心血管障害発症リスクの評価方法及び評価用キット
【課題】脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞等の心血管障害（ＣＶＤ）の将来の発症リスクを把握できる技術を提供する
【解決手段】被験者から採取した体液におけるＬＡＢ（LOX-1 ligand containing ApoB）濃度を指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価する心血管障害発症リスクの評価方法が提供される。ＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表されるＬＯＸインデックスを指標とする心血管障害発症リスクの評価方法も提供される。当該方法を簡便に行うためのキットも提供される。
【解決手段】被験者から採取した体液におけるＬＡＢ（LOX-1 ligand containing ApoB）濃度を指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価する心血管障害発症リスクの評価方法が提供される。ＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表されるＬＯＸインデックスを指標とする心血管障害発症リスクの評価方法も提供される。当該方法を簡便に行うためのキットも提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管障害発症リスクの評価方法及び評価用キットに関し、さらに詳細には、体液中のバイオマーカーを指標として心血管障害の将来の発症リスクを評価する心血管障害発症リスクの評価方法、及び当該方法に用いる心血管障害発症リスクの評価用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は所謂悪玉コレステロールと呼ばれるものであり、動脈硬化の発症と密接に関連しているといわれている。ＬＤＬは、アポリポタンパク質Ｂ（以下「ＡｐｏＢ」と称する。）と種々の脂質から構成されている。また、動脈硬化の重要な危険因子（リスクファクター）である高ＬＤＬコレステロール血症においては、酸化ＬＤＬがその生物活性を担っているといわれている（非特許文献１）。
【０００３】
レクチン様酸化ＬＤＬ受容体（Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，以下「ＬＯＸ−１」と称する。）は酸化ＬＤＬ受容体の一種であり、その機能解析が急速に進められている（非特許文献１）。ＬＯＸ−１は細胞膜一回貫通型の膜タンパク質であり、その詳細な構造はすでに明らかにされ、遺伝子もクローニングされている（特許文献１、非特許文献１）。また、血液中に可溶性ＬＯＸ−１（soluble LOX-1、以下「ｓＬＯＸ−１」と称することがある。）が存在することが知られている。可溶性ＬＯＸ−１の臨床的意義についてはいくつかの可能性が指摘されているが、詳細は明らかでない（非特許文献１）。
【０００４】
ところで、日本においては、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞といった心血管障害（cardiovascular disease; ＣＶＤ）が増加傾向にあり、その対策が求められている。心血管障害を発症するとそのまま死亡に至るおそれがあり、生存した場合でも、特に脳卒中と脳梗塞については後遺症を残すことも珍しくない。したがって、心血管障害については、治療に加えて「予防」することが重要である。そして、予防のために、個々の者について心血管障害の将来の発症リスクを把握できれば好適である。すなわち、発症リスクを予め把握できれば、投薬や生活習慣の改善指導等を早期に行うことができ、心血管障害の予防に役立つと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−９８７８７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日薬理誌，第１１９巻，ｐ１４５−１５４，２００２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、心血管障害の将来の発症リスクを把握できる有効な技術は見当たらず、心血管障害のリスク診断は行われていないのが現状である。もちろん、当該発症リスクを反映するバイオマーカーの存在も知られていない。このような現状に鑑み、本発明は、被験者における心血管障害の将来の発症リスクを把握できる一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、心血管障害の将来の発症リスクを反映するバイオマーカーを探索すべく、１０年以上の追跡調査によって心血管障害（特に、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞）の発症とその後の経過が確定している患者の血清について、網羅的な解析を行った。そして、採血時には異常はなかったが後に心血管障害を発症した患者の血清を詳細に解析し、当該患者に特異的なマーカーを探索した。その結果、ＬＡＢ（LOX-1 ligand containing ApoB）の濃度、さらに、ＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表される新しい指標「ＬＯＸインデックス」が、心血管障害の将来の発症リスクを反映していることを見出し、本発明を完成した。すなわち、上記した課題を解決するための本発明は、以下のとおりである。
【０００９】
請求項１に記載の発明は、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度を指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価することを特徴とする心血管障害発症リスクの評価方法である。
【００１０】
本発明は心血管障害発症リスクの評価方法に係るものであり、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度を指標として、当該被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価する。本発明によれば、従来は困難であった心血管障害の将来の発症リスクの評価を正確に行うことができる。また、本発明では一般の臨床検査と同様に被験者から採取した体液を検査材料とするので、簡便かつ迅速に操作を行うことができる。
【００１１】
ＬＡＢ（LOX-1 ligand containing ApoB）とは、ＬＯＸ−１に結合する活性をもつ生体内物質であってＡｐｏＢをその分子内に含むものを指す。ＬＡＢの代表例は酸化ＬＤＬであるが、結合活性があればそれに限定されない。ＬＡＢの詳細については、例えば、Kakutani M., et al., Biochem Biophys Res Commun. 2001 Mar 23;282(1):180-5.に記載されている。
【００１２】
本発明における「心血管障害の将来の発症リスクの評価」には、発症リスクの有無を判定することや、発症リスクの度合いを定量的に評価することが含まれる。
なお本発明においては、体液中のＬＡＢ濃度が高いほど、心血管障害の将来の発症リスクが高いと評価される。
【００１３】
請求項２に記載の発明は、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表されるＬＯＸインデックスを指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価することを特徴とする心血管障害発症リスクの評価方法である。
【００１４】
本発明も心血管障害発症リスクの評価方法に係るものであり、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表されるＬＯＸインデックスを指標として、当該被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価する。本発明では、ＬＯＸインデックス（ＬＡＢ濃度×可溶性ＬＯＸ−１濃度）を指標とするので、ＬＯＸ−１のファクターが加味されたより正確な心血管障害発症リスクの評価が可能となる。
なお本発明においては、ＬＯＸインデックスの値が高いほど、心血管障害の将来の発症リスクが高いと評価される。
【００１５】
請求項１又は２に記載の心血管障害発症リスクの評価方法において、体液が血液である構成が推奨される（請求項３）。
【００１６】
請求項１〜３のいずれかに記載の心血管障害発症リスクの評価方法において、心血管障害が脳卒中、脳梗塞、又は心筋梗塞である構成が推奨される（請求項４）。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の心血管障害発症リスクの評価方法に用いるためのキットであって、ＬＡＢに対する抗体を含むことを特徴とする心血管障害発症リスクの評価用キットである。
【００１８】
本発明は心血管障害発症リスクの評価用キットに係るものであり、ＬＡＢに対する抗体を含むことを特徴とする。本発明のキットによれば、被験者の体液中のＬＡＢ濃度を簡便に測定することができ、心血管障害の将来の発症リスクを簡単かつ迅速に評価することができる。なお、「ＬＡＢに対する抗体」には、ＡｐｏＢに対する抗体が含まれる。
【００１９】
請求項６に記載の発明は、可溶性ＬＯＸ−１に対する抗体をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の心血管障害発症リスクの評価用キットである。
【００２０】
本発明の心血管障害発症リスクの評価用キットは、可溶性ＬＯＸ−１に対する抗体をさらに含む。かかる構成により、被験者の体液中のＬＡＢ濃度に加えて可溶性ＬＯＸ−１濃度も簡便に測定することができ、特に、ＬＯＸインデックスを用いた心血管障害の将来の発症リスクを簡単かつ迅速に評価することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の心血管障害発症リスクの評価方法によれば、従来は困難であった心血管障害の将来の発症リスクの評価を正確に行うことができる。
【００２２】
本発明の心血管障害発症リスクの評価用キットによれば、心血管障害の将来の発症リスクを簡単かつ迅速に評価することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の心血管障害発症リスクの評価方法の１つの様相は、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度を指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価するものである。また、本発明の心血管障害発症リスクの評価方法の他の様相は、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表されるＬＯＸインデックスを指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価するものである。
【００２４】
本発明で使用する体液としては特に限定はないが、好ましくは血液が用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿を検査材料（測定試料）とすることが好ましい。血清又は血漿は、遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００２５】
心血管障害の例としては、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞、等を挙げることができる。
【００２６】
ＬＡＢあるいは可溶性ＬＯＸ−１の測定方法としては特に限定はなく、例えば、タンパク質の定量法として一般に採用されている方法をそのまま適用することができる。好ましくは、抗体を用いてＬＡＢあるいは可溶性ＬＯＸ−１の濃度を測定する。抗体を用いる方法の例としては、免疫測定法（イムノアッセイ）が挙げられる。
【００２７】
免疫測定法によれば、体液のような夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができ、好適である。免疫測定法の例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらの免疫測定法に用いるＬＡＢあるいは可溶性ＬＯＸ−１に対する抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。また、ＬＡＢはその分子内にＡｐｏＢを含むものであるから、抗ＡｐｏＢ抗体をＬＡＢに対する抗体として採用することができる。
ＬＡＢ（又はＡｐｏＢ）、可溶性ＬＯＸ−１に対する各モノクローナル抗体はすでに取得されており、一部は市販もされている。
【００２８】
ＬＡＢの測定に関しては、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体とを組み合わせたサンドイッチ法の系によっても行うことができる。例えば、ＬＯＸ−１をプレートやビーズ等の支持体（固相）に固定化しておき、検体となる体液を接触させる。これにより、ＬＯＸ−１のリガンドであるＬＡＢは固相上のＬＯＸ−１に結合し、固相上に捕捉される。その後、捕捉されたＬＡＢに抗ＡｐｏＢ抗体を接触させて結合させ、当該ＬＡＢを検出すればよい。検出は、酵素等で予め標識した抗ＡｐｏＢ抗体を用いて行ってもよいし、抗ＡｐｏＢ抗体と反応する標識抗体（２次抗体）を用いて行ってもよい。
【００２９】
免疫測定法以外では、例えばウエスタンブロット法を採用することもできる。例えば、測定試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的タンパク質（ＬＡＢ又は可溶性ＬＯＸ−１）を分離した後、分離された目的タンパク質をニトロセルロース等の膜に転写する。そして、膜上に転写された目的タンパク質を検出する。目的タンパク質の検出は、例えば標識抗体を膜上の目的タンパク質に対して直接的または間接的に結合させ、当該標識を検出することにより行うことができる。
【００３０】
抗体を用いずにＬＡＢ濃度や可溶性ＬＯＸ−１濃度を測定することもでき、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー、質量分析法を採用することができる。電気泳動法によって目的タンパク質の濃度を測定する場合には、例えば、測定試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して目的タンパク質を分離し、適宜の色素や蛍光試薬でゲルを染色し、目的タンパク質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけでは目的タンパク質の分離が不十分な場合には、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。
【００３１】
クロマトグラフィーによって目的タンパク質の濃度を測定する場合には、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、測定試料をＨＰＬＣに供して目的タンパク質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中の目的タンパク質の濃度を測定することができる。
【００３２】
質量分析法を採用する場合は、質量分析計を用いてＬＡＢ濃度又は可溶性ＬＯＸ−１由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもってＬＡＢ濃度又は可溶性ＬＯＸ−１の濃度を測定する。例えば、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization；ＭＡＬＤＩ）と飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer；ＴＯＦ）とを組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて、体液中の目的タンパク質の濃度を測定することができる。
【００３３】
本発明の心血管障害発症リスクの評価方法は、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度又はＬＯＸインデックスを「指標」とするものである。「指標」の代表例は基準値との比較である。当該基準値としては、例えば、心血管障害を発症した者における発症前の血清と心血管障害を発症しなかった者（健常者）の血清を用いて、ＬＡＢと可溶性ＬＯＸ−１の測定を予め行い、ＬＡＢ濃度又はＬＯＸインデックスの値を両者で比較して設定したカットオフ値を採用することができる。
【００３４】
本発明の心血管障害発症リスクの評価用キットは、ＬＡＢに対する抗体を含むものである。また、好ましい実施形態では、可溶性ＬＯＸ−１に対する抗体をさらに含む。本発明のキットは、免疫測定法のような抗体を用いた方法によってＬＡＢあるいは可溶性ＬＯＸ−１を測定するために用いられる。これらの抗体は、単独の試薬であってもよいし、固相等に結合した状態であってもよい。
【００３５】
本発明のキットの構成例を以下に挙げる。構成例１は、ＬＡＢを指標とする方法に特に適したものである。構成例２は、ＬＯＸインデックスを指標とする方法に特に適したものである。これらのキットには、さらに、プレートやビーズ等の支持体（固相）、標識抗体、発色基質、等をさらに含めてもよい。
【００３６】
〔キットの構成例１〕
（ａ）組換えヒトＬＯＸ−１（固相用）
（ｂ）抗ヒトＡｐｏＢモノクローナル抗体（標識又は未標識）
（ｃ）ＬＡＢ標準品（又は酸化ＬＤＬ標準品）
（ｄ）希釈用緩衝液
【００３７】
〔キットの構成例２〕
（ａ）組換えヒトＬＯＸ−１（固相用）
（ｂ）抗ヒトＡｐｏＢモノクローナル抗体（標識又は未標識）
（ｃ）ＬＡＢ標準品（又は酸化ＬＤＬ標準品）
（ｄ）希釈用緩衝液
（ｅ）抗ヒトＬＯＸ−１モノクローナル抗体Ａ（固相用）
（ｆ）抗ヒトＬＯＸ−１モノクローナル抗体Ｂ（標識又は未標識）
（ｇ）ＬＯＸ−１標準品
なお、（ｅ）と（ｆ）はエピトープが互いに異なる抗体である。
【００３８】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
（１）検体のプロファイル
国立循環器病センターの集団研究に同意の得られた３０歳から７９歳の男女６４８５名について、１９８９年から２００５年にかけて２年毎に検診が行われ、採取した血清が−８０℃にて保管されている。このうち、１９９４年４月から１９９５年２月までの間に検診を受けた男性１１７２名、女性１２６４名、計２４３６名の血清を、以下の解析対象とした。なお、２４３６名のうち２３５６名には、脳卒中と虚血性心疾患の既往症はなかった。
【００４０】
（２）ベースラインサーベイ
以下のように、問診、人体計測、および早朝空腹時血糖（１０時間絶食後）の測定を含む方法によって、ベースラインサーベイが行われた。
まず、身長と体重（軽装着服）からＢＭＩを算出した。血圧は、少なくとも５分以上、安静座位の状態ののち標準水銀血圧計にて測定した。測定回数は３回とした。収縮期血圧（ＳＢＰ）１４０ｍｍＨｇ以上、拡張期血圧（ＤＢＰ）９０ｍｍＨｇ以上を高血圧とした。降圧薬の使用者は高血圧とした。また、血清総コレステロール（ＴＣ）、ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、および空腹時血糖を、自動分析機にて測定した。空腹時血糖値が７．０ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上、または随時血糖値１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）以上の場合に、糖尿病に分類した。糖尿病治療中の者は糖尿病に分類した。さらに、喫煙、飲酒、病歴について、問診を行った。
【００４１】
（３）ＬＡＢの測定
ヒトＬＯＸ−１（固相）と抗ＡｐｏＢモノクローナル抗体（１次抗体）を用いたＥＬＩＳＡにて測定した。すなわち、４０μＬの酸化ＬＤＬ標準品（自家調製品；Sawamura T, et al., Nature 1997;386(6620):73-77 及び Sato Y, et al., Atherosclerosis. 2008;200(2):303-309 に記載）あるいは２０倍希釈した血清を、組換えヒトＬＯＸ−１（自家調製品；Sato Y, et al., Atherosclerosis. 2008;200(2):303-309 に記載）を固定化した３８４−ウェルプレートにアプライした（０．２５μｇ／ウェル）。捕捉されたＬＡＢを、１次抗体たるチキン抗ＡｐｏＢモノクローナル抗体（自家調製品；Sato Y, et al., Atherosclerosis. 2008;200(2):303-309 に記載）と２次抗体たるペルオキシダーゼ標識ロバ抗チキンＩｇＹ抗体（ケミコン社）の組み合わせで検出した。基質として、3,3'5,5'-tetramethylbenzidine（ＴＭＢ溶液；バイオラッド・ラボラトリーズ社）を用いた。測定範囲は、酸化ＬＤＬ標準品で６２．５〜１００００ｎｇ／ｍＬとした。本測定の精度（ＣＶ）は、イントラアッセイで７．０％、インターアッセイで１４．５％であった（ｎ＝１０）。
【００４２】
（４）可溶性ＬＯＸ−１（ｓＬＯＸ−１）の測定
２種の抗ヒトＬＯＸ−１モノクローナル抗体（固相抗体と１次抗体）を用いたＥＬＩＳＡにて測定した。すなわち、４０μＬの組換えヒトＬＯＸ−１標準品（自家調製品；Li D, et al., Circulation. 2003 Feb 4;107(4):612-7に記載）あるいは４倍希釈した血清を、抗ヒトＬＯＸ−１モノクローナル抗体を固定化した３８４-ウェルプレートにアプライした（０．２５μｇ／ウェル）。捕捉されたｓＬＯＸ−１を、１次抗体たるチキン抗ヒトＬＯＸ−１抗体（自家調製品）と２次抗体たるペルオキシダーゼ標識ロバ抗チキンＩｇＹ抗体（ケミコン社）の組み合わせで検出した。基質として、3,3'5,5'-tetramethylbenzidine（ＴＭＢ溶液；バイオラッド・ラボラトリーズ社）を用いた。測定範囲は、組換えヒトＬＯＸ−１標準品で１５．６〜１００００ｐｇ／ｍＬとした。本測定の精度（ＣＶ）は、イントラアッセイで７．５％、インターアッセイで１２．５％であった（ｎ＝１０）。
【００４３】
（５）参加者のサーベイ
参加者における心筋梗塞と脳卒中に関して、以下のように追跡調査を行った。
第１ステップとして、２年毎の検診と１年毎のアンケート調査を行った。第２ステップとして、病院内の医療記録を精査した。
脳卒中の判断基準は、米国の脳卒中国内調査基準（U.S. National Survey of Stroke criteria; Stroke, 1981, 12(2 Pt 2 Suppl 1): I13-44）に従った。脳卒中のサブタイプである脳梗塞、脳内出血、およびクモ膜下出血の確定診断は、ＣＴ撮影、ＭＲＩあるいは剖検により行った。
心筋梗塞の判断基準は、ＷＨＯのＭＯＮＩＣＡ（Monitoring Trends and Determinants of Cardiovascular Disease）プロジェクトの基準に従った。
臨床訪問またはアンケートで典型的な臨床症状があった場合は、医療記録がなくても心筋梗塞あるいは脳卒中と分類した（１３．８％）。さらに、心筋梗塞あるいは脳卒中であって死に至ったケースを調べるために、死亡診断書を系統的に調査した。死亡診断書が確認されたが本サーベイランスシステムに登録されていなかったケースについては、心筋梗塞あるいは脳卒中に分類した。起源不明の急死（発病から２４時間以内に生じたもの）は、心筋梗塞に分類した。
【００４４】
（６）統計分析
上記（３）及び（４）のＥＬＩＳＡにて得られたＬＡＢ濃度とｓＬＯＸ−１濃度の値を乗じて、ＬＯＸインデックスを計算した。四分位の範囲で、ｓＬＯＸ、ＬＡＢ、及びＬＯＸインデックスのカットオフ点を設定した。平均値の分散分析または比率のカイ二乗検定を行った。心筋梗塞と脳卒中に関し、ｓＬＯＸ、ＬＡＢ、およびＬＯＸインデックスについて、年齢調整（Age-adjusted）オッズ比（ＯＲ）、並びに、年齢、高血圧、糖尿病、脂質低下作用薬の使用、ＢＭＩ、喫煙、および飲酒の各ファクターを調整した多変数調整（Multivariable-adjusted）オッズ比を、ロジスティック回帰分析によって計算した。性差をさらに調整した性結合分析（sex-combined analysis）も行った。信頼区間は９５％とし、有意性はＰ値＜０．０５で判定した。全ての分析は、社会科学用統計パッケージ（リリースバージョン８．２；ＳＡＳインスティテュート社）を用いて行った。
【００４５】
（７）ベースラインサーベイの結果
ＬＡＢの平均値は、男性で５１６．１±１７．１ｎｇ／ｍＬ、女性で７８２．３±２３．７ｎｇ／ｍＬであった。ｓＬＯＸ−１の平均値は、男性で１,０６０．１±８．６ｐｇ／ｍＬ、女性で７９７．８±０．２ｐｇ／ｍＬであった。血清総コレステロール（ＴＣ）の平均値は、男性で１８１．５±１．３ｍｇ／ｄＬ、女性で２２４．５±２．０ｍｇ／ｄＬであった。
第１表に、ＬＡＢの四分位（Ｑ１〜Ｑ４）毎の各検査項目の平均値または有病率を示す。第２表に、ｓＬＯＸ−１の四分位（Ｑ１〜Ｑ４）毎の各検査項目の平均値または有病率を示す。すなわち、両性とも、ＬＡＢ四分位にしたがって、ＴＣの平均値に有意差があった。ＴＣは、より高いＬＡＢ四分位においてより高い傾向にあった。これに対し、ＴＣはｓＬＯＸ−１四分位に関係していなかった。また、ＨＤＬ−Ｃは、女性で、ＬＡＢおよびｓＬＯＸ−１のいずれでも、高い四分位においてより低い傾向を示した。喫煙率については、より高いｓＬＯＸ−１四分位においてより高い傾向を示したが、ＬＡＢとの関係はみられなかった。高血圧症有病率と糖尿病有病率については、有意差は認めらなかった。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
（８）心血管障害とＬＡＢ、ｓＬＯＸ−１との関係
追跡調査において、採血時には異常はなかったが、後に心筋梗塞あるいは脳梗塞を発症したケースが１０３例あった。詳細には、２８例の心筋梗塞と７５例の脳卒中が確認され、これらは５３例の脳梗塞を含んでいた。これら１０３例の血清について、詳細に解析した。
【００４９】
第３表に、ＬＡＢで階層化された年齢調整オッズ比と多変数調整オッズ比を疾病ごとに示す。第４表に、ｓＬＯＸ−１で階層化された年齢調整オッズ比と多変数調整オッズ比を疾病ごとに示す。各表において、年齢調整オッズ比と多変数調整オッズ比の括弧書きは、オッズ比の範囲である。
第３表に示すように、男性と女性を組み合わせると、心血管障害のＯＲは、ＬＡＢの最上位四分位（Ｑ４）において、有意に最も高かった。また、脳卒中、脳梗塞、および心筋梗塞のＯＲも、ＬＡＢの最上位四分位（Ｑ４）において最も高く、脳梗塞では統計的有意差を示した。さらに、症例数が少ないために統計的有意差は確認できなかったが、心血管障害について、男女別でも同様の結果が得られた。
一方、第４表に示すように、ｓＬＯＸ−１についても最上位四分位（Ｑ４）において、脳卒中、脳梗塞、および心筋梗塞のＯＲが最も高かったが、統計的有意差は確認できなかった。
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】
以上より、血中ＬＡＢが、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞等の心血管障害の将来の発症リスクを正確に反映していることが示された。すなわち、血中ＬＡＢを指標とすることにより、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞等の心血管障害の将来の発症リスクを正確かつ高感度に判定できることが示された。
【００５３】
（９）心血管障害とＬＯＸインデックスとの関係
上記１０３例について、ＬＯＸインデックスを算出した。第５表に、ＬＯＸインデックスによって階層化された年齢調整オッズ比と多変数調整オッズ比を疾病ごとに示す。表５において、年齢調整オッズ比と多変数調整オッズ比の括弧書きは、オッズ比の範囲である。
まず、男性と女性を組み合わせた場合、ＬＯＸインデックスの最上位四分位（Ｑ４）における心血管障害のオッズ比は２．１であり、最下位四分位（Ｑ１）と比較して約２倍の発症率を示していた。特に、脳梗塞の多変数調整オッズ比は、最上位四分位（Ｑ４）で３．４であった。また、統計的有意差を満たさなかったが、脳卒中と心筋梗塞のオッズ比は、ＬＯＸインデックスの最上位四分位（Ｑ４）において最も高かった。
男女別にみても、ＬＯＸインデックスの最上位四分位（Ｑ４）における脳卒中の発生率は、最上位四分位（Ｑ４）における発生率より著しく高かった。
【００５４】
【表５】
【表６】
【００５５】
以上より、ＬＯＸインデックスが、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞等の心血管障害の将来の発症リスクを極めて正確に反映していることが示された。すなわち、ＬＯＸインデックスを指標とすることにより、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞等の心血管障害の将来の発症リスクを極めて正確かつ高感度に判定できることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管障害発症リスクの評価方法及び評価用キットに関し、さらに詳細には、体液中のバイオマーカーを指標として心血管障害の将来の発症リスクを評価する心血管障害発症リスクの評価方法、及び当該方法に用いる心血管障害発症リスクの評価用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は所謂悪玉コレステロールと呼ばれるものであり、動脈硬化の発症と密接に関連しているといわれている。ＬＤＬは、アポリポタンパク質Ｂ（以下「ＡｐｏＢ」と称する。）と種々の脂質から構成されている。また、動脈硬化の重要な危険因子（リスクファクター）である高ＬＤＬコレステロール血症においては、酸化ＬＤＬがその生物活性を担っているといわれている（非特許文献１）。
【０００３】
レクチン様酸化ＬＤＬ受容体（Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，以下「ＬＯＸ−１」と称する。）は酸化ＬＤＬ受容体の一種であり、その機能解析が急速に進められている（非特許文献１）。ＬＯＸ−１は細胞膜一回貫通型の膜タンパク質であり、その詳細な構造はすでに明らかにされ、遺伝子もクローニングされている（特許文献１、非特許文献１）。また、血液中に可溶性ＬＯＸ−１（soluble LOX-1、以下「ｓＬＯＸ−１」と称することがある。）が存在することが知られている。可溶性ＬＯＸ−１の臨床的意義についてはいくつかの可能性が指摘されているが、詳細は明らかでない（非特許文献１）。
【０００４】
ところで、日本においては、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞といった心血管障害（cardiovascular disease; ＣＶＤ）が増加傾向にあり、その対策が求められている。心血管障害を発症するとそのまま死亡に至るおそれがあり、生存した場合でも、特に脳卒中と脳梗塞については後遺症を残すことも珍しくない。したがって、心血管障害については、治療に加えて「予防」することが重要である。そして、予防のために、個々の者について心血管障害の将来の発症リスクを把握できれば好適である。すなわち、発症リスクを予め把握できれば、投薬や生活習慣の改善指導等を早期に行うことができ、心血管障害の予防に役立つと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−９８７８７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日薬理誌，第１１９巻，ｐ１４５−１５４，２００２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、心血管障害の将来の発症リスクを把握できる有効な技術は見当たらず、心血管障害のリスク診断は行われていないのが現状である。もちろん、当該発症リスクを反映するバイオマーカーの存在も知られていない。このような現状に鑑み、本発明は、被験者における心血管障害の将来の発症リスクを把握できる一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、心血管障害の将来の発症リスクを反映するバイオマーカーを探索すべく、１０年以上の追跡調査によって心血管障害（特に、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞）の発症とその後の経過が確定している患者の血清について、網羅的な解析を行った。そして、採血時には異常はなかったが後に心血管障害を発症した患者の血清を詳細に解析し、当該患者に特異的なマーカーを探索した。その結果、ＬＡＢ（LOX-1 ligand containing ApoB）の濃度、さらに、ＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表される新しい指標「ＬＯＸインデックス」が、心血管障害の将来の発症リスクを反映していることを見出し、本発明を完成した。すなわち、上記した課題を解決するための本発明は、以下のとおりである。
【０００９】
請求項１に記載の発明は、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度を指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価することを特徴とする心血管障害発症リスクの評価方法である。
【００１０】
本発明は心血管障害発症リスクの評価方法に係るものであり、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度を指標として、当該被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価する。本発明によれば、従来は困難であった心血管障害の将来の発症リスクの評価を正確に行うことができる。また、本発明では一般の臨床検査と同様に被験者から採取した体液を検査材料とするので、簡便かつ迅速に操作を行うことができる。
【００１１】
ＬＡＢ（LOX-1 ligand containing ApoB）とは、ＬＯＸ−１に結合する活性をもつ生体内物質であってＡｐｏＢをその分子内に含むものを指す。ＬＡＢの代表例は酸化ＬＤＬであるが、結合活性があればそれに限定されない。ＬＡＢの詳細については、例えば、Kakutani M., et al., Biochem Biophys Res Commun. 2001 Mar 23;282(1):180-5.に記載されている。
【００１２】
本発明における「心血管障害の将来の発症リスクの評価」には、発症リスクの有無を判定することや、発症リスクの度合いを定量的に評価することが含まれる。
なお本発明においては、体液中のＬＡＢ濃度が高いほど、心血管障害の将来の発症リスクが高いと評価される。
【００１３】
請求項２に記載の発明は、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表されるＬＯＸインデックスを指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価することを特徴とする心血管障害発症リスクの評価方法である。
【００１４】
本発明も心血管障害発症リスクの評価方法に係るものであり、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表されるＬＯＸインデックスを指標として、当該被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価する。本発明では、ＬＯＸインデックス（ＬＡＢ濃度×可溶性ＬＯＸ−１濃度）を指標とするので、ＬＯＸ−１のファクターが加味されたより正確な心血管障害発症リスクの評価が可能となる。
なお本発明においては、ＬＯＸインデックスの値が高いほど、心血管障害の将来の発症リスクが高いと評価される。
【００１５】
請求項１又は２に記載の心血管障害発症リスクの評価方法において、体液が血液である構成が推奨される（請求項３）。
【００１６】
請求項１〜３のいずれかに記載の心血管障害発症リスクの評価方法において、心血管障害が脳卒中、脳梗塞、又は心筋梗塞である構成が推奨される（請求項４）。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の心血管障害発症リスクの評価方法に用いるためのキットであって、ＬＡＢに対する抗体を含むことを特徴とする心血管障害発症リスクの評価用キットである。
【００１８】
本発明は心血管障害発症リスクの評価用キットに係るものであり、ＬＡＢに対する抗体を含むことを特徴とする。本発明のキットによれば、被験者の体液中のＬＡＢ濃度を簡便に測定することができ、心血管障害の将来の発症リスクを簡単かつ迅速に評価することができる。なお、「ＬＡＢに対する抗体」には、ＡｐｏＢに対する抗体が含まれる。
【００１９】
請求項６に記載の発明は、可溶性ＬＯＸ−１に対する抗体をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の心血管障害発症リスクの評価用キットである。
【００２０】
本発明の心血管障害発症リスクの評価用キットは、可溶性ＬＯＸ−１に対する抗体をさらに含む。かかる構成により、被験者の体液中のＬＡＢ濃度に加えて可溶性ＬＯＸ−１濃度も簡便に測定することができ、特に、ＬＯＸインデックスを用いた心血管障害の将来の発症リスクを簡単かつ迅速に評価することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の心血管障害発症リスクの評価方法によれば、従来は困難であった心血管障害の将来の発症リスクの評価を正確に行うことができる。
【００２２】
本発明の心血管障害発症リスクの評価用キットによれば、心血管障害の将来の発症リスクを簡単かつ迅速に評価することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の心血管障害発症リスクの評価方法の１つの様相は、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度を指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価するものである。また、本発明の心血管障害発症リスクの評価方法の他の様相は、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表されるＬＯＸインデックスを指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価するものである。
【００２４】
本発明で使用する体液としては特に限定はないが、好ましくは血液が用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿を検査材料（測定試料）とすることが好ましい。血清又は血漿は、遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００２５】
心血管障害の例としては、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞、等を挙げることができる。
【００２６】
ＬＡＢあるいは可溶性ＬＯＸ−１の測定方法としては特に限定はなく、例えば、タンパク質の定量法として一般に採用されている方法をそのまま適用することができる。好ましくは、抗体を用いてＬＡＢあるいは可溶性ＬＯＸ−１の濃度を測定する。抗体を用いる方法の例としては、免疫測定法（イムノアッセイ）が挙げられる。
【００２７】
免疫測定法によれば、体液のような夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができ、好適である。免疫測定法の例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらの免疫測定法に用いるＬＡＢあるいは可溶性ＬＯＸ−１に対する抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。また、ＬＡＢはその分子内にＡｐｏＢを含むものであるから、抗ＡｐｏＢ抗体をＬＡＢに対する抗体として採用することができる。
ＬＡＢ（又はＡｐｏＢ）、可溶性ＬＯＸ−１に対する各モノクローナル抗体はすでに取得されており、一部は市販もされている。
【００２８】
ＬＡＢの測定に関しては、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体とを組み合わせたサンドイッチ法の系によっても行うことができる。例えば、ＬＯＸ−１をプレートやビーズ等の支持体（固相）に固定化しておき、検体となる体液を接触させる。これにより、ＬＯＸ−１のリガンドであるＬＡＢは固相上のＬＯＸ−１に結合し、固相上に捕捉される。その後、捕捉されたＬＡＢに抗ＡｐｏＢ抗体を接触させて結合させ、当該ＬＡＢを検出すればよい。検出は、酵素等で予め標識した抗ＡｐｏＢ抗体を用いて行ってもよいし、抗ＡｐｏＢ抗体と反応する標識抗体（２次抗体）を用いて行ってもよい。
【００２９】
免疫測定法以外では、例えばウエスタンブロット法を採用することもできる。例えば、測定試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的タンパク質（ＬＡＢ又は可溶性ＬＯＸ−１）を分離した後、分離された目的タンパク質をニトロセルロース等の膜に転写する。そして、膜上に転写された目的タンパク質を検出する。目的タンパク質の検出は、例えば標識抗体を膜上の目的タンパク質に対して直接的または間接的に結合させ、当該標識を検出することにより行うことができる。
【００３０】
抗体を用いずにＬＡＢ濃度や可溶性ＬＯＸ−１濃度を測定することもでき、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー、質量分析法を採用することができる。電気泳動法によって目的タンパク質の濃度を測定する場合には、例えば、測定試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して目的タンパク質を分離し、適宜の色素や蛍光試薬でゲルを染色し、目的タンパク質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけでは目的タンパク質の分離が不十分な場合には、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。
【００３１】
クロマトグラフィーによって目的タンパク質の濃度を測定する場合には、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、測定試料をＨＰＬＣに供して目的タンパク質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中の目的タンパク質の濃度を測定することができる。
【００３２】
質量分析法を採用する場合は、質量分析計を用いてＬＡＢ濃度又は可溶性ＬＯＸ−１由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもってＬＡＢ濃度又は可溶性ＬＯＸ−１の濃度を測定する。例えば、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization；ＭＡＬＤＩ）と飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer；ＴＯＦ）とを組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて、体液中の目的タンパク質の濃度を測定することができる。
【００３３】
本発明の心血管障害発症リスクの評価方法は、被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度又はＬＯＸインデックスを「指標」とするものである。「指標」の代表例は基準値との比較である。当該基準値としては、例えば、心血管障害を発症した者における発症前の血清と心血管障害を発症しなかった者（健常者）の血清を用いて、ＬＡＢと可溶性ＬＯＸ−１の測定を予め行い、ＬＡＢ濃度又はＬＯＸインデックスの値を両者で比較して設定したカットオフ値を採用することができる。
【００３４】
本発明の心血管障害発症リスクの評価用キットは、ＬＡＢに対する抗体を含むものである。また、好ましい実施形態では、可溶性ＬＯＸ−１に対する抗体をさらに含む。本発明のキットは、免疫測定法のような抗体を用いた方法によってＬＡＢあるいは可溶性ＬＯＸ−１を測定するために用いられる。これらの抗体は、単独の試薬であってもよいし、固相等に結合した状態であってもよい。
【００３５】
本発明のキットの構成例を以下に挙げる。構成例１は、ＬＡＢを指標とする方法に特に適したものである。構成例２は、ＬＯＸインデックスを指標とする方法に特に適したものである。これらのキットには、さらに、プレートやビーズ等の支持体（固相）、標識抗体、発色基質、等をさらに含めてもよい。
【００３６】
〔キットの構成例１〕
（ａ）組換えヒトＬＯＸ−１（固相用）
（ｂ）抗ヒトＡｐｏＢモノクローナル抗体（標識又は未標識）
（ｃ）ＬＡＢ標準品（又は酸化ＬＤＬ標準品）
（ｄ）希釈用緩衝液
【００３７】
〔キットの構成例２〕
（ａ）組換えヒトＬＯＸ−１（固相用）
（ｂ）抗ヒトＡｐｏＢモノクローナル抗体（標識又は未標識）
（ｃ）ＬＡＢ標準品（又は酸化ＬＤＬ標準品）
（ｄ）希釈用緩衝液
（ｅ）抗ヒトＬＯＸ−１モノクローナル抗体Ａ（固相用）
（ｆ）抗ヒトＬＯＸ−１モノクローナル抗体Ｂ（標識又は未標識）
（ｇ）ＬＯＸ−１標準品
なお、（ｅ）と（ｆ）はエピトープが互いに異なる抗体である。
【００３８】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
（１）検体のプロファイル
国立循環器病センターの集団研究に同意の得られた３０歳から７９歳の男女６４８５名について、１９８９年から２００５年にかけて２年毎に検診が行われ、採取した血清が−８０℃にて保管されている。このうち、１９９４年４月から１９９５年２月までの間に検診を受けた男性１１７２名、女性１２６４名、計２４３６名の血清を、以下の解析対象とした。なお、２４３６名のうち２３５６名には、脳卒中と虚血性心疾患の既往症はなかった。
【００４０】
（２）ベースラインサーベイ
以下のように、問診、人体計測、および早朝空腹時血糖（１０時間絶食後）の測定を含む方法によって、ベースラインサーベイが行われた。
まず、身長と体重（軽装着服）からＢＭＩを算出した。血圧は、少なくとも５分以上、安静座位の状態ののち標準水銀血圧計にて測定した。測定回数は３回とした。収縮期血圧（ＳＢＰ）１４０ｍｍＨｇ以上、拡張期血圧（ＤＢＰ）９０ｍｍＨｇ以上を高血圧とした。降圧薬の使用者は高血圧とした。また、血清総コレステロール（ＴＣ）、ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、および空腹時血糖を、自動分析機にて測定した。空腹時血糖値が７．０ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上、または随時血糖値１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）以上の場合に、糖尿病に分類した。糖尿病治療中の者は糖尿病に分類した。さらに、喫煙、飲酒、病歴について、問診を行った。
【００４１】
（３）ＬＡＢの測定
ヒトＬＯＸ−１（固相）と抗ＡｐｏＢモノクローナル抗体（１次抗体）を用いたＥＬＩＳＡにて測定した。すなわち、４０μＬの酸化ＬＤＬ標準品（自家調製品；Sawamura T, et al., Nature 1997;386(6620):73-77 及び Sato Y, et al., Atherosclerosis. 2008;200(2):303-309 に記載）あるいは２０倍希釈した血清を、組換えヒトＬＯＸ−１（自家調製品；Sato Y, et al., Atherosclerosis. 2008;200(2):303-309 に記載）を固定化した３８４−ウェルプレートにアプライした（０．２５μｇ／ウェル）。捕捉されたＬＡＢを、１次抗体たるチキン抗ＡｐｏＢモノクローナル抗体（自家調製品；Sato Y, et al., Atherosclerosis. 2008;200(2):303-309 に記載）と２次抗体たるペルオキシダーゼ標識ロバ抗チキンＩｇＹ抗体（ケミコン社）の組み合わせで検出した。基質として、3,3'5,5'-tetramethylbenzidine（ＴＭＢ溶液；バイオラッド・ラボラトリーズ社）を用いた。測定範囲は、酸化ＬＤＬ標準品で６２．５〜１００００ｎｇ／ｍＬとした。本測定の精度（ＣＶ）は、イントラアッセイで７．０％、インターアッセイで１４．５％であった（ｎ＝１０）。
【００４２】
（４）可溶性ＬＯＸ−１（ｓＬＯＸ−１）の測定
２種の抗ヒトＬＯＸ−１モノクローナル抗体（固相抗体と１次抗体）を用いたＥＬＩＳＡにて測定した。すなわち、４０μＬの組換えヒトＬＯＸ−１標準品（自家調製品；Li D, et al., Circulation. 2003 Feb 4;107(4):612-7に記載）あるいは４倍希釈した血清を、抗ヒトＬＯＸ−１モノクローナル抗体を固定化した３８４-ウェルプレートにアプライした（０．２５μｇ／ウェル）。捕捉されたｓＬＯＸ−１を、１次抗体たるチキン抗ヒトＬＯＸ−１抗体（自家調製品）と２次抗体たるペルオキシダーゼ標識ロバ抗チキンＩｇＹ抗体（ケミコン社）の組み合わせで検出した。基質として、3,3'5,5'-tetramethylbenzidine（ＴＭＢ溶液；バイオラッド・ラボラトリーズ社）を用いた。測定範囲は、組換えヒトＬＯＸ−１標準品で１５．６〜１００００ｐｇ／ｍＬとした。本測定の精度（ＣＶ）は、イントラアッセイで７．５％、インターアッセイで１２．５％であった（ｎ＝１０）。
【００４３】
（５）参加者のサーベイ
参加者における心筋梗塞と脳卒中に関して、以下のように追跡調査を行った。
第１ステップとして、２年毎の検診と１年毎のアンケート調査を行った。第２ステップとして、病院内の医療記録を精査した。
脳卒中の判断基準は、米国の脳卒中国内調査基準（U.S. National Survey of Stroke criteria; Stroke, 1981, 12(2 Pt 2 Suppl 1): I13-44）に従った。脳卒中のサブタイプである脳梗塞、脳内出血、およびクモ膜下出血の確定診断は、ＣＴ撮影、ＭＲＩあるいは剖検により行った。
心筋梗塞の判断基準は、ＷＨＯのＭＯＮＩＣＡ（Monitoring Trends and Determinants of Cardiovascular Disease）プロジェクトの基準に従った。
臨床訪問またはアンケートで典型的な臨床症状があった場合は、医療記録がなくても心筋梗塞あるいは脳卒中と分類した（１３．８％）。さらに、心筋梗塞あるいは脳卒中であって死に至ったケースを調べるために、死亡診断書を系統的に調査した。死亡診断書が確認されたが本サーベイランスシステムに登録されていなかったケースについては、心筋梗塞あるいは脳卒中に分類した。起源不明の急死（発病から２４時間以内に生じたもの）は、心筋梗塞に分類した。
【００４４】
（６）統計分析
上記（３）及び（４）のＥＬＩＳＡにて得られたＬＡＢ濃度とｓＬＯＸ−１濃度の値を乗じて、ＬＯＸインデックスを計算した。四分位の範囲で、ｓＬＯＸ、ＬＡＢ、及びＬＯＸインデックスのカットオフ点を設定した。平均値の分散分析または比率のカイ二乗検定を行った。心筋梗塞と脳卒中に関し、ｓＬＯＸ、ＬＡＢ、およびＬＯＸインデックスについて、年齢調整（Age-adjusted）オッズ比（ＯＲ）、並びに、年齢、高血圧、糖尿病、脂質低下作用薬の使用、ＢＭＩ、喫煙、および飲酒の各ファクターを調整した多変数調整（Multivariable-adjusted）オッズ比を、ロジスティック回帰分析によって計算した。性差をさらに調整した性結合分析（sex-combined analysis）も行った。信頼区間は９５％とし、有意性はＰ値＜０．０５で判定した。全ての分析は、社会科学用統計パッケージ（リリースバージョン８．２；ＳＡＳインスティテュート社）を用いて行った。
【００４５】
（７）ベースラインサーベイの結果
ＬＡＢの平均値は、男性で５１６．１±１７．１ｎｇ／ｍＬ、女性で７８２．３±２３．７ｎｇ／ｍＬであった。ｓＬＯＸ−１の平均値は、男性で１,０６０．１±８．６ｐｇ／ｍＬ、女性で７９７．８±０．２ｐｇ／ｍＬであった。血清総コレステロール（ＴＣ）の平均値は、男性で１８１．５±１．３ｍｇ／ｄＬ、女性で２２４．５±２．０ｍｇ／ｄＬであった。
第１表に、ＬＡＢの四分位（Ｑ１〜Ｑ４）毎の各検査項目の平均値または有病率を示す。第２表に、ｓＬＯＸ−１の四分位（Ｑ１〜Ｑ４）毎の各検査項目の平均値または有病率を示す。すなわち、両性とも、ＬＡＢ四分位にしたがって、ＴＣの平均値に有意差があった。ＴＣは、より高いＬＡＢ四分位においてより高い傾向にあった。これに対し、ＴＣはｓＬＯＸ−１四分位に関係していなかった。また、ＨＤＬ−Ｃは、女性で、ＬＡＢおよびｓＬＯＸ−１のいずれでも、高い四分位においてより低い傾向を示した。喫煙率については、より高いｓＬＯＸ−１四分位においてより高い傾向を示したが、ＬＡＢとの関係はみられなかった。高血圧症有病率と糖尿病有病率については、有意差は認めらなかった。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
（８）心血管障害とＬＡＢ、ｓＬＯＸ−１との関係
追跡調査において、採血時には異常はなかったが、後に心筋梗塞あるいは脳梗塞を発症したケースが１０３例あった。詳細には、２８例の心筋梗塞と７５例の脳卒中が確認され、これらは５３例の脳梗塞を含んでいた。これら１０３例の血清について、詳細に解析した。
【００４９】
第３表に、ＬＡＢで階層化された年齢調整オッズ比と多変数調整オッズ比を疾病ごとに示す。第４表に、ｓＬＯＸ−１で階層化された年齢調整オッズ比と多変数調整オッズ比を疾病ごとに示す。各表において、年齢調整オッズ比と多変数調整オッズ比の括弧書きは、オッズ比の範囲である。
第３表に示すように、男性と女性を組み合わせると、心血管障害のＯＲは、ＬＡＢの最上位四分位（Ｑ４）において、有意に最も高かった。また、脳卒中、脳梗塞、および心筋梗塞のＯＲも、ＬＡＢの最上位四分位（Ｑ４）において最も高く、脳梗塞では統計的有意差を示した。さらに、症例数が少ないために統計的有意差は確認できなかったが、心血管障害について、男女別でも同様の結果が得られた。
一方、第４表に示すように、ｓＬＯＸ−１についても最上位四分位（Ｑ４）において、脳卒中、脳梗塞、および心筋梗塞のＯＲが最も高かったが、統計的有意差は確認できなかった。
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】
以上より、血中ＬＡＢが、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞等の心血管障害の将来の発症リスクを正確に反映していることが示された。すなわち、血中ＬＡＢを指標とすることにより、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞等の心血管障害の将来の発症リスクを正確かつ高感度に判定できることが示された。
【００５３】
（９）心血管障害とＬＯＸインデックスとの関係
上記１０３例について、ＬＯＸインデックスを算出した。第５表に、ＬＯＸインデックスによって階層化された年齢調整オッズ比と多変数調整オッズ比を疾病ごとに示す。表５において、年齢調整オッズ比と多変数調整オッズ比の括弧書きは、オッズ比の範囲である。
まず、男性と女性を組み合わせた場合、ＬＯＸインデックスの最上位四分位（Ｑ４）における心血管障害のオッズ比は２．１であり、最下位四分位（Ｑ１）と比較して約２倍の発症率を示していた。特に、脳梗塞の多変数調整オッズ比は、最上位四分位（Ｑ４）で３．４であった。また、統計的有意差を満たさなかったが、脳卒中と心筋梗塞のオッズ比は、ＬＯＸインデックスの最上位四分位（Ｑ４）において最も高かった。
男女別にみても、ＬＯＸインデックスの最上位四分位（Ｑ４）における脳卒中の発生率は、最上位四分位（Ｑ４）における発生率より著しく高かった。
【００５４】
【表５】
【表６】
【００５５】
以上より、ＬＯＸインデックスが、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞等の心血管障害の将来の発症リスクを極めて正確に反映していることが示された。すなわち、ＬＯＸインデックスを指標とすることにより、脳卒中、脳梗塞、心筋梗塞等の心血管障害の将来の発症リスクを極めて正確かつ高感度に判定できることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度を指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価することを特徴とする心血管障害発症リスクの評価方法。
【請求項２】
被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表されるＬＯＸインデックスを指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価することを特徴とする心血管障害発症リスクの評価方法。
【請求項３】
体液は、血液であることを特徴とする請求項１又は２に記載の心血管障害発症リスクの評価方法。
【請求項４】
心血管障害は、脳卒中、脳梗塞、又は心筋梗塞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の心血管障害発症リスクの評価方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の心血管障害発症リスクの評価方法に用いるためのキットであって、ＬＡＢに対する抗体を含むことを特徴とする心血管障害発症リスクの評価用キット。
【請求項６】
可溶性ＬＯＸ−１に対する抗体をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の心血管障害発症リスクの評価用キット。
【請求項１】
被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度を指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価することを特徴とする心血管障害発症リスクの評価方法。
【請求項２】
被験者から採取した体液におけるＬＡＢ濃度と可溶性ＬＯＸ−１濃度との積で表されるＬＯＸインデックスを指標として、前記被験者における心血管障害の将来の発症リスクを評価することを特徴とする心血管障害発症リスクの評価方法。
【請求項３】
体液は、血液であることを特徴とする請求項１又は２に記載の心血管障害発症リスクの評価方法。
【請求項４】
心血管障害は、脳卒中、脳梗塞、又は心筋梗塞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の心血管障害発症リスクの評価方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の心血管障害発症リスクの評価方法に用いるためのキットであって、ＬＡＢに対する抗体を含むことを特徴とする心血管障害発症リスクの評価用キット。
【請求項６】
可溶性ＬＯＸ−１に対する抗体をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の心血管障害発症リスクの評価用キット。
【公開番号】特開２０１１−１０６８４７（Ｐ２０１１−１０６８４７Ａ）
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５９５９５（Ｐ２００９−２５９５９５）
【出願日】平成２１年１１月１３日（２００９．１１．１３）
【出願人】（３０３０５８７０８）株式会社バイオマーカーサイエンス (27)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１３日（２００９．１１．１３）
【出願人】（３０３０５８７０８）株式会社バイオマーカーサイエンス (27)
【Ｆターム（参考）】
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