微生物群集、人工培地、微生物群集組成物、微生物群集の活性維持・増強方法、汚染土壌の浄化方法、土壌汚染物質の拡散防止方法
【課題】 ＰＣＢ等の広範囲な同族体に対して長期的に維持可能な分解活性を示す微生物群集と、この分解活性を更に増強できる人工培地とを提供する。
【解決手段】 芳香族塩素化合物で汚染されていない湿地還元層土壌、特に水田のグライ層土壌に芳香族塩素化合物を投与し、嫌気的条件下で土壌中培養して得られる、多環芳香族塩素化合物の２塩素化物ないし６塩素化物に対する脱塩素活性が高い微生物群集。活性炭、無機質材料製ビーズの集積体又は焼成土等の孔隙に富む多孔質材料を主材とする人工培地。
【解決手段】 芳香族塩素化合物で汚染されていない湿地還元層土壌、特に水田のグライ層土壌に芳香族塩素化合物を投与し、嫌気的条件下で土壌中培養して得られる、多環芳香族塩素化合物の２塩素化物ないし６塩素化物に対する脱塩素活性が高い微生物群集。活性炭、無機質材料製ビーズの集積体又は焼成土等の孔隙に富む多孔質材料を主材とする人工培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種のＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）やいわゆるダイオキシン類等の芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集に関する。更に、本発明は、このような微生物群集の分解活性の維持・増強に有効な人工培地と、この人工培地に上記の微生物群集を接種してなる微生物群集組成物とに関する。更に、本発明は、芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対する上記の微生物群集や微生物群集組成物の有効な利用に関する。
【０００２】
なお「ダイオキシン類」とは、社会通念に従い、ポリ塩化ベンゾパラジオキシン（慣用名ダイオキシン）やポリ塩化ベンゾフラン（ＰＣＤＦ）を言う。ＰＣＢの内、コプラナーＰＣＢ（Ｃｏ−ＰＣＢ： 2,6−位に塩素が結合していない平面性ＰＣＢ）も「ダイオキシン類」に含まれる。ＰＣＢやダイオキシン類等の多環芳香族塩素化合物（芳香環を２つ又はそれ以上持つ芳香族塩素化合物）は、芳香族塩素化合物の内でも、とりわけ難分解性である。
【背景技術】
【０００３】
周知のように、ＰＣＢやダイオキシン類によって代表される芳香族塩素化合物は生物毒性のある合成化学物質であるが、物理化学的に非常に安定であるため、環境中における長期残留問題を引き起こしている。
【０００４】
近年、芳香族塩素化合物を高濃度に含有する土砂等の廃棄物に対して、物理・化学的方法を中心に各種の処理技術の開発が進められている。一方、芳香族塩素化合物の排出源とは直接に関係しない通常の土壌中にも、主に河床や底質層等の嫌気的環境において、低濃度ではあるがＰＣＢ等の芳香族塩素化合物が広範囲に残留している。そして、これらが種々の経路を通じて生物体へ高濃度に蓄積することが懸念されている。
【０００５】
土壌中等に低濃度に残留するＰＣＢ等の浄化に当たっては、いわゆるバイオレメディエーション等の微生物分解技術が期待されている。これらの微生物分解技術においては、要するに、多様な微生物からなる微生物群集が土壌中で芳香族塩素化合物の嫌気的分解（少なくとも脱塩素反応）を行うものと理解される。そして、土壌中での低濃度汚染物質の浄化と言う点を考えたとき、原位置浄化が可能で設備投資も少なくて済む微生物分解技術は、コスト的に有利である。
【０００６】
芳香族塩素化合物に対する微生物分解技術に関する従来技術としては、例えば以下の非特許文献１〜非特許文献５又は特許文献１を挙げることができる。
【０００７】
下記の非特許文献１、非特許文献２には嫌気性ＵＳＡＢ（ Upflow Anaerobic
Sludge Blanket）反応装置によるＰＣＢ嫌気性分解の報告がある。但し、その嫌気性分解を行う微生物は特定されていない。
【０００８】
【非特許文献１】Natarajan, M. et al., "Dechlorination of spikedPCBs in lake sediment by anaerobic microbial granules" Water Res, 32,3013-3020(1998)
【非特許文献２】Nollet, H. et al., "Carbon/electron sourcedependense of polychlorinated biphenyl dechlorination pathways foranaerobic granules" Chemosphere, 58, 299-310(2005) 下記の非特許文献３その他の幾つかの報告において、芳香族塩素化合物の嫌気的分解活性を持つ微生物群集が報告されている。但し、いずれの報告においても微生物群集の分解活性の安定的な維持に関しては困難を伴っている様子であり、その後の発表がない。
【０００９】
【非特許文献３】Mohn, N. W. et al., "Microbial reductivedehalogenation" Microbial Rev., 56, 482-507(1992) 下記の非特許文献４、非特許文献５においてはＰＣＥ（テトラクロロエチレン）やクロロベンゼンの脱塩素活性を持つ Dehalococcoides属細菌がＰＣＢの幾つかの同族体を脱塩素することを報告している。但し、それらの同族体は、例えば 2,3,4,5,6-PeCB 等の、片側のフェニル基のみに塩素が結合したタイプのものに限られている。
【００１０】
【非特許文献４】Fennel, D. E. et al., "Dehalococcoidesethanogenes Strain195 reductively dechlorinates diverse ChlorinatedAromatic pollutants" Environ. Sci. Technol., 38, 2075-2081(2004)
【非特許文献５】Adrian, L. et al., "Bacterial dehaloresirationwith Chlorinated benzenes" Nature, 408, 580-583(2000) 下記の特許文献１には、難分解性の有機塩素農薬ＰＣＮＢを分解する好気性細菌ブルクホルデリアセパシアを、砕片化多孔質材に集積させる技術が開示されている。但し、この細菌が多環芳香族塩素化合物であるＰＣＢやダイオキシン類の分解に有効か否かは不明である。又、好気性細菌は還元的な環境の多い汚染土壌の浄化には使用し難いと考えられる。
【００１１】
【特許文献１】特開平 11-318435（特願平 10-135156）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記の非特許文献１〜非特許文献５や特許文献１からも伺われるように、芳香族塩素化合物の微生物分解技術に関しては、嫌気性微生物について不明な点が多く、脱塩素反応の詳しいメカニズムは未だ明らかでない。そのため、次のような幾つかの大きな問題点が指摘される。
【００１３】
（１）芳香族塩素化合物、とりわけ難分解性であるＰＣＢやダイオキシン類等の多環芳香族塩素化合物に対して、単独で十分な分解活性を示すスーパー菌株の存在は未だ報告されていない。このようなスーパー菌株が分離される可能性を否定するものではないが、そのような菌株を実際に特定し分離することは、容易ではないと考えられる。
【００１４】
（２）従って、差し当たり、これらの化合物に対して全体として分解活性を示す微生物群集を取得して利用することが現実的である。その場合でも、芳香族塩素化合物、特に多環芳香族塩素化合物に対して十分な分解活性を持つ微生物群集はほとんど報告されていない。そして、このような微生物群集を取得できた場合においても、恐らくはその微生物群集における個々の微生物種の経時的な消長等のために、微生物群集の分解活性を安定的に維持することが困難である。
【００１５】
（３）更に、汚染土壌中の芳香族塩素化合物としては、芳香族骨格構造に対する結合塩素数や結合位置が異なる多様な同族体が混在しているのが通常である。例えばＰＣＢには２０９種類の同族体があり得る。ＰＣＢ分解活性があるとする微生物群集の従来の報告例は、塩素の結合位置等が限定された一部の同族体についてのみの分解活性の報告であり、このような限定のない広範囲な同族体に対して分解活性を示す微生物群集は、未だ報告されていない。
【００１６】
そこで本発明は、芳香族塩素化合物に対し、特に多環芳香族塩素化合物に対し、更にはこれらの広範囲な同族体に対して優れた嫌気的分解活性を示し、かつ、その分解活性を安定的に維持することができる微生物群集を提供することを目的とする。又、本発明は、このような微生物群集の分解活性の更なる維持・増強に有効な人工培地と、この人工培地に微生物群集を接種してなる微生物群集組成物とを提供することを目的とする。更に、本発明は、芳香族塩素化合物により汚染された土壌に対する上記微生物群集や微生物群集組成物の有効な利用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、芳香族塩素化合物で汚染されていない湿地還元層土壌の土壌微生物群集に芳香族塩素化合物を投与し、嫌気的条件下で土壌中培養することにより得られる微生物群集であって、下記（１）の分解活性を示し、更に下記（２）及び／又は（３）に該当する分解活性維持能力を示すものである、微生物群集である。
（１）少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を示す。
（２）殺菌土壌に対する５回以上の継代培養を繰り返しても初期分解活性以上の分解活性を維持できる。
（３）初期分解活性以上の分解活性を１０ケ月以上維持できる。
【００１８】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係る土壌微生物群集が水田のグライ層土壌の土壌微生物群集である、微生物群集である。
【００１９】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る（１）の分解活性を示す土壌微生物群集が、前記土壌中培養を４ケ月以上行うことにより得られるものであり、前記第１発明又は第２発明に係る（１）〜（３）の分解活性及び分解活性維持能力を示す土壌微生物群集が、前記土壌中培養を１０ケ月以上行うことにより得られるものである、微生物群集である。
【００２０】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集であって、優占種として少なくとも Clostridium属の嫌気的微生物を含み、かつ、以下の（４）及び／又は（５）に該当する、微生物群集である。
（４）キノンプロファイル法による微生物群集構造解析においてメナキノン６，７のみが検出される。
（５）主として、δ，ε−サブクラスのプロテオバクテリアに属する微生物からなる。
【００２１】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集であって、その分解反応の主反応として芳香環のメタ位及びパラ位における脱塩素反応を起こし、かつ、汚染土壌中で検出される芳香族塩素化合物の主体をなす２塩素化物〜６塩素化物のいずれに対しても脱塩素活性を示す、微生物群集である。
【００２２】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第５発明に係る芳香族塩素化合物の２塩素化物〜６塩素化物に対する脱塩素活性が、下記の式に定義する脱塩素化率として５％以上の値を示すものである、微生物群集である。
脱塩素化率（％）＝〔１−（培養後全塩素化量／培養前全塩素化量）〕×100
（上記の式において、「全塩素化量」は、培地中の芳香族塩素化合物の２、３、４、５、６塩素化物のそれぞれの含有量を2P、3P、4P、5P、6Pであると規定した場合、（2P×２）、（3P×３）、（4P×４）、（5P×５）、（6P×６）の総和で与えられる。又、「培養前全塩素化量」、「培養後全塩素化量」とは、それぞれ、微生物群集の培養開始直前及び５６日間の培養後における培地の全塩素化量を言う。）
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を接種するために調製される人工培地であって、任意の微生物培地と、これに対して添加される、孔隙に富む多孔質材料である人工生息場材とからなり、接種された微生物群集の嫌気的分解活性を１０ケ月以上維持させ、及び／又は、２倍以上に増強させることができるものである、人工培地である。
【００２３】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、前記第７発明に係る多孔質材料が、活性炭、無機質材料製ビーズの集積体又は焼成土である、人工培地である。
【００２４】
ここにおいて、「無機質材料製ビーズの集積体」とは、ガラスやセラミックス等の無機質材料からなる球状又はこれに近似した形状のビーズ粒子が多数集積したもので、多数のビーズ粒子間の孔隙が結果的に細孔を構成している多孔質体を言う。その際、多数のビーズ粒子は流動可能に集積していても構わない。
【００２５】
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、前記第７発明又は第８発明に係る多孔質材料の平均孔隙径が１０〜８００μｍの範囲内である、人工培地である。
【００２６】
（第１０発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、前記第７発明〜第９発明のいずれかに係る多孔質材料に金属粉が混合されている、人工培地である。
【００２７】
（第１１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１１発明の構成は、前記第１０発明に係る金属粉が鉄粉又はチタン粉である、人工培地である。
【００２８】
（第１２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１２発明の構成は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を、第７発明〜第１１発明のいずれかに係る人工培地に接種して嫌気条件下で培養したものである、微生物群集組成物である。
【００２９】
（第１３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１３発明の構成は、前記第１２発明に係る微生物群集の嫌気的分解活性が接種後１０ケ月以上維持され、及び／又は、接種後２倍以上に増強されている、微生物群集組成物である。
【００３０】
（第１４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１４発明の構成は、前記第１２発明又は第１３発明において規定された微生物群集が、第１発明〜第６発明のいずれかに係る微生物群集である、微生物群集組成物である。
【００３１】
（第１５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１５発明の構成は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を、第７発明〜第１１発明のいずれかに係る人工培地に接種して嫌気的条件下で培養することにより、接種前における微生物群集の嫌気的分解活性を１０ケ月以上維持させ、及び／又は、２倍以上に増強させる、微生物群集の活性維持・増強方法である。
【００３２】
（第１６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１６発明の構成は、前記第１５発明において規定された微生物群集が、第１発明〜第６発明のいずれかに係る微生物群集である、微生物群集の活性維持・増強方法である。
【００３３】
（第１７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１７発明の構成は、芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対して、第１発明〜第６発明のいずれかに係る微生物群集又は第１２発明〜第１４発明のいずれかに係る微生物群集組成物を散布又は混合する、汚染土壌の浄化方法である。
【００３４】
（第１８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１８発明の構成は、芳香族塩素化合物で汚染された土壌地域に対して、第１発明〜第６発明のいずれかに係る微生物群集又は第１２発明〜第１４発明のいずれかに係る微生物群集組成物を含むバリヤー層を、当該土壌地域の周囲の土壌中に上下方向に構築し、及び／又は、当該土壌地域の底層の土壌中に水平方向に構築し、前記バリヤー層の外側への芳香族塩素化合物の拡散を防止する、土壌汚染物質の拡散防止方法である。
【発明の効果】
【００３５】
（第１発明の効果）
第１発明では、まず土着の優れた嫌気性微生物群集に着目し、これに対して嫌気的条件下に芳香族塩素化合物培地を提供して、有効な分解活性を誘導する。
【００３６】
従来、例えばＰＣＢ分解活性を有する微生物又は微生物群集を採取しようとする場合には、ＰＣＢ高濃度汚染土壌を採取源とするのが常識的である。しかし、例えば水田のグライ層土壌のように良好な還元状態にある土壌であって、しかもＰＣＢ等で高濃度に汚染された土壌は見出し難いと考えられる。
【００３７】
このような点からは、微生物群集の採取源として従来のようにＰＣＢ高濃度汚染土壌に着目するよりも、むしろ、非汚染土壌であっても良好な還元状態にある土壌の微生物群集（優れた潜在能力を有する嫌気性微生物群集）に着目し、これに対して芳香族塩素化合物の分解活性を誘導すると言う方法が、効率的／合理的であると考えることができる。本願発明者は、第１発明として、このような方法を試みた結果、多環芳香族塩素化合物を含む種々の芳香族塩素化合物に対する優れた分解活性を示す土壌微生物群集を得ることができた。
【００３８】
しかも、こうして得られた微生物群集は、従来からの大きな問題であった嫌気的分解活性の獲得及びその分解活性の長期的維持について、第１発明の（１）、（２）、（３）に示すように非常に優れた特性を有するものであった。
【００３９】
（第２発明の効果）
本発明では微生物群集の採取源として湿地還元層土壌を用いるが、そのような土壌としては、低湿地や沼地等のグライ層土壌、例えば水田のグライ層土壌等が好ましく例示される。
【００４０】
（第３発明の効果）
湿地還元層土壌の微生物群集に対して芳香族塩素化合物の分解活性を誘導するには、ある程度の誘導期間（土壌中培養期間）を見込むことが望ましいが、特にＰＣＢやダイオキシン類等の多環芳香族塩素化合物に対する十分な分解活性を誘導するためには、多環芳香族塩素化合物を投与して嫌気的条件下で４ケ月以上の期間を見込むことが好ましい。
【００４１】
更に、上記の分解活性を獲得に加え、その分解活性の十分な維持能力（経時的維持能力及び継代における維持能力）をも示す土壌微生物群集を得るには、多環芳香族塩素化合物を投与して、嫌気的条件下で１０ケ月以上（更に好ましくは、１年以上）の期間を見込むことが好ましい。
【００４２】
（第４発明の効果）
本願発明者が得た芳香族塩素化合物分解性の微生物群集の一例については、その微生物群集の構造的特徴として、 Clostridium属の嫌気的微生物を優占種として含むこと、第４発明で前記した（４）及び／又は（５）に該当すること、等が判明している。従ってこの微生物群集は、専ら Dehalococcoides属細菌（前記の非特許文献４、５で報告されたもの）を主体とする微生物群集とは異なるものと考えられる。
【００４３】
（第５発明の効果）
本願発明者が得た芳香族塩素化合物分解性の微生物群集の一例については、その微生物群集における分解反応メカニズム面の特徴として、主反応が芳香環のメタ位及びパラ位における脱塩素反応であることが判明しているので、コプラナーＰＣＢ等の脱塩素反応に好適であると考えられる。
【００４４】
又、芳香族塩素化合物、特に多環芳香族塩素化合物の２塩素化物、３塩素化物、４塩素化物、５塩素化物及び６塩素化物のいずれに対しても有効な脱塩素活性を示すことが判明している。統計的に、ＰＣＢ汚染土壌中では２〜６塩素化ＰＣＢが主体をなすことが分かっているので、この微生物群集は、ＰＣＢ汚染土壌の浄化に極めて好適であると考えられる。
【００４５】
（第６発明の効果）
上記第５発明に係る芳香族塩素化合物分解性の微生物群集は、より具体的には、芳香族塩素化合物の２塩素化物〜６塩素化物に対する脱塩素活性が、第６発明に定義する「脱塩素化率」として、５％以上の値を示す。このように広範囲の芳香族塩素化合物に対して高い脱塩素活性を示す微生物群集は、今までに報告されたことがない。
【００４６】
（第７発明の効果）
本願発明者は、湿地還元層土壌の嫌気性微生物群集に対する上記のような分解活性誘導法によって、第１発明〜第６発明に述べるような優れた分解活性を示す微生物群集を得たが、更にその分解活性を増強し、かつ安定的に維持させる手段を研究する過程で、第７発明の人工培地の開発に成功した。
【００４７】
第７発明の人工培地は、孔隙に富む多孔質材料である人工生息場材を、適宜に組成された任意の微生物培地に添加するものであって、これに対して接種された微生物群集における芳香族塩素化合物に対する分解活性を、少なくとも１０ケ月以上維持させることができる。実際には２年半以上維持させることに成功している。又、この接種により、芳香族塩素化合物に対する分解活性を２倍以上に増強させることに成功している。
【００４８】
（第８発明の効果）
上記の第７発明における人工生息場材を構成する多孔質材料とは、より好ましくは、活性炭、無機質材料製ビーズの集積体又は焼成土である。現在までに集積された実験データから言えば、芳香族塩素化合物の分解活性を有する微生物群集をこのような人工培地に接種した場合に、人工生息場材が無機質材料製ビーズの集積体又は焼成土である場合には微生物群集の分解活性を約２倍に増強させることに成功し、人工生息場材が活性炭（特に第１０発明に係る金属粉混合活性炭）であるには微生物群集の分解活性を約３倍に増強させることに成功している。
【００４９】
（第９発明の効果）
人工生息場材たる多孔質材料は、細孔の平均孔隙径が、１０〜８００μｍの範囲内であることが特に好ましい。平均孔隙径が１０μｍ未満である場合には、必要な微生物の構成種が共生し難くなることが懸念される。一方、平均孔隙径が８００μｍを超える場合には、必要な微生物の構成種以外の微生物群による妨害が起こり易くなることが懸念される。
【００５０】
（第１０発明の効果）
人工培地に接種された微生物群集の分解活性を安定的に維持し及び／又は増強する上で、人工生息場材には金属粉を混合しておくことが、特に好ましい。そのような効果は、人工生息場材としての活性炭に金属粉を混合した場合に特に顕著である。
【００５１】
金属粉を混合することのメリットは、芳香族塩素化合物の脱塩素反応に関して、人工生息場材の表面で電子を供給することができる点にあると考えられる。
【００５２】
（第１１発明の効果）
上記した理由から、人工生息場材に混合する金属粉としては、鉄やチタン等の還元性である金属の粉がとりわけ好ましい。
【００５３】
（第１２発明の効果）
少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物の嫌気的分解活性を有する微生物群集を、第７発明〜第１１発明に係る人工培地に接種して嫌気条件下で培養すると、上記した理由から、微生物群集の芳香族塩素化合物に対する分解活性が更に安定的に維持され、及び／又は、増強された微生物群集組成物を得ることができる。
【００５４】
（第１３発明の効果）
上記した第１２発明の微生物群集組成物においては、より具体的には、接種前に微生物群集が示していた芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性が、接種後１０ケ月以上（好ましい場合には２年半以上）維持され、及び／又は、接種後２倍以上に増強され得る。
【００５５】
（第１４発明の効果）
人工培地に接種する微生物群集は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を有する限りにおいて限定されないが、特に第１発明〜第６発明に係る微生物群集を接種することが好ましい。この場合、特に多環芳香族塩素化合物に対する優れた嫌気的分解活性が、良好に維持され、及び／又は、増強される。
【００５６】
（第１５発明の効果）
上記した第１２発明の場合と同じ理由から、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を、第７発明〜第１１発明に係る人工培地に接種して嫌気的条件下で培養すると言う方法により、接種前における微生物群集の嫌気的分解活性を１０ケ月以上（好ましい場合には２年半以上）維持させ、及び／又は、２倍以上に増強させ得る。
【００５７】
（第１６発明の効果）
上記した第１５発明の方法において、人工培地に接種する微生物群集は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を有する限りにおいて限定されないが、特に第１発明〜第６発明に係る微生物群集を接種することが好ましい。この場合、特に多環芳香族塩素化合物に対する優れた嫌気的分解活性が、良好に維持され、及び／又は、増強される。
【００５８】
（第１７発明の効果）
以上に述べた点から、芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対して、第１発明〜第６発明に係る微生物群集又は第１２発明〜第１４発明に係る微生物群集組成物を散布又は混合すると言う、汚染土壌の優れた浄化方法が提供される。
【００５９】
この方法は、特に、ＰＣＢやダイオキシン類のような多環芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対して好適である。
【００６０】
（第１８発明の効果）
芳香族塩素化合物で汚染された土壌を浄化するに当たり、上記した第１７発明のような方法も有用であるが、一般論として微生物浄化法に共通する処理能力の量的限界を考慮した場合、第１８発明のように当該汚染土壌地域の周囲、及び／又は、底層にバリヤー層を構築し、少なくともバリヤー層の外側への芳香族塩素化合物の拡散を防止する、と言う方法も極めて有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
次に、本願の第１発明〜第１８発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において単に「本発明」と言う時は、第１発明〜第１８発明の内の該当する発明群を一括して指している。
【００６２】
〔微生物群集の取得方法〕
本発明において、芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を示す微生物群集を取得する方法は、微生物群集の採取源として芳香族塩素化合物で汚染されていない湿地還元層土壌の土壌微生物群集を利用する点、及び、このような湿地還元層土壌に芳香族塩素化合物を投与して、嫌気的条件下で土壌中培養する点に特徴がある。
【００６３】
本発明の説明の全体において、「嫌気的条件」とは、要するに酸素遮断条件であれば足り、このような嫌気的条件を維持するための手段としては、限定はされないが、例えば密封培養すること、培地環境の気相を嫌気性ガスに置換すること、培地を湛水すること、等を例示できる。
【００６４】
湿地還元層土壌としては、水田のグライ層土壌が特に好ましいが、その他にも、各種の低湿地、沼地、川床等のグライ層土壌も利用できる。いわゆるグライ層を明確に形成するに到っていない還元層土壌も利用可能である。湿地還元層土壌に投与する芳香族塩素化合物の種類は限定されないが、例えばＰＣＢ又はダイオキシン類を分解ターゲットとする微生物群集を取得したい場合には、これらを投与することが好ましい。湿地還元層土壌に対する芳香族塩素化合物の投与量は適宜に設定することができるが、例えば、０．１〜５０ｐｐｍ程度とすることができる。
【００６５】
非汚染土壌である還元層土壌の土壌微生物群集は、元々、芳香族塩素化合物に対する分解活性を示す場合は少ない。しかし、これに芳香族塩素化合物を投与して嫌気的条件下で一定期間の土壌中培養を行うと、その土壌微生物群集に芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を誘導することができる。土壌中培養を行う期間は、良好な分解活性の誘導のためには、４ケ月以上が好ましい。更に、その分解活性の長期的な経時的維持能力及び継代の繰り返しにおける維持能力をも獲得させる場合には、１０ケ月以上が好ましく、１年以上が更に好ましい。
【００６６】
〔取得される微生物群集〕
上記の方法により本発明に係る芳香族塩素化合物分解性の微生物群集が得られるが、この微生物群集の第１の特徴点は、ＰＣＢやダイオキシン類のような多環芳香族塩素化合物にも有効な分解活性を示す点である。第２の特徴点は、分解反応の主反応として、芳香環のメタ位及びパラ位における脱塩素反応を起こす点である。このような微生物群集は、例えばコプラナーＰＣＢの分解に有利であると考えられる。第３の特徴点は、多環芳香族塩素化合物も含めた芳香族塩素化合物の多様な同族体に対して広範囲な脱塩素活性を示すことであって、より具体的には、芳香族塩素化合物の２塩素化物〜６塩素化物に対する脱塩素活性が、前記した「脱塩素化率」として５％以上の値を示すと言うデータが得られている。
【００６７】
本発明に係る芳香族塩素化合物分解性の微生物群集は、直接顕微鏡法による解析において、長桿菌が優占する共生微生物群集であることが分かっている。一方、ＤＧＧＥ全バンドについてのランダムクローニングによるシーケンス解析によると、少なくとも Clostridium属の嫌気的微生物を、優占種として含む。その他にも、 Dehalococcoides属細菌、Pseudomonas 属細菌、Sedimentbacter属細菌、Peptostreptococcaceas 属細菌、Acetoanaerobacter 属細菌等も検出される場合があるが、これらは培養条件によっても異なる。更に、クロロ安息香酸による嫌気的集積物中や、嫌気的ＴＣＥ脱塩素微生物集積物中から得られた未同定株が検出されている。これらの微生物の一部又は全部が微生物群集の脱塩素活性に関与している可能性がある。更にキノンプロファイル法による微生物群集構造解析においてはメナキノン６，７のみが検出され、主としてδ，ε−サブクラスのプロテオバクテリアに属する微生物からなることが判明している。
【００６８】
次に、本発明に係る微生物群集は、芳香族塩素化合物分解活性を長期的に維持できると言う大きな特徴を持ち、具体的には殺菌土壌に対する５回以上の継代培養を繰り返しても初期分解活性以上の分解活性を維持でき、実際には１５回の継代培養を繰り返しても初期分解活性以上の分解活性を維持できており、更に初期分解活性以上の分解活性を１０ケ月以上（より好ましい場合には２年半以上）維持することができる。
【００６９】
〔人工培地〕
本発明に係る人工培地は、芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を接種するために調製されるものであって、任意の微生物培地と、これに対して添加される人工生息場材とからなる。人工生息場材とは、孔隙に富む多孔質材料である。
【００７０】
多孔質材料の種類は必ずしも限定されないが、活性炭、無機質材料製ビーズの集積体、焼成土等を代表的に例示できる。その他、ゼオライト等の多孔質無機材料、セピオライト等の多孔質粘土鉱物等も例示することができる。これらの多孔質材料は、微細な孔隙の平均孔隙径が１０〜８００μｍの範囲内にあるものが特に好ましく、２００μｍ前後のものがとりわけ好ましい。その点からは、多孔質材料が無機質材料製ビーズの集積体である場合には、ビーズの平均粒子径が５０〜２０００μｍ程度であることが好ましい。
【００７１】
「発明の効果」欄で前記した理由から、人工生息場材たる多孔質材料には、金属の粉粒体、とりわけ鉄やチタン等の粉粒体を混合することが更に好ましい。その他にも、マンガン、亜鉛、ニッケル、銅、コボルト等のいずれかの金属の粉粒体を混合することも好ましい、と考えられる。
【００７２】
上記のように、人工培地は、微生物培地と、これに添加される人工生息場材とからなるが、培地は目的に応じて適宜に組成すれば良く、その組成は何ら限定されない。培地は、微生物群集の栄養源としての酢酸やアンモニア塩、リン酸塩、無機窒素、あるいは一般的にこの種の目的の培地に添加されることがあるビタミン類や微量金属元素を含有することができる。以下に、人工生息場材たる多孔質材料が平均粒子径５００μｍのガラスビーズである場合における、本発明に係る人工培地の好ましい組成の一例を示す。
（人工生息場材）
ガラスビーズ ４〜８ｇ（培地２０ｍＬあたり）
（培地：ｐＨ７．０）
Ｋ２ ＨＰＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．１ｇ（培地１Ｌあたり）
ＦｅＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．０２ｇ（培地１Ｌあたり）
Yeast extract ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-acetate ８ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-lactate １０ｇ（培地１Ｌあたり）
resazurin ０．００１ｇ（培地１Ｌあたり）
〔微生物群集組成物及び微生物群集の活性維持・増強方法〕
以上のように構成される人工培地に、本発明に係る微生物群集、あるいは公知のものも含めてその他の芳香族塩素化合物分解性の適宜な微生物群集を接種し、微生物群集組成物を構成することにより、嫌気的条件下において、その微生物群集の芳香族塩素化合物に対する分解活性を有効に維持させ、及び／又は、増強させることができる。微生物群集の接種法は限定されないが、例えば微生物群集の培養物の土壌懸濁物を接種源とする方法や、培養物上清液を接種すると言う接種法を採用することができる。
【００７３】
本願発明者の実験によれば、この人工培地に接種された微生物群集の芳香族塩素化合物分解活性を、嫌気的条件下において、１０ケ月以上、より好ましい場合には１年以上、特に好ましい場合には２年半以上維持させ得た例があり、更には、分解活性を２倍以上に増強させ得た例がある。
【００７４】
〔汚染土壌の浄化方法又は汚染物質拡散防止方法〕
本発明によれば、以上に述べた各種の微生物群集又は微生物群集組成物を芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対して適用することにより、優れた浄化効果を期待することができる。具体的な適用方法としては、例えば微生物群集又は微生物群集組成物を汚染土壌に対して散布し、又は混合することができる。
【００７５】
あるいは、芳香族塩素化合物で汚染された土壌地域の周囲の土壌中に微生物群集又は微生物群集組成物を含む上下方向のバリヤー層を構築し、及び／又は汚染土壌地域の底層の土壌中に微生物群集又は微生物群集組成物を含む水平方向のバリヤー層を構築し、バリヤー層の外側への芳香族塩素化合物の拡散を防止することもできる。
【実施例】
【００７６】
次に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は、以下の実施例によって限定されるものではない。
【００７７】
〔実施例１：芳香族塩素化合物分解性の微生物群集の取得〕
芳香族塩素化合物非汚染水田より中粗粒強グライ土壌を採取した。採取直後の土壌はＰＣＢ分解活性をほとんど示さなかった。
【００７８】
上記の中粗粒強グライ土壌に対し、鐘淵化学工業製のＰＣＢ剤であるカネクロール３００（商標）及びカネクロール４００（商標）の重量比１：１の混合物を、ＰＣＢ全体で約５０ｐｐｍとなるように添加した。上記のＰＣＢ剤混合物には、塩素結合数が２〜７にわたる多様なＰＣＢ同族体が含まれている。
【００７９】
上記のＰＣＢ添加土壌を嫌気的条件下（窒素置換嫌気ボトル中）で約４ケ月間の長期液体培養に供したところ、様々なＰＣＢ同族体が同時に分解される活性が見出された。即ち、上記の嫌気的条件下での長期土壌培養により、約４ケ月の経過時点で（あるいはそれ以前の時点で）、ＰＣＢの多様な同族体に対する嫌気的分解活性を示す微生物群集が、土壌中微生物群として得られた。この微生物群集のＰＣＢ分解活性を図１に示す。
【００８０】
図１中、図１（ａ）に示す３本の横向きの棒グラフのうち、上側の棒グラフが、上記した土壌中微生物群が殺菌土壌培地を用いた１５回の継代培養で示した脱塩素化率の平均値（６．８％）である。図１（ａ）の中央の棒グラフは、比較のために示したもので、上記した土壌中微生物群が、焼成土を人工生息場材とする人工培地を用いた１５回の継代培養で示した脱塩素化率の平均値（３０．８％）である。図１（ａ）の下側の棒グラフも比較のために示したもので、上記した土壌中微生物群が、粒径０．５ｍｍのガラスビーズを人工生息場材とする人工培地を用いた１５回の継代培養で示した脱塩素化率の平均値（３７．１％）である。これらの棒グラフでは、エラーバーによる全変動も併せて示した。
【００８１】
図１中、図１（ｂ）に示す多数本の横向きの棒グラフは、上記の図１（ａ）の上側の棒グラフで示す平均値のオリジナルデータであって、上記の内の第３回目以降の継代培養におけるそれぞれの脱塩素化率を上側より順に示している。ほぼ中央に棒グラフが認められないスペースがあるが、これは第９回目の継代培養に相当し、各ＰＣＢ同族体の分解活性は得られているが、幾つかの低塩素化物の蓄積が見られたため、全体として、脱塩素化率及び分解率が低く見積もられているためである。
【００８２】
本実施例及び後述の各実施例におけるＰＣＢの測定は、培養物からＰＣＢを抽出し、電子捕獲型検出器付ガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＥＣＤ）で分析することにより行った。又、ＰＣＢの分解活性は、培養物における培養開始前と培養後の全ＰＣＢ回収量の対比により判定した。
【００８３】
〔実施例２：微生物群集の継代培養〕
実施例１で用いたと同様の水田土壌４ｇを、オートクレーブ中で１２１°Ｃ×３０分の熱処理を毎日１回、３日間繰り返すと言う殺菌処理に供し、実施例１と同じＰＣＢ剤混合物を５ｐｐｍ添加したもとで、これを炭素源を含む液体培地で飽和した全２０ｍＬの植継ぎ用培地を準備した。この植継ぎ用培地に対して実施例１で得られた微生物群集を含む土壌培地１ｍＬを接種する植継ぎを行った後、実施例１と同様の条件で嫌気培養し、ＰＣＢに対する嫌気的分解活性の維持・増強（ＰＣＢ分解性微生物の集積）を検討した。更に、同じ要領で、新たに準備した上記と同様の全２０ｍＬのＰＣＢ添加植継ぎ用培地に対して前培養物の一部を接種する植継ぎを繰り返す継代培養を行った。
【００８４】
それらの植継ぎ培養の結果、一般的に植継ぎ後８週間を経過しても植継ぎ前と同等のＰＣＢ分解活性が確認された。又、添加ＰＣＢ全量に対する減少量もほぼ一定値を示した。更に、特定の２系統については、現在の処、１５回の継代培養でほぼ２年半の間のＰＣＢ分解活性維持に成功している。
【００８５】
上記の植継ぎ培養においては、下記１）〜６）の条件を種々に変化させた場合について検討した。
１）植継ぎ用培地の炭素源として乳酸、酢酸又はグルコースを用いた場合。
２）脱塩素反応に配慮して植継ぎ用培地の性質（酸化還元電位）をシステイン塩酸塩、チオグリコール酸又は硫化ナトリウムの添加により変化させた場合。
３）植継ぎ用培地に対する土壌中微生物群の接種量を０．１〜１０ｍＬの範囲内で変更した場合。
４）植継ぎ後の培養温度を、４〜３０°Ｃの範囲内での種々の一定温度に設定した場合。
５）培養期間をそれぞれ１４日、２８日、５６日に設定した場合。
６）培養条件として、振とう培養又は静置培養を行った場合。
【００８６】
上記の１）〜６）のように各種の条件を変化させても、ＰＣＢに対する嫌気的分解活性は基本的に大差なく維持されていた。即ち、種々の植継ぎ培養条件において、実施例１に係る微生物群集のＰＣＢ嫌気的分解活性を維持することに成功した。上記の植継ぎ培養の各種条件の内、あえて最適な条件を幾つか絞り込むと、次のａ）〜ｃ）の通りであった。
ａ）植継ぎ用培地全２０ｍＬに対して、前培養物を１ｍＬ程度接種する。
ｂ）植継ぎ用培地に炭素源は必要で、特に乳酸及び／又は酢酸が優れる。
ｃ）還元剤無添加で、３０°Ｃ程度での８週間程度の嫌気的培養を行う。
【００８７】
〔実施例３：実施例２の継代培養の結果及び考察〕
実施例２で１５回の継代培養（各８週間）により約２年半近いＰＣＢ分解活性維持に成功している系統について、各継代培養でのＰＣＢの分解活性を図２に示す。図２においては、継代回数を横軸に示し、縦軸にその継代培養における培養後の（８週間経過後の）全ＰＣＢ残留率を示した。この培養後全ＰＣＢ残留率は培養前の全ＰＣＢ回収量に対する培養後全ＰＣＢ残留量のパーセンテージで示した。培養期間中、ＰＣＢの１０％未満の土壌吸着が認められた。図２において、第９回目の継代培養での全ＰＣＢ残留率が１００％前後となっているのは、前記の図１（ｂ）の場合と同じ理由で、分解は起こっているものの分解率が低く見積もられているためである。
【００８８】
図２から分かるように、全体として２年半近くにわたり、かつ１５回の継代にわたり、当初見られたＰＣＢ分解活性と同等以上の活性が維持されている。但し、継代培養を重ねるにつれて分解活性が向上して行く傾向は見られなかった。このことは、別の見地からは、植継ぎにおける微生物群集の安定性を意味しており、環境接種の際に土着菌との競合に耐えてＰＣＢ分解活性を安定的に再現できる可能性を示唆している。
【００８９】
〔実施例４：微生物群集の構造解析〕
実施例２における継代８週間経過後の微生物群集につき、キノンプロファイル法により群集構造解析を行ったところ、メナキノン６，７のみが検出された。従って、継代維持されている微生物群集は、主としてδ，ε−サブクラスのプロテオバクテリアに属する微生物からなることが分かった。
【００９０】
同時にＰＣＲ−ＤＧＧＥ（polymerase chain reaction-denaturing gradient
gel electrophoresis ）法による解析も行い、各バンドについてランダムクローニングによるシーケンス解析を行い、微生物群集の解析も行った。それによると、少なくとも Clostridium属の嫌気的微生物を優占種として含み、その他にも、 Dehalococcoides属細菌、Pseudomonas 属細菌、Sedimentbacter属細菌、Peptostreptococcaceas 属細菌、Acetoanaerobacter 属細菌等も検出される場合があったが、条件によってその結果は異なった。更に、クロロ安息香酸による嫌気的集積物中や、嫌気的ＴＣＥ脱塩素微生物集積物中から得られた未同定株が検出された。
【００９１】
〔実施例５：微生物群集用人工培地〕
上記の実施例１〜実施例４では殺菌土壌を用いて継代培養を行ったが、微生物群集のＰＣＢに対する嫌気的分解活性が長期安定的に維持される一方、その分解活性が顕著に向上することはなかった。そこで、微生物群集のＰＣＢ分解活性を更に顕著に向上させる人工培地の開発を試みた。
【００９２】
（実施例５−１：ガラスビーズ及び焼成土）
人工培地の人工生息場材として、粒径０．５ｍｍのガラスビーズ（の集積体）と、実施例１で用いたと同様の水田土壌に対して５５０°Ｃで２４時間の焼成を行った焼成土とを用いた。これらの人工培地の組成は下記に示す。そして、前記した殺菌土壌と同量のこれら人工培地（液体培地）に対して実施例１と同濃度にＰＣＢ剤混合物を添加したもとで、前記した殺菌土壌の場合と同様に、実施例１で得られた微生物群集を含む土壌の一部を接種する植継ぎを行い、嫌気的条件下での継代培養を繰り返した。
【００９３】
〔工生息場材としてガラスビーズを用いた人工培地の組成〕
（人工生息場材）
ガラスビーズ ４〜８ｇ（培地２０ｍＬあたり）
（培地：ｐＨ７．０）
Ｋ２ ＨＰＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．１ｇ（培地１Ｌあたり）
ＦｅＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．０２ｇ（培地１Ｌあたり）
Yeast extract ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-acetate ８ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-lactate １０ｇ（培地１Ｌあたり）
resazurin ０．００１ｇ（培地１Ｌあたり）。
【００９４】
〔人工生息場材として焼成土を用いた人工培地の組成〕
（人工生息場材）
焼成土 ４〜８ｇ（培地２０ｍＬあたり）
（培地：ｐＨ７．０）
Ｋ２ ＨＰＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．１ｇ（培地１Ｌあたり）
ＦｅＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．０２ｇ（培地１Ｌあたり）
Yeast extract ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-acetate ８ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-lactate １０ｇ（培地１Ｌあたり）
resazurin ０．００１ｇ（培地１Ｌあたり）。
【００９５】
継代培養における培養期間を５６日（８週間）とした場合における、１回目及び６〜８回目の継代培養でのＰＣＢの分解活性を図３に示す。図３では継代回数を横軸に示し、縦軸にその継代培養における培養後の全ＰＣＢ残留率を示した。この全ＰＣＢ残留率は培養前の全ＰＣＢ回収量に対する培養後全ＰＣＢ残留量のパーセンテージで示した。
【００９６】
なお、図３に示す各回の継代培養において、左側の棒グラフは人工生息場材としてガラスビーズを用いた場合の、中央の棒グラフは人工生息場材として焼成土を用いた場合の、それぞれ全ＰＣＢ残留率である。又、右側の棒グラフは比較として実施例２と同様の方法で殺菌土壌を用いた場合のデータを再度示したものである。図３から、継代培養の培地として殺菌土壌を用いた場合に比較して、人工培地を用いた場合には全ＰＣＢ残留率が著しく低い（微生物群集のＰＣＢ分解活性が著しく増強されている）ことが分かる。なお、培養期間中、ＰＣＢのガラスビーズへの吸着率は１５％未満であった。
【００９７】
次に、図４に、上記した第１回〜第８回の各継代培養における８週間経過後の塩素結合数別ＰＣＢに対する分解活性の平均値を示す。図４において、左側のブロックの棒グラフは継代培養の培地として実施例２のように殺菌土壌を用いた場合のものであり、中央のブロックの棒グラフは、継代培養の培地として上記の粒径０．５ｍｍのガラスビーズを人工生息場材とする人工培地を用いた場合のものであり、右側のブロックの棒グラフは、継代培養の培地として上記の焼成土を人工生息場材とする人工培地を用いた場合のものである。又、図４において、上下方向が塩素結合数別ＰＣＢの量的な増加又は減少のパーセンテージを示し、各ブロックの棒グラフは、左側から順に、結合塩素数がそれぞれ２、３、４、５、６、７であるＰＣＢを示す。
【００９８】
図４から分かるように、中央及び右側のブロックの棒グラフにおけるＰＣＢの減少は、左側のブロックの棒グラフに比較して顕著であり、かつ、塩素結合数３〜５のＰＣＢが減少し、特に塩素結合数３、４のＰＣＢが顕著に減少している。その結果として、塩素結合数２のＰＣＢが相対的に増大しているが、その増大量が塩素結合数３〜５のＰＣＢの減少と見合わないことから、２塩素化物〜５塩素化物のいずれに対しても有効な脱塩素活性を示すことが認められた。又、６塩素化物も、一定の有意な減少を示している。
【００９９】
一方、上記で用いた粒径０．５ｍｍのガラスビーズの他に、粒径０．０５ｍｍ及び粒径２．０ｍｍのガラスビーズを人工培地の人工生息場材として用い、同上の継代培養を行った。しかし、これら０．５ｍｍ以外の粒径のガラスビーズを人工生息場材として用いた人工培地での継代培養では、継代を３〜４回繰り返す内に活性が次第に低減する傾向が見られた。ところが、一旦粒径０．５ｍｍのガラスビーズを人工生息場材として用いた人工培地で活性維持に成功した培養物を、異なる粒径（０．０５ｍｍ及び２．０ｍｍ）のガラスビーズを人工生息場材として用いた人工培地へ植継ぎ（異径ガラスビーズ人工培地への植継ぎ）を行うと、活性を低減させることなく維持できることを見出した。又、これらの異径ガラスビーズ人工培地への植継ぎにおいては、植継ぎ後５６日間の培養でも、植継ぎ後３２日間の培養でも、同等に高い活性を維持できることが分かった。それら異径ガラスビーズ人工培地への植継ぎの場合の、図３と同じ計算方法及び表記方法による全ＰＣＢ残留率を、図５に示す。図５に示す各棒グラフは、左端のものから順に、「ガラスビーズなし（人工生息場材を含まない培地）で培養期間が３２日」の場合（人工生息場材を含まない培地）、「粒径２．０ｍｍのガラスビーズ使用で培養期間が３２日」の場合、「粒径０．５ｍｍのガラスビーズ使用で培養期間が３２日」の場合、「粒径０．０５ｍｍのガラスビーズ使用で培養期間が３２日」の場合、「粒径０．５ｍｍのガラスビーズ使用で培養期間が５６日」の場合、をそれぞれ示す。机上の計算上、粒径０．５ｍｍのガラスビーズの集積体において形成される細孔の平均孔隙径は２００μｍであり、粒径２．０ｍｍのガラスビーズの集積体において形成される細孔の平均孔隙径は８００μｍである。
【０１００】
なお、これらの人工培地を用いた場合の継代培養後の微生物群集をキノンプロファイル法で解析すると、ガラスビーズを人工生息場材とする人工培地においては全てのサンプルでメナキノン−７（Ｈ２）のみが、焼成土を人工生息場材とする人工培地では全てのサンプルでメナキノン−７のみが、それぞれ検出された。即ち、実施例２の殺菌土壌での継代培養の場合とは、微生物群集の構成にも変化を生じていることが示唆された。
【０１０１】
（実施例５−２：金属粉混合活性炭）
人工培地の人工生息場材として、金属粉混合活性炭を用いた。即ち、活性炭に微生物群集を定着させるため、実施例５−１に従って粒径０．５ｍｍのガラスビーズの集積体を人工生息場材とする人工培地による継代培養を行った培養物を接種源とし、鉄粉５０重量％を混合した固形の鶏糞活性炭１粒（約３ｃｍ：ＴＹＫ株式会社製）を前記のガラスビーズ集積体人工培地に入れた後、この培地に実施例１と同濃度に前記のＰＣＢ剤混合物を添加したもとで、嫌気条件下に４週間培養した。
【０１０２】
継代培養は、培養後の前記固形活性炭を嫌気条件下でピンセットを用いて取り出し、そのまま新しいガラスビーズ培地へ再添加することにより行った。なお、人工培地たる活性炭の強いＰＣＢ吸着能を考慮し、微生物群集を含まない前記活性炭粒子を添加した継代培地をコントロールとした。
【０１０３】
これらの実施例及びコントロールにおける、図３と同じ計算方法及び表記方法による全ＰＣＢ残留率を、図６に示す。図６の各棒グラフは、左端のものから順に、コントロールの場合、本実施例の１継代目の場合、本実施例の３継代目の場合、本実施例の４継代目の場合及び本実施例の５継代目の場合である。
【０１０４】
４継代目及び５継代目での全ＰＣＢ残留率が非常に低いことが、注目される。４週間培養後における活性炭へのＰＣＢ吸着率は３７．８％と高いが、コントロールでは全ＰＣＢ量が減少していたのに対して、継代培養したものでは下記の図７のようにＰＣＢ種も異なることから、微生物活性が集積したものと考えることができる。
【０１０５】
本実施例における結合塩素数別のＰＣＢ同族体の吸着率と残留率の比較を図７に示す。図７において縦軸の数値表示はＰＣＢ量（ｎｇ／sample）を示す。図の下方の「２Ｃｌ」、「３Ｃｌ」等の表記は結合塩素数によるＰＣＢ同族体のグループ区別を示す。各グループ区別内における「６」、「８」、「１２」等の数字表記はＰＣＢの同族体番号（＃）を示し、例えば「２０／３３／４５」と言う数字表記は、＃２０、＃３３、＃４５の混合ピークであることを示す。これらの各数字表記ごとに示された各３組の棒グラフは、左側から順に、「通常の場合」、「コントロールの場合」、及び「本実施例の場合」における結果を示す。図７から分かるように、結合塩素数が３又は４であるＰＣＢの消失率が高く、これは本発明に係る微生物群集に固有の傾向である。
【０１０６】
本実施例において活性炭に鉄粉を混合したことの影響については、人工生息場材である活性炭の表面において鉄粉が電子を供給することで、脱塩素反応に有利である、と考えることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本願発明によって、多環芳香族塩素化合物の広範囲な同族体に対して優れた嫌気的分解活性を示し、しかもその分解活性を安定的に維持できる微生物群集が提供される。更に、このような微生物群集の分解活性の更なる維持・増強に有効な人工培地も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】実施例１に係る微生物群集のＰＣＢ分解活性を示す図である。
【０１０９】
【図２】実施例２に係る各継代培養でのＰＣＢの分解活性を示す図である。
【０１１０】
【図３】実施例５−１に係る継代培養でのＰＣＢ分解活性を示す図である。
【０１１１】
【図４】実施例５−１に係る継代培養でのＰＣＢ脱塩素活性を示す図である。
【０１１２】
【図５】実施例５−１に係る継代培養でのガラスビーズの粒径別、培養期間別の全ＰＣＢ残留率を示す図である。
【０１１３】
【図６】実施例５−２における継代培養での全ＰＣＢ残留率を示す図である。
【０１１４】
【図７】実施例５−２におけるＰＣＢ同族体の吸着率と残留率の比較を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種のＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）やいわゆるダイオキシン類等の芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集に関する。更に、本発明は、このような微生物群集の分解活性の維持・増強に有効な人工培地と、この人工培地に上記の微生物群集を接種してなる微生物群集組成物とに関する。更に、本発明は、芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対する上記の微生物群集や微生物群集組成物の有効な利用に関する。
【０００２】
なお「ダイオキシン類」とは、社会通念に従い、ポリ塩化ベンゾパラジオキシン（慣用名ダイオキシン）やポリ塩化ベンゾフラン（ＰＣＤＦ）を言う。ＰＣＢの内、コプラナーＰＣＢ（Ｃｏ−ＰＣＢ： 2,6−位に塩素が結合していない平面性ＰＣＢ）も「ダイオキシン類」に含まれる。ＰＣＢやダイオキシン類等の多環芳香族塩素化合物（芳香環を２つ又はそれ以上持つ芳香族塩素化合物）は、芳香族塩素化合物の内でも、とりわけ難分解性である。
【背景技術】
【０００３】
周知のように、ＰＣＢやダイオキシン類によって代表される芳香族塩素化合物は生物毒性のある合成化学物質であるが、物理化学的に非常に安定であるため、環境中における長期残留問題を引き起こしている。
【０００４】
近年、芳香族塩素化合物を高濃度に含有する土砂等の廃棄物に対して、物理・化学的方法を中心に各種の処理技術の開発が進められている。一方、芳香族塩素化合物の排出源とは直接に関係しない通常の土壌中にも、主に河床や底質層等の嫌気的環境において、低濃度ではあるがＰＣＢ等の芳香族塩素化合物が広範囲に残留している。そして、これらが種々の経路を通じて生物体へ高濃度に蓄積することが懸念されている。
【０００５】
土壌中等に低濃度に残留するＰＣＢ等の浄化に当たっては、いわゆるバイオレメディエーション等の微生物分解技術が期待されている。これらの微生物分解技術においては、要するに、多様な微生物からなる微生物群集が土壌中で芳香族塩素化合物の嫌気的分解（少なくとも脱塩素反応）を行うものと理解される。そして、土壌中での低濃度汚染物質の浄化と言う点を考えたとき、原位置浄化が可能で設備投資も少なくて済む微生物分解技術は、コスト的に有利である。
【０００６】
芳香族塩素化合物に対する微生物分解技術に関する従来技術としては、例えば以下の非特許文献１〜非特許文献５又は特許文献１を挙げることができる。
【０００７】
下記の非特許文献１、非特許文献２には嫌気性ＵＳＡＢ（ Upflow Anaerobic
Sludge Blanket）反応装置によるＰＣＢ嫌気性分解の報告がある。但し、その嫌気性分解を行う微生物は特定されていない。
【０００８】
【非特許文献１】Natarajan, M. et al., "Dechlorination of spikedPCBs in lake sediment by anaerobic microbial granules" Water Res, 32,3013-3020(1998)
【非特許文献２】Nollet, H. et al., "Carbon/electron sourcedependense of polychlorinated biphenyl dechlorination pathways foranaerobic granules" Chemosphere, 58, 299-310(2005) 下記の非特許文献３その他の幾つかの報告において、芳香族塩素化合物の嫌気的分解活性を持つ微生物群集が報告されている。但し、いずれの報告においても微生物群集の分解活性の安定的な維持に関しては困難を伴っている様子であり、その後の発表がない。
【０００９】
【非特許文献３】Mohn, N. W. et al., "Microbial reductivedehalogenation" Microbial Rev., 56, 482-507(1992) 下記の非特許文献４、非特許文献５においてはＰＣＥ（テトラクロロエチレン）やクロロベンゼンの脱塩素活性を持つ Dehalococcoides属細菌がＰＣＢの幾つかの同族体を脱塩素することを報告している。但し、それらの同族体は、例えば 2,3,4,5,6-PeCB 等の、片側のフェニル基のみに塩素が結合したタイプのものに限られている。
【００１０】
【非特許文献４】Fennel, D. E. et al., "Dehalococcoidesethanogenes Strain195 reductively dechlorinates diverse ChlorinatedAromatic pollutants" Environ. Sci. Technol., 38, 2075-2081(2004)
【非特許文献５】Adrian, L. et al., "Bacterial dehaloresirationwith Chlorinated benzenes" Nature, 408, 580-583(2000) 下記の特許文献１には、難分解性の有機塩素農薬ＰＣＮＢを分解する好気性細菌ブルクホルデリアセパシアを、砕片化多孔質材に集積させる技術が開示されている。但し、この細菌が多環芳香族塩素化合物であるＰＣＢやダイオキシン類の分解に有効か否かは不明である。又、好気性細菌は還元的な環境の多い汚染土壌の浄化には使用し難いと考えられる。
【００１１】
【特許文献１】特開平 11-318435（特願平 10-135156）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記の非特許文献１〜非特許文献５や特許文献１からも伺われるように、芳香族塩素化合物の微生物分解技術に関しては、嫌気性微生物について不明な点が多く、脱塩素反応の詳しいメカニズムは未だ明らかでない。そのため、次のような幾つかの大きな問題点が指摘される。
【００１３】
（１）芳香族塩素化合物、とりわけ難分解性であるＰＣＢやダイオキシン類等の多環芳香族塩素化合物に対して、単独で十分な分解活性を示すスーパー菌株の存在は未だ報告されていない。このようなスーパー菌株が分離される可能性を否定するものではないが、そのような菌株を実際に特定し分離することは、容易ではないと考えられる。
【００１４】
（２）従って、差し当たり、これらの化合物に対して全体として分解活性を示す微生物群集を取得して利用することが現実的である。その場合でも、芳香族塩素化合物、特に多環芳香族塩素化合物に対して十分な分解活性を持つ微生物群集はほとんど報告されていない。そして、このような微生物群集を取得できた場合においても、恐らくはその微生物群集における個々の微生物種の経時的な消長等のために、微生物群集の分解活性を安定的に維持することが困難である。
【００１５】
（３）更に、汚染土壌中の芳香族塩素化合物としては、芳香族骨格構造に対する結合塩素数や結合位置が異なる多様な同族体が混在しているのが通常である。例えばＰＣＢには２０９種類の同族体があり得る。ＰＣＢ分解活性があるとする微生物群集の従来の報告例は、塩素の結合位置等が限定された一部の同族体についてのみの分解活性の報告であり、このような限定のない広範囲な同族体に対して分解活性を示す微生物群集は、未だ報告されていない。
【００１６】
そこで本発明は、芳香族塩素化合物に対し、特に多環芳香族塩素化合物に対し、更にはこれらの広範囲な同族体に対して優れた嫌気的分解活性を示し、かつ、その分解活性を安定的に維持することができる微生物群集を提供することを目的とする。又、本発明は、このような微生物群集の分解活性の更なる維持・増強に有効な人工培地と、この人工培地に微生物群集を接種してなる微生物群集組成物とを提供することを目的とする。更に、本発明は、芳香族塩素化合物により汚染された土壌に対する上記微生物群集や微生物群集組成物の有効な利用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、芳香族塩素化合物で汚染されていない湿地還元層土壌の土壌微生物群集に芳香族塩素化合物を投与し、嫌気的条件下で土壌中培養することにより得られる微生物群集であって、下記（１）の分解活性を示し、更に下記（２）及び／又は（３）に該当する分解活性維持能力を示すものである、微生物群集である。
（１）少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を示す。
（２）殺菌土壌に対する５回以上の継代培養を繰り返しても初期分解活性以上の分解活性を維持できる。
（３）初期分解活性以上の分解活性を１０ケ月以上維持できる。
【００１８】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係る土壌微生物群集が水田のグライ層土壌の土壌微生物群集である、微生物群集である。
【００１９】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る（１）の分解活性を示す土壌微生物群集が、前記土壌中培養を４ケ月以上行うことにより得られるものであり、前記第１発明又は第２発明に係る（１）〜（３）の分解活性及び分解活性維持能力を示す土壌微生物群集が、前記土壌中培養を１０ケ月以上行うことにより得られるものである、微生物群集である。
【００２０】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集であって、優占種として少なくとも Clostridium属の嫌気的微生物を含み、かつ、以下の（４）及び／又は（５）に該当する、微生物群集である。
（４）キノンプロファイル法による微生物群集構造解析においてメナキノン６，７のみが検出される。
（５）主として、δ，ε−サブクラスのプロテオバクテリアに属する微生物からなる。
【００２１】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集であって、その分解反応の主反応として芳香環のメタ位及びパラ位における脱塩素反応を起こし、かつ、汚染土壌中で検出される芳香族塩素化合物の主体をなす２塩素化物〜６塩素化物のいずれに対しても脱塩素活性を示す、微生物群集である。
【００２２】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第５発明に係る芳香族塩素化合物の２塩素化物〜６塩素化物に対する脱塩素活性が、下記の式に定義する脱塩素化率として５％以上の値を示すものである、微生物群集である。
脱塩素化率（％）＝〔１−（培養後全塩素化量／培養前全塩素化量）〕×100
（上記の式において、「全塩素化量」は、培地中の芳香族塩素化合物の２、３、４、５、６塩素化物のそれぞれの含有量を2P、3P、4P、5P、6Pであると規定した場合、（2P×２）、（3P×３）、（4P×４）、（5P×５）、（6P×６）の総和で与えられる。又、「培養前全塩素化量」、「培養後全塩素化量」とは、それぞれ、微生物群集の培養開始直前及び５６日間の培養後における培地の全塩素化量を言う。）
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を接種するために調製される人工培地であって、任意の微生物培地と、これに対して添加される、孔隙に富む多孔質材料である人工生息場材とからなり、接種された微生物群集の嫌気的分解活性を１０ケ月以上維持させ、及び／又は、２倍以上に増強させることができるものである、人工培地である。
【００２３】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、前記第７発明に係る多孔質材料が、活性炭、無機質材料製ビーズの集積体又は焼成土である、人工培地である。
【００２４】
ここにおいて、「無機質材料製ビーズの集積体」とは、ガラスやセラミックス等の無機質材料からなる球状又はこれに近似した形状のビーズ粒子が多数集積したもので、多数のビーズ粒子間の孔隙が結果的に細孔を構成している多孔質体を言う。その際、多数のビーズ粒子は流動可能に集積していても構わない。
【００２５】
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、前記第７発明又は第８発明に係る多孔質材料の平均孔隙径が１０〜８００μｍの範囲内である、人工培地である。
【００２６】
（第１０発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、前記第７発明〜第９発明のいずれかに係る多孔質材料に金属粉が混合されている、人工培地である。
【００２７】
（第１１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１１発明の構成は、前記第１０発明に係る金属粉が鉄粉又はチタン粉である、人工培地である。
【００２８】
（第１２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１２発明の構成は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を、第７発明〜第１１発明のいずれかに係る人工培地に接種して嫌気条件下で培養したものである、微生物群集組成物である。
【００２９】
（第１３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１３発明の構成は、前記第１２発明に係る微生物群集の嫌気的分解活性が接種後１０ケ月以上維持され、及び／又は、接種後２倍以上に増強されている、微生物群集組成物である。
【００３０】
（第１４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１４発明の構成は、前記第１２発明又は第１３発明において規定された微生物群集が、第１発明〜第６発明のいずれかに係る微生物群集である、微生物群集組成物である。
【００３１】
（第１５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１５発明の構成は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を、第７発明〜第１１発明のいずれかに係る人工培地に接種して嫌気的条件下で培養することにより、接種前における微生物群集の嫌気的分解活性を１０ケ月以上維持させ、及び／又は、２倍以上に増強させる、微生物群集の活性維持・増強方法である。
【００３２】
（第１６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１６発明の構成は、前記第１５発明において規定された微生物群集が、第１発明〜第６発明のいずれかに係る微生物群集である、微生物群集の活性維持・増強方法である。
【００３３】
（第１７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１７発明の構成は、芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対して、第１発明〜第６発明のいずれかに係る微生物群集又は第１２発明〜第１４発明のいずれかに係る微生物群集組成物を散布又は混合する、汚染土壌の浄化方法である。
【００３４】
（第１８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１８発明の構成は、芳香族塩素化合物で汚染された土壌地域に対して、第１発明〜第６発明のいずれかに係る微生物群集又は第１２発明〜第１４発明のいずれかに係る微生物群集組成物を含むバリヤー層を、当該土壌地域の周囲の土壌中に上下方向に構築し、及び／又は、当該土壌地域の底層の土壌中に水平方向に構築し、前記バリヤー層の外側への芳香族塩素化合物の拡散を防止する、土壌汚染物質の拡散防止方法である。
【発明の効果】
【００３５】
（第１発明の効果）
第１発明では、まず土着の優れた嫌気性微生物群集に着目し、これに対して嫌気的条件下に芳香族塩素化合物培地を提供して、有効な分解活性を誘導する。
【００３６】
従来、例えばＰＣＢ分解活性を有する微生物又は微生物群集を採取しようとする場合には、ＰＣＢ高濃度汚染土壌を採取源とするのが常識的である。しかし、例えば水田のグライ層土壌のように良好な還元状態にある土壌であって、しかもＰＣＢ等で高濃度に汚染された土壌は見出し難いと考えられる。
【００３７】
このような点からは、微生物群集の採取源として従来のようにＰＣＢ高濃度汚染土壌に着目するよりも、むしろ、非汚染土壌であっても良好な還元状態にある土壌の微生物群集（優れた潜在能力を有する嫌気性微生物群集）に着目し、これに対して芳香族塩素化合物の分解活性を誘導すると言う方法が、効率的／合理的であると考えることができる。本願発明者は、第１発明として、このような方法を試みた結果、多環芳香族塩素化合物を含む種々の芳香族塩素化合物に対する優れた分解活性を示す土壌微生物群集を得ることができた。
【００３８】
しかも、こうして得られた微生物群集は、従来からの大きな問題であった嫌気的分解活性の獲得及びその分解活性の長期的維持について、第１発明の（１）、（２）、（３）に示すように非常に優れた特性を有するものであった。
【００３９】
（第２発明の効果）
本発明では微生物群集の採取源として湿地還元層土壌を用いるが、そのような土壌としては、低湿地や沼地等のグライ層土壌、例えば水田のグライ層土壌等が好ましく例示される。
【００４０】
（第３発明の効果）
湿地還元層土壌の微生物群集に対して芳香族塩素化合物の分解活性を誘導するには、ある程度の誘導期間（土壌中培養期間）を見込むことが望ましいが、特にＰＣＢやダイオキシン類等の多環芳香族塩素化合物に対する十分な分解活性を誘導するためには、多環芳香族塩素化合物を投与して嫌気的条件下で４ケ月以上の期間を見込むことが好ましい。
【００４１】
更に、上記の分解活性を獲得に加え、その分解活性の十分な維持能力（経時的維持能力及び継代における維持能力）をも示す土壌微生物群集を得るには、多環芳香族塩素化合物を投与して、嫌気的条件下で１０ケ月以上（更に好ましくは、１年以上）の期間を見込むことが好ましい。
【００４２】
（第４発明の効果）
本願発明者が得た芳香族塩素化合物分解性の微生物群集の一例については、その微生物群集の構造的特徴として、 Clostridium属の嫌気的微生物を優占種として含むこと、第４発明で前記した（４）及び／又は（５）に該当すること、等が判明している。従ってこの微生物群集は、専ら Dehalococcoides属細菌（前記の非特許文献４、５で報告されたもの）を主体とする微生物群集とは異なるものと考えられる。
【００４３】
（第５発明の効果）
本願発明者が得た芳香族塩素化合物分解性の微生物群集の一例については、その微生物群集における分解反応メカニズム面の特徴として、主反応が芳香環のメタ位及びパラ位における脱塩素反応であることが判明しているので、コプラナーＰＣＢ等の脱塩素反応に好適であると考えられる。
【００４４】
又、芳香族塩素化合物、特に多環芳香族塩素化合物の２塩素化物、３塩素化物、４塩素化物、５塩素化物及び６塩素化物のいずれに対しても有効な脱塩素活性を示すことが判明している。統計的に、ＰＣＢ汚染土壌中では２〜６塩素化ＰＣＢが主体をなすことが分かっているので、この微生物群集は、ＰＣＢ汚染土壌の浄化に極めて好適であると考えられる。
【００４５】
（第６発明の効果）
上記第５発明に係る芳香族塩素化合物分解性の微生物群集は、より具体的には、芳香族塩素化合物の２塩素化物〜６塩素化物に対する脱塩素活性が、第６発明に定義する「脱塩素化率」として、５％以上の値を示す。このように広範囲の芳香族塩素化合物に対して高い脱塩素活性を示す微生物群集は、今までに報告されたことがない。
【００４６】
（第７発明の効果）
本願発明者は、湿地還元層土壌の嫌気性微生物群集に対する上記のような分解活性誘導法によって、第１発明〜第６発明に述べるような優れた分解活性を示す微生物群集を得たが、更にその分解活性を増強し、かつ安定的に維持させる手段を研究する過程で、第７発明の人工培地の開発に成功した。
【００４７】
第７発明の人工培地は、孔隙に富む多孔質材料である人工生息場材を、適宜に組成された任意の微生物培地に添加するものであって、これに対して接種された微生物群集における芳香族塩素化合物に対する分解活性を、少なくとも１０ケ月以上維持させることができる。実際には２年半以上維持させることに成功している。又、この接種により、芳香族塩素化合物に対する分解活性を２倍以上に増強させることに成功している。
【００４８】
（第８発明の効果）
上記の第７発明における人工生息場材を構成する多孔質材料とは、より好ましくは、活性炭、無機質材料製ビーズの集積体又は焼成土である。現在までに集積された実験データから言えば、芳香族塩素化合物の分解活性を有する微生物群集をこのような人工培地に接種した場合に、人工生息場材が無機質材料製ビーズの集積体又は焼成土である場合には微生物群集の分解活性を約２倍に増強させることに成功し、人工生息場材が活性炭（特に第１０発明に係る金属粉混合活性炭）であるには微生物群集の分解活性を約３倍に増強させることに成功している。
【００４９】
（第９発明の効果）
人工生息場材たる多孔質材料は、細孔の平均孔隙径が、１０〜８００μｍの範囲内であることが特に好ましい。平均孔隙径が１０μｍ未満である場合には、必要な微生物の構成種が共生し難くなることが懸念される。一方、平均孔隙径が８００μｍを超える場合には、必要な微生物の構成種以外の微生物群による妨害が起こり易くなることが懸念される。
【００５０】
（第１０発明の効果）
人工培地に接種された微生物群集の分解活性を安定的に維持し及び／又は増強する上で、人工生息場材には金属粉を混合しておくことが、特に好ましい。そのような効果は、人工生息場材としての活性炭に金属粉を混合した場合に特に顕著である。
【００５１】
金属粉を混合することのメリットは、芳香族塩素化合物の脱塩素反応に関して、人工生息場材の表面で電子を供給することができる点にあると考えられる。
【００５２】
（第１１発明の効果）
上記した理由から、人工生息場材に混合する金属粉としては、鉄やチタン等の還元性である金属の粉がとりわけ好ましい。
【００５３】
（第１２発明の効果）
少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物の嫌気的分解活性を有する微生物群集を、第７発明〜第１１発明に係る人工培地に接種して嫌気条件下で培養すると、上記した理由から、微生物群集の芳香族塩素化合物に対する分解活性が更に安定的に維持され、及び／又は、増強された微生物群集組成物を得ることができる。
【００５４】
（第１３発明の効果）
上記した第１２発明の微生物群集組成物においては、より具体的には、接種前に微生物群集が示していた芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性が、接種後１０ケ月以上（好ましい場合には２年半以上）維持され、及び／又は、接種後２倍以上に増強され得る。
【００５５】
（第１４発明の効果）
人工培地に接種する微生物群集は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を有する限りにおいて限定されないが、特に第１発明〜第６発明に係る微生物群集を接種することが好ましい。この場合、特に多環芳香族塩素化合物に対する優れた嫌気的分解活性が、良好に維持され、及び／又は、増強される。
【００５６】
（第１５発明の効果）
上記した第１２発明の場合と同じ理由から、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を、第７発明〜第１１発明に係る人工培地に接種して嫌気的条件下で培養すると言う方法により、接種前における微生物群集の嫌気的分解活性を１０ケ月以上（好ましい場合には２年半以上）維持させ、及び／又は、２倍以上に増強させ得る。
【００５７】
（第１６発明の効果）
上記した第１５発明の方法において、人工培地に接種する微生物群集は、少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を有する限りにおいて限定されないが、特に第１発明〜第６発明に係る微生物群集を接種することが好ましい。この場合、特に多環芳香族塩素化合物に対する優れた嫌気的分解活性が、良好に維持され、及び／又は、増強される。
【００５８】
（第１７発明の効果）
以上に述べた点から、芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対して、第１発明〜第６発明に係る微生物群集又は第１２発明〜第１４発明に係る微生物群集組成物を散布又は混合すると言う、汚染土壌の優れた浄化方法が提供される。
【００５９】
この方法は、特に、ＰＣＢやダイオキシン類のような多環芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対して好適である。
【００６０】
（第１８発明の効果）
芳香族塩素化合物で汚染された土壌を浄化するに当たり、上記した第１７発明のような方法も有用であるが、一般論として微生物浄化法に共通する処理能力の量的限界を考慮した場合、第１８発明のように当該汚染土壌地域の周囲、及び／又は、底層にバリヤー層を構築し、少なくともバリヤー層の外側への芳香族塩素化合物の拡散を防止する、と言う方法も極めて有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
次に、本願の第１発明〜第１８発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において単に「本発明」と言う時は、第１発明〜第１８発明の内の該当する発明群を一括して指している。
【００６２】
〔微生物群集の取得方法〕
本発明において、芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を示す微生物群集を取得する方法は、微生物群集の採取源として芳香族塩素化合物で汚染されていない湿地還元層土壌の土壌微生物群集を利用する点、及び、このような湿地還元層土壌に芳香族塩素化合物を投与して、嫌気的条件下で土壌中培養する点に特徴がある。
【００６３】
本発明の説明の全体において、「嫌気的条件」とは、要するに酸素遮断条件であれば足り、このような嫌気的条件を維持するための手段としては、限定はされないが、例えば密封培養すること、培地環境の気相を嫌気性ガスに置換すること、培地を湛水すること、等を例示できる。
【００６４】
湿地還元層土壌としては、水田のグライ層土壌が特に好ましいが、その他にも、各種の低湿地、沼地、川床等のグライ層土壌も利用できる。いわゆるグライ層を明確に形成するに到っていない還元層土壌も利用可能である。湿地還元層土壌に投与する芳香族塩素化合物の種類は限定されないが、例えばＰＣＢ又はダイオキシン類を分解ターゲットとする微生物群集を取得したい場合には、これらを投与することが好ましい。湿地還元層土壌に対する芳香族塩素化合物の投与量は適宜に設定することができるが、例えば、０．１〜５０ｐｐｍ程度とすることができる。
【００６５】
非汚染土壌である還元層土壌の土壌微生物群集は、元々、芳香族塩素化合物に対する分解活性を示す場合は少ない。しかし、これに芳香族塩素化合物を投与して嫌気的条件下で一定期間の土壌中培養を行うと、その土壌微生物群集に芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を誘導することができる。土壌中培養を行う期間は、良好な分解活性の誘導のためには、４ケ月以上が好ましい。更に、その分解活性の長期的な経時的維持能力及び継代の繰り返しにおける維持能力をも獲得させる場合には、１０ケ月以上が好ましく、１年以上が更に好ましい。
【００６６】
〔取得される微生物群集〕
上記の方法により本発明に係る芳香族塩素化合物分解性の微生物群集が得られるが、この微生物群集の第１の特徴点は、ＰＣＢやダイオキシン類のような多環芳香族塩素化合物にも有効な分解活性を示す点である。第２の特徴点は、分解反応の主反応として、芳香環のメタ位及びパラ位における脱塩素反応を起こす点である。このような微生物群集は、例えばコプラナーＰＣＢの分解に有利であると考えられる。第３の特徴点は、多環芳香族塩素化合物も含めた芳香族塩素化合物の多様な同族体に対して広範囲な脱塩素活性を示すことであって、より具体的には、芳香族塩素化合物の２塩素化物〜６塩素化物に対する脱塩素活性が、前記した「脱塩素化率」として５％以上の値を示すと言うデータが得られている。
【００６７】
本発明に係る芳香族塩素化合物分解性の微生物群集は、直接顕微鏡法による解析において、長桿菌が優占する共生微生物群集であることが分かっている。一方、ＤＧＧＥ全バンドについてのランダムクローニングによるシーケンス解析によると、少なくとも Clostridium属の嫌気的微生物を、優占種として含む。その他にも、 Dehalococcoides属細菌、Pseudomonas 属細菌、Sedimentbacter属細菌、Peptostreptococcaceas 属細菌、Acetoanaerobacter 属細菌等も検出される場合があるが、これらは培養条件によっても異なる。更に、クロロ安息香酸による嫌気的集積物中や、嫌気的ＴＣＥ脱塩素微生物集積物中から得られた未同定株が検出されている。これらの微生物の一部又は全部が微生物群集の脱塩素活性に関与している可能性がある。更にキノンプロファイル法による微生物群集構造解析においてはメナキノン６，７のみが検出され、主としてδ，ε−サブクラスのプロテオバクテリアに属する微生物からなることが判明している。
【００６８】
次に、本発明に係る微生物群集は、芳香族塩素化合物分解活性を長期的に維持できると言う大きな特徴を持ち、具体的には殺菌土壌に対する５回以上の継代培養を繰り返しても初期分解活性以上の分解活性を維持でき、実際には１５回の継代培養を繰り返しても初期分解活性以上の分解活性を維持できており、更に初期分解活性以上の分解活性を１０ケ月以上（より好ましい場合には２年半以上）維持することができる。
【００６９】
〔人工培地〕
本発明に係る人工培地は、芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を接種するために調製されるものであって、任意の微生物培地と、これに対して添加される人工生息場材とからなる。人工生息場材とは、孔隙に富む多孔質材料である。
【００７０】
多孔質材料の種類は必ずしも限定されないが、活性炭、無機質材料製ビーズの集積体、焼成土等を代表的に例示できる。その他、ゼオライト等の多孔質無機材料、セピオライト等の多孔質粘土鉱物等も例示することができる。これらの多孔質材料は、微細な孔隙の平均孔隙径が１０〜８００μｍの範囲内にあるものが特に好ましく、２００μｍ前後のものがとりわけ好ましい。その点からは、多孔質材料が無機質材料製ビーズの集積体である場合には、ビーズの平均粒子径が５０〜２０００μｍ程度であることが好ましい。
【００７１】
「発明の効果」欄で前記した理由から、人工生息場材たる多孔質材料には、金属の粉粒体、とりわけ鉄やチタン等の粉粒体を混合することが更に好ましい。その他にも、マンガン、亜鉛、ニッケル、銅、コボルト等のいずれかの金属の粉粒体を混合することも好ましい、と考えられる。
【００７２】
上記のように、人工培地は、微生物培地と、これに添加される人工生息場材とからなるが、培地は目的に応じて適宜に組成すれば良く、その組成は何ら限定されない。培地は、微生物群集の栄養源としての酢酸やアンモニア塩、リン酸塩、無機窒素、あるいは一般的にこの種の目的の培地に添加されることがあるビタミン類や微量金属元素を含有することができる。以下に、人工生息場材たる多孔質材料が平均粒子径５００μｍのガラスビーズである場合における、本発明に係る人工培地の好ましい組成の一例を示す。
（人工生息場材）
ガラスビーズ ４〜８ｇ（培地２０ｍＬあたり）
（培地：ｐＨ７．０）
Ｋ２ ＨＰＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．１ｇ（培地１Ｌあたり）
ＦｅＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．０２ｇ（培地１Ｌあたり）
Yeast extract ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-acetate ８ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-lactate １０ｇ（培地１Ｌあたり）
resazurin ０．００１ｇ（培地１Ｌあたり）
〔微生物群集組成物及び微生物群集の活性維持・増強方法〕
以上のように構成される人工培地に、本発明に係る微生物群集、あるいは公知のものも含めてその他の芳香族塩素化合物分解性の適宜な微生物群集を接種し、微生物群集組成物を構成することにより、嫌気的条件下において、その微生物群集の芳香族塩素化合物に対する分解活性を有効に維持させ、及び／又は、増強させることができる。微生物群集の接種法は限定されないが、例えば微生物群集の培養物の土壌懸濁物を接種源とする方法や、培養物上清液を接種すると言う接種法を採用することができる。
【００７３】
本願発明者の実験によれば、この人工培地に接種された微生物群集の芳香族塩素化合物分解活性を、嫌気的条件下において、１０ケ月以上、より好ましい場合には１年以上、特に好ましい場合には２年半以上維持させ得た例があり、更には、分解活性を２倍以上に増強させ得た例がある。
【００７４】
〔汚染土壌の浄化方法又は汚染物質拡散防止方法〕
本発明によれば、以上に述べた各種の微生物群集又は微生物群集組成物を芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対して適用することにより、優れた浄化効果を期待することができる。具体的な適用方法としては、例えば微生物群集又は微生物群集組成物を汚染土壌に対して散布し、又は混合することができる。
【００７５】
あるいは、芳香族塩素化合物で汚染された土壌地域の周囲の土壌中に微生物群集又は微生物群集組成物を含む上下方向のバリヤー層を構築し、及び／又は汚染土壌地域の底層の土壌中に微生物群集又は微生物群集組成物を含む水平方向のバリヤー層を構築し、バリヤー層の外側への芳香族塩素化合物の拡散を防止することもできる。
【実施例】
【００７６】
次に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は、以下の実施例によって限定されるものではない。
【００７７】
〔実施例１：芳香族塩素化合物分解性の微生物群集の取得〕
芳香族塩素化合物非汚染水田より中粗粒強グライ土壌を採取した。採取直後の土壌はＰＣＢ分解活性をほとんど示さなかった。
【００７８】
上記の中粗粒強グライ土壌に対し、鐘淵化学工業製のＰＣＢ剤であるカネクロール３００（商標）及びカネクロール４００（商標）の重量比１：１の混合物を、ＰＣＢ全体で約５０ｐｐｍとなるように添加した。上記のＰＣＢ剤混合物には、塩素結合数が２〜７にわたる多様なＰＣＢ同族体が含まれている。
【００７９】
上記のＰＣＢ添加土壌を嫌気的条件下（窒素置換嫌気ボトル中）で約４ケ月間の長期液体培養に供したところ、様々なＰＣＢ同族体が同時に分解される活性が見出された。即ち、上記の嫌気的条件下での長期土壌培養により、約４ケ月の経過時点で（あるいはそれ以前の時点で）、ＰＣＢの多様な同族体に対する嫌気的分解活性を示す微生物群集が、土壌中微生物群として得られた。この微生物群集のＰＣＢ分解活性を図１に示す。
【００８０】
図１中、図１（ａ）に示す３本の横向きの棒グラフのうち、上側の棒グラフが、上記した土壌中微生物群が殺菌土壌培地を用いた１５回の継代培養で示した脱塩素化率の平均値（６．８％）である。図１（ａ）の中央の棒グラフは、比較のために示したもので、上記した土壌中微生物群が、焼成土を人工生息場材とする人工培地を用いた１５回の継代培養で示した脱塩素化率の平均値（３０．８％）である。図１（ａ）の下側の棒グラフも比較のために示したもので、上記した土壌中微生物群が、粒径０．５ｍｍのガラスビーズを人工生息場材とする人工培地を用いた１５回の継代培養で示した脱塩素化率の平均値（３７．１％）である。これらの棒グラフでは、エラーバーによる全変動も併せて示した。
【００８１】
図１中、図１（ｂ）に示す多数本の横向きの棒グラフは、上記の図１（ａ）の上側の棒グラフで示す平均値のオリジナルデータであって、上記の内の第３回目以降の継代培養におけるそれぞれの脱塩素化率を上側より順に示している。ほぼ中央に棒グラフが認められないスペースがあるが、これは第９回目の継代培養に相当し、各ＰＣＢ同族体の分解活性は得られているが、幾つかの低塩素化物の蓄積が見られたため、全体として、脱塩素化率及び分解率が低く見積もられているためである。
【００８２】
本実施例及び後述の各実施例におけるＰＣＢの測定は、培養物からＰＣＢを抽出し、電子捕獲型検出器付ガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＥＣＤ）で分析することにより行った。又、ＰＣＢの分解活性は、培養物における培養開始前と培養後の全ＰＣＢ回収量の対比により判定した。
【００８３】
〔実施例２：微生物群集の継代培養〕
実施例１で用いたと同様の水田土壌４ｇを、オートクレーブ中で１２１°Ｃ×３０分の熱処理を毎日１回、３日間繰り返すと言う殺菌処理に供し、実施例１と同じＰＣＢ剤混合物を５ｐｐｍ添加したもとで、これを炭素源を含む液体培地で飽和した全２０ｍＬの植継ぎ用培地を準備した。この植継ぎ用培地に対して実施例１で得られた微生物群集を含む土壌培地１ｍＬを接種する植継ぎを行った後、実施例１と同様の条件で嫌気培養し、ＰＣＢに対する嫌気的分解活性の維持・増強（ＰＣＢ分解性微生物の集積）を検討した。更に、同じ要領で、新たに準備した上記と同様の全２０ｍＬのＰＣＢ添加植継ぎ用培地に対して前培養物の一部を接種する植継ぎを繰り返す継代培養を行った。
【００８４】
それらの植継ぎ培養の結果、一般的に植継ぎ後８週間を経過しても植継ぎ前と同等のＰＣＢ分解活性が確認された。又、添加ＰＣＢ全量に対する減少量もほぼ一定値を示した。更に、特定の２系統については、現在の処、１５回の継代培養でほぼ２年半の間のＰＣＢ分解活性維持に成功している。
【００８５】
上記の植継ぎ培養においては、下記１）〜６）の条件を種々に変化させた場合について検討した。
１）植継ぎ用培地の炭素源として乳酸、酢酸又はグルコースを用いた場合。
２）脱塩素反応に配慮して植継ぎ用培地の性質（酸化還元電位）をシステイン塩酸塩、チオグリコール酸又は硫化ナトリウムの添加により変化させた場合。
３）植継ぎ用培地に対する土壌中微生物群の接種量を０．１〜１０ｍＬの範囲内で変更した場合。
４）植継ぎ後の培養温度を、４〜３０°Ｃの範囲内での種々の一定温度に設定した場合。
５）培養期間をそれぞれ１４日、２８日、５６日に設定した場合。
６）培養条件として、振とう培養又は静置培養を行った場合。
【００８６】
上記の１）〜６）のように各種の条件を変化させても、ＰＣＢに対する嫌気的分解活性は基本的に大差なく維持されていた。即ち、種々の植継ぎ培養条件において、実施例１に係る微生物群集のＰＣＢ嫌気的分解活性を維持することに成功した。上記の植継ぎ培養の各種条件の内、あえて最適な条件を幾つか絞り込むと、次のａ）〜ｃ）の通りであった。
ａ）植継ぎ用培地全２０ｍＬに対して、前培養物を１ｍＬ程度接種する。
ｂ）植継ぎ用培地に炭素源は必要で、特に乳酸及び／又は酢酸が優れる。
ｃ）還元剤無添加で、３０°Ｃ程度での８週間程度の嫌気的培養を行う。
【００８７】
〔実施例３：実施例２の継代培養の結果及び考察〕
実施例２で１５回の継代培養（各８週間）により約２年半近いＰＣＢ分解活性維持に成功している系統について、各継代培養でのＰＣＢの分解活性を図２に示す。図２においては、継代回数を横軸に示し、縦軸にその継代培養における培養後の（８週間経過後の）全ＰＣＢ残留率を示した。この培養後全ＰＣＢ残留率は培養前の全ＰＣＢ回収量に対する培養後全ＰＣＢ残留量のパーセンテージで示した。培養期間中、ＰＣＢの１０％未満の土壌吸着が認められた。図２において、第９回目の継代培養での全ＰＣＢ残留率が１００％前後となっているのは、前記の図１（ｂ）の場合と同じ理由で、分解は起こっているものの分解率が低く見積もられているためである。
【００８８】
図２から分かるように、全体として２年半近くにわたり、かつ１５回の継代にわたり、当初見られたＰＣＢ分解活性と同等以上の活性が維持されている。但し、継代培養を重ねるにつれて分解活性が向上して行く傾向は見られなかった。このことは、別の見地からは、植継ぎにおける微生物群集の安定性を意味しており、環境接種の際に土着菌との競合に耐えてＰＣＢ分解活性を安定的に再現できる可能性を示唆している。
【００８９】
〔実施例４：微生物群集の構造解析〕
実施例２における継代８週間経過後の微生物群集につき、キノンプロファイル法により群集構造解析を行ったところ、メナキノン６，７のみが検出された。従って、継代維持されている微生物群集は、主としてδ，ε−サブクラスのプロテオバクテリアに属する微生物からなることが分かった。
【００９０】
同時にＰＣＲ−ＤＧＧＥ（polymerase chain reaction-denaturing gradient
gel electrophoresis ）法による解析も行い、各バンドについてランダムクローニングによるシーケンス解析を行い、微生物群集の解析も行った。それによると、少なくとも Clostridium属の嫌気的微生物を優占種として含み、その他にも、 Dehalococcoides属細菌、Pseudomonas 属細菌、Sedimentbacter属細菌、Peptostreptococcaceas 属細菌、Acetoanaerobacter 属細菌等も検出される場合があったが、条件によってその結果は異なった。更に、クロロ安息香酸による嫌気的集積物中や、嫌気的ＴＣＥ脱塩素微生物集積物中から得られた未同定株が検出された。
【００９１】
〔実施例５：微生物群集用人工培地〕
上記の実施例１〜実施例４では殺菌土壌を用いて継代培養を行ったが、微生物群集のＰＣＢに対する嫌気的分解活性が長期安定的に維持される一方、その分解活性が顕著に向上することはなかった。そこで、微生物群集のＰＣＢ分解活性を更に顕著に向上させる人工培地の開発を試みた。
【００９２】
（実施例５−１：ガラスビーズ及び焼成土）
人工培地の人工生息場材として、粒径０．５ｍｍのガラスビーズ（の集積体）と、実施例１で用いたと同様の水田土壌に対して５５０°Ｃで２４時間の焼成を行った焼成土とを用いた。これらの人工培地の組成は下記に示す。そして、前記した殺菌土壌と同量のこれら人工培地（液体培地）に対して実施例１と同濃度にＰＣＢ剤混合物を添加したもとで、前記した殺菌土壌の場合と同様に、実施例１で得られた微生物群集を含む土壌の一部を接種する植継ぎを行い、嫌気的条件下での継代培養を繰り返した。
【００９３】
〔工生息場材としてガラスビーズを用いた人工培地の組成〕
（人工生息場材）
ガラスビーズ ４〜８ｇ（培地２０ｍＬあたり）
（培地：ｐＨ７．０）
Ｋ２ ＨＰＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．１ｇ（培地１Ｌあたり）
ＦｅＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．０２ｇ（培地１Ｌあたり）
Yeast extract ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-acetate ８ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-lactate １０ｇ（培地１Ｌあたり）
resazurin ０．００１ｇ（培地１Ｌあたり）。
【００９４】
〔人工生息場材として焼成土を用いた人工培地の組成〕
（人工生息場材）
焼成土 ４〜８ｇ（培地２０ｍＬあたり）
（培地：ｐＨ７．０）
Ｋ２ ＨＰＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．１ｇ（培地１Ｌあたり）
ＦｅＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．０２ｇ（培地１Ｌあたり）
Yeast extract ０．５ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-acetate ８ｇ（培地１Ｌあたり）
Na-lactate １０ｇ（培地１Ｌあたり）
resazurin ０．００１ｇ（培地１Ｌあたり）。
【００９５】
継代培養における培養期間を５６日（８週間）とした場合における、１回目及び６〜８回目の継代培養でのＰＣＢの分解活性を図３に示す。図３では継代回数を横軸に示し、縦軸にその継代培養における培養後の全ＰＣＢ残留率を示した。この全ＰＣＢ残留率は培養前の全ＰＣＢ回収量に対する培養後全ＰＣＢ残留量のパーセンテージで示した。
【００９６】
なお、図３に示す各回の継代培養において、左側の棒グラフは人工生息場材としてガラスビーズを用いた場合の、中央の棒グラフは人工生息場材として焼成土を用いた場合の、それぞれ全ＰＣＢ残留率である。又、右側の棒グラフは比較として実施例２と同様の方法で殺菌土壌を用いた場合のデータを再度示したものである。図３から、継代培養の培地として殺菌土壌を用いた場合に比較して、人工培地を用いた場合には全ＰＣＢ残留率が著しく低い（微生物群集のＰＣＢ分解活性が著しく増強されている）ことが分かる。なお、培養期間中、ＰＣＢのガラスビーズへの吸着率は１５％未満であった。
【００９７】
次に、図４に、上記した第１回〜第８回の各継代培養における８週間経過後の塩素結合数別ＰＣＢに対する分解活性の平均値を示す。図４において、左側のブロックの棒グラフは継代培養の培地として実施例２のように殺菌土壌を用いた場合のものであり、中央のブロックの棒グラフは、継代培養の培地として上記の粒径０．５ｍｍのガラスビーズを人工生息場材とする人工培地を用いた場合のものであり、右側のブロックの棒グラフは、継代培養の培地として上記の焼成土を人工生息場材とする人工培地を用いた場合のものである。又、図４において、上下方向が塩素結合数別ＰＣＢの量的な増加又は減少のパーセンテージを示し、各ブロックの棒グラフは、左側から順に、結合塩素数がそれぞれ２、３、４、５、６、７であるＰＣＢを示す。
【００９８】
図４から分かるように、中央及び右側のブロックの棒グラフにおけるＰＣＢの減少は、左側のブロックの棒グラフに比較して顕著であり、かつ、塩素結合数３〜５のＰＣＢが減少し、特に塩素結合数３、４のＰＣＢが顕著に減少している。その結果として、塩素結合数２のＰＣＢが相対的に増大しているが、その増大量が塩素結合数３〜５のＰＣＢの減少と見合わないことから、２塩素化物〜５塩素化物のいずれに対しても有効な脱塩素活性を示すことが認められた。又、６塩素化物も、一定の有意な減少を示している。
【００９９】
一方、上記で用いた粒径０．５ｍｍのガラスビーズの他に、粒径０．０５ｍｍ及び粒径２．０ｍｍのガラスビーズを人工培地の人工生息場材として用い、同上の継代培養を行った。しかし、これら０．５ｍｍ以外の粒径のガラスビーズを人工生息場材として用いた人工培地での継代培養では、継代を３〜４回繰り返す内に活性が次第に低減する傾向が見られた。ところが、一旦粒径０．５ｍｍのガラスビーズを人工生息場材として用いた人工培地で活性維持に成功した培養物を、異なる粒径（０．０５ｍｍ及び２．０ｍｍ）のガラスビーズを人工生息場材として用いた人工培地へ植継ぎ（異径ガラスビーズ人工培地への植継ぎ）を行うと、活性を低減させることなく維持できることを見出した。又、これらの異径ガラスビーズ人工培地への植継ぎにおいては、植継ぎ後５６日間の培養でも、植継ぎ後３２日間の培養でも、同等に高い活性を維持できることが分かった。それら異径ガラスビーズ人工培地への植継ぎの場合の、図３と同じ計算方法及び表記方法による全ＰＣＢ残留率を、図５に示す。図５に示す各棒グラフは、左端のものから順に、「ガラスビーズなし（人工生息場材を含まない培地）で培養期間が３２日」の場合（人工生息場材を含まない培地）、「粒径２．０ｍｍのガラスビーズ使用で培養期間が３２日」の場合、「粒径０．５ｍｍのガラスビーズ使用で培養期間が３２日」の場合、「粒径０．０５ｍｍのガラスビーズ使用で培養期間が３２日」の場合、「粒径０．５ｍｍのガラスビーズ使用で培養期間が５６日」の場合、をそれぞれ示す。机上の計算上、粒径０．５ｍｍのガラスビーズの集積体において形成される細孔の平均孔隙径は２００μｍであり、粒径２．０ｍｍのガラスビーズの集積体において形成される細孔の平均孔隙径は８００μｍである。
【０１００】
なお、これらの人工培地を用いた場合の継代培養後の微生物群集をキノンプロファイル法で解析すると、ガラスビーズを人工生息場材とする人工培地においては全てのサンプルでメナキノン−７（Ｈ２）のみが、焼成土を人工生息場材とする人工培地では全てのサンプルでメナキノン−７のみが、それぞれ検出された。即ち、実施例２の殺菌土壌での継代培養の場合とは、微生物群集の構成にも変化を生じていることが示唆された。
【０１０１】
（実施例５−２：金属粉混合活性炭）
人工培地の人工生息場材として、金属粉混合活性炭を用いた。即ち、活性炭に微生物群集を定着させるため、実施例５−１に従って粒径０．５ｍｍのガラスビーズの集積体を人工生息場材とする人工培地による継代培養を行った培養物を接種源とし、鉄粉５０重量％を混合した固形の鶏糞活性炭１粒（約３ｃｍ：ＴＹＫ株式会社製）を前記のガラスビーズ集積体人工培地に入れた後、この培地に実施例１と同濃度に前記のＰＣＢ剤混合物を添加したもとで、嫌気条件下に４週間培養した。
【０１０２】
継代培養は、培養後の前記固形活性炭を嫌気条件下でピンセットを用いて取り出し、そのまま新しいガラスビーズ培地へ再添加することにより行った。なお、人工培地たる活性炭の強いＰＣＢ吸着能を考慮し、微生物群集を含まない前記活性炭粒子を添加した継代培地をコントロールとした。
【０１０３】
これらの実施例及びコントロールにおける、図３と同じ計算方法及び表記方法による全ＰＣＢ残留率を、図６に示す。図６の各棒グラフは、左端のものから順に、コントロールの場合、本実施例の１継代目の場合、本実施例の３継代目の場合、本実施例の４継代目の場合及び本実施例の５継代目の場合である。
【０１０４】
４継代目及び５継代目での全ＰＣＢ残留率が非常に低いことが、注目される。４週間培養後における活性炭へのＰＣＢ吸着率は３７．８％と高いが、コントロールでは全ＰＣＢ量が減少していたのに対して、継代培養したものでは下記の図７のようにＰＣＢ種も異なることから、微生物活性が集積したものと考えることができる。
【０１０５】
本実施例における結合塩素数別のＰＣＢ同族体の吸着率と残留率の比較を図７に示す。図７において縦軸の数値表示はＰＣＢ量（ｎｇ／sample）を示す。図の下方の「２Ｃｌ」、「３Ｃｌ」等の表記は結合塩素数によるＰＣＢ同族体のグループ区別を示す。各グループ区別内における「６」、「８」、「１２」等の数字表記はＰＣＢの同族体番号（＃）を示し、例えば「２０／３３／４５」と言う数字表記は、＃２０、＃３３、＃４５の混合ピークであることを示す。これらの各数字表記ごとに示された各３組の棒グラフは、左側から順に、「通常の場合」、「コントロールの場合」、及び「本実施例の場合」における結果を示す。図７から分かるように、結合塩素数が３又は４であるＰＣＢの消失率が高く、これは本発明に係る微生物群集に固有の傾向である。
【０１０６】
本実施例において活性炭に鉄粉を混合したことの影響については、人工生息場材である活性炭の表面において鉄粉が電子を供給することで、脱塩素反応に有利である、と考えることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本願発明によって、多環芳香族塩素化合物の広範囲な同族体に対して優れた嫌気的分解活性を示し、しかもその分解活性を安定的に維持できる微生物群集が提供される。更に、このような微生物群集の分解活性の更なる維持・増強に有効な人工培地も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】実施例１に係る微生物群集のＰＣＢ分解活性を示す図である。
【０１０９】
【図２】実施例２に係る各継代培養でのＰＣＢの分解活性を示す図である。
【０１１０】
【図３】実施例５−１に係る継代培養でのＰＣＢ分解活性を示す図である。
【０１１１】
【図４】実施例５−１に係る継代培養でのＰＣＢ脱塩素活性を示す図である。
【０１１２】
【図５】実施例５−１に係る継代培養でのガラスビーズの粒径別、培養期間別の全ＰＣＢ残留率を示す図である。
【０１１３】
【図６】実施例５−２における継代培養での全ＰＣＢ残留率を示す図である。
【０１１４】
【図７】実施例５−２におけるＰＣＢ同族体の吸着率と残留率の比較を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族塩素化合物で汚染されていない湿地還元層土壌の土壌微生物群集に芳香族塩素化合物を投与し、嫌気的条件下で土壌中培養することによって得られる微生物群集であって、下記の（１）の分解活性を示し、更に下記の（２）及び／又は（３）に該当する分解活性維持能力を示すものであることを特徴とする微生物群集。
（１）少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を示す。
（２）殺菌土壌に対する５回以上の継代培養を繰り返しても初期分解活性以上の分解活性を維持できる。
（３）初期分解活性以上の分解活性を１０ケ月以上維持できる。
【請求項２】
前記土壌微生物群集が水田のグライ層土壌の土壌微生物群集であることを特徴とする請求項１に記載の微生物群集。
【請求項３】
前記（１）の分解活性を示す土壌微生物群集が前記土壌中培養を４ケ月以上行うことにより得られるものであり、前記（１）〜（３）の分解活性及び分解活性維持能力を示す土壌微生物群集が前記土壌中培養を１０ケ月以上行うことにより得られるものであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の微生物群集。
【請求項４】
少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集であって、優占種として少なくとも Clostridium属の嫌気的微生物を含み、かつ、以下の（４）及び／又は（５）に該当することを特徴とする微生物群集。
（４）キノンプロファイル法による微生物群集構造解析においてメナキノン６，７のみが検出される。
（５）主として、δ，ε−サブクラスのプロテオバクテリアに属する微生物からなる。
【請求項５】
少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集であって、その分解反応の主反応として芳香環のメタ位及びパラ位における脱塩素反応を起こし、かつ、汚染土壌中で検出される芳香族塩素化合物の主体をなす２塩素化物〜６塩素化物のいずれに対しても脱塩素活性を示すことを特徴とする微生物群集。
【請求項６】
前記芳香族塩素化合物の２塩素化物〜６塩素化物に対する脱塩素活性が、下記の式に定義する脱塩素化率として５％以上の値を示すものであることを特徴とする請求項５に記載の微生物群集。
脱塩素化率（％）＝〔１−（培養後全塩素化量／培養前全塩素化量）〕×100
（上記の式において、「全塩素化量」は、培地中の芳香族塩素化合物の２、３、４、５、６塩素化物のそれぞれの含有量を2P、3P、4P、5P、6Pであると規定した場合、（2P×２）、（3P×３）、（4P×４）、（5P×５）、（6P×６）の総和で与えられる。又、「培養前全塩素化量」、「培養後全塩素化量」とは、それぞれ、微生物群集の培養開始直前及び５６日間の培養後における培地の全塩素化量を言う。）
【請求項７】
芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を接種するために調製される人工培地であって、任意の微生物培地と、これに対して添加される、孔隙に富む多孔質材料である人工生息場材とからなり、接種された微生物群集の嫌気的分解活性を１０ケ月以上維持させ、及び／又は、２倍以上に増強させることができるものであることを特徴とする人工培地。
【請求項８】
前記多孔質材料が、活性炭、無機質材料製ビーズの集積体又は焼成土であることを特徴とする請求項７に記載の人工培地。
【請求項９】
前記多孔質材料の平均孔隙径が１０〜８００μｍの範囲内であることを特徴とする請求項７又は請求項８に記載の人工培地。
【請求項１０】
前記多孔質材料に金属粉が混合されていることを特徴とする請求項７〜請求項９のいずれかに記載の人工培地。
【請求項１１】
前記金属粉が鉄粉又はチタン粉であることを特徴とする請求項１０に記載の人工培地。
【請求項１２】
少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を、請求項７〜請求項１１のいずれかに記載の人工培地に接種して嫌気条件下で培養したものであることを特徴とする微生物群集組成物。
【請求項１３】
前記微生物群集の嫌気的分解活性が接種後１０ケ月以上維持され、及び／又は、接種後２倍以上に増強されていることを特徴とする請求項１２に記載の微生物群集組成物。
【請求項１４】
前記請求項１２又は請求項１３において規定された微生物群集が請求項１〜請求項６のいずれかに記載の微生物群集であることを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載の微生物群集組成物。
【請求項１５】
少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を、請求項７〜請求項１１のいずれかに記載の人工培地に接種して嫌気的条件下で培養することにより、接種前における微生物群集の嫌気的分解活性を１０ケ月以上維持させ、及び／又は、２倍以上に増強させることを特徴とする微生物群集の活性維持・増強方法。
【請求項１６】
前記請求項１５において規定された微生物群集が請求項１〜請求項６のいずれかに記載の微生物群集であることを特徴とする請求項１５に記載の微生物群集の活性維持・増強方法。
【請求項１７】
芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対して、請求項１〜請求項６のいずれかに記載の微生物群集又は請求項１２〜請求項１４のいずれかに記載の微生物群集組成物を散布又は混合することを特徴とする汚染土壌の浄化方法。
【請求項１８】
芳香族塩素化合物で汚染された土壌地域に対して、請求項１〜請求項６のいずれかに記載の微生物群集又は請求項１２〜請求項１４のいずれかに記載の微生物群集組成物を含むバリヤー層を、当該土壌地域の周囲の土壌中に上下方向に構築し、及び／又は、当該土壌地域の底層の土壌中に水平方向に構築し、前記バリヤー層の外側への芳香族塩素化合物の拡散を防止することを特徴とする土壌汚染物質の拡散防止方法。
【請求項１】
芳香族塩素化合物で汚染されていない湿地還元層土壌の土壌微生物群集に芳香族塩素化合物を投与し、嫌気的条件下で土壌中培養することによって得られる微生物群集であって、下記の（１）の分解活性を示し、更に下記の（２）及び／又は（３）に該当する分解活性維持能力を示すものであることを特徴とする微生物群集。
（１）少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対する嫌気的分解活性を示す。
（２）殺菌土壌に対する５回以上の継代培養を繰り返しても初期分解活性以上の分解活性を維持できる。
（３）初期分解活性以上の分解活性を１０ケ月以上維持できる。
【請求項２】
前記土壌微生物群集が水田のグライ層土壌の土壌微生物群集であることを特徴とする請求項１に記載の微生物群集。
【請求項３】
前記（１）の分解活性を示す土壌微生物群集が前記土壌中培養を４ケ月以上行うことにより得られるものであり、前記（１）〜（３）の分解活性及び分解活性維持能力を示す土壌微生物群集が前記土壌中培養を１０ケ月以上行うことにより得られるものであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の微生物群集。
【請求項４】
少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集であって、優占種として少なくとも Clostridium属の嫌気的微生物を含み、かつ、以下の（４）及び／又は（５）に該当することを特徴とする微生物群集。
（４）キノンプロファイル法による微生物群集構造解析においてメナキノン６，７のみが検出される。
（５）主として、δ，ε−サブクラスのプロテオバクテリアに属する微生物からなる。
【請求項５】
少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集であって、その分解反応の主反応として芳香環のメタ位及びパラ位における脱塩素反応を起こし、かつ、汚染土壌中で検出される芳香族塩素化合物の主体をなす２塩素化物〜６塩素化物のいずれに対しても脱塩素活性を示すことを特徴とする微生物群集。
【請求項６】
前記芳香族塩素化合物の２塩素化物〜６塩素化物に対する脱塩素活性が、下記の式に定義する脱塩素化率として５％以上の値を示すものであることを特徴とする請求項５に記載の微生物群集。
脱塩素化率（％）＝〔１−（培養後全塩素化量／培養前全塩素化量）〕×100
（上記の式において、「全塩素化量」は、培地中の芳香族塩素化合物の２、３、４、５、６塩素化物のそれぞれの含有量を2P、3P、4P、5P、6Pであると規定した場合、（2P×２）、（3P×３）、（4P×４）、（5P×５）、（6P×６）の総和で与えられる。又、「培養前全塩素化量」、「培養後全塩素化量」とは、それぞれ、微生物群集の培養開始直前及び５６日間の培養後における培地の全塩素化量を言う。）
【請求項７】
芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を接種するために調製される人工培地であって、任意の微生物培地と、これに対して添加される、孔隙に富む多孔質材料である人工生息場材とからなり、接種された微生物群集の嫌気的分解活性を１０ケ月以上維持させ、及び／又は、２倍以上に増強させることができるものであることを特徴とする人工培地。
【請求項８】
前記多孔質材料が、活性炭、無機質材料製ビーズの集積体又は焼成土であることを特徴とする請求項７に記載の人工培地。
【請求項９】
前記多孔質材料の平均孔隙径が１０〜８００μｍの範囲内であることを特徴とする請求項７又は請求項８に記載の人工培地。
【請求項１０】
前記多孔質材料に金属粉が混合されていることを特徴とする請求項７〜請求項９のいずれかに記載の人工培地。
【請求項１１】
前記金属粉が鉄粉又はチタン粉であることを特徴とする請求項１０に記載の人工培地。
【請求項１２】
少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を、請求項７〜請求項１１のいずれかに記載の人工培地に接種して嫌気条件下で培養したものであることを特徴とする微生物群集組成物。
【請求項１３】
前記微生物群集の嫌気的分解活性が接種後１０ケ月以上維持され、及び／又は、接種後２倍以上に増強されていることを特徴とする請求項１２に記載の微生物群集組成物。
【請求項１４】
前記請求項１２又は請求項１３において規定された微生物群集が請求項１〜請求項６のいずれかに記載の微生物群集であることを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載の微生物群集組成物。
【請求項１５】
少なくとも多環芳香族塩素化合物を包含する芳香族塩素化合物に対して嫌気的分解活性を示す微生物群集を、請求項７〜請求項１１のいずれかに記載の人工培地に接種して嫌気的条件下で培養することにより、接種前における微生物群集の嫌気的分解活性を１０ケ月以上維持させ、及び／又は、２倍以上に増強させることを特徴とする微生物群集の活性維持・増強方法。
【請求項１６】
前記請求項１５において規定された微生物群集が請求項１〜請求項６のいずれかに記載の微生物群集であることを特徴とする請求項１５に記載の微生物群集の活性維持・増強方法。
【請求項１７】
芳香族塩素化合物で汚染された土壌に対して、請求項１〜請求項６のいずれかに記載の微生物群集又は請求項１２〜請求項１４のいずれかに記載の微生物群集組成物を散布又は混合することを特徴とする汚染土壌の浄化方法。
【請求項１８】
芳香族塩素化合物で汚染された土壌地域に対して、請求項１〜請求項６のいずれかに記載の微生物群集又は請求項１２〜請求項１４のいずれかに記載の微生物群集組成物を含むバリヤー層を、当該土壌地域の周囲の土壌中に上下方向に構築し、及び／又は、当該土壌地域の底層の土壌中に水平方向に構築し、前記バリヤー層の外側への芳香族塩素化合物の拡散を防止することを特徴とする土壌汚染物質の拡散防止方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−３２０２４９（Ｐ２００６−３２０２４９Ａ）
【公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１４６２７９（Ｐ２００５−１４６２７９）
【出願日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年１１月２１日 日本微生物生態学会第２０回大会委員会発行の「日本微生物生態学会 第２０回大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年１１月２１日 日本微生物生態学会第２０回大会委員会発行の「日本微生物生態学会 第２０回大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]