抗がん剤の効果的な治療方法を選択するための診断試薬
【課題】抗癌剤による治療が有効である癌を特定し得る手段等を提供すること。
【解決手段】ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬；ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質、およびＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断キット；（ａ）被験体由来の生体サンプル中のＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程、および（ｂ）測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度と、肺癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の試験方法。
【解決手段】ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬；ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質、およびＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断キット；（ａ）被験体由来の生体サンプル中のＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程、および（ｂ）測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度と、肺癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん剤の効果的な治療方法を選択するための診断試薬などに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌の治療においては、活性型変異ＥＧＦＲを有する非小細胞性肺癌に対してＥＧＦＲに対する特異的な阻害剤が優れた治療効果を示すことが報告されている。このような肺癌はＥＧＦＲに依存して増殖する性質を有しており、このことがＥＧＦＲ阻害剤による治療奏効性の根底にある。
しかしながら、活性型変異ＥＧＦＲを発現しないにも関わらずＥＧＦＲ阻害剤による治療が有効である症例も報告されている。このようにＥＧＦＲ阻害剤による治療が有効である癌としては活性型変異ＥＧＦＲを有する癌以外にも存在するものと考えられるが、そのような癌を特定する手段（例、バイオマーカー）は報告されていない。
【０００３】
なお、肺癌の治療では、上記活性型変異ＥＧＦＲに加えて、遺伝子増幅ＭＥＴ、融合遺伝子ＥＭＬ４−ＡＬＫというキナーゼ由来遺伝子が明確な治療標的として同定されており、それらの治療薬が肺癌の治療に応用されており、あるいは、臨床試験において有効性が示されている。しかしながら、それら以外のキナーゼについて明確な治療標的となることは証明されていない。
【０００４】
上記に関連して、以下の先行技術が報告されている。
非特許文献１は、変異ＥＧＦＲを示さない肺扁平上皮癌に対してＥＧＦＲ阻害剤（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）が有効となる症例があることを開示している。
非特許文献２は、ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２の別称）が乳癌患者の血清および腫瘍中に見出されたことを開示している。
非特許文献３は、ｐ１８５／ｎｅｕ（ＨＥＲ２の別称）の細胞外ドメインがヒト乳癌細胞株の表面から放出されることを開示している。
非特許文献４は、乳癌においてＨＥＲ２細胞外ドメインの分泌及び血清循環が見出されたこと、ならびにこのような分泌および血清循環の測定により、抗ＨＥＲ２抗体（ハーセプチン）による治療が有効であるＨＥＲ２陽性乳癌の診断及びその治療効果を追跡し得ることを開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｌａｒｋ ＧＭ， Ｃａｍｅｒｏｎ Ｔ， Ｄａｓ Ｇｕｐｔａ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ ｉｎ ｍａｌｅ ｓｍｏｋｅｒｓ ｉｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ＮＳＣＬＣ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００６；２４：７１６６．
【非特許文献２】Ｂｒｅｕｅｒ，Ｂ．，ＤｅＶｉｖｏ，Ｉ．，Ｌｕｏ，Ｊ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． ｅｒｂＢ−２ ａｎｄ ｍｙｃ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｓｅｒａ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋ．Ｐｒｅｖ．，３：６３−６６， １９９４．
【非特許文献３】Ｚａｂｒｅｃｋｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｌａｍ，Ｔ．，ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐ１８５／ｎｅｕ ｉｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ，ＳＫ−ＢＲ−３． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１７１６−１７２０，１９９１．
【非特許文献４】Ｋoｓｔｌｅｒ ＷＪ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｓｅｒｕｍ Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｏ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ｂａｓｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；１０：１６１８−２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、活性型変異ＥＧＦＲを発現しないにも関わらずＥＧＦＲ阻害剤による治療が有効である症例が報告されており、また、ＥＧＦＲ阻害剤による治療が有効である癌としては活性型変異ＥＧＦＲを有する癌以外にも存在するものと考えられる。しかしながら、ＥＧＦＲ阻害剤による治療が有効である上述したような癌を特定する手段は報告されていない。また、肺癌においてＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントが生体サンプル中に検出されることは報告されていない。
【０００７】
本発明の目的は、ＥＧＦＲ阻害剤等の抗癌剤による治療が有効である肺癌を特定し得る手段等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討したところ、肺癌においてＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントが生体サンプル中に検出されることを見出した。本発明者らはまた、活性型変異ＥＧＦＲを有さないにも関わらずＥＧＦＲ阻害剤に感受性を示す癌細胞におけるＥＧＦＲ及び他のキナーゼ因子の活性状態を鋭意解析したところ、本癌細胞がＥＧＦＲに依存せずに別のＨＥＲ２というキナーゼに依存して増殖することなどを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定することにより、肺癌に対する抗癌剤の治療効果を簡便に判定し得ることなどを着想し、本願発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬。
〔２〕ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対する抗体である、〔１〕の診断試薬。
〔３〕肺癌が血中ＨＥＲ２陽性の肺癌である、〔１〕または〔２〕の診断試薬。
〔４〕抗癌剤がＥＧＦＲ阻害剤である、〔１〕〜〔３〕のいずれかの診断試薬。
〔５〕肺癌が非小細胞肺癌である、〔１〕〜〔４〕のいずれかの診断試薬。
〔６〕肺癌が肺扁平上皮癌である、〔１〕〜〔５〕のいずれかの診断試薬。
〔７〕ＥＧＦＲ阻害剤が下記式（１）：
【化１】
で表される基本構造を有する化合物またはその塩である、〔４〕の診断試薬。
〔８〕ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質、およびＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断キット。
〔９〕以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の試験方法：
（ａ）被験体由来の生体サンプル中のＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程；および
（ｂ）測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度と、肺癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体サンプル（例、血液）中における可溶性ＨＥＲ２の測定により、肺癌に対する抗癌剤の効果を診断でき、また、生体サンプル中における可溶性ＨＥＲ２の測定により、肺癌に罹患した被験体を診断できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）に対する種々のヒト肺癌細胞株の感受性を示す図である（ｎ＝４）。ＰＣ−９：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ８２７：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ４００６：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；Ｈ２１７０：ヒト非小細胞肺癌（肺扁平上皮癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；およびＨ１７０３：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株。
【図２】図２は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の発現および活性化状態の解析を示す図である。Ａ５４９：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；ＰＣ−９：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；Ｈ４６０：ヒト非小細胞肺癌（肺大細胞癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；Ｈ１６５０：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有し、ＰＴＥＮ遺伝子を欠損する細胞株；Ｈ１７０３：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；Ｈ１９７５：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ阻害剤に耐性となる二次的耐性変異をＥＧＦＲ中に有する細胞株；Ｈ１９９３：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；Ｈ２１７０：ヒト非小細胞肺癌（肺扁平上皮癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；ＨＣＣ８２７：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ４００６：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株。ウェスタンブロッティングは、以下の抗体を用いた：ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ細胞内ドメインを認識する抗体）；ＨＥＲ２（ＨＥＲ２細胞内ドメインを認識する抗体）；ｐ−Ｔｙｒ（抗リン酸化チロシン抗体）およびβ−アクチン（コントロール）。
【図３】図３は、ＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）によるＨＥＲ２の活性阻害を示す図である。ＮＣＩ−Ｈ２１７０：ヒト非小細胞肺癌（肺扁平上皮癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株。ウェスタンブロッティングは、以下の抗体を用いた：ｐＹ（抗リン酸化チロシン抗体）；ＨＥＲ２（ＨＥＲ２細胞内ドメインを認識する抗体）。
【図４】図４は、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡまたはＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡ処理されたヒト肺癌細胞株におけるＥＧＦＲまたはＨＥＲ２の発現を示す図である。ＮＣＩ−Ｈ２１７０：ヒト非小細胞肺癌（肺扁平上皮癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；ＨＣＣ４００６：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ８２７：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株。ウェスタンブロッティングは、以下の抗体を用いた：ＨＥＲ２（ＨＥＲ２細胞内ドメインを認識する抗体）；およびＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ細胞内ドメインを認識する抗体）。
【図５】図５は、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡまたはＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡ処理されたヒト肺癌細胞株の増殖を示す図である（ｎ＝４）。用いた細胞株は、図４と同じである。４種のｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＧＦＲ−１、ｓｉ−ＥＧＦＲ−２、ｓｉ−ＨＥＲ２−１、ｓｉ−ＨＥＲ２−２）を用いた。Ｎ．Ｃ．（Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ ｓｉＲＮＡ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）
【図６】図６は、ヒト肺癌細胞株におけるＨＥＲ２のリン酸化とＥＧＦＲ発現との関係を示す図である。用いた抗体の詳細は、図２と同じである。
【図７】図７は、ヒト肺癌細胞株における分泌ＨＥＲ２のウェスタンブロットによる検出を示す図である。用いた細胞株の詳細は、上述したとおりである。ウェスタンブロットで用いた抗ＨＥＲ２抗体は、分泌ＨＥＲ２（即ち、ＨＥＲ２細胞外ドメイン）を認識する。
【図８】図８は、癌組織が形成されたマウスの血清中における可溶性ＨＥＲ２のＥＬＩＳＡキットによる検出を示す図である（ｎ＝２）。用いた細胞株の詳細は、上述したとおりである。ＥＬＩＳＡキットに添付された抗ＨＥＲ２抗体は、可溶性ＨＥＲ２（即ち、ＨＥＲ２細胞外ドメイン）を認識する。
【図９】図９は、ＥＧＦＲ阻害剤（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）に対する種々のヒト肺癌細胞株の感受性を示す図である（ｎ＝４）。ＰＣ−９：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ８２７：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ４００６：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；Ｈ２１７０：ヒト非小細胞肺癌（肺扁平上皮癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；およびＨ１７０３：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株。
【図１０】図１０は、ＥＧＦＲ阻害剤（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）に対する種々のヒト肺癌細胞株の感受性を示す図である（ｎ＝４）。細胞の詳細は、図９と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、癌に対する抗癌剤の効果の試験方法を提供する。本発明の試験方法は、診断方法または予測方法であってもよい。
【００１３】
本発明の試験方法は、以下（ａ）および（ｂ）の工程を含み得る：
（ａ）被験体由来の生体サンプル中のＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程；および
（ｂ）測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程。
【００１４】
ＨＥＲ２は、上皮成長因子（EGFR）と同じファミリーに属す受容体型チロシンキナーゼである。細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインが一本鎖で連結した構造を有する（例えば、Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，Ｖｏｌ．２３０，Ｎｏ．４７３０，ｐｐ．１１３２−１１３９を参照）。ＨＥＲ２の配列については、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１００５８６２．１を参照のこと。
【００１５】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメント」とは、癌細胞の表面より分泌されるＨＥＲ２細胞外ドメインのポリペプチドまたはそのポリペプチドの分解産物をいう。本明細書では、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを、分泌ＨＥＲ２または可溶性ＨＥＲ２ということがある。
【００１６】
上記（ａ）において、被験体としては、癌に罹患している哺乳動物、または癌に罹患している可能性がある哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類、愛玩動物、使役動物が挙げられる。具体的には、哺乳動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、マウス、ラットが挙げられるが、好ましくは、ヒトである。
【００１７】
癌としては、例えば、肺癌（例、扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌等の非小細胞癌、ならびに小細胞癌）、消化器系癌（例、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、肉腫、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、固形癌、上皮性癌、中皮腫が挙げられる。
【００１８】
癌は、ＨＥＲ２依存性の癌であってもよい。本明細書中で用いられる場合、細胞の増殖についての用語「依存」とは、細胞が特定の癌遺伝子に増殖を依拠している、癌遺伝子異存（ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）または依存（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）の状態をいう。ＨＥＲ２依存性の癌は、ＨＥＲ２発現を亢進し得る。したがって、癌がＨＥＲ２依存性であるかどうかは、ＨＥＲ２発現を測定することにより調べることができる。また、特定の癌遺伝子への依存性（即ち、特定の癌遺伝子に増殖を依拠しているか否か）は、特定の癌遺伝子の阻害剤で細胞を処理し、次いで、処理された細胞の増殖能を評価することにより、確認できる。増殖能は、例えば、ＭＴＴアッセイ、ＭＴＳアッセイにより評価できる。また、特定の癌遺伝子に対して癌遺伝子依存の細胞を、当該癌遺伝子の阻害剤で処理すると、アポトーシスによる細胞死が誘導され得ることが知られている。したがって、特定の癌遺伝子への依存性は、例えば、当該癌遺伝子の阻害によりアポトーシスが誘導され得るか否かを評価することにより、確認してもよい。アポトーシス誘導は、例えば、ＴＵＮＥＬアッセイ、活性型カスパーゼの検出、ＡＮＮＥＸＩＮ Ｖの検出により評価できる。
【００１９】
ＨＥＲ２依存性の癌では、ＨＥＲ２発現が亢進され得るので、生体サンプル中に分泌されるＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの量（ＨＥＲ２発現量と相関し得る）も増加し得る。したがって、ＨＥＲ２依存性の癌は、通常、生体サンプル中においてＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントが検出される（例、血中ＨＥＲ２陽性）。
【００２０】
好ましい被験体の例は、特定の抗癌剤による治療が検討されている癌患者である。特定の抗癌剤としては、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤が挙げられる。これらの阻害剤としては、例えば、低分子有機化合物、抗体が挙げられる。
【００２１】
ＥＧＦＲ阻害剤としては、例えば、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ＺＤ６４７４、ＣＬ−３８７７８５、ＨＫＩ−２７２、ＸＬ６４７、ＰＤ１５３０３５、ＣＩ−１０３３、ＡＥＥ７８８、ＢＩＢＷ−２９９２、ＥＫＢ−５６９、ＰＦ−２９９８０４が挙げられる。
【００２２】
ＥＧＦＲ阻害剤はまた、例えば、下記式（１）：
【００２３】
【化２】
【００２４】
で表される基本構造を有する化合物またはその塩であってもよい。上記式（１）で表される基本構造は、低分子有機化合物のＥＧＦＲ阻害剤に共通し得る構造として知られている。上記式（１）で表される基本構造を有する化合物またはその塩は、上記式（１）で表される基本構造が１〜５個（例、１個、２個、３個）の所定の置換基で置換された化合物またはその塩である。上記式（１）で表される基本構造を有する化合物またはその塩は、水和物であってもよく、水和物および非水和物のいずれも本発明の範囲に包含されるものである。塩としては、金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩）、アンモニウム塩等の無機塩、ならびに有機塩（例、アルキルアンモニウム）等の各種塩が挙げられる。
【００２５】
上記式（１）で表される基本構造を有する化合物または塩の参考のため、ゲフィチニブ、ラパチニブ、エルロチニブの構造を下記に示す。
【００２６】
【化３】
【００２７】
【化４】
【００２８】
【化５】
【００２９】
ＨＥＲ２阻害剤としては、例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツヅマブ、ＥＧＦＲとＨＥＲ２の両方を阻害するラパチニブ、ＢＩＢＷ２９９２が挙げられる。ＨＥＲ２阻害剤としてはまた、低分子有機化合物の医薬であるＥＧＦＲ阻害剤が挙げられる。本発明者らは、このようなＥＧＦＲ阻害剤がＨＥＲ２阻害剤としても作用することを見出している（後述する実施例を参照）。
【００３０】
ｃ−ＭＥＴ阻害剤としては、例えば、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＸＬ−８８０、ＸＬ−１８４、ＡＲＱ １９７、ＡＭＧ２０８、ＡＭＧ４５８、ＣＥ−３５５６２１、ＭＰ４７０が挙げられる。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＴＡＥ６８４、ＰＦ−２３４１０６６が挙げられる。ＰＤＧＦＲ阻害剤としては、例えば、グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、デサチニブ（Ｄｅｓａｔｉｎｉｂ）、ヴァラチニブ（Ｖａｌａｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）が挙げられる。ｃ−ＫＩＴ阻害剤としては、例えば、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ヴァラチニブ（Ｖａｌａｔｉｎｉｂ）、デサチニブ（Ｄｅｓａｔｉｎｉｂ）、マシチニブ（Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ）、モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）が挙げられる。
【００３１】
好ましい被験体の別の例は、特定の抗癌剤による治療効果がモニタリングされている癌患者である。癌患者はまた、特定の抗癌剤による治療効果の低下が認められた場合に、別の抗癌剤による治療に切り替えるかどうかの判断が求められている患者であってもよい。抗癌剤は、上述した抗癌剤と同様であり得る。
【００３２】
本発明において用いられ得る生体サンプルは、上述の被験体から採取された生体サンプルであり得る。生体サンプルは、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントが存在するサンプルである限り特に限定されず、例えば、血液、血清、尿、唾液、腹水、組織試料、細胞試料、組織抽出液、細胞抽出液が挙げられる。なお、侵襲性の低さの観点からは、上記のうち、血液、尿、唾液が好ましい。必要に応じて、生体サンプルは、測定前に、事前に処理されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、濃縮、分画、細胞固定、組織固定、組織凍結、組織薄片化が挙げられる。
【００３３】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度の測定は、例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対して親和性を有する物質（後述）を用いて行うことができる。測定はまた、免疫学的手法により行なわれてもよい。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法が挙げられる。ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度の測定を可能とする上記以外の方法としては、例えば、ＬＣ−ＭＳが挙げられる。
【００３４】
上記（ｂ）において、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較され得る。基準は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度の高低と、抗癌剤の効果の強弱（抗癌剤への感受性または耐性）との間の相対的な関係を示すものであり得る。例えば、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い場合には、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）の治療効果が高い可能性があり、または他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）の治療効果が低い可能性がある。また、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い場合には、ＥＧＦＲ阻害剤またはＨＥＲ２阻害剤の治療効果が低い可能性があり、または他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）の治療効果が高い可能性がある。本発明の場合、基準として、特定の基準値を設けてもよい。このような基準値として、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に感受性である患者、または他の抗癌剤に耐性である患者で高い陽性率（基準値以上）を示し、かつ、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に耐性である患者、または他の抗癌剤に感受性である患者で高い陰性率（基準値未満）を示し得る、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を設定してもよい。このような基準値の例は、カットオフ値である。基準値の算出方法は、本分野において周知である。
【００３５】
本発明によれば、被験体が、特定の抗癌剤に対して感受性であるのか、または耐性であるのかを判定することができる。このような判定は、例えば、被験体に投与する抗癌剤の決定に有用である。例えば、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い場合には、癌患者は、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に対して感受性である可能性があり、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）による治療効果が高い可能性がある。また、この場合には、他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して耐性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が低い可能性がある。一方、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い場合には、癌患者は、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に対して耐性である可能性があり、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）による治療効果が低い可能性がある。また、この場合には、他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して感受性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が高い可能性がある。
【００３６】
また、本発明によれば、特定の抗癌剤による被験体の治療効果を評価することができる（例、経時的モニタリング）。このような評価は、例えば、特定の抗癌剤による治療効果の低下が認められた場合に、別の抗癌剤による治療に切り替えるかどうかの判断に有用である。例えば、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い状態が維持されている場合には、癌患者は依然として、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に対して感受性である可能性があり、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）による治療効果が引き続き高い可能性がある。また、この場合には、依然として、他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して耐性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が低い可能性がある。一方、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い状態が維持されている場合には、癌患者は依然として、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に対して耐性である可能性があり、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）による治療効果が引き続き低い可能性がある。また、この場合には、依然として、他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して感受性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が引き続き高い可能性がある。
【００３７】
本発明の試験方法は、上記（ｂ）の代わりに、（ｂ’）測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を指標として、癌に対する抗癌剤の効果を判断する工程を含んでいてもよい。本工程は、上記（ｂ）と同様に行うことができる。本発明の試験方法はまた、このような判断に基づき、投与する抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）を決定する工程、および／または投与する抗癌剤を別の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に切り替えるか否かを決定する工程を含んでいてもよい。本発明の試験方法はさらに、このような決定に基づき、抗癌剤を投与する工程を含んでいてもよい。
【００３８】
本発明は、癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬を提供する。本発明の試薬は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む。本発明の診断試薬は、キットの形態であってもよい。本発明の診断試薬は、本発明の試験方法を行なうために好適に用いることができる。
【００３９】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質」とは、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに結合する能力を有する物質をいう。ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質としては、例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対する抗体、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対するアプタマーが挙げられる。
【００４０】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対する抗体は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに特異的に結合し得る抗体である限り特に限定されない。例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。抗体は、プレート等の基板上に固定された形態、またはストリップ等の支持体中に含侵された形態で提供されてもよい。抗体は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを抗原として用いて、自体公知の方法により作製できる。抗原は、ＨＥＲ２のアミノ酸配列情報を参考にして適宜作製できる。また、培養癌細胞の上清から得られるＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを、抗原として用いてもよい。
【００４１】
ポリクローナル抗体は、例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを、キャリアタンパク質（例、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ）に架橋した複合体であってもよい。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
【００４２】
モノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに２〜４回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、ＮＳ−１）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、ＰＥＧ法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。
【００４３】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対するアプタマーは、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに特異的に結合し得るアプタマーである限り特に限定されない。アプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸと呼ばれる手法により作製できる。
【００４４】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質は、必要に応じて、標識用物質で標識された形態で提供されてもよい。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。
【００４５】
本発明の診断試薬は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質に加えて、さらなる構成要素を含むキットの形態で提供されてもよい。この場合、キットに含まれる各構成要素は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器（例、チューブ）に格納された形態で提供されてもよい。例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が標識用物質で標識されていない場合、このようなキットは、標識用物質をさらに含んでいてもよい。このようなキットはまた、ポジティブコントロールとして、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを含んでいてもよい。
【００４６】
本発明の診断試薬がキットの形態で提供される場合、キットは、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質の種類に応じたさらなる構成要素を含んでいてもよい。例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が抗体である場合、キットは、２次抗体（例、抗ＩｇＧ抗体）、２次抗体の検出試薬をさらに含んでいてもよい。
【００４７】
本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、キットは、生体サンプルを採取し得る器具をさらに含んでいてもよい。生体サンプルを採取し得る器具は、被験体から生体サンプルを入手可能である限り特に限定されないが、例えば、注射器等の採血器具が挙げられる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。なお、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
【００４９】
実施例１：ＥＧＦＲ阻害剤に対する種々のヒト肺癌細胞株の感受性試験
ヒト肺癌細胞株の内、活性型変異ＥＧＦＲを有するＰＣ−９、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６、ならびに活性型変異ＥＧＦＲを有さないＨ２１７０およびＨ１７０３を濃度の異なるＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）に暴露し、同薬剤の増殖阻害効果をＭＴＳ（テトラゾリウム化合物［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ， ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ）］）アッセイにより評価した。
その結果、活性型変異ＥＧＦＲを有するＰＣ−９、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６よりも効果は弱いが、Ｈ２１７０もまたＥＧＦＲ阻害剤により増殖が阻害されることが示された（図１）。
【００５０】
実施例２：ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の発現および活性化状態の解析
種々のヒト肺癌細胞株におけるＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の発現および活性化状態を、ウェスタンブロットにより解析した。
その結果、活性型変異ＥＧＦＲを有する肺癌細胞株（ＰＣ−９、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６）は、活性型変異ＥＧＦＲ（分子量約１６０ｋＤａ）を発現し、かつ分子量約１６０ｋＤａタンパク質のリン酸化の亢進を示した（図２，ＥＧＦＲおよびｐ−Ｔｙｒを参照）。このことは、これらの肺癌細胞株では、活性型変異ＥＧＦＲのリン酸化が亢進されていることを示唆する。一方、活性型変異ＥＧＦＲを有さずＥＧＦＲ阻害剤に感受性を示したＨ２１７０は、検出可能量のＥＧＦＲを発現せず、より分子量の大きい（約２００ｋＤａ）リン酸化亢進タンパク質の発現を示した（図２，ＥＧＦＲおよびｐ−Ｔｙｒを参照）。このことは、Ｈ２１７０では、ＥＧＦＲ以外のタンパク質のリン酸化が亢進されていることを示す。そこで、Ｈ２１７０でリン酸化が亢進されている、約２００ｋＤａの分子量を示すタンパク質の同定を試みた。その結果、Ｈ２１７０では、約２００ｋＤａの分子量を示すタンパク質として、ＨＥＲ２が過剰発現していることが見出された（図２，ＨＥＲ２を参照）。
以上より、ＨＥＲ２がＨ２１７０特異的に過剰発現していることが示された。
【００５１】
実施例３：ＥＧＦＲ阻害剤によるＨＥＲ２の活性阻害
Ｈ２１７０を濃度の異なるＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）で処理し、ＨＥＲ２に対する活性阻害効果を、リン酸化チロシンおよびＨＥＲ２をウェスタンブロットにより解析することにより確認した。
その結果、ＥＧＦＲ阻害剤は、Ｈ２１７０に対して抗腫瘍効果を示す濃度１−１０μＭ以上で（実施例１および図１を参照）、ＨＥＲ２のリン酸化を減少させた（図３）。
以上より、ＥＧＦＲ阻害剤がＨＥＲ２の活性を阻害することが示された（図３）。
【００５２】
実施例４：ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２ノックダウンに対する感受性
活性型変異ＥＧＦＲを有するＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６、ならびに活性型変異ＥＧＦＲを有さないＨ２１７０を、ＥＧＦＲあるいはＨＥＲ２遺伝子を特異的に発現阻害するｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により処理した。
その結果、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６は、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＧＦＲ−１、ｓｉ−ＥＧＦＲ−２）によりＥＧＦＲの発現を阻害される（図４）のに伴い、増殖が抑制された（図５）。一方、Ｈ２１７０は、ＨＥＲ２特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＨＥＲ２−１、ｓｉ−ＨＥＲ２−２）によりＨＥＲ２の発現を阻害される（図４）のに伴い、増殖が抑制された（図５）。
以上より、Ｈ２１７０がＥＧＦＲには依存せず、ＨＥＲ２に依存して増殖すること、ならびにＨＥＲ２の阻害により、Ｈ２１７０の増殖が抑制されることが示された。したがって、ＨＥＲ２がＥＧＦＲ阻害剤による治療標的となり得ることが示された。
【００５３】
実施例５：ＨＥＲ２のリン酸化とＥＧＦＲ発現との関係の解析
活性型変異ＥＧＦＲを有するＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６、ならびに活性型変異ＥＧＦＲを有さないＨ２１７０を、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２遺伝子の発現を特異的に阻害するｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により処理した。それら細胞におけるＨＥＲ２のリン酸化状態を、ＨＥＲ２免疫沈降物に対するリン酸化チロシンブロットにより確認した。
その結果、活性型変異ＥＧＦＲにその生存を依存するＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６では、ＨＥＲ２のリン酸化は、ＥＧＦＲ発現の阻害に伴い減少した（図６）。一方、Ｈ２１７０では、ＨＥＲ２のリン酸化は、ＥＧＦＲ発現の阻害に影響されなかった（図６）。したがって、Ｈ２１７０により発現されるＨＥＲ２は、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６により発現されるＨＥＲ２とは異なり、ＥＧＦＲにより交差的に活性化されたものではないことが示された。
【００５４】
実施例６：血清中におけるＨＥＲ２の測定によるＨＥＲ２依存性癌の診断
（ａ）免疫染色による検出
Ｈ２１７０またはＨＣＣ８２７を移植したマウス由来の肺癌組織からパラフィン包埋ホルマリン固定切片を作製した。それらを薄切しガラススライド上に固定して作製した肺癌組織標本を抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体で染色した。
その結果、ＨＥＲ２依存性のＨ２１７０に由来する癌を、抗ＨＥＲ２抗体で特異的に染色することができた。したがって、ＨＥＲ２依存性の癌細胞を含む組織を、抗ＨＥＲ２抗体で免疫染色できることが示された。
【００５５】
（ｂ）ウェスタンブロットによる検出
Ｈ２１７０またはＨＣＣ８２７を培養し、細胞内に発現されるＨＥＲ２（Ｌｙｓａｔｅ）あるいは培地中に分泌されるＨＥＲ２（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を抗ＨＥＲ２抗体によるウェスタンブロットにより検出した。
その結果、分泌ＨＥＲ２（ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメント）が、ＨＥＲ２依存性のＨ２１７０特異的に検出された（図７）。したがって、分泌ＨＥＲ２の測定により、ＨＥＲ２依存性の癌細胞を同定できることが示された。
【００５６】
（ｃ）ＥＬＩＳＡによる検出
Ｈ２１７０またはＨＣＣ８２７を移植したマウスから血液を採取し、血清サンプルを調製した。可溶性ＨＥＲ２を特異的に検出するＥＬＩＳＡキットにより血清中ＨＥＲ２を定量した。
その結果、ＨＥＲ２依存性のＨ２１７０に由来する癌組織が形成されたマウス特異的に血中に可溶性ＨＥＲ２（ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメント）が検出された（図８）。したがって、血中における可溶性ＨＥＲ２の測定により、個体がＨＥＲ２依存性の癌細胞を保有するか否かを同定できることが示された。
【００５７】
以上より、生体サンプル（例、血液）中における可溶性ＨＥＲ２を測定することにより、癌に対する抗癌剤の効果を診断できること、ならびに、生体サンプル中における可溶性ＨＥＲ２を測定することにより、癌に罹患した被験体を診断できることが示された。
【００５８】
実施例７：ゲフィチニブ以外のＥＧＦＲ阻害剤に対する種々のヒト肺癌細胞株の感受性試験
（ａ）Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂに対する感受性試験
ヒト肺癌細胞株の内、活性型変異ＥＧＦＲを有するＰＣ−９、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６、ならびに活性型変異ＥＧＦＲを有さないＨ２１７０およびＨ１７０３を濃度の異なるＥＧＦＲ阻害剤（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）に暴露し、同薬剤の増殖阻害効果をＭＴＳアッセイにより評価した。
その結果、実施例１で示したＧｅｆｉｔｉｎｉｂに対する感受性試験の結果と同様にＨ２１７０はＥｒｌｏｔｉｎｉｂにより増殖が阻害されることが示された（図９）。
【００５９】
（ｂ）Ｌａｐａｔｉｎｉｂに対する感受性試験
ヒト肺癌細胞株の内、活性型変異ＥＧＦＲを有するＰＣ−９、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６、ならびに活性型変異ＥＧＦＲを有さないＨ２１７０およびＨ１７０３を濃度の異なるＥＧＦＲ阻害剤（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）に暴露し、同薬剤の増殖阻害効果をＭＴＳアッセイにより評価した。
その結果、実施例１で示したＧｅｆｉｔｉｎｉｂに対する感受性試験の結果と同様にＨ２１７０はＬａｐａｔｉｎｉｂにより増殖が阻害されることが示された（図１０）。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、例えば、癌に対する抗癌剤の効果の診断、および癌に罹患した被験体の診断に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん剤の効果的な治療方法を選択するための診断試薬などに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌の治療においては、活性型変異ＥＧＦＲを有する非小細胞性肺癌に対してＥＧＦＲに対する特異的な阻害剤が優れた治療効果を示すことが報告されている。このような肺癌はＥＧＦＲに依存して増殖する性質を有しており、このことがＥＧＦＲ阻害剤による治療奏効性の根底にある。
しかしながら、活性型変異ＥＧＦＲを発現しないにも関わらずＥＧＦＲ阻害剤による治療が有効である症例も報告されている。このようにＥＧＦＲ阻害剤による治療が有効である癌としては活性型変異ＥＧＦＲを有する癌以外にも存在するものと考えられるが、そのような癌を特定する手段（例、バイオマーカー）は報告されていない。
【０００３】
なお、肺癌の治療では、上記活性型変異ＥＧＦＲに加えて、遺伝子増幅ＭＥＴ、融合遺伝子ＥＭＬ４−ＡＬＫというキナーゼ由来遺伝子が明確な治療標的として同定されており、それらの治療薬が肺癌の治療に応用されており、あるいは、臨床試験において有効性が示されている。しかしながら、それら以外のキナーゼについて明確な治療標的となることは証明されていない。
【０００４】
上記に関連して、以下の先行技術が報告されている。
非特許文献１は、変異ＥＧＦＲを示さない肺扁平上皮癌に対してＥＧＦＲ阻害剤（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）が有効となる症例があることを開示している。
非特許文献２は、ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２の別称）が乳癌患者の血清および腫瘍中に見出されたことを開示している。
非特許文献３は、ｐ１８５／ｎｅｕ（ＨＥＲ２の別称）の細胞外ドメインがヒト乳癌細胞株の表面から放出されることを開示している。
非特許文献４は、乳癌においてＨＥＲ２細胞外ドメインの分泌及び血清循環が見出されたこと、ならびにこのような分泌および血清循環の測定により、抗ＨＥＲ２抗体（ハーセプチン）による治療が有効であるＨＥＲ２陽性乳癌の診断及びその治療効果を追跡し得ることを開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｌａｒｋ ＧＭ， Ｃａｍｅｒｏｎ Ｔ， Ｄａｓ Ｇｕｐｔａ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ ｉｎ ｍａｌｅ ｓｍｏｋｅｒｓ ｉｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ＮＳＣＬＣ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００６；２４：７１６６．
【非特許文献２】Ｂｒｅｕｅｒ，Ｂ．，ＤｅＶｉｖｏ，Ｉ．，Ｌｕｏ，Ｊ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． ｅｒｂＢ−２ ａｎｄ ｍｙｃ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｓｅｒａ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋ．Ｐｒｅｖ．，３：６３−６６， １９９４．
【非特許文献３】Ｚａｂｒｅｃｋｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｌａｍ，Ｔ．，ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐ１８５／ｎｅｕ ｉｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ，ＳＫ−ＢＲ−３． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１７１６−１７２０，１９９１．
【非特許文献４】Ｋoｓｔｌｅｒ ＷＪ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｓｅｒｕｍ Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｏ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ｂａｓｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；１０：１６１８−２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、活性型変異ＥＧＦＲを発現しないにも関わらずＥＧＦＲ阻害剤による治療が有効である症例が報告されており、また、ＥＧＦＲ阻害剤による治療が有効である癌としては活性型変異ＥＧＦＲを有する癌以外にも存在するものと考えられる。しかしながら、ＥＧＦＲ阻害剤による治療が有効である上述したような癌を特定する手段は報告されていない。また、肺癌においてＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントが生体サンプル中に検出されることは報告されていない。
【０００７】
本発明の目的は、ＥＧＦＲ阻害剤等の抗癌剤による治療が有効である肺癌を特定し得る手段等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討したところ、肺癌においてＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントが生体サンプル中に検出されることを見出した。本発明者らはまた、活性型変異ＥＧＦＲを有さないにも関わらずＥＧＦＲ阻害剤に感受性を示す癌細胞におけるＥＧＦＲ及び他のキナーゼ因子の活性状態を鋭意解析したところ、本癌細胞がＥＧＦＲに依存せずに別のＨＥＲ２というキナーゼに依存して増殖することなどを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定することにより、肺癌に対する抗癌剤の治療効果を簡便に判定し得ることなどを着想し、本願発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬。
〔２〕ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対する抗体である、〔１〕の診断試薬。
〔３〕肺癌が血中ＨＥＲ２陽性の肺癌である、〔１〕または〔２〕の診断試薬。
〔４〕抗癌剤がＥＧＦＲ阻害剤である、〔１〕〜〔３〕のいずれかの診断試薬。
〔５〕肺癌が非小細胞肺癌である、〔１〕〜〔４〕のいずれかの診断試薬。
〔６〕肺癌が肺扁平上皮癌である、〔１〕〜〔５〕のいずれかの診断試薬。
〔７〕ＥＧＦＲ阻害剤が下記式（１）：
【化１】
で表される基本構造を有する化合物またはその塩である、〔４〕の診断試薬。
〔８〕ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質、およびＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断キット。
〔９〕以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の試験方法：
（ａ）被験体由来の生体サンプル中のＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程；および
（ｂ）測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度と、肺癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体サンプル（例、血液）中における可溶性ＨＥＲ２の測定により、肺癌に対する抗癌剤の効果を診断でき、また、生体サンプル中における可溶性ＨＥＲ２の測定により、肺癌に罹患した被験体を診断できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）に対する種々のヒト肺癌細胞株の感受性を示す図である（ｎ＝４）。ＰＣ−９：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ８２７：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ４００６：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；Ｈ２１７０：ヒト非小細胞肺癌（肺扁平上皮癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；およびＨ１７０３：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株。
【図２】図２は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の発現および活性化状態の解析を示す図である。Ａ５４９：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；ＰＣ−９：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；Ｈ４６０：ヒト非小細胞肺癌（肺大細胞癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；Ｈ１６５０：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有し、ＰＴＥＮ遺伝子を欠損する細胞株；Ｈ１７０３：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；Ｈ１９７５：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ阻害剤に耐性となる二次的耐性変異をＥＧＦＲ中に有する細胞株；Ｈ１９９３：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；Ｈ２１７０：ヒト非小細胞肺癌（肺扁平上皮癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；ＨＣＣ８２７：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ４００６：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株。ウェスタンブロッティングは、以下の抗体を用いた：ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ細胞内ドメインを認識する抗体）；ＨＥＲ２（ＨＥＲ２細胞内ドメインを認識する抗体）；ｐ−Ｔｙｒ（抗リン酸化チロシン抗体）およびβ−アクチン（コントロール）。
【図３】図３は、ＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）によるＨＥＲ２の活性阻害を示す図である。ＮＣＩ−Ｈ２１７０：ヒト非小細胞肺癌（肺扁平上皮癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株。ウェスタンブロッティングは、以下の抗体を用いた：ｐＹ（抗リン酸化チロシン抗体）；ＨＥＲ２（ＨＥＲ２細胞内ドメインを認識する抗体）。
【図４】図４は、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡまたはＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡ処理されたヒト肺癌細胞株におけるＥＧＦＲまたはＨＥＲ２の発現を示す図である。ＮＣＩ−Ｈ２１７０：ヒト非小細胞肺癌（肺扁平上皮癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；ＨＣＣ４００６：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ８２７：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株。ウェスタンブロッティングは、以下の抗体を用いた：ＨＥＲ２（ＨＥＲ２細胞内ドメインを認識する抗体）；およびＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ細胞内ドメインを認識する抗体）。
【図５】図５は、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡまたはＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡ処理されたヒト肺癌細胞株の増殖を示す図である（ｎ＝４）。用いた細胞株は、図４と同じである。４種のｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＧＦＲ−１、ｓｉ−ＥＧＦＲ−２、ｓｉ−ＨＥＲ２−１、ｓｉ−ＨＥＲ２−２）を用いた。Ｎ．Ｃ．（Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ ｓｉＲＮＡ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）
【図６】図６は、ヒト肺癌細胞株におけるＨＥＲ２のリン酸化とＥＧＦＲ発現との関係を示す図である。用いた抗体の詳細は、図２と同じである。
【図７】図７は、ヒト肺癌細胞株における分泌ＨＥＲ２のウェスタンブロットによる検出を示す図である。用いた細胞株の詳細は、上述したとおりである。ウェスタンブロットで用いた抗ＨＥＲ２抗体は、分泌ＨＥＲ２（即ち、ＨＥＲ２細胞外ドメイン）を認識する。
【図８】図８は、癌組織が形成されたマウスの血清中における可溶性ＨＥＲ２のＥＬＩＳＡキットによる検出を示す図である（ｎ＝２）。用いた細胞株の詳細は、上述したとおりである。ＥＬＩＳＡキットに添付された抗ＨＥＲ２抗体は、可溶性ＨＥＲ２（即ち、ＨＥＲ２細胞外ドメイン）を認識する。
【図９】図９は、ＥＧＦＲ阻害剤（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）に対する種々のヒト肺癌細胞株の感受性を示す図である（ｎ＝４）。ＰＣ−９：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ８２７：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；ＨＣＣ４００６：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有する細胞株；Ｈ２１７０：ヒト非小細胞肺癌（肺扁平上皮癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株；およびＨ１７０３：ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）に由来し、かつ活性型変異ＥＧＦＲを有さない細胞株。
【図１０】図１０は、ＥＧＦＲ阻害剤（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）に対する種々のヒト肺癌細胞株の感受性を示す図である（ｎ＝４）。細胞の詳細は、図９と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、癌に対する抗癌剤の効果の試験方法を提供する。本発明の試験方法は、診断方法または予測方法であってもよい。
【００１３】
本発明の試験方法は、以下（ａ）および（ｂ）の工程を含み得る：
（ａ）被験体由来の生体サンプル中のＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程；および
（ｂ）測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程。
【００１４】
ＨＥＲ２は、上皮成長因子（EGFR）と同じファミリーに属す受容体型チロシンキナーゼである。細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインが一本鎖で連結した構造を有する（例えば、Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，Ｖｏｌ．２３０，Ｎｏ．４７３０，ｐｐ．１１３２−１１３９を参照）。ＨＥＲ２の配列については、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１００５８６２．１を参照のこと。
【００１５】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメント」とは、癌細胞の表面より分泌されるＨＥＲ２細胞外ドメインのポリペプチドまたはそのポリペプチドの分解産物をいう。本明細書では、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを、分泌ＨＥＲ２または可溶性ＨＥＲ２ということがある。
【００１６】
上記（ａ）において、被験体としては、癌に罹患している哺乳動物、または癌に罹患している可能性がある哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類、愛玩動物、使役動物が挙げられる。具体的には、哺乳動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、マウス、ラットが挙げられるが、好ましくは、ヒトである。
【００１７】
癌としては、例えば、肺癌（例、扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌等の非小細胞癌、ならびに小細胞癌）、消化器系癌（例、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、肉腫、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、固形癌、上皮性癌、中皮腫が挙げられる。
【００１８】
癌は、ＨＥＲ２依存性の癌であってもよい。本明細書中で用いられる場合、細胞の増殖についての用語「依存」とは、細胞が特定の癌遺伝子に増殖を依拠している、癌遺伝子異存（ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）または依存（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）の状態をいう。ＨＥＲ２依存性の癌は、ＨＥＲ２発現を亢進し得る。したがって、癌がＨＥＲ２依存性であるかどうかは、ＨＥＲ２発現を測定することにより調べることができる。また、特定の癌遺伝子への依存性（即ち、特定の癌遺伝子に増殖を依拠しているか否か）は、特定の癌遺伝子の阻害剤で細胞を処理し、次いで、処理された細胞の増殖能を評価することにより、確認できる。増殖能は、例えば、ＭＴＴアッセイ、ＭＴＳアッセイにより評価できる。また、特定の癌遺伝子に対して癌遺伝子依存の細胞を、当該癌遺伝子の阻害剤で処理すると、アポトーシスによる細胞死が誘導され得ることが知られている。したがって、特定の癌遺伝子への依存性は、例えば、当該癌遺伝子の阻害によりアポトーシスが誘導され得るか否かを評価することにより、確認してもよい。アポトーシス誘導は、例えば、ＴＵＮＥＬアッセイ、活性型カスパーゼの検出、ＡＮＮＥＸＩＮ Ｖの検出により評価できる。
【００１９】
ＨＥＲ２依存性の癌では、ＨＥＲ２発現が亢進され得るので、生体サンプル中に分泌されるＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの量（ＨＥＲ２発現量と相関し得る）も増加し得る。したがって、ＨＥＲ２依存性の癌は、通常、生体サンプル中においてＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントが検出される（例、血中ＨＥＲ２陽性）。
【００２０】
好ましい被験体の例は、特定の抗癌剤による治療が検討されている癌患者である。特定の抗癌剤としては、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤が挙げられる。これらの阻害剤としては、例えば、低分子有機化合物、抗体が挙げられる。
【００２１】
ＥＧＦＲ阻害剤としては、例えば、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ＺＤ６４７４、ＣＬ−３８７７８５、ＨＫＩ−２７２、ＸＬ６４７、ＰＤ１５３０３５、ＣＩ−１０３３、ＡＥＥ７８８、ＢＩＢＷ−２９９２、ＥＫＢ−５６９、ＰＦ−２９９８０４が挙げられる。
【００２２】
ＥＧＦＲ阻害剤はまた、例えば、下記式（１）：
【００２３】
【化２】
【００２４】
で表される基本構造を有する化合物またはその塩であってもよい。上記式（１）で表される基本構造は、低分子有機化合物のＥＧＦＲ阻害剤に共通し得る構造として知られている。上記式（１）で表される基本構造を有する化合物またはその塩は、上記式（１）で表される基本構造が１〜５個（例、１個、２個、３個）の所定の置換基で置換された化合物またはその塩である。上記式（１）で表される基本構造を有する化合物またはその塩は、水和物であってもよく、水和物および非水和物のいずれも本発明の範囲に包含されるものである。塩としては、金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩）、アンモニウム塩等の無機塩、ならびに有機塩（例、アルキルアンモニウム）等の各種塩が挙げられる。
【００２５】
上記式（１）で表される基本構造を有する化合物または塩の参考のため、ゲフィチニブ、ラパチニブ、エルロチニブの構造を下記に示す。
【００２６】
【化３】
【００２７】
【化４】
【００２８】
【化５】
【００２９】
ＨＥＲ２阻害剤としては、例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツヅマブ、ＥＧＦＲとＨＥＲ２の両方を阻害するラパチニブ、ＢＩＢＷ２９９２が挙げられる。ＨＥＲ２阻害剤としてはまた、低分子有機化合物の医薬であるＥＧＦＲ阻害剤が挙げられる。本発明者らは、このようなＥＧＦＲ阻害剤がＨＥＲ２阻害剤としても作用することを見出している（後述する実施例を参照）。
【００３０】
ｃ−ＭＥＴ阻害剤としては、例えば、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＸＬ−８８０、ＸＬ−１８４、ＡＲＱ １９７、ＡＭＧ２０８、ＡＭＧ４５８、ＣＥ−３５５６２１、ＭＰ４７０が挙げられる。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＴＡＥ６８４、ＰＦ−２３４１０６６が挙げられる。ＰＤＧＦＲ阻害剤としては、例えば、グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、デサチニブ（Ｄｅｓａｔｉｎｉｂ）、ヴァラチニブ（Ｖａｌａｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）が挙げられる。ｃ−ＫＩＴ阻害剤としては、例えば、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ヴァラチニブ（Ｖａｌａｔｉｎｉｂ）、デサチニブ（Ｄｅｓａｔｉｎｉｂ）、マシチニブ（Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ）、モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）が挙げられる。
【００３１】
好ましい被験体の別の例は、特定の抗癌剤による治療効果がモニタリングされている癌患者である。癌患者はまた、特定の抗癌剤による治療効果の低下が認められた場合に、別の抗癌剤による治療に切り替えるかどうかの判断が求められている患者であってもよい。抗癌剤は、上述した抗癌剤と同様であり得る。
【００３２】
本発明において用いられ得る生体サンプルは、上述の被験体から採取された生体サンプルであり得る。生体サンプルは、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントが存在するサンプルである限り特に限定されず、例えば、血液、血清、尿、唾液、腹水、組織試料、細胞試料、組織抽出液、細胞抽出液が挙げられる。なお、侵襲性の低さの観点からは、上記のうち、血液、尿、唾液が好ましい。必要に応じて、生体サンプルは、測定前に、事前に処理されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、濃縮、分画、細胞固定、組織固定、組織凍結、組織薄片化が挙げられる。
【００３３】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度の測定は、例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対して親和性を有する物質（後述）を用いて行うことができる。測定はまた、免疫学的手法により行なわれてもよい。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法が挙げられる。ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度の測定を可能とする上記以外の方法としては、例えば、ＬＣ−ＭＳが挙げられる。
【００３４】
上記（ｂ）において、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較され得る。基準は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度の高低と、抗癌剤の効果の強弱（抗癌剤への感受性または耐性）との間の相対的な関係を示すものであり得る。例えば、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い場合には、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）の治療効果が高い可能性があり、または他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）の治療効果が低い可能性がある。また、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い場合には、ＥＧＦＲ阻害剤またはＨＥＲ２阻害剤の治療効果が低い可能性があり、または他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）の治療効果が高い可能性がある。本発明の場合、基準として、特定の基準値を設けてもよい。このような基準値として、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に感受性である患者、または他の抗癌剤に耐性である患者で高い陽性率（基準値以上）を示し、かつ、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に耐性である患者、または他の抗癌剤に感受性である患者で高い陰性率（基準値未満）を示し得る、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を設定してもよい。このような基準値の例は、カットオフ値である。基準値の算出方法は、本分野において周知である。
【００３５】
本発明によれば、被験体が、特定の抗癌剤に対して感受性であるのか、または耐性であるのかを判定することができる。このような判定は、例えば、被験体に投与する抗癌剤の決定に有用である。例えば、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い場合には、癌患者は、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に対して感受性である可能性があり、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）による治療効果が高い可能性がある。また、この場合には、他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して耐性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が低い可能性がある。一方、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い場合には、癌患者は、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に対して耐性である可能性があり、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）による治療効果が低い可能性がある。また、この場合には、他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して感受性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が高い可能性がある。
【００３６】
また、本発明によれば、特定の抗癌剤による被験体の治療効果を評価することができる（例、経時的モニタリング）。このような評価は、例えば、特定の抗癌剤による治療効果の低下が認められた場合に、別の抗癌剤による治療に切り替えるかどうかの判断に有用である。例えば、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い状態が維持されている場合には、癌患者は依然として、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に対して感受性である可能性があり、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）による治療効果が引き続き高い可能性がある。また、この場合には、依然として、他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して耐性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が低い可能性がある。一方、測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い状態が維持されている場合には、癌患者は依然として、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）に対して耐性である可能性があり、ＥＧＦＲ阻害剤（またはＨＥＲ２阻害剤）による治療効果が引き続き低い可能性がある。また、この場合には、依然として、他の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して感受性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が引き続き高い可能性がある。
【００３７】
本発明の試験方法は、上記（ｂ）の代わりに、（ｂ’）測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を指標として、癌に対する抗癌剤の効果を判断する工程を含んでいてもよい。本工程は、上記（ｂ）と同様に行うことができる。本発明の試験方法はまた、このような判断に基づき、投与する抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）を決定する工程、および／または投与する抗癌剤を別の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に切り替えるか否かを決定する工程を含んでいてもよい。本発明の試験方法はさらに、このような決定に基づき、抗癌剤を投与する工程を含んでいてもよい。
【００３８】
本発明は、癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬を提供する。本発明の試薬は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む。本発明の診断試薬は、キットの形態であってもよい。本発明の診断試薬は、本発明の試験方法を行なうために好適に用いることができる。
【００３９】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質」とは、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに結合する能力を有する物質をいう。ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質としては、例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対する抗体、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対するアプタマーが挙げられる。
【００４０】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対する抗体は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに特異的に結合し得る抗体である限り特に限定されない。例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。抗体は、プレート等の基板上に固定された形態、またはストリップ等の支持体中に含侵された形態で提供されてもよい。抗体は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを抗原として用いて、自体公知の方法により作製できる。抗原は、ＨＥＲ２のアミノ酸配列情報を参考にして適宜作製できる。また、培養癌細胞の上清から得られるＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを、抗原として用いてもよい。
【００４１】
ポリクローナル抗体は、例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを、キャリアタンパク質（例、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ）に架橋した複合体であってもよい。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
【００４２】
モノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに２〜４回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、ＮＳ−１）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、ＰＥＧ法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。
【００４３】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対するアプタマーは、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに特異的に結合し得るアプタマーである限り特に限定されない。アプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸと呼ばれる手法により作製できる。
【００４４】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質は、必要に応じて、標識用物質で標識された形態で提供されてもよい。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。
【００４５】
本発明の診断試薬は、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質に加えて、さらなる構成要素を含むキットの形態で提供されてもよい。この場合、キットに含まれる各構成要素は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器（例、チューブ）に格納された形態で提供されてもよい。例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が標識用物質で標識されていない場合、このようなキットは、標識用物質をさらに含んでいてもよい。このようなキットはまた、ポジティブコントロールとして、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを含んでいてもよい。
【００４６】
本発明の診断試薬がキットの形態で提供される場合、キットは、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質の種類に応じたさらなる構成要素を含んでいてもよい。例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が抗体である場合、キットは、２次抗体（例、抗ＩｇＧ抗体）、２次抗体の検出試薬をさらに含んでいてもよい。
【００４７】
本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、キットは、生体サンプルを採取し得る器具をさらに含んでいてもよい。生体サンプルを採取し得る器具は、被験体から生体サンプルを入手可能である限り特に限定されないが、例えば、注射器等の採血器具が挙げられる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。なお、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
【００４９】
実施例１：ＥＧＦＲ阻害剤に対する種々のヒト肺癌細胞株の感受性試験
ヒト肺癌細胞株の内、活性型変異ＥＧＦＲを有するＰＣ−９、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６、ならびに活性型変異ＥＧＦＲを有さないＨ２１７０およびＨ１７０３を濃度の異なるＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）に暴露し、同薬剤の増殖阻害効果をＭＴＳ（テトラゾリウム化合物［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ， ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ）］）アッセイにより評価した。
その結果、活性型変異ＥＧＦＲを有するＰＣ−９、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６よりも効果は弱いが、Ｈ２１７０もまたＥＧＦＲ阻害剤により増殖が阻害されることが示された（図１）。
【００５０】
実施例２：ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の発現および活性化状態の解析
種々のヒト肺癌細胞株におけるＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の発現および活性化状態を、ウェスタンブロットにより解析した。
その結果、活性型変異ＥＧＦＲを有する肺癌細胞株（ＰＣ−９、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６）は、活性型変異ＥＧＦＲ（分子量約１６０ｋＤａ）を発現し、かつ分子量約１６０ｋＤａタンパク質のリン酸化の亢進を示した（図２，ＥＧＦＲおよびｐ−Ｔｙｒを参照）。このことは、これらの肺癌細胞株では、活性型変異ＥＧＦＲのリン酸化が亢進されていることを示唆する。一方、活性型変異ＥＧＦＲを有さずＥＧＦＲ阻害剤に感受性を示したＨ２１７０は、検出可能量のＥＧＦＲを発現せず、より分子量の大きい（約２００ｋＤａ）リン酸化亢進タンパク質の発現を示した（図２，ＥＧＦＲおよびｐ−Ｔｙｒを参照）。このことは、Ｈ２１７０では、ＥＧＦＲ以外のタンパク質のリン酸化が亢進されていることを示す。そこで、Ｈ２１７０でリン酸化が亢進されている、約２００ｋＤａの分子量を示すタンパク質の同定を試みた。その結果、Ｈ２１７０では、約２００ｋＤａの分子量を示すタンパク質として、ＨＥＲ２が過剰発現していることが見出された（図２，ＨＥＲ２を参照）。
以上より、ＨＥＲ２がＨ２１７０特異的に過剰発現していることが示された。
【００５１】
実施例３：ＥＧＦＲ阻害剤によるＨＥＲ２の活性阻害
Ｈ２１７０を濃度の異なるＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）で処理し、ＨＥＲ２に対する活性阻害効果を、リン酸化チロシンおよびＨＥＲ２をウェスタンブロットにより解析することにより確認した。
その結果、ＥＧＦＲ阻害剤は、Ｈ２１７０に対して抗腫瘍効果を示す濃度１−１０μＭ以上で（実施例１および図１を参照）、ＨＥＲ２のリン酸化を減少させた（図３）。
以上より、ＥＧＦＲ阻害剤がＨＥＲ２の活性を阻害することが示された（図３）。
【００５２】
実施例４：ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２ノックダウンに対する感受性
活性型変異ＥＧＦＲを有するＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６、ならびに活性型変異ＥＧＦＲを有さないＨ２１７０を、ＥＧＦＲあるいはＨＥＲ２遺伝子を特異的に発現阻害するｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により処理した。
その結果、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６は、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＧＦＲ−１、ｓｉ−ＥＧＦＲ−２）によりＥＧＦＲの発現を阻害される（図４）のに伴い、増殖が抑制された（図５）。一方、Ｈ２１７０は、ＨＥＲ２特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＨＥＲ２−１、ｓｉ−ＨＥＲ２−２）によりＨＥＲ２の発現を阻害される（図４）のに伴い、増殖が抑制された（図５）。
以上より、Ｈ２１７０がＥＧＦＲには依存せず、ＨＥＲ２に依存して増殖すること、ならびにＨＥＲ２の阻害により、Ｈ２１７０の増殖が抑制されることが示された。したがって、ＨＥＲ２がＥＧＦＲ阻害剤による治療標的となり得ることが示された。
【００５３】
実施例５：ＨＥＲ２のリン酸化とＥＧＦＲ発現との関係の解析
活性型変異ＥＧＦＲを有するＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６、ならびに活性型変異ＥＧＦＲを有さないＨ２１７０を、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２遺伝子の発現を特異的に阻害するｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により処理した。それら細胞におけるＨＥＲ２のリン酸化状態を、ＨＥＲ２免疫沈降物に対するリン酸化チロシンブロットにより確認した。
その結果、活性型変異ＥＧＦＲにその生存を依存するＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６では、ＨＥＲ２のリン酸化は、ＥＧＦＲ発現の阻害に伴い減少した（図６）。一方、Ｈ２１７０では、ＨＥＲ２のリン酸化は、ＥＧＦＲ発現の阻害に影響されなかった（図６）。したがって、Ｈ２１７０により発現されるＨＥＲ２は、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６により発現されるＨＥＲ２とは異なり、ＥＧＦＲにより交差的に活性化されたものではないことが示された。
【００５４】
実施例６：血清中におけるＨＥＲ２の測定によるＨＥＲ２依存性癌の診断
（ａ）免疫染色による検出
Ｈ２１７０またはＨＣＣ８２７を移植したマウス由来の肺癌組織からパラフィン包埋ホルマリン固定切片を作製した。それらを薄切しガラススライド上に固定して作製した肺癌組織標本を抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体で染色した。
その結果、ＨＥＲ２依存性のＨ２１７０に由来する癌を、抗ＨＥＲ２抗体で特異的に染色することができた。したがって、ＨＥＲ２依存性の癌細胞を含む組織を、抗ＨＥＲ２抗体で免疫染色できることが示された。
【００５５】
（ｂ）ウェスタンブロットによる検出
Ｈ２１７０またはＨＣＣ８２７を培養し、細胞内に発現されるＨＥＲ２（Ｌｙｓａｔｅ）あるいは培地中に分泌されるＨＥＲ２（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を抗ＨＥＲ２抗体によるウェスタンブロットにより検出した。
その結果、分泌ＨＥＲ２（ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメント）が、ＨＥＲ２依存性のＨ２１７０特異的に検出された（図７）。したがって、分泌ＨＥＲ２の測定により、ＨＥＲ２依存性の癌細胞を同定できることが示された。
【００５６】
（ｃ）ＥＬＩＳＡによる検出
Ｈ２１７０またはＨＣＣ８２７を移植したマウスから血液を採取し、血清サンプルを調製した。可溶性ＨＥＲ２を特異的に検出するＥＬＩＳＡキットにより血清中ＨＥＲ２を定量した。
その結果、ＨＥＲ２依存性のＨ２１７０に由来する癌組織が形成されたマウス特異的に血中に可溶性ＨＥＲ２（ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメント）が検出された（図８）。したがって、血中における可溶性ＨＥＲ２の測定により、個体がＨＥＲ２依存性の癌細胞を保有するか否かを同定できることが示された。
【００５７】
以上より、生体サンプル（例、血液）中における可溶性ＨＥＲ２を測定することにより、癌に対する抗癌剤の効果を診断できること、ならびに、生体サンプル中における可溶性ＨＥＲ２を測定することにより、癌に罹患した被験体を診断できることが示された。
【００５８】
実施例７：ゲフィチニブ以外のＥＧＦＲ阻害剤に対する種々のヒト肺癌細胞株の感受性試験
（ａ）Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂに対する感受性試験
ヒト肺癌細胞株の内、活性型変異ＥＧＦＲを有するＰＣ−９、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６、ならびに活性型変異ＥＧＦＲを有さないＨ２１７０およびＨ１７０３を濃度の異なるＥＧＦＲ阻害剤（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）に暴露し、同薬剤の増殖阻害効果をＭＴＳアッセイにより評価した。
その結果、実施例１で示したＧｅｆｉｔｉｎｉｂに対する感受性試験の結果と同様にＨ２１７０はＥｒｌｏｔｉｎｉｂにより増殖が阻害されることが示された（図９）。
【００５９】
（ｂ）Ｌａｐａｔｉｎｉｂに対する感受性試験
ヒト肺癌細胞株の内、活性型変異ＥＧＦＲを有するＰＣ−９、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６、ならびに活性型変異ＥＧＦＲを有さないＨ２１７０およびＨ１７０３を濃度の異なるＥＧＦＲ阻害剤（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）に暴露し、同薬剤の増殖阻害効果をＭＴＳアッセイにより評価した。
その結果、実施例１で示したＧｅｆｉｔｉｎｉｂに対する感受性試験の結果と同様にＨ２１７０はＬａｐａｔｉｎｉｂにより増殖が阻害されることが示された（図１０）。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、例えば、癌に対する抗癌剤の効果の診断、および癌に罹患した被験体の診断に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬。
【請求項２】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対する抗体である、請求項１記載の診断試薬。
【請求項３】
肺癌が血中ＨＥＲ２陽性の肺癌である、請求項１または２記載の診断試薬。
【請求項４】
抗癌剤がＥＧＦＲ阻害剤である、請求項１〜３のいずれか一項記載の診断試薬。
【請求項５】
肺癌が非小細胞肺癌である、請求項１〜４のいずれか一項記載の診断試薬。
【請求項６】
肺癌が肺扁平上皮癌である、請求項１〜５のいずれか一項記載の診断試薬。
【請求項７】
ＥＧＦＲ阻害剤が下記式（１）：
【化１】
で表される基本構造を有する化合物またはその塩である、請求項４記載の診断試薬。
【請求項８】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質、およびＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断キット。
【請求項９】
以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の試験方法：
（ａ）被験体由来の生体サンプル中のＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程；および
（ｂ）測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度と、肺癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程。
【請求項１】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬。
【請求項２】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに対する抗体である、請求項１記載の診断試薬。
【請求項３】
肺癌が血中ＨＥＲ２陽性の肺癌である、請求項１または２記載の診断試薬。
【請求項４】
抗癌剤がＥＧＦＲ阻害剤である、請求項１〜３のいずれか一項記載の診断試薬。
【請求項５】
肺癌が非小細胞肺癌である、請求項１〜４のいずれか一項記載の診断試薬。
【請求項６】
肺癌が肺扁平上皮癌である、請求項１〜５のいずれか一項記載の診断試薬。
【請求項７】
ＥＧＦＲ阻害剤が下記式（１）：
【化１】
で表される基本構造を有する化合物またはその塩である、請求項４記載の診断試薬。
【請求項８】
ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質、およびＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントを含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の診断キット。
【請求項９】
以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、肺癌に対する抗癌剤の効果の試験方法：
（ａ）被験体由来の生体サンプル中のＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程；および
（ｂ）測定されたＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ＨＥＲ２細胞外ドメインフラグメントの濃度と、肺癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程。
【図１】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−２３７５８６（Ｐ２０１２−２３７５８６Ａ）
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０５３１６（Ｐ２０１１−１０５３１６）
【出願日】平成２３年５月１０日（２０１１．５．１０）
【出願人】（３０６００８７２４）富士レビオ株式会社 (55)
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１０日（２０１１．５．１０）
【出願人】（３０６００８７２４）富士レビオ株式会社 (55)
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