微量元素濃度測定方法、微量元素濃度測定試薬、及び、鉄並びに銅のマスキング方法
【課題】
本発明は、原材料コストの低い鉄及び銅以外の微量元素測定方法、当該方法に使用する試薬、及び、鉄並びに銅のマスキング方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
亜鉛と錯体を形成し、かつ錯体形成前後で吸光波長がシフトするキレート剤を含有する試薬を用いて試料中の亜鉛濃度を比色測定する方法であって、前記試薬は、デフェロキサミンをさらに含有するものであり、試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミンを含む前記試薬を添加する工程を含む亜鉛濃度測定方法。
本発明は、原材料コストの低い鉄及び銅以外の微量元素測定方法、当該方法に使用する試薬、及び、鉄並びに銅のマスキング方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
亜鉛と錯体を形成し、かつ錯体形成前後で吸光波長がシフトするキレート剤を含有する試薬を用いて試料中の亜鉛濃度を比色測定する方法であって、前記試薬は、デフェロキサミンをさらに含有するものであり、試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミンを含む前記試薬を添加する工程を含む亜鉛濃度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量元素濃度測定方法、当該方法に用いる試薬、及び、鉄並びに銅のマスキング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者の入院が長期にわたると、当該患者は床ずれを起こすおそれがある。床ずれとは、体の一部分への血流が不十分となり、しだいに皮膚や筋肉がくずれていく症状をいう。近年、医療機関では、患者の床ずれの状態を管理する体制が求められている。
【０００３】
一方、血中の亜鉛の濃度は、患者の床ずれの状態の指標となることが知られている。このことから、近年、医療機関からの血中の亜鉛濃度を測定する試薬の需要が高まりつつある。
【０００４】
血中の亜鉛の測定技術は、古くは１９８０年代前半から存在する（例えば、特許文献１参照）。特許文献１では、血中の亜鉛の濃度を、キレート剤を用いて測定する技術が開示されている。血中の亜鉛の濃度を、キレート剤を用いて測定する技術分野において、正確に亜鉛濃度を測定するためには、血中の鉄及び銅によるキレート剤の影響を抑制するが、亜鉛には影響の少ない化合物又は組成、いわゆるマスキング剤を選定することが鍵となる。ところが、特許文献１の記載からも明らかなように、亜鉛測定試薬に、例えば、クエン酸塩、縮合リン酸塩及びフッ化ナトリウムなどの鉄のマスキング剤と、サリチルアルドキシム、２−メルカプトベンゾチアゾール及びジチオカルボキシザルコシンなどの銅のマスキング剤を個々に添加しただけでは、十分な測定結果が得られないという課題が当時存在していた。
【０００５】
係る課題を解決すべく、特許文献１では、亜鉛測定試薬に鉄のマスキング剤と、銅のマスキング剤を個々に加えた上、さらに１種又は２種以上の界面活性剤を共存させた亜鉛測定試薬が開示されている。
【０００６】
しかしながら、特許文献１の試薬は組成が複雑であり、その製造が煩雑になるという新たな課題が浮上していた。しかし、当時は血中の亜鉛の濃度を測定する試薬の需要はなかったために、亜鉛測定試薬の研究開発はこれ以上なされていないようである。この事は、特許文献１の公開から昨今に至るまで、血中の亜鉛の濃度を測定する技術において目新しい技術は開示されていないことからも伺える。
【０００７】
その上で、上述したとおり、血中の亜鉛の濃度が患者の床ずれの状態の指標となることが知られてからは、血中の亜鉛測定の研究開発競争が再発した。例えば、特許文献２では、マスキング剤として２−ピリジルアミノフェノール誘導体又はその塩が好適であることを開示している。特許文献２の亜鉛測定試薬は、組成が単純であるため、上記特許文献１における課題は解決していると言える。
【０００８】
しかしながら、特許文献２に開示されている試薬は、マスキング剤の含有量が多く、原材料のコストが高いという問題がある。
【０００９】
【特許文献１】特開昭５９−０３００６１号公報
【特許文献２】国際公開公報２００７／０９７４６８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、原材料コストの低い鉄及び銅以外の微量元素測定方法、当該方法に使用する試薬、及び、鉄並びに銅のマスキング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
［１］ 微量元素用キレート剤を含有する試薬を用いて生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定する方法であって、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩をさらに含有するものであり、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む前記試薬を添加する工程
を含む微量元素濃度測定方法、
［２］ 微量元素用キレート剤を含有する試薬を用いて生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定する方法であって、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩を含有する第１の試薬と、前記キレート剤を含有する第２の試薬を備え、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む前記第１の試薬を添加する工程
さらに、第２の試薬を添加する工程
を含む［１］に記載の微量元素濃度測定方法、
［３］ 微量元素が、亜鉛である［１］に記載の微量元素濃度測定方法、
［４］ 前記微量元素用キレート剤が、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール又は２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノールである［３］に記載の微量元素濃度測定方法、
［５］ 生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定するための試薬であって、
前記試薬は、微量元素用キレート剤及びデフェロキサミン若しくはその塩を含むものであり、
試料１Ｌに対して添加する試薬における前記デフェロキサミン又はその塩の含量が、０．２５〜１．５ｍｍｏｌとなるように調製されたものである
ことを特徴とする微量元素濃度測定試薬、
［６］ 生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定するための試薬であって、
前記試薬は、検体に前記第１の試薬を添加し、次いで、前記第２の試薬を添加するものであり、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩を含有する第１の試薬と、前記微量元素用キレート剤を含有する第２の試薬を備え、
試料１Ｌに対して添加する前記第１の試薬における前記デフェロキサミン又はその塩の含量が、０．２５〜１．５ｍｍｏｌである
ことを特徴とする［５］に記載の微量元素濃度測定試薬、
［７］ 鉄及び銅以外の微量元素が、亜鉛である［５］に記載の微量元素濃度測定試薬、
［８］ 前記微量金属用キレート剤が、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール又は２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノールである［７］に記載の微量元素濃度測定試薬、
及び、［９］ 試料中における鉄及び銅をマスキングする方法であって、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む溶液を添加する工程
を含む鉄及び銅のマスキング方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の微量元素測定方法、当該方法に使用する試薬、及び、鉄並びに銅のマスキング方法は、原材料コストが従来公知のものと比較して極めて低い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、微量元素用キレート剤を含有する試薬を用いて生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定する方法に関する。比色測定においては、試料中における鉄及び銅による影響を抑制するために、試料１Ｌに対して、いわゆるマスキング剤として、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む試薬を添加する。
【００１４】
本発明において「微量元素」とは、生体、とりわけヒトにとって微量ではあるが、その必須性が確認されている元素をいう。このような元素としては、例えば、アルミニウム、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、モリブデン、カドミウム、スズ、ヨウ素、バリウム、水銀、タリウム及び鉛などが挙げられる。但し、本発明の必須要件とされるマスキング剤（後述する）は、特定の条件下で試料中におけるマスキングする微量元素は鉄及び銅であることから、本発明における測定対象としての微量元素は、鉄及び銅以外の微量元素である。さらに、本発明は、ヒト血液中の亜鉛測定の分野における課題を解決するアプローチからなされたものであるため、測定対象としての微量元素は、主に亜鉛である。しかしながら、鉄及び銅のマスキングという作用は、測定対象としての微量元素と微量元素用キレート剤との錯体形成に影響を及ぼすものではないと考えるのが通常であるから、本発明における微量元素は必ずしも亜鉛に限定されるものではない。
【００１５】
本発明における試料としては、例えば、血液、汗、涙、尿、骨髄液及び脳髄液などが挙げられる。ここで、本発明は、血液中の微量元素測定の分野における課題を解決するアプローチからなされたものであるため、試料としては、主に血液である。但し、鉄、銅及び測定対象としての微量元素は、生体のいずれの部分にも存在しうるものであるから、本発明における試料は、必ずしも血液に限定されるものではない。
【００１６】
また、試料の由来は、例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、サル及びヒトなどが挙げられる。ここで、本発明は、ヒト由来試料の微量元素測定の分野における課題を解決するアプローチからなされたものであるため、試料としては、主にヒトである。但し、鉄、銅及び測定対象としての微量元素は、どの生体であっても存在しうるものであるから、本発明における試料の由来は、必ずしもヒトに限定されるものではない。
【００１７】
本発明において「微量元素用キレート剤」とは、上記の微量元素と錯体を形成する化合物をいう。さらには、当該化合物と微量元素との錯体形成前後において、吸光波長がシフトする化合物をいう。また、「比色測定」とは、このシフトされた波長における吸光度変化により微量元素の濃度を測定する測定をいう。診断分野における比色測定は、特段の事情がない限りは、日立製作所社製の自動分析装置により実施される。このことは、もはや周知の事項である。
【００１８】
尚、微量元素用キレート剤は、基本的な作用として、測定対象としての微量元素だけでなく、さらには鉄及び／又は銅とも錯体を形成する。このようなキレート剤としては、
(i) 測定対象としての微量元素が亜鉛である場合は、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール（以下、Ｂｒ−ＰＡＰＳと称す）、２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール（以下、Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳと称す）、３，３’−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］−ｏ−クレゾスルホンフタレイン・２ナトリウム塩（以下、ＸＯと称す）及び１−（２−ヒドロキシカルボニル−フェニル）−５−（２−ヒドロキシ−５−スルホフェニル）−３−フェニルフォルマザン・ナトリウム塩などが、
(ii) 測定対象としての微量元素がアルミニウムである場合は、４−（２−ピリジルアゾ）レゾルシノール（以下、ＰＡＲと称す）及びＸＯなどが、
(iii) 測定対象としての微量元素がクロムである場合は、８−［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノエチル］−４−メチルウンベリフェロン（以下、カルセインブルーと称す）及びＸＯなどが、
(iv) 測定対象としての微量元素がマンガンである場合は、ＰＡＲ及びＸＯなどが、
(v) 測定対象としての微量元素がコバルトである場合は、Ｂｒ−ＰＡＰＳ、Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノール（以下、Ｎｉｔｒｏｓｏ−ＰＳＰＡと称す）、カルセインブルー及びＸＯなどが、
(vi) 測定対象としての微量元素がニッケルである場合は、Ｂｒ−ＰＡＰＳＮｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ、Ｎｉｔｒｏｓｏ−ＰＳＰＡ及びＰＡＲなどが、
(vii) 測定対象としての微量元素がヒ素である場合は、アルセメート（ジエチルジチオカルバミック酸・銀塩などが、
(viii) 測定対象としての微量元素がセレンである場合は、２，３−ジアミノナフタレン及びＸＯなどが、
(ix) 測定対象としての微量元素がモリブデンである場合は、ＸＯなどが、
(x) 測定対象としての微量元素がカドミウムである場合は、ＰＡＲ、５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィネートテトラスルホン酸・ジスルフィド酸・４水和物（以下、ＴＰＰＳと称す）及びＸＯなどが、
(xi) 測定対象としての微量元素が鉛である場合は、ＴＰＰＳ及びＸＯなどが
挙げられる。測定対象としての微量元素が亜鉛である場合は、測定感度がよい観点から、Ｂｒ−ＰＡＰＳ及びＮｉｔｒｏ−ＰＡＰＳが望ましい。
【００１９】
但し、上記微量元素用キレート剤は、測定対象としての微量元素と錯体をするだけではなく、鉄や銅とも錯体を形成することがある。したがって、本発明では、試料中の微量元素を測定する場合にあっては、試薬には鉄や銅の影響を抑制する化合物、いわゆるマスキング剤を共存させることが必須となる。
【００２０】
本発明における試薬は、鉄及び銅に対するマスキング剤として、デフェロキサミン又はその塩をさらに含有するものである。本発明において「デフェロキサミン」とは、ＩＵＰＡＣ名でＮ’−［５−（アセチル−ヒドロキシアミノ）ペンチル）−Ｎ−［５−［［４−（５−アミノペンチル−ヒドロキシアミノ）ペンチル］−Ｎ−［５−［［４−アミノペンチル−ヒドロキシアミノ）−４−オキソブタノイル］アミノ］ペンチル］−Ｎ−ヒドロキシブタンジアミド（N'-[5-(acetyl-hydroxyamino)pentyl]-N-[5-[[4-(5-aminopentyl-hydroxyamino)-4-oxobutanoyl] amino]pentyl]-N-hydroxybutanediamide）、又は、Ｎ’−［５−（アセチル−ヒドロキシ−アミノ）ペンチル］−Ｎ−［５−［３−（５−アミノペンチル−ヒドロキシ−カルバモイル）パンタノイルアミノ］ペンチル］−Ｎ−ヒドロキシ−ブタンジアミド（N'-[5-(acetyl-hydroxy-amino)pentyl]-N-[5-[3-(5-aminopentyl-hydroxy-carbamoyl)propanoylamino]pentyl]-N-hydroxy-butanediamide）と称する化合物をいい、ＣＡＳ Ｎｏ．が７０−５１−９で表される化合物をいう。デフェロキサミンは、鉄の排泄を促進する注射剤（主に、ノバルティスファーマ社製のデスフェラール（登録商標）が挙げられる）の原材料化合物であって、下記化学式１に示す構造を有する化合物をいう。
【００２１】
【化１】
【００２２】
本発明において「その塩」とは、デフェロキサミンと塩を形成できる化合物であれば特に限定されるものではない。例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸並びにｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸、及び、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸並びにメシル酸などの無機酸が挙げられる。現在、市販されているデフェロキサミンの塩のほとんどがメシル酸塩である。一般的には、メシル酸デフェロキサミンを、単にデフェロキサミンと称することもあるが、本発明においては、メシル酸デフェロキサミンは、あくまでデフェロキサミンの１つの塩であることを留意されたい。尚、メシル酸デフェロキサミンは、例えば、シグマ・アルドリッチ社より購入することができる。
【００２３】
本発明の最大の特徴部分は、従来技術の技術における試薬に添加するマスキング剤の量と比較して、試薬に添加するマスキング剤、つまり、デフェロキサミン又はその塩の量がが、少量である点にある。具体的には、試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩が添加される。ここで、「試料１Ｌに対して」とは、実際に試料１Ｌを生体から採取するものであると解釈してはならない。あくまで、デフェロキサミン又はその塩の量を規定するための基準を「試料１Ｌ」に設定したにすぎない。ここで、試料１Ｌに対して、０．２５ｍｍｏｌよりも低い量のデフェロキサミン又はその塩を添加した場合は、単純に鉄及び銅のマスキング効果が得られにくくなる。一方、試料１Ｌに対して、１．５ｍｍｏｌよりも高い量のデフェロキサミン又はその塩を添加した場合は、原因は不明であるが、銅のマスキング効果が得られなくなるという現象が発生する。この現象は、後述する実施例及び比較例によっても実証されている。この現象は、当業者の技術常識からしても予測し得ないことである。言い換えれば、この現象を逆手にとり、本発明の試薬においては、従来技術と比較して少ないマスキング剤の含有量を実現することができるのである。ちなみに、特許文献１における試薬（実施例１）のマスキング剤の量は、実験例１の例において換算すると、試料１Ｌに対して、クエン酸３ナトリウムだけでも１６．８ｍｏｌも存在する。また、特許文献２における試薬（実施例１）のマスキング剤の量は、その例において換算すると、試料１Ｌに対して、ビス−トリスプロパンは７．５ｍｏｌも存在する。また、特許文献２における発明の詳細な説明においても、試料１Ｌに対して、ビス−トリスプロパンは５〜５０ｍｍｏｌ存在することが好ましい旨の記載がある。このことからも、本発明のマスキング剤の量は、従来技術におけるマスキング剤の量と比較して、極めて少量であることが明らかである。
【００２４】
本発明の試薬は、微量元素用キレート剤及びデフェロキサミン若しくはその塩を含むものであれば、いわゆる一試薬系であってもよく、また、二試薬系であってもよい。但し、キレート剤による比色測定は、マスキング剤による試料中の鉄及び銅の影響を抑制してから測定することが好ましい上、上述の日立製作所社製の自動分析装置が二試薬系に対応するものであることから、本発明の試薬は二試薬系であることが望ましい。いずれの試薬においても、試料１Ｌに対して添加するデフェロキサミン又はその塩の含量が、０．２５〜１．５ｍｍｏｌとなるように調製することは言うまでもない。例えば、試料２０〜３０μＬに対して、デフェロキサミン若しくはその塩を含む試薬１５０μＬを添加する場合は、当該試薬におけるデフェロキサミン若しくはその塩の濃度は０．０５〜０．２ｍＭの範囲で調製される。尚、上述の日立製作所社製の自動分析装置で測定可能とするよう、試薬を二試薬系にする場合は、例えば、当該装置にセットする試料の好適な量は１０〜３０μＬ、第一試薬の好適な量は１５０〜１８０μＬ、第二試薬の好適な量は７５〜９０μＬである。
【００２５】
試薬におけるキレート剤の濃度は、従来公知の濃度設定であればよく、特に限定されるものではない。例えば、試薬におけるキレート剤の濃度は、試料１Ｌに対して、１０〜５００ｍｍｏｌ、好ましくは１０〜５０ｍｍｏｌとなるように調製する。
【００２６】
また、上述した試薬においては、さらに、ＴｒｉｔｏｎＸ １００（商品名）、Ｂｒｉｊ３５（商品名）、並びにラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤及び／又はアジ化ナトリウムなどの安定化剤を添加してもよい。但し、銅及び鉄を有する化合物は添加しないように注意し、試薬の組成が複雑にならないようにすることが好ましいことは言うまでもない。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定して解釈してはならない。
【００２８】
実施例１〜４
第一試薬として、メシル酸デフェロキサミンの炭酸緩衝溶液を調製した。メシル酸デフェロキサミン濃度は、０．０５（実施例１）、０．１（実施例２）、０．１５（実施例３）及び０．２（実施例４）ｍＭとなるようにそれぞれ調製した。一方、第二試薬として、Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ濃度０．１５ｍＭの炭酸緩衝溶液を調製した。
【００２９】
実施例５〜８
キレート剤が異なっても、本発明の効果は変わらないことを確認するために、キレート剤の異なる試薬を調製した。具体的には、実施例１〜４の第二試薬のＮｉｔｒｏ−ＰＡＰＳを、Ｂｒ−ＰＡＰＳに置き換えた以外は各実施例に従って試薬を調製した。
【００３０】
比較例１
第一試薬として、炭酸緩衝溶液をそのまま用いた。一方、第二試薬として、Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ濃度０．１５ｍＭの炭酸緩衝溶液を調製した。
【００３１】
比較例２〜５
第一試薬として、メシル酸デフェロキサミンの炭酸緩衝溶液を調製した。メシル酸デフェロキサミン濃度は、０．５（比較例２）、１．０（比較例３）、２．０（比較例４）、及び１０．０（比較例５）ｍＭとなるようにそれぞれ調製した。一方、第二試薬として、Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ濃度０．１５ｍＭの炭酸緩衝溶液を調製した。
【００３２】
比較例６〜１０
実施例５〜８に対応して、比較例に関しても、新たに試薬を調製した。具体的には、比較例１〜５の第二試薬のＮｉｔｒｏ−ＰＡＰＳを、Ｂｒ−ＰＡＰＳに置き換えた以外は各比較例に従って試薬を調製した。
【００３３】
したがって、実施例１〜８及び比較例１〜１０におけるそれぞれの第一試薬中のマスキング剤の濃度及び第二試薬中のキレート剤の種類は、表１に示す通りとなる。
【００３４】
【表１】
【００３５】
参考例１：鉄の影響を測定するための試料液
試料液の基本液として、亜鉛が約１００μｇ／ｄＬ含有されている血清を用いた。この血清に所定量の塩化鉄四水和物を添加したものを試料液とした。具体的には、血清に添加した鉄の濃度を０、１００、２００、３００、４００及び５００μｇ／ｄＬに調製した６種類の鉄含有試料液（本発明における試料に相当）を調製した。
【００３６】
参考例２：銅の影響を測定するための試料液
塩化鉄四水和物を塩化銅二水和物に置き換えた以外は、参考例１と同様に６種類の銅含有試料液を調製した。
【００３７】
したがって、参考例１及び２におけるそれぞれの添加した金属及びその濃度は、表２に示す通りとなる。
【００３８】
【表２】
【００３９】
実験例１：鉄の影響に関する検討（試料液：２０μＬ、キレート剤：Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ）
参考例１の各試料液中の亜鉛濃度の測定の際における、鉄の影響について評価した。測定装置は、日立製作所社製の自動分析装置（７１７０）を用いた。そして、参考例１の試料液２０μＬ、実施例１〜４及び比較例１〜５のいずれかの第一試薬１５０μＬ、さらには実施例１〜４及び比較例１〜７のいずれかの第二試薬７５μＬを装置にセットした。本実験例における、試料液１Ｌに対するマスキング剤の量を表３に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】
そして、比色測定を開始した。測定値は、試料液に第一試薬が添加された時から約５分後の５７０ｎｍのキレート剤の吸光度から６６０ｎｍのキレート剤の吸光度を差し引いた吸光度を基準とし、第二試薬が添加された時から約５分後の５７０ｎｍのキレート剤の吸光度から６６０ｎｍのキレート剤の吸光度を差し引いた吸光度を測定するようにプログラミングした。
【００４２】
実験例２：銅の影響に関する検討（試料液：２０μＬ、キレート剤：Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ）
参考例２の各試料液中の亜鉛濃度の測定の際における、銅の影響について評価した。評価するにあたっての測定は、参考例１の試料液の代わりに、参考例２の試料液を用いたこと以外は、実験例１と同様に行った。したがって、本実験例における、試料液１Ｌに対するマスキング剤の量は、表３に示す通りである。
【００４３】
実験例１における結果を図１に、実験例２における結果を図２に示す。図１における縦軸は、実験例１における参考例１の鉄無添加の試料液の測定値を基準とした時の誤差をプロットした。一方、横軸は、鉄の濃度をプロットした。また、実験例２における参考例２の銅無添加の試料液の測定値を基準とした時の標準誤差をプロットした。一方、横軸は、銅の濃度をプロットした。
【００４４】
図１から明らかなように、いずれの実施例及び比較例１を除く比較例において、鉄の影響による誤差は少なくとも２．５％以下に抑えることができた。一方、図２から明らかなように、比較例１を除く比較例においては銅の影響による誤差が大きく見られた。これに対し、実施例においては銅の影響による誤差は、少なくとも２％以下に抑えることができている。そして、マスキング剤としてのデフェロキサミン又はその塩を全く添加しない場合、つまり比較例１においては、鉄の影響を大きく受けることが図１に示す結果より明らかとなっている。このことから、試料液に添加したマスキング剤としてのデフェロキサミン又はその塩は、少量でなければ、その効果を奏しないことが明らかとなった。
【００４５】
実験例３：鉄の影響に関する検討（試料液：３０μＬ、キレート剤：Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ）
実験例１における試料液の量を変化させることにより、相対的に試料１Ｌに対するマスキング剤の量も変化した場合についても検討した。具体的には、試料液を２０μＬから３０μＬにした事以外は実験例１と同様に行った。つまり、試料液１Ｌに対するマスキング剤の量は、表２に示す通りとなる。
【００４６】
【表４】
【００４７】
実験例４：銅の影響に関する検討（試料液：３０μＬ、キレート剤：Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ）
上記実験例３に対応して、参考例２の各試料液中の亜鉛濃度の測定の際における、銅の影響についても評価した。評価するにあたっての測定は、参考例１の試料液の代わりに、参考例２の試料液を用いたこと以外は、実験例３と同様に行った。したがって、試料１Ｌに対するマスキング剤の量は、表４に示す通りとなる。
【００４８】
実験例３における結果を図３に、実験例４における結果を図４に示す。図３からも明らかなように、いずれの実施例及び比較例１を除く比較例においても鉄の影響による誤差は、２％以下に抑えることができた。一方、図４から明らかなように、比較例１を除く比較例においては銅の影響による誤差が大きく見られた。これに対し、実施例においては鉄の影響による誤差は、２％以下に抑えることができている。このことからも、試料液に添加したマスキング剤としてのデフェロキサミン又はその塩は、試料１Ｌに対して、少なくとも０．２５〜１．５ｍｍｏｌの範囲の量を添加すれば、その効果を奏することが明らかとなった。
【００４９】
実験例５：鉄の影響に関する検討（試料液：２０μＬ、キレート剤：Ｂｒ−ＰＡＰＳ）
実験例１におけるキレート剤を変えた場合であっても、本発明の効果を奏することを確認する検討を行った。具体的には、実験例１におけるＮｉｔｒｏ−ＰＡＰＳを、Ｂｒ−ＰＡＰＳに用いたこと以外は、実験例１と同様に行った。この場合における、試料液１Ｌに対するマスキング剤の量は、表３に示す通りとなる。
【００５０】
実験例６：銅の影響に関する検討（試料液：２０μＬ、キレート剤：Ｂｒ−ＰＡＰＳ）
上記実験例５に対応して、参考例２の各試料液中の亜鉛濃度の測定の際における、銅の影響についても評価した。評価するにあたっての測定は、参考例１の試料液の代わりに、参考例２の試料液を用いたこと以外は、実験例３と同様に行った。したがって、試料１Ｌに対するマスキング剤の量は、表３に示す通りとなる。
【００５１】
実験例５における結果を図５に、実験例６における結果を図６に示す。図５からも明らかなように、いずれの実施例及び比較例１を除く比較例においても鉄の影響による誤差は、１％以下に抑えることができた。一方、図６から明らかなように、比較例１を除く比較例においては銅の影響による誤差が大きく見られた。これに対し、実施例においては鉄の影響による誤差は、６％以下に抑えることができている。このことからも、本発明の効果は、少量のデフェロキサミン又はその塩によるものであって、キレート剤が影響するものではないことが明らかとなった。
【００５２】
実験例７：鉄の影響に関する検討（試料液：３０μＬ、キレート剤：Ｂｒ−ＰＡＰＳ）
実験例３における試料液の量を増加させることにより、相対的に試料１Ｌに対するマスキング剤の量が減少した場合についても検討した。具体的には、試料液を２０μＬから３０μＬにした事以外は実験例３と同様に行った。つまり、試料液１Ｌに対するマスキング剤の量は、表２に示す通りとなる。
【００５３】
実験例８：銅の影響に関する検討（試料液：３０μＬ、キレート剤：Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ）
上記実験例７に対応して、参考例２の各試料液中の亜鉛濃度の測定の際における、銅の影響についても評価した。評価するにあたっての測定は、参考例１の試料液の代わりに、参考例２の試料液を用いたこと以外は、実験例７と同様に行った。したがって、試料１Ｌに対するマスキング剤の量は、表４に示す通りとなる。
【００５４】
実験例７における結果を図７に、実験例８における結果を図８に示す。図７からも明らかなように、いずれの実施例及び比較例１を除く比較例においても鉄の影響による誤差は、１％以下に抑えることができた。一方、図８から明らかなように、比較例１を除く比較例においては銅の影響による誤差が大きく見られた。これに対し、実施例においては鉄の影響による誤差は、５％以下に抑えることができている。このことからも、試料液に添加したマスキング剤としてのデフェロキサミン又はその塩は、試料１Ｌに対して、少なくとも０．２５〜１．５ｍｍｏｌの範囲の量を添加すれば、その効果を奏することが再度確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の微量元素測定方法、当該方法に使用する試薬、及び、鉄並びに銅のマスキング方法は、原材料コストが従来公知のものと比較して極めて低い。特に、本発明を利用する亜鉛測定試薬は、今後、入院患者の床ずれを調べるための診断用医薬品として普及するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実験例１における結果を示す図である。
【図２】実験例２における結果を示す図である。
【図３】実験例３における結果を示す図である。
【図４】実験例４における結果を示す図である。
【図５】実験例５における結果を示す図である。
【図６】実験例６における結果を示す図である。
【図７】実験例７における結果を示す図である。
【図８】実験例８における結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量元素濃度測定方法、当該方法に用いる試薬、及び、鉄並びに銅のマスキング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者の入院が長期にわたると、当該患者は床ずれを起こすおそれがある。床ずれとは、体の一部分への血流が不十分となり、しだいに皮膚や筋肉がくずれていく症状をいう。近年、医療機関では、患者の床ずれの状態を管理する体制が求められている。
【０００３】
一方、血中の亜鉛の濃度は、患者の床ずれの状態の指標となることが知られている。このことから、近年、医療機関からの血中の亜鉛濃度を測定する試薬の需要が高まりつつある。
【０００４】
血中の亜鉛の測定技術は、古くは１９８０年代前半から存在する（例えば、特許文献１参照）。特許文献１では、血中の亜鉛の濃度を、キレート剤を用いて測定する技術が開示されている。血中の亜鉛の濃度を、キレート剤を用いて測定する技術分野において、正確に亜鉛濃度を測定するためには、血中の鉄及び銅によるキレート剤の影響を抑制するが、亜鉛には影響の少ない化合物又は組成、いわゆるマスキング剤を選定することが鍵となる。ところが、特許文献１の記載からも明らかなように、亜鉛測定試薬に、例えば、クエン酸塩、縮合リン酸塩及びフッ化ナトリウムなどの鉄のマスキング剤と、サリチルアルドキシム、２−メルカプトベンゾチアゾール及びジチオカルボキシザルコシンなどの銅のマスキング剤を個々に添加しただけでは、十分な測定結果が得られないという課題が当時存在していた。
【０００５】
係る課題を解決すべく、特許文献１では、亜鉛測定試薬に鉄のマスキング剤と、銅のマスキング剤を個々に加えた上、さらに１種又は２種以上の界面活性剤を共存させた亜鉛測定試薬が開示されている。
【０００６】
しかしながら、特許文献１の試薬は組成が複雑であり、その製造が煩雑になるという新たな課題が浮上していた。しかし、当時は血中の亜鉛の濃度を測定する試薬の需要はなかったために、亜鉛測定試薬の研究開発はこれ以上なされていないようである。この事は、特許文献１の公開から昨今に至るまで、血中の亜鉛の濃度を測定する技術において目新しい技術は開示されていないことからも伺える。
【０００７】
その上で、上述したとおり、血中の亜鉛の濃度が患者の床ずれの状態の指標となることが知られてからは、血中の亜鉛測定の研究開発競争が再発した。例えば、特許文献２では、マスキング剤として２−ピリジルアミノフェノール誘導体又はその塩が好適であることを開示している。特許文献２の亜鉛測定試薬は、組成が単純であるため、上記特許文献１における課題は解決していると言える。
【０００８】
しかしながら、特許文献２に開示されている試薬は、マスキング剤の含有量が多く、原材料のコストが高いという問題がある。
【０００９】
【特許文献１】特開昭５９−０３００６１号公報
【特許文献２】国際公開公報２００７／０９７４６８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、原材料コストの低い鉄及び銅以外の微量元素測定方法、当該方法に使用する試薬、及び、鉄並びに銅のマスキング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
［１］ 微量元素用キレート剤を含有する試薬を用いて生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定する方法であって、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩をさらに含有するものであり、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む前記試薬を添加する工程
を含む微量元素濃度測定方法、
［２］ 微量元素用キレート剤を含有する試薬を用いて生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定する方法であって、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩を含有する第１の試薬と、前記キレート剤を含有する第２の試薬を備え、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む前記第１の試薬を添加する工程
さらに、第２の試薬を添加する工程
を含む［１］に記載の微量元素濃度測定方法、
［３］ 微量元素が、亜鉛である［１］に記載の微量元素濃度測定方法、
［４］ 前記微量元素用キレート剤が、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール又は２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノールである［３］に記載の微量元素濃度測定方法、
［５］ 生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定するための試薬であって、
前記試薬は、微量元素用キレート剤及びデフェロキサミン若しくはその塩を含むものであり、
試料１Ｌに対して添加する試薬における前記デフェロキサミン又はその塩の含量が、０．２５〜１．５ｍｍｏｌとなるように調製されたものである
ことを特徴とする微量元素濃度測定試薬、
［６］ 生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定するための試薬であって、
前記試薬は、検体に前記第１の試薬を添加し、次いで、前記第２の試薬を添加するものであり、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩を含有する第１の試薬と、前記微量元素用キレート剤を含有する第２の試薬を備え、
試料１Ｌに対して添加する前記第１の試薬における前記デフェロキサミン又はその塩の含量が、０．２５〜１．５ｍｍｏｌである
ことを特徴とする［５］に記載の微量元素濃度測定試薬、
［７］ 鉄及び銅以外の微量元素が、亜鉛である［５］に記載の微量元素濃度測定試薬、
［８］ 前記微量金属用キレート剤が、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール又は２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノールである［７］に記載の微量元素濃度測定試薬、
及び、［９］ 試料中における鉄及び銅をマスキングする方法であって、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む溶液を添加する工程
を含む鉄及び銅のマスキング方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の微量元素測定方法、当該方法に使用する試薬、及び、鉄並びに銅のマスキング方法は、原材料コストが従来公知のものと比較して極めて低い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、微量元素用キレート剤を含有する試薬を用いて生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定する方法に関する。比色測定においては、試料中における鉄及び銅による影響を抑制するために、試料１Ｌに対して、いわゆるマスキング剤として、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む試薬を添加する。
【００１４】
本発明において「微量元素」とは、生体、とりわけヒトにとって微量ではあるが、その必須性が確認されている元素をいう。このような元素としては、例えば、アルミニウム、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、モリブデン、カドミウム、スズ、ヨウ素、バリウム、水銀、タリウム及び鉛などが挙げられる。但し、本発明の必須要件とされるマスキング剤（後述する）は、特定の条件下で試料中におけるマスキングする微量元素は鉄及び銅であることから、本発明における測定対象としての微量元素は、鉄及び銅以外の微量元素である。さらに、本発明は、ヒト血液中の亜鉛測定の分野における課題を解決するアプローチからなされたものであるため、測定対象としての微量元素は、主に亜鉛である。しかしながら、鉄及び銅のマスキングという作用は、測定対象としての微量元素と微量元素用キレート剤との錯体形成に影響を及ぼすものではないと考えるのが通常であるから、本発明における微量元素は必ずしも亜鉛に限定されるものではない。
【００１５】
本発明における試料としては、例えば、血液、汗、涙、尿、骨髄液及び脳髄液などが挙げられる。ここで、本発明は、血液中の微量元素測定の分野における課題を解決するアプローチからなされたものであるため、試料としては、主に血液である。但し、鉄、銅及び測定対象としての微量元素は、生体のいずれの部分にも存在しうるものであるから、本発明における試料は、必ずしも血液に限定されるものではない。
【００１６】
また、試料の由来は、例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、サル及びヒトなどが挙げられる。ここで、本発明は、ヒト由来試料の微量元素測定の分野における課題を解決するアプローチからなされたものであるため、試料としては、主にヒトである。但し、鉄、銅及び測定対象としての微量元素は、どの生体であっても存在しうるものであるから、本発明における試料の由来は、必ずしもヒトに限定されるものではない。
【００１７】
本発明において「微量元素用キレート剤」とは、上記の微量元素と錯体を形成する化合物をいう。さらには、当該化合物と微量元素との錯体形成前後において、吸光波長がシフトする化合物をいう。また、「比色測定」とは、このシフトされた波長における吸光度変化により微量元素の濃度を測定する測定をいう。診断分野における比色測定は、特段の事情がない限りは、日立製作所社製の自動分析装置により実施される。このことは、もはや周知の事項である。
【００１８】
尚、微量元素用キレート剤は、基本的な作用として、測定対象としての微量元素だけでなく、さらには鉄及び／又は銅とも錯体を形成する。このようなキレート剤としては、
(i) 測定対象としての微量元素が亜鉛である場合は、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール（以下、Ｂｒ−ＰＡＰＳと称す）、２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール（以下、Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳと称す）、３，３’−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］−ｏ−クレゾスルホンフタレイン・２ナトリウム塩（以下、ＸＯと称す）及び１−（２−ヒドロキシカルボニル−フェニル）−５−（２−ヒドロキシ−５−スルホフェニル）−３−フェニルフォルマザン・ナトリウム塩などが、
(ii) 測定対象としての微量元素がアルミニウムである場合は、４−（２−ピリジルアゾ）レゾルシノール（以下、ＰＡＲと称す）及びＸＯなどが、
(iii) 測定対象としての微量元素がクロムである場合は、８−［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノエチル］−４−メチルウンベリフェロン（以下、カルセインブルーと称す）及びＸＯなどが、
(iv) 測定対象としての微量元素がマンガンである場合は、ＰＡＲ及びＸＯなどが、
(v) 測定対象としての微量元素がコバルトである場合は、Ｂｒ−ＰＡＰＳ、Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノール（以下、Ｎｉｔｒｏｓｏ−ＰＳＰＡと称す）、カルセインブルー及びＸＯなどが、
(vi) 測定対象としての微量元素がニッケルである場合は、Ｂｒ−ＰＡＰＳＮｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ、Ｎｉｔｒｏｓｏ−ＰＳＰＡ及びＰＡＲなどが、
(vii) 測定対象としての微量元素がヒ素である場合は、アルセメート（ジエチルジチオカルバミック酸・銀塩などが、
(viii) 測定対象としての微量元素がセレンである場合は、２，３−ジアミノナフタレン及びＸＯなどが、
(ix) 測定対象としての微量元素がモリブデンである場合は、ＸＯなどが、
(x) 測定対象としての微量元素がカドミウムである場合は、ＰＡＲ、５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィネートテトラスルホン酸・ジスルフィド酸・４水和物（以下、ＴＰＰＳと称す）及びＸＯなどが、
(xi) 測定対象としての微量元素が鉛である場合は、ＴＰＰＳ及びＸＯなどが
挙げられる。測定対象としての微量元素が亜鉛である場合は、測定感度がよい観点から、Ｂｒ−ＰＡＰＳ及びＮｉｔｒｏ−ＰＡＰＳが望ましい。
【００１９】
但し、上記微量元素用キレート剤は、測定対象としての微量元素と錯体をするだけではなく、鉄や銅とも錯体を形成することがある。したがって、本発明では、試料中の微量元素を測定する場合にあっては、試薬には鉄や銅の影響を抑制する化合物、いわゆるマスキング剤を共存させることが必須となる。
【００２０】
本発明における試薬は、鉄及び銅に対するマスキング剤として、デフェロキサミン又はその塩をさらに含有するものである。本発明において「デフェロキサミン」とは、ＩＵＰＡＣ名でＮ’−［５−（アセチル−ヒドロキシアミノ）ペンチル）−Ｎ−［５−［［４−（５−アミノペンチル−ヒドロキシアミノ）ペンチル］−Ｎ−［５−［［４−アミノペンチル−ヒドロキシアミノ）−４−オキソブタノイル］アミノ］ペンチル］−Ｎ−ヒドロキシブタンジアミド（N'-[5-(acetyl-hydroxyamino)pentyl]-N-[5-[[4-(5-aminopentyl-hydroxyamino)-4-oxobutanoyl] amino]pentyl]-N-hydroxybutanediamide）、又は、Ｎ’−［５−（アセチル−ヒドロキシ−アミノ）ペンチル］−Ｎ−［５−［３−（５−アミノペンチル−ヒドロキシ−カルバモイル）パンタノイルアミノ］ペンチル］−Ｎ−ヒドロキシ−ブタンジアミド（N'-[5-(acetyl-hydroxy-amino)pentyl]-N-[5-[3-(5-aminopentyl-hydroxy-carbamoyl)propanoylamino]pentyl]-N-hydroxy-butanediamide）と称する化合物をいい、ＣＡＳ Ｎｏ．が７０−５１−９で表される化合物をいう。デフェロキサミンは、鉄の排泄を促進する注射剤（主に、ノバルティスファーマ社製のデスフェラール（登録商標）が挙げられる）の原材料化合物であって、下記化学式１に示す構造を有する化合物をいう。
【００２１】
【化１】
【００２２】
本発明において「その塩」とは、デフェロキサミンと塩を形成できる化合物であれば特に限定されるものではない。例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸並びにｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸、及び、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸並びにメシル酸などの無機酸が挙げられる。現在、市販されているデフェロキサミンの塩のほとんどがメシル酸塩である。一般的には、メシル酸デフェロキサミンを、単にデフェロキサミンと称することもあるが、本発明においては、メシル酸デフェロキサミンは、あくまでデフェロキサミンの１つの塩であることを留意されたい。尚、メシル酸デフェロキサミンは、例えば、シグマ・アルドリッチ社より購入することができる。
【００２３】
本発明の最大の特徴部分は、従来技術の技術における試薬に添加するマスキング剤の量と比較して、試薬に添加するマスキング剤、つまり、デフェロキサミン又はその塩の量がが、少量である点にある。具体的には、試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩が添加される。ここで、「試料１Ｌに対して」とは、実際に試料１Ｌを生体から採取するものであると解釈してはならない。あくまで、デフェロキサミン又はその塩の量を規定するための基準を「試料１Ｌ」に設定したにすぎない。ここで、試料１Ｌに対して、０．２５ｍｍｏｌよりも低い量のデフェロキサミン又はその塩を添加した場合は、単純に鉄及び銅のマスキング効果が得られにくくなる。一方、試料１Ｌに対して、１．５ｍｍｏｌよりも高い量のデフェロキサミン又はその塩を添加した場合は、原因は不明であるが、銅のマスキング効果が得られなくなるという現象が発生する。この現象は、後述する実施例及び比較例によっても実証されている。この現象は、当業者の技術常識からしても予測し得ないことである。言い換えれば、この現象を逆手にとり、本発明の試薬においては、従来技術と比較して少ないマスキング剤の含有量を実現することができるのである。ちなみに、特許文献１における試薬（実施例１）のマスキング剤の量は、実験例１の例において換算すると、試料１Ｌに対して、クエン酸３ナトリウムだけでも１６．８ｍｏｌも存在する。また、特許文献２における試薬（実施例１）のマスキング剤の量は、その例において換算すると、試料１Ｌに対して、ビス−トリスプロパンは７．５ｍｏｌも存在する。また、特許文献２における発明の詳細な説明においても、試料１Ｌに対して、ビス−トリスプロパンは５〜５０ｍｍｏｌ存在することが好ましい旨の記載がある。このことからも、本発明のマスキング剤の量は、従来技術におけるマスキング剤の量と比較して、極めて少量であることが明らかである。
【００２４】
本発明の試薬は、微量元素用キレート剤及びデフェロキサミン若しくはその塩を含むものであれば、いわゆる一試薬系であってもよく、また、二試薬系であってもよい。但し、キレート剤による比色測定は、マスキング剤による試料中の鉄及び銅の影響を抑制してから測定することが好ましい上、上述の日立製作所社製の自動分析装置が二試薬系に対応するものであることから、本発明の試薬は二試薬系であることが望ましい。いずれの試薬においても、試料１Ｌに対して添加するデフェロキサミン又はその塩の含量が、０．２５〜１．５ｍｍｏｌとなるように調製することは言うまでもない。例えば、試料２０〜３０μＬに対して、デフェロキサミン若しくはその塩を含む試薬１５０μＬを添加する場合は、当該試薬におけるデフェロキサミン若しくはその塩の濃度は０．０５〜０．２ｍＭの範囲で調製される。尚、上述の日立製作所社製の自動分析装置で測定可能とするよう、試薬を二試薬系にする場合は、例えば、当該装置にセットする試料の好適な量は１０〜３０μＬ、第一試薬の好適な量は１５０〜１８０μＬ、第二試薬の好適な量は７５〜９０μＬである。
【００２５】
試薬におけるキレート剤の濃度は、従来公知の濃度設定であればよく、特に限定されるものではない。例えば、試薬におけるキレート剤の濃度は、試料１Ｌに対して、１０〜５００ｍｍｏｌ、好ましくは１０〜５０ｍｍｏｌとなるように調製する。
【００２６】
また、上述した試薬においては、さらに、ＴｒｉｔｏｎＸ １００（商品名）、Ｂｒｉｊ３５（商品名）、並びにラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤及び／又はアジ化ナトリウムなどの安定化剤を添加してもよい。但し、銅及び鉄を有する化合物は添加しないように注意し、試薬の組成が複雑にならないようにすることが好ましいことは言うまでもない。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定して解釈してはならない。
【００２８】
実施例１〜４
第一試薬として、メシル酸デフェロキサミンの炭酸緩衝溶液を調製した。メシル酸デフェロキサミン濃度は、０．０５（実施例１）、０．１（実施例２）、０．１５（実施例３）及び０．２（実施例４）ｍＭとなるようにそれぞれ調製した。一方、第二試薬として、Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ濃度０．１５ｍＭの炭酸緩衝溶液を調製した。
【００２９】
実施例５〜８
キレート剤が異なっても、本発明の効果は変わらないことを確認するために、キレート剤の異なる試薬を調製した。具体的には、実施例１〜４の第二試薬のＮｉｔｒｏ−ＰＡＰＳを、Ｂｒ−ＰＡＰＳに置き換えた以外は各実施例に従って試薬を調製した。
【００３０】
比較例１
第一試薬として、炭酸緩衝溶液をそのまま用いた。一方、第二試薬として、Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ濃度０．１５ｍＭの炭酸緩衝溶液を調製した。
【００３１】
比較例２〜５
第一試薬として、メシル酸デフェロキサミンの炭酸緩衝溶液を調製した。メシル酸デフェロキサミン濃度は、０．５（比較例２）、１．０（比較例３）、２．０（比較例４）、及び１０．０（比較例５）ｍＭとなるようにそれぞれ調製した。一方、第二試薬として、Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ濃度０．１５ｍＭの炭酸緩衝溶液を調製した。
【００３２】
比較例６〜１０
実施例５〜８に対応して、比較例に関しても、新たに試薬を調製した。具体的には、比較例１〜５の第二試薬のＮｉｔｒｏ−ＰＡＰＳを、Ｂｒ−ＰＡＰＳに置き換えた以外は各比較例に従って試薬を調製した。
【００３３】
したがって、実施例１〜８及び比較例１〜１０におけるそれぞれの第一試薬中のマスキング剤の濃度及び第二試薬中のキレート剤の種類は、表１に示す通りとなる。
【００３４】
【表１】
【００３５】
参考例１：鉄の影響を測定するための試料液
試料液の基本液として、亜鉛が約１００μｇ／ｄＬ含有されている血清を用いた。この血清に所定量の塩化鉄四水和物を添加したものを試料液とした。具体的には、血清に添加した鉄の濃度を０、１００、２００、３００、４００及び５００μｇ／ｄＬに調製した６種類の鉄含有試料液（本発明における試料に相当）を調製した。
【００３６】
参考例２：銅の影響を測定するための試料液
塩化鉄四水和物を塩化銅二水和物に置き換えた以外は、参考例１と同様に６種類の銅含有試料液を調製した。
【００３７】
したがって、参考例１及び２におけるそれぞれの添加した金属及びその濃度は、表２に示す通りとなる。
【００３８】
【表２】
【００３９】
実験例１：鉄の影響に関する検討（試料液：２０μＬ、キレート剤：Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ）
参考例１の各試料液中の亜鉛濃度の測定の際における、鉄の影響について評価した。測定装置は、日立製作所社製の自動分析装置（７１７０）を用いた。そして、参考例１の試料液２０μＬ、実施例１〜４及び比較例１〜５のいずれかの第一試薬１５０μＬ、さらには実施例１〜４及び比較例１〜７のいずれかの第二試薬７５μＬを装置にセットした。本実験例における、試料液１Ｌに対するマスキング剤の量を表３に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】
そして、比色測定を開始した。測定値は、試料液に第一試薬が添加された時から約５分後の５７０ｎｍのキレート剤の吸光度から６６０ｎｍのキレート剤の吸光度を差し引いた吸光度を基準とし、第二試薬が添加された時から約５分後の５７０ｎｍのキレート剤の吸光度から６６０ｎｍのキレート剤の吸光度を差し引いた吸光度を測定するようにプログラミングした。
【００４２】
実験例２：銅の影響に関する検討（試料液：２０μＬ、キレート剤：Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ）
参考例２の各試料液中の亜鉛濃度の測定の際における、銅の影響について評価した。評価するにあたっての測定は、参考例１の試料液の代わりに、参考例２の試料液を用いたこと以外は、実験例１と同様に行った。したがって、本実験例における、試料液１Ｌに対するマスキング剤の量は、表３に示す通りである。
【００４３】
実験例１における結果を図１に、実験例２における結果を図２に示す。図１における縦軸は、実験例１における参考例１の鉄無添加の試料液の測定値を基準とした時の誤差をプロットした。一方、横軸は、鉄の濃度をプロットした。また、実験例２における参考例２の銅無添加の試料液の測定値を基準とした時の標準誤差をプロットした。一方、横軸は、銅の濃度をプロットした。
【００４４】
図１から明らかなように、いずれの実施例及び比較例１を除く比較例において、鉄の影響による誤差は少なくとも２．５％以下に抑えることができた。一方、図２から明らかなように、比較例１を除く比較例においては銅の影響による誤差が大きく見られた。これに対し、実施例においては銅の影響による誤差は、少なくとも２％以下に抑えることができている。そして、マスキング剤としてのデフェロキサミン又はその塩を全く添加しない場合、つまり比較例１においては、鉄の影響を大きく受けることが図１に示す結果より明らかとなっている。このことから、試料液に添加したマスキング剤としてのデフェロキサミン又はその塩は、少量でなければ、その効果を奏しないことが明らかとなった。
【００４５】
実験例３：鉄の影響に関する検討（試料液：３０μＬ、キレート剤：Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ）
実験例１における試料液の量を変化させることにより、相対的に試料１Ｌに対するマスキング剤の量も変化した場合についても検討した。具体的には、試料液を２０μＬから３０μＬにした事以外は実験例１と同様に行った。つまり、試料液１Ｌに対するマスキング剤の量は、表２に示す通りとなる。
【００４６】
【表４】
【００４７】
実験例４：銅の影響に関する検討（試料液：３０μＬ、キレート剤：Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ）
上記実験例３に対応して、参考例２の各試料液中の亜鉛濃度の測定の際における、銅の影響についても評価した。評価するにあたっての測定は、参考例１の試料液の代わりに、参考例２の試料液を用いたこと以外は、実験例３と同様に行った。したがって、試料１Ｌに対するマスキング剤の量は、表４に示す通りとなる。
【００４８】
実験例３における結果を図３に、実験例４における結果を図４に示す。図３からも明らかなように、いずれの実施例及び比較例１を除く比較例においても鉄の影響による誤差は、２％以下に抑えることができた。一方、図４から明らかなように、比較例１を除く比較例においては銅の影響による誤差が大きく見られた。これに対し、実施例においては鉄の影響による誤差は、２％以下に抑えることができている。このことからも、試料液に添加したマスキング剤としてのデフェロキサミン又はその塩は、試料１Ｌに対して、少なくとも０．２５〜１．５ｍｍｏｌの範囲の量を添加すれば、その効果を奏することが明らかとなった。
【００４９】
実験例５：鉄の影響に関する検討（試料液：２０μＬ、キレート剤：Ｂｒ−ＰＡＰＳ）
実験例１におけるキレート剤を変えた場合であっても、本発明の効果を奏することを確認する検討を行った。具体的には、実験例１におけるＮｉｔｒｏ−ＰＡＰＳを、Ｂｒ−ＰＡＰＳに用いたこと以外は、実験例１と同様に行った。この場合における、試料液１Ｌに対するマスキング剤の量は、表３に示す通りとなる。
【００５０】
実験例６：銅の影響に関する検討（試料液：２０μＬ、キレート剤：Ｂｒ−ＰＡＰＳ）
上記実験例５に対応して、参考例２の各試料液中の亜鉛濃度の測定の際における、銅の影響についても評価した。評価するにあたっての測定は、参考例１の試料液の代わりに、参考例２の試料液を用いたこと以外は、実験例３と同様に行った。したがって、試料１Ｌに対するマスキング剤の量は、表３に示す通りとなる。
【００５１】
実験例５における結果を図５に、実験例６における結果を図６に示す。図５からも明らかなように、いずれの実施例及び比較例１を除く比較例においても鉄の影響による誤差は、１％以下に抑えることができた。一方、図６から明らかなように、比較例１を除く比較例においては銅の影響による誤差が大きく見られた。これに対し、実施例においては鉄の影響による誤差は、６％以下に抑えることができている。このことからも、本発明の効果は、少量のデフェロキサミン又はその塩によるものであって、キレート剤が影響するものではないことが明らかとなった。
【００５２】
実験例７：鉄の影響に関する検討（試料液：３０μＬ、キレート剤：Ｂｒ−ＰＡＰＳ）
実験例３における試料液の量を増加させることにより、相対的に試料１Ｌに対するマスキング剤の量が減少した場合についても検討した。具体的には、試料液を２０μＬから３０μＬにした事以外は実験例３と同様に行った。つまり、試料液１Ｌに対するマスキング剤の量は、表２に示す通りとなる。
【００５３】
実験例８：銅の影響に関する検討（試料液：３０μＬ、キレート剤：Ｎｉｔｒｏ−ＰＡＰＳ）
上記実験例７に対応して、参考例２の各試料液中の亜鉛濃度の測定の際における、銅の影響についても評価した。評価するにあたっての測定は、参考例１の試料液の代わりに、参考例２の試料液を用いたこと以外は、実験例７と同様に行った。したがって、試料１Ｌに対するマスキング剤の量は、表４に示す通りとなる。
【００５４】
実験例７における結果を図７に、実験例８における結果を図８に示す。図７からも明らかなように、いずれの実施例及び比較例１を除く比較例においても鉄の影響による誤差は、１％以下に抑えることができた。一方、図８から明らかなように、比較例１を除く比較例においては銅の影響による誤差が大きく見られた。これに対し、実施例においては鉄の影響による誤差は、５％以下に抑えることができている。このことからも、試料液に添加したマスキング剤としてのデフェロキサミン又はその塩は、試料１Ｌに対して、少なくとも０．２５〜１．５ｍｍｏｌの範囲の量を添加すれば、その効果を奏することが再度確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の微量元素測定方法、当該方法に使用する試薬、及び、鉄並びに銅のマスキング方法は、原材料コストが従来公知のものと比較して極めて低い。特に、本発明を利用する亜鉛測定試薬は、今後、入院患者の床ずれを調べるための診断用医薬品として普及するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実験例１における結果を示す図である。
【図２】実験例２における結果を示す図である。
【図３】実験例３における結果を示す図である。
【図４】実験例４における結果を示す図である。
【図５】実験例５における結果を示す図である。
【図６】実験例６における結果を示す図である。
【図７】実験例７における結果を示す図である。
【図８】実験例８における結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量元素用キレート剤を含有する試薬を用いて生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定する方法であって、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩をさらに含有するものであり、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む前記試薬を添加する工程
を含む微量元素濃度測定方法。
【請求項２】
微量元素用キレート剤を含有する試薬を用いて生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定する方法であって、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩を含有する第１の試薬と、前記キレート剤を含有する第２の試薬を備え、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む前記第１の試薬を添加する工程
さらに、第２の試薬を添加する工程
を含む請求項１に記載の微量元素濃度測定方法。
【請求項３】
微量元素が、亜鉛である請求項１に記載の微量元素濃度測定方法。
【請求項４】
前記微量元素用キレート剤が、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール又は２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノールである請求項３に記載の微量元素濃度測定方法。
【請求項５】
生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定するための試薬であって、
前記試薬は、微量元素用キレート剤及びデフェロキサミン若しくはその塩を含むものであり、
試料１Ｌに対して添加する試薬における前記デフェロキサミン又はその塩の含量が、０．２５〜１．５ｍｍｏｌとなるように調製されたものである
ことを特徴とする微量元素濃度測定試薬。
【請求項６】
生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定するための試薬であって、
前記試薬は、検体に前記第１の試薬を添加し、次いで、前記第２の試薬を添加するものであり、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩を含有する第１の試薬と、前記微量元素用キレート剤を含有する第２の試薬を備え、
試料１Ｌに対して添加する前記第１の試薬における前記デフェロキサミン又はその塩の含量が、０．２５〜１．５ｍｍｏｌである
ことを特徴とする請求項５に記載の微量元素濃度測定試薬。
【請求項７】
鉄及び銅以外の微量元素が、亜鉛である請求項５に記載の微量元素濃度測定試薬。
【請求項８】
前記微量金属用キレート剤が、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール又は２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノールである請求項７に記載の微量元素濃度測定試薬。
【請求項９】
試料中における鉄及び銅をマスキングする方法であって、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む溶液を添加する工程
を含む鉄及び銅のマスキング方法。
【請求項１】
微量元素用キレート剤を含有する試薬を用いて生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定する方法であって、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩をさらに含有するものであり、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む前記試薬を添加する工程
を含む微量元素濃度測定方法。
【請求項２】
微量元素用キレート剤を含有する試薬を用いて生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定する方法であって、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩を含有する第１の試薬と、前記キレート剤を含有する第２の試薬を備え、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む前記第１の試薬を添加する工程
さらに、第２の試薬を添加する工程
を含む請求項１に記載の微量元素濃度測定方法。
【請求項３】
微量元素が、亜鉛である請求項１に記載の微量元素濃度測定方法。
【請求項４】
前記微量元素用キレート剤が、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール又は２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノールである請求項３に記載の微量元素濃度測定方法。
【請求項５】
生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定するための試薬であって、
前記試薬は、微量元素用キレート剤及びデフェロキサミン若しくはその塩を含むものであり、
試料１Ｌに対して添加する試薬における前記デフェロキサミン又はその塩の含量が、０．２５〜１．５ｍｍｏｌとなるように調製されたものである
ことを特徴とする微量元素濃度測定試薬。
【請求項６】
生体から採取した試料中の鉄及び銅以外の微量元素濃度を比色測定するための試薬であって、
前記試薬は、検体に前記第１の試薬を添加し、次いで、前記第２の試薬を添加するものであり、
前記試薬は、デフェロキサミン又はその塩を含有する第１の試薬と、前記微量元素用キレート剤を含有する第２の試薬を備え、
試料１Ｌに対して添加する前記第１の試薬における前記デフェロキサミン又はその塩の含量が、０．２５〜１．５ｍｍｏｌである
ことを特徴とする請求項５に記載の微量元素濃度測定試薬。
【請求項７】
鉄及び銅以外の微量元素が、亜鉛である請求項５に記載の微量元素濃度測定試薬。
【請求項８】
前記微量金属用キレート剤が、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノール又は２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−３−スルホプロピルアミノ）フェノールである請求項７に記載の微量元素濃度測定試薬。
【請求項９】
試料中における鉄及び銅をマスキングする方法であって、
試料１Ｌに対して、０．２５〜１．５ｍｍｏｌのデフェロキサミン又はその塩を含む溶液を添加する工程
を含む鉄及び銅のマスキング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−２１０４３４（Ｐ２００９−２１０４３４Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３９９３（Ｐ２００８−５３９９３）
【出願日】平成２０年３月４日（２００８．３．４）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月４日（２００８．３．４）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
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