形質転換した赤痢菌
【課題】赤痢菌野生株に対するワクチンの製造に使用し得るように腸侵入性赤痢菌を改変する方法を提供する。
【解決手段】赤痢菌野生株が宿主の細胞および組織に侵入するために必要な第一のタンパク質をコードする第一の遺伝子、および赤痢菌野生株が宿主の感染細胞内および感染細胞と非感染細胞間で拡散するために必要な第二のタンパク質をコードする第二の遺伝子を不活性化あるいは欠損するように形質転換することにより、課題とする改変赤痢菌を得ることができる。
【解決手段】赤痢菌野生株が宿主の細胞および組織に侵入するために必要な第一のタンパク質をコードする第一の遺伝子、および赤痢菌野生株が宿主の感染細胞内および感染細胞と非感染細胞間で拡散するために必要な第二のタンパク質をコードする第二の遺伝子を不活性化あるいは欠損するように形質転換することにより、課題とする改変赤痢菌を得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、赤痢菌株が感染した宿主の細胞及び組織に実質的に侵入できず、宿主の感染細胞内及び感染細胞と非感染細胞との間に実質的に拡散できず、相当数の宿主細胞を殺滅させるであろう毒素を産生できなくなるように、赤痢菌の腸侵入性野生株のゲノムを改変する方法に係る。本発明は、特定的には、宿主を赤痢菌野生株に対して免疫感作するのに使用しうるこのような赤痢菌の改変株に関する。
【０００２】
シゲラ症（ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ）すなわち細菌性赤痢は世界中の風土病である疾患である。この疾患は、志賀赤痢菌Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１及びフレクスナー赤痢菌Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉが優位を占める熱帯地方や開発途上国では特に深刻な公衆衛生上の問題である。先進工業国では、シゲラ症の散在例がフレクスナー赤痢菌、ボイド赤痢菌Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ及びある種の腸侵入型大腸菌によることもあるが、主な病原菌はソンネ赤痢菌Ｓ．ｓｏｎｎｅｉである。
【０００３】
細菌性赤痢の疾病の成立ちの第一ステップは赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）がヒトの結腸粘膜に侵入することである（２３）。粘膜への侵入にはいくつかのステップがあり、細菌が上皮細胞へ入り込み、細胞内で増殖し、宿主細胞を殺滅し、最終的には隣接する細胞や結合組織へも拡散するというステップを含んでいる（９，４１，５５，５６）。通常は粘膜表面に限定される全体的な過程により強力な炎症反応が起り、これが腫瘍や潰瘍の原因となる（２３，４１，５５）。
【０００４】
赤痢がシゲラ症の特徴ではあるが、その前に水のような下痢をすることがある。下痢は結腸での再吸収の障害と空腸での分泌の増加の結果であるように思われるが、赤痢は純粋に結腸での過程によるものである（２０，４１）。シゲラ症、主として志賀赤痢菌１による例では、発症の途中で全身症状が認められることもある。これらの症状には中毒性の巨大結腸、白血病性反応そして溶血性−尿毒症症候群（“ＨＵＳ”）が含まれている。ＨＵＳは開発途上国でのシゲラ症による死亡の主因となっている（１１，２２，３８）。
【０００５】
志賀赤痢菌１が大量に産生するＳｈｉｇａ−毒素（６）及びフレクスナー赤痢菌及びソンネ赤痢菌が少量産生するＳｈｉｇａ様毒素（“ＳＬＴ”）（１９，３０）がシゲラ症の４つの段階（すなわち、個々の上皮細胞への侵入、組織への侵入、下痢そして全身症状）で果す役割はよく判ってはいない。概説に関してはＯ’Ｂｒｉｅｎ及びＨｏｌｍｅｓ（３２）を参照せよ。１８０〜２２０キロ塩基（ｋｂ）のプラスミドは全ての種の赤痢菌にとって個々の上皮細胞への侵入に不可欠である（４１，４２，４４）。これには侵入、細胞内での増殖及び宿主細胞を早期に殺滅することを含んでいる（４，５，４６）。この段階でのＳｈｉｇａ−毒素及びＳＬＴの役割は明らかではない。Ｓｈｉｇａ−毒素及びＳＬＴは細胞内増殖及び早期の殺滅に重要な役割を果しているようではない（４，１２，４６）。しかしながら、今までに行われてきた実験の中には適切な細胞アッセイ系で同一遺伝子の変異株を比較しているものはない。最近の知見はＳｈｉｇａ−毒素がヒト結腸細胞の一次培養に対し細胞毒性であることを示している（２７）。組織への侵入には他の染色体でコードされた生成物、すなわち滑面（ｓｍｏｏｔｈ）リポ多糖類（“ＬＰＳ”）（４４，５７）、遺伝子座Ｋｃｐの非特性化生成物（８，４４）及びエアロバクチン（ａｅｒｏｂａｃｔｉｎ）（２４，２８）を必要としている。ウサギの回腸係蹄での体液の産生に必要なフレクスナー赤痢菌染色体の部分はｒｈａ−ｍｔｌ領域とリジンデカルボキシラーゼ部位近くに局在している（４４）。しかし、体液貯留をもたらす能力がフレクスナー赤痢菌のＳＬＴによるものであることを示す証拠は提示されていない。従って、シゲラ症の全身性合併症の発症におけるＳｈｉｇａ−毒素の役割は未だ仮説的なものである。しかし、ＨＵＳで認められる毛細血管での病変はこの毒素を注射した動物の脳血管で認められるものと類似しているために、Ｓｈｉｇａ−毒素は血管の損傷を仲介することができる（１，２，２２）。
【０００６】
Ｓｈｉｇａ毒素又はＬＳＴを欠く変異株は疾病過程におけるこれら毒素の役割を示しうるであろう。Ｓｅｋｉｚａｋｉら（４８）がＨｅｌａ細胞アッセイ及びＳｅｒａｎｙテスト（４９）で野生株と同様の侵入性を示すこのような変異株を得てはいたが、この細胞毒素を最も大量に産生する志賀赤痢菌１はＳｈｉｇａ−毒素陰性変異株（Ｔｏｘ−）に形質転換することができ、毒素の役割を示すために最も役立てることができた。更に重要なことに、このようなＴｏｘ−変異株を使用し、侵入できず、そして宿主細胞内で実質的に増殖できず、又、宿主の感染細胞内でそしてこれら感染細胞から宿主の未感染細胞へ実質的に拡散することができず、又、相当数の感染及び非感染宿主細胞を殺滅する毒素を産生できない変異株を作ることができる。その結果、Ｔｏｘ−変異株を使用して赤痢菌野生株に対して宿主を免疫感作することができた。
【０００７】
発明の概要
ｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させたＳｈｉｇａ−毒素遺伝子で対立遺伝子を交換することにより、志賀赤痢菌１野生株のＴｏｘ−変異株を遺伝子操作する。細胞アッセイ系や動物でのこの突然変異の作用から、変異株を更に遺伝子操作して実質的に侵入できず、次いで宿主細胞内及び間で拡散できず、しかも宿主細胞内でＳｈｉｇａ−毒素を産生できない変異株を提供しうることが示されている。
【０００８】
又、本発明によると、志賀赤痢菌１野生株のＴｏｘ−変異株は次のものでの対立遺伝子交換により遺伝子操作する：
ａ）志賀赤痢菌１が宿主細胞及び組織に侵入するために必要な蛋白質をコ―トする志賀赤痢菌１の遺伝子、例えば、鉄のキレート化及び／又は志賀赤痢菌１への鉄の輸送に必要な蛋白質をコードする遺伝子（例えば、志賀赤痢菌１のエンテロバクチン（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ）又はエンテロケリン（ｅｎｔｅｒｏｃｈｅｌｉｎ）遺伝子）をｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させたもの；及び
ｂ）感染細胞内及び感染細胞と非感染細胞との間に志賀赤痢菌１が拡散するために必要な蛋白質をコードする志賀赤痢菌１ の遺伝子、例えば、細胞内−細胞間拡散遺伝子（例えば、ｉｃｓＡ又はｖｉｒＧ遺伝子）をｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させたもの。
【０００９】
本発明によると、更に、（ａ）宿主細胞及び組織にフレクスナー赤痢菌が侵入するために必要な蛋白質をコードするフレクスナー赤痢菌の遺伝子、例えば鉄のキレート化及び／又はフレクスナー赤痢菌への鉄の輸送に必要な蛋白質をコードする遺伝子（例えば、フレクスナー赤痢菌のエアロバクチン遺伝子）をｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させたもの、及び（ｂ）宿主細胞内及び間にフレクスナー赤痢菌が拡散するために必要な蛋白質をコードする遺伝子、例えばｉｃｓ Ａ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させたもので対立遺伝子交換してフレクスナー赤痢菌野生株の変異株を遺伝子操作する。
【００１０】
本発明により、更に、本発明の赤痢菌変異株を使用して赤痢菌野生株に対するワクチンを作成する。
【発明の開示】
【００１１】
改変株を赤痢菌野生株に対するワクチンの製造に使用しうるように腸侵入性赤痢菌を改変する方法が提供される。宿主特にヒトの感染細胞内に侵入及び次にそこで増殖することができず、そして宿主の感染細胞内及び感染細胞と非感染細胞との間に実質的に拡散できず、又、相当数の宿主の感染及び非感染細胞を殺滅する毒素を産生できなくなるように赤痢菌野生株を改変する。この方法には、感染した宿主細胞及び組織に菌株が侵入するために必要な１つ以上の蛋白質をコードする野生株の遺伝子（例えば、アエロバクチン（ａｅｒｏｂａｃｔｉｎ）遺伝子）及び感染した宿主細胞内及び間に菌株が拡散するために必要な１つ以上の蛋白質をコードする野生株の遺伝子（例えばｉｃｓＡ遺伝子［６０，６１］）が全部又は部分的に除去、又は永久的に不活性化され、好ましくは少なくとも部分的に除去されるように、赤痢菌の野生株（例えばフレクスナー赤痢菌）のゲノム（例えば、大きな発病性プラスミドｐＨＳ７２００）を変換することを含んでいる。志賀赤痢菌１のような野生株のゲノムを変換するためには、Ｓｈｉｇａ−毒素をコードする遺伝子、好ましくは正にＡサブユニット遺伝子を全部もしくは部分的に除去し、又は永久的に不活性化し、好ましくは、少なくとも部分的に除去することもその方法に含んでいるのが好ましい。
【００１２】
本発明方法では、赤痢菌野生株の遺伝子が慣用法例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させた遺伝子による対立遺伝子交換で完全に又は部分的に除去或いは永久的に不活化でき、少なくともその大部分は除去されているのが好ましい。この点に関して本発明ワクチンを製造するときに使用する突然変異させた遺伝子は、遺伝子に挿入され、そして次世代の赤痢菌においてｉｎ ｖｉｔｒｏで再生されるときに遺伝子から消失しうるトランスポゾンによって不活化させただけのものではないことが好ましい。むしろ、変異誘発させた遺伝子の大部分が欠損しており、好適なワクチンに適合性のマーカー遺伝子をこのような欠損部分に挿入するのが好ましい。このようなマーカー遺伝子により、そうして形質転換した赤痢菌が容易に同定される。好ましいマーカー遺伝子は水銀、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、アンチモン、カドミウム、亜鉛及び／又はコバルトに耐性の遺伝子のような重金属耐性遺伝子である（６２，６３，６４，６５）。
【００１３】
改変した菌株の細胞は慣用法で培養し、次いで減弱させることができる。次に、細胞を慣用の薬剤として許容されるベヒクル（例えば、食塩水溶液）及び適宜、慣用の賦形剤（例えば、薬剤として許容される洗剤）と混合して野生株に対するワクチンを形成することができる。ワクチンは、細胞物質を最終濃度０．２〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２ｍｇ／ｍｌ含有するように処方しうる。処方後、ワクチンは滅菌容器に入れることができ、次いで、これを密封し、低温（例えば４℃）で保存するか、或いは凍結乾燥させることもできる。
【００１４】
ヒト宿主で赤痢菌野生株に対する免疫性を誘導するためには、約１０９〜１０１１の凍結乾燥した赤痢菌細胞を含有するような用量で、好適に処方したワクチンを１回以上投与することができる。ワクチンは慣用法で経口投与することができる。治療は、ワクチンの１回投与又は長期に亘る複数回の投与からなりうる。
【００１５】
次の実施例で本発明を説明する。
【実施例】
【００１６】
特記しないかぎり、本実施例で使用するクローニング及び形質転換の手順及び手法はＭａｎｉａｔｉｓらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に一般的に記載されているものと同じである。
【００１７】
実施例１〜６で使用する菌株及びそのファージ又はプラスミドの内容は第１表に示す。
【００１８】
実施例では２つの培地を使用した：Ｍ９最少培地（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ：１５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４：３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ：０．５ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌ：１ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５ｇ／ｌ）及びトリプトカゼインソヤブロス（Ｔｒｙｐｔｏ Ｃａｓｅｉｎ Ｓｏｙａ Ｂｒｏｔｈ）（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｍａｒｎｅｓ ｌａ Ｃｏｑｕｅｔｌｅ，フランス）。
【００１９】
実施例１…Ｓｈｉｇａ−毒素オペロンのクローニング
Ｃｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｅ ｄｅｓ Ｓｈｉｇｅｌｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ （パリ、フランス）から入手した野生型の抗生物質感受性の志賀赤痢菌１ 菌株ＳＣ５００ から全ＤＮＡを調製した（５０）。ＤＮＡ１０μｇ をＥｃｏＲＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）で消化し、０．７％のアガロースゲル上に載置した。３．５〜４．５ｋｂの断片を電気溶離した。精製した断片０．１μｇを、１μｇのｃｏｓ−連結し、ＥｃｏＲＩで切断し、脱リン酸したλＧＴ１１アーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，サンディエゴ，米国）に連結し、販売元の指示に従ってＰａｋａｇｅｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｇｅｍａ Ｂｉｏｔｅｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，米国）を使用してパッケージングした。次いで、パッケージングしたＤＮＡを大腸菌Ｙ１０９０（５９）にトランスフェクトした。次に、λＧＴ１１バンクを、Ａ．Ｄ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｕ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ｈ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，米国から入手したＳＬＴ１のＢサブユニットに特異的なモノクローナル抗体である１３Ｃ４（５４）でスクリーニングした。１０３個の組換えファージをＬＢソフトアガー中のＹ１０９０上にまいた。プレートを３７℃で１２時間インキュベートした。予め１０ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（“ＩＰＴＧ”）溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）に漬けたニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，西独）をプレートに適用し、次いで、４２℃で２．５時間インキュベートした。フィルターをプレートから取り出し、ＰＢＳ−ミルク（１×ＰＢＳ中脱水低脂肪ミルク５０ｇ／ｌ）中、３７℃で１時間インキュベートし、１×ＰＢＳで５回洗い、希釈していないハイブリドーマ細胞上清中の１３Ｃ４モノクローナル抗体と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ミルクで５回洗った後、アルカリ性ホスファターゼと抱合した羊抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｓｙｓ，Ｃｏｍｐｉｅｇｎｅ，フランス）の１／２００希釈液を含有するＰＢＳ−ミルク中、３７℃で、１時間、フィルターをインキュベートした。フィルターを再度１×ＰＢＳで洗い、染色溶液（ニトロ−ブルーテトラゾリウム０．３３ｍｇ／ｌ、リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル０．１６ｍｇ／ｌ（両化合物共Ｓｉｇｍａ製）、１００ｍＭトリスＨＣｌｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中に置いた。陽性のクローンをプラーク精製し、Ｙ１０８９にトランスフェクトした（５９）。次に、ＤＮＡを溶原菌から調製した（１３）。大腸菌ＪＭ８３のプラスミドベクターｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ部位でサブクローニングした（５８）。上記のように、但し、次のような変更を行って、モノクローナル抗体１３Ｃ４で大腸菌ＪＭ８３のサブクローンをテストした：乾燥したニトロセルロースフィルターをプレート上に置き、ＰＢＳ中２ｍｇ／ｌのポリミキシンＢ溶液２ｍｌをフィルター上に加えた。次に、ＰＢＳ−ミルクインキュベーションを始める前に、プレートを３７℃で４５分間インキュベートした。ＳＬＴ１のＢサブユニットを含む大腸菌ＪＭ８３中のサブクローン ｐＨＳ７２０１が同定された。
【００２０】
遺伝子量効果によって、大腸菌ＪＭ８３のサブクローンｐＨＳ７２０１は、１３Ｃ４モノクローナル抗体の存在下でのコロニー免疫ブロットアッセイで親株ＳＣ ５００より強いシグナルを有することが判った。ｐＨＳ７２０１のＳｈｉｇａ−毒素コード領域の制限地図はＳＬＴ１のものと同じであった（１４）。Ａサブユニット遺伝子は、実施例２に記載したようにカセットを挿入しうるＡＴＧ出発コドンから３１０ｂｐ下流にある独特なＨｐａ１部位を有することが判った。
【００２１】
実施例２…Ｓｈｉｇａ−毒素Ａサブユニット遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの変異誘発
サブクローンｐＨＳ７２０１では、４．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片内に全Ｓｈｉｇａ−毒素オペロンが含まれている。スペクチノマイシン耐性をコードし、Ｔ４翻訳転写停止信号が各側にあるインターポゾンΩ（３７）を挿入することによってＡサブユニット遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの変異誘発を実施した。ΩはＨｉｎｄIII２ｋｂ断片として精製され、その末端にはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片が充填されていた。次に、ΩをＨｐａＩ線状化ｐＨＳ７２０１に連結させて、図に示すような組換えプラスミドｐＨＳ７２０２を生成した。次に、変異誘発した配列を含有する６．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を精製し、自殺プラスミドベクターｐＪＭ７０３．１（５１）のＥｃｏＲＩ部分に連結させて図に示すような組換えプラスミドｐＨＳ７２０３を生成した。大腸菌ＳＭ１０のゲノムに組み込まれているラムダファージに含まれるｐｉｒ機能をイントランス（ｉｎ−ｔｒａｎｓ）でその欠損Ｒ６Ｋ源に補足したときのみにｐＪＭ７０３．１は複製する（２１）。大腸菌ＳＭ１０はその染色体に統合されている広範な宿主域のＩｎｃＰ−型プラスミドＲＰ４の転移遺伝子も含有している。従って、ｐＪＭ７０３．１は、ＲＰ４からのＭｏｂ部位を含有している（５１）ために、ＳＭ１０λｐｉｒ（２１）で可動化されうる。このようにして、ｐＨＳ７２０３は菌株ＳＭ１０λｐｉｒ中で安定して保持されており、次に、野生型志賀赤痢菌１株ＳＣ５００に抱合的に移行させた。セロファン膜上で交配を行い、チアミン、メチオニン、トリプトファン及びニコチン酸を各々１０μｇ／ｍｌの濃度、グルコース０．２％及びスペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを補ったＭ９最少培地でプレーティングすることにより選択した。選択培地上で増殖しているコロニーを精製し、特異的なウサギの抗血清（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐａｔｅｕｒ）で凝集させることにより志賀赤痢菌１と同定した。
【００２２】
野生型染色体のＳｈｉｇａ−毒素遺伝子とＳｈｉｇａ−毒素遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させたものとの間の対立遺伝子交換は、Ｔｏｘ−表現型を発現する志賀赤痢菌１を検出するモノクローナル抗体１３Ｃ４を使用したコロニーブロットイムノアッセイにより示された。
【００２３】
志賀赤痢菌１細胞のゲノムでのＴｏｘ−改変の存在は、上記の完全なＳｈｉｇａ−毒素オペロンを含有する４．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片からのＡサブユニット遺伝子の一部とＢサブユニット遺伝子全体を含む６５５ｂｐのＨｉｎｄ III−Ｈｉｎｃ II断片から作成したプローブで立証された。Ωインターポゾンを含有する上記の２ｋｂ Ｈｉｎｄ III断片もプローブとして使用した（３７）。プローブとして使用したＤＮＡは３２Ｐ−標識５′−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるニック翻訳（３９）で標識した。全ＤＮＡは２つのＴｏｘ−クローンから調製し、Ｓｈｉｇａ−毒素プローブ及びΩプローブとのハイブリッド形成により分析した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎの方法（５３）により、ＤＮＡ断片をアガロースゲルからニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｌｌ）へ移した。６５℃、一晩でハイブリッド形成し、６×ＳＳＣ中、６５℃で洗浄した。プローブは、両方のプローブとハイブリッド形成するＴｏｘ−変異株では、毒素遺伝子を含有する志賀赤痢菌１からの４．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片が６．２ｋｂ断片で置換されていることを示していた。この結果から、ｐＨＳ７２０３の突然変異した毒素遺伝子の各側に側面を接した領域はＳＣ５００ゲノム中のその相手と組換わっており、野生型Ａサブユニット遺伝子を変異した遺伝子で置き換えたことを示していた。
【００２４】
これらＴｏｘ−クローンの１つであるＳＣ５０１を更に研究するために選択した。クローンＳＣ５０１は１９８８年６月３０日に受託番号Ｉ−７７４としてＣｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（パリ、フランス）に寄託した。
【００２５】
実施例３…細胞毒性、ＨｅＬａ細胞内での増殖、マクロファージの剥離並びにウサギ結腸係蹄及びサルでの細胞毒性のアッセイ
ＳＣ５００及びＳＣ５０１並びに各々その非侵入性誘導体であるＳＣ５０２及びＳＣ５０３（これらは、細胞の侵入に必要な大きな発病性プラスミドｐＨＳ７２００の自発的治癒（すなわち消失）により得た）を鉄欠乏培地２００ｍｌ中で４８時間増殖させた。ガラス器具は６Ｎ ＨＣｌで予備処理し、鉄を含まない水でよくすすいだ。培地はＣａＣｌ２１５μｇ／ｍｌ、カザミノ酸５ｍｇ／ｍｌ、グルコース２ｍｇ／ｍｌ、チアミン５０μｇ／ｍｌ、Ｌ−トリプトファン２０μｇ／ｍｌ、ニコチン酸１０μｇ／ｍｌ及びヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）１５０μｇ／ｍｌを補ったＭ９塩を含有していた。細菌は食塩水で２回洗い、３ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌでリゾチームを加えた。室温（２５℃）で３０分間インキュベートした後、ＥＤＴＡ ０．５Ｍ（ｐＨ８）３０μｌを加え、細胞を氷浴に移し、超音波処理した。超音波処理抽出物をフィルター滅菌し、−２０℃で凍結保存した。フィルター滅菌した培養上清及び細菌抽出物を、１０％の牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＮ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，スコットランド，英国）及びＥａｒｌｅ塩を有する最少必須培地で増殖させたＨｅＬａ細胞への細胞毒性についてアッセイした。マイクロタイタープレート内で細胞培養培地（１００μｌ）を順次希釈した。各ウェルには１００μｌ中に２×１０４個の細胞を接種した。次に、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で２４時間インキュベートした。ウサギポリクローナル血清及び１３Ｃ４モノクローナル抗体の両者で中和アッセイを実施した。プレートを光学顕微鏡で調べてからＧｉｅｍｓａ染色した。抽出物蛋白質１ｍｇ当りの５０％細胞毒性用量（ＣＤ５０）として細胞毒性を計算した。
【００２６】
ＨｅＬａ細胞内での細菌の増殖をアッセイした（４６）。３５ｍｍのプラスチック製組織培養皿（Ｂｅｅｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ，米国）中のＨｅＬａ細胞の非融合単一層に、最少必須培地（“ＭＥＭ”，Ｇｉｂｃｏ）２ｍｌに１００の感染倍数（“ＭＤＩ”）で再懸濁させた細菌を接種し、２，２００×ｇで１０分間遠心分離し、３７℃で３０分間インキュベートして侵入させた。次に、プレートを、Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｂｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（“ＥＢＳＳ”，Ｇｉｂｃｏ）で３回洗い、ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＭＥＭ２ｍｌで覆った。これを時間０（Ｔ０）とした。３７℃で１時間インキュベートした後、調製物を再度ＥＢＳＳで洗い、抗生物質を含まないＭＥＭ２ｍｌで覆った（Ｔ１）。更に３時間インキュベーションを続けた（Ｔ１〜Ｔ４）。毎時間、２枚のプレートを取り出した。１枚のプレートはＥＢＳＳで３回洗い、Ｇｉｅｍｓａ染色し、感染したＨｅＬａ細胞を計算した。もう一方はＥＢＳＳで５回洗い、成育しうる細胞外細菌を除去した。細胞をトリプシン処理し、計測し、蒸留水中０．５％のデオキシコール酸ナトリウムで溶解させた。希釈物をＴｒｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ａｇａｒに載置した。感染ＨｅＬａ細胞当りの細菌の平均数を計算した。実験は４回繰り返した。細胞内での増殖曲線を書き、指数関数相の傾斜を計算した。
【００２７】
マクロファージの剥離及び殺滅についてのアッセイは、補体不活性化牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＲＰＭＩ１６４０（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｍｃｌｅａｕ ＵＡ，米国）内に保持したＪ７７４マクロファージ（５２）を使用して実施した（４）。感染の１８時間前に、１ｍｌ当り０．５μＣｉの［３Ｈ］ウリジンを含有する培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で、３５ｍｍのプラスチック製組織培養皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）内の７×１０５個のマクロファージを標識した。ＭＯＩが１００でのＲＰＭＩ１６４０中細菌懸濁液１ｍｌを添加する前に、細胞をＥＢＳＳで３回洗った。５％ＣＯ２中、３７℃で１時間感染させた。次に、単一層をＥＢＳＳで３回洗い（Ｔ０）、５％ＣＯ２下、３７℃で、２ｍＭグルタミンとゲンタマイシン２５μｇ／ｍｌを補ったＲＰＭＩ２ｍｌで１時間覆った（Ｔ１）。次に、プレートをＥＢＳＳで３回洗い、５％ＣＯ２下、３７℃で、ゲンタマイシンを含有しないＲＰＭＩグルコース内で更に３時間インキュベートした（Ｔ１〜Ｔ４）。毎時間、２枚のプレートを取り出し、培養物をＥＢＳＳで３回洗い、プラスチック表面にまだ接着している細胞中の成育しえないマクロファージの割合をＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色により測定した。次に、皿の中に残留している放射活性量を測定することにより残留しているマクロファージの割合を測定した。蒸留水中０．５％のデオキシコール酸ナトリウム１ｍｌで粘着細胞を溶解し、この溶解物１００μｌを沈殿させて計量した（４）。
【００２８】
６％のペンタバルビタールナトリウム０．５ｍｌ／ｋｇで麻酔した約２ｋｇのウサギで、１０ｃｍのウサギ連結結腸係蹄を調製した。
【００２９】
Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ １ｍｌ中１０７及び１０９個のＣＦＵの接種物をテストした。１８時間後にウサギを殺した。係蹄内の液体貯留を記録し、容量と長さとの比（“Ｖ／Ｌ”）を計算した。感染した係蹄の部位を１０％緩衝ホルマリン中に固定した。検体を標準法で処理し、ヘマトキシリネオシン−サフラニンで染色した。
【００３０】
体重３．５〜４．５の８匹の赤毛猿に塩酸ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ ５００，Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｗｘ，リヨン，フランス）５０ｍｇを筋注した。Ｔｒｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ 及び１４ｇ／ｌの重炭酸ナトリウム（５０／５０）２０ｍｌに再懸濁させたＳＣ５００及びＳＣ５０１微生物１．５×１０１１個を各動物の胃の内に接種した。接種物をＣｏｎｇｏ−ｒｅｄ寒天にプレーティングすると、接種物中の細菌の１％以上が侵入特性を失ったことが示された（２６）。下痢、膿、粘液及び血液の存在について便を毎日調べた。これらの症状の各々の強度は、毎日、０〜３＋で評価した。各動物については、所与の症状の重篤度を、各症状の「＋」の合計を表わす指数で表現した。電撃性赤痢で死亡したサルは直ちに培検した。ウサギの組織について上記したと同様に検体を処理した。
【００３１】
結果
細胞毒性アッセイではＳＭ１０λｐｉｒ（ｐＨＳ７２０３）は非細胞毒性であった。志賀赤痢菌にｐＨＳ７２０３を抱合的に移した後、ＡｍｐＳＳｐｃＲ表現型を示すクローンをコロニーイムノブロットアッセイでテストした。５％がＴｏｘ−の表現型を示した。ＳＣ５０１は３４７ ＣＤ５０／蛋白質ｍｇの細胞毒性を示し、この値は良く知られている大腸菌Ｋ１２の値（４１２ ＣＤ５０／ｍｇ）と同程度であった。ＳＣ５０１由来の残りの細胞毒性は抗Ｓｈｉｇａ 毒素ポリクローナル抗体で中和できなかった。
【００３２】
野生型菌株ＳＣ５００の指数増殖率（世代／時間）は２．５±０．６であるのに対し、菌株ＳＣ５０１中のＴｏｘ−変異株の指数増殖率は２．６±０．７であることから、菌株ＳＣ５０１中のＴｏｘ−変異株の存在によりＨｅＬａ細胞内でのその増殖能が顕著に変化することはなかった。更に、ＳＣ５００及びＳＣ５０１によるＪ７７４マクロファージの急速な殺滅の有効性でも顕著な差は認められなかった。細胞の剥離及びＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ陽性細胞の出現の両者が４時間に亘り同様な速度で進み、従って、感染細胞内に放出されたＳｈｉｇａ−毒素は細胞内増殖速度に顕著に影響することも、宿主細胞の迅速な殺滅を増加させることもないことが示された。
【００３３】
ウサギの連結係蹄モデルでの志賀赤痢菌の病因性に対するＩｎｖ−及びＴｏｘ−変異の作用を係蹄内での液体産生に対する作用によって測定した。各菌株についての６つの係蹄に２種の接種物（すなわち１０９及び１０７ＣＦＵ）のいずれかで得た結果から算出をして平均及び標準偏差を得た。侵入性菌株（すなわち、ＳＣ５００、Ｉｎｖ＋、Ｔｏｘ＋及びＳＣ５０１、Ｉｎｖ−、Ｔｏｘ−）の両方の接種物では、Ｓｈｉｇａ毒素の産生がなくなると液体の貯留は減少したが、差異は統計的に有意ではなく、侵入とそれに続く炎症が液体貯留の第一の原因であることを示している。非侵入性菌株（すなわち、ＳＣ５０３、Ｔｏｘ＋及びＳＣ５０２、Ｔｏｘ−）については、Ｓｈｉｇａ−毒素を産生する菌株のみが液体貯留を誘発したことから大きな差異が認められた。このことは、疾患の間でこのエンテロトキシンがどのような役割を果すにしても、ウサギのモデルではＳｈｉｇａ−毒素が志賀赤痢菌１の唯一のエンテロトキシンであることを示していた。組織病理学的研究により、ＳＣ５００又はＳＣ５０１による接種物のいずれでも多くの絨毛を破壊している腫瘍及び潰瘍を含む重篤な病巣が示された。一般に、野生型菌株に感染した係蹄での病変がより重篤であったが、差が小さかったとの観察は侵入が病原性の主要因子であることを示した。
【００３４】
非侵入性Ｔｏｘ＋株であるＳＣ５０２に感染した係蹄は、絨毛の膨潤及び短縮、固有層の浮腫及び炎症、杯細胞から分泌される大量の粘液による上皮細胞の変化並びに核濃縮した核による殺滅腸細胞部分を伴い重篤に変化した。しかしながら、最も大きな特徴は上皮層全体に亘る出血であった。
【００３５】
志賀赤痢菌１の病原性についてのＴｏｘ−変異の影響をサルで示した。ＳＣ５００注射群及びＳＣ５０１の注射群の両群で４日目に電撃性赤痢により２匹のサルが死亡し、各群は、Ｓｈｉｇａ−毒素は致死的な赤痢に必要ではないことを示していた。膿及び粘液の量を正確に定量することは困難であるが、下痢便の容量並びに膿及び粘液の量に顕著な差は認められなかった。一方、ＳＣ５００に感染した動物での異常便では血液の存在は不変の特徴であったが、ＳＣ５０１に感染した動物では一匹のみで微量の血液が一時的に見られただけであった。動物の死亡直後に実施した剖検は結腸腹膜中皮で明白な違いを示した。結腸腹膜中皮は、ＳＣ５００に感染した動物の場合のみでパッチ状の出血部分が観察されうるＳ状表面で特に明らかであった。平均すると、腫瘍の数や重症度は同様であったが、リーベルキューン腺での破壊を伴う粘膜の化膿性壊死はＳＣ５００に感染した動物でのみ部分的に認められた。絨毛膜、粘膜下組織及び腹膜の炎症性浸潤もこれらの動物でより重篤であった。更に、ＳＣ５０１ に比しＳＣ５００ に感染した動物に特徴的である腹膜中皮の炎症性浸潤は主として血管周囲のものであり、従って、重篤な腹膜脈管炎の存在を示唆する肉眼的検査を確認した。しかしながら、顆粒細胞内絨毛膜内の毛細管循環のレベルで最も大きな差が観察された。ＳＣ５００で感染したサルでは粘膜の上部構造を破壊する出血が認められた。上皮内膜を局所的に損傷している微細な膿瘍を介して赤血球が小腸管腔内に拡散しているのが観察できた。これらの出血は明らかに毛細管係蹄の破壊によるものである。一方、ＳＣ５０１に感染したサルは毛細管係蹄の拡張は示すが、破壊は示さなかった。感染前及び感染後３日目に実施した白血球数の計測は以下のように示した：０日目には、多形核白血球（“ＰＭＮ”）数には有意差はなく、骨髄増加はなかった；３日目には、血液ＰＭＮの低下及び骨髄増加の程度の各々はＳＣ５００に感染したサルでより明らかであった。
【００３６】
結論
ヒトにおける状況証拠はＳｈｉｇａ−毒素が真の病原性要素であるという仮説を支持している。志賀赤痢菌１の侵入性で毒素産生が低い、塩素酸塩耐性変異株の菌株７２５を摂取した志願者は、野生株Ｍ１３１を摂取した者より重症度の低い症状を示した（２５）。自然に感染した患者では、志賀赤痢菌１に感染したときには他の血清型の赤痢菌に感染したときより、ＨＵＳを含めより重篤な症状となるのが普通である（７）。これらは毒素中和抗体を速やかに発達させる（１８）。
【００３７】
志賀赤痢菌１のＴｏｘ−変異株であるＳＣ５０１は大腸菌Ｋ１２と同様の残留量の細胞毒素を産生することが示されている。この変異株は志賀赤痢菌１の病原性におけるこのＳｈｉｇａ−毒素の役割を調べるための研究に使用されてきている。細胞アッセイ及びより確実な動物モデルが使用されている。
【００３８】
ＨｅＬａ細胞や単一層内のＪ７７４マクロファージを使用するアッセイは、以前の研究（４６）がフレクスナー赤痢菌でのＳＬＴについて示唆しているように、Ｓｈｉｇａ−毒素の分泌は感染細胞内での指数増殖速度には影響しないことで示した。これらの結果は、ＳＣ５０１に変異株及び２つの他の毒素産生の低い変異株（２５，４８）が、上皮内での細菌の増殖能に相関することが知られている角結膜炎に影響を与えない（４９）という観察と一致している。又、以前に示唆されているように（４，１２）、Ｓｈｉｇａ−毒素の産生と宿主細胞の早期殺滅との間には相関関係が観察されなかった。このようなデータは実際の感染により類似しているアッセイで確認することが必要であるが、Ｓｈｉｇａ−毒素が感染の細胞内段階では主要な役割を果していないことを明示している。侵入が、Ｓｈｉｇａ−毒素のゆっくりと作用する過程（１２）よりもより速く宿主細胞の殺滅を仲介する早期の代謝の引き金になるように思われる。
【００３９】
ウサギの連結した小腸係蹄の感染では、ＳＣ５００及びＳＣ５０１接種物の両者で、１８時間後の粘膜病変の重症度がわずかしか違わないことを示していた。しかしながら、露出の時間や係蹄の閉塞が細胞毒素産生の作用を隠し、侵入を第一のものとしているのかもしれない。腸毒性に関する結果は侵入性細菌の場合に分析がより困難であった。それは、産生された液体の量が、Ｔｏｘ−変異株の両方の接種物でより少かったが、野生菌株により分泌されたものと有意には異ってはいなかったからである。このことは、上皮の再吸収機能を阻止するには組織への侵入で十分であることを示していた。一方、非侵入性のＴｏｘ＋及びＴｏｘ−変異株の間で観察された大きな違いは、ウサギモデルの感受性の限度内ではＳｈｉｇａ−毒素が志賀赤痢菌１の唯一のエンテロトキシンであることを示している。このことは以前の研究（１６，１７，３３）とも一致する。しかし、Ｉｎｖ＋及びＩｎｖ−の変異株での液体貯留を観察すると、産生された液体の性質は感染している菌株によって異なっている。侵入性菌株は、産生されたＳｈｉｇａ−毒素の量とは無関係に、管腔内で潰瘍化した膿瘍の程度を反映しているであろう粘性で粘膜病原性で、時には血液を含む液体の産生を誘発するが、非侵入性のＴｏｘ＋菌株は腸毒性や細胞毒性をより反映している水様で時には血液を含む液体を産生する。Ｉｎｖ−，Ｔｏｘ＋変異株であるＳＣ５０２に感染した係蹄からの組織サンプルを組織病理学的に研究すると、固有層の重大な炎症性浸潤及び主として短かくなった絨毛の先端での重大な変化を示していた。このことによりｉｎ ｖｉｖｏでの腸細胞に対するＳｈｉｇａ−毒素の細胞毒性が確認される（２７）。しかし、最も大きな特徴は、大量の粘液と共に管腔内に流れ出てくる赤血球による上皮内膜の浸潤であった。大きな血管変化が固有層内で起っていることを示すこの観察は次にサルのモデルでも確認された。
【００４０】
赤毛猿の胃内にＳＣ５００及びＳＣ５０１を接種すると、Ｓｈｉｇａ−毒素産生とは無関係に致死的な電撃性赤痢が発生しうることを示した。下痢及び便内の膿や粘液の量には顕著の差は認められなかった。水様の下痢が存在しなかったこと及び便の量が等しかったことは、Ｓｈｉｇａ−毒素による空腸分泌増加を示唆する以前の研究（４１）とは一致しなかった。唯一の大きな違いは、野生型菌株に感染した動物の赤痢の便には血液が存在していたことであった。最近の論文は、赤痢患者の中で、より細胞毒性の高い菌株を排出する患者の便に血液が存在する傾向が強いことを報告していた（３６）。組織病理学的観察により、Ｓ状結腸で特に特徴的に現れる血管損傷が存在することが確認された。これは、野生型菌株に感染したサルでは絨毛膜内の毛細管係蹄の全面的破壊が見られたのに対し、Ｔｏｘ−変異株に感染した動物の血管系では膨満しているがほとんど無傷の血管を示したからであった。このことにより前者の群での血便の存在が確かに説明される。更に、腹膜中皮の観察は浮腫と重篤な炎症性脈管炎を示していた。このように、組織内に細菌が侵入してＳｈｉｇａ−毒素を放出すると、絨毛膜血流を破壊し、腹膜そして恐らく腸間膜の循環を変更させることによって局所的な虚血が生じ、そのために粘膜の病変の重症度が局所的に高まる。疾患のこの段階では腎臓の組織観察は毛細管の脈管炎の証拠を示していなかった（データは示していない）ため、この作用は局所的又は局部的であると思われる。このような血管の変性は、虚血性大腸炎の放射線学的側面について述べている（３４）大腸菌０１５７：Ｈ７（４０）による出血性大腸炎での観察と一致しうる。これらの菌株は内皮細胞の分化に対し直接的細胞病原性作用を有するＳＬＴ１（３１）を大量に産生する（１５）。
【００４１】
Ｔｏｘ＋及びＴｏｘ−の菌株で感染させた動物の間で観察されたもう１つの違いは粘膜の炎症とそれに続く膿瘍の重症度であった。Ｓ状結腸及び横行結腸の多くの部分では病変は同様の強度であったが、ＳＣ５００に感染した動物のみで粘膜組織が非常に膿状破壊されている部分があった。
【００４２】
化膿性滲出がより強度であることは、感染３日目での血液ＰＭＮのより劇的な低下とそれに続く骨髄増多に反映されていた。赤痢の間には、骨髄及び血管区分（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）の他に第三のＰＭＮ区分が結腸レベルで開いていると信じられている。滲出及び粘膜組織内へのＰＭＮの直接放出を増加させる血管の変化を通して、この新しい区分内にとらえられているＰＭＮの数をＳｈｉｇａ−毒素が増加させることが予期されている。このことが、野生型菌株に感染した動物で認められる急速で重篤な顆粒球減少、及び重篤な赤痢の間に時として観察される白血病様反応に相当しうるそれに引き続くより激しい骨髄増多を説明しよう。このようなモデルはＳｈｉｇａ−毒素の全身作用を仮定するものではない。
【００４３】
従って、上記の結果は、Ｓｈｉｇａ−毒素は上皮細胞及び食細胞内で細胞内に放出されたときには限定的な役割しか果していないことを示唆している。しかしながら、感染細胞内に放出されたＳｈｉｇａ−毒素は主として腸血管の損傷を介して作用すると思われる。
【００４４】
実施例４
実施例２の手順を使用して、ＳＣ５０１のエンテロケリンをコードするオペロンをｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させてＳＣ５０１を遺伝子操作する。使用する自殺プラスミドベクターｐＪＭ７０３．１は志賀赤痢菌１のエンテロケリンオペロンを含有しており、そのｅｎｔ Ｆ、ＦｅｐＥ、ＦｅｐＣ及びＦｅｐＤサブユニットの各々は除草剤Ｂｉｏｌａｆｏｓに対する耐性をコードするインターポゾンと除草剤耐性遺伝子の好適プロモータで突然変異させていた。得られたクローンＳＣ５０４ はＴｏｘ−及びエンテロケリン−（“Ｅｎｔ−”）である。
【００４５】
実施例５
実施例２の手順を使用して、ＳＣ５０４のｉｃｓＡ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させてＳＣ５０４を遺伝子操作する。使用した自殺プラスミドベクターｐＪＭ７０３．１はフレクスナー赤痢菌のｉｃｓＡ遺伝子を含有しており（６０，６１）、これはインターポゾンで突然変異させていた。得られたクローンＳＣ５０５はＴｏｘ−，Ｅｎｔ−及びｉｃｓＡ−であり、志賀赤痢菌１に対するワクチンの製造に使用できる。
【００４６】
実施例６
実施例２の手順を使用して、野生型のフレクスナー赤痢菌のエアロバクチンをコードする遺伝子及びｉｃｓＡ遺伝子を突然変異させてこの菌株を遺伝子操作する。使用した自殺プラスミドベクターは各々インターポゾンで突然変異させてあるフレクスナー赤痢菌のエアロバクチン及びｉｃｓＡ遺伝子を含有している。得られたクローンＳＣ５０６はエアロバクチン−及びｉｃｓＡ−でありフレクスナー赤痢菌に対するワクチンの製造に使用できる。
【００４７】
実施例７
実施例１，２及び４の手順を使用して、ＳＣ５００菌株の志賀赤痢菌由来のＤＮＡ断片中のＳｈｉｇａ−毒素オペロンのＡサブユニット遺伝子内で、唯一のＨｐａ１部位から出発し、４００塩基対Ｂａｌ３１を欠損させる。得られた断片をｐＢＲ３２２のＰ１プロモータを含有する２５７塩基対断片と再連結させてＢサブユニット蛋白質を高度に発現させる。突然変異させた毒素Ａ遺伝子を含有するこの断片を、大腸菌ｌａｃプロモータとカナマイシン耐性遺伝子の制御下で起源の複製を含有する条件自殺ベクターにクローニングする。志賀赤痢菌１中で、このベクターは培地内にＩＰＴＧが存在するときにのみ複製するであろう。突然変異させたＡサブユニット遺伝子から上流に水銀耐性カートリッジ（６５）を挿入する。得られたプラスミドを、ＩＰＴＧの存在下で、野生型志賀赤痢菌１株ＳＣ５００に形質転換する。得られた赤痢菌クローンのコロニーはＨｇ及びカナマイシン耐性である。この赤痢菌クローンをＩＰＴＧなしに数世代に亘り増殖させる。次に、培養物をＨｇ−耐性でカナマイシン−感受性のクローンの存在に関してスクリーニングする。３つのクローンを単離し、更に特徴化する。サザン法により、それらのクローンはもうＡサブユニット遺伝子の内部プローブとはハイブリッドを形成しないが、モノクローナル抗体による分析から明らかなようにＢサブユニット蛋白質はまだ生成し、もう細胞毒性ではないことが示される。
【００４８】
同じ手順を使用して、このＴｏｘＡ− クローンのエンテロケリンをコードするオペロンをｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させてこのクローンを遺伝子操作する。使用する自殺プラスミドベクターは大腸菌（６６）のエンテロケリンオペロンを含有しており、そのｅｎｔ Ｆ，ＦｅｐＥ，ＦｅｐＣ及びＦｅｐＤサブユニット遺伝子は制限部位に顕著な欠損を有し、そこには亜ヒ酸塩耐性をコードする断片（６２）と亜ヒ酸塩耐性遺伝子の好適プロモータが挿入されている。得られたクローンはＴｏｘＡ−及びＥｎｔ−である。
【００４９】
同じ手順を使用して、このＴｏｘＡ−及びＥｎｔ−のクローンのｉｃｓＡ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させて、このクローンを遺伝子操作する。使用した自殺プラスミドベクターはフレクスナー赤痢菌のｉｃｓＡ遺伝子（６０，６１）を含有しており、制限部位で顕著な欠損があり、カドミウム耐性をコードする断片（６３，６４）とカドミウム耐性遺伝子の好適なプロモータが挿入されている。得られたＴｏｘＡ−及びＥｎｔ−，ｉｃｓＡ−の志賀赤痢菌１クローンの特徴はその侵入性が著しく低下していることであり、そのために、志賀赤痢菌１に対するヒト用ワクチンの作成に好適なものとなる。
【００５０】
本発明及び本発明に付随する利点の多くは以上説明より明らかであり、本発明の精神又は範囲から離れることなく或いはその物質の利点の全てを犠牲にすることなく上記方法及びワクチンについて変更しうるものであり、上記の実施態様は単に好ましい実施態様であることは明らかであるものと信じている。
【００５１】
上記に引用した参考文献は次の通りである
【００５２】
【表１】
【００５３】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例２のＳｈｉｇａ−毒素オペロンのクローニングとＳｈｉｇａ−毒素Ａサブユニット遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの変異誘発を図式的に示している。図のプラスミドｐＨＳ７２０１、ｐＨＳ７２０２及びｐＨＳ７２０３中：黒の部分はＡサブユニット遺伝子からの配列を示し；点描部分はＢサブユニット遺伝子の配列を示し；斜線部分はΩ挿入要素からの配列を示している。
【背景技術】
【０００１】
本発明は、赤痢菌株が感染した宿主の細胞及び組織に実質的に侵入できず、宿主の感染細胞内及び感染細胞と非感染細胞との間に実質的に拡散できず、相当数の宿主細胞を殺滅させるであろう毒素を産生できなくなるように、赤痢菌の腸侵入性野生株のゲノムを改変する方法に係る。本発明は、特定的には、宿主を赤痢菌野生株に対して免疫感作するのに使用しうるこのような赤痢菌の改変株に関する。
【０００２】
シゲラ症（ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ）すなわち細菌性赤痢は世界中の風土病である疾患である。この疾患は、志賀赤痢菌Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１及びフレクスナー赤痢菌Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉが優位を占める熱帯地方や開発途上国では特に深刻な公衆衛生上の問題である。先進工業国では、シゲラ症の散在例がフレクスナー赤痢菌、ボイド赤痢菌Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ及びある種の腸侵入型大腸菌によることもあるが、主な病原菌はソンネ赤痢菌Ｓ．ｓｏｎｎｅｉである。
【０００３】
細菌性赤痢の疾病の成立ちの第一ステップは赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）がヒトの結腸粘膜に侵入することである（２３）。粘膜への侵入にはいくつかのステップがあり、細菌が上皮細胞へ入り込み、細胞内で増殖し、宿主細胞を殺滅し、最終的には隣接する細胞や結合組織へも拡散するというステップを含んでいる（９，４１，５５，５６）。通常は粘膜表面に限定される全体的な過程により強力な炎症反応が起り、これが腫瘍や潰瘍の原因となる（２３，４１，５５）。
【０００４】
赤痢がシゲラ症の特徴ではあるが、その前に水のような下痢をすることがある。下痢は結腸での再吸収の障害と空腸での分泌の増加の結果であるように思われるが、赤痢は純粋に結腸での過程によるものである（２０，４１）。シゲラ症、主として志賀赤痢菌１による例では、発症の途中で全身症状が認められることもある。これらの症状には中毒性の巨大結腸、白血病性反応そして溶血性−尿毒症症候群（“ＨＵＳ”）が含まれている。ＨＵＳは開発途上国でのシゲラ症による死亡の主因となっている（１１，２２，３８）。
【０００５】
志賀赤痢菌１が大量に産生するＳｈｉｇａ−毒素（６）及びフレクスナー赤痢菌及びソンネ赤痢菌が少量産生するＳｈｉｇａ様毒素（“ＳＬＴ”）（１９，３０）がシゲラ症の４つの段階（すなわち、個々の上皮細胞への侵入、組織への侵入、下痢そして全身症状）で果す役割はよく判ってはいない。概説に関してはＯ’Ｂｒｉｅｎ及びＨｏｌｍｅｓ（３２）を参照せよ。１８０〜２２０キロ塩基（ｋｂ）のプラスミドは全ての種の赤痢菌にとって個々の上皮細胞への侵入に不可欠である（４１，４２，４４）。これには侵入、細胞内での増殖及び宿主細胞を早期に殺滅することを含んでいる（４，５，４６）。この段階でのＳｈｉｇａ−毒素及びＳＬＴの役割は明らかではない。Ｓｈｉｇａ−毒素及びＳＬＴは細胞内増殖及び早期の殺滅に重要な役割を果しているようではない（４，１２，４６）。しかしながら、今までに行われてきた実験の中には適切な細胞アッセイ系で同一遺伝子の変異株を比較しているものはない。最近の知見はＳｈｉｇａ−毒素がヒト結腸細胞の一次培養に対し細胞毒性であることを示している（２７）。組織への侵入には他の染色体でコードされた生成物、すなわち滑面（ｓｍｏｏｔｈ）リポ多糖類（“ＬＰＳ”）（４４，５７）、遺伝子座Ｋｃｐの非特性化生成物（８，４４）及びエアロバクチン（ａｅｒｏｂａｃｔｉｎ）（２４，２８）を必要としている。ウサギの回腸係蹄での体液の産生に必要なフレクスナー赤痢菌染色体の部分はｒｈａ−ｍｔｌ領域とリジンデカルボキシラーゼ部位近くに局在している（４４）。しかし、体液貯留をもたらす能力がフレクスナー赤痢菌のＳＬＴによるものであることを示す証拠は提示されていない。従って、シゲラ症の全身性合併症の発症におけるＳｈｉｇａ−毒素の役割は未だ仮説的なものである。しかし、ＨＵＳで認められる毛細血管での病変はこの毒素を注射した動物の脳血管で認められるものと類似しているために、Ｓｈｉｇａ−毒素は血管の損傷を仲介することができる（１，２，２２）。
【０００６】
Ｓｈｉｇａ毒素又はＬＳＴを欠く変異株は疾病過程におけるこれら毒素の役割を示しうるであろう。Ｓｅｋｉｚａｋｉら（４８）がＨｅｌａ細胞アッセイ及びＳｅｒａｎｙテスト（４９）で野生株と同様の侵入性を示すこのような変異株を得てはいたが、この細胞毒素を最も大量に産生する志賀赤痢菌１はＳｈｉｇａ−毒素陰性変異株（Ｔｏｘ−）に形質転換することができ、毒素の役割を示すために最も役立てることができた。更に重要なことに、このようなＴｏｘ−変異株を使用し、侵入できず、そして宿主細胞内で実質的に増殖できず、又、宿主の感染細胞内でそしてこれら感染細胞から宿主の未感染細胞へ実質的に拡散することができず、又、相当数の感染及び非感染宿主細胞を殺滅する毒素を産生できない変異株を作ることができる。その結果、Ｔｏｘ−変異株を使用して赤痢菌野生株に対して宿主を免疫感作することができた。
【０００７】
発明の概要
ｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させたＳｈｉｇａ−毒素遺伝子で対立遺伝子を交換することにより、志賀赤痢菌１野生株のＴｏｘ−変異株を遺伝子操作する。細胞アッセイ系や動物でのこの突然変異の作用から、変異株を更に遺伝子操作して実質的に侵入できず、次いで宿主細胞内及び間で拡散できず、しかも宿主細胞内でＳｈｉｇａ−毒素を産生できない変異株を提供しうることが示されている。
【０００８】
又、本発明によると、志賀赤痢菌１野生株のＴｏｘ−変異株は次のものでの対立遺伝子交換により遺伝子操作する：
ａ）志賀赤痢菌１が宿主細胞及び組織に侵入するために必要な蛋白質をコ―トする志賀赤痢菌１の遺伝子、例えば、鉄のキレート化及び／又は志賀赤痢菌１への鉄の輸送に必要な蛋白質をコードする遺伝子（例えば、志賀赤痢菌１のエンテロバクチン（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ）又はエンテロケリン（ｅｎｔｅｒｏｃｈｅｌｉｎ）遺伝子）をｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させたもの；及び
ｂ）感染細胞内及び感染細胞と非感染細胞との間に志賀赤痢菌１が拡散するために必要な蛋白質をコードする志賀赤痢菌１ の遺伝子、例えば、細胞内−細胞間拡散遺伝子（例えば、ｉｃｓＡ又はｖｉｒＧ遺伝子）をｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させたもの。
【０００９】
本発明によると、更に、（ａ）宿主細胞及び組織にフレクスナー赤痢菌が侵入するために必要な蛋白質をコードするフレクスナー赤痢菌の遺伝子、例えば鉄のキレート化及び／又はフレクスナー赤痢菌への鉄の輸送に必要な蛋白質をコードする遺伝子（例えば、フレクスナー赤痢菌のエアロバクチン遺伝子）をｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させたもの、及び（ｂ）宿主細胞内及び間にフレクスナー赤痢菌が拡散するために必要な蛋白質をコードする遺伝子、例えばｉｃｓ Ａ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させたもので対立遺伝子交換してフレクスナー赤痢菌野生株の変異株を遺伝子操作する。
【００１０】
本発明により、更に、本発明の赤痢菌変異株を使用して赤痢菌野生株に対するワクチンを作成する。
【発明の開示】
【００１１】
改変株を赤痢菌野生株に対するワクチンの製造に使用しうるように腸侵入性赤痢菌を改変する方法が提供される。宿主特にヒトの感染細胞内に侵入及び次にそこで増殖することができず、そして宿主の感染細胞内及び感染細胞と非感染細胞との間に実質的に拡散できず、又、相当数の宿主の感染及び非感染細胞を殺滅する毒素を産生できなくなるように赤痢菌野生株を改変する。この方法には、感染した宿主細胞及び組織に菌株が侵入するために必要な１つ以上の蛋白質をコードする野生株の遺伝子（例えば、アエロバクチン（ａｅｒｏｂａｃｔｉｎ）遺伝子）及び感染した宿主細胞内及び間に菌株が拡散するために必要な１つ以上の蛋白質をコードする野生株の遺伝子（例えばｉｃｓＡ遺伝子［６０，６１］）が全部又は部分的に除去、又は永久的に不活性化され、好ましくは少なくとも部分的に除去されるように、赤痢菌の野生株（例えばフレクスナー赤痢菌）のゲノム（例えば、大きな発病性プラスミドｐＨＳ７２００）を変換することを含んでいる。志賀赤痢菌１のような野生株のゲノムを変換するためには、Ｓｈｉｇａ−毒素をコードする遺伝子、好ましくは正にＡサブユニット遺伝子を全部もしくは部分的に除去し、又は永久的に不活性化し、好ましくは、少なくとも部分的に除去することもその方法に含んでいるのが好ましい。
【００１２】
本発明方法では、赤痢菌野生株の遺伝子が慣用法例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで変異誘発させた遺伝子による対立遺伝子交換で完全に又は部分的に除去或いは永久的に不活化でき、少なくともその大部分は除去されているのが好ましい。この点に関して本発明ワクチンを製造するときに使用する突然変異させた遺伝子は、遺伝子に挿入され、そして次世代の赤痢菌においてｉｎ ｖｉｔｒｏで再生されるときに遺伝子から消失しうるトランスポゾンによって不活化させただけのものではないことが好ましい。むしろ、変異誘発させた遺伝子の大部分が欠損しており、好適なワクチンに適合性のマーカー遺伝子をこのような欠損部分に挿入するのが好ましい。このようなマーカー遺伝子により、そうして形質転換した赤痢菌が容易に同定される。好ましいマーカー遺伝子は水銀、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、アンチモン、カドミウム、亜鉛及び／又はコバルトに耐性の遺伝子のような重金属耐性遺伝子である（６２，６３，６４，６５）。
【００１３】
改変した菌株の細胞は慣用法で培養し、次いで減弱させることができる。次に、細胞を慣用の薬剤として許容されるベヒクル（例えば、食塩水溶液）及び適宜、慣用の賦形剤（例えば、薬剤として許容される洗剤）と混合して野生株に対するワクチンを形成することができる。ワクチンは、細胞物質を最終濃度０．２〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２ｍｇ／ｍｌ含有するように処方しうる。処方後、ワクチンは滅菌容器に入れることができ、次いで、これを密封し、低温（例えば４℃）で保存するか、或いは凍結乾燥させることもできる。
【００１４】
ヒト宿主で赤痢菌野生株に対する免疫性を誘導するためには、約１０９〜１０１１の凍結乾燥した赤痢菌細胞を含有するような用量で、好適に処方したワクチンを１回以上投与することができる。ワクチンは慣用法で経口投与することができる。治療は、ワクチンの１回投与又は長期に亘る複数回の投与からなりうる。
【００１５】
次の実施例で本発明を説明する。
【実施例】
【００１６】
特記しないかぎり、本実施例で使用するクローニング及び形質転換の手順及び手法はＭａｎｉａｔｉｓらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に一般的に記載されているものと同じである。
【００１７】
実施例１〜６で使用する菌株及びそのファージ又はプラスミドの内容は第１表に示す。
【００１８】
実施例では２つの培地を使用した：Ｍ９最少培地（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ：１５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４：３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ：０．５ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌ：１ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５ｇ／ｌ）及びトリプトカゼインソヤブロス（Ｔｒｙｐｔｏ Ｃａｓｅｉｎ Ｓｏｙａ Ｂｒｏｔｈ）（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｍａｒｎｅｓ ｌａ Ｃｏｑｕｅｔｌｅ，フランス）。
【００１９】
実施例１…Ｓｈｉｇａ−毒素オペロンのクローニング
Ｃｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｅ ｄｅｓ Ｓｈｉｇｅｌｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ （パリ、フランス）から入手した野生型の抗生物質感受性の志賀赤痢菌１ 菌株ＳＣ５００ から全ＤＮＡを調製した（５０）。ＤＮＡ１０μｇ をＥｃｏＲＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）で消化し、０．７％のアガロースゲル上に載置した。３．５〜４．５ｋｂの断片を電気溶離した。精製した断片０．１μｇを、１μｇのｃｏｓ−連結し、ＥｃｏＲＩで切断し、脱リン酸したλＧＴ１１アーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，サンディエゴ，米国）に連結し、販売元の指示に従ってＰａｋａｇｅｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｇｅｍａ Ｂｉｏｔｅｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，米国）を使用してパッケージングした。次いで、パッケージングしたＤＮＡを大腸菌Ｙ１０９０（５９）にトランスフェクトした。次に、λＧＴ１１バンクを、Ａ．Ｄ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｕ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ｈ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，米国から入手したＳＬＴ１のＢサブユニットに特異的なモノクローナル抗体である１３Ｃ４（５４）でスクリーニングした。１０３個の組換えファージをＬＢソフトアガー中のＹ１０９０上にまいた。プレートを３７℃で１２時間インキュベートした。予め１０ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（“ＩＰＴＧ”）溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）に漬けたニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，西独）をプレートに適用し、次いで、４２℃で２．５時間インキュベートした。フィルターをプレートから取り出し、ＰＢＳ−ミルク（１×ＰＢＳ中脱水低脂肪ミルク５０ｇ／ｌ）中、３７℃で１時間インキュベートし、１×ＰＢＳで５回洗い、希釈していないハイブリドーマ細胞上清中の１３Ｃ４モノクローナル抗体と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ミルクで５回洗った後、アルカリ性ホスファターゼと抱合した羊抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｓｙｓ，Ｃｏｍｐｉｅｇｎｅ，フランス）の１／２００希釈液を含有するＰＢＳ−ミルク中、３７℃で、１時間、フィルターをインキュベートした。フィルターを再度１×ＰＢＳで洗い、染色溶液（ニトロ−ブルーテトラゾリウム０．３３ｍｇ／ｌ、リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル０．１６ｍｇ／ｌ（両化合物共Ｓｉｇｍａ製）、１００ｍＭトリスＨＣｌｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中に置いた。陽性のクローンをプラーク精製し、Ｙ１０８９にトランスフェクトした（５９）。次に、ＤＮＡを溶原菌から調製した（１３）。大腸菌ＪＭ８３のプラスミドベクターｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ部位でサブクローニングした（５８）。上記のように、但し、次のような変更を行って、モノクローナル抗体１３Ｃ４で大腸菌ＪＭ８３のサブクローンをテストした：乾燥したニトロセルロースフィルターをプレート上に置き、ＰＢＳ中２ｍｇ／ｌのポリミキシンＢ溶液２ｍｌをフィルター上に加えた。次に、ＰＢＳ−ミルクインキュベーションを始める前に、プレートを３７℃で４５分間インキュベートした。ＳＬＴ１のＢサブユニットを含む大腸菌ＪＭ８３中のサブクローン ｐＨＳ７２０１が同定された。
【００２０】
遺伝子量効果によって、大腸菌ＪＭ８３のサブクローンｐＨＳ７２０１は、１３Ｃ４モノクローナル抗体の存在下でのコロニー免疫ブロットアッセイで親株ＳＣ ５００より強いシグナルを有することが判った。ｐＨＳ７２０１のＳｈｉｇａ−毒素コード領域の制限地図はＳＬＴ１のものと同じであった（１４）。Ａサブユニット遺伝子は、実施例２に記載したようにカセットを挿入しうるＡＴＧ出発コドンから３１０ｂｐ下流にある独特なＨｐａ１部位を有することが判った。
【００２１】
実施例２…Ｓｈｉｇａ−毒素Ａサブユニット遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの変異誘発
サブクローンｐＨＳ７２０１では、４．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片内に全Ｓｈｉｇａ−毒素オペロンが含まれている。スペクチノマイシン耐性をコードし、Ｔ４翻訳転写停止信号が各側にあるインターポゾンΩ（３７）を挿入することによってＡサブユニット遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの変異誘発を実施した。ΩはＨｉｎｄIII２ｋｂ断片として精製され、その末端にはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片が充填されていた。次に、ΩをＨｐａＩ線状化ｐＨＳ７２０１に連結させて、図に示すような組換えプラスミドｐＨＳ７２０２を生成した。次に、変異誘発した配列を含有する６．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を精製し、自殺プラスミドベクターｐＪＭ７０３．１（５１）のＥｃｏＲＩ部分に連結させて図に示すような組換えプラスミドｐＨＳ７２０３を生成した。大腸菌ＳＭ１０のゲノムに組み込まれているラムダファージに含まれるｐｉｒ機能をイントランス（ｉｎ−ｔｒａｎｓ）でその欠損Ｒ６Ｋ源に補足したときのみにｐＪＭ７０３．１は複製する（２１）。大腸菌ＳＭ１０はその染色体に統合されている広範な宿主域のＩｎｃＰ−型プラスミドＲＰ４の転移遺伝子も含有している。従って、ｐＪＭ７０３．１は、ＲＰ４からのＭｏｂ部位を含有している（５１）ために、ＳＭ１０λｐｉｒ（２１）で可動化されうる。このようにして、ｐＨＳ７２０３は菌株ＳＭ１０λｐｉｒ中で安定して保持されており、次に、野生型志賀赤痢菌１株ＳＣ５００に抱合的に移行させた。セロファン膜上で交配を行い、チアミン、メチオニン、トリプトファン及びニコチン酸を各々１０μｇ／ｍｌの濃度、グルコース０．２％及びスペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを補ったＭ９最少培地でプレーティングすることにより選択した。選択培地上で増殖しているコロニーを精製し、特異的なウサギの抗血清（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐａｔｅｕｒ）で凝集させることにより志賀赤痢菌１と同定した。
【００２２】
野生型染色体のＳｈｉｇａ−毒素遺伝子とＳｈｉｇａ−毒素遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させたものとの間の対立遺伝子交換は、Ｔｏｘ−表現型を発現する志賀赤痢菌１を検出するモノクローナル抗体１３Ｃ４を使用したコロニーブロットイムノアッセイにより示された。
【００２３】
志賀赤痢菌１細胞のゲノムでのＴｏｘ−改変の存在は、上記の完全なＳｈｉｇａ−毒素オペロンを含有する４．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片からのＡサブユニット遺伝子の一部とＢサブユニット遺伝子全体を含む６５５ｂｐのＨｉｎｄ III−Ｈｉｎｃ II断片から作成したプローブで立証された。Ωインターポゾンを含有する上記の２ｋｂ Ｈｉｎｄ III断片もプローブとして使用した（３７）。プローブとして使用したＤＮＡは３２Ｐ−標識５′−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるニック翻訳（３９）で標識した。全ＤＮＡは２つのＴｏｘ−クローンから調製し、Ｓｈｉｇａ−毒素プローブ及びΩプローブとのハイブリッド形成により分析した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎの方法（５３）により、ＤＮＡ断片をアガロースゲルからニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｌｌ）へ移した。６５℃、一晩でハイブリッド形成し、６×ＳＳＣ中、６５℃で洗浄した。プローブは、両方のプローブとハイブリッド形成するＴｏｘ−変異株では、毒素遺伝子を含有する志賀赤痢菌１からの４．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片が６．２ｋｂ断片で置換されていることを示していた。この結果から、ｐＨＳ７２０３の突然変異した毒素遺伝子の各側に側面を接した領域はＳＣ５００ゲノム中のその相手と組換わっており、野生型Ａサブユニット遺伝子を変異した遺伝子で置き換えたことを示していた。
【００２４】
これらＴｏｘ−クローンの１つであるＳＣ５０１を更に研究するために選択した。クローンＳＣ５０１は１９８８年６月３０日に受託番号Ｉ−７７４としてＣｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（パリ、フランス）に寄託した。
【００２５】
実施例３…細胞毒性、ＨｅＬａ細胞内での増殖、マクロファージの剥離並びにウサギ結腸係蹄及びサルでの細胞毒性のアッセイ
ＳＣ５００及びＳＣ５０１並びに各々その非侵入性誘導体であるＳＣ５０２及びＳＣ５０３（これらは、細胞の侵入に必要な大きな発病性プラスミドｐＨＳ７２００の自発的治癒（すなわち消失）により得た）を鉄欠乏培地２００ｍｌ中で４８時間増殖させた。ガラス器具は６Ｎ ＨＣｌで予備処理し、鉄を含まない水でよくすすいだ。培地はＣａＣｌ２１５μｇ／ｍｌ、カザミノ酸５ｍｇ／ｍｌ、グルコース２ｍｇ／ｍｌ、チアミン５０μｇ／ｍｌ、Ｌ−トリプトファン２０μｇ／ｍｌ、ニコチン酸１０μｇ／ｍｌ及びヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）１５０μｇ／ｍｌを補ったＭ９塩を含有していた。細菌は食塩水で２回洗い、３ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌでリゾチームを加えた。室温（２５℃）で３０分間インキュベートした後、ＥＤＴＡ ０．５Ｍ（ｐＨ８）３０μｌを加え、細胞を氷浴に移し、超音波処理した。超音波処理抽出物をフィルター滅菌し、−２０℃で凍結保存した。フィルター滅菌した培養上清及び細菌抽出物を、１０％の牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＮ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，スコットランド，英国）及びＥａｒｌｅ塩を有する最少必須培地で増殖させたＨｅＬａ細胞への細胞毒性についてアッセイした。マイクロタイタープレート内で細胞培養培地（１００μｌ）を順次希釈した。各ウェルには１００μｌ中に２×１０４個の細胞を接種した。次に、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で２４時間インキュベートした。ウサギポリクローナル血清及び１３Ｃ４モノクローナル抗体の両者で中和アッセイを実施した。プレートを光学顕微鏡で調べてからＧｉｅｍｓａ染色した。抽出物蛋白質１ｍｇ当りの５０％細胞毒性用量（ＣＤ５０）として細胞毒性を計算した。
【００２６】
ＨｅＬａ細胞内での細菌の増殖をアッセイした（４６）。３５ｍｍのプラスチック製組織培養皿（Ｂｅｅｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ，米国）中のＨｅＬａ細胞の非融合単一層に、最少必須培地（“ＭＥＭ”，Ｇｉｂｃｏ）２ｍｌに１００の感染倍数（“ＭＤＩ”）で再懸濁させた細菌を接種し、２，２００×ｇで１０分間遠心分離し、３７℃で３０分間インキュベートして侵入させた。次に、プレートを、Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｂｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（“ＥＢＳＳ”，Ｇｉｂｃｏ）で３回洗い、ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＭＥＭ２ｍｌで覆った。これを時間０（Ｔ０）とした。３７℃で１時間インキュベートした後、調製物を再度ＥＢＳＳで洗い、抗生物質を含まないＭＥＭ２ｍｌで覆った（Ｔ１）。更に３時間インキュベーションを続けた（Ｔ１〜Ｔ４）。毎時間、２枚のプレートを取り出した。１枚のプレートはＥＢＳＳで３回洗い、Ｇｉｅｍｓａ染色し、感染したＨｅＬａ細胞を計算した。もう一方はＥＢＳＳで５回洗い、成育しうる細胞外細菌を除去した。細胞をトリプシン処理し、計測し、蒸留水中０．５％のデオキシコール酸ナトリウムで溶解させた。希釈物をＴｒｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ａｇａｒに載置した。感染ＨｅＬａ細胞当りの細菌の平均数を計算した。実験は４回繰り返した。細胞内での増殖曲線を書き、指数関数相の傾斜を計算した。
【００２７】
マクロファージの剥離及び殺滅についてのアッセイは、補体不活性化牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＲＰＭＩ１６４０（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｍｃｌｅａｕ ＵＡ，米国）内に保持したＪ７７４マクロファージ（５２）を使用して実施した（４）。感染の１８時間前に、１ｍｌ当り０．５μＣｉの［３Ｈ］ウリジンを含有する培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で、３５ｍｍのプラスチック製組織培養皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）内の７×１０５個のマクロファージを標識した。ＭＯＩが１００でのＲＰＭＩ１６４０中細菌懸濁液１ｍｌを添加する前に、細胞をＥＢＳＳで３回洗った。５％ＣＯ２中、３７℃で１時間感染させた。次に、単一層をＥＢＳＳで３回洗い（Ｔ０）、５％ＣＯ２下、３７℃で、２ｍＭグルタミンとゲンタマイシン２５μｇ／ｍｌを補ったＲＰＭＩ２ｍｌで１時間覆った（Ｔ１）。次に、プレートをＥＢＳＳで３回洗い、５％ＣＯ２下、３７℃で、ゲンタマイシンを含有しないＲＰＭＩグルコース内で更に３時間インキュベートした（Ｔ１〜Ｔ４）。毎時間、２枚のプレートを取り出し、培養物をＥＢＳＳで３回洗い、プラスチック表面にまだ接着している細胞中の成育しえないマクロファージの割合をＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色により測定した。次に、皿の中に残留している放射活性量を測定することにより残留しているマクロファージの割合を測定した。蒸留水中０．５％のデオキシコール酸ナトリウム１ｍｌで粘着細胞を溶解し、この溶解物１００μｌを沈殿させて計量した（４）。
【００２８】
６％のペンタバルビタールナトリウム０．５ｍｌ／ｋｇで麻酔した約２ｋｇのウサギで、１０ｃｍのウサギ連結結腸係蹄を調製した。
【００２９】
Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ １ｍｌ中１０７及び１０９個のＣＦＵの接種物をテストした。１８時間後にウサギを殺した。係蹄内の液体貯留を記録し、容量と長さとの比（“Ｖ／Ｌ”）を計算した。感染した係蹄の部位を１０％緩衝ホルマリン中に固定した。検体を標準法で処理し、ヘマトキシリネオシン−サフラニンで染色した。
【００３０】
体重３．５〜４．５の８匹の赤毛猿に塩酸ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ ５００，Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｗｘ，リヨン，フランス）５０ｍｇを筋注した。Ｔｒｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ 及び１４ｇ／ｌの重炭酸ナトリウム（５０／５０）２０ｍｌに再懸濁させたＳＣ５００及びＳＣ５０１微生物１．５×１０１１個を各動物の胃の内に接種した。接種物をＣｏｎｇｏ−ｒｅｄ寒天にプレーティングすると、接種物中の細菌の１％以上が侵入特性を失ったことが示された（２６）。下痢、膿、粘液及び血液の存在について便を毎日調べた。これらの症状の各々の強度は、毎日、０〜３＋で評価した。各動物については、所与の症状の重篤度を、各症状の「＋」の合計を表わす指数で表現した。電撃性赤痢で死亡したサルは直ちに培検した。ウサギの組織について上記したと同様に検体を処理した。
【００３１】
結果
細胞毒性アッセイではＳＭ１０λｐｉｒ（ｐＨＳ７２０３）は非細胞毒性であった。志賀赤痢菌にｐＨＳ７２０３を抱合的に移した後、ＡｍｐＳＳｐｃＲ表現型を示すクローンをコロニーイムノブロットアッセイでテストした。５％がＴｏｘ−の表現型を示した。ＳＣ５０１は３４７ ＣＤ５０／蛋白質ｍｇの細胞毒性を示し、この値は良く知られている大腸菌Ｋ１２の値（４１２ ＣＤ５０／ｍｇ）と同程度であった。ＳＣ５０１由来の残りの細胞毒性は抗Ｓｈｉｇａ 毒素ポリクローナル抗体で中和できなかった。
【００３２】
野生型菌株ＳＣ５００の指数増殖率（世代／時間）は２．５±０．６であるのに対し、菌株ＳＣ５０１中のＴｏｘ−変異株の指数増殖率は２．６±０．７であることから、菌株ＳＣ５０１中のＴｏｘ−変異株の存在によりＨｅＬａ細胞内でのその増殖能が顕著に変化することはなかった。更に、ＳＣ５００及びＳＣ５０１によるＪ７７４マクロファージの急速な殺滅の有効性でも顕著な差は認められなかった。細胞の剥離及びＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ陽性細胞の出現の両者が４時間に亘り同様な速度で進み、従って、感染細胞内に放出されたＳｈｉｇａ−毒素は細胞内増殖速度に顕著に影響することも、宿主細胞の迅速な殺滅を増加させることもないことが示された。
【００３３】
ウサギの連結係蹄モデルでの志賀赤痢菌の病因性に対するＩｎｖ−及びＴｏｘ−変異の作用を係蹄内での液体産生に対する作用によって測定した。各菌株についての６つの係蹄に２種の接種物（すなわち１０９及び１０７ＣＦＵ）のいずれかで得た結果から算出をして平均及び標準偏差を得た。侵入性菌株（すなわち、ＳＣ５００、Ｉｎｖ＋、Ｔｏｘ＋及びＳＣ５０１、Ｉｎｖ−、Ｔｏｘ−）の両方の接種物では、Ｓｈｉｇａ毒素の産生がなくなると液体の貯留は減少したが、差異は統計的に有意ではなく、侵入とそれに続く炎症が液体貯留の第一の原因であることを示している。非侵入性菌株（すなわち、ＳＣ５０３、Ｔｏｘ＋及びＳＣ５０２、Ｔｏｘ−）については、Ｓｈｉｇａ−毒素を産生する菌株のみが液体貯留を誘発したことから大きな差異が認められた。このことは、疾患の間でこのエンテロトキシンがどのような役割を果すにしても、ウサギのモデルではＳｈｉｇａ−毒素が志賀赤痢菌１の唯一のエンテロトキシンであることを示していた。組織病理学的研究により、ＳＣ５００又はＳＣ５０１による接種物のいずれでも多くの絨毛を破壊している腫瘍及び潰瘍を含む重篤な病巣が示された。一般に、野生型菌株に感染した係蹄での病変がより重篤であったが、差が小さかったとの観察は侵入が病原性の主要因子であることを示した。
【００３４】
非侵入性Ｔｏｘ＋株であるＳＣ５０２に感染した係蹄は、絨毛の膨潤及び短縮、固有層の浮腫及び炎症、杯細胞から分泌される大量の粘液による上皮細胞の変化並びに核濃縮した核による殺滅腸細胞部分を伴い重篤に変化した。しかしながら、最も大きな特徴は上皮層全体に亘る出血であった。
【００３５】
志賀赤痢菌１の病原性についてのＴｏｘ−変異の影響をサルで示した。ＳＣ５００注射群及びＳＣ５０１の注射群の両群で４日目に電撃性赤痢により２匹のサルが死亡し、各群は、Ｓｈｉｇａ−毒素は致死的な赤痢に必要ではないことを示していた。膿及び粘液の量を正確に定量することは困難であるが、下痢便の容量並びに膿及び粘液の量に顕著な差は認められなかった。一方、ＳＣ５００に感染した動物での異常便では血液の存在は不変の特徴であったが、ＳＣ５０１に感染した動物では一匹のみで微量の血液が一時的に見られただけであった。動物の死亡直後に実施した剖検は結腸腹膜中皮で明白な違いを示した。結腸腹膜中皮は、ＳＣ５００に感染した動物の場合のみでパッチ状の出血部分が観察されうるＳ状表面で特に明らかであった。平均すると、腫瘍の数や重症度は同様であったが、リーベルキューン腺での破壊を伴う粘膜の化膿性壊死はＳＣ５００に感染した動物でのみ部分的に認められた。絨毛膜、粘膜下組織及び腹膜の炎症性浸潤もこれらの動物でより重篤であった。更に、ＳＣ５０１ に比しＳＣ５００ に感染した動物に特徴的である腹膜中皮の炎症性浸潤は主として血管周囲のものであり、従って、重篤な腹膜脈管炎の存在を示唆する肉眼的検査を確認した。しかしながら、顆粒細胞内絨毛膜内の毛細管循環のレベルで最も大きな差が観察された。ＳＣ５００で感染したサルでは粘膜の上部構造を破壊する出血が認められた。上皮内膜を局所的に損傷している微細な膿瘍を介して赤血球が小腸管腔内に拡散しているのが観察できた。これらの出血は明らかに毛細管係蹄の破壊によるものである。一方、ＳＣ５０１に感染したサルは毛細管係蹄の拡張は示すが、破壊は示さなかった。感染前及び感染後３日目に実施した白血球数の計測は以下のように示した：０日目には、多形核白血球（“ＰＭＮ”）数には有意差はなく、骨髄増加はなかった；３日目には、血液ＰＭＮの低下及び骨髄増加の程度の各々はＳＣ５００に感染したサルでより明らかであった。
【００３６】
結論
ヒトにおける状況証拠はＳｈｉｇａ−毒素が真の病原性要素であるという仮説を支持している。志賀赤痢菌１の侵入性で毒素産生が低い、塩素酸塩耐性変異株の菌株７２５を摂取した志願者は、野生株Ｍ１３１を摂取した者より重症度の低い症状を示した（２５）。自然に感染した患者では、志賀赤痢菌１に感染したときには他の血清型の赤痢菌に感染したときより、ＨＵＳを含めより重篤な症状となるのが普通である（７）。これらは毒素中和抗体を速やかに発達させる（１８）。
【００３７】
志賀赤痢菌１のＴｏｘ−変異株であるＳＣ５０１は大腸菌Ｋ１２と同様の残留量の細胞毒素を産生することが示されている。この変異株は志賀赤痢菌１の病原性におけるこのＳｈｉｇａ−毒素の役割を調べるための研究に使用されてきている。細胞アッセイ及びより確実な動物モデルが使用されている。
【００３８】
ＨｅＬａ細胞や単一層内のＪ７７４マクロファージを使用するアッセイは、以前の研究（４６）がフレクスナー赤痢菌でのＳＬＴについて示唆しているように、Ｓｈｉｇａ−毒素の分泌は感染細胞内での指数増殖速度には影響しないことで示した。これらの結果は、ＳＣ５０１に変異株及び２つの他の毒素産生の低い変異株（２５，４８）が、上皮内での細菌の増殖能に相関することが知られている角結膜炎に影響を与えない（４９）という観察と一致している。又、以前に示唆されているように（４，１２）、Ｓｈｉｇａ−毒素の産生と宿主細胞の早期殺滅との間には相関関係が観察されなかった。このようなデータは実際の感染により類似しているアッセイで確認することが必要であるが、Ｓｈｉｇａ−毒素が感染の細胞内段階では主要な役割を果していないことを明示している。侵入が、Ｓｈｉｇａ−毒素のゆっくりと作用する過程（１２）よりもより速く宿主細胞の殺滅を仲介する早期の代謝の引き金になるように思われる。
【００３９】
ウサギの連結した小腸係蹄の感染では、ＳＣ５００及びＳＣ５０１接種物の両者で、１８時間後の粘膜病変の重症度がわずかしか違わないことを示していた。しかしながら、露出の時間や係蹄の閉塞が細胞毒素産生の作用を隠し、侵入を第一のものとしているのかもしれない。腸毒性に関する結果は侵入性細菌の場合に分析がより困難であった。それは、産生された液体の量が、Ｔｏｘ−変異株の両方の接種物でより少かったが、野生菌株により分泌されたものと有意には異ってはいなかったからである。このことは、上皮の再吸収機能を阻止するには組織への侵入で十分であることを示していた。一方、非侵入性のＴｏｘ＋及びＴｏｘ−変異株の間で観察された大きな違いは、ウサギモデルの感受性の限度内ではＳｈｉｇａ−毒素が志賀赤痢菌１の唯一のエンテロトキシンであることを示している。このことは以前の研究（１６，１７，３３）とも一致する。しかし、Ｉｎｖ＋及びＩｎｖ−の変異株での液体貯留を観察すると、産生された液体の性質は感染している菌株によって異なっている。侵入性菌株は、産生されたＳｈｉｇａ−毒素の量とは無関係に、管腔内で潰瘍化した膿瘍の程度を反映しているであろう粘性で粘膜病原性で、時には血液を含む液体の産生を誘発するが、非侵入性のＴｏｘ＋菌株は腸毒性や細胞毒性をより反映している水様で時には血液を含む液体を産生する。Ｉｎｖ−，Ｔｏｘ＋変異株であるＳＣ５０２に感染した係蹄からの組織サンプルを組織病理学的に研究すると、固有層の重大な炎症性浸潤及び主として短かくなった絨毛の先端での重大な変化を示していた。このことによりｉｎ ｖｉｖｏでの腸細胞に対するＳｈｉｇａ−毒素の細胞毒性が確認される（２７）。しかし、最も大きな特徴は、大量の粘液と共に管腔内に流れ出てくる赤血球による上皮内膜の浸潤であった。大きな血管変化が固有層内で起っていることを示すこの観察は次にサルのモデルでも確認された。
【００４０】
赤毛猿の胃内にＳＣ５００及びＳＣ５０１を接種すると、Ｓｈｉｇａ−毒素産生とは無関係に致死的な電撃性赤痢が発生しうることを示した。下痢及び便内の膿や粘液の量には顕著の差は認められなかった。水様の下痢が存在しなかったこと及び便の量が等しかったことは、Ｓｈｉｇａ−毒素による空腸分泌増加を示唆する以前の研究（４１）とは一致しなかった。唯一の大きな違いは、野生型菌株に感染した動物の赤痢の便には血液が存在していたことであった。最近の論文は、赤痢患者の中で、より細胞毒性の高い菌株を排出する患者の便に血液が存在する傾向が強いことを報告していた（３６）。組織病理学的観察により、Ｓ状結腸で特に特徴的に現れる血管損傷が存在することが確認された。これは、野生型菌株に感染したサルでは絨毛膜内の毛細管係蹄の全面的破壊が見られたのに対し、Ｔｏｘ−変異株に感染した動物の血管系では膨満しているがほとんど無傷の血管を示したからであった。このことにより前者の群での血便の存在が確かに説明される。更に、腹膜中皮の観察は浮腫と重篤な炎症性脈管炎を示していた。このように、組織内に細菌が侵入してＳｈｉｇａ−毒素を放出すると、絨毛膜血流を破壊し、腹膜そして恐らく腸間膜の循環を変更させることによって局所的な虚血が生じ、そのために粘膜の病変の重症度が局所的に高まる。疾患のこの段階では腎臓の組織観察は毛細管の脈管炎の証拠を示していなかった（データは示していない）ため、この作用は局所的又は局部的であると思われる。このような血管の変性は、虚血性大腸炎の放射線学的側面について述べている（３４）大腸菌０１５７：Ｈ７（４０）による出血性大腸炎での観察と一致しうる。これらの菌株は内皮細胞の分化に対し直接的細胞病原性作用を有するＳＬＴ１（３１）を大量に産生する（１５）。
【００４１】
Ｔｏｘ＋及びＴｏｘ−の菌株で感染させた動物の間で観察されたもう１つの違いは粘膜の炎症とそれに続く膿瘍の重症度であった。Ｓ状結腸及び横行結腸の多くの部分では病変は同様の強度であったが、ＳＣ５００に感染した動物のみで粘膜組織が非常に膿状破壊されている部分があった。
【００４２】
化膿性滲出がより強度であることは、感染３日目での血液ＰＭＮのより劇的な低下とそれに続く骨髄増多に反映されていた。赤痢の間には、骨髄及び血管区分（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）の他に第三のＰＭＮ区分が結腸レベルで開いていると信じられている。滲出及び粘膜組織内へのＰＭＮの直接放出を増加させる血管の変化を通して、この新しい区分内にとらえられているＰＭＮの数をＳｈｉｇａ−毒素が増加させることが予期されている。このことが、野生型菌株に感染した動物で認められる急速で重篤な顆粒球減少、及び重篤な赤痢の間に時として観察される白血病様反応に相当しうるそれに引き続くより激しい骨髄増多を説明しよう。このようなモデルはＳｈｉｇａ−毒素の全身作用を仮定するものではない。
【００４３】
従って、上記の結果は、Ｓｈｉｇａ−毒素は上皮細胞及び食細胞内で細胞内に放出されたときには限定的な役割しか果していないことを示唆している。しかしながら、感染細胞内に放出されたＳｈｉｇａ−毒素は主として腸血管の損傷を介して作用すると思われる。
【００４４】
実施例４
実施例２の手順を使用して、ＳＣ５０１のエンテロケリンをコードするオペロンをｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させてＳＣ５０１を遺伝子操作する。使用する自殺プラスミドベクターｐＪＭ７０３．１は志賀赤痢菌１のエンテロケリンオペロンを含有しており、そのｅｎｔ Ｆ、ＦｅｐＥ、ＦｅｐＣ及びＦｅｐＤサブユニットの各々は除草剤Ｂｉｏｌａｆｏｓに対する耐性をコードするインターポゾンと除草剤耐性遺伝子の好適プロモータで突然変異させていた。得られたクローンＳＣ５０４ はＴｏｘ−及びエンテロケリン−（“Ｅｎｔ−”）である。
【００４５】
実施例５
実施例２の手順を使用して、ＳＣ５０４のｉｃｓＡ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させてＳＣ５０４を遺伝子操作する。使用した自殺プラスミドベクターｐＪＭ７０３．１はフレクスナー赤痢菌のｉｃｓＡ遺伝子を含有しており（６０，６１）、これはインターポゾンで突然変異させていた。得られたクローンＳＣ５０５はＴｏｘ−，Ｅｎｔ−及びｉｃｓＡ−であり、志賀赤痢菌１に対するワクチンの製造に使用できる。
【００４６】
実施例６
実施例２の手順を使用して、野生型のフレクスナー赤痢菌のエアロバクチンをコードする遺伝子及びｉｃｓＡ遺伝子を突然変異させてこの菌株を遺伝子操作する。使用した自殺プラスミドベクターは各々インターポゾンで突然変異させてあるフレクスナー赤痢菌のエアロバクチン及びｉｃｓＡ遺伝子を含有している。得られたクローンＳＣ５０６はエアロバクチン−及びｉｃｓＡ−でありフレクスナー赤痢菌に対するワクチンの製造に使用できる。
【００４７】
実施例７
実施例１，２及び４の手順を使用して、ＳＣ５００菌株の志賀赤痢菌由来のＤＮＡ断片中のＳｈｉｇａ−毒素オペロンのＡサブユニット遺伝子内で、唯一のＨｐａ１部位から出発し、４００塩基対Ｂａｌ３１を欠損させる。得られた断片をｐＢＲ３２２のＰ１プロモータを含有する２５７塩基対断片と再連結させてＢサブユニット蛋白質を高度に発現させる。突然変異させた毒素Ａ遺伝子を含有するこの断片を、大腸菌ｌａｃプロモータとカナマイシン耐性遺伝子の制御下で起源の複製を含有する条件自殺ベクターにクローニングする。志賀赤痢菌１中で、このベクターは培地内にＩＰＴＧが存在するときにのみ複製するであろう。突然変異させたＡサブユニット遺伝子から上流に水銀耐性カートリッジ（６５）を挿入する。得られたプラスミドを、ＩＰＴＧの存在下で、野生型志賀赤痢菌１株ＳＣ５００に形質転換する。得られた赤痢菌クローンのコロニーはＨｇ及びカナマイシン耐性である。この赤痢菌クローンをＩＰＴＧなしに数世代に亘り増殖させる。次に、培養物をＨｇ−耐性でカナマイシン−感受性のクローンの存在に関してスクリーニングする。３つのクローンを単離し、更に特徴化する。サザン法により、それらのクローンはもうＡサブユニット遺伝子の内部プローブとはハイブリッドを形成しないが、モノクローナル抗体による分析から明らかなようにＢサブユニット蛋白質はまだ生成し、もう細胞毒性ではないことが示される。
【００４８】
同じ手順を使用して、このＴｏｘＡ− クローンのエンテロケリンをコードするオペロンをｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させてこのクローンを遺伝子操作する。使用する自殺プラスミドベクターは大腸菌（６６）のエンテロケリンオペロンを含有しており、そのｅｎｔ Ｆ，ＦｅｐＥ，ＦｅｐＣ及びＦｅｐＤサブユニット遺伝子は制限部位に顕著な欠損を有し、そこには亜ヒ酸塩耐性をコードする断片（６２）と亜ヒ酸塩耐性遺伝子の好適プロモータが挿入されている。得られたクローンはＴｏｘＡ−及びＥｎｔ−である。
【００４９】
同じ手順を使用して、このＴｏｘＡ−及びＥｎｔ−のクローンのｉｃｓＡ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させて、このクローンを遺伝子操作する。使用した自殺プラスミドベクターはフレクスナー赤痢菌のｉｃｓＡ遺伝子（６０，６１）を含有しており、制限部位で顕著な欠損があり、カドミウム耐性をコードする断片（６３，６４）とカドミウム耐性遺伝子の好適なプロモータが挿入されている。得られたＴｏｘＡ−及びＥｎｔ−，ｉｃｓＡ−の志賀赤痢菌１クローンの特徴はその侵入性が著しく低下していることであり、そのために、志賀赤痢菌１に対するヒト用ワクチンの作成に好適なものとなる。
【００５０】
本発明及び本発明に付随する利点の多くは以上説明より明らかであり、本発明の精神又は範囲から離れることなく或いはその物質の利点の全てを犠牲にすることなく上記方法及びワクチンについて変更しうるものであり、上記の実施態様は単に好ましい実施態様であることは明らかであるものと信じている。
【００５１】
上記に引用した参考文献は次の通りである
【００５２】
【表１】
【００５３】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例２のＳｈｉｇａ−毒素オペロンのクローニングとＳｈｉｇａ−毒素Ａサブユニット遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの変異誘発を図式的に示している。図のプラスミドｐＨＳ７２０１、ｐＨＳ７２０２及びｐＨＳ７２０３中：黒の部分はＡサブユニット遺伝子からの配列を示し；点描部分はＢサブユニット遺伝子の配列を示し；斜線部分はΩ挿入要素からの配列を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化されたエンテロケリン遺伝子、不活性化されたｉｃｓＡ遺伝子および不活性化された志賀毒素遺伝子を含む赤痢菌であって、ＳＣ５０５と称され受託番号Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｉ−１１１０を有する赤痢菌。
【請求項２】
請求項１に記載の赤痢菌株から製造されたワクチン。
【請求項１】
不活性化されたエンテロケリン遺伝子、不活性化されたｉｃｓＡ遺伝子および不活性化された志賀毒素遺伝子を含む赤痢菌であって、ＳＣ５０５と称され受託番号Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｉ−１１１０を有する赤痢菌。
【請求項２】
請求項１に記載の赤痢菌株から製造されたワクチン。
【図１】
【公開番号】特開２００６−２８０３７８（Ｐ２００６−２８０３７８Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１４９２８８（Ｐ２００６−１４９２８８）
【出願日】平成１８年５月３０日（２００６．５．３０）
【分割の表示】特願２００４−２４４７０４（Ｐ２００４−２４４７０４）の分割
【原出願日】平成１年７月１４日（１９８９．７．１４）
【出願人】（５９１２２２７６２）アンステイテユ・パストウール (7)
【出願人】（５００４６７４９３）アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル（アンセルム） (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月３０日（２００６．５．３０）
【分割の表示】特願２００４−２４４７０４（Ｐ２００４−２４４７０４）の分割
【原出願日】平成１年７月１４日（１９８９．７．１４）
【出願人】（５９１２２２７６２）アンステイテユ・パストウール (7)
【出願人】（５００４６７４９３）アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル（アンセルム） (2)
【Ｆターム（参考）】
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