感知方法
【課題】感知対象物の分子量が小さい場合であっても当該感知対象物を感度高く、さらに簡便に検出することができる技術を提供すること。
【解決手段】その表面に感知対象物が吸着するように構成された圧電振動子を発振させる工程と、前記感知対象物と競合して前記圧電振動子の表面に吸着し、感知対象物よりもその分子量が大きい競合物質を含んだ試料液を、当該圧電振動子の表面に供給する工程と、前記試料液がその表面に供給される前後の前記圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、測定された各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、を行うことで、感知対象物を簡便に検出することができ、検出感度を高くすることができる。
【解決手段】その表面に感知対象物が吸着するように構成された圧電振動子を発振させる工程と、前記感知対象物と競合して前記圧電振動子の表面に吸着し、感知対象物よりもその分子量が大きい競合物質を含んだ試料液を、当該圧電振動子の表面に供給する工程と、前記試料液がその表面に供給される前後の前記圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、測定された各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、を行うことで、感知対象物を簡便に検出することができ、検出感度を高くすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、圧電振動子を用いて感知対象物を検出する感知方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品衛生分野では食品中のカビ毒や抗生物質などの比較的分子量が低い物質の検出や定量が行われる。特にカビ毒は僅かな量でも人体に毒性を示すことからカビ毒検査には高感度な測定法が必須である。また、医薬品開発の分野でも低分子物質の検出や定量を行う場合がある。従来、これら低分子物質の測定にはクロマトグラフィー分析やＥＬＩＳＡ法が用いられている。このＥＬＩＳＡ法では、低分子物質である感知対象物に結合する抗体などを予めプレートに結合させておき、感知対象物と、発色性タンパク質が結合した所定の化合物とを競合させて前記抗体に反応させる。その後、試薬を加えて前記抗体に結合した発色性タンパク質を発色させ、発色に基づいて感知対象物の検出または定量を行う。しかし、前記クロマトグラフィー分析は、カラムによる感知対象物の分離に時間がかかるし、ＥＬＩＳＡ法では複数段階の化学反応を行うため煩雑かつ測定に時間を要する。なお、一般的にＥＬＩＳＡ法として用いられるサンドイッチ法は、低分子物質が複数の物質と結合しにくいため適さない。
【０００３】
そのようなことから、特許文献１に示されるようなＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance）を利用した感知手法を用いることが考えられる。この感知手法について簡単に説明すると、感知装置に設けられた水晶振動子の表面に前記試料液が供給される。そして、水晶振動子の表面に試料液中の感知対象物が吸着されると、質量付加効果により吸着量に応じて水晶振動子の発振周波数が変化する。この周波数変化量に基づいて試料液中の感知対象物の検出または定量を行う。
【０００４】
ところで、このＱＣＭによる感知方法では質量付加効果を利用していることから、感知対象物の分子量が大きいほど前記吸着量に対する周波数変化量が大きい、即ち感度が高いため、試料液に含まれる感知対象物が低濃度であっても計測が可能である。しかし、感知対象物が低分子物質である場合には前記吸着量に対する周波数変化量が小さいので、感度が低くなってしまう。従って、試料液に含まれる感知対象物の濃度が低いと計測が行えなくなる。例えば水晶振動子の表面に感知対象物を直接物理吸着させる場合、分子量が約１５００００の抗体は、試料液中の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ（７０ｐＭ）程度であっても定量を行うことができると考えられている。しかし、分子量が約８０の低分子物質、例えば２−メルカプトエタノールは、５μｇ／ｍＬ（５０μＭ）が検出限界であると考えられている。
【０００５】
このような問題に対して、水晶振動子に供給する試料液の希釈率を低くして感度を上げることが考えられる。ところが、一般的に低分子物質は水に対する溶解性が低く、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒に溶解する性質がある。そのため、上記のように試料液の希釈率を低くすると、試料液中の有機溶媒の比率が高くなるが、有機溶媒は水に比べて粘性が高い場合が多いため、この有機溶媒により水晶振動子の発振が妨げられ、正常な測定ができないおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７-１７８３４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような事情の下になされたものであり、その目的は、感知対象物の分子量が小さい場合であっても当該感知対象物を感度高く、簡便に検出することができる技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の感知方法は、その表面に感知対象物が吸着する圧電振動子を発振させる工程と、
前記感知対象物と競合して前記圧電振動子の表面に吸着し、感知対象物よりもその分子量が大きい競合物質を含んだ試料液を、当該圧電振動子の表面に供給する工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、
を備えることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の他の発明の感知方法は、圧電振動子を発振させる工程と、
感知対象物よりもその分子量が大きく、感知対象物と結合することにより保有する前記圧電振動子の表面への吸着性が失われる結合物質を含む試料液を圧電振動子の表面に供給し、前記感知対象物に結合していない結合物質を当該圧電振動子の表面に吸着させる工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、
を備えることを特徴とする。
【００１０】
前記感知対象物の検出を行う工程は、
予め設定された試料液の供給前後における圧電振動子の固有振動数と試料液中に含まれる感知対象物の濃度との対応関係に基づいて、感知対象物の濃度を特定する工程を含んでいてもよい。また、その表面に感知対象物が吸着しない参照用の圧電振動子を発振させる工程と、
前記試料液を当該参照用の圧電振動子の表面に供給する工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記参照用の圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された前記各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の感知方法によれば、感知対象物と感知対象物よりも分子量が大きい競合物質とが競合して圧電振動子の表面に吸着され、吸着前後の固有振動数の変化に基づいて感知対象物を検出する。また、試料液に感知対象物よりも分子量が大きい結合物質を添加して、感知対象物に結合せずに遊離している結合物質を圧電振動子に吸着させ、吸着前後の周波数変化に基づいて感知対象物を検出する。従って、試料液中の感知対象物の分子量が小さくても周波数変化を大きくすることができるため、感度高く感知対象物の検出を行うことができる。また、周波数の変化に基づいて感知対象物の検出を行うため、ＥＬＩＳＡ法のように感知対象物を複数段階にわたって化学反応させる必要が無く、簡便に検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る感知方法を実施する感知装置の外観構成図である。
【図２】前記感知装置を構成する感知センサーの斜視図である
【図３】前記感知センサーの縦断側面図である。
【図４】前記感知センサーを構成する水晶振動子の斜視図である。
【図５】前記水晶振動子の側面の模式図である。
【図６】前記感知装置の構成を示すブロック図である。
【図７】水晶振動子表面へのビオチン結合ＢＳＡの吸着を示す模式図である。
【図８】前記吸着による周波数変化を示すグラフ図である。
【図９】水晶振動子表面へのビオチン結合ＢＳＡの吸着を示す模式図である。
【図１０】前記吸着による周波数変化を示すグラフ図である。
【図１１】検量線の一例を示すグラフ図である。
【図１２】測定手順を示す説明図である。
【図１３】水晶振動子表面の変化を示す模式図である。
【図１４】水晶振動子表面の変化を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（第１の実施形態）
以下、本発明の感知方法を実施するための感知装置１について説明する。この感知装置１は、例えば低分子物質であるビオチン（分子量２４４）を感知対象物として、その定量を行う。図１の外観構成図に示すように、感知装置１は発振回路ユニット１１と演算装置１２とを備えており、発振回路ユニット１１はケーブル１３を介して演算装置１２に着脱自在に接続されている。演算装置１２の筐体１４前面に設けられた表示部１５は、例えばＬＥＤ表示画面や液晶表示画面により構成され、周波数あるいは周波数の変化分等の測定結果を表示する。
【００１４】
発振回路ユニット１１には、感知センサー２が着脱自在に接続される。図２には感知センサー２の斜視図を、図３には感知センサー２の縦断側面図を夫々示している。感知センサー２は、一端側が接続端子２１ａ、２１ｂ、２１ｃをなす基板２２に設けられた孔２３を塞ぐように後述の水晶片３１を設け、基板２２の裏面側からシート２４により前記孔２３を塞ぎ、基板２２の表面側にてシート２５、上蓋ケース２６を下からこの順に積層した構成となっている。当該構成により水晶片３１の下面側に気密空間２７が形成されてランジュバン型の感知センサー２が構成される。また、シート２４にその周縁部が押圧され、水晶片３１が基板２１に固定される。上蓋ケース２６には試料液の注入口２８と試料液の観察口２９とが設けられており、注入口２８から試料液を注入することによって、シート２５に設けられた貫通孔により形成された水晶片３１の上面側の貯留空間２０に試料液が満たされる。
【００１５】
その表面、裏面を夫々示した図４（ａ）、（ｂ）を参照して水晶片３１について説明する。水晶片３１は、互いに独立して振動する第１の水晶振動子３Ａ及び第２の水晶振動子３Ｂを構成している。水晶片３１は例えば円形に構成され、その直径に沿って形成された溝３２により、これら第１の水晶振動子３Ａ、第２の水晶振動子３Ｂが仕切られている。第１の水晶振動子３Ａの上面、第２の水晶振動子３Ｂの上面には夫々励振電極３３ａ、３３ｂが設けられている。励振電極３３ａ、３３ｂから夫々水晶片３１の側面を介して裏面に向かって電極３４ａ、３４ｂが引き出されている。第１の水晶振動子３Ａ、第２の水晶振動子３Ｂの発振周波数を互いに若干ずらすために励振電極３３ａ，３３ｂは厚さが互いに異なるように形成されている。
【００１６】
また、水晶片３１の下面には励振電極３３ａ、３３ｂに対向する励振電極３３ｃが設けられており、励振電極３３ｃから水晶片３１の縁部に向かって電極３４ｃが引き出されている。電極３４ａ、３４ｂ、３４ｃを介して励振電極３３ａ、３３ｂ、３３ｃが、基板２２の接続端子２１ａ、２１ｂ、２１ｃに電気的に接続されている。各電極の表面は例えば金により構成される。
【００１７】
図５（ａ）、（ｂ）は夫々第１の水晶振動子３Ａの側面、第２の水晶振動子３Ｂの側面を模式的に示している。第１の水晶振動子３Ａの励振電極３３ａの表面には、吸着膜４１が形成されている。この吸着膜４１の表面はストレプトアビジン（ＳＡ）４０からなり、ストレプトアビジン４０は感知対象物であるビオチン及び後述するビオチン結合ＢＳＡと結合する。
【００１８】
第２の水晶振動子３Ｂの励振電極３３ｂの表面には、官能膜４２が形成されている。この官能膜４２の表面はアミノ基（ＮＨ２基）４３により構成されている。このアミノ基４３は、後にＢＳＡでブロッキングを行うためビオチン及びビオチン結合ＢＳＡに結合できない。ビオチン結合ＢＳＡの分子量は、ビオチンの分子量のおよそ２７０倍である。
【００１９】
図６は感知装置１のブロック図であり、この図６を参照しながら感知装置１を構成する発振回路ユニット１１について説明する。発振回路ユニット１１には第１の発振回路５１ａ及び第２の発振回路５１ｂが設けられており、第１の発振回路５２ａは第１の水晶振動子３Ａを、第２の発振回路５２ｂが第２の水晶振動子３Ｂを夫々発振させる。
【００２０】
続いて感知装置１を構成する演算装置１２の構成について説明する。前記発振回路５１ａ、５１ｂの後段にはスイッチ部５２が設けられており、このスイッチ部５２によって２つの発振回路５１ａ、５１ｂからの周波数信号を時分割して後段に取り込み、各振動領域の発振周波数を並行して求めることができる。第１の発振回路５１ａからの出力をチャンネル１（Ｆ１）、第２の発振回路５１ｂからの出力をチャンネル２（Ｆ２）とすると、例えば１秒間をｎ分割（ｎは偶数）し、各チャンネルの発振周波数を１／ｎ秒の処理で順次求めることにより、１秒間に少なくとも１回以上周波数を取得しているため、実質同時に各チャンネルの周波数を取得することができる。
【００２１】
スイッチ部５２の後段には測定回路部５３が設けられている。測定回路部５３は入力信号である周波数信号をディジタル処理して、各チャンネルの発振周波数を測定する。また、演算装置１３はデータバス６１を備えており、データバス６１にはＣＰＵ６２、データ処理プログラム６３を格納した記憶手段、既述の測定回路部５３及び既述の表示部１５が接続されている。
【００２２】
データ処理プログラム６３は、測定回路部５４から出力される信号に基づいて第１の発振回路５１ａの発振周波数「Ｆ１」の時系列データ及び第２の発振回路５２ａの発振周波数「Ｆ２」の時系列データを取得し、メモリ６４に格納する。またこのデータ取得動作と同時に、同一の時間帯におけるチャンネル１から取得した発振周波数Ｆ１、チャンネル２から取得した発振周波数Ｆ２の各時系列データの差分「Ｆ１−Ｆ２」を夫々演算し、当該差分データの時系列データを取得してメモリ６４に格納すると共に、この「Ｆ１−Ｆ２」の経時変化のグラフを表示部１５に表示する。
【００２３】
感知装置１を用いて、試料液中のビオチンの定量を行う工程について説明する。先ず、例えば発振回路ユニット１１から分離した状態にある感知センサー２の第１の水晶振動子３Ａ及び第２の水晶振動子３Ｂの表面に上述のようにアミノ基４３を有する吸着阻害膜４２を形成する。続いて、ストレプトアビジンをＮＨＳ／ＥＤＣ溶液で希釈して当該ストレプトアビジンのカルボキシル基を活性エステル化する。そして、この溶液を第１の水晶振動子３Ａに滴下し、アミノ基４３にストレプトアビジン４０を結合させ、第１の水晶振動子３Ａの官能膜４２を吸着膜４１にする。その後、発振回路ユニット１１に感知センサー２を装着し、注入口２８からＢＳＡを含む試薬を供給する。これによって、ＢＳＡが第２の水晶振動子３Ｂの官能膜４２のアミノ基４３に結合し、当該アミノ基４３がブロッキングされる。また第１の水晶振動子３Ａにおいて、ストレプトアビジン４０が吸着せずに残留したアミノ基４３（不図示）も、このＢＳＡに結合してブロッキングされる。
【００２４】
感知装置１の電源をオンにすると各水晶振動子３Ａ、３Ｂが発振し、夫々の周波数に対応する周波数信号Ｆ１、Ｆ２が取り出される。そして、これら周波数信号は時分割されて、測定回路部５４に取り込まれ、Ａ／Ｄ変換された後、各ディジタル値が信号処理される。そして２つのチャンネルの周波数信号から、前記周波数「Ｆ１、Ｆ２」が取り出されてメモリ６４に記憶され、さらに記憶された「Ｆ１、Ｆ２」に基づいて「Ｆ１−Ｆ２」が演算されてメモリ６４に記憶される動作が継続される。また、表示部１６に既述のグラフが表示され、周波数差「Ｆ１−Ｆ２」の変化がリアルタイムで表示される。具体的な発振周波数としては、例えばＦ１が３０．８３４ＭＨｚ、Ｆ２が３０．９３４ＭＨｚである。
【００２５】
次いで、ユーザは、ビオチンの濃度が不明である所定の量の検査液と、ビオチン結合ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を例えば１０μｇ／ｍＬ含んだ所定の量の試薬とを混合し、試料液を調製する。なお、試料液にはビオチンを溶解させるために、例えば１体積％のＤＭＳＯが含まれている。このように調製した試料液を感知センサー２の注入口２８に注入し、水晶振動子３Ａ、３Ｂの表面に試料液が供給されて、質量付加効果により水晶振動子３Ａ，３Ｂの発振周波数が低下する。
【００２６】
試料液に含まれるビオチン７１及びビオチン結合ＢＳＡ７２は、ともに水晶振動子３Ａの吸着膜４１を構成するストレプトアビジン４０に結合する性質を有するため、ビオチン７１とビオチン結合ＢＳＡ７２とが、ストレプトアビジン４０への結合をめぐって競合する。その結果、試料液中のビオチン７１の濃度に応じた割合で、ビオチン結合ＢＳＡ７２とビオチン７１とが吸着膜４１に吸着される。そして、吸着されたビオチン結合ＢＳＡ７２とビオチン７１との割合に応じて、質量付加効果によりチャンネル１の周波数Ｆ１がさらに低下し、Ｆ１−Ｆ２の値が変化する。つまり、試料液供給前後のＦ１−Ｆ２の変化量をΔＦとすると、このΔＦは試料液中のビオチン７１の濃度に対応する。
【００２７】
具体的に試料液中のビオチン７１が比較的多い場合は、図７（ａ）、（ｂ）に示すように比較的多くのビオチン７１が吸着膜４１に吸着され、ビオチン結合ＢＳＡ７２の吸着が抑えられる。上記のようにビオチン結合ＢＳＡ７２の分子量はビオチン７１の分子量より大きいため、図８に示すように周波数差Ｆ１−Ｆ２の変化量ΔＦは比較的小さくなる。なお、グラフ中の時刻ｔ１は試料液を感知センサー２に注入した時刻である。
【００２８】
試料液中のビオチン７１が比較的少ない場合は、図９（ａ）、（ｂ）に示すようにビオチン７１の吸着膜４１への吸着が抑えられ、代わってビオチン結合ＢＳＡ７２が多く吸着される。従って、図１０に示すように周波数差Ｆ１−Ｆ２の変化量ΔＦは比較的大きくなる。
【００２９】
試料液注入後所定の時間が経過すると、ユーザは表示部１５に表示されるグラフから前記変化量ΔＦを読み出す。そして、ビオチンを含まない他は前記試料液と同様に調製され、予め当該試料液と同様に測定された参照液の周波数変化ΔＦをΔＦ０とすると、読み出した試料液のΔＦ及び参照液のΔＦ０からΔＦ／ΔＦ０＝Ｐを演算し、このＰをロジット変換する。つまり、ｌｎ（Ｐ／１−Ｐ）を演算する。図１１は、予め作成しておいた検量線であり、縦軸がｌｎ（Ｐ／１−Ｐ）、横軸がビオチンの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を夫々示している。この検量線から、演算したｌｎ（Ｐ／１−Ｐ）に対応するビオチンの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を読み出し、この読み出した濃度を試料液中のビオチンの濃度として決定する。
【００３０】
図１１の検量線の作成方法について説明する。既述した試料液中のビオチンの濃度を測定する場合と同様に、水晶振動子３Ａ、３Ｂの表面に夫々吸着膜４１、吸着阻害膜４２を形成し、ＢＳＡを供給してブロッキングを行い、各水晶振動子３Ａ、３Ｂを発振させた後、用意した検量線作成用の試料液を供給して、既述のようにΔＦを計測する。この作業を複数の検量線作成用の試料液に対して行う。これらの検量線作成用の試料液は、上記のようにビオチン結合ＢＳＡを１０μｇ／ｍＬ含む試薬に検査液を混合して調製するが、検査液に含まれるビオチンの濃度は既知であると共に互いに異なり、例えば０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬである。また、検量線作成用の試料液のＤＭＳＯの濃度は、ビオチンの濃度測定用の試料液と同じく１体積％である。
【００３１】
ビオチンの濃度が０ｎｇ／ｍＬである検査液から調製した試料液を測定して得られたΔＦは、既述のΔＦ０である。その他の濃度のビオチンを含む検査液から調製した試料液から得たΔＦについては、既述のようにΔＦ０を用いて、上記のようにｌｎ（Ｐ／１−Ｐ）を演算し、演算値をグラフにプロットする。このプロットから図１１の検量線を作成する。
【００３２】
この第１の実施形態によれば、試料液中のビオチンの濃度が小さいほど、試料液中のビオチン結合ＢＳＡが第１の水晶振動子３Ａに吸着され、ビオチンとビオチン結合ＢＳＡの吸着による周波数変化に基づいてビオチンの濃度が測定される。ビオチンに比べてビオチン結合ＢＳＡは分子量が大きいため、試料液中のビオチンの濃度が小さくても第１の水晶振動子３Ａの発振周波数を大きく変化させることができるので測定感度が高くなり、従ってビオチンの定量を正確に測定することができる。また、このように周波数の測定により定量を行うため、ビオチンを複数段階に渡って化学反応させる必要が無いし、クロマトグラフィー分析のようにカラムを通過させて試料液からビオチンを分離する必要が無いので、定量を簡便に行うことができる。
【００３３】
また、上記の例ではビオチン結合ＢＳＡをビオチンと競合させて吸着膜４１と結合させているが、競合させる物質としてはビオチン結合ＢＳＡに限られない。例えばビオチンにＢＳＡよりも分子量が大きい金コロイドなどを結合させ、このビオチン結合金コロイドをビオチンに競合させることで、さらに感知装置１の感度を高め、より正確にビオチンの定量を行うことができる。また、上記の例では周波数差Ｆ１−Ｆ２に基づいて濃度の測定を行っているため、精度高く測定を行うことができる。なお、このようにＦ１とＦ２の差分を求める代わりに、予め試料液の水圧による周波数変化量を予測しておき、その予測した変化量と得られた周波数Ｆ１との差分を求めて、その差分に基づいて前記濃度の測定を行ってもよい。
【００３４】
上記の手法で、例えば抗生物質や抗菌剤などの比較的低い分子量を持った化合物についても検出や定量を行うことができる。具体的には、ビオチン以外にも例えばストレプトマイシンを同様の方法で検出したり、その濃度を測定することができる。この場合、競合させる物質としては例えばストレプトマイシン結合ＢＳＡが用いられる。また、吸着膜４１としては例えば抗ストレプトマイシン抗体が用いられる。また、その他にもアンピシリンを同様の方法で検出したり、その濃度を測定することができる。この場合、競合させる物質としては例えばアンピシリン結合ＢＳＡが用いられる。また、吸着膜４１としては例えば抗アンピシリン抗体が用いられる。
【００３５】
なお、感知対象物及び感知対象物に競合する競合物質がＳＨ基を持つ場合には、これら感知対象物及び競合物質は、当該ＳＨ基により表面が金からなる励振電極３３Ａに吸着することができ、この励振電極３３Ａに対して競合するので吸着膜４１を設けなくてよい。
【００３６】
（第２の実施形態）
試料液中のビオチンの定量を行う第２の実施形態について、第１の実施形態との差異点を中心に説明する。この第２の実施形態の感知装置１では、第１の水晶振動子３Ａの吸着膜４１をビオチンにより構成する。
【００３７】
続いて、検量線の作成方法を説明する。０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬのビオチンが夫々含まれた検査液８１が注入された各チューブ８０に、所定の濃度のストレプトアビジン４０を含む試薬８２を所定の量添加し、試料液を作成する（図１２）。このように検査液８１と試薬８２とが混合されて構成される各試料液中では、ストレプトアビジン４０がビオチン７１に結合する。従って、検査液８１におけるビオチン７１の濃度が低いほど、試料液中では当該ビオチン７１に結合せずに遊離しているストレプトアビジン４０の量が多くなる。
【００３８】
そして、第１の実施形態と同様に各試料液を感知センサー２に供給して、順次試料液の供給前後の周波数Ｆ１−Ｆ２の変化量ΔＦを計測する。このときチューブ８０内でビオチン７１に結合したストレプトアビジン４０は吸着膜４１を構成するビオチン７１に結合しない。従って、図１３（ａ）（ｂ）に示すように、試料液中において遊離しているストレプトアビジン４０が多いほど、多くのストレプトアビジン４０が吸着膜４１を構成するビオチン７１に吸着されるため、ΔＦが大きくなる。
【００３９】
逆に、図１４（ａ）（ｂ）に示すように試料液中において、遊離しているストレプトアビジン４０が少ないほど、吸着膜４１を構成するビオチン７１に吸着されるストレプトアビジン４０が少ないためΔＦが小さくなる。つまり、ΔＦは遊離しているストレプトアビジン４０の濃度に対応する。遊離しているストレプトアビジン４０の濃度は、試料液中のビオチン７１の濃度に対応するため、ΔＦは試料液中のビオチン７１の濃度に対応する。
【００４０】
第１の実施形態と同様に、各試料液について測定したΔＦから検量線を作成する。検量線作成後、ビオチンの濃度が不明な検査液８１から検量線を作成する場合と同様に試料液を調整し、ΔＦを測定する。そしてこのΔＦと既に作成した検量線とから試料液中のビオチンの濃度を特定する。ストレプトアビジンは、ビオチンよりも分子量が大きく、この第２の実施形態においては試料液中のビオチンの濃度が小さいほど、吸着膜４１に吸着されるストレプトアビジンが多くなるため、周波数変化ΔＦを大きくとることができる。従って、この第２の実施形態も第１の実施形態と同様の効果を有する。
【００４１】
この第２の実施形態の手法で、例えば抗生物質や抗菌剤などの低い分子量を持った化合物についても検出や定量を行うことができる。具体的には、ビオチン以外にも例えばストレプトマイシンを同様の方法で検出したり、その濃度を測定することができる。この場合、試料液中に添加すると共に吸着膜４１に吸着させる物質としては例えば抗ストレプトマイシン抗体が用いられる。また、吸着膜４１は例えばストレプトマイシンにより構成される。また、その他にもアンピシリンを同様の方法で検出したり、その濃度を測定することができる。この場合、試料液中に添加する共に吸着膜４１に吸着させる物質としては例えば抗アンピシリン抗体が用いられる。また、吸着膜４１は例えばアンピシリンにより構成される。
【符号の説明】
【００４２】
１ 感知装置
２ 感知センサー
３Ａ 水晶振動子
３Ｂ 水晶振動子
３１ 水晶片
３３ａ 励振電極
３３ｂ 励振電極
４１ 吸着膜
４２ 吸着阻害膜
５１ａ 発振回路
５１ｂ 発振回路
【技術分野】
【０００１】
本発明は、圧電振動子を用いて感知対象物を検出する感知方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品衛生分野では食品中のカビ毒や抗生物質などの比較的分子量が低い物質の検出や定量が行われる。特にカビ毒は僅かな量でも人体に毒性を示すことからカビ毒検査には高感度な測定法が必須である。また、医薬品開発の分野でも低分子物質の検出や定量を行う場合がある。従来、これら低分子物質の測定にはクロマトグラフィー分析やＥＬＩＳＡ法が用いられている。このＥＬＩＳＡ法では、低分子物質である感知対象物に結合する抗体などを予めプレートに結合させておき、感知対象物と、発色性タンパク質が結合した所定の化合物とを競合させて前記抗体に反応させる。その後、試薬を加えて前記抗体に結合した発色性タンパク質を発色させ、発色に基づいて感知対象物の検出または定量を行う。しかし、前記クロマトグラフィー分析は、カラムによる感知対象物の分離に時間がかかるし、ＥＬＩＳＡ法では複数段階の化学反応を行うため煩雑かつ測定に時間を要する。なお、一般的にＥＬＩＳＡ法として用いられるサンドイッチ法は、低分子物質が複数の物質と結合しにくいため適さない。
【０００３】
そのようなことから、特許文献１に示されるようなＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance）を利用した感知手法を用いることが考えられる。この感知手法について簡単に説明すると、感知装置に設けられた水晶振動子の表面に前記試料液が供給される。そして、水晶振動子の表面に試料液中の感知対象物が吸着されると、質量付加効果により吸着量に応じて水晶振動子の発振周波数が変化する。この周波数変化量に基づいて試料液中の感知対象物の検出または定量を行う。
【０００４】
ところで、このＱＣＭによる感知方法では質量付加効果を利用していることから、感知対象物の分子量が大きいほど前記吸着量に対する周波数変化量が大きい、即ち感度が高いため、試料液に含まれる感知対象物が低濃度であっても計測が可能である。しかし、感知対象物が低分子物質である場合には前記吸着量に対する周波数変化量が小さいので、感度が低くなってしまう。従って、試料液に含まれる感知対象物の濃度が低いと計測が行えなくなる。例えば水晶振動子の表面に感知対象物を直接物理吸着させる場合、分子量が約１５００００の抗体は、試料液中の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ（７０ｐＭ）程度であっても定量を行うことができると考えられている。しかし、分子量が約８０の低分子物質、例えば２−メルカプトエタノールは、５μｇ／ｍＬ（５０μＭ）が検出限界であると考えられている。
【０００５】
このような問題に対して、水晶振動子に供給する試料液の希釈率を低くして感度を上げることが考えられる。ところが、一般的に低分子物質は水に対する溶解性が低く、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒に溶解する性質がある。そのため、上記のように試料液の希釈率を低くすると、試料液中の有機溶媒の比率が高くなるが、有機溶媒は水に比べて粘性が高い場合が多いため、この有機溶媒により水晶振動子の発振が妨げられ、正常な測定ができないおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７-１７８３４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような事情の下になされたものであり、その目的は、感知対象物の分子量が小さい場合であっても当該感知対象物を感度高く、簡便に検出することができる技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の感知方法は、その表面に感知対象物が吸着する圧電振動子を発振させる工程と、
前記感知対象物と競合して前記圧電振動子の表面に吸着し、感知対象物よりもその分子量が大きい競合物質を含んだ試料液を、当該圧電振動子の表面に供給する工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、
を備えることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の他の発明の感知方法は、圧電振動子を発振させる工程と、
感知対象物よりもその分子量が大きく、感知対象物と結合することにより保有する前記圧電振動子の表面への吸着性が失われる結合物質を含む試料液を圧電振動子の表面に供給し、前記感知対象物に結合していない結合物質を当該圧電振動子の表面に吸着させる工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、
を備えることを特徴とする。
【００１０】
前記感知対象物の検出を行う工程は、
予め設定された試料液の供給前後における圧電振動子の固有振動数と試料液中に含まれる感知対象物の濃度との対応関係に基づいて、感知対象物の濃度を特定する工程を含んでいてもよい。また、その表面に感知対象物が吸着しない参照用の圧電振動子を発振させる工程と、
前記試料液を当該参照用の圧電振動子の表面に供給する工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記参照用の圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された前記各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の感知方法によれば、感知対象物と感知対象物よりも分子量が大きい競合物質とが競合して圧電振動子の表面に吸着され、吸着前後の固有振動数の変化に基づいて感知対象物を検出する。また、試料液に感知対象物よりも分子量が大きい結合物質を添加して、感知対象物に結合せずに遊離している結合物質を圧電振動子に吸着させ、吸着前後の周波数変化に基づいて感知対象物を検出する。従って、試料液中の感知対象物の分子量が小さくても周波数変化を大きくすることができるため、感度高く感知対象物の検出を行うことができる。また、周波数の変化に基づいて感知対象物の検出を行うため、ＥＬＩＳＡ法のように感知対象物を複数段階にわたって化学反応させる必要が無く、簡便に検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る感知方法を実施する感知装置の外観構成図である。
【図２】前記感知装置を構成する感知センサーの斜視図である
【図３】前記感知センサーの縦断側面図である。
【図４】前記感知センサーを構成する水晶振動子の斜視図である。
【図５】前記水晶振動子の側面の模式図である。
【図６】前記感知装置の構成を示すブロック図である。
【図７】水晶振動子表面へのビオチン結合ＢＳＡの吸着を示す模式図である。
【図８】前記吸着による周波数変化を示すグラフ図である。
【図９】水晶振動子表面へのビオチン結合ＢＳＡの吸着を示す模式図である。
【図１０】前記吸着による周波数変化を示すグラフ図である。
【図１１】検量線の一例を示すグラフ図である。
【図１２】測定手順を示す説明図である。
【図１３】水晶振動子表面の変化を示す模式図である。
【図１４】水晶振動子表面の変化を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（第１の実施形態）
以下、本発明の感知方法を実施するための感知装置１について説明する。この感知装置１は、例えば低分子物質であるビオチン（分子量２４４）を感知対象物として、その定量を行う。図１の外観構成図に示すように、感知装置１は発振回路ユニット１１と演算装置１２とを備えており、発振回路ユニット１１はケーブル１３を介して演算装置１２に着脱自在に接続されている。演算装置１２の筐体１４前面に設けられた表示部１５は、例えばＬＥＤ表示画面や液晶表示画面により構成され、周波数あるいは周波数の変化分等の測定結果を表示する。
【００１４】
発振回路ユニット１１には、感知センサー２が着脱自在に接続される。図２には感知センサー２の斜視図を、図３には感知センサー２の縦断側面図を夫々示している。感知センサー２は、一端側が接続端子２１ａ、２１ｂ、２１ｃをなす基板２２に設けられた孔２３を塞ぐように後述の水晶片３１を設け、基板２２の裏面側からシート２４により前記孔２３を塞ぎ、基板２２の表面側にてシート２５、上蓋ケース２６を下からこの順に積層した構成となっている。当該構成により水晶片３１の下面側に気密空間２７が形成されてランジュバン型の感知センサー２が構成される。また、シート２４にその周縁部が押圧され、水晶片３１が基板２１に固定される。上蓋ケース２６には試料液の注入口２８と試料液の観察口２９とが設けられており、注入口２８から試料液を注入することによって、シート２５に設けられた貫通孔により形成された水晶片３１の上面側の貯留空間２０に試料液が満たされる。
【００１５】
その表面、裏面を夫々示した図４（ａ）、（ｂ）を参照して水晶片３１について説明する。水晶片３１は、互いに独立して振動する第１の水晶振動子３Ａ及び第２の水晶振動子３Ｂを構成している。水晶片３１は例えば円形に構成され、その直径に沿って形成された溝３２により、これら第１の水晶振動子３Ａ、第２の水晶振動子３Ｂが仕切られている。第１の水晶振動子３Ａの上面、第２の水晶振動子３Ｂの上面には夫々励振電極３３ａ、３３ｂが設けられている。励振電極３３ａ、３３ｂから夫々水晶片３１の側面を介して裏面に向かって電極３４ａ、３４ｂが引き出されている。第１の水晶振動子３Ａ、第２の水晶振動子３Ｂの発振周波数を互いに若干ずらすために励振電極３３ａ，３３ｂは厚さが互いに異なるように形成されている。
【００１６】
また、水晶片３１の下面には励振電極３３ａ、３３ｂに対向する励振電極３３ｃが設けられており、励振電極３３ｃから水晶片３１の縁部に向かって電極３４ｃが引き出されている。電極３４ａ、３４ｂ、３４ｃを介して励振電極３３ａ、３３ｂ、３３ｃが、基板２２の接続端子２１ａ、２１ｂ、２１ｃに電気的に接続されている。各電極の表面は例えば金により構成される。
【００１７】
図５（ａ）、（ｂ）は夫々第１の水晶振動子３Ａの側面、第２の水晶振動子３Ｂの側面を模式的に示している。第１の水晶振動子３Ａの励振電極３３ａの表面には、吸着膜４１が形成されている。この吸着膜４１の表面はストレプトアビジン（ＳＡ）４０からなり、ストレプトアビジン４０は感知対象物であるビオチン及び後述するビオチン結合ＢＳＡと結合する。
【００１８】
第２の水晶振動子３Ｂの励振電極３３ｂの表面には、官能膜４２が形成されている。この官能膜４２の表面はアミノ基（ＮＨ２基）４３により構成されている。このアミノ基４３は、後にＢＳＡでブロッキングを行うためビオチン及びビオチン結合ＢＳＡに結合できない。ビオチン結合ＢＳＡの分子量は、ビオチンの分子量のおよそ２７０倍である。
【００１９】
図６は感知装置１のブロック図であり、この図６を参照しながら感知装置１を構成する発振回路ユニット１１について説明する。発振回路ユニット１１には第１の発振回路５１ａ及び第２の発振回路５１ｂが設けられており、第１の発振回路５２ａは第１の水晶振動子３Ａを、第２の発振回路５２ｂが第２の水晶振動子３Ｂを夫々発振させる。
【００２０】
続いて感知装置１を構成する演算装置１２の構成について説明する。前記発振回路５１ａ、５１ｂの後段にはスイッチ部５２が設けられており、このスイッチ部５２によって２つの発振回路５１ａ、５１ｂからの周波数信号を時分割して後段に取り込み、各振動領域の発振周波数を並行して求めることができる。第１の発振回路５１ａからの出力をチャンネル１（Ｆ１）、第２の発振回路５１ｂからの出力をチャンネル２（Ｆ２）とすると、例えば１秒間をｎ分割（ｎは偶数）し、各チャンネルの発振周波数を１／ｎ秒の処理で順次求めることにより、１秒間に少なくとも１回以上周波数を取得しているため、実質同時に各チャンネルの周波数を取得することができる。
【００２１】
スイッチ部５２の後段には測定回路部５３が設けられている。測定回路部５３は入力信号である周波数信号をディジタル処理して、各チャンネルの発振周波数を測定する。また、演算装置１３はデータバス６１を備えており、データバス６１にはＣＰＵ６２、データ処理プログラム６３を格納した記憶手段、既述の測定回路部５３及び既述の表示部１５が接続されている。
【００２２】
データ処理プログラム６３は、測定回路部５４から出力される信号に基づいて第１の発振回路５１ａの発振周波数「Ｆ１」の時系列データ及び第２の発振回路５２ａの発振周波数「Ｆ２」の時系列データを取得し、メモリ６４に格納する。またこのデータ取得動作と同時に、同一の時間帯におけるチャンネル１から取得した発振周波数Ｆ１、チャンネル２から取得した発振周波数Ｆ２の各時系列データの差分「Ｆ１−Ｆ２」を夫々演算し、当該差分データの時系列データを取得してメモリ６４に格納すると共に、この「Ｆ１−Ｆ２」の経時変化のグラフを表示部１５に表示する。
【００２３】
感知装置１を用いて、試料液中のビオチンの定量を行う工程について説明する。先ず、例えば発振回路ユニット１１から分離した状態にある感知センサー２の第１の水晶振動子３Ａ及び第２の水晶振動子３Ｂの表面に上述のようにアミノ基４３を有する吸着阻害膜４２を形成する。続いて、ストレプトアビジンをＮＨＳ／ＥＤＣ溶液で希釈して当該ストレプトアビジンのカルボキシル基を活性エステル化する。そして、この溶液を第１の水晶振動子３Ａに滴下し、アミノ基４３にストレプトアビジン４０を結合させ、第１の水晶振動子３Ａの官能膜４２を吸着膜４１にする。その後、発振回路ユニット１１に感知センサー２を装着し、注入口２８からＢＳＡを含む試薬を供給する。これによって、ＢＳＡが第２の水晶振動子３Ｂの官能膜４２のアミノ基４３に結合し、当該アミノ基４３がブロッキングされる。また第１の水晶振動子３Ａにおいて、ストレプトアビジン４０が吸着せずに残留したアミノ基４３（不図示）も、このＢＳＡに結合してブロッキングされる。
【００２４】
感知装置１の電源をオンにすると各水晶振動子３Ａ、３Ｂが発振し、夫々の周波数に対応する周波数信号Ｆ１、Ｆ２が取り出される。そして、これら周波数信号は時分割されて、測定回路部５４に取り込まれ、Ａ／Ｄ変換された後、各ディジタル値が信号処理される。そして２つのチャンネルの周波数信号から、前記周波数「Ｆ１、Ｆ２」が取り出されてメモリ６４に記憶され、さらに記憶された「Ｆ１、Ｆ２」に基づいて「Ｆ１−Ｆ２」が演算されてメモリ６４に記憶される動作が継続される。また、表示部１６に既述のグラフが表示され、周波数差「Ｆ１−Ｆ２」の変化がリアルタイムで表示される。具体的な発振周波数としては、例えばＦ１が３０．８３４ＭＨｚ、Ｆ２が３０．９３４ＭＨｚである。
【００２５】
次いで、ユーザは、ビオチンの濃度が不明である所定の量の検査液と、ビオチン結合ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を例えば１０μｇ／ｍＬ含んだ所定の量の試薬とを混合し、試料液を調製する。なお、試料液にはビオチンを溶解させるために、例えば１体積％のＤＭＳＯが含まれている。このように調製した試料液を感知センサー２の注入口２８に注入し、水晶振動子３Ａ、３Ｂの表面に試料液が供給されて、質量付加効果により水晶振動子３Ａ，３Ｂの発振周波数が低下する。
【００２６】
試料液に含まれるビオチン７１及びビオチン結合ＢＳＡ７２は、ともに水晶振動子３Ａの吸着膜４１を構成するストレプトアビジン４０に結合する性質を有するため、ビオチン７１とビオチン結合ＢＳＡ７２とが、ストレプトアビジン４０への結合をめぐって競合する。その結果、試料液中のビオチン７１の濃度に応じた割合で、ビオチン結合ＢＳＡ７２とビオチン７１とが吸着膜４１に吸着される。そして、吸着されたビオチン結合ＢＳＡ７２とビオチン７１との割合に応じて、質量付加効果によりチャンネル１の周波数Ｆ１がさらに低下し、Ｆ１−Ｆ２の値が変化する。つまり、試料液供給前後のＦ１−Ｆ２の変化量をΔＦとすると、このΔＦは試料液中のビオチン７１の濃度に対応する。
【００２７】
具体的に試料液中のビオチン７１が比較的多い場合は、図７（ａ）、（ｂ）に示すように比較的多くのビオチン７１が吸着膜４１に吸着され、ビオチン結合ＢＳＡ７２の吸着が抑えられる。上記のようにビオチン結合ＢＳＡ７２の分子量はビオチン７１の分子量より大きいため、図８に示すように周波数差Ｆ１−Ｆ２の変化量ΔＦは比較的小さくなる。なお、グラフ中の時刻ｔ１は試料液を感知センサー２に注入した時刻である。
【００２８】
試料液中のビオチン７１が比較的少ない場合は、図９（ａ）、（ｂ）に示すようにビオチン７１の吸着膜４１への吸着が抑えられ、代わってビオチン結合ＢＳＡ７２が多く吸着される。従って、図１０に示すように周波数差Ｆ１−Ｆ２の変化量ΔＦは比較的大きくなる。
【００２９】
試料液注入後所定の時間が経過すると、ユーザは表示部１５に表示されるグラフから前記変化量ΔＦを読み出す。そして、ビオチンを含まない他は前記試料液と同様に調製され、予め当該試料液と同様に測定された参照液の周波数変化ΔＦをΔＦ０とすると、読み出した試料液のΔＦ及び参照液のΔＦ０からΔＦ／ΔＦ０＝Ｐを演算し、このＰをロジット変換する。つまり、ｌｎ（Ｐ／１−Ｐ）を演算する。図１１は、予め作成しておいた検量線であり、縦軸がｌｎ（Ｐ／１−Ｐ）、横軸がビオチンの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を夫々示している。この検量線から、演算したｌｎ（Ｐ／１−Ｐ）に対応するビオチンの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を読み出し、この読み出した濃度を試料液中のビオチンの濃度として決定する。
【００３０】
図１１の検量線の作成方法について説明する。既述した試料液中のビオチンの濃度を測定する場合と同様に、水晶振動子３Ａ、３Ｂの表面に夫々吸着膜４１、吸着阻害膜４２を形成し、ＢＳＡを供給してブロッキングを行い、各水晶振動子３Ａ、３Ｂを発振させた後、用意した検量線作成用の試料液を供給して、既述のようにΔＦを計測する。この作業を複数の検量線作成用の試料液に対して行う。これらの検量線作成用の試料液は、上記のようにビオチン結合ＢＳＡを１０μｇ／ｍＬ含む試薬に検査液を混合して調製するが、検査液に含まれるビオチンの濃度は既知であると共に互いに異なり、例えば０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬである。また、検量線作成用の試料液のＤＭＳＯの濃度は、ビオチンの濃度測定用の試料液と同じく１体積％である。
【００３１】
ビオチンの濃度が０ｎｇ／ｍＬである検査液から調製した試料液を測定して得られたΔＦは、既述のΔＦ０である。その他の濃度のビオチンを含む検査液から調製した試料液から得たΔＦについては、既述のようにΔＦ０を用いて、上記のようにｌｎ（Ｐ／１−Ｐ）を演算し、演算値をグラフにプロットする。このプロットから図１１の検量線を作成する。
【００３２】
この第１の実施形態によれば、試料液中のビオチンの濃度が小さいほど、試料液中のビオチン結合ＢＳＡが第１の水晶振動子３Ａに吸着され、ビオチンとビオチン結合ＢＳＡの吸着による周波数変化に基づいてビオチンの濃度が測定される。ビオチンに比べてビオチン結合ＢＳＡは分子量が大きいため、試料液中のビオチンの濃度が小さくても第１の水晶振動子３Ａの発振周波数を大きく変化させることができるので測定感度が高くなり、従ってビオチンの定量を正確に測定することができる。また、このように周波数の測定により定量を行うため、ビオチンを複数段階に渡って化学反応させる必要が無いし、クロマトグラフィー分析のようにカラムを通過させて試料液からビオチンを分離する必要が無いので、定量を簡便に行うことができる。
【００３３】
また、上記の例ではビオチン結合ＢＳＡをビオチンと競合させて吸着膜４１と結合させているが、競合させる物質としてはビオチン結合ＢＳＡに限られない。例えばビオチンにＢＳＡよりも分子量が大きい金コロイドなどを結合させ、このビオチン結合金コロイドをビオチンに競合させることで、さらに感知装置１の感度を高め、より正確にビオチンの定量を行うことができる。また、上記の例では周波数差Ｆ１−Ｆ２に基づいて濃度の測定を行っているため、精度高く測定を行うことができる。なお、このようにＦ１とＦ２の差分を求める代わりに、予め試料液の水圧による周波数変化量を予測しておき、その予測した変化量と得られた周波数Ｆ１との差分を求めて、その差分に基づいて前記濃度の測定を行ってもよい。
【００３４】
上記の手法で、例えば抗生物質や抗菌剤などの比較的低い分子量を持った化合物についても検出や定量を行うことができる。具体的には、ビオチン以外にも例えばストレプトマイシンを同様の方法で検出したり、その濃度を測定することができる。この場合、競合させる物質としては例えばストレプトマイシン結合ＢＳＡが用いられる。また、吸着膜４１としては例えば抗ストレプトマイシン抗体が用いられる。また、その他にもアンピシリンを同様の方法で検出したり、その濃度を測定することができる。この場合、競合させる物質としては例えばアンピシリン結合ＢＳＡが用いられる。また、吸着膜４１としては例えば抗アンピシリン抗体が用いられる。
【００３５】
なお、感知対象物及び感知対象物に競合する競合物質がＳＨ基を持つ場合には、これら感知対象物及び競合物質は、当該ＳＨ基により表面が金からなる励振電極３３Ａに吸着することができ、この励振電極３３Ａに対して競合するので吸着膜４１を設けなくてよい。
【００３６】
（第２の実施形態）
試料液中のビオチンの定量を行う第２の実施形態について、第１の実施形態との差異点を中心に説明する。この第２の実施形態の感知装置１では、第１の水晶振動子３Ａの吸着膜４１をビオチンにより構成する。
【００３７】
続いて、検量線の作成方法を説明する。０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬのビオチンが夫々含まれた検査液８１が注入された各チューブ８０に、所定の濃度のストレプトアビジン４０を含む試薬８２を所定の量添加し、試料液を作成する（図１２）。このように検査液８１と試薬８２とが混合されて構成される各試料液中では、ストレプトアビジン４０がビオチン７１に結合する。従って、検査液８１におけるビオチン７１の濃度が低いほど、試料液中では当該ビオチン７１に結合せずに遊離しているストレプトアビジン４０の量が多くなる。
【００３８】
そして、第１の実施形態と同様に各試料液を感知センサー２に供給して、順次試料液の供給前後の周波数Ｆ１−Ｆ２の変化量ΔＦを計測する。このときチューブ８０内でビオチン７１に結合したストレプトアビジン４０は吸着膜４１を構成するビオチン７１に結合しない。従って、図１３（ａ）（ｂ）に示すように、試料液中において遊離しているストレプトアビジン４０が多いほど、多くのストレプトアビジン４０が吸着膜４１を構成するビオチン７１に吸着されるため、ΔＦが大きくなる。
【００３９】
逆に、図１４（ａ）（ｂ）に示すように試料液中において、遊離しているストレプトアビジン４０が少ないほど、吸着膜４１を構成するビオチン７１に吸着されるストレプトアビジン４０が少ないためΔＦが小さくなる。つまり、ΔＦは遊離しているストレプトアビジン４０の濃度に対応する。遊離しているストレプトアビジン４０の濃度は、試料液中のビオチン７１の濃度に対応するため、ΔＦは試料液中のビオチン７１の濃度に対応する。
【００４０】
第１の実施形態と同様に、各試料液について測定したΔＦから検量線を作成する。検量線作成後、ビオチンの濃度が不明な検査液８１から検量線を作成する場合と同様に試料液を調整し、ΔＦを測定する。そしてこのΔＦと既に作成した検量線とから試料液中のビオチンの濃度を特定する。ストレプトアビジンは、ビオチンよりも分子量が大きく、この第２の実施形態においては試料液中のビオチンの濃度が小さいほど、吸着膜４１に吸着されるストレプトアビジンが多くなるため、周波数変化ΔＦを大きくとることができる。従って、この第２の実施形態も第１の実施形態と同様の効果を有する。
【００４１】
この第２の実施形態の手法で、例えば抗生物質や抗菌剤などの低い分子量を持った化合物についても検出や定量を行うことができる。具体的には、ビオチン以外にも例えばストレプトマイシンを同様の方法で検出したり、その濃度を測定することができる。この場合、試料液中に添加すると共に吸着膜４１に吸着させる物質としては例えば抗ストレプトマイシン抗体が用いられる。また、吸着膜４１は例えばストレプトマイシンにより構成される。また、その他にもアンピシリンを同様の方法で検出したり、その濃度を測定することができる。この場合、試料液中に添加する共に吸着膜４１に吸着させる物質としては例えば抗アンピシリン抗体が用いられる。また、吸着膜４１は例えばアンピシリンにより構成される。
【符号の説明】
【００４２】
１ 感知装置
２ 感知センサー
３Ａ 水晶振動子
３Ｂ 水晶振動子
３１ 水晶片
３３ａ 励振電極
３３ｂ 励振電極
４１ 吸着膜
４２ 吸着阻害膜
５１ａ 発振回路
５１ｂ 発振回路
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その表面に感知対象物が吸着する圧電振動子を発振させる工程と、
前記感知対象物と競合して前記圧電振動子の表面に吸着し、感知対象物よりもその分子量が大きい競合物質を含んだ試料液を、当該圧電振動子の表面に供給する工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、
を備えることを特徴とする感知方法。
【請求項２】
圧電振動子を発振させる工程と、
感知対象物よりもその分子量が大きく、感知対象物と結合することにより保有する前記圧電振動子の表面への吸着性が失われる結合物質を含む試料液を圧電振動子の表面に供給し、前記感知対象物に結合していない結合物質を当該圧電振動子の表面に吸着させる工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、
を備えることを特徴とする感知方法。
【請求項３】
前記感知対象物の検出を行う工程は、
予め設定された試料液の供給前後における圧電振動子の固有振動数と試料液中に含まれる感知対象物の濃度との対応関係に基づいて、感知対象物の濃度を特定する工程を含むことを特徴とする請求項１または２記載の感知方法。
【請求項４】
その表面に感知対象物が吸着しない参照用の圧電振動子を発振させる工程と、
前記試料液を当該参照用の圧電振動子の表面に供給する工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記参照用の圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された前記各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、
を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一つに記載の感知方法。
【請求項１】
その表面に感知対象物が吸着する圧電振動子を発振させる工程と、
前記感知対象物と競合して前記圧電振動子の表面に吸着し、感知対象物よりもその分子量が大きい競合物質を含んだ試料液を、当該圧電振動子の表面に供給する工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、
を備えることを特徴とする感知方法。
【請求項２】
圧電振動子を発振させる工程と、
感知対象物よりもその分子量が大きく、感知対象物と結合することにより保有する前記圧電振動子の表面への吸着性が失われる結合物質を含む試料液を圧電振動子の表面に供給し、前記感知対象物に結合していない結合物質を当該圧電振動子の表面に吸着させる工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、
を備えることを特徴とする感知方法。
【請求項３】
前記感知対象物の検出を行う工程は、
予め設定された試料液の供給前後における圧電振動子の固有振動数と試料液中に含まれる感知対象物の濃度との対応関係に基づいて、感知対象物の濃度を特定する工程を含むことを特徴とする請求項１または２記載の感知方法。
【請求項４】
その表面に感知対象物が吸着しない参照用の圧電振動子を発振させる工程と、
前記試料液を当該参照用の圧電振動子の表面に供給する工程と、
前記試料液がその表面に供給される前後の前記参照用の圧電振動子の固有振動数を夫々測定する工程と、
測定された前記各固有振動数に基づいて、前記試料液中の感知対象物の検出を行う工程と、
を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一つに記載の感知方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−１６３４７２（Ｐ２０１２−１６３４７２Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４８２８（Ｐ２０１１−２４８２８）
【出願日】平成２３年２月８日（２０１１．２．８）
【出願人】（０００２３２４８３）日本電波工業株式会社 (1,148)
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月８日（２０１１．２．８）
【出願人】（０００２３２４８３）日本電波工業株式会社 (1,148)
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