微生物の検出および分析に使用するための微生物改変核酸
本発明は、微生物の検出および分析に使用するための、いくつかの微生物の誘導核酸または改変核酸の配列を提供する。この誘導核酸は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、Ｔ（チミン）およびＵ（ウラシル、または、Ａ、ＧもしくはＴではない他の何らかの塩基もしくは塩基様物質）の塩基を含有する。微生物核酸が、メチル化したシトシン（Ｃ）または他のＣ変化体を含有していなければ、全てのＣはＵに変換される。誘導核酸中のＵがＴで置換された配列を増幅させると、対応する未改変の微生物核酸の配列と同じ総塩基数を有するが、Ａ、ＧおよびＴの３塩基のみの組合せとなっている改変配列が生じる。このプロセスの結果として、元のｄｓＤＮＡの上鎖および下鎖から誘導された核酸は、もはや相補的ではなく、改変された微生物配列は、微生物の検出および分析で使用するために、ゲノムの相対的な複雑性が低下している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の検出および分析に使用するための改変核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の核酸分子の検出には、現時点でいくつかの手順が利用可能である。こうした手順は、通常は標的核酸と核酸プローブとの間の配列依存的なハイブリダイゼーションによるものであり、核酸プローブの長さは、短鎖オリゴヌクレオチド（２０塩基以下）から何キロベース（ｋｂ）もの配列まで多岐にわたりうる。
【０００３】
核酸配列の集団の中から特定の配列を増幅するために最も広く使用されている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．編、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）である。この増幅方法では、相補ＤＮＡ鎖上の、増幅対象領域のいずれかの末端にある、一般に長さが２０から３０ヌクレオチドを使用して、変性一本鎖ＤＮＡ上でＤＮＡ合成を開始する。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを使用した、変性、プライマーハイブリダイゼーション、およびＤＮＡ鎖合成の連続サイクルにより、プライマーで挟まれた配列の指数関数的増幅が可能になる。最初に逆転写酵素を用いた複製を行うことによりＲＮＡ配列を増幅し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の複製物を作製できる。増幅ＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動、標識プローブを用いたハイブリダイゼーション、引き続いての同定（酵素結合アッセイなどによる）を許容するタグ付きプライマーの使用、および標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションするとシグナルを発生する蛍光タグ付きプライマーの使用（例えば、Ｂｅａｃｏｎ ａｎｄ ＴａｑＭａｎシステム）といった多様な手段により検出できる。
【０００４】
特定のヌクレオチド配列の検出および増幅のためには、ＰＣＲ以外にも、他の多様な手法が開発されている。その一例は、リガーゼ連鎖反応（１９９１、Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８、１８９〜１９３）である。
【０００５】
別の例は等温増幅であり、１９９２年に最初に記載され（Ｗａｌｋｅｒ ＧＴ、Ｌｉｔｔｌｅ ＭＣ、Ｎａｄｅａｕ ＪＧ ａｎｄ Ｓｈａｎｋ Ｄ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＰＮＡＳ ８９：３９２〜３９６（１９９２））、鎖置換増幅（ＳＤＡ）と名付けられた。それ以降、他のいくつかの等温増幅技術が記載されており、その中には、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、対応するゲノムＤＮＡではなくＲＮＡ配列を複製する、転写介在増幅（ＴＭＡ）および核酸配列をベースにした増幅（ＮＡＳＢＡ）も包含される（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ＪＣ、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ ＫＭ、Ｋｗｏｈ ＤＹ、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ＫＪ、Ｒｉｃｈｍａｎｎ ＤＤ ａｎｄ Ｇｉｎｇｅｒａｓ ＴＲ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｅｄ ａｆｔｅｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ＰＮＡＳ ８７、１８７４〜１８７８（１９９０）：Ｋｉｅｖｉｔｓ Ｔ、ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ Ｂ、ｖａｎ Ｓｔｒｉｊｐ Ｄ、Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ Ｒ、Ｄｉｒｃｋｓ Ｍ、Ａｄｒｉａａｎｓｅ Ｈ、Ｍａｌｅｋ Ｌ、Ｓｏｏｋｎａｎａｎ Ｒ、Ｌｅｎｓ Ｐ、ＮＡＳＢＡ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９１ Ｄｅｃ；３５（３）：２７３〜８６）。
【０００６】
ＤＮＡベースの等温での手法としては他に、ＤＮＡポリメラーゼが環状の鋳型に向けたプライマーを伸長させるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｆｉｒｅ Ａ ａｎｄ Ｘｕ ＳＱ、Ｒｏｌｌｉｎｇ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｃｉｒｃｌｅｓ、ＰＮＡＳ ９２、４６４１〜４６４５（１９９５））、標的検出用に環状プローブを使用する分枝増幅（ＲＡＭ）（Ｚｈａｎｇ Ｗ、Ｃｏｈｅｎｆｏｒｄ Ｍ、Ｌｅｎｔｒｉｃｈｉａ Ｂ、Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ＨＤ、Ｓｉｍｓｏｎ Ｅ、Ｌｉ Ｈ、Ｙｉ Ｊ、Ｚｈａｎｇ ＤＹ、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ｂｙ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ：ａ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｙ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００２ Ｊａｎ；４０（１）：１２８〜３２）、また、より新しいところでは、熱の代わりにヘリカーゼ酵素を使用してＤＮＡ鎖をほどくヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅（ＨＤＡ）（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｍ、Ｘｕ Ｙ、Ｋｏｎｇ Ｈ、Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ、２００４ Ａｕｇ；５（８）：７９５〜８００）が挙げられる。
【０００７】
最近、等温でのＤＮＡ増幅方法が記載されている（Ｗａｌｋｅｒ ＧＴ、Ｌｉｔｔｌｅ ＭＣ、Ｎａｄｅａｕ ＪＧ ａｎｄ Ｓｈａｎｋ Ｄ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＰＮＡＳ ８９：３９２〜３９６（１９９２）。伝統的な増幅手法は、増幅反応のサイクルごとに標的分子の変性再生サイクルを繰り返すことによるものである。ＤＮＡの熱処理によりある程度ＤＮＡ分子のせん断が生じることから、発達中の胚盤胞由来の少数の細胞からのＤＮＡ単離などにおいて、または、とりわけ、組織切片、パラフィンブロックおよび古代のＤＮＡ標本などでＤＮＡがすでに断片化された形態である場合において、ＤＮＡが限られていると、こうした加熱冷却サイクルは、ＤＮＡをさらに損傷し増幅シグナルを損失する結果をまねきかねない。等温法は、さらなる増幅用の鋳型として役立てるための一本鎖分子の作製を、鋳型ＤＮＡの変性を連続させることによるのではなく、特定の制限エンドヌクレアーゼにより定温で酵素的にＤＮＡ分子に切れ目を入れることにより行うものである。
【０００８】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）と名付けられた手法は、半修飾ＤＮＡの非修飾鎖に切れ目を入れる特定の制限酵素の能力と、下流の鎖を伸長し置換する５'−３'エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼの能力とによるものである。そして、センス反応から鎖置換されたものがアンチセンス反応用の鋳型として役立つという形でセンス反応とアンチセンス反応とを連動させることにより、指数関数的な増幅が達成される（Ｗａｌｋｅｒ ＧＴ、Ｌｉｔｔｌｅ ＭＣ、Ｎａｄｅａｕ ＪＧ ａｎｄ Ｓｈａｎｋ Ｄ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＰＮＡＳ ８９：３９２〜３９６（１９９２））。このような手法は、ヒト結核菌（Ｗａｌｋｅｒ ＧＴ、Ｌｉｔｔｌｅ ＭＣ、Ｎａｄｅａｕ ＪＧ ａｎｄ Ｓｈａｎｋ Ｄ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＰＮＡＳ ８９：３９２〜３９６（１９９２）、ＨＩＶ−１、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ＣおよびＨＰＶ−１６ Ｎｕｏｖｏ Ｇ．Ｊ．、２０００）、クラミジアトラコマチス（Ｓｐｅａｒｓ ＰＡ、Ｌｉｎｎ Ｐ、Ｗｏｏｄａｒｄ ＤＬ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ ＧＴ、Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：１３０〜１３７（１９９７）を首尾よく増幅するために使用されている。
【０００９】
これまでのＳＤＡの使用は、修飾されたホスホロチオエートヌクレオチドに依存しており、修飾された鎖上では酵素による切断が起こらない半ホスホロチオエートＤＮＡ二本鎖を作製することで、酵素による消化ではなく酵素によるニッキングを生じさせて置換反応を進めるものであった。しかし最近では、いくつかの「ニッカーゼ」酵素が設計されている。こうした酵素は、伝統的な様式でＤＮＡを切断するのではなく、ＤＮＡ鎖の一方に切れ目を生じさせる。「ニッカーゼ」酵素としては、Ｎ．Ａｌｗ１（Ｘｕ Ｙ、Ｌｕｎｎｅｎ ＫＤ ａｎｄ Ｋｏｎｇ Ｈ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎ．Ａｌｗ１ ｂｙ ｄｏｍａｉｎ ｓｗａｐｐｉｎｇ、ＰＮＡＳ ９８：１２９９０〜１２９９５（２００１）、Ｎ．ＢｓｔＮＢ１（Ｍｏｒｇａｎ ＲＤ、Ｃａｌｖｅｔ Ｃ、Ｄｅｍｅｔｅｒ Ｍ、Ａｇｒａ Ｒ、Ｋｏｎｇ Ｈ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｎｉｃｋｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２０００ Ｎｏｖ；３８１（１１）：１１２３〜５）およびＭｌｙ１（Ｂｅｓｎｉｅｒ ＣＥ、Ｋｏｎｇ Ｈ、Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ＭｌｙＩ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｔｏ ａ ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｂｙ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｉｔｓ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ、２００１ Ｓｅｐ；２（９）：７８２〜６、Ｅｐｕｂ ２００１ Ａｕｇ ２３）が挙げられる。このような酵素の使用により、上述のようにしてＳＤＡ手順は簡素化されると考えられる。
【００１０】
また、ＳＤＡは、熱安定性制限酵素（Ａｖａ１）と熱安定性エキソポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）との組合せの使用により改善されてきた。この組合せは、反応の増幅効率を１０８倍増幅から１０１０倍増幅に増やすことが示されているため、この手法を用いると、唯一単独の複製分子を増幅することが可能である。熱安定性ポリメラーゼ／酵素の組合せを用いた結果生じる増幅係数は、ほぼ１０９である（Ｍｉｌｌａ Ｍ．Ａ．、Ｓｐｅａｒｓ Ｐ．Ａ．、Ｐｅａｒｓｏｎ Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．、Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｖａ１ ａｎｄ Ｅｘｏ−Ｂｓｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９７、２４：３９２〜３９６）。
【００１１】
これまでのところ、全ての等温ＤＮＡ増幅手法は、最初の鋳型である二本鎖ＤＮＡ分子を増幅開始前に変性させることが必要である。また、増幅は、各プライミング事象から一度開始されるのみである。
【００１２】
直接検出のためには、標的核酸は、ゲル電気泳動により大きさを基準にして分離してから、標的配列に相補的なプローブとハイブリダイゼーションを行う前に固相支持体に移す（サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング）のが最も一般的である。このプローブは天然の核酸であってもよく、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはロック核酸（ＬＮＡ）もしくはインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）などの類似体であってもよい。このプローブを直接標識（例えば３２Ｐで）してもよいし、または間接的な検出手順を使用してもよい。間接的な手順は、通常はビオチンまたはジゴキシゲニンなどの「タグ」をプローブ中に組み込むことによるもので、こうすることでこのプローブが、酵素に結合した基質の変換または化学発光などの手段により検出される。
【００１３】
核酸の直接検出のために広く使用されている別の方法は、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションである。この方法では、捕獲プローブを固相支持体に結合させ、溶液中の標的核酸と、結合しているプローブとをハイブリダイズさせる。結合していない標的核酸を洗い流してから、標的配列とハイブリダイズする第二のプローブを用いて、結合している核酸を検出する。検出は、上に概要を述べたような直接的または間接的な方法を用いてよい。そのような方法の例としては、サンドイッチハイブリダイゼーションの原理を使用した例である「分枝ＤＮＡ」シグナル検出システム（１９９１、Ｕｒｄｅａ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．、Ｓｅｒ．２４、１９７〜２００）が挙げられる。核酸配列の直接検出のために核酸ハイブリダイゼーションを使用する分野で急速に拡大しているのは、ＤＮＡマイクロアレイの分野である（２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３２、［Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ］；２００４、Ｃｏｐｅ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０、３２３〜３３１、２００４、Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１２、５３７〜５４４）。このプロセスでは、短鎖オリゴヌクレオチド（典型的にはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのシステムで２５ｍｅｒ）から、より長いオリゴヌクレオチド（典型的にはＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよびＡｇｉｌｅｎｔのプラットフォームで６０ｍｅｒ）、また、ｃＤＮＡクローンなどのさらに長い配列まで多岐にわたりうる個々の核酸種を、格子パターン中の固相支持体に固定させるか、または固相支持体上でフォトリソグラフィー的に合成させる。次に、タグを付けた核酸、または標識した核酸の集団をアレイとハイブリダイズさせてから、アレイ中の各スポットへのハイブリダイゼーションのレベルを定量化する。ハイブリダイゼーションには、化学発光など他の検出システムを採用することもできるが、最も一般的には、放射能標識または蛍光標識した核酸（例えばｃＲＮＡまたはｃＤＮＡ）を使用する。
【００１４】
核酸配列の直接検出のために核酸ハイブリダイゼーションを使用する分野で急速に拡大しているのは、ＤＮＡマイクロアレイの分野である（Ｙｏｕｎｇ ＲＡ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ａｒｒａｙｓ、Ｃｅｌｌ １０２：９〜１５（２０００）、Ｗａｔｓｏｎ Ａ、Ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ、Ａ ｎｅｗ ｂｒｅｅｄ ｏｆ ｈｉｇｈ ｔｅｃｈ ｄｅｔｅｃｔｉｖｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：８５０〜８５４（２０００））。このプロセスでは、オリゴヌクレオチドから、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンなどのより長い配列まで多岐にわたりうる個々の核酸種を、格子パターン中の固相支持体に固定させる。次に、タグを付けた核酸または標識した核酸の集団をアレイとハイブリダイズさせてから、アレイ中の各スポットとのハイブリダイゼーションのレベルを定量化する。ハイブリダイゼーションには、他の検出システムも採用されたが、最も一般的には、放射能標識または蛍光標識した核酸（例えばｃＤＮＡ）が使用された。
【００１５】
細菌、酵母および真菌といった微生物の検出のための伝統的な方法としては、選択的な栄養培地上で微生物を培養してから、従来の光学顕微鏡下で見られるような大きさ、形状、胞子産生、生化学反応または酵素反応などの性質および特異的染色性（グラム染色など）に基づいて微生物を分類することが挙げられる。ウイルス種は、特殊化した組織または細胞中で生育した後で、電子顕微鏡法により決定したその構造および大きさに基づいて分類しなくてはならない。このような手法の主な欠点は、全ての微生物が従来の培養液または細胞環境下で生育するわけではないことであり、それがこうした研究法の有用性を限られたものにしている。例えば、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌およびインフルエンザ菌などの細菌（これらは全て髄膜炎の原因となり、中でも髄膜炎菌は髄膜炎および劇症髄膜炎菌血症の両方の原因となる）でいえば、３種とも培養が困難である。血液培養ボトルを最長７日間毎日定期的に調べ、継代培養することが必要である。インフルエンザ菌は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびヘミンの両方を含有する特殊培地と、チョコレート寒天プレート上での生育とを必要とする。血液培養には、トリプチカーゼ大豆ブロスまたはブレインハートインフュージョンおよびポリアネトール硫酸ナトリウムなどの多様な添加物の添加が必要である。重篤な食中毒およびフロッピーベビー症候群の原因となるボツリヌス菌などの微生物の場合、毒素の同定は、食物の抽出物または培養液の上澄みをマウスに注射することと、２日後の結果を可視化することとを伴う。加えて、特殊培地での潜在微生物の培養には１週間かかる。黄色ブドウ球菌のエンテロトキシン（食中毒以外にも皮膚感染症、血液感染症、肺炎、骨髄炎、関節炎および脳膿瘍の原因）は、イオン交換樹脂による毒素の選択的吸収またはモノクローナル抗体を用いた逆受身ラテックス凝集法により、微量で検出される。その類縁菌である表皮ブドウ球菌は、血液感染症を引き起こし、病院内の機器および表面ならびに医療用の機械および器具を汚染する。
【００１６】
非ウイルス性の微生物は、ブドウ糖、麦芽糖またはショ糖などの基質上での発酵反応期間中に特定のアミノ酸または代謝物を産生するなどといったその代謝特性に基づいて分類することもできる。別の方法としては、微生物を、抗生物質に対するその感受性に基づいて型判定することもできる。細胞表面の抗原に対する、または毒素などの分泌されたタンパク質に対する特異的な抗体も、微生物を同定または型判定するために使用される。しかしながら、上述の全ての方法は、次に行われる検査の前に微生物を培養することによるものである。微生物の培養は、費用が高価で時間がかかり、培養が比較的容易な微生物による汚染または過剰増殖に見舞われる可能性もある。この手法は、決定的な診断結果を得るために多くの試験を同じ試料で行われなければならないという点では、完成度も比較的低い。大部分の微生物は、公知の培地中で容易に生育できるものではないため、異なる種の微生物が混在した典型的な集団が、野生状態で、または高等生物と共に存在していると、その検出レベルは下がる。
【００１７】
病原微生物の検出および同定のための他の方法は、血清学的研究法に基づくものであり、ここで微生物への感染に応じて抗体が産生される。例えば、髄膜炎菌は、その莢膜多糖類の構造的相違に基づいて分類可能である。このような菌は異なる抗原性を有しており、これにより主要な５つの血清型を決定できる（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５）。酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または放射性免疫測定法（ＲＩＡ）は、そのような抗体の産生を評価できる。これらの方法はいずれも、感染経過期間中に宿主動物によって産生される特異的抗体の存在を検出するものである。こうした方法は、抗体が宿主動物によって産生されるのにいくらか時間がかかるために、ごく初期の感染は検出されないことが多いという点で、欠点がある。加えて、このようなアッセイを使用した場合、過去の感染と活動性感染とを確実に区別することができない。
【００１８】
より最近では、感染症の診断のための分子法の使用に大きな関心が寄せられている。こうした方法により、病原微生物の高感度かつ特異的な検出がもたらされる。このような方法の例としては、「分枝ＤＮＡ」シグナル検出システムが挙げられる。この方法は、サンドイッチハイブリダイゼーションの原理を使用した一例である（Ｕｒｄｅａ ＭＳら、Ｂｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＨＩＶ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ、１９９１；（２４）：１９７〜２００）。
【００１９】
細菌の検出および分類のための別の方法は、１６ＳリボソームＲＮＡ配列の増幅である。１６Ｓ ｒＲＮＡは、多様な臨床試料または環境試料中の細菌種の検出用のＰＣＲ増幅アッセイにおける使用に適した標的であることが報告されており、特定のさまざまな微生物を同定するために頻繁に使用されているが、その理由は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が種特異的な多型性を示すことにある（Ｃｌｏｕｄ，Ｊ．Ｌ．、Ｈ．Ｎｅａｌ、Ｒ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｒｙ、Ｃ．Ｙ．Ｔｕｒｅｎｎｅ、Ｍ．Ｊａｍａ、Ｄ．Ｒ．Ｈｉｌｌｙａｒｄ、ａｎｄ Ｋ．Ｃ．Ｃａｒｒｏｌｌ、２００２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０、４００〜４０６）。しかし、細菌の純粋培養が必要であり、種を特定するためには、ＰＣＲ増幅後にも試料の配列を決定するか、またはマイクロアレイタイプの装置に試料をハイブリダイズさせなくてはならない（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｍ、Ｋａｋｉｎｕｍａ Ｋ、Ｈａｙａｓｈｉ Ｈ、Ｎａｇａｉ Ｈ、Ｉｔｏ Ｋ、Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｒ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００３ Ｊｕｎ；４１（６）：２６０５〜１５）。このような方法は、費用が高価で、時間も手間もかかる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
大部分の微生物のゲノムが配列解析により決定されているものの、関心対象の微生物を検出するための特異的なプローブまたはプライマーを得ることについては未だに課題がある。ゲノムは４種の塩基を含有しているため、所与の微生物に特異的と思われる十分な縮重プライマーまたはプローブを調製することは困難であることが多い。潜在的な別の問題は、特定の微生物の重要な遺伝子またはゲノムのいくつかを使用する権利が特許権により他者に帰属していることである。この所有権は、競合する検出アッセイが市場に投入されるのを阻止または遅延させることができる。特定の微生物用のマーカーとして使用できる新しい核酸が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、微生物特異的であり微生物検出のために使用できる、多数の微生物についての改変核酸を得た。
【００２２】
一態様では、本発明は、配列表番号５１中の配列番号１〜配列番号７６からなる群から選択される配列を有する、Ｃ型肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、配列表番号１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、アシネトバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、配列表番号２中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、バシラス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、配列表番号３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、バクテロイデス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、配列表番号４中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、バルトネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、配列表番号５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ボルデテラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、配列表番号６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ボレリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、配列表番号７中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ブルセラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、配列表番号８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、カンピロバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、配列表番号９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、クラミジア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０中の配列番号１〜配列番号３９からなる群から選択される配列を有する、クロストリジウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、配列表番号１１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、コルネバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、配列表番号１２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、大腸菌の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、配列表番号１３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エールリヒア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、配列表番号１４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エンテロコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、配列表番号１５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、フゾバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、配列表番号１６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ヘモフィルス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、配列表番号１７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヘリコバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、配列表番号１８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、レジオネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、配列表番号１９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、レプトスピラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、配列表番号２０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、リステリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、配列表番号２１中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、マイコバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、配列表番号２２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マイコプラズマ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、配列表番号２３中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ナイセリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、配列表番号２４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノルカジア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、配列表番号２５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、シュードモナス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、配列表番号２６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、リケッチア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、配列表番号２７中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、サルモネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、配列表番号２８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、セラチア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、配列表番号２９中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、シゲラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５２】
別の態様では、本発明は、配列表番号３０中の配列番号１〜配列番号５２からなる群から選択される配列を有する、スタフィロコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５３】
別の態様では、本発明は、配列表番号３１中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ストレプトコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、配列表番号３２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ストレプトミセス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５５】
別の態様では、本発明は、配列表番号３３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、トレポネーマ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５６】
別の態様では、本発明は、配列表番号３４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、トロフェルミア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５７】
別の態様では、本発明は、配列表番号３５中の配列番号１〜配列番号６０からなる群から選択される配列を有する、プラスモジウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５８】
別の態様では、本発明は、配列表番号３６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、アスペルギリス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５９】
別の態様では、本発明は、配列表番号３７中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、カンジダ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６０】
別の態様では、本発明は、配列表番号３８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、クリプトコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６１】
別の態様では、本発明は、配列表番号３９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、パラコクシジオイデス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６２】
別の態様では、本発明は、配列表番号４０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、リゾプス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６３】
別の態様では、本発明は、配列表番号４１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、フランシセラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６４】
別の態様では、本発明は、配列表番号４２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ビブリオ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６５】
別の態様では、本発明は、配列表番号４３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エルシニア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６６】
別の態様では、本発明は、配列表番号４４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＪＣポリオーマウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６７】
別の態様では、本発明は、配列表番号４６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、アンデスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６８】
別の態様では、本発明は、配列表番号５２中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６９】
別の態様では、本発明は、配列表番号５３中の配列番号１〜配列番号１２８からなる群から選択される配列を有する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７０】
別の態様では、本発明は、配列表番号５４中の配列番号１〜配列番号１６２からなる群から選択される配列を有する、インフルエンザウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７１】
別の態様では、本発明は、配列表番号５５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＢＫウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７２】
別の態様では、本発明は、配列表番号５６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、バーマ（Ｂａｒｍａｈ）ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７３】
別の態様では、本発明は、配列表番号５７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、カリシウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７４】
別の態様では、本発明は、配列表番号５８中の配列番号１〜配列番号４８からなる群から選択される配列を有する、コロラドダニ熱ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７５】
別の態様では、本発明は、配列表番号５９中の配列番号１〜配列番号２８からなる群から選択される配列を有する、口蹄ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７６】
別の態様では、本発明は、配列表番号６０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＧＢ肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７７】
別の態様では、本発明は、配列表番号６１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヘンダウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７８】
別の態様では、本発明は、配列表番号６２中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、ヒトアデノウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７９】
別の態様では、本発明は、配列表番号６３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトアストロウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８０】
別の態様では、本発明は、配列表番号６４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトボカウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供するウイルス。
【００８１】
別の態様では、本発明は、配列表番号６５中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ヒトコロナウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供するウイルス。
【００８２】
別の態様では、本発明は、配列表番号６６中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ヒトエンテロウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８３】
別の態様では、本発明は、配列表番号６７中の配列番号１〜配列番号３６からなる群から選択される配列を有する、ヒトヘルペスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８４】
別の態様では、本発明は、配列表番号６８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトメタニューモウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８５】
別の態様では、本発明は、配列表番号６９中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ヒトパラインフルエンザウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８６】
別の態様では、本発明は、配列表番号７０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトパレコウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８７】
別の態様では、本発明は、配列表番号７１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ヒトライノウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８８】
別の態様では、本発明は、配列表番号７２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトＲＳウイルス（ヒト呼吸器合胞体ウイルス）の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８９】
別の態様では、本発明は、配列表番号７３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、麻疹ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９０】
別の態様では、本発明は、配列表番号７４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ムンプスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９１】
別の態様では、本発明は、配列表番号７５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノロウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９２】
別の態様では、本発明は、配列表番号７６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノーウォークウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９３】
別の態様では、本発明は、配列表番号７７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、パルボウイルスＢ１９の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９４】
別の態様では、本発明は、配列表番号７８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ポリオウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９５】
別の態様では、本発明は、配列表番号７９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、狂犬病ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９６】
別の態様では、本発明は、配列表番号８０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ロスリバーウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９７】
別の態様では、本発明は、配列表番号８１中の配列番号１〜配列番号１２４からなる群から選択される配列を有する、ロタウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９８】
別の態様では、本発明は、配列表番号８２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＳＡＲＳコロナウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９９】
別の態様では、本発明は、配列表番号８３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＴＴウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１００】
別の態様では、本発明は、配列表番号８４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＴＴＶミニウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０１】
別の態様では、本発明は、配列表番号８５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、西ナイルウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、配列表番号８６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、アルファウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０３】
別の態様では、本発明は、配列表番号８７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ラクダ痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０４】
別の態様では、本発明は、配列表番号８８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、牛痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０５】
別の態様では、本発明は、配列表番号８９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、コクシエラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、配列表番号９０中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、クリミアコンゴ出血熱(Crimean-Congo HF)の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、配列表番号９１中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、デングウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０８】
別の態様では、本発明は、配列表番号９２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、東部ウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０９】
別の態様では、本発明は、配列表番号９３中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、エボラウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１０】
別の態様では、本発明は、配列表番号９４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マールブルクウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１１】
別の態様では、本発明は、配列表番号９５中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、グアナリトウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１２】
別の態様では、本発明は、配列表番号９６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ハンタウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、配列表番号９７中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ハンターンウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１４】
別の態様では、本発明は、配列表番号９７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、日本脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１５】
別の態様では、本発明は、配列表番号９９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、フニンウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１６】
別の態様では、本発明は、配列表番号１００中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ラッサウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、マチュポウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１８】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、サル痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１９】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マレー渓谷脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２０】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ニパーウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２１】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０５中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、リフト渓谷熱ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２２】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、サビアウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０７中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、シンノンブレウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２４】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、大痘瘡ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２５】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、小痘瘡ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、配列表番号１１０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２７】
別の態様では、本発明は、配列表番号１１１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、西部ウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２８】
別の態様では、本発明は、配列表番号１１２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、黄熱病ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２９】
この誘導核酸または微生物核酸の部分は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０ ７０、８０、９０、１００個など、またはそれを超える数のヌクレオチドとすることができる。いくつかの誘導核酸または微生物核酸では、その部分は、例えば１５、１６、１７、１８または１９個など、２０個未満であってもよい。
【０１３０】
微生物の誘導核酸は、シトシンをウラシルに改変する重硫酸塩などの作用剤で微生物核酸を処理することにより形成できる。この誘導核酸の増幅後、実質的にアデニン、グアニンおよびチミン塩基を有する、微生物の改変核酸が形成される。
【０１３１】
メチル化シトシンを通常は含有しない二本鎖ＤＮＡの場合、この処理ステップにより、それぞれがアデニン、グアニン、チミンおよびウラシル塩基を含有する２つの誘導核酸が生じる。この２つの誘導核酸は、二本鎖ＤＮＡの２本の一本鎖から作製される。この２つの誘導核酸は、実質的にシトシンを有していないが、元の未処理のＤＮＡ分子と同じ総塩基数および配列長をそのまま有している。重要なのは、この２つの誘導体は互いに相補的ではなく、トップ・ストランドおよびボトム・ストランドを形成することである。１本または複数のこの鎖を使用して誘導核酸を生じさせるか、またはこれを増幅して改変核酸分子を作製することができる。
【０１３２】
本明細書を通じ、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、明示された要素、整数もしくはステップ、または要素群、整数群もしくはステップ群を包含することを意味するものであって、他の任意の要素、整数もしくはステップ、または要素群、整数群もしくはステップ群を除外することを意味するものでないことは理解されよう。
【０１３３】
本明細書に包含されている、文書、行為、材料、機器、論文などについての検討の一切は、単に本発明のために背景を示すことを目的としたものである。このような検討は、これらの事項のうち任意または全てのものが先行技術の基礎の一部を形成していると認めたものであるとして、または、本明細書の各請求項の優先出願日以前にオーストラリア国内に存在していた、本発明に関する分野における一般常識であったと認めたものであるとして解釈されるべきではない。
【０１３４】
本発明をより明快に理解できるように、以下の図面および実施例を参照して、好ましい実施形態を説明していく。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】Ｃ型肝炎１ａのゲノム（トップ・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号７７）。
【図２】Ｃ型肝炎１ａのゲノム（ボトム・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号７８）。
【図３】Ｃ型肝炎１ａの誘導ゲノム（トップ・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号１）。
【図４】Ｃ型肝炎１ａの誘導ゲノム（ボトム・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号２０）。
【図５】Ｃ型肝炎１ａの改変ゲノム（トップ・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号３９）。
【図６】Ｃ型肝炎１ａの改変ゲノム（ボトム・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号５８）。
【発明を実施するための形態】
【０１３６】
定義
本明細書で使用する「ゲノム改変」という用語は、ゲノムの（または他の）核酸が、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）の４塩基で構成されているものから、実質的にアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）塩基を含有するが実質的に同じ総塩基数を有したままのものへ改変されることを意味する。
【０１３７】
本明細書で使用する「誘導核酸」という用語は、Ａ、Ｇ、ＴおよびＵ塩基（またはＡ、ＧもしくはＴではない他の何らかの塩基もしくは塩基様物質）を実質的に含有し、かつ、対応する未改変の微生物核酸と実質的に同じ総塩基数を有する核酸を意味する。微生物ＤＮＡ中の実質的に全てのシトシンは、作用剤(agent)での処理の間にウラシルへ変換されたことになる。メチル化などにより変化したシトシンが、必ずしもウラシル（またはＡ、ＧもしくはＴではない他の何らかの塩基もしくは塩基様物質）に変換されるとは限らないことは理解されよう。微生物核酸は、通常はメチル化シトシン（または他のシトシン変化）を含有しないため、この処理ステップは、好ましくは全てのシトシンを変換する。好ましくは、シトシンはウラシルに改変される。
【０１３８】
本明細書で使用する「改変核酸」という用語は、誘導核酸を増幅した後に結果として得られる核酸産物を意味する。この誘導核酸中のウラシルは、その後誘導核酸の増幅の間にチミン（Ｔ）と置き換わり、改変核酸分子を形成する。結果的に得られたこの産物は、対応する未改変の微生物核酸と実質的に同じ総塩基数を有するが、３塩基（Ａ、ＧおよびＴ）の組合せと実質的になっている。
【０１３９】
本明細書で使用する「改変配列」という用語は、改変核酸を形成するために誘導核酸を増幅した後に結果として得られる核酸の配列を意味する。結果的に得られたこの改変配列は、対応する未改変の微生物の核酸配列と実質的に同じ総塩基数を有するが、３塩基（Ａ、ＧおよびＴ）の組合せと実質的になっている。
【０１４０】
本明細書で使用する「非変換配列」という用語は、処理前の微生物核酸の核酸配列を意味する。非変換配列は、通常は、天然に存在する微生物核酸の配列である。
【０１４１】
本明細書で使用する「改変する」という用語は、シトシンを別のヌクレオチドに変換することを意味する。好ましくは、作用剤によりシトシンがウラシルに改変されて、誘導核酸が形成される。
【０１４２】
本明細書で使用する「シトシンを改変する作用剤」という用語は、シトシンを別の化学物質(chemical entity)に変換する能力をもつ作用剤を意味する。好ましくは、この作用剤はシトシンをウラシルに改変し、その後このウラシルが、誘導核酸の増幅の間にチミンで置換される。好ましくは、シトシンを改変するために使用される作用剤は、亜硫酸水素ナトリウムである。同じように、シトシンを改変するがメチル化シトシンは改変しない他の作用剤を、本発明の方法において使用することもできる。例としては、亜硫酸水素塩、酢酸塩またはクエン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、この作用剤は、酸性の水性条件の存在下でシトシンをウラシルに改変する試薬である亜硫酸水素ナトリウムである。亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）は、シトシンの５，６二重結合と容易に反応して、スルホン化したシトシン反応中間体を形成し、これは脱アミノ化を起こしやすく水の存在下ではウラシル亜硫酸塩を生じる。必要に応じ、亜硫酸基は弱アルカリ条件下で除去することができ、こうすることで結果としてウラシルが形成される。したがって、全てのシトシンがウラシルに変換される可能性があることになる。しかしながら、メチル化シトシンがある場合、これはメチル化により保護されていることから、改変用の試薬では変換できない。シトシン（または他の任意の塩基）を酵素的手段により改変して、本発明により教示されるような誘導核酸を獲得することは可能であろうということは、理解されるであろう。
【０１４３】
核酸中の塩基を改変しうる、広く使われている２つの一般的方法があり、それは化学的方法および酵素的方法である。したがって、本発明のための改変は、天然に存在する酵素によっても、または現時点で未報告の人工的に作成もしくは選択された酵素によっても実行できる。亜硫酸水素塩法などの化学的処理を用いれば、適切な化学的ステップを経てシトシンをウラシルに変換できる。同様に、例えばシトシンデアミナーゼを用いれば、誘導核酸を形成するための変換を実行しうる。本発明者らが知る限り、シトシンデアミナーゼについての最初の報告は、１９３２年のＳｃｈｍｉｄｔ，Ｇ．、Ｚ．ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０８、１８５である（１９５０、Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｐ．、Ｓａｂｌｅ，Ｈ．Ｚ．、Ｌａｍｐｅｎ，Ｊ．Ｏ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、１８４、１７〜２８、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｓｉｎｅｓ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓも参照のこと）。初期のこの研究では、シトシンデアミナーゼは他の核酸デアミナーゼ・フリーでは得られなかったが、Ｗａｎｇらは、そうした活性を酵母および大腸菌から精製することに成功した。このように、誘導核酸を形成するためにシトシンの何らかの酵素的変換を行うと、最終的には次の複製期間中に当該位置にシトシンとは違う塩基が挿入されて、改変ゲノムが得られることになる。誘導体に続いて改変ゲノムを生み出すための化学的および酵素的変換は、天然に存在する微生物核酸中の、プリンでもピリミジンでも任意の核酸塩基に適用可能である。
【０１４４】
本明細書で使用する「ゲノムまたは核酸の改変形」という用語は、天然に存在するものであるか合成されたものであるかにかかわらず、通常は一般的な４塩基Ｇ、Ａ、ＴおよびＣを含有し、ゲノム中のＣの大部分または全てが適切な化学的改変およびそれに続く増幅手順によってＴに変換されたために当該時点ではＧ、ＡおよびＴの３塩基のみから主になる、ゲノムまたは核酸を意味する。ゲノムの改変形は、ゲノムの相対的な複雑性が、基本の４塩基から３塩基組成に低下していることを意味する。
【０１４５】
本明細書で使用する「塩基様物質(base-like entity)」という用語は、シトシンの改変により形成されるものを意味する。塩基様物質は、誘導核酸の増幅期間中にＤＮＡポリメラーゼにより認識されることが可能であり、このポリメラーゼによって、誘導核酸中の塩基様物質の反対の位置に新しく形成される相補的ＤＮＡ鎖上にＡ、ＧまたはＴが配置される。通常、塩基様物質は、対応する未処理の微生物核酸中のシトシンから改変されたウラシルである。塩基様物質の例としては、プリンであるかピリミジンであるかを問わず、任意の核酸塩基が挙げられる。
【０１４６】
本明細書で使用する「相対的な複雑性の低下」という用語はプローブ長に関するもので、言い換えれば、同じ大きさの２つのゲノム（第一のゲノムは「そのまま」でありＧ、Ａ、ＴおよびＣの４塩基からなるが、第二のゲノムは全く同じ長さではあるがいくつかのシトシン（理想的には全てのシトシン）がチミンに変換されている）において、所与の一連の分子条件下、同等の特異性および同等レベルで、特定の遺伝子座に対するプローブのハイブリダイゼーションが達成されるのに必要な平均プローブ長が増加することである。試験される遺伝子座は、元の変換されていないゲノム中ならびに変換されたゲノム中の同じ位置にある。平均で、１１塩基長のプローブは、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣの４塩基からなる４１９４３０４塩基（４１１＝４１９４３０４）の正規のゲノム中に、そのプローブが完全にハイブリダイズする１つの特異的な位置を有するだろう。しかし、そのような４１９４３０４塩基の正規のゲノムが亜硫酸水素塩または他の適当な手段によって一度変換されると、変換されたこのゲノムは、今度は３塩基のみで構成され、明らかに複雑性が低下する。しかし、このようにゲノムの複雑性が低下した結果、それまで特異的であった１１ｍｅｒプローブがハイブリダイズできる特異的部位が改変ゲノム内にはもはやないということである。亜硫酸水素塩による変換の結果として新規に生じた、１１塩基の配列に相当する可能性のある位置が、今度は他にたくさんある。元の遺伝子座を見つけてそことハイブリダイズするためには、今度は１４ｍｅｒのプローブが必要であろう。直感に反すると最初は感じられるかもしれないが、そのようなわけで、今や改変された３塩基ゲノムであるものの中で元の位置を検出するためには、それまでより増加したプローブ長が必要であり、その理由は、ゲノムのより多くの部分が同じように見える（似たような配列をより多く有している）からである。したがって、ゲノムの相対的な複雑性の低下（または３塩基ゲノムの単純性）とは、元の特異的部位を見つけるために、より長いプローブを設計しなくてはならないことを意味する。
【０１４７】
本明細書で使用する「ゲノムの相対的な複雑性の低下」という用語は、微生物特異的になりうるプローブ長の、未改変のＤＮＡと比べた場合の増加分で評価できる。この用語は、微生物の存在を決定するうえで使用されるプローブ配列の型の意味も含んでいる。このようなプローブは、ＰＮＡもしくはＬＮＡの骨格、または、ＩＮＡの説明で記載したもののように、骨格への改変付加など、従来にない骨格を有することがある。したがって、ＩＮＡ中のようにインターカレートする偽ヌクレオチドなどの付加的な構成要素をプローブが有するか否かにかかわらず、ゲノムは相対的な複雑性が低下していると考えられる。例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）およびその混合物およびそのハイブリッド、ならびに、限定はしないがホスホロチオエート、メチルホスホレート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｌａｔｅ）、ホスホラミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｂｏｒａｎｏａｔｅ）といったそのリン原子改変体が挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在しないヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２'−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３'−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２'−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれるヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、これらに限定されないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート（ｆｏｒｍａｃｅｔａｔｅ）、チオホルムアセテート（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｔｅ）、および、アミドを含む連結基などのリン非含有化合物を、ヌクレオチドへの連結に使用してもよい。とりわけ、核酸および核酸類似体は、１つまたは複数のインターカレーター偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含んでよい。ＩＰＮの存在は、核酸分子にとっての複雑性を部分的に説明するものではなく、ＰＮＡ中でのように、その複雑性の骨格部分を成すものでもない。
【０１４８】
「ＩＮＡ」とは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０３／０５１９０１号、国際公開第０３／０５２１３２号、国際公開第０３／０５２１３３号および国際公開第０３／０５２１３４号（Ｕｎｅｓｔ Ａ／Ｓ）の教示に従うインターカレーティング核酸を意味する。ＩＮＡは、１つまたは複数のインターカレーター偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）分子を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である。
【０１４９】
「ＨＮＡ」とは、例えばＶａｎ Ａｅｔｓｃｈｏｔら、１９９５により記載されたような核酸を意味する。
【０１５０】
「ＭＮＡ」とは、Ｈｏｓｓａｉｎら、１９９８により記載されたような核酸を意味する。
【０１５１】
「ＡＮＡ」は、Ａｌｌｅｒｔら、１９９９により記載された核酸を指す。
【０１５２】
「ＬＮＡ」は、国際公開第９９／１４２２６号（Ｅｘｉｑｏｎ）に記載されたような任意のＬＮＡ分子であってよく、好ましくは、ＬＮＡは、国際公開第９９／１４２２６号の要約に示されている分子から選択される。より好ましくは、ＬＮＡはＳｉｎｇｈら、１９９８、Ｋｏｓｈｋｉｎら、１９９８、または、Ｏｂｉｋａら、１９９７に記載されたような核酸である。
【０１５３】
「ＰＮＡ」は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１により記載されたようなペプチド核酸を指す。
【０１５４】
本明細書で使用する「相対的な複雑性の低下」は、ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ（配列番号： ）という配列と、ＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号： ）という同じ長さの配列との間にある何らかの数学的複雑性の違いというような、塩基が現れる順序を指すものでもなければ、Ｗａｒｉｎｇ，Ｍ．＆Ｂｒｉｔｔｅｎ Ｒ．Ｊ．、１９６６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５４、７９１〜７９４、および、Ｂｒｉｔｔｅｎ，Ｒ．Ｊ ａｎｄ Ｋｏｈｎｅ Ｄ Ｅ．、１９６８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６１、５２９〜５４０による科学文献、ならびにその中に記載された、Ｃａｒｎｅｇｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｙｅａｒｂｏｏｋの報告に由来するもっと以前の参考文献内に紹介されている、ゲノムの相対的な大きさについての独自の再結合データ（および、推定に基づいたゲノムの複雑性）を指すものでもない。
【０１５５】
本明細書で使用する「ゲノムの相対的な複雑性」は、分子プローブにより評価される、２つのゲノム中の塩基の変化しない位置（元のゲノムおよび変換されていないゲノムは両方とも、１からｎの不変の位置に塩基を有する）を指す。ある特定の女性の３０億塩基対の半数体ヒトゲノムの場合、この不変の位置は１からｎまでであると定義され、このときｎは３０００００００００である。１からｎの配列において、元のゲノムでｉ番目の塩基がＣであれば、変換後のゲノムではｉ番目の塩基はＴである。
【０１５６】
本明細書で使用する「ゲノム核酸」という用語は、微生物（原核生物および単細胞の真核生物）のＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質コード核酸、タンパク質非コード核酸、ならびに、原核生物および単細胞の真核微生物のリボソーム遺伝子領域を包含する。
【０１５７】
本明細書で使用する「微生物ゲノム」という用語は、染色体の核酸ならびに染色体外の核酸、他にも、プラスミド、バクテリオファージおよび最も広い意味での可動因子など、そのゲノムに一時的に存在するものを網羅する。「ゲノム」は、Ｓ．ｇａｌａｃｔｉｄｅにより例証されるような中心となる構成要素を有し、また、別の分離株間で異なるコード因子および非コード因子を有する可能性もある。
【０１５８】
本明細書で使用する「微生物由来のＤＮＡ」という用語は、微生物から直接得られるＤＮＡ、または、逆転写酵素などの公知もしくは適当な方法のいずれかにより微生物のＲＮＡをＤＮＡに変換することで間接的に得られるＤＮＡを包含する。
【０１５９】
本明細書で使用する「微生物」という用語は、ファージ、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、藻類、原生動物、スピロヘータ、単細胞生物、または、どれだけ多様に分類されているかにかかわらず、Ｍａｒｇｕｌｉｓ，Ｌ．ら、１９９０、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｃｔｉｓｔａ、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ ＵＳＡによる原生生物界のような他の任意の微生物、または、Ｈａｒｒｉｓｏｎｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２版、Ｊ Ｄ Ｗｉｌｓｏｎら編、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｉｎｃならびにこれ以降の版で定義されているような、ヒトと関わりのある微生物を包含する。また、この用語は、ＯＭＩＭ、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｇｏｖ．に定義された、ヒトの病態と関連して記載された全ての微生物も包含する。
【０１６０】
本明細書で使用する「微生物特異的な核酸分子」という用語は、本発明による方法を用いて決定されたかまたは得られた、微生物に特異的な１つまたは複数の配列を有する分子を意味する。
【０１６１】
本明細書で使用する「微生物の分類レベル」という用語は、科、属、種、系統、型、または、同一もしくは異なる地理的集団もしくは底生集団に由来する異なる集団を包含する。細菌の場合は、細菌界、プロテオバクテリア門、βプロテオバクテリア綱、ナイセリア目、ナイセリア科、ナイセリア属といった、一般に認識された図式が使用される。異なる集団は、微生物内に細胞内物質の形で存在するＤＮＡ分子（プラスミドまたはファージミド）中の、一塩基の変化もしくは変異についての多型であってもよいし、または、病原性島など、微生物ゲノムの多型染色体領域であってもよい。微生物およびウイルスのゲノムの流動性は認識されており、そうした流動性には、独立の核酸断片内に存在しうるウイルスゲノムのキメラ性も包含される。したがって、異なる動物に由来するゲノム領域の再集合により新規に生じる系統、例えば、他の哺乳動物ウイルスのゲノムまたはトリウイルスのゲノムから獲得された部分のキメラとしての新型ヒトインフルエンザ系統なども包含される。
【０１６２】
本明細書で使用する「密接な配列類似性」という用語は、尺度としての、配列の相対的な複雑性およびプローブ長についての上述の定義を包含する。
【０１６３】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、本明細書中の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な」という用語と互換的に使用され、改変された微生物核酸の全てまたは一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするその能力によって核酸を容易に同定しうることを意味する。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、とは、核酸のアニーリングが、例えば、高温および／または塩の含有量が低いなど、標準条件下で起きることを意味し、これにより非相補的なヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションが妨げられやすい。条件は用途によって変化すると考えられるが、固定化したＤＮＡに核酸プローブをハイブリダイゼーションするためのストリンジェントなプロトコールの例（０．１倍ＳＳＣ、６８℃で２時間を含む）が、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２、３８７〜３８９ページに記載されている。
【０１６４】
材料および方法
ＤＮＡの抽出
一般的には、微生物ＤＮＡ（またはウイルスＲＮＡ）は、適当な任意の入手源から入手できる。例としては、細胞培養物、ブロス培養物、環境試料、臨床試料、体液、液体試料、組織などの固体試料が挙げられるが、これらに限定されない。試料からの微生物ＤＮＡは、標準的な手順により入手できる。適当な抽出の例は、以下のとおりである。関心対象の試料を、４００μｌの、７Ｍグアニジン塩酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ６．４、１％トリトン−Ｘ−１００、５０ｍＭプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）、酵母ｔＲＮＡ１００μｇ／ｍｌ中に入れる。試料は、使い捨ての１．５ｍｌ内筒で完全にホモジナイズした後、６０℃で４８時間放置する。インキュベーション後、試料を、ドライアイスで５分間／９５℃で５分間の、凍結／解凍サイクルに５サイクル供する。次に、試料をボルテックスしてから微量遠心管中に入れて２分間回転させ、細胞片をペレット化する。上澄みを清潔な管に取り出し、希釈して塩濃度を低下させてから、フェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた後、１０ｍＭトリス／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ５０μｌ中で再懸濁させる。
【０１６５】
具体的には、標準的な寒天プレート（それぞれの種に特異的な栄養所要量とともに）上で育成したグラム陽性菌およびグラム陰性菌からのＤＮＡ抽出を、以下のとおり実施した。
【０１６６】
グラム陰性菌からのＤＮＡ抽出のためのプロトコールは以下のとおりであった。
ａ）滅菌済の爪楊枝を用い、培養プレートから細菌コロニーをこすり取り、滅菌済の１．５ｍｌ遠心管に入れた。
ｂ）チオシアン酸グアニジン抽出緩衝溶液１８０μｌ（７Ｍチオシアン酸グアニジン、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭトリス／Ｈｃｌ ｐＨ７．６、１％トリトン−Ｘ−１００）を加え、試料を混合して細菌コロニーを再懸濁させた。
ｃ）プロテイナーゼＫ２０μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、試料をよく混合した。
ｄ）試料を５５℃で３時間インキュベートし、細胞を溶解させた。
ｅ）水２００μｌを各試料に加えてから、試料を穏やかなピペッティングにより混合した。
ｆ）フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）４００μｌを加えてから、試料を２×１５秒間ボルテックスした。
ｇ）次に、試料を微量遠心管中で１４０００ｒｐｍで４分間回転させた。
ｈ）水相を清潔な１．５ｍｌ遠心管中に取り出した。
ｉ）フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）４００μｌを加えてから、試料を２×１５秒間ボルテックスした。
ｊ）次に、試料を微量遠心管中で１４０００ｒｐｍで４分間回転させた。
ｋ）水相を清潔な１．５ｍｌ遠心管中に取り出した。
ｌ）１００％エタノール８００μｌを各試料に加え、試料を短時間ボルテックスしてから−２０℃で１時間放置した。
ｍ）試料を微量遠心管中で１４０００ｒｐｍ、４℃で４分間回転させた。
ｎ）ＤＮＡペレットを７０％エタノール５００μｌで洗浄した。
ｏ）試料を微量遠心管中で１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間回転させ、エタノールを捨ててから、ペレットを５分間風乾させた。
ｐ）最後に、１００μｌの、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０中でＤＮＡを再懸濁させた。
ｑ）溶液の吸光度を２３０、２６０、２８０ｎｍで測定することにより、ＤＮＡ濃度および純度を計算した。
【０１６７】
グラム陽性菌からのＤＮＡ抽出のためのプロトコールは以下のとおりであった。
ａ）滅菌済の爪楊枝を用い、培養プレートから細菌コロニーをこすり取り、滅菌済の１．５ｍｌ遠心管に入れた。
ｂ）２０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）１８０μｌおよびリゾスタフィン（Ｓｉｇｍａ）２００μｇを各試料に加え、試料を穏やかに混合して細菌コロニーを再懸濁させた。
ｃ）試料を３７℃で３０分間インキュベートして、細胞壁を分解させた。
ｄ）次に、試料を処理してから、グラム陽性菌用のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔのプロトコールに従い、ＤＮＡを抽出した。
【０１６８】
患者の細胞診用試料からのＤＮＡ抽出。
ａ）試料を手で勢いよく振って、沈降した細胞を全て再懸濁させ、溶液の均一性を確保した。
ｂ）再懸濁させた細胞４ｍｌを、１５ｍｌのＣｏｓｔａｒ遠心管に移した。
ｃ）この管を、スイングアウト型のバケットローター中で３０００×ｇで１５分間遠心分離した。
ｄ）この上澄みは、注意深くデカントしてから、ペレット化した細胞物質を損なわないようにして捨てた。
ｅ）ペレット化した細胞を、溶解緩衝溶液（１００ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．５％ＳＤＳ、０．５％トリトン−Ｘ−１００）２００μｌ中で再懸濁させてから、溶液が均質になるまで十分に混合した。
ｆ）試料８０μｌを９６ウェルの試料調製プレートに移した。
ｇ）プロテイナーゼＫ２０μｌを加えてから、溶液を５５℃で１時間インキュベートした（この手順により細胞が溶解する）。
【０１６９】
尿試料からのＤＮＡ抽出
ＱＩＡａｍｐ ＵｌｔｒａＳｅｎｓ（商標）Ｖｉｒｕｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋに従い、開始容量１ｍｌの尿からＤＮＡを抽出した。
【０１７０】
ＤＮＡ試料の亜硫酸水素塩処理
ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（商標）Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＤＮＡ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に従い、亜硫酸水素塩処理を実施した。以下も参照のこと。
【０１７１】
驚くべきことに、本発明者らは、例えばヒト細胞試料中に微生物ＤＮＡがある場合などに、微生物ＤＮＡを他の核酸源から分離する必要がないことを見出した。この処理ステップは、異なるＤＮＡ型が大規模に混ざり合ったものについて使用でき、さらに、微生物特異的な核酸を本発明により同定することもできる。複合ＤＮＡ混合物における検出の限界は、標準的なＰＣＲ検出の限界程度で、標的核酸分子の単一複製まではできると推定される。
【０１７２】
試料
本発明用には、適当な任意の試料が使用できる。例としては、微生物培養物、臨床試料、獣医学的試料、生体液、組織培養試料、環境試料、水試料、溶出物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は任意の微生物の検出に適用できるため、こうした列挙は網羅的なものとみなされるべきではない。
【０１７３】
キット
本発明は、多様なキット、またはキットの組合せの形態で実施でき、手作業、半自動化または完全にロボット化したプラットフォームに関して具体例が提示できる。好ましい一形態では、ＭｅｔｈｙＥａｓｙ（商標）またはＨｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（商標）ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により、ＥｐＭｏｔｉｏｎなどのロボットプラットフォームを用いて９６または３８４プレート中での核酸の変換が可能である。
【０１７４】
亜硫酸水素塩処理
核酸の効果的な亜硫酸水素塩処理のための例示的プロトコールを、以下に示す。このプロトコールを実施すると、結果として、実質的に全てのＤＮＡが処理されて保持される。この方法は、本明細書ではＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ（ＨＧＳ）法とも呼ぶ。試料または試薬の容量または分量を変更できることは理解されよう。
【０１７５】
亜硫酸水素塩処理の好ましい方法は、米国特許出願第１０／４２８３１０号または国際出願ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００５４９号で知ることができ、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
ＤＮＡ２μｇ（必要に応じ、適当な制限酵素で予め消化させることもできる）に、３Ｍ ＮａＯＨ（水５０ｍｌ中６ｇ、新規に調製）２μl（１／１０容量）を加え、最終容量２０μlとした。亜硫酸水素塩試薬は一本鎖分子と反応することが好ましいことから、このステップで、二本鎖ＤＮＡ分子を一本鎖の形に変性させる。この混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。変性効率を上げるために、室温を超える温度でのインキュベーションを採用することもできる。
【０１７７】
インキュベーション後、２Ｍメタ亜硫酸水素ナトリウム（１０Ｎ ＮａＯＨ４１６ｍｌを加えた水２０ｍｌ中に７．６ｇ、ＢＤＨ ＡｎａｌａＲ ＃１０３５６．４Ｄ、新規に調製）２０８μlおよび１０ｍＭキノール（水５０ｍｌ中に０．０５５ｇ、ＢＤＨ ＡｎａｌＲ ＃１０３１２２Ｅ、新規に調製）１２μlを連続して加えた。キノールは還元剤であり、試薬の酸化を抑える働きをする。他の還元剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、キノン（ヒドロキノン）、または他の適当な還元剤を使用することもできる。試料を鉱油２００μlで覆った。鉱油で覆うことで試薬の蒸発および酸化を防ぐが、これは絶対に必要なことではない。次に、試料を５５℃で一晩インキュベートした。別の方法としては、以下のように試料をサーマルサイクラー中でサイクルさせることもできる：約４時間または一晩、以下のとおりインキュベートする：ステップ１、ＰＣＲ機中で５５℃／２時間でサイクル；ステップ２、９５℃／２分。ステップ１は約３７℃から約９０℃までの任意の温度で実施でき、５分から８時間までの長さで変化させることができる。ステップ２は、約７０℃から約９９℃までの任意の温度で実施でき、約１秒から６０分、またはそれを超える長さまで変化させることができる。
【０１７８】
メタ亜硫酸水素ナトリウムでの処理の後、油を除去し、ＤＮＡ濃度が低ければｔＲＮＡ１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）またはグリコーゲン２μｌを加えた。こうした添加物は任意選択であり、特にＤＮＡが低濃度で存在する場合に、標的ＤＮＡと共沈させることによって得られるＤＮＡの収量を高めるために使用できる。核酸をさらに効率的に沈殿させるための担体としての添加物の使用は、一般には核酸の量が＜０．５μｇである場合に必要となる。
【０１７９】
イソプロパノールによる精製処理を以下のとおり実施した。水８００μlを試料に加え、混合してからイソプロパノール１ｍｌを加えた。反応容器中の亜硫酸水素塩濃度は、その塩が関心対象の標的核酸と共に沈殿することがないレベルまで、水または緩衝溶液を用いて低下させる。本明細書に開示するような所望の範囲を下回って塩濃度が希薄であるならば、希釈率は一般に約１／４から１／１０００である。
【０１８０】
試料を再び混合し、４℃で最低５分間放置した。試料を微量遠心管中で１０〜１５分回転させてから、７０％ＥＴＯＨを用いて、ペレットを２回、いずれもボルテックスしながら洗浄した。この洗浄処理により、核酸と共に沈殿した残留塩があれば全て除去する。
【０１８１】
ペレットを乾燥させてから、５０μlなど適当な容量のＴ／Ｅ（１０ｍＭトリス／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）ｐＨ７．０〜１２．５中で再懸濁させた。ｐＨ１０．５の緩衝溶液はとりわけ有効であることがわかっている。核酸を懸濁させる必要に応じて、試料を３７℃から９５℃で１分間から９６時間インキュベートした。
【０１８２】
亜硫酸水素塩処理の別の例は、国際公開第２００５／０２１７７８号（参照により本明細書に組み込まれる）で知ることができるが、これは、シトシンをウラシルに変換するための方法および材料を提供している。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡなどの核酸を、亜硫酸水素塩およびトリアミンまたはテトラアミンなどのポリアミン触媒と反応させる。亜硫酸水素塩は亜硫酸水素マグネシウムを含んでいてもよい。別の実施形態では、核酸を亜硫酸水素塩マグネシウムと反応させるが、ポリアミン触媒および／または第四級アミン触媒が存在する条件であってもよい。また、本発明の方法を実行するために使用できるキットも提供される。これらの方法が、処理ステップにおいても本発明に適したものとなるであろうということは理解されよう。
【０１８３】
増幅
プライマーがそれぞれ６ｎｇ／μｌの、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを用いて、亜硫酸水素塩処理したゲノムＤＮＡ２μｌを含有する反応混合物２５μｌ中でＰＣＲ増幅を実施した。増幅には、鎖特異的な、ネスト化したプライマーを使用する。ＰＣＲプライマー１および４（以下を参照のこと）を用いて、一巡目のＰＣＲ増幅を実行した。一巡目の増幅に続いて、増幅した材料１μｌを、ＰＣＲプライマー２および３を含有する二巡目用のＰＣＲプレミックスに移し、先に記載のとおりに増幅させた。ＰＣＲ産物の試料を、以下の条件でＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ ＰＸ２サーマルサイクラー中で増幅させた：９５℃で４分間を１サイクル、次に９５℃で１分間、５０℃で２分間および７２℃で２分間を３０サイクル、７２℃で１０分間を１サイクル。
【０１８４】
【化１】
【０１８５】
多重増幅
検出のために多重増幅が必要であれば、以下の手順を実行できる。
【０１８６】
亜硫酸水素塩処理したＤＮＡ１μｌを、反応容量２５μｌの、以下の成分に加える：１倍のＱｉａｇｅｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、一巡目の各ＩＮＡまたはオリゴヌクレオチドプライマー５〜１００ｎｇ、１．５〜４．０ｍＭ ＭｇＳＯ４、４００μＭの各ｄＮＴＰおよびポリメラーゼ混合物０．５〜２単位。次にこの成分を、以下のとおりホットリッドサーマルサイクラー中でサイクルさせる。通常、各増幅反応中で最大２００種の個別のプライマー配列を存在させることができる。
ステップ１ ９４℃ １５分 １サイクル
ステップ２ ９４℃ １分
５０℃ ３分 ３５サイクル
６８℃ ３分
ステップ３ ６８℃ １０分 １サイクル
【０１８７】
次に、酵素反応ミックスおよび適切な二巡目プライマーを含有する二巡目反応管に移した一巡目の増幅物１μｌ分量について、二巡目の増幅を実施する。次に、上述のとおりサイクルを実施する。
【０１８８】
プライマー
本発明には、適当な任意のＰＣＲプライマーを使用できる。プライマーは、通常は、増幅対象となる配列に相補的な配列を有する。プライマーは通常オリゴヌクレオチドであるが、オリゴヌクレオチド類似体とすることもできる。
【０１８９】
プローブ
プローブは、適切な任意の核酸分子または核酸類似体であってよい。例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）ならびにその混合物およびそのハイブリッド、ならびに、限定はしないがホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホラミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエートといったそのリン原子改変体が挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在しないヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２'−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３'−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２'−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれるヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、これらに限定されないがメチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテート、および、アミドを含む連結基などのリン非含有化合物を、ヌクレオチドへの連結に使用してもよい。とりわけ、核酸および核酸類似体は、１つまたは複数のインターカレーター偽ヌクレオチドを含んでよい。
【０１９０】
好ましくは、プローブは、ＩＮＡを形成する１つまたは複数の１つまたは複数の内因性ＩＰＮを含有するＤＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【０１９１】
電気泳動
Ｅ−ｇｅｌ ｓｙｓｔｅｍのユーザーガイド（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｄｏｃ）に従って、試料の電気泳動を実施した。
【０１９２】
検出方法
所望の試料の状態を決定するための可能性のある検出システムは、多数存在する。本発明には、核酸分子検出のための任意の公知のシステムまたは方法が使用可能であろうということが理解されるであろう。検出システムとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｉ．１０〜＞２０００００種の個別成分を選択できるようなマイクロアレイタイプの装置への、適切に標識されたＤＮＡのハイブリダイゼーション。このアレイは、ガラス、プラスチック、雲母、ナイロン、ビーズ、磁気ビーズ、蛍光ビーズまたは膜などの適当な任意の固相表面上に、ＩＮＡ、ＰＮＡまたはヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドのアレイのいずれかで構成可能であろう。
ＩＩ．サザンブロットタイプの検出システム。
ＩＩＩ．アガロースゲル、Ｇｅｎｅｓｃａｎ分析などの蛍光読み取りといった、標準的なＰＣＲ検出システム。サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、臭化エチジウム、Ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎなどのＤＮＡ染色試薬、抗体検出、ＥＬＩＳＡプレートリーダータイプの装置、蛍光光度計装置。
ＩＶ．特異的もしくは複合的な増幅ゲノム断片のリアルタイムＰＣＲ定量、またはその任意の変化形。
Ｖ．蛍光ビーズ、酵素複合体、放射性ビーズなど、国際公開第２００４／０６５６２５号に概要が記載された検出システムのいずれか。
ＶＩ．リガーゼ連鎖反応、または、鎖置換増幅（ＳＤＡ）などの等温でのＤＮＡ増幅技術といった増幅ステップを利用する、他の任意の検出システム。
ＶＩＩ．多光子検出システム。
ＶＩＩＩ．ゲル中での電気泳動および可視化。
ＩＸ．核酸を検出するために使用されるか、または使用できると考えられる、任意の検出プラットフォーム。
【０１９３】
インターカレーティング核酸
インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）は、配列特異性を有する核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にハイブリダイズできる、天然に存在しないポリヌクレオチドである。ＩＮＡは、プローブをベースにしたハイブリダイゼーションアッセイにおける核酸プローブの代替物／代用物としての候補であるが、その理由は、ＩＮＡがいくつか望ましい性質を示すからである。ＩＮＡは、核酸にハイブリダイズして、対応する、天然に存在する核酸／核酸複合体よりも熱力学的に安定なハイブリッドを形成するポリマーである。ＩＮＡは、ペプチドまたは核酸を分解することで知られる酵素に対する基質ではない。したがって、ＩＮＡは、天然に存在する核酸断片よりも、生物試料中での安定性が高いはずであり、同時に、貯蔵期間も長いはずである。イオン強度への依存度が非常に高い核酸ハイブリダイゼーションとは異なり、核酸とのＩＮＡのハイブリダイゼーションは、イオン強度からはほぼ独立しており、天然に存在する核酸を核酸にハイブリダイゼーションするには非常に不利な、イオン強度が低い条件下で、有利である。ＩＮＡの結合強度は、分子中に組み込まれたインターカレーティング基の数のほか、二本鎖構造中で特異的な様式で積み重なっている塩基間の水素結合に由来する通常の相互作用にも依存している。配列の識別は、ＤＮＡ認識ＤＮＡよりも、ＩＮＡ認識ＤＮＡについてのほうが効率的である。
【０１９４】
好ましくは、ＩＮＡは、（Ｓ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−（１−ピレニルメチル）−グリセロールのホスホラミダイトである。
【０１９５】
ＩＮＡは、標準的なオリゴヌクレオチド合成手順を適応させることによって、市販のフォーマットで合成される。ＩＮＡの完全な定義およびその合成については、国際公開第０３／０５１９０１号、国際公開第０３／０５２１３２号、国際公開第０３／０５２１３３号および国際公開第０３／０５２１３４号（Ｕｎｅｓｔ Ａ／Ｓ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ａｕｓｔｒａｌｉａに譲渡）で知ることができ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
実際には、ＩＮＡプローブと標準的な核酸プローブとの間には、多くの違いがある。こうした違いは、便宜上、生物学的、構造的、および物理化学的な違いに分けることができる。上述および下述するように、通常は核酸が採用されている用途でＩＮＡプローブの使用を試みた場合、このような生物学的、構造的、および物理化学的な違いによって、予測できない結果が生じる可能性がある。異なる組成物のこうした非等価性は、化学分野ではよく見られる。
【０１９７】
生物学的な違いに関しては、核酸は、遺伝子の伝達および発現の媒介物として、生物種の生命において中心的な役割を果たす生体物質である。ｉｎ ｖｉｖｏでのその性質は、かなりよく理解されている。しかし、ＩＮＡは、最近開発された完全に人工的な分子であり、化学者の頭の中で着想され、有機合成化学を用いて作製されるものである。ＩＮＡには、公知の生物学的機能はない。
【０１９８】
構造的にも、ＩＮＡは核酸とは劇的に異なる。どちらも普通の核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ）を使用できるが、これらの分子の組成は構造的に別のものである。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＩＮＡの骨格は、リン酸ジエステルリボースおよび２−デオキシリボースの単位が繰り返されてできている。ＩＮＡは、リンカー分子を介してポリマーに結合している１つまたは複数の大きく平らな分子を有する点で、ＤＮＡまたはＲＮＡとは異なる。この平らな分子は、二本鎖構造中でＩＮＡと向かい合う相補的ＤＮＡ中の塩基間にインターカレートする。
【０１９９】
ＩＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間の物理／化学的な違いも、かなり大きい。ＩＮＡが相補的ＤＮＡに結合する速度は、核酸プローブが同じ標的配列に結合するより速い。ＤＮＡまたはＲＮＡ断片とは異なり、ＩＮＡは、インターカレーティング基が末端部位に位置していない限り、ＲＮＡにほとんど結合しない。インターカレーティング基と相補的ＤＮＡ鎖上の塩基との間に強い相互作用があることで、ＩＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定性は、類似した、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定性を上回る。
【０２００】
ＤＮＡまたはＲＮＡ断片またはＰＮＡといった他の核酸とは異なり、ＩＮＡは、自己会合性または自己結合性を示さない。
【０２０１】
ＩＮＡは配列特異的に核酸とハイブリダイズするため、ＩＮＡはプローブをベースにしたアッセイを発展させるための有用な候補であり、キットおよびスクリーニングアッセイにはとりわけ適切である。しかしながら、ＩＮＡプローブは、核酸プローブと同等ではない。したがって、プローブをベースにしたアッセイにおける特異性、感受性および信頼性を向上できると考えられる、任意の方法、キットまたは組成物は、ＤＮＡを含有する試料の検出、分析および定量化において有用であろう。ＩＮＡは、この目的にとって必要な性質を有している。
【０２０２】
結果
本発明を実証するために、Ｃ型肝炎１ａの誘導核酸および単純化した核酸を図２から６に示す。Ｃ型肝炎１ａの天然のゲノムのトップ・ストランドおよびボトム・ストランドを、図１および２にそれぞれ示す。図３および４は、トップ・ストランドおよびボトム・ストランドそれぞれにおいて、全てのシトシンがウラシルで置換されている誘導核酸を示している。図５および６は改変核酸を示し、ここで、誘導核酸中の全てのウラシルはチミンで置換され、Ｃ型肝炎１ａのトップ・ストランドおよびボトム・ストランドそれぞれについて改変核酸が形成される。
【０２０３】
図２から６でわかるように、検出のため、または適当な標的を得るために使用できる、Ｃ型肝炎１ａについての本質的に４つの新しい人工ゲノムが創出された。誘導核酸および改変核酸は、天然には存在しないが、亜硫酸水素塩処理（誘導核酸）および増幅（改変核酸）により、典型的に生成される。
【０２０４】
したがって、本発明は、天然に存在する微生物核酸から生成され、新規かつ所望の用途を有する新規核酸分子に向けられる。
【０２０５】
表１は、本発明による、微生物の誘導核酸および改変核酸の配列の一覧を示すもので、配列表とともに記載してある（番号順に列挙）。配列のサイズおよび総数は極めて大きいので、本明細書ではペーパーコピーを提供していない。しかし、全ての配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０６】
【表１−１】
【０２０７】
【表１−２】
【０２０８】
【表１−３】
【０２０９】
【表１−４】
【０２１０】
【表１−５】
【０２１１】
【表１−６】
【０２１２】
【表１−７】
【０２１３】
【表１−８】
【０２１４】
【表１−９】
【０２１５】
【表１−１０】
【０２１６】
【表１−１１】
【０２１７】
【表１−１２】
【０２１８】
【表１−１３】
【０２１９】
【表１−１４】
【０２２０】
【表１−１５】
【０２２１】
【表１−１６】
【０２２２】
【表１−１７】
【０２２３】
【表１−１８】
【０２２４】
【表１−１９】
【０２２５】
【表１−２０】
【０２２６】
【表１−２１】
【０２２７】
【表１−２２】
【０２２８】
【表１−２３】
【０２２９】
【表１−２４】
【０２３０】
【表１−２５】
【０２３１】
【表１−２６】
【０２３２】
【表１−２７】
【０２３３】
本発明に対して、特定の実施形態で示すような多数の変形および／または改変が、広範に記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく成されうることが、当業者には理解されよう。したがって、本実施形態は全ての点において例証的なものであって限定的なものではないとみなされるべきである。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【図５−５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図６−５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の検出および分析に使用するための改変核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の核酸分子の検出には、現時点でいくつかの手順が利用可能である。こうした手順は、通常は標的核酸と核酸プローブとの間の配列依存的なハイブリダイゼーションによるものであり、核酸プローブの長さは、短鎖オリゴヌクレオチド（２０塩基以下）から何キロベース（ｋｂ）もの配列まで多岐にわたりうる。
【０００３】
核酸配列の集団の中から特定の配列を増幅するために最も広く使用されている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．編、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）である。この増幅方法では、相補ＤＮＡ鎖上の、増幅対象領域のいずれかの末端にある、一般に長さが２０から３０ヌクレオチドを使用して、変性一本鎖ＤＮＡ上でＤＮＡ合成を開始する。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを使用した、変性、プライマーハイブリダイゼーション、およびＤＮＡ鎖合成の連続サイクルにより、プライマーで挟まれた配列の指数関数的増幅が可能になる。最初に逆転写酵素を用いた複製を行うことによりＲＮＡ配列を増幅し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の複製物を作製できる。増幅ＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動、標識プローブを用いたハイブリダイゼーション、引き続いての同定（酵素結合アッセイなどによる）を許容するタグ付きプライマーの使用、および標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションするとシグナルを発生する蛍光タグ付きプライマーの使用（例えば、Ｂｅａｃｏｎ ａｎｄ ＴａｑＭａｎシステム）といった多様な手段により検出できる。
【０００４】
特定のヌクレオチド配列の検出および増幅のためには、ＰＣＲ以外にも、他の多様な手法が開発されている。その一例は、リガーゼ連鎖反応（１９９１、Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８、１８９〜１９３）である。
【０００５】
別の例は等温増幅であり、１９９２年に最初に記載され（Ｗａｌｋｅｒ ＧＴ、Ｌｉｔｔｌｅ ＭＣ、Ｎａｄｅａｕ ＪＧ ａｎｄ Ｓｈａｎｋ Ｄ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＰＮＡＳ ８９：３９２〜３９６（１９９２））、鎖置換増幅（ＳＤＡ）と名付けられた。それ以降、他のいくつかの等温増幅技術が記載されており、その中には、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、対応するゲノムＤＮＡではなくＲＮＡ配列を複製する、転写介在増幅（ＴＭＡ）および核酸配列をベースにした増幅（ＮＡＳＢＡ）も包含される（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ＪＣ、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ ＫＭ、Ｋｗｏｈ ＤＹ、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ＫＪ、Ｒｉｃｈｍａｎｎ ＤＤ ａｎｄ Ｇｉｎｇｅｒａｓ ＴＲ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｅｄ ａｆｔｅｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ＰＮＡＳ ８７、１８７４〜１８７８（１９９０）：Ｋｉｅｖｉｔｓ Ｔ、ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ Ｂ、ｖａｎ Ｓｔｒｉｊｐ Ｄ、Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ Ｒ、Ｄｉｒｃｋｓ Ｍ、Ａｄｒｉａａｎｓｅ Ｈ、Ｍａｌｅｋ Ｌ、Ｓｏｏｋｎａｎａｎ Ｒ、Ｌｅｎｓ Ｐ、ＮＡＳＢＡ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９１ Ｄｅｃ；３５（３）：２７３〜８６）。
【０００６】
ＤＮＡベースの等温での手法としては他に、ＤＮＡポリメラーゼが環状の鋳型に向けたプライマーを伸長させるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｆｉｒｅ Ａ ａｎｄ Ｘｕ ＳＱ、Ｒｏｌｌｉｎｇ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｃｉｒｃｌｅｓ、ＰＮＡＳ ９２、４６４１〜４６４５（１９９５））、標的検出用に環状プローブを使用する分枝増幅（ＲＡＭ）（Ｚｈａｎｇ Ｗ、Ｃｏｈｅｎｆｏｒｄ Ｍ、Ｌｅｎｔｒｉｃｈｉａ Ｂ、Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ＨＤ、Ｓｉｍｓｏｎ Ｅ、Ｌｉ Ｈ、Ｙｉ Ｊ、Ｚｈａｎｇ ＤＹ、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ｂｙ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ：ａ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｙ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００２ Ｊａｎ；４０（１）：１２８〜３２）、また、より新しいところでは、熱の代わりにヘリカーゼ酵素を使用してＤＮＡ鎖をほどくヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅（ＨＤＡ）（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｍ、Ｘｕ Ｙ、Ｋｏｎｇ Ｈ、Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ、２００４ Ａｕｇ；５（８）：７９５〜８００）が挙げられる。
【０００７】
最近、等温でのＤＮＡ増幅方法が記載されている（Ｗａｌｋｅｒ ＧＴ、Ｌｉｔｔｌｅ ＭＣ、Ｎａｄｅａｕ ＪＧ ａｎｄ Ｓｈａｎｋ Ｄ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＰＮＡＳ ８９：３９２〜３９６（１９９２）。伝統的な増幅手法は、増幅反応のサイクルごとに標的分子の変性再生サイクルを繰り返すことによるものである。ＤＮＡの熱処理によりある程度ＤＮＡ分子のせん断が生じることから、発達中の胚盤胞由来の少数の細胞からのＤＮＡ単離などにおいて、または、とりわけ、組織切片、パラフィンブロックおよび古代のＤＮＡ標本などでＤＮＡがすでに断片化された形態である場合において、ＤＮＡが限られていると、こうした加熱冷却サイクルは、ＤＮＡをさらに損傷し増幅シグナルを損失する結果をまねきかねない。等温法は、さらなる増幅用の鋳型として役立てるための一本鎖分子の作製を、鋳型ＤＮＡの変性を連続させることによるのではなく、特定の制限エンドヌクレアーゼにより定温で酵素的にＤＮＡ分子に切れ目を入れることにより行うものである。
【０００８】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）と名付けられた手法は、半修飾ＤＮＡの非修飾鎖に切れ目を入れる特定の制限酵素の能力と、下流の鎖を伸長し置換する５'−３'エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼの能力とによるものである。そして、センス反応から鎖置換されたものがアンチセンス反応用の鋳型として役立つという形でセンス反応とアンチセンス反応とを連動させることにより、指数関数的な増幅が達成される（Ｗａｌｋｅｒ ＧＴ、Ｌｉｔｔｌｅ ＭＣ、Ｎａｄｅａｕ ＪＧ ａｎｄ Ｓｈａｎｋ Ｄ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＰＮＡＳ ８９：３９２〜３９６（１９９２））。このような手法は、ヒト結核菌（Ｗａｌｋｅｒ ＧＴ、Ｌｉｔｔｌｅ ＭＣ、Ｎａｄｅａｕ ＪＧ ａｎｄ Ｓｈａｎｋ Ｄ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＰＮＡＳ ８９：３９２〜３９６（１９９２）、ＨＩＶ−１、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ＣおよびＨＰＶ−１６ Ｎｕｏｖｏ Ｇ．Ｊ．、２０００）、クラミジアトラコマチス（Ｓｐｅａｒｓ ＰＡ、Ｌｉｎｎ Ｐ、Ｗｏｏｄａｒｄ ＤＬ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ ＧＴ、Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：１３０〜１３７（１９９７）を首尾よく増幅するために使用されている。
【０００９】
これまでのＳＤＡの使用は、修飾されたホスホロチオエートヌクレオチドに依存しており、修飾された鎖上では酵素による切断が起こらない半ホスホロチオエートＤＮＡ二本鎖を作製することで、酵素による消化ではなく酵素によるニッキングを生じさせて置換反応を進めるものであった。しかし最近では、いくつかの「ニッカーゼ」酵素が設計されている。こうした酵素は、伝統的な様式でＤＮＡを切断するのではなく、ＤＮＡ鎖の一方に切れ目を生じさせる。「ニッカーゼ」酵素としては、Ｎ．Ａｌｗ１（Ｘｕ Ｙ、Ｌｕｎｎｅｎ ＫＤ ａｎｄ Ｋｏｎｇ Ｈ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎ．Ａｌｗ１ ｂｙ ｄｏｍａｉｎ ｓｗａｐｐｉｎｇ、ＰＮＡＳ ９８：１２９９０〜１２９９５（２００１）、Ｎ．ＢｓｔＮＢ１（Ｍｏｒｇａｎ ＲＤ、Ｃａｌｖｅｔ Ｃ、Ｄｅｍｅｔｅｒ Ｍ、Ａｇｒａ Ｒ、Ｋｏｎｇ Ｈ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｎｉｃｋｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２０００ Ｎｏｖ；３８１（１１）：１１２３〜５）およびＭｌｙ１（Ｂｅｓｎｉｅｒ ＣＥ、Ｋｏｎｇ Ｈ、Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ＭｌｙＩ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｔｏ ａ ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｂｙ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｉｔｓ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ、２００１ Ｓｅｐ；２（９）：７８２〜６、Ｅｐｕｂ ２００１ Ａｕｇ ２３）が挙げられる。このような酵素の使用により、上述のようにしてＳＤＡ手順は簡素化されると考えられる。
【００１０】
また、ＳＤＡは、熱安定性制限酵素（Ａｖａ１）と熱安定性エキソポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）との組合せの使用により改善されてきた。この組合せは、反応の増幅効率を１０８倍増幅から１０１０倍増幅に増やすことが示されているため、この手法を用いると、唯一単独の複製分子を増幅することが可能である。熱安定性ポリメラーゼ／酵素の組合せを用いた結果生じる増幅係数は、ほぼ１０９である（Ｍｉｌｌａ Ｍ．Ａ．、Ｓｐｅａｒｓ Ｐ．Ａ．、Ｐｅａｒｓｏｎ Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．、Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｖａ１ ａｎｄ Ｅｘｏ−Ｂｓｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９７、２４：３９２〜３９６）。
【００１１】
これまでのところ、全ての等温ＤＮＡ増幅手法は、最初の鋳型である二本鎖ＤＮＡ分子を増幅開始前に変性させることが必要である。また、増幅は、各プライミング事象から一度開始されるのみである。
【００１２】
直接検出のためには、標的核酸は、ゲル電気泳動により大きさを基準にして分離してから、標的配列に相補的なプローブとハイブリダイゼーションを行う前に固相支持体に移す（サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング）のが最も一般的である。このプローブは天然の核酸であってもよく、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはロック核酸（ＬＮＡ）もしくはインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）などの類似体であってもよい。このプローブを直接標識（例えば３２Ｐで）してもよいし、または間接的な検出手順を使用してもよい。間接的な手順は、通常はビオチンまたはジゴキシゲニンなどの「タグ」をプローブ中に組み込むことによるもので、こうすることでこのプローブが、酵素に結合した基質の変換または化学発光などの手段により検出される。
【００１３】
核酸の直接検出のために広く使用されている別の方法は、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションである。この方法では、捕獲プローブを固相支持体に結合させ、溶液中の標的核酸と、結合しているプローブとをハイブリダイズさせる。結合していない標的核酸を洗い流してから、標的配列とハイブリダイズする第二のプローブを用いて、結合している核酸を検出する。検出は、上に概要を述べたような直接的または間接的な方法を用いてよい。そのような方法の例としては、サンドイッチハイブリダイゼーションの原理を使用した例である「分枝ＤＮＡ」シグナル検出システム（１９９１、Ｕｒｄｅａ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．、Ｓｅｒ．２４、１９７〜２００）が挙げられる。核酸配列の直接検出のために核酸ハイブリダイゼーションを使用する分野で急速に拡大しているのは、ＤＮＡマイクロアレイの分野である（２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３２、［Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ］；２００４、Ｃｏｐｅ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０、３２３〜３３１、２００４、Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１２、５３７〜５４４）。このプロセスでは、短鎖オリゴヌクレオチド（典型的にはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのシステムで２５ｍｅｒ）から、より長いオリゴヌクレオチド（典型的にはＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよびＡｇｉｌｅｎｔのプラットフォームで６０ｍｅｒ）、また、ｃＤＮＡクローンなどのさらに長い配列まで多岐にわたりうる個々の核酸種を、格子パターン中の固相支持体に固定させるか、または固相支持体上でフォトリソグラフィー的に合成させる。次に、タグを付けた核酸、または標識した核酸の集団をアレイとハイブリダイズさせてから、アレイ中の各スポットへのハイブリダイゼーションのレベルを定量化する。ハイブリダイゼーションには、化学発光など他の検出システムを採用することもできるが、最も一般的には、放射能標識または蛍光標識した核酸（例えばｃＲＮＡまたはｃＤＮＡ）を使用する。
【００１４】
核酸配列の直接検出のために核酸ハイブリダイゼーションを使用する分野で急速に拡大しているのは、ＤＮＡマイクロアレイの分野である（Ｙｏｕｎｇ ＲＡ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ａｒｒａｙｓ、Ｃｅｌｌ １０２：９〜１５（２０００）、Ｗａｔｓｏｎ Ａ、Ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ、Ａ ｎｅｗ ｂｒｅｅｄ ｏｆ ｈｉｇｈ ｔｅｃｈ ｄｅｔｅｃｔｉｖｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：８５０〜８５４（２０００））。このプロセスでは、オリゴヌクレオチドから、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンなどのより長い配列まで多岐にわたりうる個々の核酸種を、格子パターン中の固相支持体に固定させる。次に、タグを付けた核酸または標識した核酸の集団をアレイとハイブリダイズさせてから、アレイ中の各スポットとのハイブリダイゼーションのレベルを定量化する。ハイブリダイゼーションには、他の検出システムも採用されたが、最も一般的には、放射能標識または蛍光標識した核酸（例えばｃＤＮＡ）が使用された。
【００１５】
細菌、酵母および真菌といった微生物の検出のための伝統的な方法としては、選択的な栄養培地上で微生物を培養してから、従来の光学顕微鏡下で見られるような大きさ、形状、胞子産生、生化学反応または酵素反応などの性質および特異的染色性（グラム染色など）に基づいて微生物を分類することが挙げられる。ウイルス種は、特殊化した組織または細胞中で生育した後で、電子顕微鏡法により決定したその構造および大きさに基づいて分類しなくてはならない。このような手法の主な欠点は、全ての微生物が従来の培養液または細胞環境下で生育するわけではないことであり、それがこうした研究法の有用性を限られたものにしている。例えば、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌およびインフルエンザ菌などの細菌（これらは全て髄膜炎の原因となり、中でも髄膜炎菌は髄膜炎および劇症髄膜炎菌血症の両方の原因となる）でいえば、３種とも培養が困難である。血液培養ボトルを最長７日間毎日定期的に調べ、継代培養することが必要である。インフルエンザ菌は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびヘミンの両方を含有する特殊培地と、チョコレート寒天プレート上での生育とを必要とする。血液培養には、トリプチカーゼ大豆ブロスまたはブレインハートインフュージョンおよびポリアネトール硫酸ナトリウムなどの多様な添加物の添加が必要である。重篤な食中毒およびフロッピーベビー症候群の原因となるボツリヌス菌などの微生物の場合、毒素の同定は、食物の抽出物または培養液の上澄みをマウスに注射することと、２日後の結果を可視化することとを伴う。加えて、特殊培地での潜在微生物の培養には１週間かかる。黄色ブドウ球菌のエンテロトキシン（食中毒以外にも皮膚感染症、血液感染症、肺炎、骨髄炎、関節炎および脳膿瘍の原因）は、イオン交換樹脂による毒素の選択的吸収またはモノクローナル抗体を用いた逆受身ラテックス凝集法により、微量で検出される。その類縁菌である表皮ブドウ球菌は、血液感染症を引き起こし、病院内の機器および表面ならびに医療用の機械および器具を汚染する。
【００１６】
非ウイルス性の微生物は、ブドウ糖、麦芽糖またはショ糖などの基質上での発酵反応期間中に特定のアミノ酸または代謝物を産生するなどといったその代謝特性に基づいて分類することもできる。別の方法としては、微生物を、抗生物質に対するその感受性に基づいて型判定することもできる。細胞表面の抗原に対する、または毒素などの分泌されたタンパク質に対する特異的な抗体も、微生物を同定または型判定するために使用される。しかしながら、上述の全ての方法は、次に行われる検査の前に微生物を培養することによるものである。微生物の培養は、費用が高価で時間がかかり、培養が比較的容易な微生物による汚染または過剰増殖に見舞われる可能性もある。この手法は、決定的な診断結果を得るために多くの試験を同じ試料で行われなければならないという点では、完成度も比較的低い。大部分の微生物は、公知の培地中で容易に生育できるものではないため、異なる種の微生物が混在した典型的な集団が、野生状態で、または高等生物と共に存在していると、その検出レベルは下がる。
【００１７】
病原微生物の検出および同定のための他の方法は、血清学的研究法に基づくものであり、ここで微生物への感染に応じて抗体が産生される。例えば、髄膜炎菌は、その莢膜多糖類の構造的相違に基づいて分類可能である。このような菌は異なる抗原性を有しており、これにより主要な５つの血清型を決定できる（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５）。酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または放射性免疫測定法（ＲＩＡ）は、そのような抗体の産生を評価できる。これらの方法はいずれも、感染経過期間中に宿主動物によって産生される特異的抗体の存在を検出するものである。こうした方法は、抗体が宿主動物によって産生されるのにいくらか時間がかかるために、ごく初期の感染は検出されないことが多いという点で、欠点がある。加えて、このようなアッセイを使用した場合、過去の感染と活動性感染とを確実に区別することができない。
【００１８】
より最近では、感染症の診断のための分子法の使用に大きな関心が寄せられている。こうした方法により、病原微生物の高感度かつ特異的な検出がもたらされる。このような方法の例としては、「分枝ＤＮＡ」シグナル検出システムが挙げられる。この方法は、サンドイッチハイブリダイゼーションの原理を使用した一例である（Ｕｒｄｅａ ＭＳら、Ｂｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＨＩＶ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ、１９９１；（２４）：１９７〜２００）。
【００１９】
細菌の検出および分類のための別の方法は、１６ＳリボソームＲＮＡ配列の増幅である。１６Ｓ ｒＲＮＡは、多様な臨床試料または環境試料中の細菌種の検出用のＰＣＲ増幅アッセイにおける使用に適した標的であることが報告されており、特定のさまざまな微生物を同定するために頻繁に使用されているが、その理由は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が種特異的な多型性を示すことにある（Ｃｌｏｕｄ，Ｊ．Ｌ．、Ｈ．Ｎｅａｌ、Ｒ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｒｙ、Ｃ．Ｙ．Ｔｕｒｅｎｎｅ、Ｍ．Ｊａｍａ、Ｄ．Ｒ．Ｈｉｌｌｙａｒｄ、ａｎｄ Ｋ．Ｃ．Ｃａｒｒｏｌｌ、２００２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０、４００〜４０６）。しかし、細菌の純粋培養が必要であり、種を特定するためには、ＰＣＲ増幅後にも試料の配列を決定するか、またはマイクロアレイタイプの装置に試料をハイブリダイズさせなくてはならない（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｍ、Ｋａｋｉｎｕｍａ Ｋ、Ｈａｙａｓｈｉ Ｈ、Ｎａｇａｉ Ｈ、Ｉｔｏ Ｋ、Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｒ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００３ Ｊｕｎ；４１（６）：２６０５〜１５）。このような方法は、費用が高価で、時間も手間もかかる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
大部分の微生物のゲノムが配列解析により決定されているものの、関心対象の微生物を検出するための特異的なプローブまたはプライマーを得ることについては未だに課題がある。ゲノムは４種の塩基を含有しているため、所与の微生物に特異的と思われる十分な縮重プライマーまたはプローブを調製することは困難であることが多い。潜在的な別の問題は、特定の微生物の重要な遺伝子またはゲノムのいくつかを使用する権利が特許権により他者に帰属していることである。この所有権は、競合する検出アッセイが市場に投入されるのを阻止または遅延させることができる。特定の微生物用のマーカーとして使用できる新しい核酸が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、微生物特異的であり微生物検出のために使用できる、多数の微生物についての改変核酸を得た。
【００２２】
一態様では、本発明は、配列表番号５１中の配列番号１〜配列番号７６からなる群から選択される配列を有する、Ｃ型肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、配列表番号１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、アシネトバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、配列表番号２中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、バシラス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、配列表番号３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、バクテロイデス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、配列表番号４中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、バルトネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、配列表番号５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ボルデテラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、配列表番号６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ボレリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、配列表番号７中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ブルセラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、配列表番号８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、カンピロバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、配列表番号９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、クラミジア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０中の配列番号１〜配列番号３９からなる群から選択される配列を有する、クロストリジウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、配列表番号１１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、コルネバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、配列表番号１２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、大腸菌の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、配列表番号１３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エールリヒア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、配列表番号１４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エンテロコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、配列表番号１５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、フゾバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、配列表番号１６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ヘモフィルス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、配列表番号１７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヘリコバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、配列表番号１８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、レジオネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、配列表番号１９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、レプトスピラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、配列表番号２０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、リステリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、配列表番号２１中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、マイコバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、配列表番号２２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マイコプラズマ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、配列表番号２３中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ナイセリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、配列表番号２４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノルカジア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、配列表番号２５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、シュードモナス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、配列表番号２６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、リケッチア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、配列表番号２７中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、サルモネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、配列表番号２８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、セラチア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、配列表番号２９中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、シゲラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５２】
別の態様では、本発明は、配列表番号３０中の配列番号１〜配列番号５２からなる群から選択される配列を有する、スタフィロコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５３】
別の態様では、本発明は、配列表番号３１中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ストレプトコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、配列表番号３２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ストレプトミセス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５５】
別の態様では、本発明は、配列表番号３３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、トレポネーマ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５６】
別の態様では、本発明は、配列表番号３４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、トロフェルミア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５７】
別の態様では、本発明は、配列表番号３５中の配列番号１〜配列番号６０からなる群から選択される配列を有する、プラスモジウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５８】
別の態様では、本発明は、配列表番号３６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、アスペルギリス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００５９】
別の態様では、本発明は、配列表番号３７中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、カンジダ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６０】
別の態様では、本発明は、配列表番号３８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、クリプトコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６１】
別の態様では、本発明は、配列表番号３９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、パラコクシジオイデス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６２】
別の態様では、本発明は、配列表番号４０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、リゾプス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６３】
別の態様では、本発明は、配列表番号４１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、フランシセラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６４】
別の態様では、本発明は、配列表番号４２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ビブリオ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６５】
別の態様では、本発明は、配列表番号４３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エルシニア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６６】
別の態様では、本発明は、配列表番号４４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＪＣポリオーマウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６７】
別の態様では、本発明は、配列表番号４６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、アンデスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６８】
別の態様では、本発明は、配列表番号５２中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００６９】
別の態様では、本発明は、配列表番号５３中の配列番号１〜配列番号１２８からなる群から選択される配列を有する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７０】
別の態様では、本発明は、配列表番号５４中の配列番号１〜配列番号１６２からなる群から選択される配列を有する、インフルエンザウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７１】
別の態様では、本発明は、配列表番号５５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＢＫウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７２】
別の態様では、本発明は、配列表番号５６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、バーマ（Ｂａｒｍａｈ）ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７３】
別の態様では、本発明は、配列表番号５７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、カリシウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７４】
別の態様では、本発明は、配列表番号５８中の配列番号１〜配列番号４８からなる群から選択される配列を有する、コロラドダニ熱ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７５】
別の態様では、本発明は、配列表番号５９中の配列番号１〜配列番号２８からなる群から選択される配列を有する、口蹄ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７６】
別の態様では、本発明は、配列表番号６０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＧＢ肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７７】
別の態様では、本発明は、配列表番号６１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヘンダウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７８】
別の態様では、本発明は、配列表番号６２中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、ヒトアデノウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００７９】
別の態様では、本発明は、配列表番号６３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトアストロウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８０】
別の態様では、本発明は、配列表番号６４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトボカウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供するウイルス。
【００８１】
別の態様では、本発明は、配列表番号６５中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ヒトコロナウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供するウイルス。
【００８２】
別の態様では、本発明は、配列表番号６６中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ヒトエンテロウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８３】
別の態様では、本発明は、配列表番号６７中の配列番号１〜配列番号３６からなる群から選択される配列を有する、ヒトヘルペスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８４】
別の態様では、本発明は、配列表番号６８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトメタニューモウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８５】
別の態様では、本発明は、配列表番号６９中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ヒトパラインフルエンザウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８６】
別の態様では、本発明は、配列表番号７０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトパレコウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８７】
別の態様では、本発明は、配列表番号７１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ヒトライノウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８８】
別の態様では、本発明は、配列表番号７２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトＲＳウイルス（ヒト呼吸器合胞体ウイルス）の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００８９】
別の態様では、本発明は、配列表番号７３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、麻疹ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９０】
別の態様では、本発明は、配列表番号７４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ムンプスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９１】
別の態様では、本発明は、配列表番号７５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノロウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９２】
別の態様では、本発明は、配列表番号７６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノーウォークウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９３】
別の態様では、本発明は、配列表番号７７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、パルボウイルスＢ１９の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９４】
別の態様では、本発明は、配列表番号７８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ポリオウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９５】
別の態様では、本発明は、配列表番号７９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、狂犬病ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９６】
別の態様では、本発明は、配列表番号８０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ロスリバーウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９７】
別の態様では、本発明は、配列表番号８１中の配列番号１〜配列番号１２４からなる群から選択される配列を有する、ロタウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９８】
別の態様では、本発明は、配列表番号８２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＳＡＲＳコロナウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【００９９】
別の態様では、本発明は、配列表番号８３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＴＴウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１００】
別の態様では、本発明は、配列表番号８４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＴＴＶミニウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０１】
別の態様では、本発明は、配列表番号８５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、西ナイルウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、配列表番号８６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、アルファウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０３】
別の態様では、本発明は、配列表番号８７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ラクダ痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０４】
別の態様では、本発明は、配列表番号８８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、牛痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０５】
別の態様では、本発明は、配列表番号８９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、コクシエラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、配列表番号９０中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、クリミアコンゴ出血熱(Crimean-Congo HF)の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、配列表番号９１中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、デングウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０８】
別の態様では、本発明は、配列表番号９２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、東部ウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１０９】
別の態様では、本発明は、配列表番号９３中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、エボラウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１０】
別の態様では、本発明は、配列表番号９４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マールブルクウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１１】
別の態様では、本発明は、配列表番号９５中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、グアナリトウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１２】
別の態様では、本発明は、配列表番号９６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ハンタウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、配列表番号９７中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ハンターンウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１４】
別の態様では、本発明は、配列表番号９７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、日本脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１５】
別の態様では、本発明は、配列表番号９９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、フニンウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１６】
別の態様では、本発明は、配列表番号１００中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ラッサウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、マチュポウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１８】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、サル痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１１９】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マレー渓谷脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２０】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ニパーウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２１】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０５中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、リフト渓谷熱ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２２】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、サビアウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０７中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、シンノンブレウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２４】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、大痘瘡ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２５】
別の態様では、本発明は、配列表番号１０９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、小痘瘡ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、配列表番号１１０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２７】
別の態様では、本発明は、配列表番号１１１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、西部ウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２８】
別の態様では、本発明は、配列表番号１１２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、黄熱病ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子を提供する。
【０１２９】
この誘導核酸または微生物核酸の部分は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０ ７０、８０、９０、１００個など、またはそれを超える数のヌクレオチドとすることができる。いくつかの誘導核酸または微生物核酸では、その部分は、例えば１５、１６、１７、１８または１９個など、２０個未満であってもよい。
【０１３０】
微生物の誘導核酸は、シトシンをウラシルに改変する重硫酸塩などの作用剤で微生物核酸を処理することにより形成できる。この誘導核酸の増幅後、実質的にアデニン、グアニンおよびチミン塩基を有する、微生物の改変核酸が形成される。
【０１３１】
メチル化シトシンを通常は含有しない二本鎖ＤＮＡの場合、この処理ステップにより、それぞれがアデニン、グアニン、チミンおよびウラシル塩基を含有する２つの誘導核酸が生じる。この２つの誘導核酸は、二本鎖ＤＮＡの２本の一本鎖から作製される。この２つの誘導核酸は、実質的にシトシンを有していないが、元の未処理のＤＮＡ分子と同じ総塩基数および配列長をそのまま有している。重要なのは、この２つの誘導体は互いに相補的ではなく、トップ・ストランドおよびボトム・ストランドを形成することである。１本または複数のこの鎖を使用して誘導核酸を生じさせるか、またはこれを増幅して改変核酸分子を作製することができる。
【０１３２】
本明細書を通じ、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、明示された要素、整数もしくはステップ、または要素群、整数群もしくはステップ群を包含することを意味するものであって、他の任意の要素、整数もしくはステップ、または要素群、整数群もしくはステップ群を除外することを意味するものでないことは理解されよう。
【０１３３】
本明細書に包含されている、文書、行為、材料、機器、論文などについての検討の一切は、単に本発明のために背景を示すことを目的としたものである。このような検討は、これらの事項のうち任意または全てのものが先行技術の基礎の一部を形成していると認めたものであるとして、または、本明細書の各請求項の優先出願日以前にオーストラリア国内に存在していた、本発明に関する分野における一般常識であったと認めたものであるとして解釈されるべきではない。
【０１３４】
本発明をより明快に理解できるように、以下の図面および実施例を参照して、好ましい実施形態を説明していく。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】Ｃ型肝炎１ａのゲノム（トップ・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号７７）。
【図２】Ｃ型肝炎１ａのゲノム（ボトム・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号７８）。
【図３】Ｃ型肝炎１ａの誘導ゲノム（トップ・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号１）。
【図４】Ｃ型肝炎１ａの誘導ゲノム（ボトム・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号２０）。
【図５】Ｃ型肝炎１ａの改変ゲノム（トップ・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号３９）。
【図６】Ｃ型肝炎１ａの改変ゲノム（ボトム・ストランド）の配列である（配列表番号５１の配列番号５８）。
【発明を実施するための形態】
【０１３６】
定義
本明細書で使用する「ゲノム改変」という用語は、ゲノムの（または他の）核酸が、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）の４塩基で構成されているものから、実質的にアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）塩基を含有するが実質的に同じ総塩基数を有したままのものへ改変されることを意味する。
【０１３７】
本明細書で使用する「誘導核酸」という用語は、Ａ、Ｇ、ＴおよびＵ塩基（またはＡ、ＧもしくはＴではない他の何らかの塩基もしくは塩基様物質）を実質的に含有し、かつ、対応する未改変の微生物核酸と実質的に同じ総塩基数を有する核酸を意味する。微生物ＤＮＡ中の実質的に全てのシトシンは、作用剤(agent)での処理の間にウラシルへ変換されたことになる。メチル化などにより変化したシトシンが、必ずしもウラシル（またはＡ、ＧもしくはＴではない他の何らかの塩基もしくは塩基様物質）に変換されるとは限らないことは理解されよう。微生物核酸は、通常はメチル化シトシン（または他のシトシン変化）を含有しないため、この処理ステップは、好ましくは全てのシトシンを変換する。好ましくは、シトシンはウラシルに改変される。
【０１３８】
本明細書で使用する「改変核酸」という用語は、誘導核酸を増幅した後に結果として得られる核酸産物を意味する。この誘導核酸中のウラシルは、その後誘導核酸の増幅の間にチミン（Ｔ）と置き換わり、改変核酸分子を形成する。結果的に得られたこの産物は、対応する未改変の微生物核酸と実質的に同じ総塩基数を有するが、３塩基（Ａ、ＧおよびＴ）の組合せと実質的になっている。
【０１３９】
本明細書で使用する「改変配列」という用語は、改変核酸を形成するために誘導核酸を増幅した後に結果として得られる核酸の配列を意味する。結果的に得られたこの改変配列は、対応する未改変の微生物の核酸配列と実質的に同じ総塩基数を有するが、３塩基（Ａ、ＧおよびＴ）の組合せと実質的になっている。
【０１４０】
本明細書で使用する「非変換配列」という用語は、処理前の微生物核酸の核酸配列を意味する。非変換配列は、通常は、天然に存在する微生物核酸の配列である。
【０１４１】
本明細書で使用する「改変する」という用語は、シトシンを別のヌクレオチドに変換することを意味する。好ましくは、作用剤によりシトシンがウラシルに改変されて、誘導核酸が形成される。
【０１４２】
本明細書で使用する「シトシンを改変する作用剤」という用語は、シトシンを別の化学物質(chemical entity)に変換する能力をもつ作用剤を意味する。好ましくは、この作用剤はシトシンをウラシルに改変し、その後このウラシルが、誘導核酸の増幅の間にチミンで置換される。好ましくは、シトシンを改変するために使用される作用剤は、亜硫酸水素ナトリウムである。同じように、シトシンを改変するがメチル化シトシンは改変しない他の作用剤を、本発明の方法において使用することもできる。例としては、亜硫酸水素塩、酢酸塩またはクエン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、この作用剤は、酸性の水性条件の存在下でシトシンをウラシルに改変する試薬である亜硫酸水素ナトリウムである。亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）は、シトシンの５，６二重結合と容易に反応して、スルホン化したシトシン反応中間体を形成し、これは脱アミノ化を起こしやすく水の存在下ではウラシル亜硫酸塩を生じる。必要に応じ、亜硫酸基は弱アルカリ条件下で除去することができ、こうすることで結果としてウラシルが形成される。したがって、全てのシトシンがウラシルに変換される可能性があることになる。しかしながら、メチル化シトシンがある場合、これはメチル化により保護されていることから、改変用の試薬では変換できない。シトシン（または他の任意の塩基）を酵素的手段により改変して、本発明により教示されるような誘導核酸を獲得することは可能であろうということは、理解されるであろう。
【０１４３】
核酸中の塩基を改変しうる、広く使われている２つの一般的方法があり、それは化学的方法および酵素的方法である。したがって、本発明のための改変は、天然に存在する酵素によっても、または現時点で未報告の人工的に作成もしくは選択された酵素によっても実行できる。亜硫酸水素塩法などの化学的処理を用いれば、適切な化学的ステップを経てシトシンをウラシルに変換できる。同様に、例えばシトシンデアミナーゼを用いれば、誘導核酸を形成するための変換を実行しうる。本発明者らが知る限り、シトシンデアミナーゼについての最初の報告は、１９３２年のＳｃｈｍｉｄｔ，Ｇ．、Ｚ．ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０８、１８５である（１９５０、Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｐ．、Ｓａｂｌｅ，Ｈ．Ｚ．、Ｌａｍｐｅｎ，Ｊ．Ｏ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、１８４、１７〜２８、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｓｉｎｅｓ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓも参照のこと）。初期のこの研究では、シトシンデアミナーゼは他の核酸デアミナーゼ・フリーでは得られなかったが、Ｗａｎｇらは、そうした活性を酵母および大腸菌から精製することに成功した。このように、誘導核酸を形成するためにシトシンの何らかの酵素的変換を行うと、最終的には次の複製期間中に当該位置にシトシンとは違う塩基が挿入されて、改変ゲノムが得られることになる。誘導体に続いて改変ゲノムを生み出すための化学的および酵素的変換は、天然に存在する微生物核酸中の、プリンでもピリミジンでも任意の核酸塩基に適用可能である。
【０１４４】
本明細書で使用する「ゲノムまたは核酸の改変形」という用語は、天然に存在するものであるか合成されたものであるかにかかわらず、通常は一般的な４塩基Ｇ、Ａ、ＴおよびＣを含有し、ゲノム中のＣの大部分または全てが適切な化学的改変およびそれに続く増幅手順によってＴに変換されたために当該時点ではＧ、ＡおよびＴの３塩基のみから主になる、ゲノムまたは核酸を意味する。ゲノムの改変形は、ゲノムの相対的な複雑性が、基本の４塩基から３塩基組成に低下していることを意味する。
【０１４５】
本明細書で使用する「塩基様物質(base-like entity)」という用語は、シトシンの改変により形成されるものを意味する。塩基様物質は、誘導核酸の増幅期間中にＤＮＡポリメラーゼにより認識されることが可能であり、このポリメラーゼによって、誘導核酸中の塩基様物質の反対の位置に新しく形成される相補的ＤＮＡ鎖上にＡ、ＧまたはＴが配置される。通常、塩基様物質は、対応する未処理の微生物核酸中のシトシンから改変されたウラシルである。塩基様物質の例としては、プリンであるかピリミジンであるかを問わず、任意の核酸塩基が挙げられる。
【０１４６】
本明細書で使用する「相対的な複雑性の低下」という用語はプローブ長に関するもので、言い換えれば、同じ大きさの２つのゲノム（第一のゲノムは「そのまま」でありＧ、Ａ、ＴおよびＣの４塩基からなるが、第二のゲノムは全く同じ長さではあるがいくつかのシトシン（理想的には全てのシトシン）がチミンに変換されている）において、所与の一連の分子条件下、同等の特異性および同等レベルで、特定の遺伝子座に対するプローブのハイブリダイゼーションが達成されるのに必要な平均プローブ長が増加することである。試験される遺伝子座は、元の変換されていないゲノム中ならびに変換されたゲノム中の同じ位置にある。平均で、１１塩基長のプローブは、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣの４塩基からなる４１９４３０４塩基（４１１＝４１９４３０４）の正規のゲノム中に、そのプローブが完全にハイブリダイズする１つの特異的な位置を有するだろう。しかし、そのような４１９４３０４塩基の正規のゲノムが亜硫酸水素塩または他の適当な手段によって一度変換されると、変換されたこのゲノムは、今度は３塩基のみで構成され、明らかに複雑性が低下する。しかし、このようにゲノムの複雑性が低下した結果、それまで特異的であった１１ｍｅｒプローブがハイブリダイズできる特異的部位が改変ゲノム内にはもはやないということである。亜硫酸水素塩による変換の結果として新規に生じた、１１塩基の配列に相当する可能性のある位置が、今度は他にたくさんある。元の遺伝子座を見つけてそことハイブリダイズするためには、今度は１４ｍｅｒのプローブが必要であろう。直感に反すると最初は感じられるかもしれないが、そのようなわけで、今や改変された３塩基ゲノムであるものの中で元の位置を検出するためには、それまでより増加したプローブ長が必要であり、その理由は、ゲノムのより多くの部分が同じように見える（似たような配列をより多く有している）からである。したがって、ゲノムの相対的な複雑性の低下（または３塩基ゲノムの単純性）とは、元の特異的部位を見つけるために、より長いプローブを設計しなくてはならないことを意味する。
【０１４７】
本明細書で使用する「ゲノムの相対的な複雑性の低下」という用語は、微生物特異的になりうるプローブ長の、未改変のＤＮＡと比べた場合の増加分で評価できる。この用語は、微生物の存在を決定するうえで使用されるプローブ配列の型の意味も含んでいる。このようなプローブは、ＰＮＡもしくはＬＮＡの骨格、または、ＩＮＡの説明で記載したもののように、骨格への改変付加など、従来にない骨格を有することがある。したがって、ＩＮＡ中のようにインターカレートする偽ヌクレオチドなどの付加的な構成要素をプローブが有するか否かにかかわらず、ゲノムは相対的な複雑性が低下していると考えられる。例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）およびその混合物およびそのハイブリッド、ならびに、限定はしないがホスホロチオエート、メチルホスホレート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｌａｔｅ）、ホスホラミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｂｏｒａｎｏａｔｅ）といったそのリン原子改変体が挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在しないヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２'−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３'−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２'−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれるヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、これらに限定されないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート（ｆｏｒｍａｃｅｔａｔｅ）、チオホルムアセテート（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｔｅ）、および、アミドを含む連結基などのリン非含有化合物を、ヌクレオチドへの連結に使用してもよい。とりわけ、核酸および核酸類似体は、１つまたは複数のインターカレーター偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含んでよい。ＩＰＮの存在は、核酸分子にとっての複雑性を部分的に説明するものではなく、ＰＮＡ中でのように、その複雑性の骨格部分を成すものでもない。
【０１４８】
「ＩＮＡ」とは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０３／０５１９０１号、国際公開第０３／０５２１３２号、国際公開第０３／０５２１３３号および国際公開第０３／０５２１３４号（Ｕｎｅｓｔ Ａ／Ｓ）の教示に従うインターカレーティング核酸を意味する。ＩＮＡは、１つまたは複数のインターカレーター偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）分子を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である。
【０１４９】
「ＨＮＡ」とは、例えばＶａｎ Ａｅｔｓｃｈｏｔら、１９９５により記載されたような核酸を意味する。
【０１５０】
「ＭＮＡ」とは、Ｈｏｓｓａｉｎら、１９９８により記載されたような核酸を意味する。
【０１５１】
「ＡＮＡ」は、Ａｌｌｅｒｔら、１９９９により記載された核酸を指す。
【０１５２】
「ＬＮＡ」は、国際公開第９９／１４２２６号（Ｅｘｉｑｏｎ）に記載されたような任意のＬＮＡ分子であってよく、好ましくは、ＬＮＡは、国際公開第９９／１４２２６号の要約に示されている分子から選択される。より好ましくは、ＬＮＡはＳｉｎｇｈら、１９９８、Ｋｏｓｈｋｉｎら、１９９８、または、Ｏｂｉｋａら、１９９７に記載されたような核酸である。
【０１５３】
「ＰＮＡ」は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１により記載されたようなペプチド核酸を指す。
【０１５４】
本明細書で使用する「相対的な複雑性の低下」は、ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ（配列番号： ）という配列と、ＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号： ）という同じ長さの配列との間にある何らかの数学的複雑性の違いというような、塩基が現れる順序を指すものでもなければ、Ｗａｒｉｎｇ，Ｍ．＆Ｂｒｉｔｔｅｎ Ｒ．Ｊ．、１９６６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５４、７９１〜７９４、および、Ｂｒｉｔｔｅｎ，Ｒ．Ｊ ａｎｄ Ｋｏｈｎｅ Ｄ Ｅ．、１９６８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６１、５２９〜５４０による科学文献、ならびにその中に記載された、Ｃａｒｎｅｇｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｙｅａｒｂｏｏｋの報告に由来するもっと以前の参考文献内に紹介されている、ゲノムの相対的な大きさについての独自の再結合データ（および、推定に基づいたゲノムの複雑性）を指すものでもない。
【０１５５】
本明細書で使用する「ゲノムの相対的な複雑性」は、分子プローブにより評価される、２つのゲノム中の塩基の変化しない位置（元のゲノムおよび変換されていないゲノムは両方とも、１からｎの不変の位置に塩基を有する）を指す。ある特定の女性の３０億塩基対の半数体ヒトゲノムの場合、この不変の位置は１からｎまでであると定義され、このときｎは３０００００００００である。１からｎの配列において、元のゲノムでｉ番目の塩基がＣであれば、変換後のゲノムではｉ番目の塩基はＴである。
【０１５６】
本明細書で使用する「ゲノム核酸」という用語は、微生物（原核生物および単細胞の真核生物）のＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質コード核酸、タンパク質非コード核酸、ならびに、原核生物および単細胞の真核微生物のリボソーム遺伝子領域を包含する。
【０１５７】
本明細書で使用する「微生物ゲノム」という用語は、染色体の核酸ならびに染色体外の核酸、他にも、プラスミド、バクテリオファージおよび最も広い意味での可動因子など、そのゲノムに一時的に存在するものを網羅する。「ゲノム」は、Ｓ．ｇａｌａｃｔｉｄｅにより例証されるような中心となる構成要素を有し、また、別の分離株間で異なるコード因子および非コード因子を有する可能性もある。
【０１５８】
本明細書で使用する「微生物由来のＤＮＡ」という用語は、微生物から直接得られるＤＮＡ、または、逆転写酵素などの公知もしくは適当な方法のいずれかにより微生物のＲＮＡをＤＮＡに変換することで間接的に得られるＤＮＡを包含する。
【０１５９】
本明細書で使用する「微生物」という用語は、ファージ、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、藻類、原生動物、スピロヘータ、単細胞生物、または、どれだけ多様に分類されているかにかかわらず、Ｍａｒｇｕｌｉｓ，Ｌ．ら、１９９０、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｃｔｉｓｔａ、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ ＵＳＡによる原生生物界のような他の任意の微生物、または、Ｈａｒｒｉｓｏｎｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２版、Ｊ Ｄ Ｗｉｌｓｏｎら編、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｉｎｃならびにこれ以降の版で定義されているような、ヒトと関わりのある微生物を包含する。また、この用語は、ＯＭＩＭ、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｇｏｖ．に定義された、ヒトの病態と関連して記載された全ての微生物も包含する。
【０１６０】
本明細書で使用する「微生物特異的な核酸分子」という用語は、本発明による方法を用いて決定されたかまたは得られた、微生物に特異的な１つまたは複数の配列を有する分子を意味する。
【０１６１】
本明細書で使用する「微生物の分類レベル」という用語は、科、属、種、系統、型、または、同一もしくは異なる地理的集団もしくは底生集団に由来する異なる集団を包含する。細菌の場合は、細菌界、プロテオバクテリア門、βプロテオバクテリア綱、ナイセリア目、ナイセリア科、ナイセリア属といった、一般に認識された図式が使用される。異なる集団は、微生物内に細胞内物質の形で存在するＤＮＡ分子（プラスミドまたはファージミド）中の、一塩基の変化もしくは変異についての多型であってもよいし、または、病原性島など、微生物ゲノムの多型染色体領域であってもよい。微生物およびウイルスのゲノムの流動性は認識されており、そうした流動性には、独立の核酸断片内に存在しうるウイルスゲノムのキメラ性も包含される。したがって、異なる動物に由来するゲノム領域の再集合により新規に生じる系統、例えば、他の哺乳動物ウイルスのゲノムまたはトリウイルスのゲノムから獲得された部分のキメラとしての新型ヒトインフルエンザ系統なども包含される。
【０１６２】
本明細書で使用する「密接な配列類似性」という用語は、尺度としての、配列の相対的な複雑性およびプローブ長についての上述の定義を包含する。
【０１６３】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、本明細書中の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な」という用語と互換的に使用され、改変された微生物核酸の全てまたは一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするその能力によって核酸を容易に同定しうることを意味する。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、とは、核酸のアニーリングが、例えば、高温および／または塩の含有量が低いなど、標準条件下で起きることを意味し、これにより非相補的なヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションが妨げられやすい。条件は用途によって変化すると考えられるが、固定化したＤＮＡに核酸プローブをハイブリダイゼーションするためのストリンジェントなプロトコールの例（０．１倍ＳＳＣ、６８℃で２時間を含む）が、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２、３８７〜３８９ページに記載されている。
【０１６４】
材料および方法
ＤＮＡの抽出
一般的には、微生物ＤＮＡ（またはウイルスＲＮＡ）は、適当な任意の入手源から入手できる。例としては、細胞培養物、ブロス培養物、環境試料、臨床試料、体液、液体試料、組織などの固体試料が挙げられるが、これらに限定されない。試料からの微生物ＤＮＡは、標準的な手順により入手できる。適当な抽出の例は、以下のとおりである。関心対象の試料を、４００μｌの、７Ｍグアニジン塩酸塩、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ６．４、１％トリトン−Ｘ−１００、５０ｍＭプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）、酵母ｔＲＮＡ１００μｇ／ｍｌ中に入れる。試料は、使い捨ての１．５ｍｌ内筒で完全にホモジナイズした後、６０℃で４８時間放置する。インキュベーション後、試料を、ドライアイスで５分間／９５℃で５分間の、凍結／解凍サイクルに５サイクル供する。次に、試料をボルテックスしてから微量遠心管中に入れて２分間回転させ、細胞片をペレット化する。上澄みを清潔な管に取り出し、希釈して塩濃度を低下させてから、フェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた後、１０ｍＭトリス／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ５０μｌ中で再懸濁させる。
【０１６５】
具体的には、標準的な寒天プレート（それぞれの種に特異的な栄養所要量とともに）上で育成したグラム陽性菌およびグラム陰性菌からのＤＮＡ抽出を、以下のとおり実施した。
【０１６６】
グラム陰性菌からのＤＮＡ抽出のためのプロトコールは以下のとおりであった。
ａ）滅菌済の爪楊枝を用い、培養プレートから細菌コロニーをこすり取り、滅菌済の１．５ｍｌ遠心管に入れた。
ｂ）チオシアン酸グアニジン抽出緩衝溶液１８０μｌ（７Ｍチオシアン酸グアニジン、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭトリス／Ｈｃｌ ｐＨ７．６、１％トリトン−Ｘ−１００）を加え、試料を混合して細菌コロニーを再懸濁させた。
ｃ）プロテイナーゼＫ２０μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、試料をよく混合した。
ｄ）試料を５５℃で３時間インキュベートし、細胞を溶解させた。
ｅ）水２００μｌを各試料に加えてから、試料を穏やかなピペッティングにより混合した。
ｆ）フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）４００μｌを加えてから、試料を２×１５秒間ボルテックスした。
ｇ）次に、試料を微量遠心管中で１４０００ｒｐｍで４分間回転させた。
ｈ）水相を清潔な１．５ｍｌ遠心管中に取り出した。
ｉ）フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）４００μｌを加えてから、試料を２×１５秒間ボルテックスした。
ｊ）次に、試料を微量遠心管中で１４０００ｒｐｍで４分間回転させた。
ｋ）水相を清潔な１．５ｍｌ遠心管中に取り出した。
ｌ）１００％エタノール８００μｌを各試料に加え、試料を短時間ボルテックスしてから−２０℃で１時間放置した。
ｍ）試料を微量遠心管中で１４０００ｒｐｍ、４℃で４分間回転させた。
ｎ）ＤＮＡペレットを７０％エタノール５００μｌで洗浄した。
ｏ）試料を微量遠心管中で１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間回転させ、エタノールを捨ててから、ペレットを５分間風乾させた。
ｐ）最後に、１００μｌの、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０中でＤＮＡを再懸濁させた。
ｑ）溶液の吸光度を２３０、２６０、２８０ｎｍで測定することにより、ＤＮＡ濃度および純度を計算した。
【０１６７】
グラム陽性菌からのＤＮＡ抽出のためのプロトコールは以下のとおりであった。
ａ）滅菌済の爪楊枝を用い、培養プレートから細菌コロニーをこすり取り、滅菌済の１．５ｍｌ遠心管に入れた。
ｂ）２０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）１８０μｌおよびリゾスタフィン（Ｓｉｇｍａ）２００μｇを各試料に加え、試料を穏やかに混合して細菌コロニーを再懸濁させた。
ｃ）試料を３７℃で３０分間インキュベートして、細胞壁を分解させた。
ｄ）次に、試料を処理してから、グラム陽性菌用のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔのプロトコールに従い、ＤＮＡを抽出した。
【０１６８】
患者の細胞診用試料からのＤＮＡ抽出。
ａ）試料を手で勢いよく振って、沈降した細胞を全て再懸濁させ、溶液の均一性を確保した。
ｂ）再懸濁させた細胞４ｍｌを、１５ｍｌのＣｏｓｔａｒ遠心管に移した。
ｃ）この管を、スイングアウト型のバケットローター中で３０００×ｇで１５分間遠心分離した。
ｄ）この上澄みは、注意深くデカントしてから、ペレット化した細胞物質を損なわないようにして捨てた。
ｅ）ペレット化した細胞を、溶解緩衝溶液（１００ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．５％ＳＤＳ、０．５％トリトン−Ｘ−１００）２００μｌ中で再懸濁させてから、溶液が均質になるまで十分に混合した。
ｆ）試料８０μｌを９６ウェルの試料調製プレートに移した。
ｇ）プロテイナーゼＫ２０μｌを加えてから、溶液を５５℃で１時間インキュベートした（この手順により細胞が溶解する）。
【０１６９】
尿試料からのＤＮＡ抽出
ＱＩＡａｍｐ ＵｌｔｒａＳｅｎｓ（商標）Ｖｉｒｕｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋに従い、開始容量１ｍｌの尿からＤＮＡを抽出した。
【０１７０】
ＤＮＡ試料の亜硫酸水素塩処理
ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（商標）Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＤＮＡ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に従い、亜硫酸水素塩処理を実施した。以下も参照のこと。
【０１７１】
驚くべきことに、本発明者らは、例えばヒト細胞試料中に微生物ＤＮＡがある場合などに、微生物ＤＮＡを他の核酸源から分離する必要がないことを見出した。この処理ステップは、異なるＤＮＡ型が大規模に混ざり合ったものについて使用でき、さらに、微生物特異的な核酸を本発明により同定することもできる。複合ＤＮＡ混合物における検出の限界は、標準的なＰＣＲ検出の限界程度で、標的核酸分子の単一複製まではできると推定される。
【０１７２】
試料
本発明用には、適当な任意の試料が使用できる。例としては、微生物培養物、臨床試料、獣医学的試料、生体液、組織培養試料、環境試料、水試料、溶出物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は任意の微生物の検出に適用できるため、こうした列挙は網羅的なものとみなされるべきではない。
【０１７３】
キット
本発明は、多様なキット、またはキットの組合せの形態で実施でき、手作業、半自動化または完全にロボット化したプラットフォームに関して具体例が提示できる。好ましい一形態では、ＭｅｔｈｙＥａｓｙ（商標）またはＨｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（商標）ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により、ＥｐＭｏｔｉｏｎなどのロボットプラットフォームを用いて９６または３８４プレート中での核酸の変換が可能である。
【０１７４】
亜硫酸水素塩処理
核酸の効果的な亜硫酸水素塩処理のための例示的プロトコールを、以下に示す。このプロトコールを実施すると、結果として、実質的に全てのＤＮＡが処理されて保持される。この方法は、本明細書ではＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ（ＨＧＳ）法とも呼ぶ。試料または試薬の容量または分量を変更できることは理解されよう。
【０１７５】
亜硫酸水素塩処理の好ましい方法は、米国特許出願第１０／４２８３１０号または国際出願ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００５４９号で知ることができ、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
ＤＮＡ２μｇ（必要に応じ、適当な制限酵素で予め消化させることもできる）に、３Ｍ ＮａＯＨ（水５０ｍｌ中６ｇ、新規に調製）２μl（１／１０容量）を加え、最終容量２０μlとした。亜硫酸水素塩試薬は一本鎖分子と反応することが好ましいことから、このステップで、二本鎖ＤＮＡ分子を一本鎖の形に変性させる。この混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。変性効率を上げるために、室温を超える温度でのインキュベーションを採用することもできる。
【０１７７】
インキュベーション後、２Ｍメタ亜硫酸水素ナトリウム（１０Ｎ ＮａＯＨ４１６ｍｌを加えた水２０ｍｌ中に７．６ｇ、ＢＤＨ ＡｎａｌａＲ ＃１０３５６．４Ｄ、新規に調製）２０８μlおよび１０ｍＭキノール（水５０ｍｌ中に０．０５５ｇ、ＢＤＨ ＡｎａｌＲ ＃１０３１２２Ｅ、新規に調製）１２μlを連続して加えた。キノールは還元剤であり、試薬の酸化を抑える働きをする。他の還元剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、キノン（ヒドロキノン）、または他の適当な還元剤を使用することもできる。試料を鉱油２００μlで覆った。鉱油で覆うことで試薬の蒸発および酸化を防ぐが、これは絶対に必要なことではない。次に、試料を５５℃で一晩インキュベートした。別の方法としては、以下のように試料をサーマルサイクラー中でサイクルさせることもできる：約４時間または一晩、以下のとおりインキュベートする：ステップ１、ＰＣＲ機中で５５℃／２時間でサイクル；ステップ２、９５℃／２分。ステップ１は約３７℃から約９０℃までの任意の温度で実施でき、５分から８時間までの長さで変化させることができる。ステップ２は、約７０℃から約９９℃までの任意の温度で実施でき、約１秒から６０分、またはそれを超える長さまで変化させることができる。
【０１７８】
メタ亜硫酸水素ナトリウムでの処理の後、油を除去し、ＤＮＡ濃度が低ければｔＲＮＡ１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）またはグリコーゲン２μｌを加えた。こうした添加物は任意選択であり、特にＤＮＡが低濃度で存在する場合に、標的ＤＮＡと共沈させることによって得られるＤＮＡの収量を高めるために使用できる。核酸をさらに効率的に沈殿させるための担体としての添加物の使用は、一般には核酸の量が＜０．５μｇである場合に必要となる。
【０１７９】
イソプロパノールによる精製処理を以下のとおり実施した。水８００μlを試料に加え、混合してからイソプロパノール１ｍｌを加えた。反応容器中の亜硫酸水素塩濃度は、その塩が関心対象の標的核酸と共に沈殿することがないレベルまで、水または緩衝溶液を用いて低下させる。本明細書に開示するような所望の範囲を下回って塩濃度が希薄であるならば、希釈率は一般に約１／４から１／１０００である。
【０１８０】
試料を再び混合し、４℃で最低５分間放置した。試料を微量遠心管中で１０〜１５分回転させてから、７０％ＥＴＯＨを用いて、ペレットを２回、いずれもボルテックスしながら洗浄した。この洗浄処理により、核酸と共に沈殿した残留塩があれば全て除去する。
【０１８１】
ペレットを乾燥させてから、５０μlなど適当な容量のＴ／Ｅ（１０ｍＭトリス／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）ｐＨ７．０〜１２．５中で再懸濁させた。ｐＨ１０．５の緩衝溶液はとりわけ有効であることがわかっている。核酸を懸濁させる必要に応じて、試料を３７℃から９５℃で１分間から９６時間インキュベートした。
【０１８２】
亜硫酸水素塩処理の別の例は、国際公開第２００５／０２１７７８号（参照により本明細書に組み込まれる）で知ることができるが、これは、シトシンをウラシルに変換するための方法および材料を提供している。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡなどの核酸を、亜硫酸水素塩およびトリアミンまたはテトラアミンなどのポリアミン触媒と反応させる。亜硫酸水素塩は亜硫酸水素マグネシウムを含んでいてもよい。別の実施形態では、核酸を亜硫酸水素塩マグネシウムと反応させるが、ポリアミン触媒および／または第四級アミン触媒が存在する条件であってもよい。また、本発明の方法を実行するために使用できるキットも提供される。これらの方法が、処理ステップにおいても本発明に適したものとなるであろうということは理解されよう。
【０１８３】
増幅
プライマーがそれぞれ６ｎｇ／μｌの、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを用いて、亜硫酸水素塩処理したゲノムＤＮＡ２μｌを含有する反応混合物２５μｌ中でＰＣＲ増幅を実施した。増幅には、鎖特異的な、ネスト化したプライマーを使用する。ＰＣＲプライマー１および４（以下を参照のこと）を用いて、一巡目のＰＣＲ増幅を実行した。一巡目の増幅に続いて、増幅した材料１μｌを、ＰＣＲプライマー２および３を含有する二巡目用のＰＣＲプレミックスに移し、先に記載のとおりに増幅させた。ＰＣＲ産物の試料を、以下の条件でＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ ＰＸ２サーマルサイクラー中で増幅させた：９５℃で４分間を１サイクル、次に９５℃で１分間、５０℃で２分間および７２℃で２分間を３０サイクル、７２℃で１０分間を１サイクル。
【０１８４】
【化１】
【０１８５】
多重増幅
検出のために多重増幅が必要であれば、以下の手順を実行できる。
【０１８６】
亜硫酸水素塩処理したＤＮＡ１μｌを、反応容量２５μｌの、以下の成分に加える：１倍のＱｉａｇｅｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、一巡目の各ＩＮＡまたはオリゴヌクレオチドプライマー５〜１００ｎｇ、１．５〜４．０ｍＭ ＭｇＳＯ４、４００μＭの各ｄＮＴＰおよびポリメラーゼ混合物０．５〜２単位。次にこの成分を、以下のとおりホットリッドサーマルサイクラー中でサイクルさせる。通常、各増幅反応中で最大２００種の個別のプライマー配列を存在させることができる。
ステップ１ ９４℃ １５分 １サイクル
ステップ２ ９４℃ １分
５０℃ ３分 ３５サイクル
６８℃ ３分
ステップ３ ６８℃ １０分 １サイクル
【０１８７】
次に、酵素反応ミックスおよび適切な二巡目プライマーを含有する二巡目反応管に移した一巡目の増幅物１μｌ分量について、二巡目の増幅を実施する。次に、上述のとおりサイクルを実施する。
【０１８８】
プライマー
本発明には、適当な任意のＰＣＲプライマーを使用できる。プライマーは、通常は、増幅対象となる配列に相補的な配列を有する。プライマーは通常オリゴヌクレオチドであるが、オリゴヌクレオチド類似体とすることもできる。
【０１８９】
プローブ
プローブは、適切な任意の核酸分子または核酸類似体であってよい。例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）ならびにその混合物およびそのハイブリッド、ならびに、限定はしないがホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホラミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエートといったそのリン原子改変体が挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在しないヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２'−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３'−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２'−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれるヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、これらに限定されないがメチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテート、および、アミドを含む連結基などのリン非含有化合物を、ヌクレオチドへの連結に使用してもよい。とりわけ、核酸および核酸類似体は、１つまたは複数のインターカレーター偽ヌクレオチドを含んでよい。
【０１９０】
好ましくは、プローブは、ＩＮＡを形成する１つまたは複数の１つまたは複数の内因性ＩＰＮを含有するＤＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【０１９１】
電気泳動
Ｅ−ｇｅｌ ｓｙｓｔｅｍのユーザーガイド（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｄｏｃ）に従って、試料の電気泳動を実施した。
【０１９２】
検出方法
所望の試料の状態を決定するための可能性のある検出システムは、多数存在する。本発明には、核酸分子検出のための任意の公知のシステムまたは方法が使用可能であろうということが理解されるであろう。検出システムとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｉ．１０〜＞２０００００種の個別成分を選択できるようなマイクロアレイタイプの装置への、適切に標識されたＤＮＡのハイブリダイゼーション。このアレイは、ガラス、プラスチック、雲母、ナイロン、ビーズ、磁気ビーズ、蛍光ビーズまたは膜などの適当な任意の固相表面上に、ＩＮＡ、ＰＮＡまたはヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドのアレイのいずれかで構成可能であろう。
ＩＩ．サザンブロットタイプの検出システム。
ＩＩＩ．アガロースゲル、Ｇｅｎｅｓｃａｎ分析などの蛍光読み取りといった、標準的なＰＣＲ検出システム。サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、臭化エチジウム、Ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎなどのＤＮＡ染色試薬、抗体検出、ＥＬＩＳＡプレートリーダータイプの装置、蛍光光度計装置。
ＩＶ．特異的もしくは複合的な増幅ゲノム断片のリアルタイムＰＣＲ定量、またはその任意の変化形。
Ｖ．蛍光ビーズ、酵素複合体、放射性ビーズなど、国際公開第２００４／０６５６２５号に概要が記載された検出システムのいずれか。
ＶＩ．リガーゼ連鎖反応、または、鎖置換増幅（ＳＤＡ）などの等温でのＤＮＡ増幅技術といった増幅ステップを利用する、他の任意の検出システム。
ＶＩＩ．多光子検出システム。
ＶＩＩＩ．ゲル中での電気泳動および可視化。
ＩＸ．核酸を検出するために使用されるか、または使用できると考えられる、任意の検出プラットフォーム。
【０１９３】
インターカレーティング核酸
インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）は、配列特異性を有する核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にハイブリダイズできる、天然に存在しないポリヌクレオチドである。ＩＮＡは、プローブをベースにしたハイブリダイゼーションアッセイにおける核酸プローブの代替物／代用物としての候補であるが、その理由は、ＩＮＡがいくつか望ましい性質を示すからである。ＩＮＡは、核酸にハイブリダイズして、対応する、天然に存在する核酸／核酸複合体よりも熱力学的に安定なハイブリッドを形成するポリマーである。ＩＮＡは、ペプチドまたは核酸を分解することで知られる酵素に対する基質ではない。したがって、ＩＮＡは、天然に存在する核酸断片よりも、生物試料中での安定性が高いはずであり、同時に、貯蔵期間も長いはずである。イオン強度への依存度が非常に高い核酸ハイブリダイゼーションとは異なり、核酸とのＩＮＡのハイブリダイゼーションは、イオン強度からはほぼ独立しており、天然に存在する核酸を核酸にハイブリダイゼーションするには非常に不利な、イオン強度が低い条件下で、有利である。ＩＮＡの結合強度は、分子中に組み込まれたインターカレーティング基の数のほか、二本鎖構造中で特異的な様式で積み重なっている塩基間の水素結合に由来する通常の相互作用にも依存している。配列の識別は、ＤＮＡ認識ＤＮＡよりも、ＩＮＡ認識ＤＮＡについてのほうが効率的である。
【０１９４】
好ましくは、ＩＮＡは、（Ｓ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−（１−ピレニルメチル）−グリセロールのホスホラミダイトである。
【０１９５】
ＩＮＡは、標準的なオリゴヌクレオチド合成手順を適応させることによって、市販のフォーマットで合成される。ＩＮＡの完全な定義およびその合成については、国際公開第０３／０５１９０１号、国際公開第０３／０５２１３２号、国際公開第０３／０５２１３３号および国際公開第０３／０５２１３４号（Ｕｎｅｓｔ Ａ／Ｓ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ａｕｓｔｒａｌｉａに譲渡）で知ることができ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
実際には、ＩＮＡプローブと標準的な核酸プローブとの間には、多くの違いがある。こうした違いは、便宜上、生物学的、構造的、および物理化学的な違いに分けることができる。上述および下述するように、通常は核酸が採用されている用途でＩＮＡプローブの使用を試みた場合、このような生物学的、構造的、および物理化学的な違いによって、予測できない結果が生じる可能性がある。異なる組成物のこうした非等価性は、化学分野ではよく見られる。
【０１９７】
生物学的な違いに関しては、核酸は、遺伝子の伝達および発現の媒介物として、生物種の生命において中心的な役割を果たす生体物質である。ｉｎ ｖｉｖｏでのその性質は、かなりよく理解されている。しかし、ＩＮＡは、最近開発された完全に人工的な分子であり、化学者の頭の中で着想され、有機合成化学を用いて作製されるものである。ＩＮＡには、公知の生物学的機能はない。
【０１９８】
構造的にも、ＩＮＡは核酸とは劇的に異なる。どちらも普通の核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ）を使用できるが、これらの分子の組成は構造的に別のものである。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＩＮＡの骨格は、リン酸ジエステルリボースおよび２−デオキシリボースの単位が繰り返されてできている。ＩＮＡは、リンカー分子を介してポリマーに結合している１つまたは複数の大きく平らな分子を有する点で、ＤＮＡまたはＲＮＡとは異なる。この平らな分子は、二本鎖構造中でＩＮＡと向かい合う相補的ＤＮＡ中の塩基間にインターカレートする。
【０１９９】
ＩＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間の物理／化学的な違いも、かなり大きい。ＩＮＡが相補的ＤＮＡに結合する速度は、核酸プローブが同じ標的配列に結合するより速い。ＤＮＡまたはＲＮＡ断片とは異なり、ＩＮＡは、インターカレーティング基が末端部位に位置していない限り、ＲＮＡにほとんど結合しない。インターカレーティング基と相補的ＤＮＡ鎖上の塩基との間に強い相互作用があることで、ＩＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定性は、類似した、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定性を上回る。
【０２００】
ＤＮＡまたはＲＮＡ断片またはＰＮＡといった他の核酸とは異なり、ＩＮＡは、自己会合性または自己結合性を示さない。
【０２０１】
ＩＮＡは配列特異的に核酸とハイブリダイズするため、ＩＮＡはプローブをベースにしたアッセイを発展させるための有用な候補であり、キットおよびスクリーニングアッセイにはとりわけ適切である。しかしながら、ＩＮＡプローブは、核酸プローブと同等ではない。したがって、プローブをベースにしたアッセイにおける特異性、感受性および信頼性を向上できると考えられる、任意の方法、キットまたは組成物は、ＤＮＡを含有する試料の検出、分析および定量化において有用であろう。ＩＮＡは、この目的にとって必要な性質を有している。
【０２０２】
結果
本発明を実証するために、Ｃ型肝炎１ａの誘導核酸および単純化した核酸を図２から６に示す。Ｃ型肝炎１ａの天然のゲノムのトップ・ストランドおよびボトム・ストランドを、図１および２にそれぞれ示す。図３および４は、トップ・ストランドおよびボトム・ストランドそれぞれにおいて、全てのシトシンがウラシルで置換されている誘導核酸を示している。図５および６は改変核酸を示し、ここで、誘導核酸中の全てのウラシルはチミンで置換され、Ｃ型肝炎１ａのトップ・ストランドおよびボトム・ストランドそれぞれについて改変核酸が形成される。
【０２０３】
図２から６でわかるように、検出のため、または適当な標的を得るために使用できる、Ｃ型肝炎１ａについての本質的に４つの新しい人工ゲノムが創出された。誘導核酸および改変核酸は、天然には存在しないが、亜硫酸水素塩処理（誘導核酸）および増幅（改変核酸）により、典型的に生成される。
【０２０４】
したがって、本発明は、天然に存在する微生物核酸から生成され、新規かつ所望の用途を有する新規核酸分子に向けられる。
【０２０５】
表１は、本発明による、微生物の誘導核酸および改変核酸の配列の一覧を示すもので、配列表とともに記載してある（番号順に列挙）。配列のサイズおよび総数は極めて大きいので、本明細書ではペーパーコピーを提供していない。しかし、全ての配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０６】
【表１−１】
【０２０７】
【表１−２】
【０２０８】
【表１−３】
【０２０９】
【表１−４】
【０２１０】
【表１−５】
【０２１１】
【表１−６】
【０２１２】
【表１−７】
【０２１３】
【表１−８】
【０２１４】
【表１−９】
【０２１５】
【表１−１０】
【０２１６】
【表１−１１】
【０２１７】
【表１−１２】
【０２１８】
【表１−１３】
【０２１９】
【表１−１４】
【０２２０】
【表１−１５】
【０２２１】
【表１−１６】
【０２２２】
【表１−１７】
【０２２３】
【表１−１８】
【０２２４】
【表１−１９】
【０２２５】
【表１−２０】
【０２２６】
【表１−２１】
【０２２７】
【表１−２２】
【０２２８】
【表１−２３】
【０２２９】
【表１−２４】
【０２３０】
【表１−２５】
【０２３１】
【表１−２６】
【０２３２】
【表１−２７】
【０２３３】
本発明に対して、特定の実施形態で示すような多数の変形および／または改変が、広範に記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく成されうることが、当業者には理解されよう。したがって、本実施形態は全ての点において例証的なものであって限定的なものではないとみなされるべきである。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【図５−５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図６−５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表番号５１中の配列番号１〜配列番号７６からなる群から選択される配列を有する、Ｃ型肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２】
配列表番号１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、アシネトバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３】
配列表番号２中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、バシラス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４】
配列表番号３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、バクテロイデス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５】
配列表番号４中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、バルトネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６】
配列表番号５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ボルデテラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７】
配列表番号６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ボレリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８】
配列表番号７中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ブルセラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９】
配列表番号８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、カンピロバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０】
配列表番号９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、クラミジア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１１】
配列表番号１０中の配列番号１〜配列番号３９からなる群から選択される配列を有する、クロストリジウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１２】
配列表番号１１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、コルネバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１３】
配列表番号１２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、大腸菌の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１４】
配列表番号１３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エールリヒア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１５】
配列表番号１４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エンテロコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１６】
配列表番号１５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、フゾバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１７】
配列表番号１６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ヘモフィルス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１８】
配列表番号１７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヘリコバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１９】
配列表番号１８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、レジオネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２０】
配列表番号１９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、レプトスピラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２１】
配列表番号２０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、リステリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２２】
配列表番号２１中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、マイコバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２３】
配列表番号２２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マイコプラズマ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２４】
配列表番号２３中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ナイセリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２５】
配列表番号２４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノルカジア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２６】
配列表番号２５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、シュードモナス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２７】
配列表番号２６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、リケッチア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２８】
配列表番号２７中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、サルモネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２９】
配列表番号２８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、セラチア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３０】
配列表番号２９中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、シゲラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３１】
配列表番号３０中の配列番号１〜配列番号５２からなる群から選択される配列を有する、スタフィロコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３２】
配列表番号３１中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ストレプトコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３３】
配列表番号３２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ストレプトミセス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３４】
配列表番号３３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、トレポネーマ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３５】
配列表番号３４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、トロフェルミア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３６】
配列表番号３５中の配列番号１〜配列番号６０からなる群から選択される配列を有する、プラスモジウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３７】
配列表番号３６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、アスペルギリス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３８】
配列表番号３７中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、カンジダ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３９】
配列表番号３８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、クリプトコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４０】
配列表番号３９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、パラコクシジオイデス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４１】
配列表番号４０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、リゾプス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４２】
配列表番号４１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、フランシセラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４３】
配列表番号４２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ビブリオ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４４】
配列表番号４３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エルシニア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４５】
配列表番号４４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＪＣポリオーマウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４６】
配列表番号４６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、アンデスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４７】
配列表番号５２中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４８】
配列表番号５３中の配列番号１〜配列番号１２８からなる群から選択される配列を有する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４９】
配列表番号５４中の配列番号１〜配列番号１６２からなる群から選択される配列を有する、インフルエンザウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５０】
配列表番号５５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＢＫウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５１】
配列表番号５６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、バーマウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５２】
配列表番号５７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、カリシウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５３】
配列表番号５８中の配列番号１〜配列番号４８からなる群から選択される配列を有する、コロラドダニ熱ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５４】
配列表番号５９中の配列番号１〜配列番号２８からなる群から選択される配列を有する、口蹄ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５５】
配列表番号６０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＧＢ肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５６】
配列表番号６１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヘンダウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５７】
配列表番号６２中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、ヒトアデノウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５８】
配列表番号６３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトアストロウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５９】
配列表番号６４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトボカウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６０】
配列表番号６５中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ヒトコロナウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６１】
配列表番号６６中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ヒトエンテロウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６２】
配列表番号６７中の配列番号１〜配列番号３６からなる群から選択される配列を有する、ヒトヘルペスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６３】
配列表番号６８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトメタニューモウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６４】
配列表番号６９中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ヒトパラインフルエンザウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６５】
配列表番号７０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトパレコウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６６】
配列表番号７１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ヒトライノウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６７】
配列表番号７２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトＲＳウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６８】
配列表番号７３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、麻疹ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６９】
配列表番号７４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ムンプスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７０】
配列表番号７５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノロウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７１】
配列表番号７６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノーウォークウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７２】
配列表番号７７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、パルボウイルスＢ１９の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７３】
配列表番号７８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ポリオウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７４】
配列表番号７９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、狂犬病ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７５】
配列表番号８０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ロスリバーウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７６】
配列表番号８１中の配列番号１〜配列番号１２４からなる群から選択される配列を有する、ロタウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７７】
配列表番号８２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＳＡＲＳコロナウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７８】
配列表番号８３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＴＴウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７９】
配列表番号８４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＴＴＶミニウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８０】
配列表番号８５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、西ナイルウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８１】
配列表番号８６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、アルファウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８２】
配列表番号８７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ラクダ痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８３】
配列表番号８８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、牛痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８４】
配列表番号８９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、コクシエラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８５】
配列表番号９０中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、クリミアコンゴ出血熱の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８６】
配列表番号９１中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、デングウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８７】
配列表番号９２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、東部ウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８８】
配列表番号９３中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、エボラウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８９】
配列表番号９４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マールブルクウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９０】
配列表番号９５中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、グアナリトウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９１】
配列表番号９６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ハンタウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９２】
配列表番号９７中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ハンタンウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９３】
配列表番号９７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、日本脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９４】
配列表番号９９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、フニンウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９５】
配列表番号１００中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ラッサウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９６】
配列表番号１０１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、マチュポウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９７】
配列表番号１０２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、サル痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９８】
配列表番号１０３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マレー渓谷脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９９】
配列表番号１０４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ニパーウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１００】
配列表番号１０５中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、リフト渓谷熱ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０１】
配列表番号１０６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、サビアウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０２】
配列表番号１０７中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、シンノンブレウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０３】
配列表番号１０８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、大痘瘡ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０４】
配列表番号１０９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、小痘瘡ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０５】
配列表番号１１０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０６】
配列表番号１１１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、西部ウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０７】
配列表番号１１２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、黄熱病ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１】
配列表番号５１中の配列番号１〜配列番号７６からなる群から選択される配列を有する、Ｃ型肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２】
配列表番号１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、アシネトバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３】
配列表番号２中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、バシラス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４】
配列表番号３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、バクテロイデス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５】
配列表番号４中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、バルトネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６】
配列表番号５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ボルデテラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７】
配列表番号６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ボレリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８】
配列表番号７中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ブルセラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９】
配列表番号８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、カンピロバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０】
配列表番号９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、クラミジア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１１】
配列表番号１０中の配列番号１〜配列番号３９からなる群から選択される配列を有する、クロストリジウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１２】
配列表番号１１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、コルネバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１３】
配列表番号１２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、大腸菌の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１４】
配列表番号１３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エールリヒア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１５】
配列表番号１４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エンテロコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１６】
配列表番号１５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、フゾバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１７】
配列表番号１６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ヘモフィルス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１８】
配列表番号１７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヘリコバクター属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１９】
配列表番号１８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、レジオネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２０】
配列表番号１９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、レプトスピラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２１】
配列表番号２０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、リステリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２２】
配列表番号２１中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、マイコバクテリウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２３】
配列表番号２２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マイコプラズマ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２４】
配列表番号２３中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ナイセリア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２５】
配列表番号２４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノルカジア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２６】
配列表番号２５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、シュードモナス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２７】
配列表番号２６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、リケッチア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２８】
配列表番号２７中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、サルモネラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項２９】
配列表番号２８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、セラチア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３０】
配列表番号２９中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、シゲラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３１】
配列表番号３０中の配列番号１〜配列番号５２からなる群から選択される配列を有する、スタフィロコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３２】
配列表番号３１中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ストレプトコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３３】
配列表番号３２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ストレプトミセス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３４】
配列表番号３３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、トレポネーマ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３５】
配列表番号３４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、トロフェルミア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３６】
配列表番号３５中の配列番号１〜配列番号６０からなる群から選択される配列を有する、プラスモジウム属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３７】
配列表番号３６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、アスペルギリス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３８】
配列表番号３７中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、カンジダ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項３９】
配列表番号３８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、クリプトコッカス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４０】
配列表番号３９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、パラコクシジオイデス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４１】
配列表番号４０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、リゾプス属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４２】
配列表番号４１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、フランシセラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４３】
配列表番号４２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ビブリオ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４４】
配列表番号４３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、エルシニア属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４５】
配列表番号４４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＪＣポリオーマウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４６】
配列表番号４６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、アンデスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４７】
配列表番号５２中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４８】
配列表番号５３中の配列番号１〜配列番号１２８からなる群から選択される配列を有する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項４９】
配列表番号５４中の配列番号１〜配列番号１６２からなる群から選択される配列を有する、インフルエンザウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５０】
配列表番号５５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＢＫウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５１】
配列表番号５６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、バーマウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５２】
配列表番号５７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、カリシウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５３】
配列表番号５８中の配列番号１〜配列番号４８からなる群から選択される配列を有する、コロラドダニ熱ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５４】
配列表番号５９中の配列番号１〜配列番号２８からなる群から選択される配列を有する、口蹄ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５５】
配列表番号６０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＧＢ肝炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５６】
配列表番号６１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヘンダウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５７】
配列表番号６２中の配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される配列を有する、ヒトアデノウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５８】
配列表番号６３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトアストロウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項５９】
配列表番号６４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトボカウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６０】
配列表番号６５中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ヒトコロナウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６１】
配列表番号６６中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、ヒトエンテロウイルスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６２】
配列表番号６７中の配列番号１〜配列番号３６からなる群から選択される配列を有する、ヒトヘルペスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６３】
配列表番号６８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトメタニューモウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６４】
配列表番号６９中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ヒトパラインフルエンザウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６５】
配列表番号７０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトパレコウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６６】
配列表番号７１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ヒトライノウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６７】
配列表番号７２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ヒトＲＳウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６８】
配列表番号７３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、麻疹ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項６９】
配列表番号７４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ムンプスウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７０】
配列表番号７５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノロウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７１】
配列表番号７６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ノーウォークウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７２】
配列表番号７７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、パルボウイルスＢ１９の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７３】
配列表番号７８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ポリオウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７４】
配列表番号７９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、狂犬病ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７５】
配列表番号８０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ロスリバーウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７６】
配列表番号８１中の配列番号１〜配列番号１２４からなる群から選択される配列を有する、ロタウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７７】
配列表番号８２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＳＡＲＳコロナウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７８】
配列表番号８３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＴＴウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項７９】
配列表番号８４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ＴＴＶミニウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８０】
配列表番号８５中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、西ナイルウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８１】
配列表番号８６中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、アルファウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８２】
配列表番号８７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ラクダ痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８３】
配列表番号８８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、牛痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８４】
配列表番号８９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、コクシエラ属の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８５】
配列表番号９０中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、クリミアコンゴ出血熱の誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８６】
配列表番号９１中の配列番号１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を有する、デングウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８７】
配列表番号９２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、東部ウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８８】
配列表番号９３中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、エボラウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項８９】
配列表番号９４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マールブルクウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９０】
配列表番号９５中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、グアナリトウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９１】
配列表番号９６中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ハンタウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９２】
配列表番号９７中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、ハンタンウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９３】
配列表番号９７中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、日本脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９４】
配列表番号９９中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、フニンウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９５】
配列表番号１００中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、ラッサウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９６】
配列表番号１０１中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、マチュポウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９７】
配列表番号１０２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、サル痘ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９８】
配列表番号１０３中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、マレー渓谷脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項９９】
配列表番号１０４中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ニパーウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１００】
配列表番号１０５中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、リフト渓谷熱ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０１】
配列表番号１０６中の配列番号１〜配列番号８からなる群から選択される配列を有する、サビアウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０２】
配列表番号１０７中の配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される配列を有する、シンノンブレウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０３】
配列表番号１０８中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、大痘瘡ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０４】
配列表番号１０９中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、小痘瘡ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０５】
配列表番号１１０中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０６】
配列表番号１１１中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、西部ウマ脳炎ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【請求項１０７】
配列表番号１１２中の配列番号１〜配列番号４からなる群から選択される配列を有する、黄熱病ウイルスの誘導核酸または改変核酸、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むその部分、およびそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸分子。
【公表番号】特表２００９−５３８６０３（Ｐ２００９−５３８６０３Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１２３６６（Ｐ２００９−５１２３６６）
【出願日】平成１８年６月２日（２００６．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００６／０００７５５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４０５０６
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５０５１８８９０６）ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２日（２００６．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００６／０００７５５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４０５０６
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５０５１８８９０６）ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]