微生物トランスグルタミナーゼの製造法
本発明により、微生物由来プロトランスグルタミナーゼのプロ構造部を選択的に切断する、放線菌由来中性メタロプロテアーゼおよびこれをコードする遺伝子が提供される。本発明の放線菌由来中性メタロプロテアーゼをコードする遺伝子を導入した微生物を培養し、前記放線菌由来中性メタロプロテアーゼを生産させ、微生物由来プロトランスグルタミナーゼに作用させることにより、プロ構造部が切断された活性型微生物由来トランスグルタミナーゼを製造することができる。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、放線菌により生産されるプロトランスグルタミナーゼのプロ構造部を効率的に切断し、活性型トランスグルタミナーゼに変換する新規プロテアーゼ、およびそれをコードする核酸分子に関する。
また本発明は、前記プロテアーゼを用いて、活性型微生物由来トランスグルタミナーゼを製造する方法に関する。
さらに本発明は、前記中性メタロプロテアーゼの製造法に関するものである。
【背景技術】
トランスグルタミナーゼはタンパク質のペプチド鎖内にあるγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素である。本酵素をタンパク質に作用させると、ε−（γ−Ｇｌｕ）−Ｌｙｓ架橋形成反応、Ｇｌｎの脱アミド化によるＧｌｕ残基への変換反応が起こりうる。このトランスグルタミナーゼは、ゼリー等のゲル化食品、ヨーグルト、チーズ、或いはゲル状化粧品などの製造や食肉の肉質改善等に利用されている（特公平１−５０３８２）。また、熱に安定なマイクロカプセルの素材、固定化酵素の担体などの製造に利用されているなど、産業上利用性の高い酵素である。
トランスグルタミナーゼには、活性発現がカルシウム依存性の動物由来トランスグルタミナーゼおよびカルシウム非依存性の微生物由来トランスグルタミナーゼ（マイクロバイアルトランスグルタミナーゼ：以下「ＭＴＧ」という）が知られている。ＭＴＧとしては、これまでにストレプトバーチシリウム属（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌から発見されたものが知られている。そのようなストレプトバーチシリウム属としては、例えば、ストレプトバーチシリウム・グリセオカルニウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ）ＩＦＯ １２７７６、ストレプトバーチシリウム・シナモニウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ ｓｕｂ ｓｐ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）ＩＦＯ １２８５２、ストレプトバーチシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ、以後、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅと略すことがある）ＩＦＯ １３８１９等が挙げられている（特開昭６４−２７４７１）。
しかしこれらは、上記菌類等の培養物から精製作業を経て製造されていたため、供給量、効率等の点で問題があった。そこで、異種タンパク質を効率よく分泌する方法として、宿主にコリネ型細菌を選択し、コリネ型細菌由来のシグナルペプチドの下流にトランスグルタミナーゼが接続された融合タンパク質を産生させ、これを菌体外に効率よく分泌させ、高収量のトランスグルタミナーゼを得る方法が確立された（ＷＯ ０１／２３５９１）。そこでは、ＭＴＧにプロ構造部の付加した不活性型のプロトランスグルタミナーゼ（以下、「プロＭＴＧ」という）の形態で分泌させ、分泌後プロテアーゼによってプロＭＴＧのプロ構造部を切断させ活性を有するトランスグルタミナーゼに変換する方法、および、放線菌由来のセリンプロテアーゼであるＳＡＭ−Ｐ４５を、プロＭＴＧを生産するコリネ型細菌に必要十分量共発現させることによって、培養液中に直接活性型のトランスグルタミナーゼを生成させる方法が示されている。
ところで、コリネ型細菌にプロＭＴＧと、そのプロ構造部を切断させるプロテアーゼとを共発現させて培養液に直接、活性型のトランスグルタミナーゼを生成させる方法は、きわめて効率の良いトランスグルタミナーゼ製造方法になると想定されるが、ＳＡＭ−Ｐ４５はその基質特異性が厳格ではなく、プロＭＴＧのプロ構造部のみならず、トランスグルタミナーゼ本体をある程度消化分解する場合もあるため、その取り扱いは必ずしも簡便とは言えない。したがって、ＳＡＭ−Ｐ４５を使用する場合には、培養液中に生成したトランスグルタミーゼの分解を起こさせないよう、トランスグルタミーゼ製造の工程管理を厳密に行う必要がある。
従って、活性型トランスグルタミナーゼを有利に行うために、プロＭＴＧのプロ構造部のみを選択的に分解し、かつトランスグルタミナーゼ本体の過分解をできるだけ起こさないプロテアーゼに対する需要がなお存在していた。
プロＭＴＧのプロ構造部を切断する酵素としては、ＳＡＭ−Ｐ４５以外には、バチラス・ポリミキサ由来のディスパーゼが知られている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５７巻、５７０−５７６頁（１９９８年））。しかしながら、プロ構造部の切断に大量の酵素が必要であり、トランスグルタミナーゼ本体の過分解の恐れがある。また、ディスパーゼは細胞培養用の試薬であり、産業用酵素としては高価である。
【発明の開示】
上述のように、活性型トランスグルタミナーゼ製造を有利に行うために、プロＭＴＧのプロ構造部のみを選択的に分解し、かつトランスグルタミナーゼ本体の過分解をできるだけ起こさないプロテアーゼがなお望まれていた。また、もしプロＭＴＧのプロ構造部のみを選択的に分解し、かつトランスグルタミナーゼ本体の過分解をできるだけ起こさないプロテアーゼを利用できれば、活性型トランスグルタミナーゼの製造に有利であると考えられた。さらに、プロＭＴＧのプロ構造部を選択的に分解する、トランスグルタミナーゼ製造に有用なプロテアーゼは、コリネ型細菌を用いて、容易に菌体外へ分泌できるものであれば、プロＭＴＧとともに共発現させることによって培養液に直接、活性型のトランスグルタミナーゼを生成させることができるので、より好ましいと考えられた。
従って、本発明の目的は、プロＭＴＧのプロ構造部を選択的に切断する、トランスグルタミナーゼ製造に有用なプロテアーゼを提供することである。
特に、本発明の目的は、プロＭＴＧのプロ構造部を選択的に切断するプロテアーゼであって、コリネ型細菌を宿主として生産することができ、かつ容易に菌体外へ分泌できるプロテアーゼを提供することである。
また、本発明の目的は、前記プロテアーゼをコードする核酸分子を提供することでもある。
本発明の更なる目的は、前記プロテアーゼを用いて、ＭＴＧを効率的に製造する方法を提供することである。
さらに本発明は、前記プロテアーゼを製造する方法を提供することである。
本発明者らは、プロＭＴＧのプロ構造部分を選択的に分解するがトランスグルタミナーゼ自体の分解をできるだけ起こさないプロテアーゼの探索を行い、放線菌から、そのような性質を有する中性メタロプロテアーゼを単離精製することができた。本発明者らは、前記プロテアーゼをコードするＤＮＡも取得し、これをコリネ型細菌に組み込み、コリネ型細菌を宿主とした分泌発現に成功した。さらに実際に本酵素をプロＭＴＧに作用させ、プロ構造部を切断させ、活性型トランスグルタミナーゼを回収することができた。また、同等の機能を有する他起源の微生物由来中性メタロプロテアーゼを見出し、同様に活性型ＭＴＧの製造に有用であることも明らかにし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は放線菌由来の、プロＭＴＧプロ構造部の切断選択性が高い中性メタロプロテアーゼ、および、これらをコードする核酸分子である。
また本発明は、中性メタロプロテアーゼによりプロＭＴＧのプロ構造部分を切断することを特徴とする、活性型ＭＴＧの製造方法である。
また、本発明は上記中性メタロプロテアーゼをコードする核酸分子をコリネ型細菌に導入し、前記核酸分子が導入されたコリネ型細菌を培養し、それによって上記中性メタロプロテアーゼを発現させ、菌体外に分泌された上記メタロプロテアーゼを回収することを特徴とする、上記メタロプロテアーゼ製造方法でもある。
より具体的には、本発明は、以下の性質を有する放線菌由来の中性メタロプロテアーゼＳＶＰ３５である：
１）分子量：約３５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
２）至適ｐＨ：６．０〜８．０、より具体的には６．５〜７．５、特に７．０付近
３）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１０
４）至適温度：約４５℃
５）温度安定性：約５０℃以下で安定
６）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
また、本発明は、以下の性質を有する放線菌由来の中性メタロプロテアーゼＳＶＰ７０である：
１）分子量：約７１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
２）至適ｐＨ：６．０〜８．０の範囲、より具体的には６．５〜７．５、特に７．０付近
３）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０
４）至適温度：５０℃〜５５℃の範囲、特に５５℃付近
５）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、ＳＨ−還元剤であるジチオスレイトール、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
また、本発明は上記ＳＶＰ３５またはＳＶＰ７０をコードする核酸分子である。
また、本発明は、上記ＳＶＰ３５またはＳＶＰ７０によりプロＭＴＧのプロ構造部分を切断することを特徴とする、活性型ＭＴＧの製造方法である。
さらに、本発明は上記ＳＶＰ３５またはＳＶＰ７０をコードする核酸分子をコリネ型細菌に導入し、前記核酸分子が導入されたコリネ型細菌を培養し、菌体外に分泌されたＳＶＰ３５またはＳＶＰ７０を回収することを特徴とする、ＳＶＰ３５またはＳＶＰ７０の製造方法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＳＶＰ３５およびＳＶＰ７０の活性のｐＨ依存性を表したグラフである。
図２は、ＳＶＰ３５およびＳＶＰ７０のｐＨ安定性を表したグラフである。
図３は、ＳＶＰ３５およびＳＶＰ７０の活性の温度依存性を表したグラフである。
図４は、ＳＶＰ３５の温度安定性を表したグラフである。
図５は、ＳＶＰ３５およびＳＶＰ７０の活性に対する種々の化合物の阻害活性を表す。
図６は、ＳＶＰ３５およびＳＶＰ７０による、プロＭＴＧの活性型ＭＴＧへの変換の経時変化をタンパク質量の変化としてそれぞれ表した図である。
図７は、ＳＶＰ７０およびＳＡＭ−Ｐ４５をプロＭＴＧに作用させた場合の、トランスグルタミナーゼ活性の経時変化を表したグラフである。（Ａ）：ＳＶＰ７０添加、●：基質に対して１／２００量を添加、■：基質に対して１／５００量を添加；（Ｂ）：ＳＡＭ−Ｐ４５添加、●：基質に対して１／１０量を添加、■：基質に対して１／５０量を添加。
図８は、ＳＶＰ７０およびＳＡＭ−Ｐ４５をプロＭＴＧに作用させた場合の、ＭＴＧタンパク質量の経時変化を表したグラフである。（Ａ）：ＳＶＰ７０添加、●：基質に対して１／２００量を添加、■：基質に対して１／５００量を添加；（Ｂ）：ＳＡＭ−Ｐ４５添加、●：基質に対して１／１０量を添加、■：基質に対して１／５０量を添加。
【発明を実施するための最良の形態】
一般に、分泌型タンパク質はプレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳された後、シグナルペプチド（「プレ部分」）が切断されて成熟ペプチドまたはプロペプチドに変換され、プロペプチドはプロテアーゼによってさらにプロ構造分と呼ばれる領域が切断されて成熟ペプチドになることが知られている。本明細書において、分泌型タンパク質のプロ構造部分を単に「プロ構造」と呼ぶこともある。また、本明細書において、「シグナル配列」とは、分泌性タンパク質前駆体のＮ末端に存在し、かつ天然の成熟タンパク質には存在しない配列をいい、「シグナルペプチド」とはそのようなタンパク質前駆体から切り取られるペプチドをいう。一般にはシグナル配列は菌体外への分泌に伴ってプロテアーゼによって切断される。
本明細書において、シグナルペプチドを有しないがプロ構造部分を有するタンパク質を「プロタンパク質」、たとえば「プロトランスグルタミナーゼ」あるいは「プロＭＴＧ」と称することがある。本明細書において、分泌型タンパク質のプロ構造部分を単に「プロ構造」あるいは「プロ構造部」と称することがあり、これらの用語は互換的に使用される。
本発明者らは、まずコリネ型細菌で容易に発現できると想定されるプロテアーゼのうち、目的とする基質選択特異性が高い、すなわちプロＭＴＧのプロ構造部を選択的に分解し且つトランスグルタミナーゼ本体の過分解をできるだけ起こさないプロテアーゼの探索を行った。
本来放線菌によってＭＴＧが菌体外に分泌されるときは、まずプロＭＴＧとして分泌され、分泌後プロＭＴＧのプロ構造部が切断され活性型ＭＴＧとなることが想定されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５７巻、５７０−５７６頁（１９９８年））。このことから、本発明者らは、ＭＴＧ生産放線菌にプロＭＴＧのプロ構造部を切断するプロテアーゼが存在することを予想した。このプロテアーゼは本来プロ構造部を切断するプロテアーゼであるから、基質選択性が高く、プロ構造部のみを切断し、ＭＴＧ本体への作用は少ないことが想定される。
また、放線菌由来のプロＭＴＧの構造遺伝子、並びにプロテアーゼＳＡＭ−Ｐ４５の構造遺伝子何れもがコリネ型細菌で良好に発現し、これらを菌体外へ分泌させることができる。これらの情報に基づき、放線菌であるＭＴＧ生産菌から目的とするプロテアーゼを見出すべく鋭意検討を行った結果、ＭＴＧ生産菌ストレプトバーチシリウム・モバラエンスが、プロＭＴＧのプロ構造部の切断選択性が高く、活性型ＭＴＧ生産に有用な新規中性メタロプロテアーゼをも生産していることが見出された。本発明者らは、この中性メタロプロテアーゼを単離精製し、その酵素学的特性を明らかにした。さらに本発明者らは、このメタロプロテアーゼのＮ末端部分アミノ酸配列を決定し、このメタロプロテアーゼをコードする遺伝子を得た。
また、本発明者らは、本酵素遺伝子をコリネ型細菌に組み込み、コリネ型細菌を宿主とした系において発現させたところ菌体外に分泌させることができた。さらに実際に本酵素をプロＭＴＧに作用させたところ、プロ構造部が切断され、活性型トランスグルタミナーゼが得られた。また、同等の機能を有する他の起源の微生物由来中性メタロプロテアーゼも見出され、同様に活性型ＭＴＧの製造に有用であることが明らかになった。
以下に、より具体的な本発明の実施の態様を例示的に示す。
本発明の中性メタロプロテアーゼは、ストレプトバーチシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）等の放線菌の培養菌体表層および培養上清中から調製することができる。
以下では、まず、ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９から新規に見出した中性プロテアーゼについて述べる。
本発明の中性プロテアーゼを得るための菌、例えば上述した放線菌の培養は、放線菌の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。すなわち、培養するための培地としては通常の炭素源、窒素源、無機イオン等を含有する通常の培地が利用できる。炭素源としてはグルコース、デンプン、ショ糖、その他を用いることができる。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、アンモニウム塩、その他を必要に応じて適宜使用することができる。培養は好気条件下にｐＨ５．０から８．５、温度を１５℃から３７℃の適当な範囲に制御することによって行うことができる。本発明の中性プロテアーゼ製造のためには、目的とする中性メタロプロテアーゼの生産が最大に達するまで培養を続け、その後停止させるのが好ましい。適切な培養期間は温度、ｐＨ、培地に依存するが、一般には１〜１２日程度が好ましい。培養後遠心分離操作等により、培養物を菌体と培養上清とに分ける。
本発明の新規中性メタロプロテアーゼは、培養上清液、および、回収した菌体、特に菌体表層から得ることができる。本酵素を精製するためには、通常酵素の精製を行うために用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法等を採用することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を使用することによって、さらに効率よくプロテアーゼを精製することができる。このようにして得られる中性メタロプロテアーゼの酵素活性の測定は、プロトランスグルタミナーゼのプロ構造部分と成熟トランスグルタミナーゼの接続領域を含むペプチド、例えば、合成ペプチドＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（配列番号１１）（ペプチド研究所製）を基質として酵素を反応させ、基質の減少量を算出することにより測定することができる。
上述したように、回収した菌体、特に菌体表層または培養上清液から抽出精製された本発明の中性メタロプロテアーゼは、次に、気相プロテインシークエンサーにてＮ末端のアミノ酸配列を解析し、部分アミノ酸配列を決定することができる。さらに、単離精製した中性メタロプロテアーゼの酵素化学的性質（至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性、阻害剤の影響等）を調べることができる。
本発明の一実施態様において、ストレプトバーチシリウム・モバラエンスの菌体表層からＳＶＰ３５と命名した中性メタロプロテアーゼが、培養上清からＳＶＰ７０と命名した中性メタロプロテアーゼが得られる。
本発明の一実施態様において、本発明の中性メタロプロテアーゼは以下の性質を有する中性メタロプロテアーゼＳＶＰ３５である：
１）分子量：約３５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
２）至適ｐＨ：６．０〜８．０、より具体的には６．５〜７．５、特に７．０付近
３）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１０
４）至適温度：約４５℃
５）温度安定性：約５０℃以下で安定
６）阻害剤：メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
また、本発明の別の実施態様において、本発明の中性メタロプロテアーゼは以下の性質を有する中性メタロプロテアーゼＳＶＰ７０である：
１）分子量：約７１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
２）至適ｐＨ：６．０〜８．０の範囲、より具体的には６．５〜７．５、特に７．０付近
３）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０
４）至適温度：５０℃〜５５℃の範囲、特に５５℃付近
５）阻害剤：メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、ＳＨ−還元剤であるジチオスレイトール、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
ＳＶＰ３５及びＳＶＰ７０は、いずれもプロＭＴＧに作用させた場合、ＭＴＧのプロ構造部の選択的切断活性が高い。すなわち、いずれの酵素もプロＭＴＧを活性型のＭＴＧに効率よく変換させるが、生成した活性型ＭＴＧ本体を分解する活性は低いという特徴があるので、どちらもプロＭＴＧを原料として活性型ＭＴＧを製造するのに好適な酵素である。一方これら新規な２種の中性メタロプロテアーゼのＮ末端アミノ酸配列は、ＳＶＰ３５については配列表配列番号１に、ＳＶＰ７０については配列表配列番号２に示してあり、両者には相同性がある。従って、これらプロテアーゼとＮ末端アミノ酸配列に相同性を有するものを検索したところ、ストレプトマイセス・グリセウス由来のメタロプロテアーゼＳＧＭＰ ＩＩ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０巻、３３９〜３４４ページ、１９９１年）、並びに、ストレプトマイセス・セリカラー由来の３種のメタロプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＣＡＢ７６０００、同ＣＡＢ７６００１、同ＣＡＢ６９７６２）等が見出された。これらのプロテアーゼも、ＳＶＰ３５及びＳＶＰ７０と同様に、プロＭＴＧのプロ構造部の選択的切断に使用することができ、プロＭＴＧを原料として活性型ＭＴＧを製造するために用いることができる。
次に、組み換えＤＮＡ技術によって本発明の中性メタロプロテアーゼを製造する方法について説明する。
組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られている。組み換えＤＮＡ技術を用いることの利点は、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できることである。
組み換えＤＮＡ技術を利用して本発明の中性メタロプロテアーゼを製造するためには、まず、プロモーター、適切なシグナルペプチドをコードする配列および本発明の中性メタロプロテアーゼをコードする核酸断片、およびコリネ型細菌中で中性メタロプロテアーゼ遺伝子を発現させるために必要な制御配列（オペレーターやターミネーター等）、をそれらが機能し得るように適切な位置に有する遺伝子構築物を作製する。本発明の中性メタロプロテアーゼは、Ｎ末端にプロ構造部を有していてもよい。この構築物作製のために使用できるベクターは特に制限されず、宿主微生物、好ましくはコリネ型細菌中で機能し得るものであればよく、例えば、プラスミドのように染色体外で自立増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってもよい。宿主としてコリネ型細菌を使用する場合、コリネ型細菌由来のプラスミドはベクターとして特に好ましい。これらには、例えばｐＨＭ１５１９（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４））、ｐＡＭ３３０（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４））、およびこれらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドが含まれる。
本発明において宿主菌として使用できるコリネ型細菌としては、Ｌ−グルタミン酸生産菌に代表されるブレビバクテリウム・サッカロリティクムＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・インマリオフィルムＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１５９９０、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）ＡＴＣＣ６８７１等の野生株またはその変異株より誘導される変異株である。
本発明において使用される変異株としては、例えばグルタミン酸生産性を失った変異株、更にはリジン等のアミノ酸生産変異株、イノシン等の核酸のような他の物質を生産する変異株も含まれる。このような変異株は、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン等の化学変異剤による処理を行なった後、タンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜することにより得ることができる。
とりわけ、野生株コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９よりストレプトマイシン（Ｓｍ）耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３４）（昭和５９年３月２６日原寄託）（現、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国つくば市東１−１−１ 中央第６、郵便番号３０５−８５６６）はその親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、異種タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２〜３倍と極めて高く、宿主菌として好適である（ＷＯ ０２／０８１６９４参照）。さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。
コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質のＰＳ１、ＰＳ２、ＳｌｐＡの遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系、例えばグルタミン酸合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
本発明で使用するシグナルペプチドは、宿主であるコリネ型細菌の分泌性タンパク質のシグナルペプチドであり、好ましくは、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドである。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に由来するＰＳ１及びＰＳ２（特表平６−５０２５４８）、及びコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）に由来するＳｌｐＡ（特開平１０−１０８６７５）が挙げられる。
組み換えＤＮＡ技術を利用してプロＭＴＧのプロ構造部の選択的切断活性が強い中性メタロプロテアーゼを製造するためには、当該中性メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡが必要である。
本発明の一実施態様において、組み換えＤＮＡ技術を利用して中性メタロプロテアーゼＳＶＰ３５が製造される。ＳＶＰ３５をコードするＤＮＡは、下記のようにして取得することができる。
はじめに、精製されたＳＶＰ３５のアミノ酸配列を決定する。エドマン法（Ｅｄｍａｎ，Ｐ．，Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．４，２２７（１９５０））を用いてアミノ酸配列を決定することができる。また島津製作所社製等の気相プロテインシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。
本発明の中性メタロプロテアーゼＳＶＰ３５について、Ｎ末端から２０残基のアミノ酸配列を決定したところ、配列表配列番号１に示される配列が明らかとなった。
この配列情報を利用して適切なＰＣＲ用プライマーを合成し、本発明の中性メタロプレテアーゼを得るためのプローブを作製することができる。例えば、Ｎ末端アミノ酸配列の相同性検索結果から相同性を有することが予想される放線菌由来のプロテアーゼ遺伝子、例えば、ストレプトマイセス・セリカラー由来のメタロプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＣＡＢ７６００１）遺伝子、を斉藤、三浦の方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］により調製した放線菌ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、このプロテアーゼをコードする遺伝子の断片を増幅することができる。得られた増幅断片はプローブとして使用することができる。
次に斉藤、三浦の方法により調製した放線菌由来のＤＮＡ、例えばＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡを、適当な種々の制限酵素、例えば６塩基配列を認識する種々の制限酵素で消化する。上記ＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物の３２Ｐ−ラベル化物をプローブとして、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ９．３１（１９８９）］に記載されたサザンブロットハイブリダイゼーション法等の当業者に知られた方法により、消化した放線菌染色体ＤＮＡを解析することができる。例えばサザンブロットにより、用いたプローブと高い相同性を有することが確認された断片を回収し、適切なベクター中にクローニングすることにより、本発明の中性メタロプロテアーゼをコードする核酸分子またはその一部をクローニングすることができる。このような遺伝子クローニングに必要な技法は当業者にはよく知られたものである（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ１．９０（１９８９）］参照）。
本発明の一実施態様においては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、プローブが作製される。更に、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９染色体ＤＮＡのＳｐｈ Ｉ消化物中に、３２Ｐラベルしたプローブとハイブリダイズする約８ｋｂの単一バンドが検出される。そこで、先の方法により調製したＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡをＳｐｈ Ｉで消化し、約８ｋｂの断片をアガローズゲル電気泳動により回収し、この回収断片をｐＵＣ１８のＳｐｈ Ｉ部位に挿入した後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９のコンピテントセルに導入し、ライブラリーが作製される。作製したライブラリーに対して、合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（既出）記載のコロニーハイブリダイゼーション法に従ってスクリーニングを行い、ＳＶＰ３５の遺伝子断片がクローン化されたプラスミドを保持する菌株を選択することにより目的のクローンが得られる。この菌株より回収したプラスミドはｐＶＳＶ１と名付けられている。ｐＶＳＶ１にクローン化されている断片のヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の一次配列を推定することにより、先に決定したＮ末端部分アミノ酸配列をコードしていることが確認される。これによって、得られた遺伝子がＳＶＰ３５をコードする遺伝子であることが確認される。
次に、得られたメタロプロテアーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子構築物を、使用する宿主の性質に応じて適切なベクターと結合させて、本発明の中性メタロプロテアーゼを発現させるための組換え核酸分子を構築することができる。この組換え核酸分子で宿主であるコリネ型細菌細胞を形質転換する。形質転換された細胞を適切な培地中で培養し、培地中及び／又は細胞中に分泌又は蓄積された本発明の中性メタロプロテアーゼを回収することができる。
次に、中性メタロプロテアーゼを用いてプロＭＴＧから活性型ＭＴＧを製造する方法について述べる。
活性型ＭＴＧ製造に用いる中性メタロプロテアーゼは、中性メタロプロテアーゼ生産菌の培養液から調製される中性メタロプロテアーゼ含有画分としてプロＭＴＧに作用させることができる。又、さらに高度に精製された比活性の高い中性メタロプロテアーゼとして用いることもできる。さらに、後述するように、プロＭＴＧのプロ構造部の選択的切断活性が強い中性メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡとベクターとを連結して得られる組換え核酸分子によって形質転換された細胞を培養することによって得られる中性メタロプロテアーゼを用いることもできる。
ＭＴＧ製造に用いるプロＭＴＧは、プロＭＴＧ生産菌の培養液から調製されるプロＭＴＧ含有画分であってもよい。また、さらに高度に精製されたプロＭＴＧを用いてもよい。反応条件は、プロＭＴＧに対し中性メタロプロテアーゼの添加量を質量にして１／１０から１／５００とし、反応温度１５℃から５０℃、ｐＨをｐＨ５．０から９の適当な範囲に調整して行うことができる。
また、前述したように構築した本発明の中性メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子構築物と、プロＭＴＧをコードする遺伝子構築物を有する微生物、特に、コリネ型細菌に導入し、プロＭＴＧと本発明のメタロプロテアーゼを一菌体によって産生させ、上記条件下でプロＭＴＧを成熟ＭＴＧに変換することもできる。プロＭＴＧをコリネ型細菌で効率よく生産させるためのより詳細な方法、その方法に使用する遺伝子構築物、そのような遺伝子構築物が導入されたコリネ型細菌は、例えばＷＯ ０１／２３５９１に明らかにされている。より具体的には、例えば、コリネ型細菌由来のシグナルペプチド領域、特に細胞表層タンパク質のシグナルペプチド領域をコードする配列の下流にプロＭＴＧをコードする配列を適切なプロモーターの下流に結合して得られる遺伝子構築物をコリネ型細菌に導入して、プロＭＴＧタンパク質を菌体外に効率よく分泌し得るコリネ型細菌を得ることができる。この目的に使用し得るシグナルペプチド、プロモーターおよび宿主は本発明のメタロプロテアーゼを発現させるために適した上述のシグナルペプチド、プロモーターおよび宿主から選ぶことができる。また、同一菌体内で共存可能なベクターの組み合わせも当業者にはよく知られている。従って、プロＭＴＧを産生するコリネ型細菌に上述した本発明の中性メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡを含む適切な遺伝子発現構築物を導入する、あるいは逆に、本発明の中性メタロプロテアーゼを産生するコリネ型細菌にプロＭＴＧをコードする適切な遺伝子発現構築物を導入することにより、同一菌体内にプロＭＴＧおよび本発明の中性メタロプロテアーゼを発現させ得る遺伝子構築物を共存させ、その菌を培養し、上述したような、本発明の中性メタロプロテアーゼが活性を有するような適切な条件に置くことによって成熟ＭＴＧを得ることができる。
本発明の方法により製造されたトランスグルタミナーゼは、当業者によく知られた方法に従って反応液から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。尚、本発明は実施例の記載に限定されない。
【実施例】
実施例１．ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９が生産する中性メタロプロテアーゼ
（１）ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９の生産する中性メタロプロテアーゼ（ＳＶＰ７０）の精製
ＩＳＰ２液体培地（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ４ｇ、Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ、Ｇｌｕｃｏｓｅ ４ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．３に調整）を５Ｌ坂口フラスコに８００ｍＬ張り込み、Ｓｔｐｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９株をプレートより植菌して３０℃にて９日間、１２０ｒｐｍで振盪培養した。培養液を遠心分離し、培養上清を回収した。デプスフィルター（ポアサイズ３μｍ、ザルトリウス社製）を用いて濾過後、ポアサイズ１０，０００Ｄａのザルトコンスライスメンブラン（ザルトリウス社製）を用いて濃縮を行った。濃縮液を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／５ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ７．５）で１０倍に希釈し、ＦＰＬＣ（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース ＦＦ（２．６φ×１０ｃｍ，Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のカラムに通し、塩化ナトリウム０−０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出した。活性成分を含有する画分を回収し、１．５Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液／５ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ６．０）で平衡化したフェニルセファロースＨＰ（１．６φ×１０ｃｍ，Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のカラムに通し、硫酸アンモニウム１．５−０Ｍの直線濃度勾配で溶出して活性画分を回収した。得られた活性画分を２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液／５ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ６．０）に対して一晩、４℃で透析して、精製酵素液を得た。
各段階での酵素活性の測定は以下のように行った。
ペプチドＧＰＳＦＲＡＰＤＳ（ペプチド研究所製）（配列番号１１）を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に酵素溶液を加え、総液量１７０μｌで３０℃、１０分間反応させた後、９５℃で５分間加熱して反応を停止させた。このうち８０μｌを以下の条件でＨＰＬＣ分析し、基質の減少量に基づいて活性を算出した。
装置：日立株式会社製 ＨＰＬＣ Ｌ−６３００ システム
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ １２０Ａ ４．６×１５０ｍｍ （ワイエムシィ）
溶離液：（Ａ）０．１％ ＴＦＡ （Ｂ）８０％アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡ
溶出条件：アセトニトリル１２−１６％直線濃度勾配（１５分間）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２２０ｎｍ
この条件において、ペプチドＧＰＳＦＲＡＰＤＳは、リテンションタイム１３〜１４分に、分解物ＦＲＡＰＤＳはリテンションタイム７．５〜８．５分に溶出した。
酵素活性の単位として１分間に１ｎｍｏｌのプロＭＴＧ分解を触媒する酵素量を１Ｕと定義した。
（２）ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９の生産する中性メタロプロテアーゼ（ＳＶＰ３５）の精製
ＩＳＰ２液体培地を５Ｌ坂口フラスコに８００ｍＬ張り込み、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９株をプレートより植菌して３０℃にて４８時間、１２０ｒｐｍで振盪培養した。培養液を遠心分離し、培養上清を除いて菌体を回収した。菌体を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／３０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）に懸濁し、氷上で４時間振盪後、遠心分離により上清を回収した。得られた上清をデプスフィルター（ポアサイズ０．２２μｍ、ザルトリウス社製）で濾過滅菌後、ＦＰＬＣ（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のカラム（１．６φ×１０ｃｍ）に通し、同緩衝液中、塩化ナトリウム０−０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出した。活性成分を含有する画分を回収し、さらに１．５Ｍ硫酸アンモニウム、５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（１ｍＬ Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に通し、硫酸アンモニウム１．５−０Ｍの直線濃度勾配で溶出した。活性画分を回収し、ＰＤ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて、５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で脱塩して、部分精製酵素液を得た。
各段階での酵素活性は（１）と同様に、ペプチドＧＰＳＦＲＡＰＤＳを基質として用いて測定した。
（３）ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９の生産する中性メタロプロテアーゼ（ＳＶＰ３５）の特性評価
ｉ）基質特異性
５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて１ｍｇ／ｍｌに調製したインスリンＢ溶液およびプロＭＴＧ溶液を基質とし、酵素溶液を添加して３０℃、２時間反応させた後、以下の条件のＨＰＬＣにてペプチド断片を分取した。
装置：Ｌ−７１００／７２００／７４０５／Ｄ−７６００（日立）
カラム ：ＶＹＤＡＣ Ｃ１８ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ＶＹＤＡＣ）
溶離液：（Ａ）０．１％ ＴＦＡ（Ｂ）８０％アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡ
溶出条件：アセトニトリル４−４４％直線濃度勾配
流速 ：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：ＵＶ ２２０ｎｍ
得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＰＰＳＱ−１０（島津製作所）にて分析し、ＳＶＰ３５による切断点の配列を解析した。その結果、特にＰｈｅ、しばしばＬｅｕ、時々Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｖａｌの前（Ｎ末端側）にて切断されており、ＳＶＰは切断部位のＰ’１位に位置する芳香族アミノ酸および巨大側鎖の疎水アミノ酸を認識していることが明らかとなった。
ｉｉ）至適ｐＨ
ｐＨ３から１０までの０．１５Ｍ ＧＴＡ緩衝液（３，３−ジメチルグルタル酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールによる緩衝液）中で、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒを基質として３０℃にて１０分間ＳＶＰ３５を作用させた。その結果、ＳＶＰ３５の至適ｐＨは７．０付近であり、ｐＨ７．０の活性を１００％とすると、ｐＨ６．０〜８．０の範囲で７０％以上、ｐＨ６．５〜７．５の範囲で８０％以上の活性を有することが明らかになった（図１）。
ｉｉｉ）ｐＨ安定性
ｐＨ３から１０までの０．１５Ｍ ＧＴＡ緩衝液にＳＶＰ３５精製酵素溶液１０μｌに各ｐＨの緩衝液を４０μｌ加え、４℃で一晩放置した後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で液量を４００μｌに合わせ、ｐＨを７．０に調整した。この酵素溶液にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒを基質として添加し、ｐＨ７．０、３０℃で１０分間反応させた。その結果、ＳＶＰ３５はｐＨ４〜１０の範囲で安定（ｐＨ４．０における活性を１００％とすると、ｐＨ４〜１０において９０％以上の活性を有する）であることが示された（図２）。
ｉｖ）至適温度
５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈した精製酵素溶液にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒを加えてｐＨ７．０、５℃から６５℃にて１０分間反応させた。その結果、ＳＶＰ３５の至適温度は約４５℃であり、４０℃〜５０℃の範囲で高い活性を有する（４５℃における活性の８０％以上の活性を有する）ことが示された（図３）。
ｖ）温度安定性
精製酵素液１０μｌに５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を４０μｌ加え、４℃または３０℃から７０℃にて１５分間処理した後、氷冷し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を２５０μｌ添加した。この酵素溶液にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｐを基質として添加し、３０℃で５分間反応させた。４℃で処理した場合の活性を１００％として各温度における残存活性を算出した。その結果、ＳＶＰ３５は５０℃では８０％の活性を保っているが、６０℃で失活することが示された（図４）。
ｖｉ）阻害剤
各種化合物を第５図に示した濃度で含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に精製酵素溶液を加え、室温で６０分間放置した。その後基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒを加えて３０℃で１０分間反応させた。化合物無添加の場合のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ切断活性を１００％として、各種化合物を添加した場合の相対活性を算出した。その結果、メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）によってＳＶＰ３５は強い阻害作用を受けた（図５）。
（４）ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９の生産する中性メタロプロテアーゼ（ＳＶＰ７０）の特性評価
ｉ）基質特異性
（３）−ｉ）と同様にして基質特異性を調べた。
その結果、基質は特にＰｈｅ、しばしばＬｅｕ、時々Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｖａｌの前（Ｎ末端側）にて切断されており、ＳＶＰ７０は切断部位のＰ’１位に位置する芳香族アミノ酸および巨大側鎖の疎水アミノ酸を認識していることが明らかとなった。
ｉｉ）至適ｐＨ
（３）−ｉｉ）と同様にしてＳＶＰ７０の至適ｐＨを調べた。その結果、ＳＶＰ７０の至適ｐＨは７．０付近であり、ｐＨ７．０における活性を１００％としてｐＨ６．０〜８．０においてで９０％以上、ｐＨ６．５〜７．５の範囲で９５％以上の活性を有することがことが明らかになった（図１）。
ｉｉｉ）ｐＨ安定性
（３）−ｉｉｉ）と同様にしてｐＨ安定性を調べた。その結果、ＳＶＰ７０はｐＨ５〜１０の範囲で安定であるが、ＳＶＰ３５に比べてややアルカリ側で安定性が弱いことが示された（図２）。具体的には、ｐＨ５における活性を１００％とすると、ｐＨ５〜７の範囲で９０％以上の活性を有し、ｐＨ７〜１０の範囲でも約８０％以上の活性を有することが示された。
ｉｖ）至適温度
（３）−ｉｖ）と同様にしてＳＶＰ７０の至適温度を調べた。その結果、ＳＶＰ７０の至適温度は約５０〜５５℃の範囲、特に５５℃付近にあることが示された（図３）。
ｖ）阻害剤
（３）−ｖ）と同様にして、種々の化合物のＳＶＰ７０に対する阻害活性を調べた。
その結果、ＳＶＰ７０は、メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、還元剤ジチオスレイトール、尿素および放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）によって強い阻害作用を受けた（図５）。
（５）ＳＶＰ３５、ＳＶＰ７０のＮ末端アミノ酸配列解析
（１）、（２）で得たＳＶＰ３５、ＳＶＰ７０の精製酵素をメンブランカートリッジ（パーキンエルマー社製）を用いてポリビニリデン−ジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写し、気相プロテインシークエンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所製）にてＮ末端アミノ酸配列を解析した。ＳＶＰ３５のアミノ酸配列を配列表配列番号１に、ＳＶＰ７０のアミノ酸配列を配列表配列番号２に示した。これらには相同性が認められる。
そこで、これらプロテアーゼとＮ末端アミノ酸配列に相同性を有するものを放線菌から検索したところ、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｐｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のメタロプロテアーゼＳＧＭＰ ＩＩ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０巻、３３９〜３４４ページ、１９９１年）、および、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来の３種のメタロプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＣＡＢ７６０００、同ＣＡＢ７６００１、同ＣＡＢ６９７６２）等が見出された。これらのプロテアーゼも、プロＭＴＧのプロ構造部を選択的に切断するために使用することができ、従って、本発明による活性型ＭＴＧの製造に用いることができる。
（６）ＳＶＰ３５遺伝子のクローン化とコリネ型細菌での分泌発現
斉藤、三浦の方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］によりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）の染色体ＤＮＡを調製した。Ｎ末端アミノ酸配列に相同性を有するストレプトマイセス・セリカラー由来のメタロプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＣＡＢ７６００１）遺伝子の配列を参考にして、配列番号３と配列番号４に示したプライマーを合成した。前述の、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３と配列番号４に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、メタロプロテアーゼ遺伝子中の遺伝子領域を増幅した。ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このＰＣＲ産物の３２Ｐ−ラベル化物をプローブとして、斉藤、三浦の方法により調製したＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡを６塩基配列を認識する種々の制限酵素で消化した試料を用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ９．３１（１９８９）］記載のサザンブロットハイブリダイゼーション法により解析したところ、ＳｐｈＩ切断により約８ｋｂの単一バンドが検出された。
そこで、先の方法により調製したＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡをＳｐｈＩで消化し、約８ｋｂの断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲル電気泳動により回収した。回収断片をｐＵＣ１８のＳｐｈＩ部位に挿入した後、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）のコンピテントセルに導入し、ライブラリーを作製した。作製したライブラリーに対して、合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ１．９０（１９８９）］記載のコロニーハイブリダイゼーション法により、ＳＶＰ３５の遺伝子断片がクローン化されたプラスミドを保持する菌株をスクリーニングした。
得られた菌株より回収したプラスミドをｐＶＳＶ１と名付けた。ｐＶＳＶ１にクローン化されている断片のヌクレオチド配列を決定した。このクローン化断片のヌクレオチド配列を配列番号５に示した。この遺伝子にコードされるアミノ酸の一次配列を推定したところ、先に決定したＮ末端部分アミノ酸配列を含む、ＳＶＰ３５のシグナル配列およびプロ構造と想定される領域を含む全アミノ酸の一次配列を決定した。ＳＶＰ３５の全アミノ酸配列を配列番号６に示した。配列番号６に記載のアミノ酸配列の１〜３６番アミノ酸までがシグナル配列であり、アミノ酸番号３７〜２１６がプロ構造部であり、アミノ酸２１７〜５３７番が成熟型ＳＶＰ３５と推定される。
配列番号５の配列を参考にして、ｐＶＳＶ１を鋳型として、配列番号７と配列番号８に示したプライマーを合成し、ＳＶＰ３５のプロ構造部分および成熟ＳＶＰ３５を含む遺伝子領域をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
次に、ＷＯ ０１／２３５９１に記載のｐＰＫＳＰＴＧ１を鋳型として、配列番号９と配列番号１０のオリゴヌクレオチドの組み合わせにより、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質であるＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡのシグナル配列とを含む領域をＰＣＲ法にて増幅した。配列番号１０に示したプライマーはプロ構造付きＳＶＰ３５のＮ末端側のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。
次に、それぞれ増幅させたＰＣＲ反応液各１μｌを混ぜて鋳型とし、配列表配列番号８と配列表配列番号９を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、ＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡのシグナル配列に接続された異種融合プレプロＳＶＰ３５遺伝子断片を増幅させた。
アガロースゲル電気泳動により、約２．３ｋｂの増幅断片を検出した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、約２．３ｋｂの断片を回収し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造製）を用い末端を平滑化後、特開平９−０７０２９１記載のｐＣＶ７のＳｍａＩ部位に挿入することによって、ｐＶＳＶ１を得た。定法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
構築したプラスミドｐＶＳＶ１を用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＴＣ１３８６９を形質転換し、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｓ（酵母エキストラクト１０ｇ、トリプトン１０ｇ、シュークロース５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天１５ｇ、水で１Ｌにする）寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選択したｐＶＳＶ１を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＴＣ１３８６９を、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＭＭＴＧ液体培地（グルコース６０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．４ｇ、硫酸アンモニウム３０ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸鉄七水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン五水和物０．０１ｇ、チアミン塩酸塩４５０μｇ、ビオチン４５０μｇ、ＤＬ−メチオニン０．１５ｇ、炭酸カルシウム５０ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．５に調整）で３０℃、３０時間培養した。この培養液１ｍｌを遠心分離により培養上清と菌体に分離した。培養上清には、ＳＶＰ３５の活性が検出され、Ｌａｅｍｍｌｉの方法によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））電気泳動の結果、約２００ｍｇ／ＬのＳＶＰ３５が分泌発現していることが確認された。
実施例２．ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９の生産するトランスグルタミナーゼ前駆体（プロＭＴＧ）の活性型への変換
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにて発現させたプロＭＴＧ（１ｍｇ／ｍｌ）を精製した基質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ由来中性プロテアーゼ（ＳＶＰ３５，ＳＶＰ７０）または放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来中性メタロプロテアーゼＳＧＭＰ ＩＩと基質：酵素＝２００：１の割合で混合し、３０℃で反応させた。経時的に０，１，２，４，７，２０時間後に反応混合物を分取し、一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合して９５℃、３分間加熱した後Ｌａｅｍｍｌｉの方法によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））に供した。その結果を第６図に示す。第６図から分かるように、これらのプロテアーゼを反応させるとプロＭＴＧは成熟型に変換され、長時間反応させた後も生成したＭＴＧは減少しなかった。また、分取した画分のトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）活性をハイドロキサメート法にて測定したところ、十分な活性が確認された。なお、ＳＧＭＰ ＩＩは、アクチナーゼ（科研製薬製）かから文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０巻、３３９〜３４４ページ、１９９１年）の方法に従って精製した。
次に、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ由来中性プロテアーゼＳＶＰ７０、および、対照としてセリンプロテアーゼＳＡＭ−Ｐ４５（放線菌Ｓｔ．ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ由来）を、酵素添加量を増加させてプロＭＴＧに添加し、３０℃、ｐＨ７．０にて反応させた。経時的に１，４，７，２４時間後に分取し、ＴＧ活性をハイドロキサメート法により測定した（第７図）。また、ＴＧのタンパク質濃度を逆相ＨＰＬＣにて測定した（第８図）。その結果、ＳＶＰは基質に対して１／５００という少量でプロＭＴＧを効率よく活性型ＭＴＧに変換できることが示された。ＳＡＭ−Ｐ４５は基質に対して１／５０量でもトランスグルタミナーゼ活性が上がりきらず、活性型への完全な変換はされないことが示された。一方、ＳＡＭ−Ｐ４５を基質に対して１／１０量添加した場合、活性型ＭＴＧへの変換が見られたが、続いてＭＴＧタンパク量の減少および活性の低下が見られた。このことは、ＳＡＭ−Ｐ４５による成熟ＭＴＧの過分解が起こっていることを示唆する。
本発明により、放線菌ストレプトバーチシリウム・モバラエンスより、トランスグルタミナーゼ前駆体のプロ構造部分を特異的に切断し、活性化する新規プロテアーゼ、およびその遺伝子が提供される。また、本発明の新規プロテアーゼはコリネ型細菌で大量発現させることができるため、これにより、微生物由来トランスグルタミナーゼを効率よく製造する方法が提供される。
本発明の放線菌由来中性メタロプロテアーゼを活性型ＭＴＧ製造に用いる利点は、プロＭＴＧのプロ構造部の選択的切断活性が強いとともに、コリネ型細菌でこれら酵素を発現分泌させることができる点である。
放線菌由来のプロＭＴＧはコリネ型細菌で効率よく発現させ分泌させ得ることが分かっているので、コリネ型細菌にプロＭＴＧと中性メタロプロテアーゼを共発現および分泌させることより、一菌体でのさらに効率的な活性型ＭＴＧの製造が可能となる。ここで、中性メタロプロテアーゼはプロＭＴＧのプロ構造部切断に必要十分な量を発現させるだけで良い。
参考文献
１．特公平１−５０３８２号公報
２．特開昭６４−２７４７１号公報
３．国際公開第０１／２３５９１号パンフレット
４．特表平６−５０２５４８号公報
５．特開平１０−１０８６７５号公報
６．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５７巻、５７０−５７６頁、１９９８年
７．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０巻、３３９〜３４４頁、１９９１年
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
発明の技術分野
本発明は、放線菌により生産されるプロトランスグルタミナーゼのプロ構造部を効率的に切断し、活性型トランスグルタミナーゼに変換する新規プロテアーゼ、およびそれをコードする核酸分子に関する。
また本発明は、前記プロテアーゼを用いて、活性型微生物由来トランスグルタミナーゼを製造する方法に関する。
さらに本発明は、前記中性メタロプロテアーゼの製造法に関するものである。
【背景技術】
トランスグルタミナーゼはタンパク質のペプチド鎖内にあるγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素である。本酵素をタンパク質に作用させると、ε−（γ−Ｇｌｕ）−Ｌｙｓ架橋形成反応、Ｇｌｎの脱アミド化によるＧｌｕ残基への変換反応が起こりうる。このトランスグルタミナーゼは、ゼリー等のゲル化食品、ヨーグルト、チーズ、或いはゲル状化粧品などの製造や食肉の肉質改善等に利用されている（特公平１−５０３８２）。また、熱に安定なマイクロカプセルの素材、固定化酵素の担体などの製造に利用されているなど、産業上利用性の高い酵素である。
トランスグルタミナーゼには、活性発現がカルシウム依存性の動物由来トランスグルタミナーゼおよびカルシウム非依存性の微生物由来トランスグルタミナーゼ（マイクロバイアルトランスグルタミナーゼ：以下「ＭＴＧ」という）が知られている。ＭＴＧとしては、これまでにストレプトバーチシリウム属（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌から発見されたものが知られている。そのようなストレプトバーチシリウム属としては、例えば、ストレプトバーチシリウム・グリセオカルニウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ）ＩＦＯ １２７７６、ストレプトバーチシリウム・シナモニウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ ｓｕｂ ｓｐ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）ＩＦＯ １２８５２、ストレプトバーチシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ、以後、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅと略すことがある）ＩＦＯ １３８１９等が挙げられている（特開昭６４−２７４７１）。
しかしこれらは、上記菌類等の培養物から精製作業を経て製造されていたため、供給量、効率等の点で問題があった。そこで、異種タンパク質を効率よく分泌する方法として、宿主にコリネ型細菌を選択し、コリネ型細菌由来のシグナルペプチドの下流にトランスグルタミナーゼが接続された融合タンパク質を産生させ、これを菌体外に効率よく分泌させ、高収量のトランスグルタミナーゼを得る方法が確立された（ＷＯ ０１／２３５９１）。そこでは、ＭＴＧにプロ構造部の付加した不活性型のプロトランスグルタミナーゼ（以下、「プロＭＴＧ」という）の形態で分泌させ、分泌後プロテアーゼによってプロＭＴＧのプロ構造部を切断させ活性を有するトランスグルタミナーゼに変換する方法、および、放線菌由来のセリンプロテアーゼであるＳＡＭ−Ｐ４５を、プロＭＴＧを生産するコリネ型細菌に必要十分量共発現させることによって、培養液中に直接活性型のトランスグルタミナーゼを生成させる方法が示されている。
ところで、コリネ型細菌にプロＭＴＧと、そのプロ構造部を切断させるプロテアーゼとを共発現させて培養液に直接、活性型のトランスグルタミナーゼを生成させる方法は、きわめて効率の良いトランスグルタミナーゼ製造方法になると想定されるが、ＳＡＭ−Ｐ４５はその基質特異性が厳格ではなく、プロＭＴＧのプロ構造部のみならず、トランスグルタミナーゼ本体をある程度消化分解する場合もあるため、その取り扱いは必ずしも簡便とは言えない。したがって、ＳＡＭ−Ｐ４５を使用する場合には、培養液中に生成したトランスグルタミーゼの分解を起こさせないよう、トランスグルタミーゼ製造の工程管理を厳密に行う必要がある。
従って、活性型トランスグルタミナーゼを有利に行うために、プロＭＴＧのプロ構造部のみを選択的に分解し、かつトランスグルタミナーゼ本体の過分解をできるだけ起こさないプロテアーゼに対する需要がなお存在していた。
プロＭＴＧのプロ構造部を切断する酵素としては、ＳＡＭ−Ｐ４５以外には、バチラス・ポリミキサ由来のディスパーゼが知られている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５７巻、５７０−５７６頁（１９９８年））。しかしながら、プロ構造部の切断に大量の酵素が必要であり、トランスグルタミナーゼ本体の過分解の恐れがある。また、ディスパーゼは細胞培養用の試薬であり、産業用酵素としては高価である。
【発明の開示】
上述のように、活性型トランスグルタミナーゼ製造を有利に行うために、プロＭＴＧのプロ構造部のみを選択的に分解し、かつトランスグルタミナーゼ本体の過分解をできるだけ起こさないプロテアーゼがなお望まれていた。また、もしプロＭＴＧのプロ構造部のみを選択的に分解し、かつトランスグルタミナーゼ本体の過分解をできるだけ起こさないプロテアーゼを利用できれば、活性型トランスグルタミナーゼの製造に有利であると考えられた。さらに、プロＭＴＧのプロ構造部を選択的に分解する、トランスグルタミナーゼ製造に有用なプロテアーゼは、コリネ型細菌を用いて、容易に菌体外へ分泌できるものであれば、プロＭＴＧとともに共発現させることによって培養液に直接、活性型のトランスグルタミナーゼを生成させることができるので、より好ましいと考えられた。
従って、本発明の目的は、プロＭＴＧのプロ構造部を選択的に切断する、トランスグルタミナーゼ製造に有用なプロテアーゼを提供することである。
特に、本発明の目的は、プロＭＴＧのプロ構造部を選択的に切断するプロテアーゼであって、コリネ型細菌を宿主として生産することができ、かつ容易に菌体外へ分泌できるプロテアーゼを提供することである。
また、本発明の目的は、前記プロテアーゼをコードする核酸分子を提供することでもある。
本発明の更なる目的は、前記プロテアーゼを用いて、ＭＴＧを効率的に製造する方法を提供することである。
さらに本発明は、前記プロテアーゼを製造する方法を提供することである。
本発明者らは、プロＭＴＧのプロ構造部分を選択的に分解するがトランスグルタミナーゼ自体の分解をできるだけ起こさないプロテアーゼの探索を行い、放線菌から、そのような性質を有する中性メタロプロテアーゼを単離精製することができた。本発明者らは、前記プロテアーゼをコードするＤＮＡも取得し、これをコリネ型細菌に組み込み、コリネ型細菌を宿主とした分泌発現に成功した。さらに実際に本酵素をプロＭＴＧに作用させ、プロ構造部を切断させ、活性型トランスグルタミナーゼを回収することができた。また、同等の機能を有する他起源の微生物由来中性メタロプロテアーゼを見出し、同様に活性型ＭＴＧの製造に有用であることも明らかにし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は放線菌由来の、プロＭＴＧプロ構造部の切断選択性が高い中性メタロプロテアーゼ、および、これらをコードする核酸分子である。
また本発明は、中性メタロプロテアーゼによりプロＭＴＧのプロ構造部分を切断することを特徴とする、活性型ＭＴＧの製造方法である。
また、本発明は上記中性メタロプロテアーゼをコードする核酸分子をコリネ型細菌に導入し、前記核酸分子が導入されたコリネ型細菌を培養し、それによって上記中性メタロプロテアーゼを発現させ、菌体外に分泌された上記メタロプロテアーゼを回収することを特徴とする、上記メタロプロテアーゼ製造方法でもある。
より具体的には、本発明は、以下の性質を有する放線菌由来の中性メタロプロテアーゼＳＶＰ３５である：
１）分子量：約３５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
２）至適ｐＨ：６．０〜８．０、より具体的には６．５〜７．５、特に７．０付近
３）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１０
４）至適温度：約４５℃
５）温度安定性：約５０℃以下で安定
６）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
また、本発明は、以下の性質を有する放線菌由来の中性メタロプロテアーゼＳＶＰ７０である：
１）分子量：約７１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
２）至適ｐＨ：６．０〜８．０の範囲、より具体的には６．５〜７．５、特に７．０付近
３）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０
４）至適温度：５０℃〜５５℃の範囲、特に５５℃付近
５）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、ＳＨ−還元剤であるジチオスレイトール、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
また、本発明は上記ＳＶＰ３５またはＳＶＰ７０をコードする核酸分子である。
また、本発明は、上記ＳＶＰ３５またはＳＶＰ７０によりプロＭＴＧのプロ構造部分を切断することを特徴とする、活性型ＭＴＧの製造方法である。
さらに、本発明は上記ＳＶＰ３５またはＳＶＰ７０をコードする核酸分子をコリネ型細菌に導入し、前記核酸分子が導入されたコリネ型細菌を培養し、菌体外に分泌されたＳＶＰ３５またはＳＶＰ７０を回収することを特徴とする、ＳＶＰ３５またはＳＶＰ７０の製造方法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＳＶＰ３５およびＳＶＰ７０の活性のｐＨ依存性を表したグラフである。
図２は、ＳＶＰ３５およびＳＶＰ７０のｐＨ安定性を表したグラフである。
図３は、ＳＶＰ３５およびＳＶＰ７０の活性の温度依存性を表したグラフである。
図４は、ＳＶＰ３５の温度安定性を表したグラフである。
図５は、ＳＶＰ３５およびＳＶＰ７０の活性に対する種々の化合物の阻害活性を表す。
図６は、ＳＶＰ３５およびＳＶＰ７０による、プロＭＴＧの活性型ＭＴＧへの変換の経時変化をタンパク質量の変化としてそれぞれ表した図である。
図７は、ＳＶＰ７０およびＳＡＭ−Ｐ４５をプロＭＴＧに作用させた場合の、トランスグルタミナーゼ活性の経時変化を表したグラフである。（Ａ）：ＳＶＰ７０添加、●：基質に対して１／２００量を添加、■：基質に対して１／５００量を添加；（Ｂ）：ＳＡＭ−Ｐ４５添加、●：基質に対して１／１０量を添加、■：基質に対して１／５０量を添加。
図８は、ＳＶＰ７０およびＳＡＭ−Ｐ４５をプロＭＴＧに作用させた場合の、ＭＴＧタンパク質量の経時変化を表したグラフである。（Ａ）：ＳＶＰ７０添加、●：基質に対して１／２００量を添加、■：基質に対して１／５００量を添加；（Ｂ）：ＳＡＭ−Ｐ４５添加、●：基質に対して１／１０量を添加、■：基質に対して１／５０量を添加。
【発明を実施するための最良の形態】
一般に、分泌型タンパク質はプレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳された後、シグナルペプチド（「プレ部分」）が切断されて成熟ペプチドまたはプロペプチドに変換され、プロペプチドはプロテアーゼによってさらにプロ構造分と呼ばれる領域が切断されて成熟ペプチドになることが知られている。本明細書において、分泌型タンパク質のプロ構造部分を単に「プロ構造」と呼ぶこともある。また、本明細書において、「シグナル配列」とは、分泌性タンパク質前駆体のＮ末端に存在し、かつ天然の成熟タンパク質には存在しない配列をいい、「シグナルペプチド」とはそのようなタンパク質前駆体から切り取られるペプチドをいう。一般にはシグナル配列は菌体外への分泌に伴ってプロテアーゼによって切断される。
本明細書において、シグナルペプチドを有しないがプロ構造部分を有するタンパク質を「プロタンパク質」、たとえば「プロトランスグルタミナーゼ」あるいは「プロＭＴＧ」と称することがある。本明細書において、分泌型タンパク質のプロ構造部分を単に「プロ構造」あるいは「プロ構造部」と称することがあり、これらの用語は互換的に使用される。
本発明者らは、まずコリネ型細菌で容易に発現できると想定されるプロテアーゼのうち、目的とする基質選択特異性が高い、すなわちプロＭＴＧのプロ構造部を選択的に分解し且つトランスグルタミナーゼ本体の過分解をできるだけ起こさないプロテアーゼの探索を行った。
本来放線菌によってＭＴＧが菌体外に分泌されるときは、まずプロＭＴＧとして分泌され、分泌後プロＭＴＧのプロ構造部が切断され活性型ＭＴＧとなることが想定されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５７巻、５７０−５７６頁（１９９８年））。このことから、本発明者らは、ＭＴＧ生産放線菌にプロＭＴＧのプロ構造部を切断するプロテアーゼが存在することを予想した。このプロテアーゼは本来プロ構造部を切断するプロテアーゼであるから、基質選択性が高く、プロ構造部のみを切断し、ＭＴＧ本体への作用は少ないことが想定される。
また、放線菌由来のプロＭＴＧの構造遺伝子、並びにプロテアーゼＳＡＭ−Ｐ４５の構造遺伝子何れもがコリネ型細菌で良好に発現し、これらを菌体外へ分泌させることができる。これらの情報に基づき、放線菌であるＭＴＧ生産菌から目的とするプロテアーゼを見出すべく鋭意検討を行った結果、ＭＴＧ生産菌ストレプトバーチシリウム・モバラエンスが、プロＭＴＧのプロ構造部の切断選択性が高く、活性型ＭＴＧ生産に有用な新規中性メタロプロテアーゼをも生産していることが見出された。本発明者らは、この中性メタロプロテアーゼを単離精製し、その酵素学的特性を明らかにした。さらに本発明者らは、このメタロプロテアーゼのＮ末端部分アミノ酸配列を決定し、このメタロプロテアーゼをコードする遺伝子を得た。
また、本発明者らは、本酵素遺伝子をコリネ型細菌に組み込み、コリネ型細菌を宿主とした系において発現させたところ菌体外に分泌させることができた。さらに実際に本酵素をプロＭＴＧに作用させたところ、プロ構造部が切断され、活性型トランスグルタミナーゼが得られた。また、同等の機能を有する他の起源の微生物由来中性メタロプロテアーゼも見出され、同様に活性型ＭＴＧの製造に有用であることが明らかになった。
以下に、より具体的な本発明の実施の態様を例示的に示す。
本発明の中性メタロプロテアーゼは、ストレプトバーチシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）等の放線菌の培養菌体表層および培養上清中から調製することができる。
以下では、まず、ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９から新規に見出した中性プロテアーゼについて述べる。
本発明の中性プロテアーゼを得るための菌、例えば上述した放線菌の培養は、放線菌の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。すなわち、培養するための培地としては通常の炭素源、窒素源、無機イオン等を含有する通常の培地が利用できる。炭素源としてはグルコース、デンプン、ショ糖、その他を用いることができる。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、アンモニウム塩、その他を必要に応じて適宜使用することができる。培養は好気条件下にｐＨ５．０から８．５、温度を１５℃から３７℃の適当な範囲に制御することによって行うことができる。本発明の中性プロテアーゼ製造のためには、目的とする中性メタロプロテアーゼの生産が最大に達するまで培養を続け、その後停止させるのが好ましい。適切な培養期間は温度、ｐＨ、培地に依存するが、一般には１〜１２日程度が好ましい。培養後遠心分離操作等により、培養物を菌体と培養上清とに分ける。
本発明の新規中性メタロプロテアーゼは、培養上清液、および、回収した菌体、特に菌体表層から得ることができる。本酵素を精製するためには、通常酵素の精製を行うために用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法等を採用することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を使用することによって、さらに効率よくプロテアーゼを精製することができる。このようにして得られる中性メタロプロテアーゼの酵素活性の測定は、プロトランスグルタミナーゼのプロ構造部分と成熟トランスグルタミナーゼの接続領域を含むペプチド、例えば、合成ペプチドＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（配列番号１１）（ペプチド研究所製）を基質として酵素を反応させ、基質の減少量を算出することにより測定することができる。
上述したように、回収した菌体、特に菌体表層または培養上清液から抽出精製された本発明の中性メタロプロテアーゼは、次に、気相プロテインシークエンサーにてＮ末端のアミノ酸配列を解析し、部分アミノ酸配列を決定することができる。さらに、単離精製した中性メタロプロテアーゼの酵素化学的性質（至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性、阻害剤の影響等）を調べることができる。
本発明の一実施態様において、ストレプトバーチシリウム・モバラエンスの菌体表層からＳＶＰ３５と命名した中性メタロプロテアーゼが、培養上清からＳＶＰ７０と命名した中性メタロプロテアーゼが得られる。
本発明の一実施態様において、本発明の中性メタロプロテアーゼは以下の性質を有する中性メタロプロテアーゼＳＶＰ３５である：
１）分子量：約３５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
２）至適ｐＨ：６．０〜８．０、より具体的には６．５〜７．５、特に７．０付近
３）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１０
４）至適温度：約４５℃
５）温度安定性：約５０℃以下で安定
６）阻害剤：メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
また、本発明の別の実施態様において、本発明の中性メタロプロテアーゼは以下の性質を有する中性メタロプロテアーゼＳＶＰ７０である：
１）分子量：約７１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
２）至適ｐＨ：６．０〜８．０の範囲、より具体的には６．５〜７．５、特に７．０付近
３）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０
４）至適温度：５０℃〜５５℃の範囲、特に５５℃付近
５）阻害剤：メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、ＳＨ−還元剤であるジチオスレイトール、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
ＳＶＰ３５及びＳＶＰ７０は、いずれもプロＭＴＧに作用させた場合、ＭＴＧのプロ構造部の選択的切断活性が高い。すなわち、いずれの酵素もプロＭＴＧを活性型のＭＴＧに効率よく変換させるが、生成した活性型ＭＴＧ本体を分解する活性は低いという特徴があるので、どちらもプロＭＴＧを原料として活性型ＭＴＧを製造するのに好適な酵素である。一方これら新規な２種の中性メタロプロテアーゼのＮ末端アミノ酸配列は、ＳＶＰ３５については配列表配列番号１に、ＳＶＰ７０については配列表配列番号２に示してあり、両者には相同性がある。従って、これらプロテアーゼとＮ末端アミノ酸配列に相同性を有するものを検索したところ、ストレプトマイセス・グリセウス由来のメタロプロテアーゼＳＧＭＰ ＩＩ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０巻、３３９〜３４４ページ、１９９１年）、並びに、ストレプトマイセス・セリカラー由来の３種のメタロプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＣＡＢ７６０００、同ＣＡＢ７６００１、同ＣＡＢ６９７６２）等が見出された。これらのプロテアーゼも、ＳＶＰ３５及びＳＶＰ７０と同様に、プロＭＴＧのプロ構造部の選択的切断に使用することができ、プロＭＴＧを原料として活性型ＭＴＧを製造するために用いることができる。
次に、組み換えＤＮＡ技術によって本発明の中性メタロプロテアーゼを製造する方法について説明する。
組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られている。組み換えＤＮＡ技術を用いることの利点は、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できることである。
組み換えＤＮＡ技術を利用して本発明の中性メタロプロテアーゼを製造するためには、まず、プロモーター、適切なシグナルペプチドをコードする配列および本発明の中性メタロプロテアーゼをコードする核酸断片、およびコリネ型細菌中で中性メタロプロテアーゼ遺伝子を発現させるために必要な制御配列（オペレーターやターミネーター等）、をそれらが機能し得るように適切な位置に有する遺伝子構築物を作製する。本発明の中性メタロプロテアーゼは、Ｎ末端にプロ構造部を有していてもよい。この構築物作製のために使用できるベクターは特に制限されず、宿主微生物、好ましくはコリネ型細菌中で機能し得るものであればよく、例えば、プラスミドのように染色体外で自立増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってもよい。宿主としてコリネ型細菌を使用する場合、コリネ型細菌由来のプラスミドはベクターとして特に好ましい。これらには、例えばｐＨＭ１５１９（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４））、ｐＡＭ３３０（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４））、およびこれらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドが含まれる。
本発明において宿主菌として使用できるコリネ型細菌としては、Ｌ−グルタミン酸生産菌に代表されるブレビバクテリウム・サッカロリティクムＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・インマリオフィルムＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１５９９０、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）ＡＴＣＣ６８７１等の野生株またはその変異株より誘導される変異株である。
本発明において使用される変異株としては、例えばグルタミン酸生産性を失った変異株、更にはリジン等のアミノ酸生産変異株、イノシン等の核酸のような他の物質を生産する変異株も含まれる。このような変異株は、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン等の化学変異剤による処理を行なった後、タンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜することにより得ることができる。
とりわけ、野生株コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９よりストレプトマイシン（Ｓｍ）耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３４）（昭和５９年３月２６日原寄託）（現、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国つくば市東１−１−１ 中央第６、郵便番号３０５−８５６６）はその親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、異種タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２〜３倍と極めて高く、宿主菌として好適である（ＷＯ ０２／０８１６９４参照）。さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。
コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質のＰＳ１、ＰＳ２、ＳｌｐＡの遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系、例えばグルタミン酸合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
本発明で使用するシグナルペプチドは、宿主であるコリネ型細菌の分泌性タンパク質のシグナルペプチドであり、好ましくは、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドである。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に由来するＰＳ１及びＰＳ２（特表平６−５０２５４８）、及びコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）に由来するＳｌｐＡ（特開平１０−１０８６７５）が挙げられる。
組み換えＤＮＡ技術を利用してプロＭＴＧのプロ構造部の選択的切断活性が強い中性メタロプロテアーゼを製造するためには、当該中性メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡが必要である。
本発明の一実施態様において、組み換えＤＮＡ技術を利用して中性メタロプロテアーゼＳＶＰ３５が製造される。ＳＶＰ３５をコードするＤＮＡは、下記のようにして取得することができる。
はじめに、精製されたＳＶＰ３５のアミノ酸配列を決定する。エドマン法（Ｅｄｍａｎ，Ｐ．，Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．４，２２７（１９５０））を用いてアミノ酸配列を決定することができる。また島津製作所社製等の気相プロテインシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。
本発明の中性メタロプロテアーゼＳＶＰ３５について、Ｎ末端から２０残基のアミノ酸配列を決定したところ、配列表配列番号１に示される配列が明らかとなった。
この配列情報を利用して適切なＰＣＲ用プライマーを合成し、本発明の中性メタロプレテアーゼを得るためのプローブを作製することができる。例えば、Ｎ末端アミノ酸配列の相同性検索結果から相同性を有することが予想される放線菌由来のプロテアーゼ遺伝子、例えば、ストレプトマイセス・セリカラー由来のメタロプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＣＡＢ７６００１）遺伝子、を斉藤、三浦の方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］により調製した放線菌ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、このプロテアーゼをコードする遺伝子の断片を増幅することができる。得られた増幅断片はプローブとして使用することができる。
次に斉藤、三浦の方法により調製した放線菌由来のＤＮＡ、例えばＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡを、適当な種々の制限酵素、例えば６塩基配列を認識する種々の制限酵素で消化する。上記ＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物の３２Ｐ−ラベル化物をプローブとして、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ９．３１（１９８９）］に記載されたサザンブロットハイブリダイゼーション法等の当業者に知られた方法により、消化した放線菌染色体ＤＮＡを解析することができる。例えばサザンブロットにより、用いたプローブと高い相同性を有することが確認された断片を回収し、適切なベクター中にクローニングすることにより、本発明の中性メタロプロテアーゼをコードする核酸分子またはその一部をクローニングすることができる。このような遺伝子クローニングに必要な技法は当業者にはよく知られたものである（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ１．９０（１９８９）］参照）。
本発明の一実施態様においては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、プローブが作製される。更に、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９染色体ＤＮＡのＳｐｈ Ｉ消化物中に、３２Ｐラベルしたプローブとハイブリダイズする約８ｋｂの単一バンドが検出される。そこで、先の方法により調製したＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡをＳｐｈ Ｉで消化し、約８ｋｂの断片をアガローズゲル電気泳動により回収し、この回収断片をｐＵＣ１８のＳｐｈ Ｉ部位に挿入した後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９のコンピテントセルに導入し、ライブラリーが作製される。作製したライブラリーに対して、合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（既出）記載のコロニーハイブリダイゼーション法に従ってスクリーニングを行い、ＳＶＰ３５の遺伝子断片がクローン化されたプラスミドを保持する菌株を選択することにより目的のクローンが得られる。この菌株より回収したプラスミドはｐＶＳＶ１と名付けられている。ｐＶＳＶ１にクローン化されている断片のヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の一次配列を推定することにより、先に決定したＮ末端部分アミノ酸配列をコードしていることが確認される。これによって、得られた遺伝子がＳＶＰ３５をコードする遺伝子であることが確認される。
次に、得られたメタロプロテアーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子構築物を、使用する宿主の性質に応じて適切なベクターと結合させて、本発明の中性メタロプロテアーゼを発現させるための組換え核酸分子を構築することができる。この組換え核酸分子で宿主であるコリネ型細菌細胞を形質転換する。形質転換された細胞を適切な培地中で培養し、培地中及び／又は細胞中に分泌又は蓄積された本発明の中性メタロプロテアーゼを回収することができる。
次に、中性メタロプロテアーゼを用いてプロＭＴＧから活性型ＭＴＧを製造する方法について述べる。
活性型ＭＴＧ製造に用いる中性メタロプロテアーゼは、中性メタロプロテアーゼ生産菌の培養液から調製される中性メタロプロテアーゼ含有画分としてプロＭＴＧに作用させることができる。又、さらに高度に精製された比活性の高い中性メタロプロテアーゼとして用いることもできる。さらに、後述するように、プロＭＴＧのプロ構造部の選択的切断活性が強い中性メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡとベクターとを連結して得られる組換え核酸分子によって形質転換された細胞を培養することによって得られる中性メタロプロテアーゼを用いることもできる。
ＭＴＧ製造に用いるプロＭＴＧは、プロＭＴＧ生産菌の培養液から調製されるプロＭＴＧ含有画分であってもよい。また、さらに高度に精製されたプロＭＴＧを用いてもよい。反応条件は、プロＭＴＧに対し中性メタロプロテアーゼの添加量を質量にして１／１０から１／５００とし、反応温度１５℃から５０℃、ｐＨをｐＨ５．０から９の適当な範囲に調整して行うことができる。
また、前述したように構築した本発明の中性メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子構築物と、プロＭＴＧをコードする遺伝子構築物を有する微生物、特に、コリネ型細菌に導入し、プロＭＴＧと本発明のメタロプロテアーゼを一菌体によって産生させ、上記条件下でプロＭＴＧを成熟ＭＴＧに変換することもできる。プロＭＴＧをコリネ型細菌で効率よく生産させるためのより詳細な方法、その方法に使用する遺伝子構築物、そのような遺伝子構築物が導入されたコリネ型細菌は、例えばＷＯ ０１／２３５９１に明らかにされている。より具体的には、例えば、コリネ型細菌由来のシグナルペプチド領域、特に細胞表層タンパク質のシグナルペプチド領域をコードする配列の下流にプロＭＴＧをコードする配列を適切なプロモーターの下流に結合して得られる遺伝子構築物をコリネ型細菌に導入して、プロＭＴＧタンパク質を菌体外に効率よく分泌し得るコリネ型細菌を得ることができる。この目的に使用し得るシグナルペプチド、プロモーターおよび宿主は本発明のメタロプロテアーゼを発現させるために適した上述のシグナルペプチド、プロモーターおよび宿主から選ぶことができる。また、同一菌体内で共存可能なベクターの組み合わせも当業者にはよく知られている。従って、プロＭＴＧを産生するコリネ型細菌に上述した本発明の中性メタロプロテアーゼをコードするＤＮＡを含む適切な遺伝子発現構築物を導入する、あるいは逆に、本発明の中性メタロプロテアーゼを産生するコリネ型細菌にプロＭＴＧをコードする適切な遺伝子発現構築物を導入することにより、同一菌体内にプロＭＴＧおよび本発明の中性メタロプロテアーゼを発現させ得る遺伝子構築物を共存させ、その菌を培養し、上述したような、本発明の中性メタロプロテアーゼが活性を有するような適切な条件に置くことによって成熟ＭＴＧを得ることができる。
本発明の方法により製造されたトランスグルタミナーゼは、当業者によく知られた方法に従って反応液から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。尚、本発明は実施例の記載に限定されない。
【実施例】
実施例１．ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９が生産する中性メタロプロテアーゼ
（１）ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９の生産する中性メタロプロテアーゼ（ＳＶＰ７０）の精製
ＩＳＰ２液体培地（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ４ｇ、Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ、Ｇｌｕｃｏｓｅ ４ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．３に調整）を５Ｌ坂口フラスコに８００ｍＬ張り込み、Ｓｔｐｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９株をプレートより植菌して３０℃にて９日間、１２０ｒｐｍで振盪培養した。培養液を遠心分離し、培養上清を回収した。デプスフィルター（ポアサイズ３μｍ、ザルトリウス社製）を用いて濾過後、ポアサイズ１０，０００Ｄａのザルトコンスライスメンブラン（ザルトリウス社製）を用いて濃縮を行った。濃縮液を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／５ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ７．５）で１０倍に希釈し、ＦＰＬＣ（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース ＦＦ（２．６φ×１０ｃｍ，Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のカラムに通し、塩化ナトリウム０−０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出した。活性成分を含有する画分を回収し、１．５Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液／５ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ６．０）で平衡化したフェニルセファロースＨＰ（１．６φ×１０ｃｍ，Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のカラムに通し、硫酸アンモニウム１．５−０Ｍの直線濃度勾配で溶出して活性画分を回収した。得られた活性画分を２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液／５ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ６．０）に対して一晩、４℃で透析して、精製酵素液を得た。
各段階での酵素活性の測定は以下のように行った。
ペプチドＧＰＳＦＲＡＰＤＳ（ペプチド研究所製）（配列番号１１）を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に酵素溶液を加え、総液量１７０μｌで３０℃、１０分間反応させた後、９５℃で５分間加熱して反応を停止させた。このうち８０μｌを以下の条件でＨＰＬＣ分析し、基質の減少量に基づいて活性を算出した。
装置：日立株式会社製 ＨＰＬＣ Ｌ−６３００ システム
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ １２０Ａ ４．６×１５０ｍｍ （ワイエムシィ）
溶離液：（Ａ）０．１％ ＴＦＡ （Ｂ）８０％アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡ
溶出条件：アセトニトリル１２−１６％直線濃度勾配（１５分間）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２２０ｎｍ
この条件において、ペプチドＧＰＳＦＲＡＰＤＳは、リテンションタイム１３〜１４分に、分解物ＦＲＡＰＤＳはリテンションタイム７．５〜８．５分に溶出した。
酵素活性の単位として１分間に１ｎｍｏｌのプロＭＴＧ分解を触媒する酵素量を１Ｕと定義した。
（２）ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９の生産する中性メタロプロテアーゼ（ＳＶＰ３５）の精製
ＩＳＰ２液体培地を５Ｌ坂口フラスコに８００ｍＬ張り込み、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９株をプレートより植菌して３０℃にて４８時間、１２０ｒｐｍで振盪培養した。培養液を遠心分離し、培養上清を除いて菌体を回収した。菌体を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液／３０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）に懸濁し、氷上で４時間振盪後、遠心分離により上清を回収した。得られた上清をデプスフィルター（ポアサイズ０．２２μｍ、ザルトリウス社製）で濾過滅菌後、ＦＰＬＣ（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のカラム（１．６φ×１０ｃｍ）に通し、同緩衝液中、塩化ナトリウム０−０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出した。活性成分を含有する画分を回収し、さらに１．５Ｍ硫酸アンモニウム、５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（１ｍＬ Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に通し、硫酸アンモニウム１．５−０Ｍの直線濃度勾配で溶出した。活性画分を回収し、ＰＤ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて、５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で脱塩して、部分精製酵素液を得た。
各段階での酵素活性は（１）と同様に、ペプチドＧＰＳＦＲＡＰＤＳを基質として用いて測定した。
（３）ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９の生産する中性メタロプロテアーゼ（ＳＶＰ３５）の特性評価
ｉ）基質特異性
５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて１ｍｇ／ｍｌに調製したインスリンＢ溶液およびプロＭＴＧ溶液を基質とし、酵素溶液を添加して３０℃、２時間反応させた後、以下の条件のＨＰＬＣにてペプチド断片を分取した。
装置：Ｌ−７１００／７２００／７４０５／Ｄ−７６００（日立）
カラム ：ＶＹＤＡＣ Ｃ１８ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ＶＹＤＡＣ）
溶離液：（Ａ）０．１％ ＴＦＡ（Ｂ）８０％アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡ
溶出条件：アセトニトリル４−４４％直線濃度勾配
流速 ：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：ＵＶ ２２０ｎｍ
得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＰＰＳＱ−１０（島津製作所）にて分析し、ＳＶＰ３５による切断点の配列を解析した。その結果、特にＰｈｅ、しばしばＬｅｕ、時々Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｖａｌの前（Ｎ末端側）にて切断されており、ＳＶＰは切断部位のＰ’１位に位置する芳香族アミノ酸および巨大側鎖の疎水アミノ酸を認識していることが明らかとなった。
ｉｉ）至適ｐＨ
ｐＨ３から１０までの０．１５Ｍ ＧＴＡ緩衝液（３，３−ジメチルグルタル酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールによる緩衝液）中で、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒを基質として３０℃にて１０分間ＳＶＰ３５を作用させた。その結果、ＳＶＰ３５の至適ｐＨは７．０付近であり、ｐＨ７．０の活性を１００％とすると、ｐＨ６．０〜８．０の範囲で７０％以上、ｐＨ６．５〜７．５の範囲で８０％以上の活性を有することが明らかになった（図１）。
ｉｉｉ）ｐＨ安定性
ｐＨ３から１０までの０．１５Ｍ ＧＴＡ緩衝液にＳＶＰ３５精製酵素溶液１０μｌに各ｐＨの緩衝液を４０μｌ加え、４℃で一晩放置した後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で液量を４００μｌに合わせ、ｐＨを７．０に調整した。この酵素溶液にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒを基質として添加し、ｐＨ７．０、３０℃で１０分間反応させた。その結果、ＳＶＰ３５はｐＨ４〜１０の範囲で安定（ｐＨ４．０における活性を１００％とすると、ｐＨ４〜１０において９０％以上の活性を有する）であることが示された（図２）。
ｉｖ）至適温度
５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈した精製酵素溶液にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒを加えてｐＨ７．０、５℃から６５℃にて１０分間反応させた。その結果、ＳＶＰ３５の至適温度は約４５℃であり、４０℃〜５０℃の範囲で高い活性を有する（４５℃における活性の８０％以上の活性を有する）ことが示された（図３）。
ｖ）温度安定性
精製酵素液１０μｌに５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１ｍＭ塩化亜鉛を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を４０μｌ加え、４℃または３０℃から７０℃にて１５分間処理した後、氷冷し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を２５０μｌ添加した。この酵素溶液にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｐを基質として添加し、３０℃で５分間反応させた。４℃で処理した場合の活性を１００％として各温度における残存活性を算出した。その結果、ＳＶＰ３５は５０℃では８０％の活性を保っているが、６０℃で失活することが示された（図４）。
ｖｉ）阻害剤
各種化合物を第５図に示した濃度で含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に精製酵素溶液を加え、室温で６０分間放置した。その後基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒを加えて３０℃で１０分間反応させた。化合物無添加の場合のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ切断活性を１００％として、各種化合物を添加した場合の相対活性を算出した。その結果、メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）によってＳＶＰ３５は強い阻害作用を受けた（図５）。
（４）ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９の生産する中性メタロプロテアーゼ（ＳＶＰ７０）の特性評価
ｉ）基質特異性
（３）−ｉ）と同様にして基質特異性を調べた。
その結果、基質は特にＰｈｅ、しばしばＬｅｕ、時々Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｖａｌの前（Ｎ末端側）にて切断されており、ＳＶＰ７０は切断部位のＰ’１位に位置する芳香族アミノ酸および巨大側鎖の疎水アミノ酸を認識していることが明らかとなった。
ｉｉ）至適ｐＨ
（３）−ｉｉ）と同様にしてＳＶＰ７０の至適ｐＨを調べた。その結果、ＳＶＰ７０の至適ｐＨは７．０付近であり、ｐＨ７．０における活性を１００％としてｐＨ６．０〜８．０においてで９０％以上、ｐＨ６．５〜７．５の範囲で９５％以上の活性を有することがことが明らかになった（図１）。
ｉｉｉ）ｐＨ安定性
（３）−ｉｉｉ）と同様にしてｐＨ安定性を調べた。その結果、ＳＶＰ７０はｐＨ５〜１０の範囲で安定であるが、ＳＶＰ３５に比べてややアルカリ側で安定性が弱いことが示された（図２）。具体的には、ｐＨ５における活性を１００％とすると、ｐＨ５〜７の範囲で９０％以上の活性を有し、ｐＨ７〜１０の範囲でも約８０％以上の活性を有することが示された。
ｉｖ）至適温度
（３）−ｉｖ）と同様にしてＳＶＰ７０の至適温度を調べた。その結果、ＳＶＰ７０の至適温度は約５０〜５５℃の範囲、特に５５℃付近にあることが示された（図３）。
ｖ）阻害剤
（３）−ｖ）と同様にして、種々の化合物のＳＶＰ７０に対する阻害活性を調べた。
その結果、ＳＶＰ７０は、メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、還元剤ジチオスレイトール、尿素および放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）によって強い阻害作用を受けた（図５）。
（５）ＳＶＰ３５、ＳＶＰ７０のＮ末端アミノ酸配列解析
（１）、（２）で得たＳＶＰ３５、ＳＶＰ７０の精製酵素をメンブランカートリッジ（パーキンエルマー社製）を用いてポリビニリデン−ジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写し、気相プロテインシークエンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所製）にてＮ末端アミノ酸配列を解析した。ＳＶＰ３５のアミノ酸配列を配列表配列番号１に、ＳＶＰ７０のアミノ酸配列を配列表配列番号２に示した。これらには相同性が認められる。
そこで、これらプロテアーゼとＮ末端アミノ酸配列に相同性を有するものを放線菌から検索したところ、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｐｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のメタロプロテアーゼＳＧＭＰ ＩＩ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０巻、３３９〜３４４ページ、１９９１年）、および、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来の３種のメタロプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＣＡＢ７６０００、同ＣＡＢ７６００１、同ＣＡＢ６９７６２）等が見出された。これらのプロテアーゼも、プロＭＴＧのプロ構造部を選択的に切断するために使用することができ、従って、本発明による活性型ＭＴＧの製造に用いることができる。
（６）ＳＶＰ３５遺伝子のクローン化とコリネ型細菌での分泌発現
斉藤、三浦の方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］によりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）の染色体ＤＮＡを調製した。Ｎ末端アミノ酸配列に相同性を有するストレプトマイセス・セリカラー由来のメタロプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＣＡＢ７６００１）遺伝子の配列を参考にして、配列番号３と配列番号４に示したプライマーを合成した。前述の、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３と配列番号４に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、メタロプロテアーゼ遺伝子中の遺伝子領域を増幅した。ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このＰＣＲ産物の３２Ｐ−ラベル化物をプローブとして、斉藤、三浦の方法により調製したＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡを６塩基配列を認識する種々の制限酵素で消化した試料を用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ９．３１（１９８９）］記載のサザンブロットハイブリダイゼーション法により解析したところ、ＳｐｈＩ切断により約８ｋｂの単一バンドが検出された。
そこで、先の方法により調製したＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ ＩＦＯ１３８１９の染色体ＤＮＡをＳｐｈＩで消化し、約８ｋｂの断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲル電気泳動により回収した。回収断片をｐＵＣ１８のＳｐｈＩ部位に挿入した後、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）のコンピテントセルに導入し、ライブラリーを作製した。作製したライブラリーに対して、合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐ１．９０（１９８９）］記載のコロニーハイブリダイゼーション法により、ＳＶＰ３５の遺伝子断片がクローン化されたプラスミドを保持する菌株をスクリーニングした。
得られた菌株より回収したプラスミドをｐＶＳＶ１と名付けた。ｐＶＳＶ１にクローン化されている断片のヌクレオチド配列を決定した。このクローン化断片のヌクレオチド配列を配列番号５に示した。この遺伝子にコードされるアミノ酸の一次配列を推定したところ、先に決定したＮ末端部分アミノ酸配列を含む、ＳＶＰ３５のシグナル配列およびプロ構造と想定される領域を含む全アミノ酸の一次配列を決定した。ＳＶＰ３５の全アミノ酸配列を配列番号６に示した。配列番号６に記載のアミノ酸配列の１〜３６番アミノ酸までがシグナル配列であり、アミノ酸番号３７〜２１６がプロ構造部であり、アミノ酸２１７〜５３７番が成熟型ＳＶＰ３５と推定される。
配列番号５の配列を参考にして、ｐＶＳＶ１を鋳型として、配列番号７と配列番号８に示したプライマーを合成し、ＳＶＰ３５のプロ構造部分および成熟ＳＶＰ３５を含む遺伝子領域をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
次に、ＷＯ ０１／２３５９１に記載のｐＰＫＳＰＴＧ１を鋳型として、配列番号９と配列番号１０のオリゴヌクレオチドの組み合わせにより、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質であるＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡのシグナル配列とを含む領域をＰＣＲ法にて増幅した。配列番号１０に示したプライマーはプロ構造付きＳＶＰ３５のＮ末端側のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。
次に、それぞれ増幅させたＰＣＲ反応液各１μｌを混ぜて鋳型とし、配列表配列番号８と配列表配列番号９を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、ＰＳ２遺伝子のプロモーター領域を含む５’−上流域とＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの細胞表層タンパク質ＳｌｐＡのシグナル配列に接続された異種融合プレプロＳＶＰ３５遺伝子断片を増幅させた。
アガロースゲル電気泳動により、約２．３ｋｂの増幅断片を検出した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、約２．３ｋｂの断片を回収し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造製）を用い末端を平滑化後、特開平９−０７０２９１記載のｐＣＶ７のＳｍａＩ部位に挿入することによって、ｐＶＳＶ１を得た。定法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
構築したプラスミドｐＶＳＶ１を用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＴＣ１３８６９を形質転換し、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｓ（酵母エキストラクト１０ｇ、トリプトン１０ｇ、シュークロース５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天１５ｇ、水で１Ｌにする）寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選択したｐＶＳＶ１を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＴＣ１３８６９を、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＭＭＴＧ液体培地（グルコース６０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．４ｇ、硫酸アンモニウム３０ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸鉄七水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン五水和物０．０１ｇ、チアミン塩酸塩４５０μｇ、ビオチン４５０μｇ、ＤＬ−メチオニン０．１５ｇ、炭酸カルシウム５０ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．５に調整）で３０℃、３０時間培養した。この培養液１ｍｌを遠心分離により培養上清と菌体に分離した。培養上清には、ＳＶＰ３５の活性が検出され、Ｌａｅｍｍｌｉの方法によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））電気泳動の結果、約２００ｍｇ／ＬのＳＶＰ３５が分泌発現していることが確認された。
実施例２．ストレプトバーチシリウム・モバラエンスＩＦＯ１３８１９の生産するトランスグルタミナーゼ前駆体（プロＭＴＧ）の活性型への変換
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにて発現させたプロＭＴＧ（１ｍｇ／ｍｌ）を精製した基質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ由来中性プロテアーゼ（ＳＶＰ３５，ＳＶＰ７０）または放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来中性メタロプロテアーゼＳＧＭＰ ＩＩと基質：酵素＝２００：１の割合で混合し、３０℃で反応させた。経時的に０，１，２，４，７，２０時間後に反応混合物を分取し、一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合して９５℃、３分間加熱した後Ｌａｅｍｍｌｉの方法によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））に供した。その結果を第６図に示す。第６図から分かるように、これらのプロテアーゼを反応させるとプロＭＴＧは成熟型に変換され、長時間反応させた後も生成したＭＴＧは減少しなかった。また、分取した画分のトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）活性をハイドロキサメート法にて測定したところ、十分な活性が確認された。なお、ＳＧＭＰ ＩＩは、アクチナーゼ（科研製薬製）かから文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０巻、３３９〜３４４ページ、１９９１年）の方法に従って精製した。
次に、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ由来中性プロテアーゼＳＶＰ７０、および、対照としてセリンプロテアーゼＳＡＭ−Ｐ４５（放線菌Ｓｔ．ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ由来）を、酵素添加量を増加させてプロＭＴＧに添加し、３０℃、ｐＨ７．０にて反応させた。経時的に１，４，７，２４時間後に分取し、ＴＧ活性をハイドロキサメート法により測定した（第７図）。また、ＴＧのタンパク質濃度を逆相ＨＰＬＣにて測定した（第８図）。その結果、ＳＶＰは基質に対して１／５００という少量でプロＭＴＧを効率よく活性型ＭＴＧに変換できることが示された。ＳＡＭ−Ｐ４５は基質に対して１／５０量でもトランスグルタミナーゼ活性が上がりきらず、活性型への完全な変換はされないことが示された。一方、ＳＡＭ−Ｐ４５を基質に対して１／１０量添加した場合、活性型ＭＴＧへの変換が見られたが、続いてＭＴＧタンパク量の減少および活性の低下が見られた。このことは、ＳＡＭ−Ｐ４５による成熟ＭＴＧの過分解が起こっていることを示唆する。
本発明により、放線菌ストレプトバーチシリウム・モバラエンスより、トランスグルタミナーゼ前駆体のプロ構造部分を特異的に切断し、活性化する新規プロテアーゼ、およびその遺伝子が提供される。また、本発明の新規プロテアーゼはコリネ型細菌で大量発現させることができるため、これにより、微生物由来トランスグルタミナーゼを効率よく製造する方法が提供される。
本発明の放線菌由来中性メタロプロテアーゼを活性型ＭＴＧ製造に用いる利点は、プロＭＴＧのプロ構造部の選択的切断活性が強いとともに、コリネ型細菌でこれら酵素を発現分泌させることができる点である。
放線菌由来のプロＭＴＧはコリネ型細菌で効率よく発現させ分泌させ得ることが分かっているので、コリネ型細菌にプロＭＴＧと中性メタロプロテアーゼを共発現および分泌させることより、一菌体でのさらに効率的な活性型ＭＴＧの製造が可能となる。ここで、中性メタロプロテアーゼはプロＭＴＧのプロ構造部切断に必要十分な量を発現させるだけで良い。
参考文献
１．特公平１−５０３８２号公報
２．特開昭６４−２７４７１号公報
３．国際公開第０１／２３５９１号パンフレット
４．特表平６−５０２５４８号公報
５．特開平１０−１０８６７５号公報
６．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５７巻、５７０−５７６頁、１９９８年
７．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０巻、３３９〜３４４頁、１９９１年
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌由来中性メタロプロテアーゼをコードする遺伝子を導入した微生物を培養し、前記放線菌由来中性メタロプロテアーゼを生産させ、微生物由来プロトランスグルタミナーゼのプロ構造部を前記微生物が生産した放線菌由来中性メタロプロテアーゼにより切断することを特徴とする、微生物由来プロトランスグルタミナーゼから活性型微生物由来トランスグルタミナーゼを製造する方法。
【請求項２】
放線菌由来中性メタロプロテアーゼをコードする遺伝子を導入した微生物がコリネ型細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
放線菌由来中性メタロプロテアーゼが以下の性質を有する、請求項１記載の活性型微生物由来トランスグルタミナーゼを製造する方法：
１）分子量が約３５，０００、
２）至適ｐＨが約７．０、
３）ｐＨ４〜１０において安定であり、
４）至適温度が約４５℃、
５）約５０℃以下で安定であり、
６）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
【請求項４】
放線菌由来中性メタロプロテアーゼが以下の性質を有する請求項１記載の活性型微生物由来トランスグルタミナーゼの製造法。
１）分子量が約７１，０００、
２）至適ｐＨが約７．０、
３）ｐＨ５〜１０にて安定であり、
４）至適温度が約５５℃
５）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、ＳＨ−還元剤であるジチオスレイトール、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
【請求項５】
以下の性質を有する放線菌由来中性メタロプロテアーゼ：
１）分子量が約３５，０００、
２）至適ｐＨが約７．０、
３）ｐＨ４〜１０において安定であり、
４）至適温度が約４５℃、
５）約５０℃以下で安定であり、
６）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
【請求項６】
以下の性質を有する放線菌由来中性メタロプロテアーゼ：
１）分子量が約７１，０００、
２）至適ｐＨが約７．０、
３）ｐＨ５〜１０にて安定であり、
４）至適温度が約５５℃
５）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、ＳＨ−還元剤であるジチオスレイトール、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の放線菌由来中性メタロプロテアーゼをコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子が導入されたコリネ型細菌を培養し、コリネ型細菌の菌体外に分泌された放線菌由来中性メタロプロテアーゼを回収することを特徴とする、放線菌由来中性メタロプロテアーゼを製造する方法。
【請求項１】
放線菌由来中性メタロプロテアーゼをコードする遺伝子を導入した微生物を培養し、前記放線菌由来中性メタロプロテアーゼを生産させ、微生物由来プロトランスグルタミナーゼのプロ構造部を前記微生物が生産した放線菌由来中性メタロプロテアーゼにより切断することを特徴とする、微生物由来プロトランスグルタミナーゼから活性型微生物由来トランスグルタミナーゼを製造する方法。
【請求項２】
放線菌由来中性メタロプロテアーゼをコードする遺伝子を導入した微生物がコリネ型細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
放線菌由来中性メタロプロテアーゼが以下の性質を有する、請求項１記載の活性型微生物由来トランスグルタミナーゼを製造する方法：
１）分子量が約３５，０００、
２）至適ｐＨが約７．０、
３）ｐＨ４〜１０において安定であり、
４）至適温度が約４５℃、
５）約５０℃以下で安定であり、
６）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
【請求項４】
放線菌由来中性メタロプロテアーゼが以下の性質を有する請求項１記載の活性型微生物由来トランスグルタミナーゼの製造法。
１）分子量が約７１，０００、
２）至適ｐＨが約７．０、
３）ｐＨ５〜１０にて安定であり、
４）至適温度が約５５℃
５）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、ＳＨ−還元剤であるジチオスレイトール、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
【請求項５】
以下の性質を有する放線菌由来中性メタロプロテアーゼ：
１）分子量が約３５，０００、
２）至適ｐＨが約７．０、
３）ｐＨ４〜１０において安定であり、
４）至適温度が約４５℃、
５）約５０℃以下で安定であり、
６）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
【請求項６】
以下の性質を有する放線菌由来中性メタロプロテアーゼ：
１）分子量が約７１，０００、
２）至適ｐＨが約７．０、
３）ｐＨ５〜１０にて安定であり、
４）至適温度が約５５℃
５）メタロプロテアーゼ阻害剤であるエチレンジアミン四酢酸、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラミドン、ＳＨ−還元剤であるジチオスレイトール、また、放線菌由来サチライシン阻害タンパク質（ＳＳＩ）にて強い阻害作用を受ける。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の放線菌由来中性メタロプロテアーゼをコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子が導入されたコリネ型細菌を培養し、コリネ型細菌の菌体外に分泌された放線菌由来中性メタロプロテアーゼを回収することを特徴とする、放線菌由来中性メタロプロテアーゼを製造する方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８９７３
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【発行日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３１５５（Ｐ２００５−５０３１５５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２９２３
【国際出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【発行日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２９２３
【国際出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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