６を含有するｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡ９１５０（それぞれＣＶ２５０及びＣＶ４２１）をラムダレッド突然変異誘発に付し、〜１．４ｋｂのＰＣＲ産物をＣＶＯＬ８９及びＣＶＯＬ９０を用いながらｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ：：（ｃｌｐＰｍ：：ｃｍｌ）から増幅した。ｃｍｌ耐性突然変異体を単離し、ＣＶＯＬ８９及びＣＶＯＬ９０に相同な領域外の領域に結合するＣＶＯＬ９１及びＣＶＯＬ９２を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。正しいＰＣＲプロファイルを示す突然変異体をｃｍｌカートリッジを除去するためのｐＣＰ２０処理のために選択した。
【０１１７】
図５は改変されたｃｌｐＰ遺伝子を含有する突然変異体は未改変のＳ・パラチフスＡ９１５０（パネルＡ、レーン７）で観察されたものと比較して、ＰＣＲにより、より小さい〜０．４ｋｂのバンド（パネルＡ、レーン１〜６）を呈したことを示している。ＣＶＯＬ１３及び１５による同じ菌株のＰＣＲ分析ではｇｕａＢＡがＣＶ４１５から誘導された菌株からのみ欠失し、ＣＶ２５０によるものの場合は欠失しなかったことが確認された（パネルＢ、レーン４〜６ｖｓレーン１〜３及び７）。ｃｌｐＰ及びｃｌｐＰとｇｕａＢＡの両方を欠失した突然変異体はそれぞれＣＶ５２８及びＣＶ５３０として保存した。ＣＶ５２８及びＣＶ５３０内の突然変異したｃｌｐＰ領域をプライマーＣＶＯＬ８７及びＣＶＯＬ８８でＰＣＲ増幅し、産物を配列決定（ポリヌクレオチド配列、配列番号３）し；配列番号３の５’及び３’領域はｃｌｐＰに相同であるのに対し、中央領域はｐＫＤ３に相同である。
【０１１８】
９．補完性分析のための低コピープラスミドの構築
上記において実施した通り、ラムダレッド媒介突然変異誘発は特定の遺伝子座のみをターゲティングしたことを確認するために、ｃｌｐＸ又はｃｌｐＰ、又はｃｌｐＸ又はｃｌｐＰの何れかの直ぐ下流のｇｕａＢＡをコードするに最小フラグメントを含有するモノ又はビシストロン性のｐＬｏｗＢｌｕ１８４系（低コピー数）プラスミドを設計した。これらのプラスミドにおける遺伝子の構成的発現はＰｌａｃＺにより指向した。
【０１１９】
プライマーＣＶＯＬ６４及びＣＶＯＬ６５を用いることにより、５’及び３’末端においてそれぞれＮｄｅＩ及びＮｓｉＩ制限部位を有する増強されたリボソーム結合部位を含有するＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来のｇｕａＢＡをＰＣＲ増幅した。産物をカラム精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ内にライゲーションし（ＣＶ３９４として保存）、〜３．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＮｓｉＩフラグメントとして切り出し、ｐＬｏｗＢｌｕ １８４内のＮｄｅＩ及びＮｓｉＩ部位にクローニングし、ｐｇｕａＢＡＶ．２を作成した（ＣＶ４８２として保存）。
【０１２０】
ｃｌｐＰをコードする低コピー数プラスミドを作成するために、プライマーＣＶＯＬ１２２及びＣＶＯＬ１２３を用いることにより、５’及び３’末端においてそれぞれＮｏｔＩ及びＮｒｕＩ部位を有するＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来の増強されたリボソーム結合部位を有するｃｌｐＰを増幅した。〜０．７ｋｂの産物をカラム精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ内にライゲーションし（ＣＶ５６７として保存）、ＮｏｔＩ−ＮｒｕＩフラグメントとして切り出し、予めＮｏｔＩ及びＮｄｅＩで切断しておいたｐＬｏｗＢｌｕ １８４内にライゲーションし、ｐＡＴＧｃｌｐＰを作成した（ＣＶ５８４として保存）。ｃｌｐＰ及びｇｕａＢＡを含有するビシストロン性のプラスミドを構築するために、５’及び３’末端の両方においてＮｏｔＩ部位を有するＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来の増強されたリボゾーム結合部位を有するｃｌｐＰを増幅するようにプライマーＣＶＯＬ１２２及びＣＶＯＬ１２８を設計した。〜０．７ｋｂの産物をカラム精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ内にライゲーションし（ＣＶ６００として保存）、ＮｏｔＩフラグメントとして切り出し、予めＮｏｔＩで切断しておいたｐｇｕａＢＡＶ．２内にライゲーションし、ｐＡＴＧｃｌｐＰＡＴＧｇｕａＢＡを作成した（ＣＶ６０３として保存）。
【０１２１】
ｃｌｐＸをコードする低コピープラスミドを作成するために、プライマーＣＶＯＬ１２４及びＣＶＯＬ１２５を用いることにより、５’及び３’末端においてそれぞれＮｏｔＩ及びＮｄｅＩ部位を有するＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来の増強されたリボソーム結合部位を有するｃｌｐＸを増幅した。〜１．３ｋｂの産物をカラム精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ内にライゲーションし（ＣＶ５６９として保存）、ＮｏｔＩ−ＮｄｅＩフラグメントとして切り出し、予めＮｏｔＩ及びＮｄｅＩで切断しておいたｐＬｏｗＢｌｕ １８４又はｐｇｕａＢＡＶ．２内にライゲーションし、ｐＡＴＧｃｌｐＸ（ＣＶ５８２として保存）及びｐＡＴＧｃｌｐＸＡＴＧｇｕａＢＡ（ＣＶ５７３として保存）を作成した。
【０１２２】
１０．マウスにおけるＳ・パラチフスＡ及び突然変異体のビルレンスの試験
野生型Ｓ・パラチフスＡ９１５０のビルレンスを腹腔内注射マウスにおける各突然変異体のものと比較するためにＬＤ５０試験を実施した。
【０１２３】
図６は野生型及びｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスにおいて得られたＬＤ５０データを示す。野生型Ｓ・パラチフスＡはマウス当たり１０細菌未満のＬＤ５０値を有していた。これとは対照的に、ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡは〜４．５対数高値のＬＤ５０値を有していた。ｐＬｏｗＢｌｕ １８４によるｇｕａＢＡ突然変異体の補完はＬＤ５０値を改変しなかったのに対し、ｐＡＴＧｇｕａＢＡによる形質転換は野生型ビルレンスを回復させた。
【０１２４】
図７はＳ・パラチフスＡ、ｃｌｐＸ欠失Ｓ・パラチフスＡ又はｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスにおいて得られたＬＤ５０データを示す。野生型及びｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡのＬＤ５０値は以前に達成されたものと合致していた。ｃｌｐＸ欠失Ｓ・パラチフスＡはｇｕａＢＡ突然変異体と比較して〜１対数高値のＬＤ５０値を示し、ｃｌｐＸにおける欠失がｇｕａＢＡにおけるものほどは弱毒化をもたらさないことを示している。ｐＬｏｗＢｌｕ １８４によるｃｌｐＸ欠失又はｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ欠失菌株の補完は無効であったのに対し、ｐＡＴＧｃｌｐＸ及びｐＡＴＧｃｌｐＸＡＴＧｇｕａＢＡによる形質転換はそれぞれ野生型ビルレンスを回復させた。
【０１２５】
図８は野生型Ｓ・パラチフスＡ、ｃｌｐＰ欠失Ｓ・パラチフスＡ又はｃｌｐＰ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスにおいて得られたＬＤ５０データを示す。野生型及びｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡのＬＤ５０値は以前に達成されたものと合致していた。ｃｌｐＸ欠失菌株の場合と同様、ｃｌｐＰ欠失Ｓ・パラチフスＡはｇｕａＢＡ突然変異体と比較して高値のビルレンスを示した。このことはｃｌｐＰにおける欠失がｇｕａＢＡにおけるものほどは弱毒化をもたらさないことを示している。ｐＬｏｗＢｌｕ １８４によるｃｌｐＸ又はｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ欠失菌株の補完はビルレンスに対する作用を有さなかった。ｐＡＴＧｃｌｐＰ及びｐＡＴＧｃｌｐＰＡＴＧｇｕａＢＡによるこれらの菌株の形質転換はそれぞれ野生型ビルレンスを完全には回復させなかった。如何なる理論にも制約されないが、ｃｌｐＰの調節された発現は、ｐＡＴＧｃｌｐＰ及びｐＡＴＧｃｌｐＰＡＴＧｇｕａＢＡによりコードされた場合の調節不能の発現とは逆に。ｃｌｐＰ突然変異を完全に補完するために必要である。
【０１２６】
（引用された文献）
全ての刊行物、特許、書籍、論文、および他の書類がこの出願で言及されそして全体にわたって示されるように、以下の参考文献の開示は、それらの全体が本明細書に援用される。
【０１２７】
【化３】
【０１２８】
【化４】
【０１２９】
【化５】
【０１３０】
【化６】
【０１３１】
【化７】
【０１３２】
【化８】
【０１３３】
【化９】
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１はｇｕａＢＡ及びｇｕａＢＡ：：ｃｍｌのＰＣＲ増幅産物を示す。レーン１は野生型のｇｕａＢＡ；レーン２及び３はｇｕａＢＡ：：ｃｍｌである。矢印は３ｋｂ（上）及び１．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンドを示す。
【図２】図２はｇｕａＢＡ：：ｃｍｌ及びｇｕａＢＡ欠失のＰＣＲ増幅産物を示す。レーン１はｇｕａＢＡ：：ｃｍｌ；レーン２〜５はｇｕａＢＡ欠失である。矢印は１．５ｋｂ（上）及び０．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンドを示す。
【図３】図３はｇｕａＢＡ欠失の補完性試験の結果を示す。プレート１はｐＬｏｗＢｌｕ１８４で形質転換されたｇｕａＢＡ突然変異体であり；プレート２はｐＡＴＧｇｕａＢＡで形質転換された同じ突然変異体である。
【図４】図４はｗｔ、ｃｌｐＸ及びｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ弱毒化Ｓ・パラチフスＡのＰＣＲ増幅産物を示す。パネルＡはｃｌｐＸに特異的なプライマーを用いて製造したＰＣＲ産物を示し、パネルＢはｇｕａＢＡに特異的なプライマーを用いて製造したＰＣＲ産物を示す。矢印はパネルＡ上の１．５ｋｂ（上）及び０．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンド及びパネルＢ上の３ｋｂ（上）及び０．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンドを示す。
【図５】図５はｗｔ、ｃｌｐＰ及びｃｌｐＰ−ｇｕａＢＡ弱毒化Ｓ・パラチフスＡのＰＣＲ増幅産物を示す。パネルＡはｃｌｐＰに特異的なプライマーを用いて製造したＰＣＲ産物を示し、パネルＢはｇｕａＢＡに特異的なプライマーを用いて製造したＰＣＲ産物を示す。矢印はパネルＡ上の１ｋｂ（上）及び０．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンド及びパネルＢ上の３ｋｂ（上）及び０．５ｋｂ（下）の分子量マーカーバンドを示す。
【図６】図６はｗｔ、ｇｕａＢＡ−欠失Ｓ・パラチフスＡ、ｐＬｏｗＢｌｕ１８４補完のｇｕａＢＡ−欠失、及び、ｐＡＴＧｇｕａＢＡ補完のｇｕａＢＡ−欠失を注射したマウスにおけるＬＤ５０試験から得られたデータのグラフ表示である。
【図７】図７はｗｔ、ｃｌｐＸ欠失Ｓ・パラチフスＡ、ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡ又はｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスにおけるＬＤ５０試験から得られたデータのグラフ表示である。データはｐＬｏｗＢｌｕ１８４又はｐＡＴＧｃｌｐＸ補完のｃｌｐＸ欠失Ｓ・パラチフスＡ、並びにｐＬｏｗＢｌｕ１８４又はｐＡＴＧｃｌｐＸＡＴＧｇｕａＢＡ補完のｃｌｐＸ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスを包含する。
【図８】図８はｗｔ、ｃｌｐＰ欠失Ｓ・パラチフスＡ、ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡ又はｃｌｐＰ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスにおけるＬＤ５０試験から得られたデータのグラフ表示である。データはｐＬｏｗＢｌｕ１８４又はｐＡＴＧｃｌｐＰ補完のｃｌｐＰ欠失Ｓ・パラチフスＡ、並びにｐＬｏｗＢｌｕ１８４又はｐＡＴＧｃｌｐＰＡＴＧｇｕａＢＡ補完のｃｌｐＰ−ｇｕａＢＡ欠失Ｓ・パラチフスＡを注射したマウスを包含する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ・パラチフスＡ菌株であって、ここで該菌株はｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子における弱毒化突然変異よりなる群から選択される弱毒化突然変異少なくとも１つを有する、サルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項２】
前記菌株が前記ｇｕａＢ遺伝子、前記ｇｕａＡ遺伝子及び前記ｃｌｐＰ遺伝子において弱毒化突然変異を有する、請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項３】
前記菌株が前記ｇｕａＢ遺伝子、前記ｇｕａＡ遺伝子及び前記ｃｌｐＸ遺伝子において弱毒化突然変異を有する、請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項４】
前記菌株が前記ｇｕａＢ遺伝子、前記ｇｕａＡ遺伝子、前記ｃｌｐＰ遺伝子及び前記ｃｌｐＸ遺伝子において弱毒化突然変異を有する、請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項５】
前記弱毒化突然変異が前記遺伝子座又は前記遺伝子の発現のレベルを低減するか、該遺伝子座又は該遺伝子の発現をブロックする弱毒化突然変異である請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項６】
前記弱毒化突然変異が前記遺伝子座又は前記遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を低減するか、該遺伝子座又は該遺伝子によりコードされるポリペプチドを不活性化する弱毒化突然変異である請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項７】
前記菌株がＳ・パラチフスＡ９１５０菌株である請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項８】
サルモネラ・パラチフスＡ菌株であって、該菌株がｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子における弱毒化突然変異よりなる群から選択される弱毒化突然変異少なくとも１つを有し、そして該菌株が安定化されたプラスミド発現系を含む、サルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項９】
前記安定化されたプラスミド発現系が、以下：
（ａ）以下：
（ｉ）細胞当たり約２〜７５コピーの平均プラスミドコピー数に発現ベクターを制限する複製起点をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）該複製起点をコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第１のユニークな制限酵素切断部位、及び、
（ｉｉｉ）該複製起点をコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第２のユニークな制限酵素切断部位、
を含む制限されたコピー数の複製起点カセット；
（ｂ）以下：
（ｉ）分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）該分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第３のユニークな制限酵素切断部位、及び、
（ｉｉｉ）該分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第４のユニークな制限酵素切断部位
を含む分離後殺傷カセット少なくとも１つ；
（ｃ）以下：
（ｉ）分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）該分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第５のユニークな制限酵素切断部位、及び、
（ｉｉｉ）該分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第６のユニークな制限酵素切断部位、
を含む分配カセット少なくとも１つ；及び、
（ｄ）以下：
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）該プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第７のユニークな制限酵素切断部位、及び、
（ｉｉｉ）該プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第８のユニークな制限酵素切断部位、
を含む発現カセット；
を含む発現ベクターを含む、請求項８記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１０】
前記複製起点をコードするヌクレオチド配列が配列番号２８に示すｏｒｉＥ１配列、配列番号３０に示すｏｒｉ１０１配列、及び配列番号２９に示すｏｒｉ１５Ａ配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１１】
前記分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列がｓｓｂ平衡致死系をコードするヌクレオチド配列、ａｓｄ平衡致死系をコードするヌクレオチド配列、ｐｈｄ−ｄｏｃ蛋白系をコードするヌクレオチド配列及びｈｏｋ−ｓｏｋアンチセンス系をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１２】
前記ｓｓｂ平衡致死系がシゲラ・フレクスナーｓｓｂ遺伝子座、サルモネラ・チフスｓｓｂ遺伝子座及びＥ・コリｓｓｂ遺伝子座よりなる群から選択されるｓｓｂ遺伝子座である請求項１１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１３】
前記ｓｓｂ平衡致死系が、配列番号３４に示すＳ・フレクスナー２ａ菌株ＣＶＤ１２０８ｓのｓｓｂ誘導性プロモーター、ｓｓｂ構成的プロモーター及びｓｓｂコード領域を含むｓｓｂ遺伝子座である請求項１１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１４】
前記分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列が配列番号３１に示すＥ・コリｐａｒＡ遺伝子座及び配列番号３２に示すＥ・コリｐＳＣ１０１ ｐａｒ遺伝子座よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１５】
前記プロモーター（ｄ）（ｉ）が誘導性プロモーターである請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１６】
前記プロモーター（ｄ）（ｉ）が配列番号３３に示すｏｍｐＣプロモーターである請求項１５記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１７】
前記選択された抗原（ｄ）（ｉ）をコードするヌクレオチド配列が同種の抗原をコードするヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１８】
前記選択された抗原（ｄ）（ｉ）をコードするヌクレオチド配列が異種の抗原をコードするヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１９】
前記選択された抗原（ｄ）（ｉ）をコードするヌクレオチド配列がウィルス抗原、細菌抗原、癌抗原及び自己免疫抗原よりなる群から選択される抗原をコードするヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項２０】
請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株及び製薬上許容しうる担体を含む医薬品製剤。
【請求項２１】
請求項８記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株及び製薬上許容しうる担体を含む医薬品製剤。
【請求項２２】
前記医薬品製剤が経口用医薬品製剤である請求項２０記載の医薬品製剤。
【請求項２３】
前記医薬品製剤が経口用医薬品製剤である請求項２１記載の医薬品製剤。
【請求項２４】
請求項２０記載の医薬品製剤の免疫学的有効量を被験体に投与することを含む弱毒化したサルモネラ・パラチフスＡ菌株に対する被験体における免疫応答を誘導する方法。
【請求項２５】
請求項２１記載の医薬品製剤の免疫学的有効量を被験体に投与することを含む選択された抗原に対する被験体における免疫応答を誘導する方法。
【請求項２６】
前記免疫応答が防御免疫応答である請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫応答が防御免疫応答である請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫応答が前記選択された抗原に対する免疫応答である請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫応答が前記選択された抗原に対する免疫応答及びサルモネラ・パラチフスＡ菌株に対する免疫応答である請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記医薬品製剤の免疫学的有効量がＳ・パラチフスＡ菌株の約１０２ｃｆｕ〜約１０１０ｃｆｕを含有する請求項２４記載の免疫応答を誘導する方法。
【請求項３１】
前記医薬品製剤の免疫学的有効量がＳ・パラチフスＡ菌株の約１０６ｃｆｕ〜約１０９ｃｆｕを含有する請求項２４記載の免疫応答を誘導する方法。
【請求項３２】
前記医薬品製剤の免疫学的有効量がＳ・パラチフスＡ菌株の約１０２ｃｆｕ〜約１０１０ｃｆｕを含有する請求項２５記載の免疫応答を誘導する方法。
【請求項３３】
前記医薬品製剤の免疫学的有効量がＳ・パラチフスＡ菌株の約１０６ｃｆｕ〜約１０９ｃｆｕを含有する請求項２５記載の免疫応答を誘導する方法。
【請求項１】
サルモネラ・パラチフスＡ菌株であって、ここで該菌株はｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子における弱毒化突然変異よりなる群から選択される弱毒化突然変異少なくとも１つを有する、サルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項２】
前記菌株が前記ｇｕａＢ遺伝子、前記ｇｕａＡ遺伝子及び前記ｃｌｐＰ遺伝子において弱毒化突然変異を有する、請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項３】
前記菌株が前記ｇｕａＢ遺伝子、前記ｇｕａＡ遺伝子及び前記ｃｌｐＸ遺伝子において弱毒化突然変異を有する、請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項４】
前記菌株が前記ｇｕａＢ遺伝子、前記ｇｕａＡ遺伝子、前記ｃｌｐＰ遺伝子及び前記ｃｌｐＸ遺伝子において弱毒化突然変異を有する、請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項５】
前記弱毒化突然変異が前記遺伝子座又は前記遺伝子の発現のレベルを低減するか、該遺伝子座又は該遺伝子の発現をブロックする弱毒化突然変異である請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項６】
前記弱毒化突然変異が前記遺伝子座又は前記遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を低減するか、該遺伝子座又は該遺伝子によりコードされるポリペプチドを不活性化する弱毒化突然変異である請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項７】
前記菌株がＳ・パラチフスＡ９１５０菌株である請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項８】
サルモネラ・パラチフスＡ菌株であって、該菌株がｇｕａＢＡ遺伝子座、ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子及びｃｌｐＸ遺伝子における弱毒化突然変異よりなる群から選択される弱毒化突然変異少なくとも１つを有し、そして該菌株が安定化されたプラスミド発現系を含む、サルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項９】
前記安定化されたプラスミド発現系が、以下：
（ａ）以下：
（ｉ）細胞当たり約２〜７５コピーの平均プラスミドコピー数に発現ベクターを制限する複製起点をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）該複製起点をコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第１のユニークな制限酵素切断部位、及び、
（ｉｉｉ）該複製起点をコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第２のユニークな制限酵素切断部位、
を含む制限されたコピー数の複製起点カセット；
（ｂ）以下：
（ｉ）分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）該分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第３のユニークな制限酵素切断部位、及び、
（ｉｉｉ）該分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第４のユニークな制限酵素切断部位
を含む分離後殺傷カセット少なくとも１つ；
（ｃ）以下：
（ｉ）分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）該分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第５のユニークな制限酵素切断部位、及び、
（ｉｉｉ）該分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第６のユニークな制限酵素切断部位、
を含む分配カセット少なくとも１つ；及び、
（ｄ）以下：
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）該プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列の５’に位置する第７のユニークな制限酵素切断部位、及び、
（ｉｉｉ）該プロモーターに作動可能に連結した選択された抗原をコードするヌクレオチド配列の３’に位置する第８のユニークな制限酵素切断部位、
を含む発現カセット；
を含む発現ベクターを含む、請求項８記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１０】
前記複製起点をコードするヌクレオチド配列が配列番号２８に示すｏｒｉＥ１配列、配列番号３０に示すｏｒｉ１０１配列、及び配列番号２９に示すｏｒｉ１５Ａ配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１１】
前記分離後殺傷遺伝子座少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列がｓｓｂ平衡致死系をコードするヌクレオチド配列、ａｓｄ平衡致死系をコードするヌクレオチド配列、ｐｈｄ−ｄｏｃ蛋白系をコードするヌクレオチド配列及びｈｏｋ−ｓｏｋアンチセンス系をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１２】
前記ｓｓｂ平衡致死系がシゲラ・フレクスナーｓｓｂ遺伝子座、サルモネラ・チフスｓｓｂ遺伝子座及びＥ・コリｓｓｂ遺伝子座よりなる群から選択されるｓｓｂ遺伝子座である請求項１１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１３】
前記ｓｓｂ平衡致死系が、配列番号３４に示すＳ・フレクスナー２ａ菌株ＣＶＤ１２０８ｓのｓｓｂ誘導性プロモーター、ｓｓｂ構成的プロモーター及びｓｓｂコード領域を含むｓｓｂ遺伝子座である請求項１１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１４】
前記分配機能少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列が配列番号３１に示すＥ・コリｐａｒＡ遺伝子座及び配列番号３２に示すＥ・コリｐＳＣ１０１ ｐａｒ遺伝子座よりなる群から選択されるヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１５】
前記プロモーター（ｄ）（ｉ）が誘導性プロモーターである請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１６】
前記プロモーター（ｄ）（ｉ）が配列番号３３に示すｏｍｐＣプロモーターである請求項１５記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１７】
前記選択された抗原（ｄ）（ｉ）をコードするヌクレオチド配列が同種の抗原をコードするヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１８】
前記選択された抗原（ｄ）（ｉ）をコードするヌクレオチド配列が異種の抗原をコードするヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項１９】
前記選択された抗原（ｄ）（ｉ）をコードするヌクレオチド配列がウィルス抗原、細菌抗原、癌抗原及び自己免疫抗原よりなる群から選択される抗原をコードするヌクレオチド配列である請求項９記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株。
【請求項２０】
請求項１記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株及び製薬上許容しうる担体を含む医薬品製剤。
【請求項２１】
請求項８記載のサルモネラ・パラチフスＡ菌株及び製薬上許容しうる担体を含む医薬品製剤。
【請求項２２】
前記医薬品製剤が経口用医薬品製剤である請求項２０記載の医薬品製剤。
【請求項２３】
前記医薬品製剤が経口用医薬品製剤である請求項２１記載の医薬品製剤。
【請求項２４】
請求項２０記載の医薬品製剤の免疫学的有効量を被験体に投与することを含む弱毒化したサルモネラ・パラチフスＡ菌株に対する被験体における免疫応答を誘導する方法。
【請求項２５】
請求項２１記載の医薬品製剤の免疫学的有効量を被験体に投与することを含む選択された抗原に対する被験体における免疫応答を誘導する方法。
【請求項２６】
前記免疫応答が防御免疫応答である請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫応答が防御免疫応答である請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫応答が前記選択された抗原に対する免疫応答である請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫応答が前記選択された抗原に対する免疫応答及びサルモネラ・パラチフスＡ菌株に対する免疫応答である請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記医薬品製剤の免疫学的有効量がＳ・パラチフスＡ菌株の約１０２ｃｆｕ〜約１０１０ｃｆｕを含有する請求項２４記載の免疫応答を誘導する方法。
【請求項３１】
前記医薬品製剤の免疫学的有効量がＳ・パラチフスＡ菌株の約１０６ｃｆｕ〜約１０９ｃｆｕを含有する請求項２４記載の免疫応答を誘導する方法。
【請求項３２】
前記医薬品製剤の免疫学的有効量がＳ・パラチフスＡ菌株の約１０２ｃｆｕ〜約１０１０ｃｆｕを含有する請求項２５記載の免疫応答を誘導する方法。
【請求項３３】
前記医薬品製剤の免疫学的有効量がＳ・パラチフスＡ菌株の約１０６ｃｆｕ〜約１０９ｃｆｕを含有する請求項２５記載の免疫応答を誘導する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５１６５０３（Ｐ２００９−５１６５０３Ａ）
【公表日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３８０４１（Ｐ２００８−５３８０４１）
【出願日】平成１８年１０月３０日（２００６．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４２１４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５３４８９
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（３０１０３３２４８）ユニバーシティ オブ メリーランド， ボルチモア (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月３０日（２００６．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４２１４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５３４８９
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（３０１０３３２４８）ユニバーシティ オブ メリーランド， ボルチモア (7)
【Ｆターム（参考）】
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