急性腎不全治療用ＨＧＦ
【課題】治療上有効量のＨＧＦからなる、横紋筋融解症による急性腎不全の治療剤を提供する。
【解決手段】治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、横紋筋融解症による急性腎不全の治療剤。
【解決手段】治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、横紋筋融解症による急性腎不全の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
急性腎不全とは急速な腎機能低下によって高窒素血症、電解質異常、尿毒症症状などを認められる状態を言う。腎機能低下の原因により、腎前性、腎性、及び腎後性の急性腎不全に分類される。腎性急性腎不全は、１）血管炎、糸球体病変、２）急性間質性腎炎、３）尿細管閉塞、及び４）狭義の急性腎不全に分類される。狭義の急性腎不全は、急性尿細管壊死によるものを言う。尿細管壊死による急性腎不全の原因としては、１）虚血性、２）腎毒性物質、及び３）筋融解物質（例えばミオグロビンなど）が挙げられる。
【０００２】
虚血性の急性腎不全は、手術などによる出血、ショック、外傷、火傷などが原因となる。虚血性の急性腎不全の動物モデルとしては腎動脈結紮が行われる。腎虚血ラットモデルでは、血中ＢＵＮ（血清尿素窒素）や血清クレアチニンが上昇し、虚血後、６〜１２時間後に肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）のｍＲＮＡが誘導され、その結果、腎・血漿中のＨＧＦ活性が上昇することが確認されている(非特許文献１)。
【０００３】
急性腎不全は、抗生物質、抗腫瘍薬、造影剤などの腎毒性物質によっても起こる。腎毒性物質による急性腎不全の動物モデルは、塩化水銀、シスプラチン、造影剤などをラットに投与することにより作製される。塩化水銀投与ラットにおいては、ＢＵＮ・クレアチニンの上昇や、ＨＧＦｍＲＮＡの発現誘導・ＨＧＦ活性上昇が、虚血モデルと同様に確認されている(非特許文献２)。これらの事実から、腎障害からの修復因子として、ＨＧＦが発現していると考えられている。
【０００４】
また、虚血性及び腎毒性物質（塩化水銀、シスプラチン）による腎不全障害動物モデルにおいて、ＨＧＦ投与による腎機能回復効果が報告されている(非特許文献３及び４)。いずれの障害モデルにおいても、ＢＵＮ・クレアチニン値の障害による上昇が、ＨＧＦの投与により速やかに抑えられた。これらの事実から、ＨＧＦが、障害を受けた尿細管細胞の増殖促進をするrenotropic factorとして作用していると考えられている。
【０００５】
外傷、圧迫(例えば座滅症候群)、火傷、感染、薬物（例えばアルコール、バルビツール誘導体など）中毒、筋代謝疾患、筋の過剰使用、低リン血症、蛇毒などにより、筋融解物質（例えばミオグロビン、リン、カリウム、尿酸など）が放出された場合、これが尿細管細胞に毒性をもたらす。その結果、尿細管細胞の壊死が起こり、それにより生じる細胞の残骸やヒアリン円柱により尿細管の閉塞が起こる。またミオグロビンは腎の血流を低下させるという報告もされている。以上の機序により、横紋筋融解症による腎不全が発症すると考えられている(非特許文献５)。
【０００６】
横紋筋融解症の臨床的特徴としては、１）クレアチンリン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼといった筋由来の酵素の上昇、２）99mＴＣ-pyrophosphateの障害筋への取り込みの増加、３）ミオグロビンの存在、４）血清尿素窒素／血清クレアチニン比が１０〜２０以下、５）高尿酸血症、６）高リン酸血症、低カルシウム、高カリウムなどが挙げられる。
【０００７】
横紋筋融解症に対する現在の治療法は、補液交換療法、利尿薬の投与、筋膜解放術、血漿交換療法、抗血小板療法などが行われているが、重症あるいは予後不良の症例に関してはこれらの治療は不十分であり、横紋筋融解症による急性腎不全の発症を予防あるいは治療する方法及び薬剤はない。
【０００８】
また、溶血性尿毒症症候群（Hemolytic Uremic Syndrome:HUS）は、血小板減少、細血管性溶血性貧血及び急性腎不全の症状を特徴とするが、ＨＵＳの予防・治療のための薬剤及び治療法は知られていない。ＨＵＳの原因としては感染(例えばO-157)、遺伝性の発症、薬剤(例えばシクロスポリン)、妊娠、臓器移植、ＳＬＥ、高血圧、異型輸血などがある。これらの原因により溶血が起こり、ヘモグロビンなどの物質が放出され、溶血性尿毒症症候群がおこる。
【０００９】
グリセロール誘発動物モデルは急性腎不全の病態モデルとして知られており、確立されている。グリセロールが動物の筋肉に投与されると、グリセロールの高浸透圧により、筋肉細胞及び筋肉内血管で溶血が起こる。すなわち、ミオグロビン、ヘモグロビン、カリウム、その他の筋融解物質が血中に出て腎細胞を障害する。これに脱水が加わると、筋融解物質の毒性が増強される。つまり、著しい腎血流量の低下及び虚血が起こり、糸球体ろ過量が乏尿から無尿となるのである。
【００１０】
またグリセロールを注射された筋肉部には体液の貯留が起こるため、全身循環、血流量及び心拍出量は低下する(非特許文献６)。グリセロールを実験動物に投与する以前に、実験動物を絶水状態にすると筋融解物質の影響が大きくなり、横紋筋融解症モデルを作製することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】American Journal of Physiology,1993;265;61-69
【非特許文献２】Nephron 1996;73;735
【非特許文献３】American Journal of Physiology,1994;266;129-134
【非特許文献４】Proc.Nat1.Acad.Sci.1994;91;4357-4361
【非特許文献５】Common Disease Series 17：腎不全、ｐ５７−６１、南江堂、１９９１
【非特許文献６】腎疾患モデル 腎と透析Vo1.31,（1991）臨時増刊号 395-399
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、治療上有効量のＨＧＦからなる、横紋筋融解症による急性腎不全の治療剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、治療上有効量のＨＧＦを患者、特にヒト患者に投与することからなる、横紋筋融解症による急性腎不全の治療方法を提供する。
また、本発明は、治療上有効量のＨＧＦからなる、ミオグロビン尿症の治療剤を提供する。
【００１４】
更に、本発明は、治療上有効量のＨＧＦを患者に投与することからなる、外傷、圧迫(例えば、座滅症候群)、火傷、感染、薬物（例えば、アルコール、バルビツール誘導体）中毒、筋代謝疾患、筋の過剰使用、低リン血症、蛇毒などにより放出された筋融解物質に起因する横紋筋融解症による急性腎不全の治療方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、治療上有効量のＨＧＦからなる、外傷、圧迫(例えば、座滅症候群)、火傷、感染、薬物（例えば、アルコール、バルビツール誘導体）中毒、筋代謝疾患、筋の過剰使用、低リン血症、蛇毒などにより放出された筋融解物質に起因する横紋筋融解症による急性腎不全の治療剤を提供する。
本発明は、治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、溶血性尿毒症症候群の治療剤を提供する。
【００１６】
本発明は、治療上有効量のＨＧＦを患者に投与することからなる、溶血性尿毒症症候群の治療方法を提供する。
本発明は、治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、感染(O-157)、遺伝性の発症、薬剤（シクロスポリン）投与、妊娠、臓器移植、ＳＬＥ、高血圧、異型輸血などによる溶血性尿毒症症候群の治療剤を提供する。
本発明は、治療上有効量のＨＧＦを患者に投与することからなる、感染(例えばO-157)、遺伝性の発症、薬剤（例えばシクロスポリン）投与、妊娠、臓器移植、ＳＬＥ、高血圧、異型輸血などによる溶血性尿毒症症候群の治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、対照群とＨＧＦ投与群の生存率を示す図である。
【図２】図２は、グリセロール投与後１、３、６日の血清・尿生化学値及び腎機能検査値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明で使用される肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）は既に市販されており、また以下の方法で製造することができる。
ＨＧＦの調製方法は、当業者によく知られている。例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤などの臓器、血小板、白血球などの血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる(FEBS Letters,224,312,1987, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,5844,1989)。
【００１９】
また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞など）からの抽出物を精製してＨＧＦを得ることもできる。
あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清を精製することによりＨＧＦを得ることができる(例えば、Nature,342,440,1989,特開平5-111383号公報、特開平3-255096号公報、Biochem.Biophys.Res.Commun.,163,967,1989など参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【００２０】
より具体的にはＨＧＦを生体組織から製造する方法としては、例えばラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出して粉砕し、S-セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、HPLCなどの通常の蛋白質精製法にて精製する方法が挙げられる。
【００２１】
また、遺伝子組換え法を用い、ＨＧＦのアミノ酸をコードする遺伝子で、動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、マウスC127細胞、サルCOS細胞、Sf細胞などを形質転換し、その培養上清を精製することによりＨＧＦを得ることができる。
【００２２】
ＨＧＦは、ヒトＨＧＦ及び動物ＨＧＦを含み、好ましくはヒトＨＧＦ、より好ましくはヒト組換えＨＧＦである(特開平５−１１１３８３号公報)。
【００２３】
かくして得られたＨＧＦは、ＨＧＦと実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されたり、Ｎ末端又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
【００２４】
本発明の治療剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤、デポット製剤など）をとりうる。ＨＧＦのみ又はそれと適当な担体と共に注射剤、又は適当な担体と共に経口剤とされる。当該注射剤は当業者にとって慣用の方法により調製することができ、例えば、ＨＧＦを適当な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水など）に溶解した後、濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量としては、0.0002-0.2(w/w％)程度、好ましくは0.001-0.1(w/w％)程度に調整される。製剤は製剤上の常套手段に準じて調製することができる。ＨＧＦの含量は、製剤形態、疾患、患者の症状などにより適宜変更することができる。
【００２５】
更に、ＨＧＦは、慣用の坐薬基剤、例えば、カカオ脂、水溶性基剤(例えば、グリセロゼラチン、マクロゴールなど)、他のグリセリド類などを含有する坐薬、保持性浣腸液などの直腸用製剤とすることもできる。
【００２６】
またＨＧＦは吸入剤として投与することもできる。吸入剤として投与する場合、ＨＧＦは、二酸化炭素、適切なガスなどの適当な噴射剤を使用した、加圧された容器又は噴射器からなるエアゾルスプレーの形態とされる。
【００２７】
ＨＧＦは、当業者にとって周知の慣用の徐放性製剤として投与することもできる。徐放性製剤の例としては、微小球体（例えば、ノナ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ビーズ、リポソーム、複エマルジョンなど）などを挙げることができる。
【００２８】
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えは、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤などを含んでいてもよい。液状製剤とした場合には凍結保存、又は凍結乾燥などにより水分を除去して保存することができる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用精製水などを加え、再溶解する。
【００２９】
ＨＧＦの効果的な投与量及び投与スケジュールは経験的に決定することができ、当該決定は当業者にとって自明である。製剤の投与経路は製剤形態により設定することができ、例えば注射剤においては静脈内、動脈内、皮下、筋肉内などに投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、０．１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ・体重の範囲から選択され、好ましい範囲は１μｇ〜４００μｇ／ｋｇである。ＨＧＦ製剤は１日１回又は数回（２又は３回）に分けて投与することができる。
【００３０】
また、ＨＧＦはデポット(depot製剤とすることもできる。このような持続性製剤は、移植（例えば、皮下、筋肉内）又は筋肉内注射により投与される。しかして、例えば、ＨＧＦは適当なポリマー又は親油性物質(例えば、許容される油のエマルジョン)、イオン交換樹脂を用いて、又は徐溶性塩などのような徐溶性誘導体として製剤化される。
【００３１】
デポット製剤の効果的な投与量及び投与スケジュールは経験的に決定することができ、当該決定は当業者にとって自明である。デポット製剤の投与経路は製剤形態により設定することができる。デポット製剤の好ましい投与方法は少なくとも１週間に１回、好ましくは少なくとも１ヶ月に１回とされる。
【００３２】
本発明の一つの目的は、ＨＧＦを含有し、横紋筋融解症又はミオグロビン尿症による急性腎不全治療用の包装製品、キット又は製品を提供する。包装製品は、横紋筋融解症又はミオグロビン尿症による急性腎不全を治療する上で有効量のＨＧＦを含有する容器、及び当該容器に添付された、ＨＧＦが横紋筋融解症又はミオグロビン尿症による急性腎不全を治療するために使用されることを示す説明書からなることができる。例えば、ＨＧＦは無菌バイアルに充填され、次いで箱のような容器に収容される。本発明に基づき薬剤を投与するための説明書は、バイアル及び／又は箱のラベルとして、また包装の挿入物として箱に収納される。
【実施例】
【００３３】
以下の実施例は本発明を説明するためのもので、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
材料
動物
７週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本ＳＬＣより購入し、３日間の予備飼育ののち、７．５週齢（体重約２００ｇ）で実験に用いた。
【００３５】
急性腎不全モデル作製
５０％グリセロールを生理食塩水で調製し、投与前１５時間絶水状態にしたラットに、エーテル麻酔下で筋肉内投与（１０ｍｌ／ｋｇ）した。グリセロール投与８時間後以降は自由飲水に処した。
【００３６】
投与薬物
組換え型ヒト肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）をＨＧF溶解液で１２５μｇ／ｍｌに希釈して用いた。一回の投与当たり２ｍｌ／ｋｇ（２５０μｇ／ｋｇ）の薬物を尾静脈内に投与した。
ＨＧＦ溶解液は、０．３ＭＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液である。
【００３７】
投与
ラットは、対照群とｈＨＧＦ投与群の二群に分けた。一群に、グリセロール投与１時間前及び１、３、５、８、２４、３６時間後にｈＨＧＦ溶液を投与した。
対照群には、グリセロール投与後１及び３時間後に１ｍｌの生理食塩水を、また５及び８時間後に水を投与した。
【００３８】
症状観察
グリセロール投与後１４日間にわたり、ラットの生存率を観察した。
【００３９】
結果
グリセロールの投与によって、ラットは著しい急性腎不全に陥り、グリセロール投与２日後の血清ＢＵＮ及び血清クレアチニン値は大きく上昇していた(血清クレアチニン値：対照群＝５．１±１．２ｍｇ／ｄｌ、ＨＧＦ投与群＝４．２±０．８ｍｇ／ｄｌ)。
【００４０】
生存率を図１に示す。グリセロール投与３日後以降、対照群のラットに死亡が観察され、その後９日後までに１３匹中９匹が死亡した。死亡直後の個体を剖検した結果では、腎臓の外見が著しく変化し、腎皮質部分の尿細管の壊死が観察された。
【００４１】
ＨＧＦ投与群では、実験期間中に死亡例は見られなかった。グリセロール投与後１４日の時点における生存率をカイ２乗検定を用いて検定したところ、対照群に対してＨＧＦ投与群の生存率が有意に（Ｐ＜０．０１）高かった。
【００４２】
実施例２
材料
実験動物
７週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本ＳＬＣより購入し、３日間の予備飼育ののち、７．５週齢（体重約２００ｇ）で実験に用いた。
【００４３】
急性腎不全モデル作製
５０％グリセロールを生理食塩水で調製し、投与前１５時間絶水状態にしたラットに、エーテル麻酔下で筋肉内投与（１０ｍｌ／ｋｇ）した。グリセロール投与８時間後以降は自由飲水に処した。
【００４４】
投与薬物
組換え型ヒト肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）を生理食塩水で１２５μｇ／ｍｌに希釈して用いた。一回の投与当たり２ｍｌ／ｋｇ（２５０μｇ／ｋｇ）の薬物を尾静脈内に投与した。
【００４５】
投与
実験は、対照群１０匹、ｈＨＧＦ投与群１０匹の二群をもうけた。一群に、グリセロール投与１時間前及び１、３、５、８、２４、３６時間後にｈＨＧＦ溶液を投与した。対照群には、グリセロール投与後１及び３時間後に１ｍｌの生理食塩水を、また５及び８時間後に水を投与した。
【００４６】
血清及び尿生化学値の測定
グリセロール投与１、３、６日後に、エーテル麻酔下において、尾動脈より採血し血清を得た。超微量多目的生化学自動分析装置ＣＨＥＭ １を用いて血清尿素窒素(ＢＵＮ)、血清クレアチニン（Ｃｒｅ）量を測定した。
【００４７】
また、代謝ケージを用いて、グリセロール投与１、３、６日後の１２時間蓄尿を採取した。尿量を測定したのち、超微量多目的生化学自動分析装置ＣＨＥＭ １を用いて、尿中クレアチニン量を測定した。
以上の項目から、内因性Ｃｒｅクリアランス値を以下の換算式より算出した。
内因性Ｃｒｅクリアランス＝［尿Ｃｒｅ値（ｍｇ／ｄｌ）ｘ１２時間蓄尿量(ｍｌ)］／［血清Ｃｒｅ値（ｍｇ／ｄｌ）ｘ蓄尿時間(７２０ｍｉｎ)］
【００４８】
症状観察
グリセロール投与後１５日間にわたり、ラットの生死を観測した。
【００４９】
統計処理
グリセロール投与後１５日の時点における両群の生存率をカイ２乗検定を用いて検定した。
グリセロール投与後１日及び３日の両群の血清生化学値を、ｔ検定あるいはWelchの検定により検定した。
【００５０】
結果
生存率
グリセロール投与３日後以降、対照群のラットに死亡が観察され、９日後までに１０匹中７匹が死亡した。
ＨＧＦ投与群では、実験期間中、１０匹中２匹の死亡が観察されたが、ＨＧＦ投与群の生存率は対照群のそれに比して有意に高かった(Ｐ＜０．０５)。
【００５１】
血清・尿生化学値及び腎機能検査値
血清・尿生化学値及び腎機能検査値を図２に示す。
対照群では、グリセロールの投与により、１日後から血清ＢＵＮ、Ｃｒｅ値の著明な上昇がみられ、以後６日後にかけてＢＵＮ、Ｃｒｅ値は悪化した。内因性Ｃｒｅクリアランスは０．１以下と低いレベルを維持しており、重度の腎不全症状を示した。
【００５２】
これに対して、ＨＧＦ投与群では、グリセロール投与３日後において、血清ＢＵＮ値の減少が観察され、急性腎不全の抑制（Ｐ＜０．０５）を伴っていた。また、同時に内因性Ｃｒｅクリアランスも有意に（Ｐ＜０．０５）改善された。
【００５３】
実施例３
材料
動物
７週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本ＳＬＣより購入し、３日間の予備飼育ののち、７．５週齢（体重約２００ｇ）で実験に用いた。
急性腎不全モデル ５０％グリセロールを生理食塩水で調製し、投与前１５時間絶水状態にしたラットに、エーテル麻酔下で筋肉内投与（１０ｍｌ／ｋｇ）した。グリセロール投与８時間後以降は自由飲水に処した。
【００５４】
投与薬物
組換え型ヒト肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）をＨＧＦ溶解液で１２５μｇ／ｍｌに希釈して用いた。一回の投与当たり２ｍｌ／ｋｇ（２５０μｇ／ｋｇ）の薬物を尾静脈内に投与した。
【００５５】
投与
実験は、対照群８匹、ｈＨＧＦ投与群８匹の二群をもうけた。一群に、グリセロール投与１時間前及び１、３、５、８、２４、３６時間後にｈＨＧＦ溶液を投与した。対照群には、グリセロール投与後１及び３時間後に１ｍｌの生理食塩水を、また５及び８時間後に水を投与した。
【００５６】
腎組織の解析 グリセロール投与３日後にラットをと殺し、腎臓を切り出してリン酸緩衝ホルマリン液に固定し、パラフィン包埋から腎組織切片を作製し、ＰＡＳ染色に供した。各個体につき一枚ずつ、腎皮質部分の光顕像を撮影し、腎皮質尿細管細胞の壊死の程度を、軽度・中度・重度にわけてスコアづけした。対照群・ＨＧＦ投与群間のスコアの差は、カイ二乗検定を用いて有意差検定した。
【００５７】
結果
腎尿細管細胞の組織障害
下記表１に、両群の腎組織障害のスコアを示す。ＨＧＦ投与群では、対照群に比して有意に障害度が抑制されていた。
【００５８】
【表１】
【背景技術】
【０００１】
急性腎不全とは急速な腎機能低下によって高窒素血症、電解質異常、尿毒症症状などを認められる状態を言う。腎機能低下の原因により、腎前性、腎性、及び腎後性の急性腎不全に分類される。腎性急性腎不全は、１）血管炎、糸球体病変、２）急性間質性腎炎、３）尿細管閉塞、及び４）狭義の急性腎不全に分類される。狭義の急性腎不全は、急性尿細管壊死によるものを言う。尿細管壊死による急性腎不全の原因としては、１）虚血性、２）腎毒性物質、及び３）筋融解物質（例えばミオグロビンなど）が挙げられる。
【０００２】
虚血性の急性腎不全は、手術などによる出血、ショック、外傷、火傷などが原因となる。虚血性の急性腎不全の動物モデルとしては腎動脈結紮が行われる。腎虚血ラットモデルでは、血中ＢＵＮ（血清尿素窒素）や血清クレアチニンが上昇し、虚血後、６〜１２時間後に肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）のｍＲＮＡが誘導され、その結果、腎・血漿中のＨＧＦ活性が上昇することが確認されている(非特許文献１)。
【０００３】
急性腎不全は、抗生物質、抗腫瘍薬、造影剤などの腎毒性物質によっても起こる。腎毒性物質による急性腎不全の動物モデルは、塩化水銀、シスプラチン、造影剤などをラットに投与することにより作製される。塩化水銀投与ラットにおいては、ＢＵＮ・クレアチニンの上昇や、ＨＧＦｍＲＮＡの発現誘導・ＨＧＦ活性上昇が、虚血モデルと同様に確認されている(非特許文献２)。これらの事実から、腎障害からの修復因子として、ＨＧＦが発現していると考えられている。
【０００４】
また、虚血性及び腎毒性物質（塩化水銀、シスプラチン）による腎不全障害動物モデルにおいて、ＨＧＦ投与による腎機能回復効果が報告されている(非特許文献３及び４)。いずれの障害モデルにおいても、ＢＵＮ・クレアチニン値の障害による上昇が、ＨＧＦの投与により速やかに抑えられた。これらの事実から、ＨＧＦが、障害を受けた尿細管細胞の増殖促進をするrenotropic factorとして作用していると考えられている。
【０００５】
外傷、圧迫(例えば座滅症候群)、火傷、感染、薬物（例えばアルコール、バルビツール誘導体など）中毒、筋代謝疾患、筋の過剰使用、低リン血症、蛇毒などにより、筋融解物質（例えばミオグロビン、リン、カリウム、尿酸など）が放出された場合、これが尿細管細胞に毒性をもたらす。その結果、尿細管細胞の壊死が起こり、それにより生じる細胞の残骸やヒアリン円柱により尿細管の閉塞が起こる。またミオグロビンは腎の血流を低下させるという報告もされている。以上の機序により、横紋筋融解症による腎不全が発症すると考えられている(非特許文献５)。
【０００６】
横紋筋融解症の臨床的特徴としては、１）クレアチンリン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼといった筋由来の酵素の上昇、２）99mＴＣ-pyrophosphateの障害筋への取り込みの増加、３）ミオグロビンの存在、４）血清尿素窒素／血清クレアチニン比が１０〜２０以下、５）高尿酸血症、６）高リン酸血症、低カルシウム、高カリウムなどが挙げられる。
【０００７】
横紋筋融解症に対する現在の治療法は、補液交換療法、利尿薬の投与、筋膜解放術、血漿交換療法、抗血小板療法などが行われているが、重症あるいは予後不良の症例に関してはこれらの治療は不十分であり、横紋筋融解症による急性腎不全の発症を予防あるいは治療する方法及び薬剤はない。
【０００８】
また、溶血性尿毒症症候群（Hemolytic Uremic Syndrome:HUS）は、血小板減少、細血管性溶血性貧血及び急性腎不全の症状を特徴とするが、ＨＵＳの予防・治療のための薬剤及び治療法は知られていない。ＨＵＳの原因としては感染(例えばO-157)、遺伝性の発症、薬剤(例えばシクロスポリン)、妊娠、臓器移植、ＳＬＥ、高血圧、異型輸血などがある。これらの原因により溶血が起こり、ヘモグロビンなどの物質が放出され、溶血性尿毒症症候群がおこる。
【０００９】
グリセロール誘発動物モデルは急性腎不全の病態モデルとして知られており、確立されている。グリセロールが動物の筋肉に投与されると、グリセロールの高浸透圧により、筋肉細胞及び筋肉内血管で溶血が起こる。すなわち、ミオグロビン、ヘモグロビン、カリウム、その他の筋融解物質が血中に出て腎細胞を障害する。これに脱水が加わると、筋融解物質の毒性が増強される。つまり、著しい腎血流量の低下及び虚血が起こり、糸球体ろ過量が乏尿から無尿となるのである。
【００１０】
またグリセロールを注射された筋肉部には体液の貯留が起こるため、全身循環、血流量及び心拍出量は低下する(非特許文献６)。グリセロールを実験動物に投与する以前に、実験動物を絶水状態にすると筋融解物質の影響が大きくなり、横紋筋融解症モデルを作製することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】American Journal of Physiology,1993;265;61-69
【非特許文献２】Nephron 1996;73;735
【非特許文献３】American Journal of Physiology,1994;266;129-134
【非特許文献４】Proc.Nat1.Acad.Sci.1994;91;4357-4361
【非特許文献５】Common Disease Series 17：腎不全、ｐ５７−６１、南江堂、１９９１
【非特許文献６】腎疾患モデル 腎と透析Vo1.31,（1991）臨時増刊号 395-399
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、治療上有効量のＨＧＦからなる、横紋筋融解症による急性腎不全の治療剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、治療上有効量のＨＧＦを患者、特にヒト患者に投与することからなる、横紋筋融解症による急性腎不全の治療方法を提供する。
また、本発明は、治療上有効量のＨＧＦからなる、ミオグロビン尿症の治療剤を提供する。
【００１４】
更に、本発明は、治療上有効量のＨＧＦを患者に投与することからなる、外傷、圧迫(例えば、座滅症候群)、火傷、感染、薬物（例えば、アルコール、バルビツール誘導体）中毒、筋代謝疾患、筋の過剰使用、低リン血症、蛇毒などにより放出された筋融解物質に起因する横紋筋融解症による急性腎不全の治療方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、治療上有効量のＨＧＦからなる、外傷、圧迫(例えば、座滅症候群)、火傷、感染、薬物（例えば、アルコール、バルビツール誘導体）中毒、筋代謝疾患、筋の過剰使用、低リン血症、蛇毒などにより放出された筋融解物質に起因する横紋筋融解症による急性腎不全の治療剤を提供する。
本発明は、治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、溶血性尿毒症症候群の治療剤を提供する。
【００１６】
本発明は、治療上有効量のＨＧＦを患者に投与することからなる、溶血性尿毒症症候群の治療方法を提供する。
本発明は、治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、感染(O-157)、遺伝性の発症、薬剤（シクロスポリン）投与、妊娠、臓器移植、ＳＬＥ、高血圧、異型輸血などによる溶血性尿毒症症候群の治療剤を提供する。
本発明は、治療上有効量のＨＧＦを患者に投与することからなる、感染(例えばO-157)、遺伝性の発症、薬剤（例えばシクロスポリン）投与、妊娠、臓器移植、ＳＬＥ、高血圧、異型輸血などによる溶血性尿毒症症候群の治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、対照群とＨＧＦ投与群の生存率を示す図である。
【図２】図２は、グリセロール投与後１、３、６日の血清・尿生化学値及び腎機能検査値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明で使用される肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）は既に市販されており、また以下の方法で製造することができる。
ＨＧＦの調製方法は、当業者によく知られている。例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤などの臓器、血小板、白血球などの血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる(FEBS Letters,224,312,1987, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,5844,1989)。
【００１９】
また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞など）からの抽出物を精製してＨＧＦを得ることもできる。
あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清を精製することによりＨＧＦを得ることができる(例えば、Nature,342,440,1989,特開平5-111383号公報、特開平3-255096号公報、Biochem.Biophys.Res.Commun.,163,967,1989など参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【００２０】
より具体的にはＨＧＦを生体組織から製造する方法としては、例えばラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出して粉砕し、S-セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、HPLCなどの通常の蛋白質精製法にて精製する方法が挙げられる。
【００２１】
また、遺伝子組換え法を用い、ＨＧＦのアミノ酸をコードする遺伝子で、動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、マウスC127細胞、サルCOS細胞、Sf細胞などを形質転換し、その培養上清を精製することによりＨＧＦを得ることができる。
【００２２】
ＨＧＦは、ヒトＨＧＦ及び動物ＨＧＦを含み、好ましくはヒトＨＧＦ、より好ましくはヒト組換えＨＧＦである(特開平５−１１１３８３号公報)。
【００２３】
かくして得られたＨＧＦは、ＨＧＦと実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されたり、Ｎ末端又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
【００２４】
本発明の治療剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤、デポット製剤など）をとりうる。ＨＧＦのみ又はそれと適当な担体と共に注射剤、又は適当な担体と共に経口剤とされる。当該注射剤は当業者にとって慣用の方法により調製することができ、例えば、ＨＧＦを適当な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水など）に溶解した後、濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量としては、0.0002-0.2(w/w％)程度、好ましくは0.001-0.1(w/w％)程度に調整される。製剤は製剤上の常套手段に準じて調製することができる。ＨＧＦの含量は、製剤形態、疾患、患者の症状などにより適宜変更することができる。
【００２５】
更に、ＨＧＦは、慣用の坐薬基剤、例えば、カカオ脂、水溶性基剤(例えば、グリセロゼラチン、マクロゴールなど)、他のグリセリド類などを含有する坐薬、保持性浣腸液などの直腸用製剤とすることもできる。
【００２６】
またＨＧＦは吸入剤として投与することもできる。吸入剤として投与する場合、ＨＧＦは、二酸化炭素、適切なガスなどの適当な噴射剤を使用した、加圧された容器又は噴射器からなるエアゾルスプレーの形態とされる。
【００２７】
ＨＧＦは、当業者にとって周知の慣用の徐放性製剤として投与することもできる。徐放性製剤の例としては、微小球体（例えば、ノナ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ビーズ、リポソーム、複エマルジョンなど）などを挙げることができる。
【００２８】
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えは、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤などを含んでいてもよい。液状製剤とした場合には凍結保存、又は凍結乾燥などにより水分を除去して保存することができる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用精製水などを加え、再溶解する。
【００２９】
ＨＧＦの効果的な投与量及び投与スケジュールは経験的に決定することができ、当該決定は当業者にとって自明である。製剤の投与経路は製剤形態により設定することができ、例えば注射剤においては静脈内、動脈内、皮下、筋肉内などに投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、０．１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ・体重の範囲から選択され、好ましい範囲は１μｇ〜４００μｇ／ｋｇである。ＨＧＦ製剤は１日１回又は数回（２又は３回）に分けて投与することができる。
【００３０】
また、ＨＧＦはデポット(depot製剤とすることもできる。このような持続性製剤は、移植（例えば、皮下、筋肉内）又は筋肉内注射により投与される。しかして、例えば、ＨＧＦは適当なポリマー又は親油性物質(例えば、許容される油のエマルジョン)、イオン交換樹脂を用いて、又は徐溶性塩などのような徐溶性誘導体として製剤化される。
【００３１】
デポット製剤の効果的な投与量及び投与スケジュールは経験的に決定することができ、当該決定は当業者にとって自明である。デポット製剤の投与経路は製剤形態により設定することができる。デポット製剤の好ましい投与方法は少なくとも１週間に１回、好ましくは少なくとも１ヶ月に１回とされる。
【００３２】
本発明の一つの目的は、ＨＧＦを含有し、横紋筋融解症又はミオグロビン尿症による急性腎不全治療用の包装製品、キット又は製品を提供する。包装製品は、横紋筋融解症又はミオグロビン尿症による急性腎不全を治療する上で有効量のＨＧＦを含有する容器、及び当該容器に添付された、ＨＧＦが横紋筋融解症又はミオグロビン尿症による急性腎不全を治療するために使用されることを示す説明書からなることができる。例えば、ＨＧＦは無菌バイアルに充填され、次いで箱のような容器に収容される。本発明に基づき薬剤を投与するための説明書は、バイアル及び／又は箱のラベルとして、また包装の挿入物として箱に収納される。
【実施例】
【００３３】
以下の実施例は本発明を説明するためのもので、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
材料
動物
７週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本ＳＬＣより購入し、３日間の予備飼育ののち、７．５週齢（体重約２００ｇ）で実験に用いた。
【００３５】
急性腎不全モデル作製
５０％グリセロールを生理食塩水で調製し、投与前１５時間絶水状態にしたラットに、エーテル麻酔下で筋肉内投与（１０ｍｌ／ｋｇ）した。グリセロール投与８時間後以降は自由飲水に処した。
【００３６】
投与薬物
組換え型ヒト肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）をＨＧF溶解液で１２５μｇ／ｍｌに希釈して用いた。一回の投与当たり２ｍｌ／ｋｇ（２５０μｇ／ｋｇ）の薬物を尾静脈内に投与した。
ＨＧＦ溶解液は、０．３ＭＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液である。
【００３７】
投与
ラットは、対照群とｈＨＧＦ投与群の二群に分けた。一群に、グリセロール投与１時間前及び１、３、５、８、２４、３６時間後にｈＨＧＦ溶液を投与した。
対照群には、グリセロール投与後１及び３時間後に１ｍｌの生理食塩水を、また５及び８時間後に水を投与した。
【００３８】
症状観察
グリセロール投与後１４日間にわたり、ラットの生存率を観察した。
【００３９】
結果
グリセロールの投与によって、ラットは著しい急性腎不全に陥り、グリセロール投与２日後の血清ＢＵＮ及び血清クレアチニン値は大きく上昇していた(血清クレアチニン値：対照群＝５．１±１．２ｍｇ／ｄｌ、ＨＧＦ投与群＝４．２±０．８ｍｇ／ｄｌ)。
【００４０】
生存率を図１に示す。グリセロール投与３日後以降、対照群のラットに死亡が観察され、その後９日後までに１３匹中９匹が死亡した。死亡直後の個体を剖検した結果では、腎臓の外見が著しく変化し、腎皮質部分の尿細管の壊死が観察された。
【００４１】
ＨＧＦ投与群では、実験期間中に死亡例は見られなかった。グリセロール投与後１４日の時点における生存率をカイ２乗検定を用いて検定したところ、対照群に対してＨＧＦ投与群の生存率が有意に（Ｐ＜０．０１）高かった。
【００４２】
実施例２
材料
実験動物
７週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本ＳＬＣより購入し、３日間の予備飼育ののち、７．５週齢（体重約２００ｇ）で実験に用いた。
【００４３】
急性腎不全モデル作製
５０％グリセロールを生理食塩水で調製し、投与前１５時間絶水状態にしたラットに、エーテル麻酔下で筋肉内投与（１０ｍｌ／ｋｇ）した。グリセロール投与８時間後以降は自由飲水に処した。
【００４４】
投与薬物
組換え型ヒト肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）を生理食塩水で１２５μｇ／ｍｌに希釈して用いた。一回の投与当たり２ｍｌ／ｋｇ（２５０μｇ／ｋｇ）の薬物を尾静脈内に投与した。
【００４５】
投与
実験は、対照群１０匹、ｈＨＧＦ投与群１０匹の二群をもうけた。一群に、グリセロール投与１時間前及び１、３、５、８、２４、３６時間後にｈＨＧＦ溶液を投与した。対照群には、グリセロール投与後１及び３時間後に１ｍｌの生理食塩水を、また５及び８時間後に水を投与した。
【００４６】
血清及び尿生化学値の測定
グリセロール投与１、３、６日後に、エーテル麻酔下において、尾動脈より採血し血清を得た。超微量多目的生化学自動分析装置ＣＨＥＭ １を用いて血清尿素窒素(ＢＵＮ)、血清クレアチニン（Ｃｒｅ）量を測定した。
【００４７】
また、代謝ケージを用いて、グリセロール投与１、３、６日後の１２時間蓄尿を採取した。尿量を測定したのち、超微量多目的生化学自動分析装置ＣＨＥＭ １を用いて、尿中クレアチニン量を測定した。
以上の項目から、内因性Ｃｒｅクリアランス値を以下の換算式より算出した。
内因性Ｃｒｅクリアランス＝［尿Ｃｒｅ値（ｍｇ／ｄｌ）ｘ１２時間蓄尿量(ｍｌ)］／［血清Ｃｒｅ値（ｍｇ／ｄｌ）ｘ蓄尿時間(７２０ｍｉｎ)］
【００４８】
症状観察
グリセロール投与後１５日間にわたり、ラットの生死を観測した。
【００４９】
統計処理
グリセロール投与後１５日の時点における両群の生存率をカイ２乗検定を用いて検定した。
グリセロール投与後１日及び３日の両群の血清生化学値を、ｔ検定あるいはWelchの検定により検定した。
【００５０】
結果
生存率
グリセロール投与３日後以降、対照群のラットに死亡が観察され、９日後までに１０匹中７匹が死亡した。
ＨＧＦ投与群では、実験期間中、１０匹中２匹の死亡が観察されたが、ＨＧＦ投与群の生存率は対照群のそれに比して有意に高かった(Ｐ＜０．０５)。
【００５１】
血清・尿生化学値及び腎機能検査値
血清・尿生化学値及び腎機能検査値を図２に示す。
対照群では、グリセロールの投与により、１日後から血清ＢＵＮ、Ｃｒｅ値の著明な上昇がみられ、以後６日後にかけてＢＵＮ、Ｃｒｅ値は悪化した。内因性Ｃｒｅクリアランスは０．１以下と低いレベルを維持しており、重度の腎不全症状を示した。
【００５２】
これに対して、ＨＧＦ投与群では、グリセロール投与３日後において、血清ＢＵＮ値の減少が観察され、急性腎不全の抑制（Ｐ＜０．０５）を伴っていた。また、同時に内因性Ｃｒｅクリアランスも有意に（Ｐ＜０．０５）改善された。
【００５３】
実施例３
材料
動物
７週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本ＳＬＣより購入し、３日間の予備飼育ののち、７．５週齢（体重約２００ｇ）で実験に用いた。
急性腎不全モデル ５０％グリセロールを生理食塩水で調製し、投与前１５時間絶水状態にしたラットに、エーテル麻酔下で筋肉内投与（１０ｍｌ／ｋｇ）した。グリセロール投与８時間後以降は自由飲水に処した。
【００５４】
投与薬物
組換え型ヒト肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）をＨＧＦ溶解液で１２５μｇ／ｍｌに希釈して用いた。一回の投与当たり２ｍｌ／ｋｇ（２５０μｇ／ｋｇ）の薬物を尾静脈内に投与した。
【００５５】
投与
実験は、対照群８匹、ｈＨＧＦ投与群８匹の二群をもうけた。一群に、グリセロール投与１時間前及び１、３、５、８、２４、３６時間後にｈＨＧＦ溶液を投与した。対照群には、グリセロール投与後１及び３時間後に１ｍｌの生理食塩水を、また５及び８時間後に水を投与した。
【００５６】
腎組織の解析 グリセロール投与３日後にラットをと殺し、腎臓を切り出してリン酸緩衝ホルマリン液に固定し、パラフィン包埋から腎組織切片を作製し、ＰＡＳ染色に供した。各個体につき一枚ずつ、腎皮質部分の光顕像を撮影し、腎皮質尿細管細胞の壊死の程度を、軽度・中度・重度にわけてスコアづけした。対照群・ＨＧＦ投与群間のスコアの差は、カイ二乗検定を用いて有意差検定した。
【００５７】
結果
腎尿細管細胞の組織障害
下記表１に、両群の腎組織障害のスコアを示す。ＨＧＦ投与群では、対照群に比して有意に障害度が抑制されていた。
【００５８】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、横紋筋融解症による急性腎不全の治療剤。
【請求項２】
治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、ミオグロビン尿症の治療剤。
【請求項３】
治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、外傷、圧迫、座滅症候群、火傷、感染、薬物中毒、筋代謝疾患、筋の過剰使用、低リン血症又は蛇毒により放出された筋融解物質に起因する横紋筋融解症による急性腎不全の治療剤。
【請求項４】
治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、ミオグロビン尿症による腎皮質尿細管細胞の壊死抑制剤。
【請求項５】
容器；
当該容器に収容された、横紋筋融解症又はミオグロビン尿症による急性腎不全を治療する上で有効量のＨＧＦ；及び、
当該容器に添付され、ＨＧＦが横紋筋融解症又はミオグロビン尿症による急性腎不全を治療するために使用されることを示す説明書；
からなる包装製品。
【請求項１】
治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、横紋筋融解症による急性腎不全の治療剤。
【請求項２】
治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、ミオグロビン尿症の治療剤。
【請求項３】
治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、外傷、圧迫、座滅症候群、火傷、感染、薬物中毒、筋代謝疾患、筋の過剰使用、低リン血症又は蛇毒により放出された筋融解物質に起因する横紋筋融解症による急性腎不全の治療剤。
【請求項４】
治療上有効量のＨＧＦ及び医薬として許容される担体からなる、ミオグロビン尿症による腎皮質尿細管細胞の壊死抑制剤。
【請求項５】
容器；
当該容器に収容された、横紋筋融解症又はミオグロビン尿症による急性腎不全を治療する上で有効量のＨＧＦ；及び、
当該容器に添付され、ＨＧＦが横紋筋融解症又はミオグロビン尿症による急性腎不全を治療するために使用されることを示す説明書；
からなる包装製品。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１００６６４（Ｐ２０１０−１００６６４Ａ）
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２９２９４（Ｐ２０１０−２９２９４）
【出願日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【分割の表示】特願平１０−５４０３５３の分割
【原出願日】平成１０年３月１２日（１９９８．３．１２）
【出願人】（５９１１１５０７３）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【分割の表示】特願平１０−５４０３５３の分割
【原出願日】平成１０年３月１２日（１９９８．３．１２）
【出願人】（５９１１１５０７３）
【Ｆターム（参考）】
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