形質転換中のＢＢＭの誘導によって稔性植物を提供するための方法
本発明は、トランスジェニック植物を提供するための方法であって、その方法は、ＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列で植物細胞または植物材料を形質転換する工程を含み、そのＢＢＭタンパク質の活性が形質転換中および／または形質転換された植物細胞もしくは植物材料の再生中に誘導され、その植物細胞または植物材料が抵抗性植物を起源とする、方法に関する。さらに、本発明は、ＢＢＭタンパク質を含み、抵抗性植物であるトランスジェニック植物またはその材料に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抵抗性（ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ）植物である成熟トランスジェニック植物を提供するための方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法によって入手可能な、成熟トランスジェニック植物、植物材料、子孫、植物の一部、種子またはそれらのクローンに関する。本発明はまた、同時形質転換系としての本発明の方法に従って入手可能な成熟トランスジェニック植物またはその植物の一部の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝形質転換は、生命科学の分野において使用される方法論であり、同様に多くの目的のために様々な生物において使用される方法論でもある。この技術は、生命科学研究の多くの領域において大きな意味を有していたし、今も有している。この技術の１つの態様は、それを用いることにより、個別のヌクレオチド分子（例えば、遺伝的エレメントおよび／または遺伝子）またはそのようなヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質の機能を同定することができることである。得られる遺伝子改変生物は、基礎研究もしくは応用研究において使用することができるか、または産業上の利用において使用することができる。
【０００３】
遺伝形質転換は、目的のヌクレオチド分子を受け手側の（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）植物種に移すことができるので、植物科学の分野において強力な技術であり得る。そのようなヌクレオチド分子は、プロモータ、遺伝子、ターミネータ、タンパク質機能の遺伝子のリプレッサまたはエンハンサなどを含み得る。
【０００４】
遺伝形質転換は、例えば、目的のタンパク質を受け手側の植物に付加することに関する作用を研究することを意図して使用され得る。そのような場合、通常はより大きなヌクレオチド分子の一部である目的のタンパク質をコードする遺伝子が、受け手側の植物に導入される。
【０００５】
遺伝子改変植物を得るために、形質転換、その後の再生、およびそれに続いて、形質転換されて再生された植物材料を成熟トランスジェニック植物に成長させることを含む方法を適用することができる。そのような方法は、形質転換段階および再生段階と、その後の成熟トランスジェニック植物へのさらなる成長との両方に対して応答性である特定の植物種にだけ首尾よく適用することができる。そのような植物種としては、例えば、アラビドプシス・サリアーナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）またはブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）が挙げられる。
【０００６】
形質転換では、目的のヌクレオチド分子が、植物細胞に導入される。再生では、形質転換された植物材料を、カルス組織などのかなり未決定の構造から植物器官（例えば、葉様構造、シュート様構造または体細胞胚）に成長させ、そこから成熟トランスジェニック植物を得ることができる。
【０００７】
その形質転換の段階は、植物細胞または植物材料を、目的のヌクレオチド分子を有するＴｉ（腫瘍誘導）プラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細菌と接触させる工程を含み得る。そのＴｉプラスミドは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによって宿主植物に移されるＤＮＡセグメント；Ｔ−ＤＮＡエレメントを少なくとも含む。そのＴ−ＤＮＡエレメントは、ＤＮＡ反復配列、いわゆる左境界配列および右境界配列に隣接している。遺伝子操作によって、目的のヌクレオチド分子を、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左境界配列と右境界配列との間に入れることが可能である。植物細胞または植物材料をアグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌と接触させることにより、少なくとも目的のヌクレオチド分子を含むＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡエレメントが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌から植物細胞に移動し、その植物細胞において、そのエレメントは、核ゲノムまたはオルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体由来のゲノム）に安定的にインテグレートされる。他の形質転換の方法を植物材料に適用してもよい。
【０００８】
巨視的な観点から適当な再生を考えるとき、植物細胞または植物組織の再生によって、シュート様構造または葉様構造を発生することができる無定形の細胞塊（すなわちカルス）が発生することがある。通常、必要であれば適当な植物ホルモンの影響下において、そのような構造から伸長した茎が発生し得る。続いて、そのような構造は、必要であれば１つまたはそれ以上の適当な発根誘導剤の影響下において、根系の形成を開始し、それにより、さらなる成長を持続するために適した発達した根系を発達させる。続いて、発生段階の進んだ適当な植物材料が、インビトロからエキソビトロ環境に移植され得る。その植物は続いて、成熟トランスジェニック植物を得ることが可能な適当な条件下においてエキソビトロで（例えば、土壌、バーミキュライト、ロックウールなどの上で）生育される。この再生手順は、この全体的な概念の追加工程または代替工程を含んでもよい。あるいは、再生は、成熟植物に生育させることができる可能性のある体細胞胚の形成によって進めてもよい。
【０００９】
形質転換および再生のそのような方法は、好ましくは、出発材料としての若い体細胞性植物組織、培養細胞（例えばプロトプラスト）または器官に適用される。そのような組織（例えば、若い植物組織の外植片または苗木由来の植物材料の小片）は、分化または決定の程度が様々である細胞を含む。そのような組織に存在する細胞集団の分化のレベルまたは程度が様々であり不均一であることにおそらく起因して、そのような組織は、再生処理の最初の段階に特に応答性である。
【００１０】
ある特定の植物または植物種だけが、形質転換および再生の方法に応答性であると示されている。比較的単刀直入な方法でそのような植物を形質転換して再生する既存の方法を適用することが可能である。逆に、他の植物または植物種がそのような形質転換および再生の方法に対して無応答性であることが明白になっている。そのような植物は、適当な様式で再生せず、そして／または成熟植物に再生させることが全くできない。そのような植物、植物品種または植物栽培品種は、「抵抗性」または「再生不能（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」と呼ばれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
どの基本的な分子もしくは生理学的因子が関与しているか、または植物が抵抗性になるか否かを決定するかは、ほとんど知られていない。このことから、多種多様の植物種に適用することができる信頼できる植物特異的な形質転換方法および再生方法を開発する必要性が現在あることが示唆される。実際に、成熟トランスジェニック植物を効率的に提供するための適当な形質転換方法および再生方法は、いくつかの種またはいくつかの種の栽培品種に対してしか開発されていない。
【００１２】
抵抗性植物が形質転換方法および再生方法に供され、成熟トランスジェニック植物に成長するとき、種々の多くの問題が観察されており、克服できないことが見出されている。そのような問題は、供される植物細胞または植物材料由来の植物細胞を形質転換することができないことを含む。または、形質転換を達成することができた場合でも、そのような形質転換された材料は、形質転換された成熟植物に成長しない可能性がある。形質転換された細胞または植物材料は、ある特定の成長段階まで再生し、異常な挙動（例えば、変更されたもしくは異常な生育、成熟前での成長の終結、大幅に遅れた成長、または不正確な成長）を示し得る。また、偽陽性植物の形成が起きることも知られている。そのような形質転換されていない植物材料は、選択薬剤の圧力から逃れることがあり、成熟植物に再生することがある。
【００１３】
さらに、上記方法の適用性、信頼性および適合性に関して以下の問題が知られている。再現性に問題がある場合がある；上記方法の成果は、予測不可能である場合があり、産業的環境における適当な用途のためには、シュート、根または小植物を再生する量が少なすぎる場合がある；上記方法は、単一の植物種または所与の植物種の特定の栽培品種群にしか適用できない；上記方法は、ハイスループットまたはルーチンの用途に適していない可能性がある；上記方法は、適当な適用性のために特定の細菌株に依存し得る。そのような方法は、コスト効率の高い産業上の用途にとって適当でないことは明らかであり得る。それゆえ、抵抗性植物種に適用することができる、成熟トランスジェニック植物を提供するための効率的で信頼できる方法が必要とされ続けている。
【００１４】
ゆえに、本発明の目的は、形質転換段階および再生段階を含む、抵抗性植物である成熟トランスジェニック植物を得るための方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、本発明の方法によって入手可能なトランスジェニック植物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
とりわけ上記の目的は、添付の請求項に定義される方法によって提供される。
詳細には、本発明は、成熟トランスジェニック植物を提供するための方法であって、その方法は、植物細胞または植物材料を形質転換して再生する工程を含み、その植物細胞または植物材料がＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子で形質転換され、そのＢＢＭタンパク質の活性が形質転換中および／または形質転換された植物細胞もしくは植物材料の再生中に誘導され、その植物細胞または植物材料が抵抗性植物を起源とする、方法に関する。
【００１６】
本発明に至る研究によって、アマトウガラシおよびペチュニアＷ１３８などのいくつかの抵抗性植物を起源とする植物材料が、形質転換中および再生中にＢＢＭを誘導することによって成熟トランスジェニック植物に再生させることができるのに対し、これらの段階においてＢＢＭを誘導しないと、そのような植物は成熟トランスジェニック植物に成長しないことが見出された。当該分野および本明細書中における抵抗性植物は、そのような植物を起源とする植物材料が応答性植物にとって適当な形質転換および再生の手順に供されるとき、本質的に成熟トランスジェニック植物に再生および成長しない植物である。そのような方法の基本原理は、植物ホルモン、好ましくは、オーキシン、サイトカイニンまたはジベレリン酸だけでなく、アブシジン酸、エチレンまたはそれらの阻害剤も含む培地と接触した形質転換された植物材料が、応答性植物の場合のように、形質転換された植物材料の再生を可能にすることである。本明細書中の抵抗性植物は、そのような任意の条件下において成熟トランスジェニック植物に成長できない植物である。
【００１７】
かなり多数の抵抗性植物、特に、経済的に重要な植物種、作物または品種に属する抵抗性植物は、再生を用いて成熟トランスジェニック植物を提供するのに適した方法を開発することを目指した広範囲の研究の対象である。従来技術の方法を用いてそのような植物由来の植物材料を形質転換して成熟トランスジェニック植物に再生しようと試みるときに遭遇する多くの種々の問題とあわせて、アマトウガラシなどの抵抗性植物が成熟トランスジェニック植物に再生できないとよく知られていることを考えると、本発明の効率は驚くべきものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の利点は、明らかに抵抗性植物由来の植物細胞または植物材料を、１つまたはそれ以上の生物学的に活性な薬剤（例えば、植物ホルモン、または植物ホルモンの作用を模倣する物質）を加えることによって助けられても、または助けられなくても、成熟トランスジェニック植物に成長させることができる点である。そのような生物学的に活性な薬剤が使用されるとき、それらは形質転換された植物材料を培養する培地に加えられ、それにより、トランスジェニック植物材料が成熟トランスジェニック植物に成長することを可能にすることができる。そのような生物学的に活性な薬剤をＢＢＭの活性が誘導されていない植物細胞または植物材料に加えても、そのような植物細胞または植物材料は成熟トランスジェニック植物に再生できなかった。
【００１９】
本発明の別の利点は、形質転換段階および／または再生段階におけるＢＢＭ活性のタイミングを調節する可能性を含む。ＢＢＭの時間的活性を調整することにより、本発明によって抵抗性植物から入手可能な成熟トランスジェニック植物の質または量のさらなる最適化が可能になり得る。
【００２０】
本発明のさらなる利点は、生殖生長段階を通じて、形質転換された植物材料の適当な成長を確実にする可能性に関する。植物の成長の生殖生長期の間のＢＢＭタンパク質の不適当な発現および／または活性を防ぐことによって、部分不稔または完全不稔に関する問題を回避することができるかまたは軽減することができる。
【００２１】
本明細書中の再生は、形質転換された植物細胞が体細胞胚、葉様構造またはシュート様構造に成長していくことを含む。その後の段階において、そのような植物組織は、さらに成熟トランスジェニック植物に成長することができる。
【００２２】
したがって、本発明は、形質転換中および再生中にＢＢＭを活性化することによって抵抗性植物を起源とする植物材料から成熟トランスジェニック植物を効率的に得ることを初めて可能にする。本明細書におけるＢＢＭ活性とは、形質転換された宿主植物の遺伝子の転写に対する、形質転換されたＢＢＭの発現の作用のことを意味する。ＢＢＭは、転写因子であるので、その活性は、１つまたはそれ以上のＢＢＭ標的遺伝子の転写に影響することを含む。ＢＢＭの活性化は、誘導された際にＢＢＭが核に局在化されるようになることを可能にすることだけでなく、その転写または翻訳を誘導することによっても、達成することができる。ＢＢＭの活性化により、ＢＢＭが調節性のヌクレオチド配列および／またはタンパク質配列に直接的または間接的に結合することによってその標的遺伝子の転写の誘導または抑制が引き起こされることが考えられる。ＢＢＭ活性の基礎をなすメカニズムに関係なく、発現コンストラクトから発現されたＢＢＭタンパク質の活性が誘導された結果は、形質転換および再生に供された抵抗性植物を起源とする植物材料が、成熟トランスジェニック植物に成長することができるということである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書における「成熟トランスジェニック植物」とは、生存可能な子孫を与えることができる少なくとも１つの生殖器官、好ましくは、より多くのそのような器官（例えば、種子を含む果実）を生成する進んだ発生段階に達した植物のことを意味する。本明細書中の用語「成熟植物」は、用語「稔性植物」と交換可能である。そのような生殖器官は、有性生殖器官（例えば、花）または栄養生殖器官（例えば、塊茎、匍匐枝、根茎、球茎、小鱗茎または鱗茎）であり得る。本明細書中に記載されるような生殖器官から生存可能な子孫をもたらすことができる、本発明に従って得ることができる成熟トランスジェニック植物が、特に興味深い。
【００２４】
本明細書において、花は、単性であり得る、すなわち、少なくとも雄性生殖器官（雄ずい群）もしくは少なくとも雌性生殖器官（雌ずい群）のいずれかを有し得るか；または本明細書において、花は、両性であり得る、すなわち、少なくとも１つの雄性生殖器官および少なくとも１つの雌性生殖器官を有し得る。
【００２５】
本明細書において、花は、好ましくは稔性であるが、機能的な卵細胞または機能的花粉のいずれかを含むこともできる。稔性の花の場合、そのような花は、その後生存可能な子孫をもたらす、機能的花粉および１つまたはそれ以上の機能的な卵細胞を有する。機能的花粉および１つまたはそれ以上の機能的な卵細胞を有する花は、自家受精だけでなく他家受精によっても１つまたはそれ以上の種子を生成することができる。機能的な卵細胞または機能的花粉のいずれかを含む花の場合、そのような花は、自家受精によって種子を生成しないが、他家受精によって種子を生成することができる。したがって、そのような花は、雄性不稔または雌性不稔であり得る。しかしながら、雄性不稔の花は、別の花の機能的花粉によって受精され得る。雌性不稔の花の花粉を用いることにより、別の花を受精させることができる。そのような花の雄性不稔は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）、胞子体型自家不和合性、配偶体型自家不和合性または他の任意の不稔系の結果であり得る。上記の生物学的用語は、それらの分野において認識されている意味において使用される。
【００２６】
成熟トランスジェニック植物をもたらすことができる最初の形質転換された植物材料から外植片を得ることも可能性として考えられる。最初の形質転換体の外植片から得られるそのような成熟トランスジェニック植物もまた、本発明に記載の、および本発明の方法によって直接得られた生成物としての、成熟トランスジェニック植物の意味の範囲内に入る。
【００２７】
本明細書中の用語「植物細胞」とは、植物または植物材料から得られる任意の細胞のことを指す。プロトプラストまたは液体懸濁液などからの任意の細胞のことも意味する。
【００２８】
本明細書中の用語「植物材料」とは、植物の任意の構造、組織または器官から得られる任意の外植片、小片または切り取ったもののことを指す。本明細書における植物材料は、植物の任意の組織または器官のことも指すことがある。前記外植片、小片または切り取ったものが由来する前記植物組織または植物器官は、子葉、胚軸、上胚軸、種子、カルス、葉、根、シュート、花、葯、花粉、胚珠、卵細胞、果実、分裂組織、原基、花序、葉柄、プロトプラスト、シンク組織、ソース組織、苗木、シンク器官、ソース器官、塊茎、接合子胚、体細胞胚、または半数体の倍加半数体に由来する胚を含む。また、この点において、単細胞培養物、懸濁液、雄性発生（ａｎｄｒｏｇｅｎｉｃ）培養物、雌性発生（ｇｙｎｏｇｅｎｉｃ）培養物などの細胞培養物も含まれる。特に、植物材料という用語は、苗木由来の組織（例えば、子葉またはその小片）のことを指す。
【００２９】
本明細書中の用語「形質転換する」とは、ヌクレオチド分子（例えば、発現ベクターまたは発現コンストラクト）を受け手側の植物細胞に導入する方法のことを指す。そのような形質転換手順は、遺伝子もしくはタンパク質または別の遺伝的エレメント（例えば、プロモータ、エンハンサ、ターミネータなど）の機能を解明するために用いることができる。そのヌクレオチド分子は、好ましくは、植物から得られたものであるか、または植物から得られたヌクレオチド配列に基づくものである。そのヌクレオチド分子はまた、合成の起源のものでもあり得る。そのヌクレオチド分子は、細菌ベクター（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（例えば、Ｂｅｎｔ，２０００を参照のこと）または植物の形質転換に適した別の細菌（例えば、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５を参照のこと）を使用することによって植物細胞に導入することができる。その形質転換手順は、粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、機械的注入、または本発明における使用に適した他の形質転換手法も含み得る。そのような技術のすべてが、当業者に公知であり、本発明を実施するために器用な技能を行うことなく適用され得る。
【００３０】
本発明の別の態様は、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、チューリップ属（Ｔｕｌｉｐａ）、ユリ属（Ｌｉｌｉｕｍ）、サフラン属（Ｃｒｏｃｕｓ）、アヤメ属（Ｉｒｉｓ）、グラジオラス属（Ｇｌａｄｉｏｌｕｓ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）、ブタンソウ属（Ｂｅｔａ）、アカザ属（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）からなる群から選択される植物、特にナス科（Ｓｏｌａｎｅｃｅａｅ）由来の植物に由来する植物細胞または植物材料に関する。本発明は、より具体的には、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）種、ペチュニア・ヒブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）種、チューリップ属の種（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ）、ユリ属の種（Ｌｉｌｉｕｍ ｓｓｐ）、サフラン属の種（Ｃｒｏｃｕｓ，ｓｓｐ）、アヤメ属の種（Ｉｒｉｓ ｓｓｐ）、グラジオラス属の種（Ｇｌａｄｉｏｌｕｓ ｓｓｐ）、スピナセア・オレラセア（Ｓｐｉｎａｃｅａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ベータ・バルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ケノポディウム・クイノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）、ファセオラス・バルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ファセオラス・コシネアス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、ピスム・サティブム（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）およびカプシカム・アンナム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、特に、アマトウガラシであるカプシカム・アンナム植物に関する。これらの植物種および／またはいくつかの植物種のいくつかの栽培品種、品種もしくはタイプは、周知のこととして抵抗性であり、形質転換および／または成熟トランスジェニック植物への再生を行い難い。
【００３１】
本発明は、特に、抵抗性ジャガイモ（ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））のタイプまたは品種、ペチュニア（ペチュニア・ヒブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ））のタイプまたは品種（例えば、Ｗ１３８）、およびより詳細には、アマトウガラシ（カプシカム・アンナム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ））のタイプまたは品種（少なくともアマトウガラシの場合、当業者によって、周知のこととして抵抗性であると考えられており、知られている）に関する。
【００３２】
カプシカム・アンナム種は、果実の食味に基づいて２つの群、すなわち、アマトウガラシ（またはシシトウ）タイプおよびトウガラシ（ｈｏｔ ｐｅｐｐｅｒまたはｃｈｉｌｉ ｐｅｐｐｅｒ）タイプに分類される。アマトウガラシタイプの群は、辛味でない甘味のある果実をつけるトウガラシ植物を含む。そのような果実は、果実のより進んだ成熟レベルでは、その果実中に低レベルのカプサイシン（８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネンアミド）を有する。本明細書においてアマトウガラシの群は、ブロッキー（ｂｌｏｃｋｙ）、ベル（ｂｅｌｌ）、ラムヨ（ｌａｍｕｙｏ）、パプリカ（ｐａｐｒｉｋａ）、ハンガリアン・パプリカ（Ｈｕｎｇａｒｉａｎ ｐａｐｒｉｋａ）、ニューメキシカン・パプリカ（Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃａｎ ｐａｐｒｉｋａ）、スカッシュペッパー（ｓｑｕａｓｈ ｐｅｐｐｅｒ）、スパニッシュ・パプリカ（Ｓｐａｎｉｓｈ ｐａｐｒｉｋａ）、ピミエント（ｐｉｍｉｅｎｔｉｏ）、イタリアン・フライング（Ｉｔａｌｉａｎ ｆｒｙｉｎｇ）、ジャパニーズ・スイート（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｗｅｅｔ）、ビエジョ・アルガ・ダルセ（Ｖｉｅｊｏ ａｒｒｕｇａ ｄｕｌｃｅ）およびキューバン（Ｃｕｂａｎ）品種を含む（Ｄｅ Ｗｉｔｔ ＆ Ｂｏｓｌａｎｄ，１９９７）。
【００３３】
アマトウガラシは、高度に抵抗性のカプシカム・アンナムであると考えられている。アマトウガラシ植物が形質転換および再生を含む方法に供されたとき、以下の観察結果が報告されている。カルスから葉原基が形成されない；葉様構造が再生段階に進むことができない；再生中の組織にシュートが存在しない；シュート芽が伸長しない；シュート芽からシュート様テラトーマが発生する；頂端分裂組織が伸長しない；再生中のシュートの頂芽優性が低下する；選択圧下において生育されたカルスから非トランスジェニックシュートが再生する；再生中のシュートの稔性が低下する、適切な根系がトランスジェニックシュートから発生できない、または植物組織もしくは植物器官の生育が大きく遅れる。偽陽性植物、すなわち、選択圧下で植物の生育を可能にする必要な耐性付与遺伝子を含まない成熟非トランスジェニック植物の出現も知られている。したがって、従来技術は、成熟トランスジェニックアマトウガラシ植物を提供するための形質転換および再生の適当な、有効なまたは信頼できる方法を教示しないと言うことができる。本発明は、成熟トランスジェニックアマトウガラシ植物を得る方法が提供されるという利点を有する。
【００３４】
本発明に記載の方法を適用することにより、成熟トランスジェニックアマトウガラシ植物が提供され、特に、これらの植物から十分に成長したトウガラシ果実および生存可能な種子も提供される。さらに、本発明は、外来性ＢＢＭヌクレオチド配列を含む発芽する苗木を提供するために使用することができる。自家受精した成熟トランスジェニック植物の分離比分析から、導入遺伝子が次世代の子孫に遺伝されたことが実証された。いくつかの成熟トランスジェニック植物の子孫のメンデルの法則に従った分離は、単一の遺伝子座の存在に対応した。表４は、分離比分析の結果を表している。このように、本発明は、形質転換されたヌクレオチド配列を含む生存可能な子孫を生成する成熟トランスジェニックアマトウガラシ植物を提供した。
【００３５】
本発明の方法によって得られたトランスジェニックアマトウガラシの種子は、ＮＣＩＭＢ４１７３２番として寄託された。
【００３６】
本発明の別の態様は、配列番号１であるＢＢＭタンパク質、または配列番号１と少なくとも５０％、６０％、７０％、好ましくは、８０％、より好ましくは、９０％、なおもより好ましくは、少なくとも９５％の同一性および最も好ましくは、少なくとも９８％の同一性を有することを特徴とするＢＢＭタンパク質の機能的ホモログに関する。タンパク質がＢＢＭホモログであるか否かは、目的のタンパク質が、配列番号１のＢＢＭタンパク質ではなくＢＢＭ標的遺伝子のプロモータに結合されたレポーター遺伝子を同様に発現するか否かを評価することによって確認することができる。そのような標的遺伝子は、例えば、アクチン脱重合因子９（ＡＤＦ９；ＧｅｎｅＩＤ：８２９６４９、ＴＡＩＲ：ＡＴ４Ｇ３４９７０）を含む。
【００３７】
あるいは、候補遺伝子は、発現ベクターが前記ＢＢＭ候補タンパク質の誘導性の核転写活性を提供する候補ＢＢＭタンパク質をコードする発現ベクターを用いて、アマトウガラシ植物に形質転換されてもよい。アマトウガラシ植物由来の植物細胞に形質転換する際、その供された植物材料が１つまたはそれ以上の成熟トランスジェニック植物に成長することは、本発明に従って生じる。遺伝子またはタンパク質がＢＢＭの機能性ホモログであるかを本発明に従って確認することは、十分に当業者の能力の範囲内である。初期調査において、当業者は、研究所（例えば、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）または他の任意のそのような研究所）によって提供される最新の電子的な分子生物工学的ツールおよびデータベースを調べることができる。そのようなツールおよびデータベースは、任意の未知の遺伝子またはタンパク質が機能的なＢＢＭホモログであり得るか否かという任意の指摘が存在し得るかを迅速に評価する手段を当業者に提供する。そのような指摘は、関係するクレードまたは同じクレードにおける進化的保存および分類についてＢＢＭに関する未知配列の情報；未知配列が、ＢＢＭに関係する遺伝子またはタンパク質のクラス（例えば、ＡＮＴ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２を含むＡＰ２ファミリー）に属するか否か；ＡＰ２ドメインなどの特定のドメインを共有すること；そのような共有されるドメイン、単一のまたは反復のＡＰ２ドメインの数；ＢＢＭ様と呼ばれる配列などの遺伝子またはタンパク質の名称を含み得る。その結果として、調査の第２段階では、目的の配列が機能的なＢＢＭホモログであるかを確かめるために、限られた数の遺伝子またはタンパク質だけが、抵抗性植物、特に、アマトウガラシに形質転換されるのに必要とされるだろう。ゆえに、この手順に従って、現代生物工学の当業者は、過度の負担なしに、遺伝子またはタンパク質が機能的なＢＢＭホモログであり得るか否かを確認することができるだろう。
【００３８】
本明細書中の用語「配列同一性」は、配列番号１に記載の完全長ＢＢＭタンパク質における同一のアミノ酸の数を完全長のアミノ酸の数で除して１００を乗じたものと定義される。例えば、配列番号１と９０％の同一性を有する配列は、以下の計算：５２１／５７９×１００＝９０％によって例証されるように、配列番号１の５７９アミノ酸という配列全体にわたって、５２１個の同一アミノ酸を含む。
【００３９】
ＢＢＭは、種々の異なる種（例えば、ブラシカ・ナパス、アラビドプシス・サリアーナ、メディカゴ・トランカラータ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃｕｌａｔａ）、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ））において保存されている。本願において開示されるように、アブラナ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒｓ）（またはアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ））の分類群の植物由来のＢＢＭ遺伝子を使用して、形質転換および再生を含む方法によって、別個かつ遠縁のナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）から成熟トランスジェニック植物を得ることが可能である。おそらく、進化的保存のレベルのおかげで、これらのタンパク質は、ナス科（Ｓｏｌａｎｅｃｅａｅ）にわたるかまたは単子葉植物から双子葉植物にさえ及ぶ種々の抵抗性植物種に対して本方法を適用する場合に適当なものとなる。
【００４０】
【表１】
【００４１】
表１：配列番号１のＢＢＭに似ている様々な植物種のタンパク質のＧＩ番号（ＧｅｎＩｎｆｏ識別子）
本発明のさらに別の態様は、転写活性化因子、翻訳アクチベータまたは核標的化系（ｎｕｃｌｅａｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）からなる群から選択される遺伝的エレメントに作動可能に連結されたＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。
【００４２】
そのような遺伝的エレメントは、ＢＢＭタンパク質の適当な空間的活性および／または時間的活性を可能にするＢＢＭタンパク質の活性の調節を可能にする。本明細書における空間的活性とは、器官または組織に特異的なＢＢＭ活性を達成することができることを意味する。そのような遺伝的エレメントを使用する利点は、ＢＢＭタンパク質の不適当な発現または活性に関する問題の発生を防ぐことができる点である。
【００４３】
好ましい実施形態において、ＢＢＭタンパク質は、核標的化系に作動可能に連結される。この実施形態において、翻訳段階で融合されたＢＢＭ：：ＧＲのタンパク質を核に移動させるかまたは転位させることによって、ＢＢＭの活性を調節することが可能である。
【００４４】
本発明に記載の遺伝的エレメントが、転写活性化因子であるとき、転写レベルでＢＢＭの活性を制御することが可能である。そのような転写誘導系は、エタノール誘導性プロモータまたは熱ショック誘導性プロモータを含む系であり得る。５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ配列に配置され得る翻訳アクチベータを用いることにより、翻訳調節によってＢＢＭ活性を制御することができる。どの系を用いることによって、上で述べた遺伝的エレメントに従ってＢＢＭ活性を誘導することができるかは、当業者に明らかである。他の適当な系としては、エストロゲン誘導系、ＰＲＰ誘導系、ＵＡＳ誘導系、任意のＶＰ１６を含む系が挙げられる。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、ＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２を特徴とするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。このヌクレオチド配列によってコードされるペプチドは、植物材料がデキサメタゾン（ＤＥＸ）を含む培地と接触したときにＢＢＭタンパク質の活性が誘導されることを可能にする。
【００４６】
本発明の別の好ましい実施形態において、再生中の形質転換された植物細胞または植物材料は、ＢＢＭタンパク質の活性を誘導するのに適した薬剤を含む培地と接触される。
【００４７】
本発明のさらに別の実施形態において、ＢＢＭタンパク質の活性を誘導するのに適した薬剤は、エタノールである。この実施形態において、エタノールは、外来性ＢＢＭ遺伝子の転写を誘導するために使用され得る。転写を誘導するための他の系もまた、本発明を実施するために適している。ＢＢＭの活性は、本発明を実施するために、他のレベル（例えば、翻訳のレベルまたは翻訳後のレベル）においても制御され得る。
【００４８】
この態様の実施形態によれば、発現ベクターは、１つもしくはそれ以上の選択可能マーカー、１つもしくはそれ以上の目的のタンパク質、および／または１つもしくはそれ以上の目的の転写産物をさらにコードする。そのような目的のタンパク質は、目的の任意の病原体に対する抵抗性を提供する任意のタンパク質を含むが、ビタミン、栄養分、糖などの産生をもたらす経路の一部であるタンパク質も含む。
【００４９】
本発明はさらに、ＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む外来性ヌクレオチド配列、およびＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントを含み、抵抗性植物である、上記の方法によって入手可能な成熟トランスジェニック植物またはその材料に関する。本発明の好ましい実施形態において、成熟トランスジェニック植物は、ナス属、ペチュニア属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、ブタンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属、エンドウ属およびトウガラシ属由来の抵抗性植物からなる群から選択される植物、特に、ナス科由来の植物である。
【００５０】
本発明のより好ましい実施形態において、成熟トランスジェニック植物は、アマトウガラシのカプシカム・アンナム植物である。
【００５１】
本発明に記載の成熟トランスジェニック植物は、配列番号１である外来性ＢＢＭタンパク質、または配列番号１と少なくとも５０％、６０％、７０％の同一性、好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、なおもより好ましくは、少なくとも９５％の同一性、および最も好ましくは、少なくとも９８％の同一性を有することを特徴とするＢＢＭタンパク質の機能的ホモログを含む。好ましくは、成熟トランスジェニック植物は、本発明に記載のＢＢＭタンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列をそのゲノム内に含む。
【００５２】
本明細書において、外来性ヌクレオチド配列は、形質転換などの生物工学的手順によって植物材料に導入されたヌクレオチド配列である。外来性タンパク質は、外来性ヌクレオチド配列からコードされるタンパク質である。
【００５３】
本発明のさらに別の実施形態において、外来性ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントは、転写活性化因子、翻訳アクチベータ、または好ましくは、核標的化系からなる群から選択される。
【００５４】
本発明の利点は、外来性ＢＢＭタンパク質の活性が、空間的様式と時間的様式の両方において、ＢＢＭタンパク質の適当な活性または発現を可能にするように誘導することができる点である。形質転換および／または再生において外来性ＢＢＭの活性が誘導される可能性に加えて、外来性ＢＢＭの活性が都合の悪い有害作用を有し得る成長段階においては外来性ＢＢＭの活性を低下することができるかまたは無くすことができることは、特に有益であるとみられる。外来性ＢＢＭの空間的活性は、組織特異的プロモータを用いて調節され得る。例えば、植物成長の生殖生長期において活性でないプロモータを使用することにより、不稔性に関する問題が回避され得る。苗木の生育および成長の段階において活性なプロモータを使用することは、形質転換された植物材料の再生において好ましいだろう。
【００５５】
本発明に記載の遺伝的エレメントは、外来性ＢＢＭの適当な活性を可能にするために外来性ＢＢＭ遺伝子に作動可能に連結される。適当なエレメントとしては、任意の熱ショック誘導系、エタノール誘導系、エストロゲン誘導系、ＰＲＰ誘導系、ＵＡＳ誘導系、任意のＶＰ１６を含む系が挙げられる。当業者にとっては、本発明を実施するために他の適当な系を使用することができること、および生物工学的方法を使用することによりそのような系を作製することができることは明らかである。
【００５６】
さらに、ドミナントリプレッサ、ドミナントアクチベータ、アンチセンスコンストラクト、ＲＮＡｉコンストラクト、ｓｉＲＮＡコンストラクト、ノックアウトの使用に基づく方法、またはＢＢＭ活性に影響する同じ作用を選別する他のそのような方法によって本発明に記載のＢＢＭ活性を調節することが可能であると考えられる。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号２を特徴とする、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントに関する。この遺伝的エレメントは、ＢＢＭタンパク質に作動可能に連結することができ、それにより、翻訳融合がもたらされる。そのような作動可能な連結は、ＢＢＭタンパク質が、ＢＢＭ活性の誘導を可能にするトランスジェニック細胞の核に局在することを可能にする。この実施形態において、外来性ＢＢＭの活性化は、植物材料がデキサメタゾンを含む培地と接触したときにＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にする配列番号２によってコードされるペプチドによって媒介される。
【００５８】
さらに、本発明は、本発明に記載の成熟トランスジェニック植物の子孫、植物の一部、種子またはクローンに関する。本発明の利点は、本発明に記載の成熟トランスジェニック植物から子孫を得ることができる点である。そのような子孫は、例えば、組織または器官からの無性繁殖によって、成熟トランスジェニック植物から得ることができる。そのような場合、子孫は、細胞、組織、器官または適当な任意の植物の一部を繁殖するのに適した方法によって得ることができる。そのような方法は、様々な手段による植物材料のクローン化、接木、葉を切り取ったものの繁殖、切り取ったものの発根または他のそのような適当な方法を含み得る。繁殖方法は、子孫を得るための生殖体の調製に基づく技術も含み得る。そのような技術は、雌性発生または雄性発生による倍加半数体の子孫の作出を含む。植物組織培養または植物細胞培養を含む適当な方法もまた、子孫を得るために構想される。
【００５９】
ＢＢＭをコードするヌクレオチド配列を植物細胞のゲノムから切除するか、組み換えるか、または失わせることができるヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクトに本発明に記載のＢＢＭ遺伝子をクローニングすることによって本発明を実施することも可能であると考えられる。そのような系としては、例えば、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系またはＦＬＰ／ＦＲＴ系が挙げられるが、別の適当な組換え系も含まれ得る。
【００６０】
さらに、トランスジェニックの子孫および／または非トランスジェニックの子孫が、本発明に記載の成熟トランスジェニック植物から得られることがあることに注意されたい。そのような子孫は、メンデルの法則に従った導入遺伝子の分離を可能にする成熟植物を他家受精するかまたは自家受精することによって、得ることができる。非トランスジェニックの子孫は、導入遺伝子がヘテロ接合性である成熟トランスジェニック植物の自家受精によって得られるかもしれないし、成熟トランスジェニック植物を、非トランスジェニック子孫をもたらすことができるＢＢＭ導入遺伝子を含まない他の任意の適当な植物と交配することによって得られるかもしれない。
【００６１】
本発明の別の態様は、同時形質転換系としての本発明の方法に従って入手可能な成熟トランスジェニック植物または植物の一部の使用に関する。本明細書中の本発明の範囲は、同時形質転換系の基本原理として、好ましくは、マーカーを含まない系として、本発明に記載の誘導性のＢＢＭヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子の使用も包含する。
【００６２】
本明細書ではいくつかの実施形態が構想される。第１の実施形態では、外来性かつ誘導性のＢＢＭを含む植物（例えば、Ｔ１またはそれ以降のアマトウガラシ植物）に由来する植物材料が、目的の遺伝子を含み得る別の発現コンストラクトで形質転換される。このＴ１またはそれ以降の植物は、外来性かつ誘導性のＢＢＭ導入遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。第２の実施形態では、非トランスジェニック抵抗性植物を起源とする植物材料が、誘導性のＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列に加えて、１つもしくはそれ以上の目的の遺伝子または１つもしくはそれ以上の目的の遺伝的エレメントをコードすることができる別のヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで形質転換される（そして成熟トランスジェニック植物に再生される）。このストラテジーの利点は、得られる各成熟植物が、本質的に、誘導性のＢＢＭコンストラクトおよびさらなる目的のヌクレオチド配列を含むことになるので、誘導性のＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含めることによって、マーカーを含まない効率的な形質転換および再生が可能になる点である。
【００６３】
さらなる実施形態において、非トランスジェニック抵抗性植物細胞または植物材料は、誘導性のＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびさらなる目的のヌクレオチド配列を含む異なる第２の発現コンストラクトで形質転換される。好ましくは、抵抗性植物細胞または植物材料は、両方の発現コンストラクトと同時に接触される。このさらなる目的のヌクレオチド配列は、さらなる目的のタンパク質をコードし得るか、または好ましくはコードする。これらの実施形態の利点は、抵抗性植物種、例えば、アマトウガラシを、本質的に任意の目的のヌクレオチド配列または遺伝子で形質転換し、再生することができる点である。そのような目的のヌクレオチド配列は、目的の配列に対するＲＮＡｉ配列もしくはアンチセンス配列、過剰発現配列、機能獲得配列、または他の任意の目的の配列から選択され得る。
【００６４】
両方の実施形態が、外来性ＢＢＭに加えて他の任意の目的のヌクレオチド分子を含むアマトウガラシなどの成熟トランスジェニック植物を得ることを可能にする。
【００６５】
同時形質転換系に関する第１の実施形態は、適当な表現型または遺伝子型に基づいて外来性ＢＢＭを含むトランスジェニック植物を第１に選択することができるという意味においてさらなる利点を有する。適当な表現型には、十分に生育するかもしくは成長する植物、あるいは適当な稔性または他の任意の適当なもしくは好ましい表現型を有する植物が含まれ得る。適当な遺伝子型は、導入遺伝子の安定性、位置効果によって引き起こされるものなどのＢＢＭの発現レベル、コンストラクトの漏出性（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）、すなわち、ＢＢＭの不適当な活性、単一植物における導入遺伝子の数、単一植物内の１つのインテグレーション部位に存在するコンストラクトの数（多コピーのＴ−ＤＮＡコンストラクトが単一の遺伝子座に挿入され得る）または他の任意の適当なもしくは好ましい特性に関することがある。
【００６６】
同時形質転換系に関する第２の実施形態は、単回の形質転換および再生の処理において、外来性ＢＢＭに加えて他の任意の目的のヌクレオチド配列を含む抵抗性植物を得ることを可能にするという意味においてさらなる利点を有する。
【００６７】
ここで、これらの両方の実施形態においてそのような同時感染または同時形質転換のためにプロトプラストを使用することが可能であることに特に注意されたい。
【００６８】
したがって、追加的にまたは二者択一的に、形質転換された植物細胞または形質転換された植物材料においてその再生中にＢＢＭ活性を誘導する工程を包含する、成熟トランスジェニック植物を得るための方法であって、その植物細胞または植物材料は、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントに作動可能に連結されたＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む外来性ヌクレオチド分子を含み、その植物材料の植物細胞は、抵抗性植物、特に、アマトウガラシに由来する方法が、提供される。所望であれば、そのトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物材料は、成熟トランスジェニック植物に再生される。その植物細胞または植物材料は、Ｔ１またはそれ以降の形質転換体に由来し得る。この植物は、好ましくは、誘導性のＢＢＭ導入遺伝子についてホモ接合性であるが、ヘテロ接合性であってもよい。
【００６９】
再生は、形質転換された植物細胞または植物材料を、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導に適した薬剤を含む培地と接触させることによって達成することができる。
【００７０】
Ｔ１またはそれ以降の植物は、活性を誘導することができるＢＢＭタンパク質を含むので、それぞれの抵抗性植物は、ＢＢＭが活性化されると再生可能になる。これにより、形質転換された植物細胞または植物材料は、さらなる目的のヌクレオチド配列、特に、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む別のヌクレオチド分子で形質転換することができ、そしてこの植物材料を成熟トランスジェニック植物に再生する可能性が開ける。この第２の目的のヌクレオチド配列は、目的の配列に対するＲＮＡｉ配列もしくはアンチセンス配列、過剰発現配列、機能獲得配列、または他の任意の目的の配列を含み得る。活性を誘導することができる外来性ＢＢＭタンパク質が存在することに起因して再生能力のある抵抗性植物を得ることは、本質的に任意の目的のヌクレオチド配列または遺伝子を用いて、ここで初めて効率的に形質転換されて成熟するまで再生することが可能なアマトウガラシについて、特に興味深い。したがって、この実施形態において、その方法は、本明細書中で意味されるような同時形質転換系として使用される。
【００７１】
あるいは、誘導性かつ外来性のＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物は、本明細書中で意味されるようなＢＢＭの誘導に適した薬剤を含む栽培培地と接触すると、多数の体細胞胚を発生するので、誘導性のＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞または植物材料の再生は、植物を増殖させる目的のために使用することができる。好ましくは、この培地は、さらにより多くの体細胞胚が望まれるとき、適当量のサイトカイニン（例えば、チジアズロン、ゼアチンまたは６−ベンジルアミノプリン）も含む。子葉外植片の表面上における明らかに識別可能な体細胞胚の数は、少なくとも１００を超えることが見出されたので、これらの胚を単離すること、およびそれらを出芽させてさらに成熟トランスジェニック植物に成長させることが可能である。増殖させることができるこの植物材料は、好ましくは、外植片、特に、子葉外植片から得られる。
【００７２】
さらに、体細胞胚から得られた植物材料を生育させるかまたは成熟させることによる材料または細胞は、再生中にＢＢＭを誘導することによって別の回の増殖に供されてもよく、それにより、そこから体細胞胚が提供される。
【００７３】
本発明の最後の態様は、植物材料を形質転換して成熟トランスジェニック植物に再生するための、ヌクレオチド分子の使用であって、その植物材料は抵抗性植物を起源とし、そのヌクレオチド分子はＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、そのＢＢＭタンパク質は配列番号１と少なくとも５０％、６０％、７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、なおもより好ましくは、少なくとも９５％、および最も好ましくは、少なくとも９８％の同一性を有することを特徴とするか、またはそのＢＢＭタンパク質は、配列番号１を特徴とする、使用に関する。
【００７４】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、ＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントに作動可能に連結される。
【００７５】
本発明のこの態様の別の好ましい実施形態において、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントは、転写活性化因子、翻訳アクチベータ、または好ましくは核標的化系からなる群から選択される。
【００７６】
本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施形態において、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントは、配列番号２である。
【００７７】
本発明のこの態様の最後の好ましい実施形態において、抵抗性植物は、ナス属、ペチュニア属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、ブタンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属、エンドウ属およびトウガラシ属からなる群から選択され、特に、ナス科の植物、より詳細には、アマトウガラシのカプシカム・アンナム植物である。
【００７８】
本願では、以下の図面が参照される：
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、様々な植物種由来のＢＢＭタンパク質の系統樹を示している。
【図２】図２は、カルス形成した３週齢の外植片を明示している。
【図３】図３は、コントロールのカルスおよびＳＬＳの形成を明示している。
【図４】図４は、３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲで形質転換された外植片におけるＳＬＳにおける体細胞胚の形成を明示している。
【図５】図５は、伸長しているシュートを明示している。
【図６】図６は、発根したシュートを明示している。
【図７】図７は、トランスジェニックレッドブロッキーを明示している。
【図８】図８は、トランスジェニックイエローブロッキーを明示している。
【図９】図９は、トランスジェニック植物の種子を示している。
【図１０】図１０は、Ｋｍ含有培地上の分離した子孫を示している。
【図１１】図１１は、分離したトランスジェニック植物の表現型を示している。上段は、Ｋｍ耐性苗木を示しており、下段は、Ｋｍ感受性苗木を示している。
【図１２】図１２は、コントロールまたは３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲで形質転換された子葉外植片がカルス、シュート様構造（ＳＬＳ）およびシュートを形成したパーセンテージを示している。
【図１３】図１３は、トランスジェニックトウガラシ植物において行われたＰＣＲの結果のゲルを表している。レーン：Ｍ，分子マーカー；Ｐ，３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲプラスミドＤＮＡ；Ａ，非トランスジェニックアラビドプシス；Ａ＋，トランスジェニックアラビドプシス；Ｃ，非トランスジェニックトウガラシ；Ｃ１〜４，別個のトランスジェニックアマトウガラシ；Ｃ５〜８，同じ外植片に由来するトランスジェニックトウガラシのシュート。
【図１４】図１４は、Ｗ１３８バックグラウンドのトランスジェニックペチュニアのシュート再生を明示している。
【図１５】図１５は、Ｗ１３８バックグラウンドのトランスジェニックペチュニアのシュート再生を明示している。
【図１６】図１６は、配列番号１を示している。
【図１７】図１７は、配列番号２を示している。
【図１８】図１８は、配列番号３を示している。
【図１９】図１９は、核転写性のベビーブーム（ｂａｂｙｂｏｏｍ）の活性を誘導した後の、３５Ｓ：：ＢＢＭ：：ＧＲを含むアマトウガラシトランスジェニック系統のＴ１子孫における傷の部位の周縁部における体細胞胚の形成を明示している。
【実施例】
【００８０】
本発明は、本発明の範囲を決して限定することを意図していない以下の実施例によってさらに例証される。
【００８１】
実施例１
ＢＢＭによるアマトウガラシの遺伝形質転換
配列番号１および配列番号２を含むカプシカム・アンナム種であるアマトウガラシ植物の遺伝形質転換。表現型的かつ遺伝子型的に異なる品種のＦｉｅｓｔａ、ＦｅｒｒａｒｉおよびＳｐｉｒｉｔ由来の植物を使用した。
【００８２】
ドナー植物の生育
Ｆ１雑種であるＦｉｅｓｔａ、ＦｅｒｒａｒｉおよびＳｐｉｒｉｔ（Ｅｎｚａ Ｚａｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の表面滅菌した種子を、０．８％Ｍｉｃｒｏａｇａｒ（Ｄｕｃｈｅｆａ）を用いて凝固した、２％スクロースが添加されたフルストレングスのＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６２）の上に播種した。１０日齢の子葉を３〜１０ｍｍの外植片に切り出し、２３℃の薄明条件下において１〜２日間、共培養培地（ＣＣＭ）上で前培養した。ＣＣＭは、０．７％Ｍｉｃｒｏａｇａｒを用いて凝固した、１．６％グルコースおよび２ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド、０．１ｍｇ／Ｌインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）または０．２５〜１ｍｇ／Ｌチジアズロン（ＴＤＺ）、１０μＭデキサメタゾンが添加された改変Ｒ培地を含む。独立して反復された６〜１０回の実験において、コンストラクト１つあたり平均２００個の外植片を使用した。
【００８３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスの生育
アグロバクテリウム・ツメファシエンスの系統ＧＶ３１０１＋ｐＭＰ９０（３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲ（翻訳段階で糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）（配列番号２）に融合されるＢＢＭコード配列（配列番号１）に作動可能に連結された３５Ｓプロモータを含む）、３５Ｓ：：ＢＢＭ（ＢＢＭコード配列の配列番号１に作動可能に連結された３５Ｓプロモータを含む）を有する）または３５Ｓ：：ＧＵＳを有するコントロールプラスミドを、１００ｍＬのＹＥＢ培地（０．５％酵母エキス、０．５％牛肉エキス、２％スクロース，ｐＨ７．２）中の適切な抗生物質、リファンピシン（１００ｍｇ／Ｌ）、硫酸カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）および／またはゲンタマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）の存在下、２８℃において一晩培養物として生育した。植物を形質転換する前に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を、新しく調製された４０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン（Ｓｉｇｍａ）が添加された液体ＣＣＭでＯＤ６６０ ０．３〜０．４に希釈した。
【００８４】
植物材料の遺伝形質転換
希釈されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス培養物を前培養された外植片に加え、室温で３０〜６０分間インキュベートした。吸い取らせて外植片を乾燥させ、４０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンが添加されたＣＣＭ上で２３℃の薄明条件下において２〜３日間さらに同時培養した後、１００ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンおよび５００ｍｇ／Ｌセフォタキシムが添加されたＣＣＭからなる選択培地に移した。
【００８５】
トランスジェニック植物材料の再生
外植片を２３℃、１６／８時間の昼／夜体制の明光条件に２ヶ月間移した（４週間後に１回継代した）。シュート様構造が出現した外植片を、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ １９６２）のマクロ塩とマイクロ塩との混合物、Ｂ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇ Ｏ．Ｌ．１９６８）に従うビタミン類、１．６％グルコース、１ｍｇ／Ｌイノシトール、２０ｍｇ／Ｌ硫酸アデニン、２００ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物、１０ｍｇ／Ｌ ＧＡ３、４ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、３０μＭチオ硫酸銀、１００ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンおよび５００ｍｇ／Ｌセフォタキシムからなる伸長培地（ＥＭ）に４週間にわたって移した。伸長したシュートを、３０ｍｇ／Ｌグルタチオン、６０ｍＬ／Ｌ硫酸カナマイシンおよび３００ｍｇ／Ｌセフォタキシムが添加された改変ＭＳ培地である前発根（ｐｒｅ−ｒｏｏｔｉｎｇ）培地（ＰＲＭ）に２ヶ月間にわたって移し、次いで、１ｍｇ／Ｌ ＩＡＡを含むかまたは含まない、２％スクロース、５０ｍｇ／Ｌセフォタキシムおよびバンコマイシンが添加されたＲｕｇｉｎｉ培地からなる発根培地に移した。発根したシュートを温室に移すことにより、結実させた。組織培養に関するすべての化学物質は、Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈａａｒｌｅｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって供給されたものである。
【００８６】
トランスジェニックシュートの分析
ＣＴＡＢミニプレップ法によりＤＮＡを葉から単離し、５０μＬのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。ＢＢＭ特異的プライマーを、公開されているｃＤＮＡ配列（ＡＦ３１７９０４および−９０５）に基づいて設計した。ＢＢＭｆｗ：ｇｔｔａｇｇｙｔｔｙｔｃｔｃｔｍｔｃｔｃｃ，ＢＢＭｒｗ：ｇｇｇｃｔｇｃａａａｔｃｃｔｔｇａｔａａｃｃａ。形質転換されるプラスミドおよびトランスジェニックアラビドプシス系統からのＤＮＡをコントロールとして使用した。供給業者のプロトコールに従って、ＰＣＲ混合物を使用した。ＰＣＲ条件：１５秒間９４℃；３０秒間４８℃：４５秒間７２℃；３５サイクル。結果を図１３に示す。
【００８７】
トランスジェニック子孫の分析
各個別のトランスジェニックシュートを自家受粉させ、また、元のドナー系統由来の植物と交配することにより、導入遺伝子の遺伝を分析した。回収した後の種子の表面を滅菌し、その種子をＭＳ培地、２％スクロース、０．８％ｍｉｃｒｏａｇａｒおよび２００ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンまたは１００ｍＬ／Ｌ硫酸パロモマイシンの上に播種した。播種の４週間後に分離を評価した。
【００８８】
結果
全体では、３つの栽培品種の１００００個を超える外植片をコントロールコンストラクトまたはＢＢＭコンストラクトとともに共培養した。選択培地上での培養の最初の３週間は、すべての外植片のサイズが大きくなり、薄緑色または白っぽい小さいカルスが目で見えるようになった。さらに２週間後、使用したサイトカイニンのタイプに応じて、カルス形成および／または直接のシュート形成が切断表面に生じた。ＴＤＺの存在下においては、外植片は複数のシュート様構造（ＳＬＳ）を形成したが、ゼアチンリボシドは、主にカルスおよび少数のＳＬＳを誘導した（図２および３）。この段階において、３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲで形質転換された外植片は、コントロールよりも多いＳＬＳを生成した。ＥＭ培地に移した後は、３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲのＳＬＳだけが増殖し、次の３〜４週間以内に初生葉上にシュートまたは体細胞胚を形成した（図４および５ならびに表２）。適切なシュートの発生、伸長および形成のすべてが、ＰＲＭに移した後に促進された。伸長したシュートを発根培地に移した後、その移した後の２週間以内に根の形成が起きた。形質転換の６ヶ月後、発根したシュートをロックウールブロックに移し、種子生成のために温室条件に馴化させた。
【００８９】
【表２】
【００９０】
表２は、２つのＢＢＭコンストラクトを用いたときの再生の比較を示している。
３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲコンストラクトによる形質転換によってトランスジェニックシュートが生成されたが、コントロールからは生成されなかった。選択された条件下において、コントロール形質転換は、シュート様構造（ＳＬＳ）またはシュートではなくカルスの生成を示した（図１２）。試験された３つの系統のうち、Ｆｉｅｓｔａが最も高い再生能を示し（４８％）、それにＳｐｉｒｉｔ（３，４％）およびＦｅｒｒａｒｉ（１，７％）が続いた（表３）。温室条件に馴化させた後、植物は、急速に生育し、花成したが、形質転換されていないコントロール植物よりも約３０％短いままだった。自殖および他殖が成功したことから、稔性は形質転換および再生のプロセスの影響を受けなかったことが示された。
【００９１】
体細胞胚形成の開始により、トランスジェニック植物の複数のシュートが形成された（図５）。いくつかの独立した形質転換実験から得られたＦｉｅｓｔａおよびＦｅｒｒａｒｉ由来の合計２０個を超える独立したトランスジェニック植物が作出された。同じ外植片から得られた独立したＴ０植物におけるＰＣＲによる分子分析は、すべてのシュートがトランスジェニックであること、および形質転換１回あたりに使用された最初の外植片数から計算された全体の形質転換効率が０．５〜１％で変動し得ることを示した。
【００９２】
分離比分析から、導入遺伝子がメンデルのパターンに従って遺伝することが示された（表４）。
【００９３】
【表３】
【００９４】
表３は、３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲで形質転換された後の種々の品種のシュート形成のパーセンテージを示している。
【００９５】
【表４】
【００９６】
表４は、選択培地上で生育された、自家受精した成熟トランスジェニック植物からの子孫の分離比分析を示している。
【００９７】
考察
結果から、誘導性の過剰発現されたＢＢＭ遺伝子を使用することによって、トランスジェニックアマトウガラシ植物の良質のシュートを直接または体細胞胚形成を介して再生することができること、および導入遺伝子が次世代に遺伝されることが示された。
【００９８】
トウガラシの種および品種における、正常植物への再生に至る体細胞胚形成の誘導は、集中的に研究されている。しかしながら、アマトウガラシでは、体細胞胚の誘導は可能であったが、胚は、頂端分裂組織を欠き、正常植物に成長しなかった。再生プロセス中にＢＢＭ遺伝子を活性化することにより、稔性アマトウガラシ植物を再生することができた。
【００９９】
実施例２
ＢＢＭによる抵抗性ペチュニアＷ１３８の遺伝形質転換
ペチュニアのＷ１３８系統は、再生およびその後のトランスジェニック植物の作出に対して抵抗性であることが証明されている。
【０１００】
成熟トランスジェニックペチュニア植物を得る目的で、Ｗ１３８の外植片を、ペチュニア形質転換に対する標準的なプロトコールを用いて形質転換した。
【０１０１】
Ｗ１３８バックグラウンドの２系統（ＮＣ２６７６−１０、ＮＣ２６７６−１１）およびＷ５バックグラウンドの１系統（２９３）を誘導性のＢＢＭコンストラクト（３５Ｓ：：ＢＢＭ：：ＧＲ）またはコントロールＴ−ＤＮＡコンストラクト（この場合はＧＵＳレポーター遺伝子を含む）で形質転換した。両方のコンストラクトによって３つすべての系統からカナマイシン耐性カルスを得た（最も高い効率はＮＣ２６７６−１１であり、それに２９３が続いた）。コントロールコンストラクトのカルスは、強いＧＵＳ発現を示した。
【０１０２】
シュート様構造（ＳＬＳ）および原基が、まずＮＣ２６７６−１１系統に見られ、続いて同じ順序で他の系統においても見られたが、しかしながら、さらなる成長および生長は、３５Ｓ：ＢＢＭ：：ＧＲで形質転換されたカルスでしか観察されなかった（図１４および１５）。
【０１０３】
アマトウガラシにおけるように、ＢＢＭの過剰発現によって、抵抗性植物においてもトランスジェニックシュートが形成される。
【０１０４】
実施例３
３５Ｓ：：ＢＢＭ：：ＧＲ系統の子孫の分析
複数の３５Ｓ：：ＢＢＭ：：ＧＲ系統のホモ接合性Ｔ１子孫を、ＴＤＺ、ＤＥＸおよび／またはＴＤＺならびにＤＥＸをさらに含む共培養培地またはコントロールとしてＴＤＺ／ＤＥＸを含まない共培養培地上でインビトロにおいて生育した。
【０１０５】
ホモ接合性３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲ系統由来の子葉外植片の培養から、核によって誘導されるＢＢＭタンパク質および核によって誘導されないＢＢＭタンパク質によって引き起こされる成長の差異が明らかになった。横方向に切断された子葉の周縁部において、体細胞胚が形成される（図１９）。これらの作用は、ＤＥＸを含まない培地上で生育された子葉外植片からは観察されなかった。
【０１０６】
本明細書中の結果は、調節された外来性ＢＢＭの発現を用いることにより、トランスジェニックアマトウガラシの高品質の形態学的に正常なシュートを生成することができることを示す。そのような体細胞胚は、実際に、接合胚と著しい類似性を有した。現実に、トウガラシ子葉に対して多数（＞１００）の体細胞胚を誘導することができた。トウガラシ外植片において確認することができた多量のそのような胚は、組織培養において成熟アマトウガラシ植物を作出する際に少なくとも１００倍の増殖率に到達するには十分である。この知見により、維持系統を使用する必要なく、雄性不稔のアマトウガラシ植物を増殖することも可能である。
［参照文献］
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抵抗性（ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ）植物である成熟トランスジェニック植物を提供するための方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法によって入手可能な、成熟トランスジェニック植物、植物材料、子孫、植物の一部、種子またはそれらのクローンに関する。本発明はまた、同時形質転換系としての本発明の方法に従って入手可能な成熟トランスジェニック植物またはその植物の一部の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝形質転換は、生命科学の分野において使用される方法論であり、同様に多くの目的のために様々な生物において使用される方法論でもある。この技術は、生命科学研究の多くの領域において大きな意味を有していたし、今も有している。この技術の１つの態様は、それを用いることにより、個別のヌクレオチド分子（例えば、遺伝的エレメントおよび／または遺伝子）またはそのようなヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質の機能を同定することができることである。得られる遺伝子改変生物は、基礎研究もしくは応用研究において使用することができるか、または産業上の利用において使用することができる。
【０００３】
遺伝形質転換は、目的のヌクレオチド分子を受け手側の（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）植物種に移すことができるので、植物科学の分野において強力な技術であり得る。そのようなヌクレオチド分子は、プロモータ、遺伝子、ターミネータ、タンパク質機能の遺伝子のリプレッサまたはエンハンサなどを含み得る。
【０００４】
遺伝形質転換は、例えば、目的のタンパク質を受け手側の植物に付加することに関する作用を研究することを意図して使用され得る。そのような場合、通常はより大きなヌクレオチド分子の一部である目的のタンパク質をコードする遺伝子が、受け手側の植物に導入される。
【０００５】
遺伝子改変植物を得るために、形質転換、その後の再生、およびそれに続いて、形質転換されて再生された植物材料を成熟トランスジェニック植物に成長させることを含む方法を適用することができる。そのような方法は、形質転換段階および再生段階と、その後の成熟トランスジェニック植物へのさらなる成長との両方に対して応答性である特定の植物種にだけ首尾よく適用することができる。そのような植物種としては、例えば、アラビドプシス・サリアーナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）またはブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）が挙げられる。
【０００６】
形質転換では、目的のヌクレオチド分子が、植物細胞に導入される。再生では、形質転換された植物材料を、カルス組織などのかなり未決定の構造から植物器官（例えば、葉様構造、シュート様構造または体細胞胚）に成長させ、そこから成熟トランスジェニック植物を得ることができる。
【０００７】
その形質転換の段階は、植物細胞または植物材料を、目的のヌクレオチド分子を有するＴｉ（腫瘍誘導）プラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細菌と接触させる工程を含み得る。そのＴｉプラスミドは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによって宿主植物に移されるＤＮＡセグメント；Ｔ−ＤＮＡエレメントを少なくとも含む。そのＴ−ＤＮＡエレメントは、ＤＮＡ反復配列、いわゆる左境界配列および右境界配列に隣接している。遺伝子操作によって、目的のヌクレオチド分子を、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左境界配列と右境界配列との間に入れることが可能である。植物細胞または植物材料をアグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌と接触させることにより、少なくとも目的のヌクレオチド分子を含むＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡエレメントが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌から植物細胞に移動し、その植物細胞において、そのエレメントは、核ゲノムまたはオルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体由来のゲノム）に安定的にインテグレートされる。他の形質転換の方法を植物材料に適用してもよい。
【０００８】
巨視的な観点から適当な再生を考えるとき、植物細胞または植物組織の再生によって、シュート様構造または葉様構造を発生することができる無定形の細胞塊（すなわちカルス）が発生することがある。通常、必要であれば適当な植物ホルモンの影響下において、そのような構造から伸長した茎が発生し得る。続いて、そのような構造は、必要であれば１つまたはそれ以上の適当な発根誘導剤の影響下において、根系の形成を開始し、それにより、さらなる成長を持続するために適した発達した根系を発達させる。続いて、発生段階の進んだ適当な植物材料が、インビトロからエキソビトロ環境に移植され得る。その植物は続いて、成熟トランスジェニック植物を得ることが可能な適当な条件下においてエキソビトロで（例えば、土壌、バーミキュライト、ロックウールなどの上で）生育される。この再生手順は、この全体的な概念の追加工程または代替工程を含んでもよい。あるいは、再生は、成熟植物に生育させることができる可能性のある体細胞胚の形成によって進めてもよい。
【０００９】
形質転換および再生のそのような方法は、好ましくは、出発材料としての若い体細胞性植物組織、培養細胞（例えばプロトプラスト）または器官に適用される。そのような組織（例えば、若い植物組織の外植片または苗木由来の植物材料の小片）は、分化または決定の程度が様々である細胞を含む。そのような組織に存在する細胞集団の分化のレベルまたは程度が様々であり不均一であることにおそらく起因して、そのような組織は、再生処理の最初の段階に特に応答性である。
【００１０】
ある特定の植物または植物種だけが、形質転換および再生の方法に応答性であると示されている。比較的単刀直入な方法でそのような植物を形質転換して再生する既存の方法を適用することが可能である。逆に、他の植物または植物種がそのような形質転換および再生の方法に対して無応答性であることが明白になっている。そのような植物は、適当な様式で再生せず、そして／または成熟植物に再生させることが全くできない。そのような植物、植物品種または植物栽培品種は、「抵抗性」または「再生不能（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」と呼ばれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
どの基本的な分子もしくは生理学的因子が関与しているか、または植物が抵抗性になるか否かを決定するかは、ほとんど知られていない。このことから、多種多様の植物種に適用することができる信頼できる植物特異的な形質転換方法および再生方法を開発する必要性が現在あることが示唆される。実際に、成熟トランスジェニック植物を効率的に提供するための適当な形質転換方法および再生方法は、いくつかの種またはいくつかの種の栽培品種に対してしか開発されていない。
【００１２】
抵抗性植物が形質転換方法および再生方法に供され、成熟トランスジェニック植物に成長するとき、種々の多くの問題が観察されており、克服できないことが見出されている。そのような問題は、供される植物細胞または植物材料由来の植物細胞を形質転換することができないことを含む。または、形質転換を達成することができた場合でも、そのような形質転換された材料は、形質転換された成熟植物に成長しない可能性がある。形質転換された細胞または植物材料は、ある特定の成長段階まで再生し、異常な挙動（例えば、変更されたもしくは異常な生育、成熟前での成長の終結、大幅に遅れた成長、または不正確な成長）を示し得る。また、偽陽性植物の形成が起きることも知られている。そのような形質転換されていない植物材料は、選択薬剤の圧力から逃れることがあり、成熟植物に再生することがある。
【００１３】
さらに、上記方法の適用性、信頼性および適合性に関して以下の問題が知られている。再現性に問題がある場合がある；上記方法の成果は、予測不可能である場合があり、産業的環境における適当な用途のためには、シュート、根または小植物を再生する量が少なすぎる場合がある；上記方法は、単一の植物種または所与の植物種の特定の栽培品種群にしか適用できない；上記方法は、ハイスループットまたはルーチンの用途に適していない可能性がある；上記方法は、適当な適用性のために特定の細菌株に依存し得る。そのような方法は、コスト効率の高い産業上の用途にとって適当でないことは明らかであり得る。それゆえ、抵抗性植物種に適用することができる、成熟トランスジェニック植物を提供するための効率的で信頼できる方法が必要とされ続けている。
【００１４】
ゆえに、本発明の目的は、形質転換段階および再生段階を含む、抵抗性植物である成熟トランスジェニック植物を得るための方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、本発明の方法によって入手可能なトランスジェニック植物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
とりわけ上記の目的は、添付の請求項に定義される方法によって提供される。
詳細には、本発明は、成熟トランスジェニック植物を提供するための方法であって、その方法は、植物細胞または植物材料を形質転換して再生する工程を含み、その植物細胞または植物材料がＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子で形質転換され、そのＢＢＭタンパク質の活性が形質転換中および／または形質転換された植物細胞もしくは植物材料の再生中に誘導され、その植物細胞または植物材料が抵抗性植物を起源とする、方法に関する。
【００１６】
本発明に至る研究によって、アマトウガラシおよびペチュニアＷ１３８などのいくつかの抵抗性植物を起源とする植物材料が、形質転換中および再生中にＢＢＭを誘導することによって成熟トランスジェニック植物に再生させることができるのに対し、これらの段階においてＢＢＭを誘導しないと、そのような植物は成熟トランスジェニック植物に成長しないことが見出された。当該分野および本明細書中における抵抗性植物は、そのような植物を起源とする植物材料が応答性植物にとって適当な形質転換および再生の手順に供されるとき、本質的に成熟トランスジェニック植物に再生および成長しない植物である。そのような方法の基本原理は、植物ホルモン、好ましくは、オーキシン、サイトカイニンまたはジベレリン酸だけでなく、アブシジン酸、エチレンまたはそれらの阻害剤も含む培地と接触した形質転換された植物材料が、応答性植物の場合のように、形質転換された植物材料の再生を可能にすることである。本明細書中の抵抗性植物は、そのような任意の条件下において成熟トランスジェニック植物に成長できない植物である。
【００１７】
かなり多数の抵抗性植物、特に、経済的に重要な植物種、作物または品種に属する抵抗性植物は、再生を用いて成熟トランスジェニック植物を提供するのに適した方法を開発することを目指した広範囲の研究の対象である。従来技術の方法を用いてそのような植物由来の植物材料を形質転換して成熟トランスジェニック植物に再生しようと試みるときに遭遇する多くの種々の問題とあわせて、アマトウガラシなどの抵抗性植物が成熟トランスジェニック植物に再生できないとよく知られていることを考えると、本発明の効率は驚くべきものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の利点は、明らかに抵抗性植物由来の植物細胞または植物材料を、１つまたはそれ以上の生物学的に活性な薬剤（例えば、植物ホルモン、または植物ホルモンの作用を模倣する物質）を加えることによって助けられても、または助けられなくても、成熟トランスジェニック植物に成長させることができる点である。そのような生物学的に活性な薬剤が使用されるとき、それらは形質転換された植物材料を培養する培地に加えられ、それにより、トランスジェニック植物材料が成熟トランスジェニック植物に成長することを可能にすることができる。そのような生物学的に活性な薬剤をＢＢＭの活性が誘導されていない植物細胞または植物材料に加えても、そのような植物細胞または植物材料は成熟トランスジェニック植物に再生できなかった。
【００１９】
本発明の別の利点は、形質転換段階および／または再生段階におけるＢＢＭ活性のタイミングを調節する可能性を含む。ＢＢＭの時間的活性を調整することにより、本発明によって抵抗性植物から入手可能な成熟トランスジェニック植物の質または量のさらなる最適化が可能になり得る。
【００２０】
本発明のさらなる利点は、生殖生長段階を通じて、形質転換された植物材料の適当な成長を確実にする可能性に関する。植物の成長の生殖生長期の間のＢＢＭタンパク質の不適当な発現および／または活性を防ぐことによって、部分不稔または完全不稔に関する問題を回避することができるかまたは軽減することができる。
【００２１】
本明細書中の再生は、形質転換された植物細胞が体細胞胚、葉様構造またはシュート様構造に成長していくことを含む。その後の段階において、そのような植物組織は、さらに成熟トランスジェニック植物に成長することができる。
【００２２】
したがって、本発明は、形質転換中および再生中にＢＢＭを活性化することによって抵抗性植物を起源とする植物材料から成熟トランスジェニック植物を効率的に得ることを初めて可能にする。本明細書におけるＢＢＭ活性とは、形質転換された宿主植物の遺伝子の転写に対する、形質転換されたＢＢＭの発現の作用のことを意味する。ＢＢＭは、転写因子であるので、その活性は、１つまたはそれ以上のＢＢＭ標的遺伝子の転写に影響することを含む。ＢＢＭの活性化は、誘導された際にＢＢＭが核に局在化されるようになることを可能にすることだけでなく、その転写または翻訳を誘導することによっても、達成することができる。ＢＢＭの活性化により、ＢＢＭが調節性のヌクレオチド配列および／またはタンパク質配列に直接的または間接的に結合することによってその標的遺伝子の転写の誘導または抑制が引き起こされることが考えられる。ＢＢＭ活性の基礎をなすメカニズムに関係なく、発現コンストラクトから発現されたＢＢＭタンパク質の活性が誘導された結果は、形質転換および再生に供された抵抗性植物を起源とする植物材料が、成熟トランスジェニック植物に成長することができるということである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書における「成熟トランスジェニック植物」とは、生存可能な子孫を与えることができる少なくとも１つの生殖器官、好ましくは、より多くのそのような器官（例えば、種子を含む果実）を生成する進んだ発生段階に達した植物のことを意味する。本明細書中の用語「成熟植物」は、用語「稔性植物」と交換可能である。そのような生殖器官は、有性生殖器官（例えば、花）または栄養生殖器官（例えば、塊茎、匍匐枝、根茎、球茎、小鱗茎または鱗茎）であり得る。本明細書中に記載されるような生殖器官から生存可能な子孫をもたらすことができる、本発明に従って得ることができる成熟トランスジェニック植物が、特に興味深い。
【００２４】
本明細書において、花は、単性であり得る、すなわち、少なくとも雄性生殖器官（雄ずい群）もしくは少なくとも雌性生殖器官（雌ずい群）のいずれかを有し得るか；または本明細書において、花は、両性であり得る、すなわち、少なくとも１つの雄性生殖器官および少なくとも１つの雌性生殖器官を有し得る。
【００２５】
本明細書において、花は、好ましくは稔性であるが、機能的な卵細胞または機能的花粉のいずれかを含むこともできる。稔性の花の場合、そのような花は、その後生存可能な子孫をもたらす、機能的花粉および１つまたはそれ以上の機能的な卵細胞を有する。機能的花粉および１つまたはそれ以上の機能的な卵細胞を有する花は、自家受精だけでなく他家受精によっても１つまたはそれ以上の種子を生成することができる。機能的な卵細胞または機能的花粉のいずれかを含む花の場合、そのような花は、自家受精によって種子を生成しないが、他家受精によって種子を生成することができる。したがって、そのような花は、雄性不稔または雌性不稔であり得る。しかしながら、雄性不稔の花は、別の花の機能的花粉によって受精され得る。雌性不稔の花の花粉を用いることにより、別の花を受精させることができる。そのような花の雄性不稔は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）、胞子体型自家不和合性、配偶体型自家不和合性または他の任意の不稔系の結果であり得る。上記の生物学的用語は、それらの分野において認識されている意味において使用される。
【００２６】
成熟トランスジェニック植物をもたらすことができる最初の形質転換された植物材料から外植片を得ることも可能性として考えられる。最初の形質転換体の外植片から得られるそのような成熟トランスジェニック植物もまた、本発明に記載の、および本発明の方法によって直接得られた生成物としての、成熟トランスジェニック植物の意味の範囲内に入る。
【００２７】
本明細書中の用語「植物細胞」とは、植物または植物材料から得られる任意の細胞のことを指す。プロトプラストまたは液体懸濁液などからの任意の細胞のことも意味する。
【００２８】
本明細書中の用語「植物材料」とは、植物の任意の構造、組織または器官から得られる任意の外植片、小片または切り取ったもののことを指す。本明細書における植物材料は、植物の任意の組織または器官のことも指すことがある。前記外植片、小片または切り取ったものが由来する前記植物組織または植物器官は、子葉、胚軸、上胚軸、種子、カルス、葉、根、シュート、花、葯、花粉、胚珠、卵細胞、果実、分裂組織、原基、花序、葉柄、プロトプラスト、シンク組織、ソース組織、苗木、シンク器官、ソース器官、塊茎、接合子胚、体細胞胚、または半数体の倍加半数体に由来する胚を含む。また、この点において、単細胞培養物、懸濁液、雄性発生（ａｎｄｒｏｇｅｎｉｃ）培養物、雌性発生（ｇｙｎｏｇｅｎｉｃ）培養物などの細胞培養物も含まれる。特に、植物材料という用語は、苗木由来の組織（例えば、子葉またはその小片）のことを指す。
【００２９】
本明細書中の用語「形質転換する」とは、ヌクレオチド分子（例えば、発現ベクターまたは発現コンストラクト）を受け手側の植物細胞に導入する方法のことを指す。そのような形質転換手順は、遺伝子もしくはタンパク質または別の遺伝的エレメント（例えば、プロモータ、エンハンサ、ターミネータなど）の機能を解明するために用いることができる。そのヌクレオチド分子は、好ましくは、植物から得られたものであるか、または植物から得られたヌクレオチド配列に基づくものである。そのヌクレオチド分子はまた、合成の起源のものでもあり得る。そのヌクレオチド分子は、細菌ベクター（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（例えば、Ｂｅｎｔ，２０００を参照のこと）または植物の形質転換に適した別の細菌（例えば、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５を参照のこと）を使用することによって植物細胞に導入することができる。その形質転換手順は、粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、機械的注入、または本発明における使用に適した他の形質転換手法も含み得る。そのような技術のすべてが、当業者に公知であり、本発明を実施するために器用な技能を行うことなく適用され得る。
【００３０】
本発明の別の態様は、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、チューリップ属（Ｔｕｌｉｐａ）、ユリ属（Ｌｉｌｉｕｍ）、サフラン属（Ｃｒｏｃｕｓ）、アヤメ属（Ｉｒｉｓ）、グラジオラス属（Ｇｌａｄｉｏｌｕｓ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）、ブタンソウ属（Ｂｅｔａ）、アカザ属（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）からなる群から選択される植物、特にナス科（Ｓｏｌａｎｅｃｅａｅ）由来の植物に由来する植物細胞または植物材料に関する。本発明は、より具体的には、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）種、ペチュニア・ヒブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）種、チューリップ属の種（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ）、ユリ属の種（Ｌｉｌｉｕｍ ｓｓｐ）、サフラン属の種（Ｃｒｏｃｕｓ，ｓｓｐ）、アヤメ属の種（Ｉｒｉｓ ｓｓｐ）、グラジオラス属の種（Ｇｌａｄｉｏｌｕｓ ｓｓｐ）、スピナセア・オレラセア（Ｓｐｉｎａｃｅａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ベータ・バルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ケノポディウム・クイノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）、ファセオラス・バルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ファセオラス・コシネアス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、ピスム・サティブム（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）およびカプシカム・アンナム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、特に、アマトウガラシであるカプシカム・アンナム植物に関する。これらの植物種および／またはいくつかの植物種のいくつかの栽培品種、品種もしくはタイプは、周知のこととして抵抗性であり、形質転換および／または成熟トランスジェニック植物への再生を行い難い。
【００３１】
本発明は、特に、抵抗性ジャガイモ（ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））のタイプまたは品種、ペチュニア（ペチュニア・ヒブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ））のタイプまたは品種（例えば、Ｗ１３８）、およびより詳細には、アマトウガラシ（カプシカム・アンナム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ））のタイプまたは品種（少なくともアマトウガラシの場合、当業者によって、周知のこととして抵抗性であると考えられており、知られている）に関する。
【００３２】
カプシカム・アンナム種は、果実の食味に基づいて２つの群、すなわち、アマトウガラシ（またはシシトウ）タイプおよびトウガラシ（ｈｏｔ ｐｅｐｐｅｒまたはｃｈｉｌｉ ｐｅｐｐｅｒ）タイプに分類される。アマトウガラシタイプの群は、辛味でない甘味のある果実をつけるトウガラシ植物を含む。そのような果実は、果実のより進んだ成熟レベルでは、その果実中に低レベルのカプサイシン（８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネンアミド）を有する。本明細書においてアマトウガラシの群は、ブロッキー（ｂｌｏｃｋｙ）、ベル（ｂｅｌｌ）、ラムヨ（ｌａｍｕｙｏ）、パプリカ（ｐａｐｒｉｋａ）、ハンガリアン・パプリカ（Ｈｕｎｇａｒｉａｎ ｐａｐｒｉｋａ）、ニューメキシカン・パプリカ（Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃａｎ ｐａｐｒｉｋａ）、スカッシュペッパー（ｓｑｕａｓｈ ｐｅｐｐｅｒ）、スパニッシュ・パプリカ（Ｓｐａｎｉｓｈ ｐａｐｒｉｋａ）、ピミエント（ｐｉｍｉｅｎｔｉｏ）、イタリアン・フライング（Ｉｔａｌｉａｎ ｆｒｙｉｎｇ）、ジャパニーズ・スイート（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｗｅｅｔ）、ビエジョ・アルガ・ダルセ（Ｖｉｅｊｏ ａｒｒｕｇａ ｄｕｌｃｅ）およびキューバン（Ｃｕｂａｎ）品種を含む（Ｄｅ Ｗｉｔｔ ＆ Ｂｏｓｌａｎｄ，１９９７）。
【００３３】
アマトウガラシは、高度に抵抗性のカプシカム・アンナムであると考えられている。アマトウガラシ植物が形質転換および再生を含む方法に供されたとき、以下の観察結果が報告されている。カルスから葉原基が形成されない；葉様構造が再生段階に進むことができない；再生中の組織にシュートが存在しない；シュート芽が伸長しない；シュート芽からシュート様テラトーマが発生する；頂端分裂組織が伸長しない；再生中のシュートの頂芽優性が低下する；選択圧下において生育されたカルスから非トランスジェニックシュートが再生する；再生中のシュートの稔性が低下する、適切な根系がトランスジェニックシュートから発生できない、または植物組織もしくは植物器官の生育が大きく遅れる。偽陽性植物、すなわち、選択圧下で植物の生育を可能にする必要な耐性付与遺伝子を含まない成熟非トランスジェニック植物の出現も知られている。したがって、従来技術は、成熟トランスジェニックアマトウガラシ植物を提供するための形質転換および再生の適当な、有効なまたは信頼できる方法を教示しないと言うことができる。本発明は、成熟トランスジェニックアマトウガラシ植物を得る方法が提供されるという利点を有する。
【００３４】
本発明に記載の方法を適用することにより、成熟トランスジェニックアマトウガラシ植物が提供され、特に、これらの植物から十分に成長したトウガラシ果実および生存可能な種子も提供される。さらに、本発明は、外来性ＢＢＭヌクレオチド配列を含む発芽する苗木を提供するために使用することができる。自家受精した成熟トランスジェニック植物の分離比分析から、導入遺伝子が次世代の子孫に遺伝されたことが実証された。いくつかの成熟トランスジェニック植物の子孫のメンデルの法則に従った分離は、単一の遺伝子座の存在に対応した。表４は、分離比分析の結果を表している。このように、本発明は、形質転換されたヌクレオチド配列を含む生存可能な子孫を生成する成熟トランスジェニックアマトウガラシ植物を提供した。
【００３５】
本発明の方法によって得られたトランスジェニックアマトウガラシの種子は、ＮＣＩＭＢ４１７３２番として寄託された。
【００３６】
本発明の別の態様は、配列番号１であるＢＢＭタンパク質、または配列番号１と少なくとも５０％、６０％、７０％、好ましくは、８０％、より好ましくは、９０％、なおもより好ましくは、少なくとも９５％の同一性および最も好ましくは、少なくとも９８％の同一性を有することを特徴とするＢＢＭタンパク質の機能的ホモログに関する。タンパク質がＢＢＭホモログであるか否かは、目的のタンパク質が、配列番号１のＢＢＭタンパク質ではなくＢＢＭ標的遺伝子のプロモータに結合されたレポーター遺伝子を同様に発現するか否かを評価することによって確認することができる。そのような標的遺伝子は、例えば、アクチン脱重合因子９（ＡＤＦ９；ＧｅｎｅＩＤ：８２９６４９、ＴＡＩＲ：ＡＴ４Ｇ３４９７０）を含む。
【００３７】
あるいは、候補遺伝子は、発現ベクターが前記ＢＢＭ候補タンパク質の誘導性の核転写活性を提供する候補ＢＢＭタンパク質をコードする発現ベクターを用いて、アマトウガラシ植物に形質転換されてもよい。アマトウガラシ植物由来の植物細胞に形質転換する際、その供された植物材料が１つまたはそれ以上の成熟トランスジェニック植物に成長することは、本発明に従って生じる。遺伝子またはタンパク質がＢＢＭの機能性ホモログであるかを本発明に従って確認することは、十分に当業者の能力の範囲内である。初期調査において、当業者は、研究所（例えば、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）または他の任意のそのような研究所）によって提供される最新の電子的な分子生物工学的ツールおよびデータベースを調べることができる。そのようなツールおよびデータベースは、任意の未知の遺伝子またはタンパク質が機能的なＢＢＭホモログであり得るか否かという任意の指摘が存在し得るかを迅速に評価する手段を当業者に提供する。そのような指摘は、関係するクレードまたは同じクレードにおける進化的保存および分類についてＢＢＭに関する未知配列の情報；未知配列が、ＢＢＭに関係する遺伝子またはタンパク質のクラス（例えば、ＡＮＴ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２を含むＡＰ２ファミリー）に属するか否か；ＡＰ２ドメインなどの特定のドメインを共有すること；そのような共有されるドメイン、単一のまたは反復のＡＰ２ドメインの数；ＢＢＭ様と呼ばれる配列などの遺伝子またはタンパク質の名称を含み得る。その結果として、調査の第２段階では、目的の配列が機能的なＢＢＭホモログであるかを確かめるために、限られた数の遺伝子またはタンパク質だけが、抵抗性植物、特に、アマトウガラシに形質転換されるのに必要とされるだろう。ゆえに、この手順に従って、現代生物工学の当業者は、過度の負担なしに、遺伝子またはタンパク質が機能的なＢＢＭホモログであり得るか否かを確認することができるだろう。
【００３８】
本明細書中の用語「配列同一性」は、配列番号１に記載の完全長ＢＢＭタンパク質における同一のアミノ酸の数を完全長のアミノ酸の数で除して１００を乗じたものと定義される。例えば、配列番号１と９０％の同一性を有する配列は、以下の計算：５２１／５７９×１００＝９０％によって例証されるように、配列番号１の５７９アミノ酸という配列全体にわたって、５２１個の同一アミノ酸を含む。
【００３９】
ＢＢＭは、種々の異なる種（例えば、ブラシカ・ナパス、アラビドプシス・サリアーナ、メディカゴ・トランカラータ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃｕｌａｔａ）、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ））において保存されている。本願において開示されるように、アブラナ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒｓ）（またはアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ））の分類群の植物由来のＢＢＭ遺伝子を使用して、形質転換および再生を含む方法によって、別個かつ遠縁のナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）から成熟トランスジェニック植物を得ることが可能である。おそらく、進化的保存のレベルのおかげで、これらのタンパク質は、ナス科（Ｓｏｌａｎｅｃｅａｅ）にわたるかまたは単子葉植物から双子葉植物にさえ及ぶ種々の抵抗性植物種に対して本方法を適用する場合に適当なものとなる。
【００４０】
【表１】
【００４１】
表１：配列番号１のＢＢＭに似ている様々な植物種のタンパク質のＧＩ番号（ＧｅｎＩｎｆｏ識別子）
本発明のさらに別の態様は、転写活性化因子、翻訳アクチベータまたは核標的化系（ｎｕｃｌｅａｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）からなる群から選択される遺伝的エレメントに作動可能に連結されたＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。
【００４２】
そのような遺伝的エレメントは、ＢＢＭタンパク質の適当な空間的活性および／または時間的活性を可能にするＢＢＭタンパク質の活性の調節を可能にする。本明細書における空間的活性とは、器官または組織に特異的なＢＢＭ活性を達成することができることを意味する。そのような遺伝的エレメントを使用する利点は、ＢＢＭタンパク質の不適当な発現または活性に関する問題の発生を防ぐことができる点である。
【００４３】
好ましい実施形態において、ＢＢＭタンパク質は、核標的化系に作動可能に連結される。この実施形態において、翻訳段階で融合されたＢＢＭ：：ＧＲのタンパク質を核に移動させるかまたは転位させることによって、ＢＢＭの活性を調節することが可能である。
【００４４】
本発明に記載の遺伝的エレメントが、転写活性化因子であるとき、転写レベルでＢＢＭの活性を制御することが可能である。そのような転写誘導系は、エタノール誘導性プロモータまたは熱ショック誘導性プロモータを含む系であり得る。５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ配列に配置され得る翻訳アクチベータを用いることにより、翻訳調節によってＢＢＭ活性を制御することができる。どの系を用いることによって、上で述べた遺伝的エレメントに従ってＢＢＭ活性を誘導することができるかは、当業者に明らかである。他の適当な系としては、エストロゲン誘導系、ＰＲＰ誘導系、ＵＡＳ誘導系、任意のＶＰ１６を含む系が挙げられる。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、ＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２を特徴とするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。このヌクレオチド配列によってコードされるペプチドは、植物材料がデキサメタゾン（ＤＥＸ）を含む培地と接触したときにＢＢＭタンパク質の活性が誘導されることを可能にする。
【００４６】
本発明の別の好ましい実施形態において、再生中の形質転換された植物細胞または植物材料は、ＢＢＭタンパク質の活性を誘導するのに適した薬剤を含む培地と接触される。
【００４７】
本発明のさらに別の実施形態において、ＢＢＭタンパク質の活性を誘導するのに適した薬剤は、エタノールである。この実施形態において、エタノールは、外来性ＢＢＭ遺伝子の転写を誘導するために使用され得る。転写を誘導するための他の系もまた、本発明を実施するために適している。ＢＢＭの活性は、本発明を実施するために、他のレベル（例えば、翻訳のレベルまたは翻訳後のレベル）においても制御され得る。
【００４８】
この態様の実施形態によれば、発現ベクターは、１つもしくはそれ以上の選択可能マーカー、１つもしくはそれ以上の目的のタンパク質、および／または１つもしくはそれ以上の目的の転写産物をさらにコードする。そのような目的のタンパク質は、目的の任意の病原体に対する抵抗性を提供する任意のタンパク質を含むが、ビタミン、栄養分、糖などの産生をもたらす経路の一部であるタンパク質も含む。
【００４９】
本発明はさらに、ＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む外来性ヌクレオチド配列、およびＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントを含み、抵抗性植物である、上記の方法によって入手可能な成熟トランスジェニック植物またはその材料に関する。本発明の好ましい実施形態において、成熟トランスジェニック植物は、ナス属、ペチュニア属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、ブタンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属、エンドウ属およびトウガラシ属由来の抵抗性植物からなる群から選択される植物、特に、ナス科由来の植物である。
【００５０】
本発明のより好ましい実施形態において、成熟トランスジェニック植物は、アマトウガラシのカプシカム・アンナム植物である。
【００５１】
本発明に記載の成熟トランスジェニック植物は、配列番号１である外来性ＢＢＭタンパク質、または配列番号１と少なくとも５０％、６０％、７０％の同一性、好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、なおもより好ましくは、少なくとも９５％の同一性、および最も好ましくは、少なくとも９８％の同一性を有することを特徴とするＢＢＭタンパク質の機能的ホモログを含む。好ましくは、成熟トランスジェニック植物は、本発明に記載のＢＢＭタンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列をそのゲノム内に含む。
【００５２】
本明細書において、外来性ヌクレオチド配列は、形質転換などの生物工学的手順によって植物材料に導入されたヌクレオチド配列である。外来性タンパク質は、外来性ヌクレオチド配列からコードされるタンパク質である。
【００５３】
本発明のさらに別の実施形態において、外来性ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントは、転写活性化因子、翻訳アクチベータ、または好ましくは、核標的化系からなる群から選択される。
【００５４】
本発明の利点は、外来性ＢＢＭタンパク質の活性が、空間的様式と時間的様式の両方において、ＢＢＭタンパク質の適当な活性または発現を可能にするように誘導することができる点である。形質転換および／または再生において外来性ＢＢＭの活性が誘導される可能性に加えて、外来性ＢＢＭの活性が都合の悪い有害作用を有し得る成長段階においては外来性ＢＢＭの活性を低下することができるかまたは無くすことができることは、特に有益であるとみられる。外来性ＢＢＭの空間的活性は、組織特異的プロモータを用いて調節され得る。例えば、植物成長の生殖生長期において活性でないプロモータを使用することにより、不稔性に関する問題が回避され得る。苗木の生育および成長の段階において活性なプロモータを使用することは、形質転換された植物材料の再生において好ましいだろう。
【００５５】
本発明に記載の遺伝的エレメントは、外来性ＢＢＭの適当な活性を可能にするために外来性ＢＢＭ遺伝子に作動可能に連結される。適当なエレメントとしては、任意の熱ショック誘導系、エタノール誘導系、エストロゲン誘導系、ＰＲＰ誘導系、ＵＡＳ誘導系、任意のＶＰ１６を含む系が挙げられる。当業者にとっては、本発明を実施するために他の適当な系を使用することができること、および生物工学的方法を使用することによりそのような系を作製することができることは明らかである。
【００５６】
さらに、ドミナントリプレッサ、ドミナントアクチベータ、アンチセンスコンストラクト、ＲＮＡｉコンストラクト、ｓｉＲＮＡコンストラクト、ノックアウトの使用に基づく方法、またはＢＢＭ活性に影響する同じ作用を選別する他のそのような方法によって本発明に記載のＢＢＭ活性を調節することが可能であると考えられる。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号２を特徴とする、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントに関する。この遺伝的エレメントは、ＢＢＭタンパク質に作動可能に連結することができ、それにより、翻訳融合がもたらされる。そのような作動可能な連結は、ＢＢＭタンパク質が、ＢＢＭ活性の誘導を可能にするトランスジェニック細胞の核に局在することを可能にする。この実施形態において、外来性ＢＢＭの活性化は、植物材料がデキサメタゾンを含む培地と接触したときにＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にする配列番号２によってコードされるペプチドによって媒介される。
【００５８】
さらに、本発明は、本発明に記載の成熟トランスジェニック植物の子孫、植物の一部、種子またはクローンに関する。本発明の利点は、本発明に記載の成熟トランスジェニック植物から子孫を得ることができる点である。そのような子孫は、例えば、組織または器官からの無性繁殖によって、成熟トランスジェニック植物から得ることができる。そのような場合、子孫は、細胞、組織、器官または適当な任意の植物の一部を繁殖するのに適した方法によって得ることができる。そのような方法は、様々な手段による植物材料のクローン化、接木、葉を切り取ったものの繁殖、切り取ったものの発根または他のそのような適当な方法を含み得る。繁殖方法は、子孫を得るための生殖体の調製に基づく技術も含み得る。そのような技術は、雌性発生または雄性発生による倍加半数体の子孫の作出を含む。植物組織培養または植物細胞培養を含む適当な方法もまた、子孫を得るために構想される。
【００５９】
ＢＢＭをコードするヌクレオチド配列を植物細胞のゲノムから切除するか、組み換えるか、または失わせることができるヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクトに本発明に記載のＢＢＭ遺伝子をクローニングすることによって本発明を実施することも可能であると考えられる。そのような系としては、例えば、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系またはＦＬＰ／ＦＲＴ系が挙げられるが、別の適当な組換え系も含まれ得る。
【００６０】
さらに、トランスジェニックの子孫および／または非トランスジェニックの子孫が、本発明に記載の成熟トランスジェニック植物から得られることがあることに注意されたい。そのような子孫は、メンデルの法則に従った導入遺伝子の分離を可能にする成熟植物を他家受精するかまたは自家受精することによって、得ることができる。非トランスジェニックの子孫は、導入遺伝子がヘテロ接合性である成熟トランスジェニック植物の自家受精によって得られるかもしれないし、成熟トランスジェニック植物を、非トランスジェニック子孫をもたらすことができるＢＢＭ導入遺伝子を含まない他の任意の適当な植物と交配することによって得られるかもしれない。
【００６１】
本発明の別の態様は、同時形質転換系としての本発明の方法に従って入手可能な成熟トランスジェニック植物または植物の一部の使用に関する。本明細書中の本発明の範囲は、同時形質転換系の基本原理として、好ましくは、マーカーを含まない系として、本発明に記載の誘導性のＢＢＭヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子の使用も包含する。
【００６２】
本明細書ではいくつかの実施形態が構想される。第１の実施形態では、外来性かつ誘導性のＢＢＭを含む植物（例えば、Ｔ１またはそれ以降のアマトウガラシ植物）に由来する植物材料が、目的の遺伝子を含み得る別の発現コンストラクトで形質転換される。このＴ１またはそれ以降の植物は、外来性かつ誘導性のＢＢＭ導入遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。第２の実施形態では、非トランスジェニック抵抗性植物を起源とする植物材料が、誘導性のＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列に加えて、１つもしくはそれ以上の目的の遺伝子または１つもしくはそれ以上の目的の遺伝的エレメントをコードすることができる別のヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで形質転換される（そして成熟トランスジェニック植物に再生される）。このストラテジーの利点は、得られる各成熟植物が、本質的に、誘導性のＢＢＭコンストラクトおよびさらなる目的のヌクレオチド配列を含むことになるので、誘導性のＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含めることによって、マーカーを含まない効率的な形質転換および再生が可能になる点である。
【００６３】
さらなる実施形態において、非トランスジェニック抵抗性植物細胞または植物材料は、誘導性のＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびさらなる目的のヌクレオチド配列を含む異なる第２の発現コンストラクトで形質転換される。好ましくは、抵抗性植物細胞または植物材料は、両方の発現コンストラクトと同時に接触される。このさらなる目的のヌクレオチド配列は、さらなる目的のタンパク質をコードし得るか、または好ましくはコードする。これらの実施形態の利点は、抵抗性植物種、例えば、アマトウガラシを、本質的に任意の目的のヌクレオチド配列または遺伝子で形質転換し、再生することができる点である。そのような目的のヌクレオチド配列は、目的の配列に対するＲＮＡｉ配列もしくはアンチセンス配列、過剰発現配列、機能獲得配列、または他の任意の目的の配列から選択され得る。
【００６４】
両方の実施形態が、外来性ＢＢＭに加えて他の任意の目的のヌクレオチド分子を含むアマトウガラシなどの成熟トランスジェニック植物を得ることを可能にする。
【００６５】
同時形質転換系に関する第１の実施形態は、適当な表現型または遺伝子型に基づいて外来性ＢＢＭを含むトランスジェニック植物を第１に選択することができるという意味においてさらなる利点を有する。適当な表現型には、十分に生育するかもしくは成長する植物、あるいは適当な稔性または他の任意の適当なもしくは好ましい表現型を有する植物が含まれ得る。適当な遺伝子型は、導入遺伝子の安定性、位置効果によって引き起こされるものなどのＢＢＭの発現レベル、コンストラクトの漏出性（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）、すなわち、ＢＢＭの不適当な活性、単一植物における導入遺伝子の数、単一植物内の１つのインテグレーション部位に存在するコンストラクトの数（多コピーのＴ−ＤＮＡコンストラクトが単一の遺伝子座に挿入され得る）または他の任意の適当なもしくは好ましい特性に関することがある。
【００６６】
同時形質転換系に関する第２の実施形態は、単回の形質転換および再生の処理において、外来性ＢＢＭに加えて他の任意の目的のヌクレオチド配列を含む抵抗性植物を得ることを可能にするという意味においてさらなる利点を有する。
【００６７】
ここで、これらの両方の実施形態においてそのような同時感染または同時形質転換のためにプロトプラストを使用することが可能であることに特に注意されたい。
【００６８】
したがって、追加的にまたは二者択一的に、形質転換された植物細胞または形質転換された植物材料においてその再生中にＢＢＭ活性を誘導する工程を包含する、成熟トランスジェニック植物を得るための方法であって、その植物細胞または植物材料は、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントに作動可能に連結されたＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む外来性ヌクレオチド分子を含み、その植物材料の植物細胞は、抵抗性植物、特に、アマトウガラシに由来する方法が、提供される。所望であれば、そのトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物材料は、成熟トランスジェニック植物に再生される。その植物細胞または植物材料は、Ｔ１またはそれ以降の形質転換体に由来し得る。この植物は、好ましくは、誘導性のＢＢＭ導入遺伝子についてホモ接合性であるが、ヘテロ接合性であってもよい。
【００６９】
再生は、形質転換された植物細胞または植物材料を、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導に適した薬剤を含む培地と接触させることによって達成することができる。
【００７０】
Ｔ１またはそれ以降の植物は、活性を誘導することができるＢＢＭタンパク質を含むので、それぞれの抵抗性植物は、ＢＢＭが活性化されると再生可能になる。これにより、形質転換された植物細胞または植物材料は、さらなる目的のヌクレオチド配列、特に、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む別のヌクレオチド分子で形質転換することができ、そしてこの植物材料を成熟トランスジェニック植物に再生する可能性が開ける。この第２の目的のヌクレオチド配列は、目的の配列に対するＲＮＡｉ配列もしくはアンチセンス配列、過剰発現配列、機能獲得配列、または他の任意の目的の配列を含み得る。活性を誘導することができる外来性ＢＢＭタンパク質が存在することに起因して再生能力のある抵抗性植物を得ることは、本質的に任意の目的のヌクレオチド配列または遺伝子を用いて、ここで初めて効率的に形質転換されて成熟するまで再生することが可能なアマトウガラシについて、特に興味深い。したがって、この実施形態において、その方法は、本明細書中で意味されるような同時形質転換系として使用される。
【００７１】
あるいは、誘導性かつ外来性のＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物は、本明細書中で意味されるようなＢＢＭの誘導に適した薬剤を含む栽培培地と接触すると、多数の体細胞胚を発生するので、誘導性のＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞または植物材料の再生は、植物を増殖させる目的のために使用することができる。好ましくは、この培地は、さらにより多くの体細胞胚が望まれるとき、適当量のサイトカイニン（例えば、チジアズロン、ゼアチンまたは６−ベンジルアミノプリン）も含む。子葉外植片の表面上における明らかに識別可能な体細胞胚の数は、少なくとも１００を超えることが見出されたので、これらの胚を単離すること、およびそれらを出芽させてさらに成熟トランスジェニック植物に成長させることが可能である。増殖させることができるこの植物材料は、好ましくは、外植片、特に、子葉外植片から得られる。
【００７２】
さらに、体細胞胚から得られた植物材料を生育させるかまたは成熟させることによる材料または細胞は、再生中にＢＢＭを誘導することによって別の回の増殖に供されてもよく、それにより、そこから体細胞胚が提供される。
【００７３】
本発明の最後の態様は、植物材料を形質転換して成熟トランスジェニック植物に再生するための、ヌクレオチド分子の使用であって、その植物材料は抵抗性植物を起源とし、そのヌクレオチド分子はＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、そのＢＢＭタンパク質は配列番号１と少なくとも５０％、６０％、７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、なおもより好ましくは、少なくとも９５％、および最も好ましくは、少なくとも９８％の同一性を有することを特徴とするか、またはそのＢＢＭタンパク質は、配列番号１を特徴とする、使用に関する。
【００７４】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、ＢＢＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントに作動可能に連結される。
【００７５】
本発明のこの態様の別の好ましい実施形態において、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントは、転写活性化因子、翻訳アクチベータ、または好ましくは核標的化系からなる群から選択される。
【００７６】
本発明のこの態様のさらに別の好ましい実施形態において、ＢＢＭタンパク質の活性の誘導を可能にするのに適した遺伝的エレメントは、配列番号２である。
【００７７】
本発明のこの態様の最後の好ましい実施形態において、抵抗性植物は、ナス属、ペチュニア属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、ブタンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属、エンドウ属およびトウガラシ属からなる群から選択され、特に、ナス科の植物、より詳細には、アマトウガラシのカプシカム・アンナム植物である。
【００７８】
本願では、以下の図面が参照される：
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、様々な植物種由来のＢＢＭタンパク質の系統樹を示している。
【図２】図２は、カルス形成した３週齢の外植片を明示している。
【図３】図３は、コントロールのカルスおよびＳＬＳの形成を明示している。
【図４】図４は、３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲで形質転換された外植片におけるＳＬＳにおける体細胞胚の形成を明示している。
【図５】図５は、伸長しているシュートを明示している。
【図６】図６は、発根したシュートを明示している。
【図７】図７は、トランスジェニックレッドブロッキーを明示している。
【図８】図８は、トランスジェニックイエローブロッキーを明示している。
【図９】図９は、トランスジェニック植物の種子を示している。
【図１０】図１０は、Ｋｍ含有培地上の分離した子孫を示している。
【図１１】図１１は、分離したトランスジェニック植物の表現型を示している。上段は、Ｋｍ耐性苗木を示しており、下段は、Ｋｍ感受性苗木を示している。
【図１２】図１２は、コントロールまたは３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲで形質転換された子葉外植片がカルス、シュート様構造（ＳＬＳ）およびシュートを形成したパーセンテージを示している。
【図１３】図１３は、トランスジェニックトウガラシ植物において行われたＰＣＲの結果のゲルを表している。レーン：Ｍ，分子マーカー；Ｐ，３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲプラスミドＤＮＡ；Ａ，非トランスジェニックアラビドプシス；Ａ＋，トランスジェニックアラビドプシス；Ｃ，非トランスジェニックトウガラシ；Ｃ１〜４，別個のトランスジェニックアマトウガラシ；Ｃ５〜８，同じ外植片に由来するトランスジェニックトウガラシのシュート。
【図１４】図１４は、Ｗ１３８バックグラウンドのトランスジェニックペチュニアのシュート再生を明示している。
【図１５】図１５は、Ｗ１３８バックグラウンドのトランスジェニックペチュニアのシュート再生を明示している。
【図１６】図１６は、配列番号１を示している。
【図１７】図１７は、配列番号２を示している。
【図１８】図１８は、配列番号３を示している。
【図１９】図１９は、核転写性のベビーブーム（ｂａｂｙｂｏｏｍ）の活性を誘導した後の、３５Ｓ：：ＢＢＭ：：ＧＲを含むアマトウガラシトランスジェニック系統のＴ１子孫における傷の部位の周縁部における体細胞胚の形成を明示している。
【実施例】
【００８０】
本発明は、本発明の範囲を決して限定することを意図していない以下の実施例によってさらに例証される。
【００８１】
実施例１
ＢＢＭによるアマトウガラシの遺伝形質転換
配列番号１および配列番号２を含むカプシカム・アンナム種であるアマトウガラシ植物の遺伝形質転換。表現型的かつ遺伝子型的に異なる品種のＦｉｅｓｔａ、ＦｅｒｒａｒｉおよびＳｐｉｒｉｔ由来の植物を使用した。
【００８２】
ドナー植物の生育
Ｆ１雑種であるＦｉｅｓｔａ、ＦｅｒｒａｒｉおよびＳｐｉｒｉｔ（Ｅｎｚａ Ｚａｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の表面滅菌した種子を、０．８％Ｍｉｃｒｏａｇａｒ（Ｄｕｃｈｅｆａ）を用いて凝固した、２％スクロースが添加されたフルストレングスのＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６２）の上に播種した。１０日齢の子葉を３〜１０ｍｍの外植片に切り出し、２３℃の薄明条件下において１〜２日間、共培養培地（ＣＣＭ）上で前培養した。ＣＣＭは、０．７％Ｍｉｃｒｏａｇａｒを用いて凝固した、１．６％グルコースおよび２ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド、０．１ｍｇ／Ｌインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）または０．２５〜１ｍｇ／Ｌチジアズロン（ＴＤＺ）、１０μＭデキサメタゾンが添加された改変Ｒ培地を含む。独立して反復された６〜１０回の実験において、コンストラクト１つあたり平均２００個の外植片を使用した。
【００８３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスの生育
アグロバクテリウム・ツメファシエンスの系統ＧＶ３１０１＋ｐＭＰ９０（３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲ（翻訳段階で糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）（配列番号２）に融合されるＢＢＭコード配列（配列番号１）に作動可能に連結された３５Ｓプロモータを含む）、３５Ｓ：：ＢＢＭ（ＢＢＭコード配列の配列番号１に作動可能に連結された３５Ｓプロモータを含む）を有する）または３５Ｓ：：ＧＵＳを有するコントロールプラスミドを、１００ｍＬのＹＥＢ培地（０．５％酵母エキス、０．５％牛肉エキス、２％スクロース，ｐＨ７．２）中の適切な抗生物質、リファンピシン（１００ｍｇ／Ｌ）、硫酸カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）および／またはゲンタマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）の存在下、２８℃において一晩培養物として生育した。植物を形質転換する前に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を、新しく調製された４０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン（Ｓｉｇｍａ）が添加された液体ＣＣＭでＯＤ６６０ ０．３〜０．４に希釈した。
【００８４】
植物材料の遺伝形質転換
希釈されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス培養物を前培養された外植片に加え、室温で３０〜６０分間インキュベートした。吸い取らせて外植片を乾燥させ、４０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンが添加されたＣＣＭ上で２３℃の薄明条件下において２〜３日間さらに同時培養した後、１００ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンおよび５００ｍｇ／Ｌセフォタキシムが添加されたＣＣＭからなる選択培地に移した。
【００８５】
トランスジェニック植物材料の再生
外植片を２３℃、１６／８時間の昼／夜体制の明光条件に２ヶ月間移した（４週間後に１回継代した）。シュート様構造が出現した外植片を、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ １９６２）のマクロ塩とマイクロ塩との混合物、Ｂ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇ Ｏ．Ｌ．１９６８）に従うビタミン類、１．６％グルコース、１ｍｇ／Ｌイノシトール、２０ｍｇ／Ｌ硫酸アデニン、２００ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物、１０ｍｇ／Ｌ ＧＡ３、４ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、３０μＭチオ硫酸銀、１００ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンおよび５００ｍｇ／Ｌセフォタキシムからなる伸長培地（ＥＭ）に４週間にわたって移した。伸長したシュートを、３０ｍｇ／Ｌグルタチオン、６０ｍＬ／Ｌ硫酸カナマイシンおよび３００ｍｇ／Ｌセフォタキシムが添加された改変ＭＳ培地である前発根（ｐｒｅ−ｒｏｏｔｉｎｇ）培地（ＰＲＭ）に２ヶ月間にわたって移し、次いで、１ｍｇ／Ｌ ＩＡＡを含むかまたは含まない、２％スクロース、５０ｍｇ／Ｌセフォタキシムおよびバンコマイシンが添加されたＲｕｇｉｎｉ培地からなる発根培地に移した。発根したシュートを温室に移すことにより、結実させた。組織培養に関するすべての化学物質は、Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈａａｒｌｅｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって供給されたものである。
【００８６】
トランスジェニックシュートの分析
ＣＴＡＢミニプレップ法によりＤＮＡを葉から単離し、５０μＬのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。ＢＢＭ特異的プライマーを、公開されているｃＤＮＡ配列（ＡＦ３１７９０４および−９０５）に基づいて設計した。ＢＢＭｆｗ：ｇｔｔａｇｇｙｔｔｙｔｃｔｃｔｍｔｃｔｃｃ，ＢＢＭｒｗ：ｇｇｇｃｔｇｃａａａｔｃｃｔｔｇａｔａａｃｃａ。形質転換されるプラスミドおよびトランスジェニックアラビドプシス系統からのＤＮＡをコントロールとして使用した。供給業者のプロトコールに従って、ＰＣＲ混合物を使用した。ＰＣＲ条件：１５秒間９４℃；３０秒間４８℃：４５秒間７２℃；３５サイクル。結果を図１３に示す。
【００８７】
トランスジェニック子孫の分析
各個別のトランスジェニックシュートを自家受粉させ、また、元のドナー系統由来の植物と交配することにより、導入遺伝子の遺伝を分析した。回収した後の種子の表面を滅菌し、その種子をＭＳ培地、２％スクロース、０．８％ｍｉｃｒｏａｇａｒおよび２００ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンまたは１００ｍＬ／Ｌ硫酸パロモマイシンの上に播種した。播種の４週間後に分離を評価した。
【００８８】
結果
全体では、３つの栽培品種の１００００個を超える外植片をコントロールコンストラクトまたはＢＢＭコンストラクトとともに共培養した。選択培地上での培養の最初の３週間は、すべての外植片のサイズが大きくなり、薄緑色または白っぽい小さいカルスが目で見えるようになった。さらに２週間後、使用したサイトカイニンのタイプに応じて、カルス形成および／または直接のシュート形成が切断表面に生じた。ＴＤＺの存在下においては、外植片は複数のシュート様構造（ＳＬＳ）を形成したが、ゼアチンリボシドは、主にカルスおよび少数のＳＬＳを誘導した（図２および３）。この段階において、３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲで形質転換された外植片は、コントロールよりも多いＳＬＳを生成した。ＥＭ培地に移した後は、３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲのＳＬＳだけが増殖し、次の３〜４週間以内に初生葉上にシュートまたは体細胞胚を形成した（図４および５ならびに表２）。適切なシュートの発生、伸長および形成のすべてが、ＰＲＭに移した後に促進された。伸長したシュートを発根培地に移した後、その移した後の２週間以内に根の形成が起きた。形質転換の６ヶ月後、発根したシュートをロックウールブロックに移し、種子生成のために温室条件に馴化させた。
【００８９】
【表２】
【００９０】
表２は、２つのＢＢＭコンストラクトを用いたときの再生の比較を示している。
３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲコンストラクトによる形質転換によってトランスジェニックシュートが生成されたが、コントロールからは生成されなかった。選択された条件下において、コントロール形質転換は、シュート様構造（ＳＬＳ）またはシュートではなくカルスの生成を示した（図１２）。試験された３つの系統のうち、Ｆｉｅｓｔａが最も高い再生能を示し（４８％）、それにＳｐｉｒｉｔ（３，４％）およびＦｅｒｒａｒｉ（１，７％）が続いた（表３）。温室条件に馴化させた後、植物は、急速に生育し、花成したが、形質転換されていないコントロール植物よりも約３０％短いままだった。自殖および他殖が成功したことから、稔性は形質転換および再生のプロセスの影響を受けなかったことが示された。
【００９１】
体細胞胚形成の開始により、トランスジェニック植物の複数のシュートが形成された（図５）。いくつかの独立した形質転換実験から得られたＦｉｅｓｔａおよびＦｅｒｒａｒｉ由来の合計２０個を超える独立したトランスジェニック植物が作出された。同じ外植片から得られた独立したＴ０植物におけるＰＣＲによる分子分析は、すべてのシュートがトランスジェニックであること、および形質転換１回あたりに使用された最初の外植片数から計算された全体の形質転換効率が０．５〜１％で変動し得ることを示した。
【００９２】
分離比分析から、導入遺伝子がメンデルのパターンに従って遺伝することが示された（表４）。
【００９３】
【表３】
【００９４】
表３は、３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲで形質転換された後の種々の品種のシュート形成のパーセンテージを示している。
【００９５】
【表４】
【００９６】
表４は、選択培地上で生育された、自家受精した成熟トランスジェニック植物からの子孫の分離比分析を示している。
【００９７】
考察
結果から、誘導性の過剰発現されたＢＢＭ遺伝子を使用することによって、トランスジェニックアマトウガラシ植物の良質のシュートを直接または体細胞胚形成を介して再生することができること、および導入遺伝子が次世代に遺伝されることが示された。
【００９８】
トウガラシの種および品種における、正常植物への再生に至る体細胞胚形成の誘導は、集中的に研究されている。しかしながら、アマトウガラシでは、体細胞胚の誘導は可能であったが、胚は、頂端分裂組織を欠き、正常植物に成長しなかった。再生プロセス中にＢＢＭ遺伝子を活性化することにより、稔性アマトウガラシ植物を再生することができた。
【００９９】
実施例２
ＢＢＭによる抵抗性ペチュニアＷ１３８の遺伝形質転換
ペチュニアのＷ１３８系統は、再生およびその後のトランスジェニック植物の作出に対して抵抗性であることが証明されている。
【０１００】
成熟トランスジェニックペチュニア植物を得る目的で、Ｗ１３８の外植片を、ペチュニア形質転換に対する標準的なプロトコールを用いて形質転換した。
【０１０１】
Ｗ１３８バックグラウンドの２系統（ＮＣ２６７６−１０、ＮＣ２６７６−１１）およびＷ５バックグラウンドの１系統（２９３）を誘導性のＢＢＭコンストラクト（３５Ｓ：：ＢＢＭ：：ＧＲ）またはコントロールＴ−ＤＮＡコンストラクト（この場合はＧＵＳレポーター遺伝子を含む）で形質転換した。両方のコンストラクトによって３つすべての系統からカナマイシン耐性カルスを得た（最も高い効率はＮＣ２６７６−１１であり、それに２９３が続いた）。コントロールコンストラクトのカルスは、強いＧＵＳ発現を示した。
【０１０２】
シュート様構造（ＳＬＳ）および原基が、まずＮＣ２６７６−１１系統に見られ、続いて同じ順序で他の系統においても見られたが、しかしながら、さらなる成長および生長は、３５Ｓ：ＢＢＭ：：ＧＲで形質転換されたカルスでしか観察されなかった（図１４および１５）。
【０１０３】
アマトウガラシにおけるように、ＢＢＭの過剰発現によって、抵抗性植物においてもトランスジェニックシュートが形成される。
【０１０４】
実施例３
３５Ｓ：：ＢＢＭ：：ＧＲ系統の子孫の分析
複数の３５Ｓ：：ＢＢＭ：：ＧＲ系統のホモ接合性Ｔ１子孫を、ＴＤＺ、ＤＥＸおよび／またはＴＤＺならびにＤＥＸをさらに含む共培養培地またはコントロールとしてＴＤＺ／ＤＥＸを含まない共培養培地上でインビトロにおいて生育した。
【０１０５】
ホモ接合性３５Ｓ：：ＢＢＭ：ＧＲ系統由来の子葉外植片の培養から、核によって誘導されるＢＢＭタンパク質および核によって誘導されないＢＢＭタンパク質によって引き起こされる成長の差異が明らかになった。横方向に切断された子葉の周縁部において、体細胞胚が形成される（図１９）。これらの作用は、ＤＥＸを含まない培地上で生育された子葉外植片からは観察されなかった。
【０１０６】
本明細書中の結果は、調節された外来性ＢＢＭの発現を用いることにより、トランスジェニックアマトウガラシの高品質の形態学的に正常なシュートを生成することができることを示す。そのような体細胞胚は、実際に、接合胚と著しい類似性を有した。現実に、トウガラシ子葉に対して多数（＞１００）の体細胞胚を誘導することができた。トウガラシ外植片において確認することができた多量のそのような胚は、組織培養において成熟アマトウガラシ植物を作出する際に少なくとも１００倍の増殖率に到達するには十分である。この知見により、維持系統を使用する必要なく、雄性不稔のアマトウガラシ植物を増殖することも可能である。
［参照文献］
【特許請求の範囲】
【請求項１】
稔性トランスジェニック植物を提供するための方法であって、前記方法は、
ａ）ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）をコードする発現ベクターで植物細胞を形質転換する工程であって、前記発現ベクターが前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）の誘導性の核転写活性を提供する工程と、
ｂ）前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）の核転写活性をもたらす誘導条件下において、前記形質転換された植物細胞を体細胞胚、シュート様構造（ＳＬＳ）および／または葉様構造（ＬＬＳ）に再生する工程と、
ｃ）前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）の核転写活性が実質的に存在しない非誘導条件下において、前記体細胞胚、シュート様構造（ＳＬＳ）および／または葉様構造（ＬＬＳ）を、稔性トランスジェニック植物に培養する工程とを
含む、方法。
【請求項２】
前記植物細胞が、ナス属、ブタンソウ属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属およびエンドウ属からなる群から選択される植物細胞、好ましくは、ナス科、より好ましくは、ペチュニア属およびトウガラシ属である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物細胞が、アマトウガラシのカプシカム・アンナムまたはペチュニア・ヒブリダ由来の植物細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）が転写活性を有する条件下において、前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）が、配列番号１とアミノ酸レベルで少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、なおもより好ましくは、少なくとも９５％、および最も好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記誘導性の核転写活性が、転写調節エレメント、核標的化配列または翻訳調節エレメントによって提供される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記核標的化配列が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導条件が、デキサメタゾンによって提供される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記発現ベクターが、１つもしくはそれ以上の選択可能マーカー、１つもしくはそれ以上の目的のタンパク質および／または１つもしくはそれ以上の目的の転写産物をさらにコードする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、さらに
ｄ）前記稔性トランスジェニック植物から植物細胞を得る工程と、
ｅ）１つまたはそれ以上の目的のタンパク質または転写産物をコードする発現ベクターで前記植物細胞を形質転換する工程と、
ｆ）前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）の核転写活性をもたらす誘導条件下において、前記形質転換された植物細胞を体細胞胚、シュート様構造（ＳＬＳ）および／または葉様構造（ＬＬＳ）に再生する工程と、
ｇ）前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）の核転写活性が存在しない非誘導条件下において、前記体細胞胚、シュート様構造（ＳＬＳ）および／または葉様構造（ＬＬＳ）を稔性トランスジェニック植物に培養する工程と、
ｈ）必要に応じて、工程（ｄ）〜（ｇ）を１回またはそれ以上繰り返す工程とを
含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９、好ましくは、請求項１〜８のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の発現ベクターを含む、稔性トランスジェニック植物。
【請求項１１】
前記植物が、ナス属、ブタンソウ属、ペチュニア属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属、エンドウ属およびトウガラシ属からなる群から選択され、好ましくは、ナス科、またはＮＣＩＭＢ番号４１７３２として寄託されているものである、請求項１０に記載の稔性トランスジェニック植物。
【請求項１２】
前記植物が、カプシカム・アンナム植物、好ましくは、アマトウガラシのカプシカム・アンナム植物である、請求項１０または請求項１１に記載の稔性植物。
【請求項１３】
請求項１〜９、好ましくは、請求項１〜８のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の発現ベクターを含む、請求項１０〜１２のいずれかに記載の稔性植物由来の種子または果実。
【請求項１４】
好ましくは、ナス属、ブタンソウ属、ペチュニア属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属、エンドウ属およびトウガラシ属からなる群から選択され、より好ましくは、ナス科から選択され、なおもより好ましくは、前記植物がカプシカム・アンナム植物であり、最も好ましくは、前記植物がアマトウガラシのカプシカム・アンナム植物である、稔性トランスジェニック植物を作出するための、請求項１〜９、好ましくは、請求項１〜８のいずれかに記載のベビーブームタンパク質の使用。
【請求項１５】
好ましくは、ナス属、ブタンソウ属、ペチュニア属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属、エンドウ属およびトウガラシ属からなる群から選択され、より好ましくは、ナス科から選択され、なおもより好ましくは、前記植物がカプシカム・アンナム植物であり、最も好ましくは、前記植物がアマトウガラシのカプシカム・アンナム植物である、稔性トランスジェニック植物を作出するための、請求項１〜９、好ましくは、請求項１〜８のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の発現ベクターの使用。
【請求項１】
稔性トランスジェニック植物を提供するための方法であって、前記方法は、
ａ）ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）をコードする発現ベクターで植物細胞を形質転換する工程であって、前記発現ベクターが前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）の誘導性の核転写活性を提供する工程と、
ｂ）前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）の核転写活性をもたらす誘導条件下において、前記形質転換された植物細胞を体細胞胚、シュート様構造（ＳＬＳ）および／または葉様構造（ＬＬＳ）に再生する工程と、
ｃ）前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）の核転写活性が実質的に存在しない非誘導条件下において、前記体細胞胚、シュート様構造（ＳＬＳ）および／または葉様構造（ＬＬＳ）を、稔性トランスジェニック植物に培養する工程とを
含む、方法。
【請求項２】
前記植物細胞が、ナス属、ブタンソウ属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属およびエンドウ属からなる群から選択される植物細胞、好ましくは、ナス科、より好ましくは、ペチュニア属およびトウガラシ属である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物細胞が、アマトウガラシのカプシカム・アンナムまたはペチュニア・ヒブリダ由来の植物細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）が転写活性を有する条件下において、前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）が、配列番号１とアミノ酸レベルで少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、なおもより好ましくは、少なくとも９５％、および最も好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記誘導性の核転写活性が、転写調節エレメント、核標的化配列または翻訳調節エレメントによって提供される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記核標的化配列が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導条件が、デキサメタゾンによって提供される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記発現ベクターが、１つもしくはそれ以上の選択可能マーカー、１つもしくはそれ以上の目的のタンパク質および／または１つもしくはそれ以上の目的の転写産物をさらにコードする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、さらに
ｄ）前記稔性トランスジェニック植物から植物細胞を得る工程と、
ｅ）１つまたはそれ以上の目的のタンパク質または転写産物をコードする発現ベクターで前記植物細胞を形質転換する工程と、
ｆ）前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）の核転写活性をもたらす誘導条件下において、前記形質転換された植物細胞を体細胞胚、シュート様構造（ＳＬＳ）および／または葉様構造（ＬＬＳ）に再生する工程と、
ｇ）前記ベビーブームタンパク質（ＢＢＭ）の核転写活性が存在しない非誘導条件下において、前記体細胞胚、シュート様構造（ＳＬＳ）および／または葉様構造（ＬＬＳ）を稔性トランスジェニック植物に培養する工程と、
ｈ）必要に応じて、工程（ｄ）〜（ｇ）を１回またはそれ以上繰り返す工程とを
含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９、好ましくは、請求項１〜８のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の発現ベクターを含む、稔性トランスジェニック植物。
【請求項１１】
前記植物が、ナス属、ブタンソウ属、ペチュニア属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属、エンドウ属およびトウガラシ属からなる群から選択され、好ましくは、ナス科、またはＮＣＩＭＢ番号４１７３２として寄託されているものである、請求項１０に記載の稔性トランスジェニック植物。
【請求項１２】
前記植物が、カプシカム・アンナム植物、好ましくは、アマトウガラシのカプシカム・アンナム植物である、請求項１０または請求項１１に記載の稔性植物。
【請求項１３】
請求項１〜９、好ましくは、請求項１〜８のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の発現ベクターを含む、請求項１０〜１２のいずれかに記載の稔性植物由来の種子または果実。
【請求項１４】
好ましくは、ナス属、ブタンソウ属、ペチュニア属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属、エンドウ属およびトウガラシ属からなる群から選択され、より好ましくは、ナス科から選択され、なおもより好ましくは、前記植物がカプシカム・アンナム植物であり、最も好ましくは、前記植物がアマトウガラシのカプシカム・アンナム植物である、稔性トランスジェニック植物を作出するための、請求項１〜９、好ましくは、請求項１〜８のいずれかに記載のベビーブームタンパク質の使用。
【請求項１５】
好ましくは、ナス属、ブタンソウ属、ペチュニア属、チューリップ属、ユリ属、サフラン属、アヤメ属、グラジオラス属、ホウレンソウ属、アカザ属、インゲンマメ属、エンドウ属およびトウガラシ属からなる群から選択され、より好ましくは、ナス科から選択され、なおもより好ましくは、前記植物がカプシカム・アンナム植物であり、最も好ましくは、前記植物がアマトウガラシのカプシカム・アンナム植物である、稔性トランスジェニック植物を作出するための、請求項１〜９、好ましくは、請求項１〜８のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の発現ベクターの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１９】
【図１２】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１９】
【図１２】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１２−５３２５８７（Ｐ２０１２−５３２５８７Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１８９３８（Ｐ２０１２−５１８９３８）
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９５４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００３８５０
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５０９０１８８４５）エンザ・ザデン・ビヘーア・ベスローテン・フエンノートシャップ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＡ ＺＡＤＥＮ ＢＥＨＥＥＲ Ｂ．Ｖ．
【出願人】（５１００９０７６０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９５４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００３８５０
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５０９０１８８４５）エンザ・ザデン・ビヘーア・ベスローテン・フエンノートシャップ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＡ ＺＡＤＥＮ ＢＥＨＥＥＲ Ｂ．Ｖ．
【出願人】（５１００９０７６０）
【Ｆターム（参考）】
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