抗体をヒト化及び親和性成熟する方法
抗体をヒト化及び親和性成熟する方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体をヒト化及び親和性成熟する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの治療用として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可を受けた抗体は２０種類以上あり、ほぼ同数の抗体が臨床実験の後期にある（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｓｔｒｏｈｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｂｅｎｃｈ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００９）。これまでに記述されてきた全ての抗体療法は、多大な量及び複数の用量を必要とするため、抗体系の薬剤を開発するときには、免疫原性が重要な懸念である（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｄ：Ｄｕｂｅｌ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００７）。ファージディスプレー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５〜１６，２００５）、又はヒト抗体遺伝子レパートリーを有するトランスジェニックマウスの免疫付与（Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｄ：Ｄｕｂｅｌ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００７）といった濃縮技術による、生体外でのヒト抗体の発見は、ヒト抗体を生成するための強力な手段を提供してきた。ヒト化の方法はこの１０年間に多様化してきており、ヒト化抗体の数は継続した安定成長を示してきた（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １３：１６１９〜３３，２００８）。
【０００３】
抗体ヒト化の方法は、ヒトに適用されたときに最小の免疫原性を伴う一方で親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持する分子を生成するように設計される。ヒト化は、ネズミ抗体可変（Ｖ）ドメインをヒト定常（Ｃ）ドメインと組み合わせて、ヒトの含有量が〜７０％である分子を生成するキメラ化とともに始まった（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１〜５，１９８４）。キメラ抗体は親マウス抗体の特異性を保持し、かつその免疫原性を減退することに成功したが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答は、なお誘導された（Ｈｗａｎｇ ａｎｄ Ｆｏｏｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：３〜１０，２００５）。
【０００４】
ヒト抗体における非ヒト配列の使用を最小限にするための改善された方法としては、相補的決定領域（ＣＤＲ）グラフト法（米国特許第５，２２５，５３９号（Ｗｉｎｔｅｒ））が挙げられる。いくつかのケースでは、ヒトフレームワーク内でヒトＣＤＲの代わりにげっ歯類抗体由来のＣＤＲを使うことで抗原結合親和性の転移が十分に行われたが（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５，１９８６；Ｖｅｒｈｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜３６，１９９８）、他のケースでは、１つ又は複数のフレームワーク残基を追加的に置換する必要があった。例えば、Ｑｕｅｅｎ（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９〜３３，１９８９）は、米国内で治療用として最初にＦＤＡに認可された抗体をヒト化した（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））。Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）は、ネズミ抗体との相同性を最大限にするようにヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を選択することによって生成された。マウス抗体のコンピュータモデルを案内として、ＣＤＲ又は抗原と相互作用する、ＣＤＲの外のいくつかのネズミのアミノ酸が識別された。これらの残基は、親和性を改善するためにヒト化抗体において復帰突然変異した（back-mutated）。
【０００５】
更なる研究において、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ（Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７〜９９，１９９２）は、それらのＣＤＲの元となっている３０の残基（ＶＨに１６とＶＬに１４）が、ＨＶループ構造の安定化及びそれらの位置決めの修正に関与し、それ故、その抗体の親和性に関与している、と予測した。この領域はバーニヤゾーン（ＶＺ）と呼ばれ、それを画定する残基はバーニヤ残基（ＶＲ）と呼ばれる。ＶＲにおける復帰突然変異、及びＶＨ：ＶＬインターフェイスに関与する残基における復帰突然変異は、ＣＤＲグラフトの後に、与えられた抗体の親和性を回復する方法として、記述されてきた（Ｃａｒｔｅｒ及びＰｒｅｓｔａに与えられた米国特許第６，６３９，０５５号）。
【０００６】
リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９〜９８，１９９１）、超ヒト化（Superhumanization）（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９〜２５，２００２）、ヒトストリング含有量最適化（Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１９８６〜９８，２００７）のような異なるパラダイムに基づくヒト化の方法もまた、開発されてきた。ＣＤＲグラフト法と同じく、これらの方法は、非ヒト抗体及びヒト抗体の構造及び配列の比較解析によって、ヒト化プロセスが最終生成物に与える潜在的影響を評価する。これらの方法に共通しているのは、関心対象の結合又は他の任意の特性を試験するために、いくつかのヒト化変異型を生成することである。設計された変異型が不十分であることが実証された場合、設計及び結合評価の新しいサイクルが開始される。したがって、これらの方法は、抗体ヒト化のための合理的な戦略として分類され得る。
【０００７】
ファージディスプレー法及びハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法は、多数の抗体変異型の組み合わせライブラリの探求及び関心対象の変異型の選択のための効率的なツールとして出現した（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５，１９９０）。これらの技法は、設計サイクルでなく選択に基づく方法の創出を刺激する抗体ヒト化プロトコルに適用されてきた。誘導選択（Guided Selection）（Ｏｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１〜８，２００５）と呼ばれる、これらの方法の１つは、ＦＤＡの認可を受けた最初のヒト抗体（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９〜９０３，１９９４）であるＨｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）を生成した。大きい組み合わせライブラリの選択に依存する誘導選択及び他のヒト化の戦略は、最終的なヒト化された生成物への変異の影響をほとんど仮定しておらず、したがって、これらの技法は、抗体のヒト化のための経験的方法と呼ばれる場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗原及び他の望ましい生物活性に対する高い親和性の保持を伴う抗体のヒト化では、治療用として有用なものにすべく、免疫原性を低減するために元の非ヒト配列を置換することと、十分な抗原結合を保持するためにヒト化された分子を必要とすることとの間の釣り合いを取ることが要求される。したがって、抗体のヒト化及び親和性の成熟のための改善された方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の一態様は、抗体をヒト化する方法であって、
非ヒト抗体可変領域のアミノ酸配列を得る工程と、
前記非ヒト抗体可変領域の第１のカノニカル構造クラスを決定する工程と、
生殖細胞系列遺伝子によってコードされるヒト抗体可変領域のアミノ酸配列の第１のライブラリを得る工程と、
前記第１のライブラリから、アミノ酸配列の一群を選択する工程と、
（この選択する工程は、前記第１のライブラリのそれぞれのアミノ酸配列に関する第２のカノニカル構造クラスとＳＤＲＵランクスコアとを決定する工程と、前記第１のカノニカル構造クラスと同一の第２のカノニカル構造クラスを有し、最高のＳＤＲＵランクスコアを更に有する、アミノ酸配列の一群を前記第１のライブラリから識別する工程と、を含む）
ヒト化抗体を生成するために、上で選択されたアミノ酸配列の群において、ＳＤＲＵ残基を、対応する非ヒトＳＤＲＵ残基と置換する工程と、を含む、方法。
【００１０】
本発明の別の態様は、抗体の親和性成熟の方法であって、
前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
前記抗体内の親和性決定残基（ＡＤＲ）を決定する工程と、
少なくとも１つのＡＤＲ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
前記ライブラリを宿主において発現する又は前記ライブラリを生体外で翻訳する工程と、
前記ライブラリから、対抗原に対する改善された親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【００１１】
本発明の別の態様は、親和性成熟された抗体を作製する方法であって、
前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
前記抗体内の特異性決定残基使用（ＳＤＲＵ）残基を決定する工程と、
少なくとも１つのＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
前記ライブラリを宿主において発現する又は前記ライブラリを生体外で翻訳する工程と、
前記ライブラリから、対抗原に対する改善された親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】重鎖のカバット付番方式とコチア付番方式、ＣＤＲ、ＨＶ、ＳＤＲＵ残基、ＡＤＲ、及びＶＲ間の対応黒は残基を示す。ＳＤＲＵに関しては、閾値≧０．３灰色：ＳＤＲＵ残基、閾値＜０．３。薄い灰色：割り当てされず。
【図２】軽鎖のカバット付番方式とコチア付番方式、ＣＤＲ、ＨＶ、ＳＤＲＵ残基、ＡＤＲ、及びＶＲ間の対応黒は残基を示す。ＳＤＲＵに関しては、閾値≧０．３灰色：ＳＤＲＵ残基、閾値＜０．３。薄い灰色：割り当てされず。
【図３】ヒト生殖細胞系列のＩＧＶＨ遺伝子レパートリー及びカノニカル構造クラス。
【図４】ヒト生殖細胞系列のＩＧＶκ遺伝子レパートリー及びカノニカル構造クラス。
【図５】ヒト生殖細胞系列のＩＧＨＪ及びＩＧκＪレパートリー。
【図６】抗ＣＤ１４７抗体４Ａ５重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列。ＣＤＲ（カバット）、ＨＶループ（コチア）及びＳＤＲＵ残基（ｐＳＤＲＵ）が指示されている。
【図７】Ａ４５の潜在的ヒトスカフォールドのＳＤＲＵランクスコア。ＶＨに関しては、最も高いスコアの３つの遺伝子のみが示されている。
【図８】ＡＤＲライブラリの設計ＳＤＲＵ残基にはアスタリスクが付されており、ＡＤＲの位置は「Ｘ」で表されている。置換されたＳＤＲＵ残基には下線が付されている。
【図９】ヒトＣＤ１４７のＨｉｓタグ付きＮ末端ドメインでの３回のパニング後に選択されたＶＨ配列変異型。
【図１０】ＶＨ変異型におけるＡＤＲの位置で表されるアミノ酸のロゴ図ロゴプロットの各列は、文字のスタックとしてアミノ酸頻度を表しており、各文字の高さは、各アミノ酸の観察された頻度に比例する。
【図１１】抗ＩＬ−１７抗体ＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列。ＣＤＲ（カバット）、ＨＶループ（コチア）及びＳＤＲＵ残基（ｐＳＤＲＵ）が指示されている。
【図１２ａ】ヒトＩＬ−１７ Ｋ３Ｒ／Ｋ７４Ｑ／Ａ１３６Ｑ変異型での３回のパニングの後に選択されたＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２変異型ＶＬアミノ酸配列及びＶＨアミノ酸配列。Ａ）ＩＬ−１７Ｍ７０の重鎖Ｂ）ＩＬ−１７Ｍ７０の軽鎖Ｃ）ＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖、Ｄ）ＩＬ−１７Ｍ８２の軽鎖の変異型配列。
【図１２ｂ】ヒトＩＬ−１７ Ｋ３Ｒ／Ｋ７４Ｑ／Ａ１３６Ｑ変異型での３回のパニングの後に選択されたＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２変異型ＶＬアミノ酸配列及びＶＨアミノ酸配列。Ａ）ＩＬ−１７Ｍ７０の重鎖Ｂ）ＩＬ−１７Ｍ７０の軽鎖Ｃ）ＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖、Ｄ）ＩＬ−１７Ｍ８２の軽鎖の変異型配列。
【図１２ｃ】ヒトＩＬ−１７ Ｋ３Ｒ／Ｋ７４Ｑ／Ａ１３６Ｑ変異型での３回のパニングの後に選択されたＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２変異型ＶＬアミノ酸配列及びＶＨアミノ酸配列。Ａ）ＩＬ−１７Ｍ７０の重鎖Ｂ）ＩＬ−１７Ｍ７０の軽鎖Ｃ）ＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖、Ｄ）ＩＬ−１７Ｍ８２の軽鎖の変異型配列。
【図１２ｄ】ヒトＩＬ−１７ Ｋ３Ｒ／Ｋ７４Ｑ／Ａ１３６Ｑ変異型での３回のパニングの後に選択されたＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２変異型ＶＬアミノ酸配列及びＶＨアミノ酸配列。Ａ）ＩＬ−１７Ｍ７０の重鎖Ｂ）ＩＬ−１７Ｍ７０の軽鎖Ｃ）ＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖、Ｄ）ＩＬ−１７Ｍ８２の軽鎖の変異型配列。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載した、特許及び特許出願を含む（ただし限定せず）全ての出版物は、参照によりその全文がここに明記されたかのように組み込まれる。
【００１４】
本明細書及び請求項の範囲において使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」には、その文脈が明確に異なって指定しない限り、複数の言及が含まれる。したがって、例えば、「ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」という言及は、１つ以上のポリペプチドの言及であり、当業者には既知のその同等物を含む。
【００１５】
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者に慣例的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記述したものと同様又は同等の何らかの組成物及び方法を本発明の実践又は試験に使用することができるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記述する。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は広義であって、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む免疫グロブリン又は抗体分子、ネズミのような非ヒト、ヒト、ヒト適応型、ヒト化、及びキメラのモノクローナル抗体、並びに抗体フラグメントを含む。抗体は、抗体全体及び任意の抗原結合フラグメント、又はその単鎖を含む。天然発生する抗体は、４つのポリペプチド鎖と、２つの同一の重鎖と、２つの同一の軽鎖とを備える。それぞれの重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それを多数の定常ドメイン（ＣＨ）が追従している。それぞれの軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、もう一方の端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。任意の脊椎種の抗体の軽鎖に、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と名づけられた明確に区別される２つのタイプのうち１つを、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、割り当てることができる。
【００１７】
免疫グロブリンは、定常ドメインの重鎖のアミノ酸配列に依存して、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥと名づけられた５つの主要なクラスに割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４として更に細かく分類される。
【００１８】
本明細書で用いられる「抗体フラグメント」とは、損なわれていない抗体の一部、概して、損なわれていない抗体の抗原結合領域又は可変領域を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジアボディ、単鎖抗体分子、及び少なくとも２つの損なわれていない抗体で形成された多特異性（multispecific）抗体を含む抗体フラグメントが挙げられる。
【００１９】
本明細書で用いられる「抗体可変領域」とは、抗原結合部位のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と、フレームワーク領域（ＦＲすなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）とを含む抗体分子の軽鎖及び重鎖の部分を指す。軽鎖可変領域（ＶＬ）は、抗体Ｖ及びＪセグメント遺伝子によってコードされ、重鎖可変領域（ＶＨ）は、抗体Ｖ、Ｄ、Ｊセグメント遺伝子によってコードされる。ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子ｌｏｃｉ（loci）、抗体遺伝子構造、遺伝子再配列のゲノム組織は周知である。
【００２０】
「ヒト化抗体」は、非ヒト種からの抗原結合部位の１つ以上のアミノ酸と、ヒト由来のフレームワーク配列とを含有する抗体である。定常領域が存在してよく、ヒトの配列、例えばヒト生殖細胞系列の配列由来であるか、又は自然発生する抗体由来である場合がある。ヒト化抗体は、例えば親和性又は特異性を向上するために、非ヒト種からのフレームワーク領域アミノ酸の１つ以上のアミノ酸を有することができる。このヒト化抗体は、１つ以上のクラスのアイソタイプからの配列を含むことが可能であり、特定の定常ドメインを選択して、例えば細胞毒性活性など所望のエフェクタ機能を最適化することは、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。
【００２１】
本明細書で用いられるとき、用語「完全な長さの抗体」とは、少なくとも２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む、実質的に損なわれていない形状にある抗体を指す。この用語は、特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。完全な長さの抗体は、非ヒト、ヒト、ヒト化、及び／又は親和性成熟されたものである場合がある。
【００２２】
本明細書で用いられる「親和性成熟された抗体」とは、可変領域に１つ以上の置換を有する抗体であり、それらの置換を有さない親抗体と比べ、抗原に対して改善された抗体の親和性をもたらす。代表的な親和性成熟された抗体は、少なくとも１つのＡＤＲ残基に置換を有する。
【００２３】
本明細書で用いられる「親和性」とは、抗体と配位子との間の相互作用の強度を指す。抗体の親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって表される。典型的には、抗体は、１０-7Ｍ以下、１０-8Ｍ以下、１０-9Ｍ以下、又は１０-10Ｍ以下の解離定数（ＫD）で、既定の抗原と結合する。本明細書で用いられる「改善された親和性」とは、親和性成熟された抗体のＫｄが親と比較して少なくとも２倍低減することを指す。抗体の親和性は、周知の方法、例えば競合的結合ＥＬＩＳＡアッセイ、ＢＩＯＡｃｏｒｅ（商標）又はＫｉｎＥｘＡを用いる表面プラズモン共鳴を用いて決定される。
【００２４】
免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）又は重鎖（ＶＨ）可変領域は、３つの「抗原結合部位」が介入する「フレームワーク」領域から成る。抗原結合部位は、次のような様々な表現を用いて記述される。
（ｉ）カバット（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５th Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）の定義による、抗体の可変配列内の「相補的決定領域」（「ＣＤＲ」）であり、これらは配列の可変性に基づく。可変重鎖及び可変軽鎖配列のそれぞれに３つのＣＤＲがあり、それぞれの可変領域はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と指定される。
（ｉｉ）「ハイパー可変領域」（「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」）は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）の定義による、構造的にハイパー可変である抗体の可変ドメインの領域を指す。概して、その抗原結合部位は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）とＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのハイパー可変領域を有する。
（ｉｉｉ）Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３）の提案による「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」は、免疫グロブリンとＴ細胞受容体からのＶドメインの比較に基づく。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、３つの領域の標準的な付番及び定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ、ＩＭＧＴの記述間の対応は、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３に記述されている。
（ｉｖ）抗原結合部位を形成する領域のもう１つの定義は、Ｐａｄｌａｎが記述したような「特異性決定残基」（「ＳＤＲ」）であり、配列の分析と利用可能な結晶構造情報との組み合わせによって定義される（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１３３〜９，１９９５）。
（ｖ）この抗原結合部位もまた、例えばタンパク質、ペプチド、ハプテンといった異なるタイプの抗原と接触する残基の数及び分布の正確な測定値である特異性決定残基使用量（ＳＤＲＵ）に基づいて記述され得る（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜４３，２００４）。ＳＤＲＵを決定するには、次の式を用いて一連の抗原・抗体接触を算出することができる。
ＳＤＲＵ＝１−［（ｃｍ−ｃｉ）／ｃｍ］
式中、ｃｍはＶＬ又はＶＨにおける接触の最大数であり、ｃｉは位置当たりの接触である。ＳＤＲＵ残基は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）にしたがって数えられる。ＳＤＲＵの範囲は０〜１が可能である。ＳＤＲＵ値≧０．７は、複合体の６７％より多くにおいて接触していることが見出されるＳＤＲに相当し、高使用量と定義される。ＳＤＲＵ値＜０．３は、複合体の３３％未満において接触していることが見出されるＳＤＲに相当し、低使用量と定義される。０．３〜０．７のＳＤＲＵ値は、中間使用量とみなされる。その位置でのＳＤＲＵスコアが≧０．３のとき、残基は、本明細書で用いられる「ＳＤＲＵ残基」である。いくつかの用途では、分析又は置換のためのＳＤＲＵ残基の数を増やすために、「ＳＤＲＵ残基」は０〜０．３のＳＤＲＵスコアを有する残基を含む場合がある。例えば、下の実施例１は、ヒト化プロセスの間に特異性及び親和性を保持するために非ヒト抗体からヒトスカフォールドに転移される残基の数を最大にするために、＞０のＳＤＲＵスコアを使用して、ヒト化のためのＳＤＲＵ残基を定義している。＞０．３又は＞０．７のＳＤＲＵスコアを使用して、例えば、特にＮＮＫコドンが使用されるときに、結果的に得られるライブラリの表現（representation）を増すために親和性成熟のためにバリエゲートされるＳＤＲＵ残基を定義することができる。
【００２５】
「カノニカル構造」は、ＨＶループの長さと、ＨＶ及びフレームワークに保存された残基とによって決定されるＨＶループ型であり、ＨＶ及びＨＬについてそれぞれ表１及び２に示されている（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７〜４８，１９９７）。
【００２６】
「カノニカル構造クラス」は、重鎖Ｈ１、Ｈ２又は軽鎖Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３のための組み合わされたカノニカル構造である。
【００２７】
「コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）残基」は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３，９２７〜４８，１９９７）にしたがって数えられた抗体ＶＬ残基及びＶＨ残基である。
【００２８】
本明細書で用いられる「対応するＳＤＲＵ残基」は、２つの異なる可変領域配列間、例えばヒトと非ヒトの可変領域配列間の位置に対応するＳＤＲＵ残基を指す。
【００２９】
「本明細書で用いられる「ＳＤＲＵランクスコア」は、同一残基（アイデンティティ）の数及び親配列内の対応するＳＤＲＵ残基間の類似に基づく、試験配列の相同性ランクスコアを指す。同一残基にはスコア値１が割り当てられる。類似残基にはスコア値０．５が割り当てられる。他の残基については、スコア値０が割り当てられる。その結果得られる「ＳＤＲＵランクスコア」は、個々のランクスコアの合計である。スコア値０．５を割り当てる類似残基の５つの群は、（ｉ）極性アミノ酸Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、（ｉｉ）非極性アミノ酸Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸Ｆ、Ｗ、Ｙ、（ｉｖ）酸性アミノ酸Ｄ、Ｅ、（ｖ）塩基性アミノ酸Ｈ、Ｋ、Ｒである。代表的な試験配列はヒト抗体重鎖可変領域アミノ酸配列であり、代表的な親配列は非ヒト抗体重鎖可変領域アミノ酸配列である。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位として定義されていない、可変領域の残りの配列である。抗原結合部位は上述のように様々な描写（delineation）によって定義され得るので、フレームワークの正確なアミノ酸配列は、抗原結合部位の描写に依存する。
【００３３】
「親和性決定残基」（ＡＤＲ）は、ＣＤＲ内にある非ＳＤＲＵ残基として定義され、ＣＤＲは次のように描写される。ＶＬからのＣＤＲ−１は残基２４〜３６を包含し、ＶＬからのＣＤＲ−２は残基４６〜５６を包含し、ＶＬからのＣＤＲ−３は残基８９〜９８を包含し、ＶＨからのＣＤＲ−１は残基２７〜３７を、ＶＨからのＣＤＲ−２は残基４７〜６１を、ＶＨからのＣＤＲ−３は残基９３〜１０３を、包含する（表１）。ＡＤＲは、ＳＤＲＵ残基の付近の残基を含む。ＡＤＲはＶドメインに埋め込まれている場合があり、ＨＶループの配座のために重要である場合があり、ＨＶループの構造及び位置づけの修正に関与する場合がある。ＳＤＲＵ残基は様々なＳＤＲＵスコアを使用して描写され得るので、可変領域内にある正確なＡＤＲ残基は、ＳＤＲＵ残基の描写に依存する。
【００３４】
「バーニヤ残基」（ＶＲ）は、ＨＶループ構造の安定及びそれらの位置づけの修正に関与すると特定された抗体の可変領域のフレームワークに宿る３０の残基である（Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：４８７〜９９，１９９２）。場合によっては、ＶＲは、カノニカル構造の維持に関与する残基と一致する（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７〜４８，１９９７）。
【００３５】
最もよく使用される２つの付番システムであるカバット（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５th Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）とコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）間の対応、及びＣＤＲ、ＨＶ、ＳＤＲＵ残基、ＡＤＲ、ＶＲを、それぞれ重鎖及び軽鎖について、図１及び２に示す。灰色で示されている残基は、ＳＤＲＵ及びＡＤＲについては定義されていない。図は、ＳＤＲＵスコアＸ≧０．３の残基を黒で、ＳＤＲＵスコア＜０．３の残基を灰色で示す。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。アミノ酸が３０未満の小タンパク質は「ペプチド」と呼ばれる場合がある。タンパク質はまた、「ポリペプチド」とも呼ばれる場合がある。
【００３７】
「融合タンパク質」は、少なくとも２つのポリペプチドと、それら２つのポリペプチドを動作可能に連結して１つの連続したポリペプチドにするための連結配列とを含むタンパク質である。融合ポリペプチド内の連結された２つのポリペプチドは、典型的には、２つの独立のソースから派生しており、したがって、融合ポリペプチドは、通常は自然界で連結しているものとして発見されることがない２つの連結したポリペプチドを含む。その連結配列はよく知られており、例えば、アミド結合又はグリセリンの豊富なリンカーを含む。代表的な融合タンパク質は、バクテリオファージコートタンパク質を有するＶＬ融合及びＶＨ融合であり、例えば、ｐＩＩＩ、又はｐＶＩＩ、又はｐＩＸ（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６０２５〜３０，１９９９）である。融合タンパク質は周知の方法を用いて作製される。
【００３８】
抗体の「望ましい生物活性」は、例えば、強化又は改善された結合力、強化又は改善された親和力、オンレート、オフレート、特異性、半減期、低減された免疫原性、多様な宿主からの効率的な発現及び生成、抗体安定性、良好な溶解特性、又は他の任意の好適な特性を含む。
【００３９】
本明細書で用いられる「生殖細胞系列遺伝子」は、特定の免疫グロブリンの発現のための遺伝的再配列及び変異につながる成熟プロセスを経ていない非リンパ細胞によってコードされる免疫グロブリン配列である。
【００４０】
本明細書で用いられる「抗体の可変領域のペアリング」は、完全な長さの自然発生する抗体を形成するための、生体内におけるＶＨ及びＶＬの結合を指す。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子レパートリーは、約４０の重鎖、３５のカッパ及び３０のラムダ官能性Ｖ遺伝子から成る。特定のＶセグメント遺伝子によってコードされる重鎖と軽鎖のランダムな結合の代わりに、ランダムでないやり方で自然の抗体において生じる特定の軽鎖及び重鎖に向けてバイアスが存在する（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：８９５〜９０１，１９９９）。ヒト化のためのフレームワークドナーとして重鎖及び軽鎖のＶセグメント生殖細胞系列遺伝子を選択するとき、好ましいのは、生体内で対になっているＶ遺伝子である。
【００４１】
用語「置換する」又は「バリエゲートする」又は「変異する」又は「多様化する」は、互換性を持って使用することができ、本明細書で使用されるとき、ペプチド又はタンパク質の配列における１つ以上のアミノ酸を変更して、その配列の変異型を生成することを指す。
【００４２】
本明細書で用いられるとき、「変異型」は、参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドと異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指し、変更された特性を有しても有さなくてもよい。変異型又は参照ポリペプチドは、１つ以上の修正によって、例えば置換、挿入、又は削除によって、アミノ酸配列が異なっている場合がある。
【００４３】
本明細書で用いられるとき、「ライブラリ」は、１つ以上の変異型の集合を指す。
【００４４】
本明細書で用いられるとき、「スカフォールド」は、ヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされる軽鎖又は重鎖の可変領域のアミノ酸配列を指す。したがって、スカフォールドは、フレームワークと抗原結合部位の両方を包含する。
【００４５】
本発明は、抗体のヒト化及び親和性成熟方法を説明する。
【００４６】
抗体のヒト化方法
特異性決定残基リサーフェシング（ＳＤＲＲ）
特異性決定残基リサーフェシング（ＳＤＲＲ）は、抗体をヒト化する方法である。ＳＤＲＲは、（ｉ）スカフォールドの選択のためにＳＤＲＵランクオーダーを利用すること、及び（ｉｉ）ＳＤＲＵ残基の置換によって、非ヒト抗体の特異性をその選択されたスカフォールドに転移することにおいて、公開された方法と異なる。
【００４７】
公開されたヒト化方法において、非ヒト抗体の特異性は、ＣＤＲ（米国特許第５，２２５，５３９号（Ｗｉｎｔｅｒ）、米国特許第６，８８１，５５７号（Ｆｏｏｔｅ））又はＳＤＲ（米国特許第６，８１８，７４９号（Ｋａｓｈｍｉｒｉ））の変異によってヒトのスカフォールドに転移され、所望により、カノニカル構造の保持（米国特許第５，６９３，７６１号（Ｑｕｅｅｎ））又はＨＶループの位置づけ（米国特許第６，６３９，０５５号（Ｃａｒｔｅｒ））において重要ないくつかのフレームワーク残基の復帰突然変異を伴う。ヒトのスカフォールドは、生殖細胞系列の遺伝子との相同性（Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３〜７２，２００４）、体細胞又はコンセンサス免疫グロブリン可変領域遺伝子に基づいて選択され、場合によっては、ＣＤＲ又はカノニカル構造の相同性の評価によって、更に選択される（米国特許第６，８８１，５５７号（Ｆｏｏｔｅ））。上述の方法によってヒト化される残基同士の対応を、図１及び２に示す。
【００４８】
先行のヒト化方法に勝るＳＤＲＲの利益は、ＳＤＲＵ残基の正確な定義のおかげで、選択されたスカフォールドに最小限の数の非ヒト残基を転移し得ること、及び、タンパク質、ペプチド、又はハプテンのようなジェネリックな配位子の異なる型を認識するヒト化プロトコルを抗体に合わせてカスタマイズすることにより、ヒト化抗体の潜在的な免疫原性を低減する可能性である。
【００４９】
ＳＤＲＵ残基は、抗体の新たなライブラリを生成するために置換されてきたが、集中的ライブラリでのヒト化又は親和性成熟の試みはまだ成されていない（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５７，６０７〜６２０，２００６；Ｃｏｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３７８：６２２〜６３３，２００８）。
【００５０】
発明の一実施形態は、抗体をヒト化する方法であって、
ａ．非ヒト抗体可変領域のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記非ヒト抗体可変領域の第１のカノニカル構造クラスを決定する工程と、
ｃ．生殖細胞系列遺伝子によってコードされるヒト抗体可変領域のアミノ酸配列の第１のライブラリを得る工程と、
ｄ．前記第１のライブラリから、アミノ酸配列の一群を選択する工程と、
ｉ．この選択する工程は、前記第１のライブラリのそれぞれのアミノ酸配列に関する第２のカノニカル構造クラスと、ＳＤＲＵランクスコアとを決定する工程と、
ｉｉ．前記第１のカノニカル構造クラスと同一の第２のカノニカル構造クラスを有し、最高のＳＤＲＵランクスコアを更に有する、アミノ酸配列の一群を前記第１のライブラリから識別する工程と、を含む）
ｅ．ヒト化抗体を生成するために、工程ｄ）で選択されたアミノ酸配列の群において、ＳＤＲＵ残基を、対応する非ヒトＳＤＲＵ残基と置換する工程と、を含む、方法。
【００５１】
上記の実施形態の方法は、本明細書において、「ＳＤＲＲ」（「特異性決定残基リサーフェシング」）と名づけられる。
【００５２】
非ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、よく知られた方法、例えば、ゲノムクローニング又はＰＣＲクローニング及びその後のＤＮＡ塩基配列決定法によって配列を決定することによって得ることができる。非ヒト抗体は、ヒト以外の任意の種からの抗体、例えばげっ歯類、ラクダ、又はサルの抗体を含む。
【００５３】
本発明の方法では、ヒトのスカフォールドは、カノニカル構造クラスのアイデンティティ及び非ヒト抗体に対するＳＤＲＵランクスコアに基づいて生殖細胞系列遺伝子によってコードされたヒト抗体可変領域のアミノ酸配列ライブラリから選択される。生殖細胞系列Ｖセグメント遺伝子をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３の選択に使用し、生殖細胞系列Ｊセグメント遺伝子をＦＲ４の選択に使用する。
【００５４】
生殖細胞系列遺伝子配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ＿／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）からダウンロードすることができる。図３及び４は、ＩＭＧＴからコンパイルされたヒト「０１」生殖細胞系列ＩＧＶＨ及びＩＧＶκ遺伝子、及びそれらがコードするカノニカル構造クラスのリストである。図５は、ＩＧＨＪ及びＩＧκＪ Ｊセグメント遺伝子のヒト配列を示す。免疫原性の可能性がある体細胞の変異を避けるために、ヒト生殖細胞系列遺伝子は、コンセンサス配列又は成熟配列の代わりにヒトフレームワークのソースとしてますます利用されるようになってきている（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９，２００８）。加えて、生殖細胞系列の遺伝子は、改善された塑性及びフレキシビリティをもたらして、ヒト抗体の親和性を回復するためのＦＲへの復帰突然変異をほとんど又は全く伴わずに多様な抗原結合部位を許容することが可能である（Ｗｅｄｅｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１６６５〜９，１９９７；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：１３７２２〜７，２００６；Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３〜７２，２００４）。
【００５５】
カノニカル構造クラスは、表１及び２に記載したパターンにしたがって決定される。ヒト以外の種からのいくつかの抗体又は免疫反応の成熟の産物であるいくつかのヒト抗体は、ヒトゲノムにコードされていないカノニカル構造型を有する（Ａｌｍａｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１１９９〜１２１４，１９９７；Ａｌｍａｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４７：３５５〜６３，１９９８）。例えば、いくつかのネズミ生殖細胞系列遺伝子は、Ｌ１にて１型及び５型をコードする。これらのカノニカル構造は、ヒト生殖細胞系列遺伝子には存在しない。そのような場合、類似のカノニカル構造を有するヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子が比較のために考慮される。例えば、非ヒト抗体に１型が見出される場合、２型を有するヒトＶκ配列を比較のために用いるべきである。非ヒト抗体に５型が見出される場合は、３型又は４型のいずれかを有するヒトＶκ配列を比較に使用すべきである。
【００５６】
非ヒト抗体の特異性は、その非ヒト抗体のＳＤＲＵ残基を置換して、選択されたヒトスカフォールド内に導入することによって、選択されたヒトスカフォールドに転移される。典型的には、選択されたスカフォールド内の全てのＳＤＲＵ残基は、非ヒトＳＤＲＵ残基と置換される。ＳＤＲＵ残基の置換は、周知の方法によって、例えばＰＣＲ変異誘発によって実行できる（米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ））。例えば、非ヒト抗体における、ＣＤＲ−Ｌ３については９４Ｌ、ＣＤＲ−Ｈ１については３１Ｈ、３３Ｈ、３５Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２については５２Ｈ、５３Ｈ、５４Ｈ、５６Ｈ、５８Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ３については残基９５Ｈ〜１０２Ｈを、選択されたスカフォールド内に置換することができる。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、生殖細胞系列遺伝子は、ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ、ＪＨ、Ｊκ、又はＪλ配列から選択される。
【００５８】
本発明の別の態様は、上述のように、抗体の可変領域のペアリングを評価することによって行われる、第１のライブラリからのアミノ酸配列の群の更なる選択である。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、抗体をヒト化する方法は、更に、
ｅ−ｉ：工程ｄ）で選択されたアミノ酸配列の群の親和力決定残基（ＡＤＲ）を決定する工程と、
ｅ−ｉｉ：少なくとも１つのＡＤＲ残基をバリエゲートすることによって、ヒト抗体可変領域のアミノ酸配列の第２のライブラリを生成する工程と、
ｅ−ｉｉｉ：宿主において前記第２のライブラリを表現する又は前記第２のライブラリを生体外で翻訳する工程と、
ｅ−ｉｖ：前記第２のライブラリから、望ましい生物活性を有する可変領域を選択する工程と、を含む。
【００６０】
本発明の方法では、ＡＤＲのバリエゲーションは、ＳＤＲＵ残基の置換によって、選択されたスカフォールド内に非ヒト抗体の選択性が転移された後に、親和性を保持、回復又は改善するように設計される。上で定義したＡＤＲ残基の重鎖及び軽鎖はそれぞれ図１及び２に示されている。少なくとも１つ、２つ、３つ、又はそれ以上のＡＤＲをバリエゲートすることができる。軽鎖又は重鎖のいずれかに宿るＡＤＲをバリエゲートすることができる。あるいは、ＡＤＲの定義されたサブセットをバリエゲートしてもよい。例えば、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈをバリエゲートするか、又はコチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、６１Ｈをバリエゲートする。ＡＤＲのバリエゲーションはいくつかの利益を提供する。例えば、非ヒト残基と、それらの周りのヒト残基との不適合性は、結果的に得られる抗体の親和性の損失を引き起こす場合がある。非ヒトループとヒトＨＶループの構造の違いは、抗体の特異性を定義する残基の異なる位置づけ、及びしたがって親和性の損失の原因となる場合がある。
【００６１】
少なくとも１つのＡＤＲ残基のバリエゲーションによって生成されたアミノ酸配列のライブラリは、本明細書で用いられるような「ＡＤＲライブラリ」である。ＡＤＲライブラリは、例えば、重鎖又は軽鎖可変領域変異型のライブラリである。ＡＤＲライブラリは、周知の方法を用いて生成することができる。例えば、ランダム置換を有するこのライブラリのＡＤＲ変異型は、２０の自然発生するアミノ酸全てをコードするＮＮＫコドンを用いて生成することができる。あるいは、ランダムでない置換を伴うＡＤＲ変異型を、例えば、１１のアミノ酸（ＡＣＤＥＧＫＮＲＳＹＷ）をコードするＤＶＫコドン及び１つの終止コドンを用いて生成することができる。あるいは、クンケル変異誘発法を使用して、ＡＤＲをバリエゲートしてもよい（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２，１９８７）。
【００６２】
標準のクローニング法を使用して、ＡＤＲライブラリをベクターにして発現する。ＡＤＲライブラリは、既知のシステムを用いて発現することができ、例えば、融合タンパク質としてそのライブラリを発現することができる。代表的な融合タンパク質は、ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、及びそれらの変異型のようなウィルスコートタンパク質を有するＡＤＲライブラリ変異型の融合である。融合タンパク質は、任意の好適なファージの表面にディスプレイすることができる。バクテリオファージの表面上に抗体フラグメントを含む融合ポリペプチドのディスプレイの方法は周知である（米国特許第６，９６９，１０８号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）、米国特許第６，１７２，１９７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）、米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒ）、米国特許第６，５８２，９１５号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）、米国特許第６４７２１４７号（Ｊａｎｄａ）、ＷＯ２００９０８５４６２Ａ１号）。ＡＤＲライブラリはまた、例えばリボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ，９４：４９３７，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｓｔ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７，１９９７）、又は他の無細胞システム（米国特許第５，６４３，７６８号（Ｋａｗａｓａｋｉ））を使用して生体外で翻訳することもできる。ＡＤＲライブラリは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、又はＦｖを含む様々なフォーマットで表現及びディスプレイすることができる。本発明の実施例１では、ＡＤＲライブラリは、バクテリオファージコートタンパク質ｐＩＸを伴う融合タンパク質として発現された（ＷＯ２００９０８５４６２Ａ１号（Ｐｉｎｇ））。
【００６３】
その結果得られたライブラリを、例えば、低減、強化、又は修正された結合力、親和性、オンレート、オフレート又は特異性といった望ましい生物活性又は他の任意の好適な特性の抗体又は抗体フラグメントのためにスクリーニングすることができる。例えば、本発明のヒト化抗体は、約１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、又は１０-12Ｍ以下のＫdを有する抗原と結合することができる。抗原に対する抗体の親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる。そのような方法は、当業者に既知のＢｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ計測、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合アッセイを利用することができる。
【００６４】
ＡＤＲライブラリを独立に使用して、任意の抗体又は抗体フラグメントの親和性を成熟することができる。
【００６５】
抗体可変領域を隔離し、完全な長さの抗体又は任意の所望の抗原結合性フラグメントを作るために使用すること、及び哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、細菌を含む任意の宿主において発現することができる。発現ベクター及び生体外の翻訳方法は周知である。哺乳類細胞は、ＳＰ２／０（アメリカ培養コレクション（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ヨーロッパ細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）ネズミ細胞株のようなハイブリドーマ又は骨髄腫の細胞株のような不死化細胞株を含む。代表的なヒト骨髄腫細胞株はＵ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６１）のようなチャイニーズハムスター由来卵巣（ＣＨＯ）株又はＤＧ４４が挙げられる。抗体の作製及び精製方法は、当該技術分野において周知である。
【００６６】
抗体の親和性を成熟する方法
高親和性の抗体に対する需要は年々増してきており、特に、親和性が用量に、及びしたがって潜在的に免疫原性及び生産コストに直接影響し得る、治療用の価値を有する抗体については、なおさらである。ランダム（Ｇｒｏｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１３：１２９〜３９，２００６）及び部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）法（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３８０９〜１３，１９９４）を含む、抗体の親和性を進化するための多くの戦略が報告されている。前者では、変化はＶ遺伝子全体にわたってランダムに導入され、ファージ、ｍＲＮＡ及びリボソームディスプレイのようなハイスループットスクリーニング法を用いて最良の変異型が選択される（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０：５１〜６７，２００４）。一方、部位特異的変異誘発法（ＳＤＭ）は、既定の残基に変異を導入するように設計され、ランダム変異誘発法に勝るその潜在的な利点は、導入される変化の結果を制御しやすいことである。
【００６７】
それにも関わらず、一般的なＳＤＭ法はなお、ランダマイゼーションのために標的とする残基を特定するという難題を抱えている。ファージ又はリボソームディスプレイのような分子ディスプレイ技法を使用すると、残基が追加されるごとにライブラリのサイズが指数関数的に増すので、制限された一式の残基のみがランダマイズされ得る。例えば、全ての位置において３２のコドンを導入する共通のＮＮＫ多様化スキームで構築されたライブラリは、残基の数ｎ毎に３２n増加する。制限クローニング及び形質転換によって構築されるファージライブラリは、通常、１０9〜１０10メンバーというサイズに制限されるので、そのライブラリに完全な配列を収録しようとする場合、これは、６〜７残基のみを標的にできることを意味する。したがって、ランダマイゼーションのための主要な位置を正確に特定する方法が強く求められてきた。本発明の方法は、例えばＡＤＲ及びＳＤＲＵ残基など既定の位置を標的として置換する２つの親和性成熟法を提供する。
【００６８】
ＡＤＲライブラリを用いる親和性成熟
本発明の別の実施形態は、抗体の親和性成熟の方法であって、
ａ．前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記抗体の親和性決定残基（ＡＤＲ）を決定する工程と、
ｃ．少なくとも１つのＡＤＲ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
ｄ．前記ライブラリを宿主において発現する又は生体外で翻訳する工程と、
ｅ．前記ライブラリから、改善された対抗原親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【００６９】
本発明の方法を用いて、任意の抗体の親和性成熟が可能である。例えば、げっ歯類又はサルなど非ヒトの、ヒトの、キメラの、又はヒト化された、任意の抗体を使用することができる。少なくとも１つ、２つ、３つ、又はそれ以上のＡＤＲをバリエゲートすることができる。軽鎖又は重鎖のいずれかに宿るＡＤＲをバリエゲートすることができる。あるいは、ＡＤＲの定義されたサブセットのバリエゲーションを行ってもよい。
【００７０】
本発明の別の態様では、バリエゲートされるＡＤＲ残基は、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈから選択される。
【００７１】
本発明の別の態様では、バリエゲートされるＡＤＲ残基は、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、６１Ｈから選択される。ＡＤＲ残基は、上記のように決定され、図１及び２に示されている。ライブラリの生成方法、抗体及び抗体フラグメントの発現及び隔離の方法、及び抗体親和性の測定方法は上述した。
【００７２】
ＳＤＲＵライブラリを用いる親和性成熟
本発明の別の実施形態は、抗体の親和性成熟の方法であって、
ａ．前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記抗体内の特異性決定残基使用量（ＳＤＲＵ）残基を決定する工程と、
ｃ．少なくとも１つのＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
ｄ．前記ライブラリを宿主において発現する又は前記ライブラリを生体外で翻訳する工程と、
ｅ．前記ライブラリから、改善された対抗原親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【００７３】
本発明の方法を用いて、任意の抗体の親和性成熟が可能である。例えば、げっ歯類又はサルなど非ヒトの、ヒトの、キメラの、又はヒト化された、任意の抗体を使用することができる。少なくとも１つ、２つ、３つ、又はそれ以上のＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることができる。軽鎖又は重鎖のいずれかに宿るＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることができる。あるいは、定義されたサブセットのＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることができる。
【００７４】
本発明の別の態様では、バリエゲートされるＳＤＲＵ残基は、コチア残基９１Ｌ、９２Ｌ、及び９３Ｌから選択される。
【００７５】
本発明の別の態様では、バリエゲートされるＳＤＲＵ残基は、コチア残基Ｈ３２、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、及びＨ５８から選択される。
【００７６】
本発明の別の態様では、バリエゲートされるＳＤＲＵ残基は、コチア残基Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、及びＬ９６から選択される。
【００７７】
ライブラリの生成方法、抗体及び抗体フラグメントの発現及び隔離の方法、及び抗体親和性の測定方法は上述した。本発明の方法は、抗体の親和性の有意な改善につながる可能性がある。下の実施例において実証されるように、例えば、抗ＩＬ−１３抗体の親和性は最高２５倍、抗ＩＬ−１７の親和性は２倍、親抗体より向上した。
【００７８】
本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【００７９】
（実施例１）
ＳＤＲＲを用いて行うマウス抗ＣＤ１４７抗体のヒト化
マウス抗ＣＤ１４７抗体４Ａ５の生成
バシギン又はＣＤ１４７としても知られる細胞外マトリックス金属タンパク質（ＭＭＰ）誘導因子（ＥＭＭＰＲＩＮ）は４４〜６６ｋＤａの免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型膜透過性タンパク質である。ヒトＣＤ１４７アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ Ｎｏ：ＢＡＢ８８９３８．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示される。
【００８０】
４Ａ５は、精製されたＮ末端ヒトＣＤ１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸１９−１１７）を抗原として使用し、Ａ１９Ｎ置換によって生成されたネズミ抗体である。クローニング、発現、タンパク質精製及び免疫付与は、標準の方法を用いて行った。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されたＣＤ１４７ Ｈｉｓタグ付きＮ末端ドメインに対する４Ａ５ Ｆａｂの親和性は１２０ｎＭであった（表３）。
【００８１】
ＳＤＲＵ注釈
分解された、４Ａ５のＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列を、図６に示す（ＶＨ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；ＶＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。それらの配列の上に、図１及び２で決定されたＣＤＲ及びＨＶの定義が提供される。ＳＤＲＵ残基を決定するために、ＳＤＲＵの抗タンパク質抗体（ｐＳＤＲＵ、表１）を使用した。
【００８２】
ヒト生殖細胞系列抗体可変領域の遺伝子配列の選択
ｍＡｂ ４Ａ５ ＨＶループ全長の可変領域の配列及びカノニカル構造を定義する位置における残基の分析は、４Ａ５ ＶＬがカノニカル構造クラス３−１をコードしたことを指示した（それぞれＬ１及びＬ２について）。Ｌ３では、４Ａ５は削除を有し、したがって、カノニカル構造５型としての資格を有する（表３）。ヒト生殖細胞系列遺伝子でＬ３に５型のカノニカル構造を有するものはないので、Ｌ３はＳＤＲＵランキングでは考慮されなかった。４Ａ５ ＶＨはクラス１−２をコードした（それぞれＨ１およびＨ２について）。
【００８３】
ヒト生殖細胞系列レパートリー（図３及び４に示す）との比較によって、カノニカル構造クラス３−１−１を共有する３つのＶＬ遺伝子（０１１、０１、及びＢ３）及びカノニカル構造クラス１〜２を有する７つのヒトＶＨ遺伝子（１−１８、１−６９、１−ｅ、１−ｆ、５−５１、５−ａ、及び７−４．１）が識別された。更なるランキングのためにこれらの生殖細胞系列遺伝子配列を選択した。
【００８４】
４Ａ５とヒト生殖細胞系列遺伝子間のＳＤＲＵランクスコアを計算し、図７に示した。ＶＬに関しては、ヒトＢ３はＳＤＲＵランクスコアが９．０であり、ネズミ４Ａ５に対する相同性がヒトＯ１１及びＯ１配列より高いことが見出され、４Ａ５の配列と比較すると、同一であり、位置９４において類似性を１つだけ有し、ランクスコアは０．５であった。ＶＨに関しては、同様の比較で１−６９が４Ａ５と最も相同性の高い遺伝子配列として識別され、ランクスコアは６．５であった。最も高いスコアを有する３つのヒト遺伝子を図７に示した。ｄｅ Ｗｉｌｄによる１−６９／Ｂ３の発現プロファイルの更なる検査（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：８９５〜９０１，１９９９）は、両方の遺伝子が生体内でよく発現したことを示し、したがって選択のための追加的な裏付けをもたらした。したがって、４Ａ５ ＳＤＲＵ残基を置換するために１−６９／Ｂ３をＶＨ／ＶＬスカフォールドとして選択した。１−６９の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に、Ｂ３の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される。
【００８５】
ヒト生殖細胞系列Ｊ領域をＦＲ４ドナーとして識別するために、ＩｍＭｕｎｏＧｅＴｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）にコンパイルされた軽鎖のＩＧκＪ生殖細胞系列遺伝子と、重鎖のＩＧＨＪ生殖細胞系列遺伝子との配列比較を行った。ＩＧκＪ及びＩＧＨＪの配列を図５に示す。Ｊκ１及びＪＨ４についてはそれぞれ最高のランクスコアが得られ、それらはＦＲ４配列として選択された。
【００８６】
ＳＤＲＵリサーフェシング
抗マウス抗体からの選択された重鎖及び軽鎖スカフォールドに置換により導入されたＳＤＲＵ残基は、ＣＤＲ−Ｌ３については９４Ｌ、ＣＤＲ−Ｈ１については３３Ｈ及び３５Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２については５２Ｈ、５３Ｈ、５４Ｈ、５６Ｈ、５８Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ３については９５Ｈ〜１０２Ｈであった。ヒト化重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される。
【００８７】
ＳＤＲＲヒト化重鎖及び軽鎖可変領域を、ハイブリッドＦａｂとして発現し、ＶＨ及びＮＬへのヒト化プロセスの影響を評価するためにＥＬＩＳＡによって試験した。ＳＤＲＲヒト化ＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ；６）又はＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を含有するハイブリッドＦａｂ、親４Ａ５ ＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）又はＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）鎖、又は選択されたスカフォールド１〜６９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）又はＢ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を発現し、ＣＤ１４７への結合を試験した。生成されたＦａｂの結合の結果を表４に示す。ＳＤＲＲヒト化ＶＬはＣＤ１４７との結合を示したが、ＳＤＲＲヒト化ＶＨは検出不能な結合を示した。
【００８８】
【表３】
【００８９】
（実施例２）
ＡＤＲライブラリの生成による親和性成熟
実施例１に記述したヒト化及びハイブリッドＦａｂの結合実験に基づき、４Ａ５／ＣＤ１４７の相互作用において、ＶＬよりＶＨの方がより重要な役割を果たしたこと及びＡＤＲライブラリがＶＨに限定されたことが決定された。多様化のための標的とされたＡＤＲ残基は、ＣＤＲ−Ｈ１については２６Ｈ、２７Ｈ、２８Ｈ、２９Ｈ、及び３４Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２については５１Ｈ、５５Ｈ、５７Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、及び６１Ｈであった。図８は、ＡＤＲライブラリの設計及び４Ａ５重鎖及び軽鎖に関して置換されたＳＤＲＲ残基を示す。
【００９０】
ライブラリの生成及びスクリーニング
Ｂ３／４Ａ５可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）は、ＰＣＲ法（Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １６４：４９〜５３，１９９５）を用いて、２つの制限クローニング部位（５’でのＮｈｅ Ｉ及び３’でのＲｓｒ ＩＩ）をＮｈｅ Ｉ−Ｒｓｒ ＩＩフラグメントとしてクローンし、ｐＣＮＴＯ−ｌａｃＩ−ｐＩＸ（ＷＯ２００９０８５４６２Ａ１号）にして、オーバーラップするオリゴを組み立てることによって合成された。
【００９１】
１−６９／４Ａ５のＡＤＲライブラリは、テンプレートとして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されている可変領域配列によってコードされたｃＤＮＡを用いて、ＡＤＲの位置においてＮＮＫミックスを伴うオリゴを用いたオーバーラッピングＰＣＲによって合成された。このようにして、ＡＤＲの位置における全ての可能な変異型のサンプルを得た。その結果得られたライブラリによってコードされたアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す。
【００９２】
アガロースゲル抽出及び精製されたＰＣＲ混合物をＳｆｉ Ｉ及びＸｈｏ Ｉで消化し、Ｂ３−４Ａ５を含有するｐＣＮＴＯ−ｌａｃＩ−ｐＩＸベクターに連結した。その連結したＤＮＡに２０ｍｇ／ｍＬのグリコーゲンを１μｌ添加し、更に５００ｍＬのｎ−ブタノールを加えてボルテックスし、室温で１０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿させた。その上清をデカントし、１ｍＬの７０％ ＥｔＯＨでペレットを洗浄し、ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。５分間乾燥した後、最終ペレットを２０μＬの水で再懸濁した。電気穿孔法によって連結混合物１０μＬを５０μＬのＭＣ１０６１Ｆ’細胞に形質転換し、３７℃で１時間、１ｍＬのＳＯＣ中に回収した。形質転換体を１００μｇ／ｍＬカルビンシリン／１％グルコースのプレート上に出してシングルコロニーを得、電気穿孔毎に少なくとも１０7の独立したコロニーを収穫した。２０の電気穿孔は２×１０8の形質転換体のライブラリをもたらした。
【００９３】
電気穿孔ライブラリを、４００μＬのＳＯＣ培地にて３７℃で１時間培養した後、レスキューした。この培養物を、１％グルコースを含有する１００μｇ／ｍＬのカルビンシリンで希釈して１０００ｍｌの２ｘＹＴを得、ＯＤ６００が１．０に達するまで振った。この培養物１００ｍＬをＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（１０11／ｍＬ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で感染させ、その感染させた細胞を遠心分離し、カルビンシリン、カナマイシン及び１ｍＭ ＩＰＴＧで再懸濁して、５００ｍＬの２ｘＹＴにした。この培養物を一晩、３０℃で振った。ファージの上清を回収し、翌日、１０％のＰＥＧ／ＮａＣｌを添加した。氷上で２時間培養した後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してファージを沈降し、２５ｍＬの冷たいＰＢＳで再懸濁し、１ｍＬのアリコートに分割した。アリコートは、使用するまで−７０℃で貯蔵した。
【００９４】
ライブラリを３回パニングした。特異的ファージは、上述のように調製された、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレート（ＮＵＮＣ）上で吸収されたヒトＨｉｓタグ付きＮ末端ＣＤ１４７を使用して親和性選択される。３回の選択後にＤＮＡを特異的ファージから隔離し、ＮｈｅＩ／ＳｐｅＩの消化によってｐｌＸを取り除く。ｐｌＸのない、ゲル抽出され精製されたＤＮＡを連結し、電気穿孔によってＩＭＣ１０６１Ｆ’細胞５０μＬに形質転換し、３７℃で１時間かけて、ＳＯＣ １ｍＬにて回収した。形質転換物を、カルベニシリンとグルコースを含有する寒天プレート上に出し、スクリーニングのためのシングルコロニーを得た。
【００９５】
シングルコロニーをランダムに取り出して、カルベニシリン及び１％グルコース（２ｘＹＴ／カルベニシリン）を含有するウェル当たり１００μＬの２ｘＹＴに接種し、３７℃で一晩成長させて、マスタープレート（ＭＰ）を作製した。一晩経ったこのＭＰからの培養物２０μＬを、ウェル当たり１００μＬの２ｘＹＴ／カルベニシリンを含有する発現プレート（ＥＰ）に添加し、振りながら３７℃で６〜８時間成長させた。最終的に２０％になるようグリセロールをＭＰに添加し、−８０℃で貯蔵した。
【００９６】
６〜８時間成長させた後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）をＥＰに添加し、一晩振りながら３０℃で培養した。ＥＬＩＳＡプレートは、結合のための１μｇ／ｍＬのヒトＣＤ１４７ Ｈｉｓタグ付きＮ末端ドメイン及び発現のための１μｇ／ｍＬのヒツジ抗Ｆｄ（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．）でコーティングして準備した。翌日、それぞれの試料に、１ｘＰＢＳ中のＬｙｓｏｚｙｍｅ（２．５ｍｇ／ｍＬ）を２０μＬ添加することにより、細胞を溶解した。タンパク質でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴで洗浄し、ＣｈｅｍｉＢｌｏｃｋｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）でブロックした。細胞可溶化物とともにプレートを１時間培養し、ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄後、抗ヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）ＨＲＰ共役抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）培養した。ＨＲＰ基質を添加後、結合したＦａｂを化学発光法によって検出した。
【００９７】
スクリーニングした３７６のＦａｂのうち１９５（５３％）はＥＬＩＳＡ形式でＣＤ１４７への陽性結合を示した。８１の強結合剤の配列決定により、２回出現した２つのクローンを含む７５の固有の配列が明らかになった（図９）。ＡＤＲ中のアミノ酸の分布は、「ロゴ」図（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６０９７〜６１００，１９９０）として示されている（図１０）。ＮＮＫコドンによって精製されたアミノ酸の頻度からいかにＡＤＲが逸脱しているかを決定するために、これらの位置の統計解析を、適合度による手法（goodness-of-fit technique）によって実行した。
【００９８】
χ2値を、各位置について算出した。期待されるＮＮＫ頻度に対して、非常に有意な差（ｐ＜０．０１）を示す位置に２つのアスタリスクでラベル付けした。有意な頻度を伴う位置は１つのアスタリスクでラベル付けした（ｐ＜０．０５）。示されているように、Ｈ１におけるＡＤＲの位置３４Ｈ及びＨ２における位置５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、及び６１Ｈは、非常に有意な差を持ってＮＮＫ分布から逸脱しており、これらの残基がループの配座及び／又はＣＤＲ−Ｈ１とＣＤＲ−Ｈ２の相対的な位置を修正することを示唆した。位置２６及び５７は有意な差を示し、これらの位置が親和性に影響を及ぼし得るものの、置換に対する耐性がより高いことを示唆した。
【００９９】
得られたＦａｂの特性
更なる特性評価のために、図９に示されている生成された４Ａ５のＦａｂクローン７０〜７５を選択した。これらのＦａｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される配列を有するＶＬと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、１３、及び１４に示される配列を有するＶＨとをそれぞれ有していた。これら６つのクローンのそれぞれのシングルコロニーを１０ｍＬの２ｘＹＴ／カルベニシリンにて一晩成長させた。この一晩成長させた培養物を１Ｌの新鮮な２ｘＹＴ／カルベニシリンに接種し、ＯＤ６００が０．８〜１．０Ｏ．Ｄ．に達するまで成長させた。タンパク質の発現は、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、その培養物を一晩、３０℃で振った。翌朝、１Ｌの培養物を４５００ｒｐｍで３０分間、遠心分離した。その上清を廃棄し、ペレットを１００ｍＬの２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）／３５０ｍＭＮａＣｌ／７．５ｍＭイミダゾールにて再懸濁し、完成品である蛋白質分解酵素抑制剤１錠を加えた（ＥＤＴＡなし）。この均質の細胞をマイクロフルイダイザー（３Ｘ）で溶解し、氷上にて保存した。マイクロフルイダイザーで処理した細胞を９Ｋｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を清浄な試験管に注ぎ入れ、遠心分離を繰り返した。
【０１００】
タロン樹脂を２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）／３５０ｍＭ ＮａＣｌ／７．５ｍＭイミダゾールで平衡化した（タロン／ＥｔＯＨを２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＥｔＯＨを注ぎ出し、同量の２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）にて再懸濁を２回繰り返した）。平衡化されたタロン樹脂２ｍＬを、濾過したそれぞれの上清に添加した。この混合物を、２時間やさしく振りながら室温で培養した。Ｈｉｓ結合された樹脂と上清を５００ｍＬの遠心分離用ボトルに移し入れ、４，５００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。上清のほとんどを注ぎ出し、約３０ｍＬを使用して、タロンペレットを再懸濁したものをＢｉｏＲａｄカラムに充填した。樹脂を約５分間沈殿させた後、重力の流れによって上清を取り出した。次いで、この樹脂を５０ｍＬの２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）／３５０ｍＭ ＮａＣｌ／７．５ｍＭイミダゾール樹脂で２回洗浄した。１５０ｍＭ ＥＤＴＡ／２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）を用いてカラムからタンパク質を溶離した。この溶離液を４℃で一晩、トリス（ｐＨ８．５）にて透析した。
【０１０１】
Ｑ−ＦＦアニオン交換樹脂を２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）で平衡化した。透析されたＨｉｓ生成材料に、Ｑ−ＦＦアニオン交換樹脂５〜７．５ｍＬを添加し、やさしく振りながら室温で２時間培養した。次いで、樹脂及び上清をカラムに充填し、貫流を回収し、約１ｍＬに濃縮した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ｕｖ／ｖｉｓ分光光度計で、２８０ｎｍと３２０ｎｍ波長の吸光度差から濃度を判定した。精製した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、次いでゲルをＣｏｍｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅで染めることにより、濃度及び純度も決定した。
【０１０２】
４Ａ５と並んだ、精製後のＦａｂ試料のＣＤ１４７結合をＳＰＲで評価した。表面結合したヒトＮ末端ＣＤ１４７（１２０ＲＵ）を用いて、４Ａ５キメラ及びＡＤＲ Ｆａｂ変異型との親和性を、１１〜６００ｎＭへ濃度を漸増して、Ｆａｂ結合の動力学から算出した。ヒトＮ末端ＣＤ１４７ドメインに対して、ヒト化及び親和性成熟されたＦａｂは１５〜１００ｎＭの範囲であり、一方、キメラの４Ａ５ Ｆａｂは１２０ｎＭという親和性を示した（表３）。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
エピトープのマッピング
親和性成熟された変異型によって認識されるエピトープの保持を確保するために、ヒト／マウスキメラＣＤ１４７タンパク質上の４Ａ５の結合を評価することによって、エピトープのマッピングを行った。ヒト（ＢＡＢ８８９３８．１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びマウス（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＨ１０２７０．１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）のＣＤ１４７Ｈｉｓタグ付きＮ末端ドメイン及びいくつかのヒト／マウスキメラＣＤ１４７分子をｐＣＥＰ４ベクターにクローンし、標準の方法を用いて２９３の細胞に過渡的に発現した。発現されたキメラ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、１８、及び１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有していた。ヒト化及び親和性成熟された全てのＦａｂは、４Ａ５と類似した結合プロファイルを呈し、負対照として使用した非特異的なＦａｂとは異なっていた。したがって、ＣＤ１４７において４Ａ５によって認識されるエピトープは、ＳＤＲＲヒト化及びその後の親和性成熟の後、保持された。
【０１０５】
（実施例３）
ＳＤＲＵ多様性の導入による集中的親和性成熟
抗ＩＬ１３抗体の親和性成熟
親和性成熟のために選択したＩＬ１３−６２抗体は、ヒトフレームワークに適合された、ハイブリドーマＣ８３６が分泌する親マウス抗体のＩｇＧ１の変異型であった。フレームワークの配列はＨｃ２〜Ｌｃ６の重鎖及び軽鎖の遺伝子であった。ＩＬ１３−６２の重鎖及び軽鎖の配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される。
【０１０６】
ＩＬ１３−６２ランダムファージライブラリは、高使用量の４つの抗タンパク質ＳＤＲＵ残基（残基Ｈ９１、Ｎ９２、Ｅ９３、及びＹ９４）のバリエゲーションによって生成した。このライブラリは、ＮＮＫコドンを使用する完全な多様性を導入するように設計され、理論上の多様性である１．９×１０5の変異型をもたらした。
【０１０７】
Ｆａｂライブラリは、米国特許第６，４７２，１４７号及びＷＯ２００９０８５４６２Ａ１号に記述されているｐｌＸファージディスプレイシステムにおいて構築した。ＩＬ１３−６２は、Ｌｃ６及びＨｃ２の可変領域を含有するダイシストロニック（dicistronic）単位として発現した。ライブラリは、標準の方法を用いて、入れ子になったＰＣＲによって、３つのフラグメントから組み立てられた。完全な長さのフラグメントをクローンして、ファージベクターｐＣＮＴＯ−ｌａｃｌ−ｐｌＸに導入した。
【０１０８】
軽鎖ＣＤＲ３ファージライブラリを、Ｒ１３０Ｑ置換を有するビオチニル化ＩＬ−１３（ニュージャージー州ロッキーヒル所在のＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）に対してパニングした（ＩＬ−１３野生型アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されている）。端的に、パニングの前に、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビード（カリフォルニア州カールスバッド所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（カリフォルニア州テメキュラ所在のＣｈｅｍｉｃｏｎ）でブロックした。同様に、ＣＤＲＬ３ファージライブラリを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｔ）とともにトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）にて１：１に希釈したＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒにて、室温で３０分間、予めブロックし、次いで、予吸着工程において、ＣＤＲＬ３ライブラリを、ブロックされた磁性ビードを用いて培養して、特異的でないバインダーをライブラリから取り除いた。次いで、３回連続パニングするために、ビオチニル化ＩＬ−１３変異型Ｒ１３０Ｑを異なる濃度（１０ｎＭ〜０．０１ｎＭ）でファージライブラリに添加した。磁性ビードを用い、抗原結合したファージを捕らえ、指数関数的に成長する大腸菌ＴＧ−１細胞１ｍＬを添加し（ＯＤ（６００ｎｍ）＝０．５）、３７℃で３０分間培養して、レスキューした。次いで、ファージを生成し、次のパニングのために準備した。Ｆａｂ−ｐｌＸは、ＴＧ−１コロニーのバクテリア細胞租溶解物から生成した。
【０１０９】
ＣＤＲＬ３ライブラリの質は、１９２のランダムに取り出したクローンの配列を決定することによって評価した。１９２のうち１７８は少なくとも８０％の配列カバレッジを有していた（Ｎｈｅｌ部位からＲｓｒＩＩまで）。１７８のうち１６３（９２％）は挿入及び／又は削除（すなわち、使用可能なクローンのパーセンテージ）を有さず、１６３のクローン全てが固有のものであった。残基の分布は、自社占有プログラムを使用して、配列カバレッジを有する全てのクローンを元に計算した。
【０１１０】
ハイスループットのシングルポイント（１０ｎＭ）ＥＬＩＳＡを使用し、得られた変異型をランキングした。ＴＢＳ中で、Ｂｌａｃｋ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（デンマークのロスキルド所在のＮｕｎｃ）に１μｇ／ｍＬのヒツジ抗Ｆｄ抗体（ヒトＩｇＧのＣＨ１ドメインを結合）を４℃で一晩コーティングした。プレートをＴＢＳＴ中で５回洗浄し、次いで、室温で１時間、５０％Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／ＴＢＳＴにてブロッキングした。租Ｆａｂ−ｐｌＸ細胞溶解物５０μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間、培養した。プレートを洗浄し、１０％Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／ＴＢＳＴにて希釈された一定の希釈範囲のビオチニル化ＩＬ１３Ｒ１３０Ｑ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）をそれらのウェルに添加し、室温で１時間培養した。平行プレートにて、１：５，０００希釈（１０％Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／ＴＢＳＴにて）でＨＲＰ共役ヤギ抗Ｆａｂ抗体（ペンシルベニア州ウェストグローブ所在のＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、Ｆａｂの捕獲を検出した。ビオチニル化ＩＬ１３Ｒ１３０Ｑは、１：５，０００希釈のストレプトアビジン−ＨＲＰによって検出した。最終洗浄後、化学発光基質（Ｒｏｃｈｅ販売元の指示に従って調製したＰＯＤ）を添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎの計器（マサチューセッツ州ウォルサム所在のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でプレートを計測した。いくつかの変異型は、使用した対照Ｆａｂ（親ネズミＩＬ１３−６２Ｆａｂ及びネズミとヒトのキメラＦａｂＩＬ１３−１６７）に比べて高い化学発光信号を示した。
【０１１１】
Ｆａｂ−ｐｌＸ形式での高い結合信号及び配列解析に基づき、関心対象のクローンは、完全なＩｇＧ ｍＡｂ形式に変換された。ファージスクリーンからのＦａｂを制限酵素で消化し、ＣＭＶプロモーターベクターｐＵＮＤＥＲにクローンし、配列を確認した。Ｌｃ６変異型を、Ｈｃ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）と、又はグルタミン酸塩、セリン、バリン、グルタミン又はロイシンの代わりに位置３４及び１００にメチオニンを有するＨｃ２と、ペアリングした。得られたＦａｂを、ヒトＩｇＧ１を含有するベクターにおいてクローンし、標準の方法を用いて精製した。
【０１１２】
選択された抗体の親和性は、ＥＬＩＳＡ及びＢｉｏａｃｏｒｅ（商標）によって決定し、表５に示した。最も優れた１０の親和性成熟された変異型の親和性は、１０ｐＭの範囲以上であった。
【０１１３】
抗ＩＬ１７抗体の親和性成熟
親和性成熟のために選んだＩＬ１７の抗体ＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２は、ヒトフレームワーク適合された変異型の、ハイブリドーマＣ１８６３Ａによって選択された親マウス抗体のＩｇＧ１サブタイプであった。フレームワーク配列は、Ｈｃ９〜Ｌｃ４であり、Ｈｃ１１重鎖遺伝子についてはＩＬ−１７Ｍ７０、Ｌｃ２軽鎖遺伝子についてはＩＬ−１７Ｍ８２とした。ＩＬ−１７Ｍ７０の重鎖及び軽鎖の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４にそれぞれ示されており、ＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖及び軽鎖の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６にそれぞれ示されている。ヒトＩＬ−１７に対する抗体の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、ＩＬ−１７Ｍ７０では４３８ｎＭであり、ＩＬ−１７Ｍ８２では４３１ｎＭであった。ＩＬ−１３抗体ＩＬ１３−６２の親和性成熟に使用した方法は、基本的に上述の通りである。
【０１１４】
ファージの成熟のためのＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２ライブラリは、ｐＣＮＴＯ−Ｆａｂ−ｐＩＸにおいて構築した。タンパク質ＳＤＲＵ残基（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、及びＣＤＲ−Ｈ２のｐＳＤＲＵ）をランダマイズすることによって構築した。各抗体の２つのライブラリ（ＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２の重鎖ライブラリとＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｌ３の軽鎖ライブラリ）を合成したライブラリでランダマイズされた残基は、コチア残基Ｈ３２、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、及びＬ９６である。
【０１１５】
軽鎖ライブラリのベクターは、親重鎖配列を有していた（ＩＬ−１７Ｍ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）についてはＨｃ９、及びＩＬ−１７Ｍ８２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）についてはＨｃ１１）。
【０１１６】
【表５−１】
【０１１７】
【表５−２】
【０１１８】
同様に、重鎖ライブラリのベクターは親軽鎖配列を有する（ＩＬ−１７Ｍ７０についてはＬｃ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）及びＩＬ−１７Ｍ８２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）についてはＬｃ２）。
【０１１９】
ＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２の軽鎖及び重鎖の配列、ｐＳＤＲＵ、コチア及びカバット記述を図１１に示す。ライブラリの残基のうち、ランダマイズされたものに下線を付した。ライブラリの合成は、各位置に、メチオニン、システイン、リシン、グルタミン、グルタミン酸塩を除く全てのアミノ酸を導入するように設計された。ライブラリの理論上の多様性は２×１０9メンバーであった。ライブラリのサイズを制限するために、ｐＳＤＲＵ残基（Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ５０ａ、及びＬ９１）はランダマイズしなかった。得られたライブラリによってコードされたアミノ酸配列は、ＩＬ−１７Ｍ７０についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に、及びＩＬ−１７Ｍ８２についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されている。
【０１２０】
形質転換されたライブラリプレートからのファージ調製及びパニングは、上述のように、１０ｎＭ〜０．０１ｎＭの様々な濃度でビオチニル化ヒトＩＬ−１７Ａ Ｋ３Ｒ／Ｋ７４Ｑ／Ａ１３６Ｑ変異型を使用して実行した（ＩＬ−１７野生型はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されている）。第２回及び第３回目のパニングからのコロニーを、Ｆａｂの精製及び配列の決定のために取り出した。ＦａｂのＥＬＩＳＡ及び配列解析に基づいて、親Ｆａｂより優れた結合信号を有する固有のクローンが識別された。ＩＬ−１７Ｍ７０ライブラリからの合計６の重鎖及び１４の軽鎖と、ＩＬ−１７Ｍ８２ライブラリからの９の重鎖及び２２の軽鎖の配列を決定した。それらの重鎖及び軽鎖変異型の配列を図１２に示す。選択された重鎖及び軽鎖をｍＡｂに変換し、標準のプロトコルを用いてマトリックストランスフェクションにて発現させた。１２ｎｇ／ｍＬでのヒトＩＬ−１７Ａ変異型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）への結合率（％）をＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２の両方の変異型Ｆａｂについて評価し、それぞれ表６及び７に示した。更なる特性評価のために、それぞれの親の４つの変異型ｍＡｂを選択した（表８）。結果すなわち特性を表９に示す。親和性成熟されたｍＡｂは、ＩＬ１７に対して、親抗体に比べて最高２倍の改善された親和性を有していた。
【０１２１】
【表６】
【０１２２】
【表７】
【０１２３】
【表８】
【０１２４】
【表９】
【０１２５】
以上のように、本発明の全てを説明してきたが、当業者には、添付の請求項の意図又は範囲から逸脱せずに本発明に多くの変更及び修正を行うことが可能であることは明白となるであろう。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体をヒト化及び親和性成熟する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの治療用として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可を受けた抗体は２０種類以上あり、ほぼ同数の抗体が臨床実験の後期にある（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｓｔｒｏｈｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｂｅｎｃｈ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００９）。これまでに記述されてきた全ての抗体療法は、多大な量及び複数の用量を必要とするため、抗体系の薬剤を開発するときには、免疫原性が重要な懸念である（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｄ：Ｄｕｂｅｌ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００７）。ファージディスプレー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５〜１６，２００５）、又はヒト抗体遺伝子レパートリーを有するトランスジェニックマウスの免疫付与（Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｄ：Ｄｕｂｅｌ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００７）といった濃縮技術による、生体外でのヒト抗体の発見は、ヒト抗体を生成するための強力な手段を提供してきた。ヒト化の方法はこの１０年間に多様化してきており、ヒト化抗体の数は継続した安定成長を示してきた（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １３：１６１９〜３３，２００８）。
【０００３】
抗体ヒト化の方法は、ヒトに適用されたときに最小の免疫原性を伴う一方で親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持する分子を生成するように設計される。ヒト化は、ネズミ抗体可変（Ｖ）ドメインをヒト定常（Ｃ）ドメインと組み合わせて、ヒトの含有量が〜７０％である分子を生成するキメラ化とともに始まった（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１〜５，１９８４）。キメラ抗体は親マウス抗体の特異性を保持し、かつその免疫原性を減退することに成功したが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答は、なお誘導された（Ｈｗａｎｇ ａｎｄ Ｆｏｏｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：３〜１０，２００５）。
【０００４】
ヒト抗体における非ヒト配列の使用を最小限にするための改善された方法としては、相補的決定領域（ＣＤＲ）グラフト法（米国特許第５，２２５，５３９号（Ｗｉｎｔｅｒ））が挙げられる。いくつかのケースでは、ヒトフレームワーク内でヒトＣＤＲの代わりにげっ歯類抗体由来のＣＤＲを使うことで抗原結合親和性の転移が十分に行われたが（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５，１９８６；Ｖｅｒｈｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜３６，１９９８）、他のケースでは、１つ又は複数のフレームワーク残基を追加的に置換する必要があった。例えば、Ｑｕｅｅｎ（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９〜３３，１９８９）は、米国内で治療用として最初にＦＤＡに認可された抗体をヒト化した（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））。Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）は、ネズミ抗体との相同性を最大限にするようにヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を選択することによって生成された。マウス抗体のコンピュータモデルを案内として、ＣＤＲ又は抗原と相互作用する、ＣＤＲの外のいくつかのネズミのアミノ酸が識別された。これらの残基は、親和性を改善するためにヒト化抗体において復帰突然変異した（back-mutated）。
【０００５】
更なる研究において、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ（Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７〜９９，１９９２）は、それらのＣＤＲの元となっている３０の残基（ＶＨに１６とＶＬに１４）が、ＨＶループ構造の安定化及びそれらの位置決めの修正に関与し、それ故、その抗体の親和性に関与している、と予測した。この領域はバーニヤゾーン（ＶＺ）と呼ばれ、それを画定する残基はバーニヤ残基（ＶＲ）と呼ばれる。ＶＲにおける復帰突然変異、及びＶＨ：ＶＬインターフェイスに関与する残基における復帰突然変異は、ＣＤＲグラフトの後に、与えられた抗体の親和性を回復する方法として、記述されてきた（Ｃａｒｔｅｒ及びＰｒｅｓｔａに与えられた米国特許第６，６３９，０５５号）。
【０００６】
リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９〜９８，１９９１）、超ヒト化（Superhumanization）（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９〜２５，２００２）、ヒトストリング含有量最適化（Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１９８６〜９８，２００７）のような異なるパラダイムに基づくヒト化の方法もまた、開発されてきた。ＣＤＲグラフト法と同じく、これらの方法は、非ヒト抗体及びヒト抗体の構造及び配列の比較解析によって、ヒト化プロセスが最終生成物に与える潜在的影響を評価する。これらの方法に共通しているのは、関心対象の結合又は他の任意の特性を試験するために、いくつかのヒト化変異型を生成することである。設計された変異型が不十分であることが実証された場合、設計及び結合評価の新しいサイクルが開始される。したがって、これらの方法は、抗体ヒト化のための合理的な戦略として分類され得る。
【０００７】
ファージディスプレー法及びハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法は、多数の抗体変異型の組み合わせライブラリの探求及び関心対象の変異型の選択のための効率的なツールとして出現した（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５，１９９０）。これらの技法は、設計サイクルでなく選択に基づく方法の創出を刺激する抗体ヒト化プロトコルに適用されてきた。誘導選択（Guided Selection）（Ｏｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１〜８，２００５）と呼ばれる、これらの方法の１つは、ＦＤＡの認可を受けた最初のヒト抗体（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９〜９０３，１９９４）であるＨｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）を生成した。大きい組み合わせライブラリの選択に依存する誘導選択及び他のヒト化の戦略は、最終的なヒト化された生成物への変異の影響をほとんど仮定しておらず、したがって、これらの技法は、抗体のヒト化のための経験的方法と呼ばれる場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗原及び他の望ましい生物活性に対する高い親和性の保持を伴う抗体のヒト化では、治療用として有用なものにすべく、免疫原性を低減するために元の非ヒト配列を置換することと、十分な抗原結合を保持するためにヒト化された分子を必要とすることとの間の釣り合いを取ることが要求される。したがって、抗体のヒト化及び親和性の成熟のための改善された方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の一態様は、抗体をヒト化する方法であって、
非ヒト抗体可変領域のアミノ酸配列を得る工程と、
前記非ヒト抗体可変領域の第１のカノニカル構造クラスを決定する工程と、
生殖細胞系列遺伝子によってコードされるヒト抗体可変領域のアミノ酸配列の第１のライブラリを得る工程と、
前記第１のライブラリから、アミノ酸配列の一群を選択する工程と、
（この選択する工程は、前記第１のライブラリのそれぞれのアミノ酸配列に関する第２のカノニカル構造クラスとＳＤＲＵランクスコアとを決定する工程と、前記第１のカノニカル構造クラスと同一の第２のカノニカル構造クラスを有し、最高のＳＤＲＵランクスコアを更に有する、アミノ酸配列の一群を前記第１のライブラリから識別する工程と、を含む）
ヒト化抗体を生成するために、上で選択されたアミノ酸配列の群において、ＳＤＲＵ残基を、対応する非ヒトＳＤＲＵ残基と置換する工程と、を含む、方法。
【００１０】
本発明の別の態様は、抗体の親和性成熟の方法であって、
前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
前記抗体内の親和性決定残基（ＡＤＲ）を決定する工程と、
少なくとも１つのＡＤＲ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
前記ライブラリを宿主において発現する又は前記ライブラリを生体外で翻訳する工程と、
前記ライブラリから、対抗原に対する改善された親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【００１１】
本発明の別の態様は、親和性成熟された抗体を作製する方法であって、
前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
前記抗体内の特異性決定残基使用（ＳＤＲＵ）残基を決定する工程と、
少なくとも１つのＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
前記ライブラリを宿主において発現する又は前記ライブラリを生体外で翻訳する工程と、
前記ライブラリから、対抗原に対する改善された親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】重鎖のカバット付番方式とコチア付番方式、ＣＤＲ、ＨＶ、ＳＤＲＵ残基、ＡＤＲ、及びＶＲ間の対応黒は残基を示す。ＳＤＲＵに関しては、閾値≧０．３灰色：ＳＤＲＵ残基、閾値＜０．３。薄い灰色：割り当てされず。
【図２】軽鎖のカバット付番方式とコチア付番方式、ＣＤＲ、ＨＶ、ＳＤＲＵ残基、ＡＤＲ、及びＶＲ間の対応黒は残基を示す。ＳＤＲＵに関しては、閾値≧０．３灰色：ＳＤＲＵ残基、閾値＜０．３。薄い灰色：割り当てされず。
【図３】ヒト生殖細胞系列のＩＧＶＨ遺伝子レパートリー及びカノニカル構造クラス。
【図４】ヒト生殖細胞系列のＩＧＶκ遺伝子レパートリー及びカノニカル構造クラス。
【図５】ヒト生殖細胞系列のＩＧＨＪ及びＩＧκＪレパートリー。
【図６】抗ＣＤ１４７抗体４Ａ５重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列。ＣＤＲ（カバット）、ＨＶループ（コチア）及びＳＤＲＵ残基（ｐＳＤＲＵ）が指示されている。
【図７】Ａ４５の潜在的ヒトスカフォールドのＳＤＲＵランクスコア。ＶＨに関しては、最も高いスコアの３つの遺伝子のみが示されている。
【図８】ＡＤＲライブラリの設計ＳＤＲＵ残基にはアスタリスクが付されており、ＡＤＲの位置は「Ｘ」で表されている。置換されたＳＤＲＵ残基には下線が付されている。
【図９】ヒトＣＤ１４７のＨｉｓタグ付きＮ末端ドメインでの３回のパニング後に選択されたＶＨ配列変異型。
【図１０】ＶＨ変異型におけるＡＤＲの位置で表されるアミノ酸のロゴ図ロゴプロットの各列は、文字のスタックとしてアミノ酸頻度を表しており、各文字の高さは、各アミノ酸の観察された頻度に比例する。
【図１１】抗ＩＬ−１７抗体ＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列。ＣＤＲ（カバット）、ＨＶループ（コチア）及びＳＤＲＵ残基（ｐＳＤＲＵ）が指示されている。
【図１２ａ】ヒトＩＬ−１７ Ｋ３Ｒ／Ｋ７４Ｑ／Ａ１３６Ｑ変異型での３回のパニングの後に選択されたＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２変異型ＶＬアミノ酸配列及びＶＨアミノ酸配列。Ａ）ＩＬ−１７Ｍ７０の重鎖Ｂ）ＩＬ−１７Ｍ７０の軽鎖Ｃ）ＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖、Ｄ）ＩＬ−１７Ｍ８２の軽鎖の変異型配列。
【図１２ｂ】ヒトＩＬ−１７ Ｋ３Ｒ／Ｋ７４Ｑ／Ａ１３６Ｑ変異型での３回のパニングの後に選択されたＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２変異型ＶＬアミノ酸配列及びＶＨアミノ酸配列。Ａ）ＩＬ−１７Ｍ７０の重鎖Ｂ）ＩＬ−１７Ｍ７０の軽鎖Ｃ）ＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖、Ｄ）ＩＬ−１７Ｍ８２の軽鎖の変異型配列。
【図１２ｃ】ヒトＩＬ−１７ Ｋ３Ｒ／Ｋ７４Ｑ／Ａ１３６Ｑ変異型での３回のパニングの後に選択されたＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２変異型ＶＬアミノ酸配列及びＶＨアミノ酸配列。Ａ）ＩＬ−１７Ｍ７０の重鎖Ｂ）ＩＬ−１７Ｍ７０の軽鎖Ｃ）ＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖、Ｄ）ＩＬ−１７Ｍ８２の軽鎖の変異型配列。
【図１２ｄ】ヒトＩＬ−１７ Ｋ３Ｒ／Ｋ７４Ｑ／Ａ１３６Ｑ変異型での３回のパニングの後に選択されたＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２変異型ＶＬアミノ酸配列及びＶＨアミノ酸配列。Ａ）ＩＬ−１７Ｍ７０の重鎖Ｂ）ＩＬ−１７Ｍ７０の軽鎖Ｃ）ＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖、Ｄ）ＩＬ−１７Ｍ８２の軽鎖の変異型配列。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載した、特許及び特許出願を含む（ただし限定せず）全ての出版物は、参照によりその全文がここに明記されたかのように組み込まれる。
【００１４】
本明細書及び請求項の範囲において使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」には、その文脈が明確に異なって指定しない限り、複数の言及が含まれる。したがって、例えば、「ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」という言及は、１つ以上のポリペプチドの言及であり、当業者には既知のその同等物を含む。
【００１５】
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者に慣例的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記述したものと同様又は同等の何らかの組成物及び方法を本発明の実践又は試験に使用することができるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記述する。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は広義であって、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む免疫グロブリン又は抗体分子、ネズミのような非ヒト、ヒト、ヒト適応型、ヒト化、及びキメラのモノクローナル抗体、並びに抗体フラグメントを含む。抗体は、抗体全体及び任意の抗原結合フラグメント、又はその単鎖を含む。天然発生する抗体は、４つのポリペプチド鎖と、２つの同一の重鎖と、２つの同一の軽鎖とを備える。それぞれの重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それを多数の定常ドメイン（ＣＨ）が追従している。それぞれの軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、もう一方の端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。任意の脊椎種の抗体の軽鎖に、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と名づけられた明確に区別される２つのタイプのうち１つを、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、割り当てることができる。
【００１７】
免疫グロブリンは、定常ドメインの重鎖のアミノ酸配列に依存して、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥと名づけられた５つの主要なクラスに割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４として更に細かく分類される。
【００１８】
本明細書で用いられる「抗体フラグメント」とは、損なわれていない抗体の一部、概して、損なわれていない抗体の抗原結合領域又は可変領域を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジアボディ、単鎖抗体分子、及び少なくとも２つの損なわれていない抗体で形成された多特異性（multispecific）抗体を含む抗体フラグメントが挙げられる。
【００１９】
本明細書で用いられる「抗体可変領域」とは、抗原結合部位のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と、フレームワーク領域（ＦＲすなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）とを含む抗体分子の軽鎖及び重鎖の部分を指す。軽鎖可変領域（ＶＬ）は、抗体Ｖ及びＪセグメント遺伝子によってコードされ、重鎖可変領域（ＶＨ）は、抗体Ｖ、Ｄ、Ｊセグメント遺伝子によってコードされる。ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子ｌｏｃｉ（loci）、抗体遺伝子構造、遺伝子再配列のゲノム組織は周知である。
【００２０】
「ヒト化抗体」は、非ヒト種からの抗原結合部位の１つ以上のアミノ酸と、ヒト由来のフレームワーク配列とを含有する抗体である。定常領域が存在してよく、ヒトの配列、例えばヒト生殖細胞系列の配列由来であるか、又は自然発生する抗体由来である場合がある。ヒト化抗体は、例えば親和性又は特異性を向上するために、非ヒト種からのフレームワーク領域アミノ酸の１つ以上のアミノ酸を有することができる。このヒト化抗体は、１つ以上のクラスのアイソタイプからの配列を含むことが可能であり、特定の定常ドメインを選択して、例えば細胞毒性活性など所望のエフェクタ機能を最適化することは、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。
【００２１】
本明細書で用いられるとき、用語「完全な長さの抗体」とは、少なくとも２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む、実質的に損なわれていない形状にある抗体を指す。この用語は、特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。完全な長さの抗体は、非ヒト、ヒト、ヒト化、及び／又は親和性成熟されたものである場合がある。
【００２２】
本明細書で用いられる「親和性成熟された抗体」とは、可変領域に１つ以上の置換を有する抗体であり、それらの置換を有さない親抗体と比べ、抗原に対して改善された抗体の親和性をもたらす。代表的な親和性成熟された抗体は、少なくとも１つのＡＤＲ残基に置換を有する。
【００２３】
本明細書で用いられる「親和性」とは、抗体と配位子との間の相互作用の強度を指す。抗体の親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって表される。典型的には、抗体は、１０-7Ｍ以下、１０-8Ｍ以下、１０-9Ｍ以下、又は１０-10Ｍ以下の解離定数（ＫD）で、既定の抗原と結合する。本明細書で用いられる「改善された親和性」とは、親和性成熟された抗体のＫｄが親と比較して少なくとも２倍低減することを指す。抗体の親和性は、周知の方法、例えば競合的結合ＥＬＩＳＡアッセイ、ＢＩＯＡｃｏｒｅ（商標）又はＫｉｎＥｘＡを用いる表面プラズモン共鳴を用いて決定される。
【００２４】
免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）又は重鎖（ＶＨ）可変領域は、３つの「抗原結合部位」が介入する「フレームワーク」領域から成る。抗原結合部位は、次のような様々な表現を用いて記述される。
（ｉ）カバット（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５th Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）の定義による、抗体の可変配列内の「相補的決定領域」（「ＣＤＲ」）であり、これらは配列の可変性に基づく。可変重鎖及び可変軽鎖配列のそれぞれに３つのＣＤＲがあり、それぞれの可変領域はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と指定される。
（ｉｉ）「ハイパー可変領域」（「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」）は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）の定義による、構造的にハイパー可変である抗体の可変ドメインの領域を指す。概して、その抗原結合部位は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）とＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのハイパー可変領域を有する。
（ｉｉｉ）Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３）の提案による「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」は、免疫グロブリンとＴ細胞受容体からのＶドメインの比較に基づく。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、３つの領域の標準的な付番及び定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ、ＩＭＧＴの記述間の対応は、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３に記述されている。
（ｉｖ）抗原結合部位を形成する領域のもう１つの定義は、Ｐａｄｌａｎが記述したような「特異性決定残基」（「ＳＤＲ」）であり、配列の分析と利用可能な結晶構造情報との組み合わせによって定義される（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１３３〜９，１９９５）。
（ｖ）この抗原結合部位もまた、例えばタンパク質、ペプチド、ハプテンといった異なるタイプの抗原と接触する残基の数及び分布の正確な測定値である特異性決定残基使用量（ＳＤＲＵ）に基づいて記述され得る（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜４３，２００４）。ＳＤＲＵを決定するには、次の式を用いて一連の抗原・抗体接触を算出することができる。
ＳＤＲＵ＝１−［（ｃｍ−ｃｉ）／ｃｍ］
式中、ｃｍはＶＬ又はＶＨにおける接触の最大数であり、ｃｉは位置当たりの接触である。ＳＤＲＵ残基は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）にしたがって数えられる。ＳＤＲＵの範囲は０〜１が可能である。ＳＤＲＵ値≧０．７は、複合体の６７％より多くにおいて接触していることが見出されるＳＤＲに相当し、高使用量と定義される。ＳＤＲＵ値＜０．３は、複合体の３３％未満において接触していることが見出されるＳＤＲに相当し、低使用量と定義される。０．３〜０．７のＳＤＲＵ値は、中間使用量とみなされる。その位置でのＳＤＲＵスコアが≧０．３のとき、残基は、本明細書で用いられる「ＳＤＲＵ残基」である。いくつかの用途では、分析又は置換のためのＳＤＲＵ残基の数を増やすために、「ＳＤＲＵ残基」は０〜０．３のＳＤＲＵスコアを有する残基を含む場合がある。例えば、下の実施例１は、ヒト化プロセスの間に特異性及び親和性を保持するために非ヒト抗体からヒトスカフォールドに転移される残基の数を最大にするために、＞０のＳＤＲＵスコアを使用して、ヒト化のためのＳＤＲＵ残基を定義している。＞０．３又は＞０．７のＳＤＲＵスコアを使用して、例えば、特にＮＮＫコドンが使用されるときに、結果的に得られるライブラリの表現（representation）を増すために親和性成熟のためにバリエゲートされるＳＤＲＵ残基を定義することができる。
【００２５】
「カノニカル構造」は、ＨＶループの長さと、ＨＶ及びフレームワークに保存された残基とによって決定されるＨＶループ型であり、ＨＶ及びＨＬについてそれぞれ表１及び２に示されている（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７〜４８，１９９７）。
【００２６】
「カノニカル構造クラス」は、重鎖Ｈ１、Ｈ２又は軽鎖Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３のための組み合わされたカノニカル構造である。
【００２７】
「コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）残基」は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３，９２７〜４８，１９９７）にしたがって数えられた抗体ＶＬ残基及びＶＨ残基である。
【００２８】
本明細書で用いられる「対応するＳＤＲＵ残基」は、２つの異なる可変領域配列間、例えばヒトと非ヒトの可変領域配列間の位置に対応するＳＤＲＵ残基を指す。
【００２９】
「本明細書で用いられる「ＳＤＲＵランクスコア」は、同一残基（アイデンティティ）の数及び親配列内の対応するＳＤＲＵ残基間の類似に基づく、試験配列の相同性ランクスコアを指す。同一残基にはスコア値１が割り当てられる。類似残基にはスコア値０．５が割り当てられる。他の残基については、スコア値０が割り当てられる。その結果得られる「ＳＤＲＵランクスコア」は、個々のランクスコアの合計である。スコア値０．５を割り当てる類似残基の５つの群は、（ｉ）極性アミノ酸Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、（ｉｉ）非極性アミノ酸Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸Ｆ、Ｗ、Ｙ、（ｉｖ）酸性アミノ酸Ｄ、Ｅ、（ｖ）塩基性アミノ酸Ｈ、Ｋ、Ｒである。代表的な試験配列はヒト抗体重鎖可変領域アミノ酸配列であり、代表的な親配列は非ヒト抗体重鎖可変領域アミノ酸配列である。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位として定義されていない、可変領域の残りの配列である。抗原結合部位は上述のように様々な描写（delineation）によって定義され得るので、フレームワークの正確なアミノ酸配列は、抗原結合部位の描写に依存する。
【００３３】
「親和性決定残基」（ＡＤＲ）は、ＣＤＲ内にある非ＳＤＲＵ残基として定義され、ＣＤＲは次のように描写される。ＶＬからのＣＤＲ−１は残基２４〜３６を包含し、ＶＬからのＣＤＲ−２は残基４６〜５６を包含し、ＶＬからのＣＤＲ−３は残基８９〜９８を包含し、ＶＨからのＣＤＲ−１は残基２７〜３７を、ＶＨからのＣＤＲ−２は残基４７〜６１を、ＶＨからのＣＤＲ−３は残基９３〜１０３を、包含する（表１）。ＡＤＲは、ＳＤＲＵ残基の付近の残基を含む。ＡＤＲはＶドメインに埋め込まれている場合があり、ＨＶループの配座のために重要である場合があり、ＨＶループの構造及び位置づけの修正に関与する場合がある。ＳＤＲＵ残基は様々なＳＤＲＵスコアを使用して描写され得るので、可変領域内にある正確なＡＤＲ残基は、ＳＤＲＵ残基の描写に依存する。
【００３４】
「バーニヤ残基」（ＶＲ）は、ＨＶループ構造の安定及びそれらの位置づけの修正に関与すると特定された抗体の可変領域のフレームワークに宿る３０の残基である（Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：４８７〜９９，１９９２）。場合によっては、ＶＲは、カノニカル構造の維持に関与する残基と一致する（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７〜４８，１９９７）。
【００３５】
最もよく使用される２つの付番システムであるカバット（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５th Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）とコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）間の対応、及びＣＤＲ、ＨＶ、ＳＤＲＵ残基、ＡＤＲ、ＶＲを、それぞれ重鎖及び軽鎖について、図１及び２に示す。灰色で示されている残基は、ＳＤＲＵ及びＡＤＲについては定義されていない。図は、ＳＤＲＵスコアＸ≧０．３の残基を黒で、ＳＤＲＵスコア＜０．３の残基を灰色で示す。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。アミノ酸が３０未満の小タンパク質は「ペプチド」と呼ばれる場合がある。タンパク質はまた、「ポリペプチド」とも呼ばれる場合がある。
【００３７】
「融合タンパク質」は、少なくとも２つのポリペプチドと、それら２つのポリペプチドを動作可能に連結して１つの連続したポリペプチドにするための連結配列とを含むタンパク質である。融合ポリペプチド内の連結された２つのポリペプチドは、典型的には、２つの独立のソースから派生しており、したがって、融合ポリペプチドは、通常は自然界で連結しているものとして発見されることがない２つの連結したポリペプチドを含む。その連結配列はよく知られており、例えば、アミド結合又はグリセリンの豊富なリンカーを含む。代表的な融合タンパク質は、バクテリオファージコートタンパク質を有するＶＬ融合及びＶＨ融合であり、例えば、ｐＩＩＩ、又はｐＶＩＩ、又はｐＩＸ（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６０２５〜３０，１９９９）である。融合タンパク質は周知の方法を用いて作製される。
【００３８】
抗体の「望ましい生物活性」は、例えば、強化又は改善された結合力、強化又は改善された親和力、オンレート、オフレート、特異性、半減期、低減された免疫原性、多様な宿主からの効率的な発現及び生成、抗体安定性、良好な溶解特性、又は他の任意の好適な特性を含む。
【００３９】
本明細書で用いられる「生殖細胞系列遺伝子」は、特定の免疫グロブリンの発現のための遺伝的再配列及び変異につながる成熟プロセスを経ていない非リンパ細胞によってコードされる免疫グロブリン配列である。
【００４０】
本明細書で用いられる「抗体の可変領域のペアリング」は、完全な長さの自然発生する抗体を形成するための、生体内におけるＶＨ及びＶＬの結合を指す。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子レパートリーは、約４０の重鎖、３５のカッパ及び３０のラムダ官能性Ｖ遺伝子から成る。特定のＶセグメント遺伝子によってコードされる重鎖と軽鎖のランダムな結合の代わりに、ランダムでないやり方で自然の抗体において生じる特定の軽鎖及び重鎖に向けてバイアスが存在する（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：８９５〜９０１，１９９９）。ヒト化のためのフレームワークドナーとして重鎖及び軽鎖のＶセグメント生殖細胞系列遺伝子を選択するとき、好ましいのは、生体内で対になっているＶ遺伝子である。
【００４１】
用語「置換する」又は「バリエゲートする」又は「変異する」又は「多様化する」は、互換性を持って使用することができ、本明細書で使用されるとき、ペプチド又はタンパク質の配列における１つ以上のアミノ酸を変更して、その配列の変異型を生成することを指す。
【００４２】
本明細書で用いられるとき、「変異型」は、参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドと異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指し、変更された特性を有しても有さなくてもよい。変異型又は参照ポリペプチドは、１つ以上の修正によって、例えば置換、挿入、又は削除によって、アミノ酸配列が異なっている場合がある。
【００４３】
本明細書で用いられるとき、「ライブラリ」は、１つ以上の変異型の集合を指す。
【００４４】
本明細書で用いられるとき、「スカフォールド」は、ヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされる軽鎖又は重鎖の可変領域のアミノ酸配列を指す。したがって、スカフォールドは、フレームワークと抗原結合部位の両方を包含する。
【００４５】
本発明は、抗体のヒト化及び親和性成熟方法を説明する。
【００４６】
抗体のヒト化方法
特異性決定残基リサーフェシング（ＳＤＲＲ）
特異性決定残基リサーフェシング（ＳＤＲＲ）は、抗体をヒト化する方法である。ＳＤＲＲは、（ｉ）スカフォールドの選択のためにＳＤＲＵランクオーダーを利用すること、及び（ｉｉ）ＳＤＲＵ残基の置換によって、非ヒト抗体の特異性をその選択されたスカフォールドに転移することにおいて、公開された方法と異なる。
【００４７】
公開されたヒト化方法において、非ヒト抗体の特異性は、ＣＤＲ（米国特許第５，２２５，５３９号（Ｗｉｎｔｅｒ）、米国特許第６，８８１，５５７号（Ｆｏｏｔｅ））又はＳＤＲ（米国特許第６，８１８，７４９号（Ｋａｓｈｍｉｒｉ））の変異によってヒトのスカフォールドに転移され、所望により、カノニカル構造の保持（米国特許第５，６９３，７６１号（Ｑｕｅｅｎ））又はＨＶループの位置づけ（米国特許第６，６３９，０５５号（Ｃａｒｔｅｒ））において重要ないくつかのフレームワーク残基の復帰突然変異を伴う。ヒトのスカフォールドは、生殖細胞系列の遺伝子との相同性（Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３〜７２，２００４）、体細胞又はコンセンサス免疫グロブリン可変領域遺伝子に基づいて選択され、場合によっては、ＣＤＲ又はカノニカル構造の相同性の評価によって、更に選択される（米国特許第６，８８１，５５７号（Ｆｏｏｔｅ））。上述の方法によってヒト化される残基同士の対応を、図１及び２に示す。
【００４８】
先行のヒト化方法に勝るＳＤＲＲの利益は、ＳＤＲＵ残基の正確な定義のおかげで、選択されたスカフォールドに最小限の数の非ヒト残基を転移し得ること、及び、タンパク質、ペプチド、又はハプテンのようなジェネリックな配位子の異なる型を認識するヒト化プロトコルを抗体に合わせてカスタマイズすることにより、ヒト化抗体の潜在的な免疫原性を低減する可能性である。
【００４９】
ＳＤＲＵ残基は、抗体の新たなライブラリを生成するために置換されてきたが、集中的ライブラリでのヒト化又は親和性成熟の試みはまだ成されていない（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５７，６０７〜６２０，２００６；Ｃｏｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３７８：６２２〜６３３，２００８）。
【００５０】
発明の一実施形態は、抗体をヒト化する方法であって、
ａ．非ヒト抗体可変領域のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記非ヒト抗体可変領域の第１のカノニカル構造クラスを決定する工程と、
ｃ．生殖細胞系列遺伝子によってコードされるヒト抗体可変領域のアミノ酸配列の第１のライブラリを得る工程と、
ｄ．前記第１のライブラリから、アミノ酸配列の一群を選択する工程と、
ｉ．この選択する工程は、前記第１のライブラリのそれぞれのアミノ酸配列に関する第２のカノニカル構造クラスと、ＳＤＲＵランクスコアとを決定する工程と、
ｉｉ．前記第１のカノニカル構造クラスと同一の第２のカノニカル構造クラスを有し、最高のＳＤＲＵランクスコアを更に有する、アミノ酸配列の一群を前記第１のライブラリから識別する工程と、を含む）
ｅ．ヒト化抗体を生成するために、工程ｄ）で選択されたアミノ酸配列の群において、ＳＤＲＵ残基を、対応する非ヒトＳＤＲＵ残基と置換する工程と、を含む、方法。
【００５１】
上記の実施形態の方法は、本明細書において、「ＳＤＲＲ」（「特異性決定残基リサーフェシング」）と名づけられる。
【００５２】
非ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、よく知られた方法、例えば、ゲノムクローニング又はＰＣＲクローニング及びその後のＤＮＡ塩基配列決定法によって配列を決定することによって得ることができる。非ヒト抗体は、ヒト以外の任意の種からの抗体、例えばげっ歯類、ラクダ、又はサルの抗体を含む。
【００５３】
本発明の方法では、ヒトのスカフォールドは、カノニカル構造クラスのアイデンティティ及び非ヒト抗体に対するＳＤＲＵランクスコアに基づいて生殖細胞系列遺伝子によってコードされたヒト抗体可変領域のアミノ酸配列ライブラリから選択される。生殖細胞系列Ｖセグメント遺伝子をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３の選択に使用し、生殖細胞系列Ｊセグメント遺伝子をＦＲ４の選択に使用する。
【００５４】
生殖細胞系列遺伝子配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ＿／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）からダウンロードすることができる。図３及び４は、ＩＭＧＴからコンパイルされたヒト「０１」生殖細胞系列ＩＧＶＨ及びＩＧＶκ遺伝子、及びそれらがコードするカノニカル構造クラスのリストである。図５は、ＩＧＨＪ及びＩＧκＪ Ｊセグメント遺伝子のヒト配列を示す。免疫原性の可能性がある体細胞の変異を避けるために、ヒト生殖細胞系列遺伝子は、コンセンサス配列又は成熟配列の代わりにヒトフレームワークのソースとしてますます利用されるようになってきている（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９，２００８）。加えて、生殖細胞系列の遺伝子は、改善された塑性及びフレキシビリティをもたらして、ヒト抗体の親和性を回復するためのＦＲへの復帰突然変異をほとんど又は全く伴わずに多様な抗原結合部位を許容することが可能である（Ｗｅｄｅｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１６６５〜９，１９９７；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：１３７２２〜７，２００６；Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３〜７２，２００４）。
【００５５】
カノニカル構造クラスは、表１及び２に記載したパターンにしたがって決定される。ヒト以外の種からのいくつかの抗体又は免疫反応の成熟の産物であるいくつかのヒト抗体は、ヒトゲノムにコードされていないカノニカル構造型を有する（Ａｌｍａｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１１９９〜１２１４，１９９７；Ａｌｍａｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４７：３５５〜６３，１９９８）。例えば、いくつかのネズミ生殖細胞系列遺伝子は、Ｌ１にて１型及び５型をコードする。これらのカノニカル構造は、ヒト生殖細胞系列遺伝子には存在しない。そのような場合、類似のカノニカル構造を有するヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子が比較のために考慮される。例えば、非ヒト抗体に１型が見出される場合、２型を有するヒトＶκ配列を比較のために用いるべきである。非ヒト抗体に５型が見出される場合は、３型又は４型のいずれかを有するヒトＶκ配列を比較に使用すべきである。
【００５６】
非ヒト抗体の特異性は、その非ヒト抗体のＳＤＲＵ残基を置換して、選択されたヒトスカフォールド内に導入することによって、選択されたヒトスカフォールドに転移される。典型的には、選択されたスカフォールド内の全てのＳＤＲＵ残基は、非ヒトＳＤＲＵ残基と置換される。ＳＤＲＵ残基の置換は、周知の方法によって、例えばＰＣＲ変異誘発によって実行できる（米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ））。例えば、非ヒト抗体における、ＣＤＲ−Ｌ３については９４Ｌ、ＣＤＲ−Ｈ１については３１Ｈ、３３Ｈ、３５Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２については５２Ｈ、５３Ｈ、５４Ｈ、５６Ｈ、５８Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ３については残基９５Ｈ〜１０２Ｈを、選択されたスカフォールド内に置換することができる。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、生殖細胞系列遺伝子は、ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ、ＪＨ、Ｊκ、又はＪλ配列から選択される。
【００５８】
本発明の別の態様は、上述のように、抗体の可変領域のペアリングを評価することによって行われる、第１のライブラリからのアミノ酸配列の群の更なる選択である。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、抗体をヒト化する方法は、更に、
ｅ−ｉ：工程ｄ）で選択されたアミノ酸配列の群の親和力決定残基（ＡＤＲ）を決定する工程と、
ｅ−ｉｉ：少なくとも１つのＡＤＲ残基をバリエゲートすることによって、ヒト抗体可変領域のアミノ酸配列の第２のライブラリを生成する工程と、
ｅ−ｉｉｉ：宿主において前記第２のライブラリを表現する又は前記第２のライブラリを生体外で翻訳する工程と、
ｅ−ｉｖ：前記第２のライブラリから、望ましい生物活性を有する可変領域を選択する工程と、を含む。
【００６０】
本発明の方法では、ＡＤＲのバリエゲーションは、ＳＤＲＵ残基の置換によって、選択されたスカフォールド内に非ヒト抗体の選択性が転移された後に、親和性を保持、回復又は改善するように設計される。上で定義したＡＤＲ残基の重鎖及び軽鎖はそれぞれ図１及び２に示されている。少なくとも１つ、２つ、３つ、又はそれ以上のＡＤＲをバリエゲートすることができる。軽鎖又は重鎖のいずれかに宿るＡＤＲをバリエゲートすることができる。あるいは、ＡＤＲの定義されたサブセットをバリエゲートしてもよい。例えば、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈをバリエゲートするか、又はコチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、６１Ｈをバリエゲートする。ＡＤＲのバリエゲーションはいくつかの利益を提供する。例えば、非ヒト残基と、それらの周りのヒト残基との不適合性は、結果的に得られる抗体の親和性の損失を引き起こす場合がある。非ヒトループとヒトＨＶループの構造の違いは、抗体の特異性を定義する残基の異なる位置づけ、及びしたがって親和性の損失の原因となる場合がある。
【００６１】
少なくとも１つのＡＤＲ残基のバリエゲーションによって生成されたアミノ酸配列のライブラリは、本明細書で用いられるような「ＡＤＲライブラリ」である。ＡＤＲライブラリは、例えば、重鎖又は軽鎖可変領域変異型のライブラリである。ＡＤＲライブラリは、周知の方法を用いて生成することができる。例えば、ランダム置換を有するこのライブラリのＡＤＲ変異型は、２０の自然発生するアミノ酸全てをコードするＮＮＫコドンを用いて生成することができる。あるいは、ランダムでない置換を伴うＡＤＲ変異型を、例えば、１１のアミノ酸（ＡＣＤＥＧＫＮＲＳＹＷ）をコードするＤＶＫコドン及び１つの終止コドンを用いて生成することができる。あるいは、クンケル変異誘発法を使用して、ＡＤＲをバリエゲートしてもよい（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２，１９８７）。
【００６２】
標準のクローニング法を使用して、ＡＤＲライブラリをベクターにして発現する。ＡＤＲライブラリは、既知のシステムを用いて発現することができ、例えば、融合タンパク質としてそのライブラリを発現することができる。代表的な融合タンパク質は、ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、及びそれらの変異型のようなウィルスコートタンパク質を有するＡＤＲライブラリ変異型の融合である。融合タンパク質は、任意の好適なファージの表面にディスプレイすることができる。バクテリオファージの表面上に抗体フラグメントを含む融合ポリペプチドのディスプレイの方法は周知である（米国特許第６，９６９，１０８号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）、米国特許第６，１７２，１９７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）、米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒ）、米国特許第６，５８２，９１５号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）、米国特許第６４７２１４７号（Ｊａｎｄａ）、ＷＯ２００９０８５４６２Ａ１号）。ＡＤＲライブラリはまた、例えばリボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ，９４：４９３７，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｓｔ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７，１９９７）、又は他の無細胞システム（米国特許第５，６４３，７６８号（Ｋａｗａｓａｋｉ））を使用して生体外で翻訳することもできる。ＡＤＲライブラリは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、又はＦｖを含む様々なフォーマットで表現及びディスプレイすることができる。本発明の実施例１では、ＡＤＲライブラリは、バクテリオファージコートタンパク質ｐＩＸを伴う融合タンパク質として発現された（ＷＯ２００９０８５４６２Ａ１号（Ｐｉｎｇ））。
【００６３】
その結果得られたライブラリを、例えば、低減、強化、又は修正された結合力、親和性、オンレート、オフレート又は特異性といった望ましい生物活性又は他の任意の好適な特性の抗体又は抗体フラグメントのためにスクリーニングすることができる。例えば、本発明のヒト化抗体は、約１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、又は１０-12Ｍ以下のＫdを有する抗原と結合することができる。抗原に対する抗体の親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる。そのような方法は、当業者に既知のＢｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ計測、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合アッセイを利用することができる。
【００６４】
ＡＤＲライブラリを独立に使用して、任意の抗体又は抗体フラグメントの親和性を成熟することができる。
【００６５】
抗体可変領域を隔離し、完全な長さの抗体又は任意の所望の抗原結合性フラグメントを作るために使用すること、及び哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、細菌を含む任意の宿主において発現することができる。発現ベクター及び生体外の翻訳方法は周知である。哺乳類細胞は、ＳＰ２／０（アメリカ培養コレクション（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ヨーロッパ細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）ネズミ細胞株のようなハイブリドーマ又は骨髄腫の細胞株のような不死化細胞株を含む。代表的なヒト骨髄腫細胞株はＵ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６１）のようなチャイニーズハムスター由来卵巣（ＣＨＯ）株又はＤＧ４４が挙げられる。抗体の作製及び精製方法は、当該技術分野において周知である。
【００６６】
抗体の親和性を成熟する方法
高親和性の抗体に対する需要は年々増してきており、特に、親和性が用量に、及びしたがって潜在的に免疫原性及び生産コストに直接影響し得る、治療用の価値を有する抗体については、なおさらである。ランダム（Ｇｒｏｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１３：１２９〜３９，２００６）及び部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）法（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３８０９〜１３，１９９４）を含む、抗体の親和性を進化するための多くの戦略が報告されている。前者では、変化はＶ遺伝子全体にわたってランダムに導入され、ファージ、ｍＲＮＡ及びリボソームディスプレイのようなハイスループットスクリーニング法を用いて最良の変異型が選択される（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０：５１〜６７，２００４）。一方、部位特異的変異誘発法（ＳＤＭ）は、既定の残基に変異を導入するように設計され、ランダム変異誘発法に勝るその潜在的な利点は、導入される変化の結果を制御しやすいことである。
【００６７】
それにも関わらず、一般的なＳＤＭ法はなお、ランダマイゼーションのために標的とする残基を特定するという難題を抱えている。ファージ又はリボソームディスプレイのような分子ディスプレイ技法を使用すると、残基が追加されるごとにライブラリのサイズが指数関数的に増すので、制限された一式の残基のみがランダマイズされ得る。例えば、全ての位置において３２のコドンを導入する共通のＮＮＫ多様化スキームで構築されたライブラリは、残基の数ｎ毎に３２n増加する。制限クローニング及び形質転換によって構築されるファージライブラリは、通常、１０9〜１０10メンバーというサイズに制限されるので、そのライブラリに完全な配列を収録しようとする場合、これは、６〜７残基のみを標的にできることを意味する。したがって、ランダマイゼーションのための主要な位置を正確に特定する方法が強く求められてきた。本発明の方法は、例えばＡＤＲ及びＳＤＲＵ残基など既定の位置を標的として置換する２つの親和性成熟法を提供する。
【００６８】
ＡＤＲライブラリを用いる親和性成熟
本発明の別の実施形態は、抗体の親和性成熟の方法であって、
ａ．前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記抗体の親和性決定残基（ＡＤＲ）を決定する工程と、
ｃ．少なくとも１つのＡＤＲ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
ｄ．前記ライブラリを宿主において発現する又は生体外で翻訳する工程と、
ｅ．前記ライブラリから、改善された対抗原親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【００６９】
本発明の方法を用いて、任意の抗体の親和性成熟が可能である。例えば、げっ歯類又はサルなど非ヒトの、ヒトの、キメラの、又はヒト化された、任意の抗体を使用することができる。少なくとも１つ、２つ、３つ、又はそれ以上のＡＤＲをバリエゲートすることができる。軽鎖又は重鎖のいずれかに宿るＡＤＲをバリエゲートすることができる。あるいは、ＡＤＲの定義されたサブセットのバリエゲーションを行ってもよい。
【００７０】
本発明の別の態様では、バリエゲートされるＡＤＲ残基は、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈから選択される。
【００７１】
本発明の別の態様では、バリエゲートされるＡＤＲ残基は、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、６１Ｈから選択される。ＡＤＲ残基は、上記のように決定され、図１及び２に示されている。ライブラリの生成方法、抗体及び抗体フラグメントの発現及び隔離の方法、及び抗体親和性の測定方法は上述した。
【００７２】
ＳＤＲＵライブラリを用いる親和性成熟
本発明の別の実施形態は、抗体の親和性成熟の方法であって、
ａ．前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記抗体内の特異性決定残基使用量（ＳＤＲＵ）残基を決定する工程と、
ｃ．少なくとも１つのＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
ｄ．前記ライブラリを宿主において発現する又は前記ライブラリを生体外で翻訳する工程と、
ｅ．前記ライブラリから、改善された対抗原親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【００７３】
本発明の方法を用いて、任意の抗体の親和性成熟が可能である。例えば、げっ歯類又はサルなど非ヒトの、ヒトの、キメラの、又はヒト化された、任意の抗体を使用することができる。少なくとも１つ、２つ、３つ、又はそれ以上のＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることができる。軽鎖又は重鎖のいずれかに宿るＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることができる。あるいは、定義されたサブセットのＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることができる。
【００７４】
本発明の別の態様では、バリエゲートされるＳＤＲＵ残基は、コチア残基９１Ｌ、９２Ｌ、及び９３Ｌから選択される。
【００７５】
本発明の別の態様では、バリエゲートされるＳＤＲＵ残基は、コチア残基Ｈ３２、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、及びＨ５８から選択される。
【００７６】
本発明の別の態様では、バリエゲートされるＳＤＲＵ残基は、コチア残基Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、及びＬ９６から選択される。
【００７７】
ライブラリの生成方法、抗体及び抗体フラグメントの発現及び隔離の方法、及び抗体親和性の測定方法は上述した。本発明の方法は、抗体の親和性の有意な改善につながる可能性がある。下の実施例において実証されるように、例えば、抗ＩＬ−１３抗体の親和性は最高２５倍、抗ＩＬ−１７の親和性は２倍、親抗体より向上した。
【００７８】
本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【００７９】
（実施例１）
ＳＤＲＲを用いて行うマウス抗ＣＤ１４７抗体のヒト化
マウス抗ＣＤ１４７抗体４Ａ５の生成
バシギン又はＣＤ１４７としても知られる細胞外マトリックス金属タンパク質（ＭＭＰ）誘導因子（ＥＭＭＰＲＩＮ）は４４〜６６ｋＤａの免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型膜透過性タンパク質である。ヒトＣＤ１４７アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ Ｎｏ：ＢＡＢ８８９３８．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示される。
【００８０】
４Ａ５は、精製されたＮ末端ヒトＣＤ１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸１９−１１７）を抗原として使用し、Ａ１９Ｎ置換によって生成されたネズミ抗体である。クローニング、発現、タンパク質精製及び免疫付与は、標準の方法を用いて行った。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されたＣＤ１４７ Ｈｉｓタグ付きＮ末端ドメインに対する４Ａ５ Ｆａｂの親和性は１２０ｎＭであった（表３）。
【００８１】
ＳＤＲＵ注釈
分解された、４Ａ５のＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列を、図６に示す（ＶＨ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；ＶＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。それらの配列の上に、図１及び２で決定されたＣＤＲ及びＨＶの定義が提供される。ＳＤＲＵ残基を決定するために、ＳＤＲＵの抗タンパク質抗体（ｐＳＤＲＵ、表１）を使用した。
【００８２】
ヒト生殖細胞系列抗体可変領域の遺伝子配列の選択
ｍＡｂ ４Ａ５ ＨＶループ全長の可変領域の配列及びカノニカル構造を定義する位置における残基の分析は、４Ａ５ ＶＬがカノニカル構造クラス３−１をコードしたことを指示した（それぞれＬ１及びＬ２について）。Ｌ３では、４Ａ５は削除を有し、したがって、カノニカル構造５型としての資格を有する（表３）。ヒト生殖細胞系列遺伝子でＬ３に５型のカノニカル構造を有するものはないので、Ｌ３はＳＤＲＵランキングでは考慮されなかった。４Ａ５ ＶＨはクラス１−２をコードした（それぞれＨ１およびＨ２について）。
【００８３】
ヒト生殖細胞系列レパートリー（図３及び４に示す）との比較によって、カノニカル構造クラス３−１−１を共有する３つのＶＬ遺伝子（０１１、０１、及びＢ３）及びカノニカル構造クラス１〜２を有する７つのヒトＶＨ遺伝子（１−１８、１−６９、１−ｅ、１−ｆ、５−５１、５−ａ、及び７−４．１）が識別された。更なるランキングのためにこれらの生殖細胞系列遺伝子配列を選択した。
【００８４】
４Ａ５とヒト生殖細胞系列遺伝子間のＳＤＲＵランクスコアを計算し、図７に示した。ＶＬに関しては、ヒトＢ３はＳＤＲＵランクスコアが９．０であり、ネズミ４Ａ５に対する相同性がヒトＯ１１及びＯ１配列より高いことが見出され、４Ａ５の配列と比較すると、同一であり、位置９４において類似性を１つだけ有し、ランクスコアは０．５であった。ＶＨに関しては、同様の比較で１−６９が４Ａ５と最も相同性の高い遺伝子配列として識別され、ランクスコアは６．５であった。最も高いスコアを有する３つのヒト遺伝子を図７に示した。ｄｅ Ｗｉｌｄによる１−６９／Ｂ３の発現プロファイルの更なる検査（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：８９５〜９０１，１９９９）は、両方の遺伝子が生体内でよく発現したことを示し、したがって選択のための追加的な裏付けをもたらした。したがって、４Ａ５ ＳＤＲＵ残基を置換するために１−６９／Ｂ３をＶＨ／ＶＬスカフォールドとして選択した。１−６９の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に、Ｂ３の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される。
【００８５】
ヒト生殖細胞系列Ｊ領域をＦＲ４ドナーとして識別するために、ＩｍＭｕｎｏＧｅＴｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）にコンパイルされた軽鎖のＩＧκＪ生殖細胞系列遺伝子と、重鎖のＩＧＨＪ生殖細胞系列遺伝子との配列比較を行った。ＩＧκＪ及びＩＧＨＪの配列を図５に示す。Ｊκ１及びＪＨ４についてはそれぞれ最高のランクスコアが得られ、それらはＦＲ４配列として選択された。
【００８６】
ＳＤＲＵリサーフェシング
抗マウス抗体からの選択された重鎖及び軽鎖スカフォールドに置換により導入されたＳＤＲＵ残基は、ＣＤＲ−Ｌ３については９４Ｌ、ＣＤＲ−Ｈ１については３３Ｈ及び３５Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２については５２Ｈ、５３Ｈ、５４Ｈ、５６Ｈ、５８Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ３については９５Ｈ〜１０２Ｈであった。ヒト化重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される。
【００８７】
ＳＤＲＲヒト化重鎖及び軽鎖可変領域を、ハイブリッドＦａｂとして発現し、ＶＨ及びＮＬへのヒト化プロセスの影響を評価するためにＥＬＩＳＡによって試験した。ＳＤＲＲヒト化ＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ；６）又はＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を含有するハイブリッドＦａｂ、親４Ａ５ ＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）又はＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）鎖、又は選択されたスカフォールド１〜６９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）又はＢ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を発現し、ＣＤ１４７への結合を試験した。生成されたＦａｂの結合の結果を表４に示す。ＳＤＲＲヒト化ＶＬはＣＤ１４７との結合を示したが、ＳＤＲＲヒト化ＶＨは検出不能な結合を示した。
【００８８】
【表３】
【００８９】
（実施例２）
ＡＤＲライブラリの生成による親和性成熟
実施例１に記述したヒト化及びハイブリッドＦａｂの結合実験に基づき、４Ａ５／ＣＤ１４７の相互作用において、ＶＬよりＶＨの方がより重要な役割を果たしたこと及びＡＤＲライブラリがＶＨに限定されたことが決定された。多様化のための標的とされたＡＤＲ残基は、ＣＤＲ−Ｈ１については２６Ｈ、２７Ｈ、２８Ｈ、２９Ｈ、及び３４Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２については５１Ｈ、５５Ｈ、５７Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、及び６１Ｈであった。図８は、ＡＤＲライブラリの設計及び４Ａ５重鎖及び軽鎖に関して置換されたＳＤＲＲ残基を示す。
【００９０】
ライブラリの生成及びスクリーニング
Ｂ３／４Ａ５可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）は、ＰＣＲ法（Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １６４：４９〜５３，１９９５）を用いて、２つの制限クローニング部位（５’でのＮｈｅ Ｉ及び３’でのＲｓｒ ＩＩ）をＮｈｅ Ｉ−Ｒｓｒ ＩＩフラグメントとしてクローンし、ｐＣＮＴＯ−ｌａｃＩ−ｐＩＸ（ＷＯ２００９０８５４６２Ａ１号）にして、オーバーラップするオリゴを組み立てることによって合成された。
【００９１】
１−６９／４Ａ５のＡＤＲライブラリは、テンプレートとして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されている可変領域配列によってコードされたｃＤＮＡを用いて、ＡＤＲの位置においてＮＮＫミックスを伴うオリゴを用いたオーバーラッピングＰＣＲによって合成された。このようにして、ＡＤＲの位置における全ての可能な変異型のサンプルを得た。その結果得られたライブラリによってコードされたアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す。
【００９２】
アガロースゲル抽出及び精製されたＰＣＲ混合物をＳｆｉ Ｉ及びＸｈｏ Ｉで消化し、Ｂ３−４Ａ５を含有するｐＣＮＴＯ−ｌａｃＩ−ｐＩＸベクターに連結した。その連結したＤＮＡに２０ｍｇ／ｍＬのグリコーゲンを１μｌ添加し、更に５００ｍＬのｎ−ブタノールを加えてボルテックスし、室温で１０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿させた。その上清をデカントし、１ｍＬの７０％ ＥｔＯＨでペレットを洗浄し、ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。５分間乾燥した後、最終ペレットを２０μＬの水で再懸濁した。電気穿孔法によって連結混合物１０μＬを５０μＬのＭＣ１０６１Ｆ’細胞に形質転換し、３７℃で１時間、１ｍＬのＳＯＣ中に回収した。形質転換体を１００μｇ／ｍＬカルビンシリン／１％グルコースのプレート上に出してシングルコロニーを得、電気穿孔毎に少なくとも１０7の独立したコロニーを収穫した。２０の電気穿孔は２×１０8の形質転換体のライブラリをもたらした。
【００９３】
電気穿孔ライブラリを、４００μＬのＳＯＣ培地にて３７℃で１時間培養した後、レスキューした。この培養物を、１％グルコースを含有する１００μｇ／ｍＬのカルビンシリンで希釈して１０００ｍｌの２ｘＹＴを得、ＯＤ６００が１．０に達するまで振った。この培養物１００ｍＬをＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（１０11／ｍＬ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で感染させ、その感染させた細胞を遠心分離し、カルビンシリン、カナマイシン及び１ｍＭ ＩＰＴＧで再懸濁して、５００ｍＬの２ｘＹＴにした。この培養物を一晩、３０℃で振った。ファージの上清を回収し、翌日、１０％のＰＥＧ／ＮａＣｌを添加した。氷上で２時間培養した後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してファージを沈降し、２５ｍＬの冷たいＰＢＳで再懸濁し、１ｍＬのアリコートに分割した。アリコートは、使用するまで−７０℃で貯蔵した。
【００９４】
ライブラリを３回パニングした。特異的ファージは、上述のように調製された、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレート（ＮＵＮＣ）上で吸収されたヒトＨｉｓタグ付きＮ末端ＣＤ１４７を使用して親和性選択される。３回の選択後にＤＮＡを特異的ファージから隔離し、ＮｈｅＩ／ＳｐｅＩの消化によってｐｌＸを取り除く。ｐｌＸのない、ゲル抽出され精製されたＤＮＡを連結し、電気穿孔によってＩＭＣ１０６１Ｆ’細胞５０μＬに形質転換し、３７℃で１時間かけて、ＳＯＣ １ｍＬにて回収した。形質転換物を、カルベニシリンとグルコースを含有する寒天プレート上に出し、スクリーニングのためのシングルコロニーを得た。
【００９５】
シングルコロニーをランダムに取り出して、カルベニシリン及び１％グルコース（２ｘＹＴ／カルベニシリン）を含有するウェル当たり１００μＬの２ｘＹＴに接種し、３７℃で一晩成長させて、マスタープレート（ＭＰ）を作製した。一晩経ったこのＭＰからの培養物２０μＬを、ウェル当たり１００μＬの２ｘＹＴ／カルベニシリンを含有する発現プレート（ＥＰ）に添加し、振りながら３７℃で６〜８時間成長させた。最終的に２０％になるようグリセロールをＭＰに添加し、−８０℃で貯蔵した。
【００９６】
６〜８時間成長させた後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）をＥＰに添加し、一晩振りながら３０℃で培養した。ＥＬＩＳＡプレートは、結合のための１μｇ／ｍＬのヒトＣＤ１４７ Ｈｉｓタグ付きＮ末端ドメイン及び発現のための１μｇ／ｍＬのヒツジ抗Ｆｄ（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．）でコーティングして準備した。翌日、それぞれの試料に、１ｘＰＢＳ中のＬｙｓｏｚｙｍｅ（２．５ｍｇ／ｍＬ）を２０μＬ添加することにより、細胞を溶解した。タンパク質でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴで洗浄し、ＣｈｅｍｉＢｌｏｃｋｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）でブロックした。細胞可溶化物とともにプレートを１時間培養し、ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄後、抗ヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）ＨＲＰ共役抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）培養した。ＨＲＰ基質を添加後、結合したＦａｂを化学発光法によって検出した。
【００９７】
スクリーニングした３７６のＦａｂのうち１９５（５３％）はＥＬＩＳＡ形式でＣＤ１４７への陽性結合を示した。８１の強結合剤の配列決定により、２回出現した２つのクローンを含む７５の固有の配列が明らかになった（図９）。ＡＤＲ中のアミノ酸の分布は、「ロゴ」図（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６０９７〜６１００，１９９０）として示されている（図１０）。ＮＮＫコドンによって精製されたアミノ酸の頻度からいかにＡＤＲが逸脱しているかを決定するために、これらの位置の統計解析を、適合度による手法（goodness-of-fit technique）によって実行した。
【００９８】
χ2値を、各位置について算出した。期待されるＮＮＫ頻度に対して、非常に有意な差（ｐ＜０．０１）を示す位置に２つのアスタリスクでラベル付けした。有意な頻度を伴う位置は１つのアスタリスクでラベル付けした（ｐ＜０．０５）。示されているように、Ｈ１におけるＡＤＲの位置３４Ｈ及びＨ２における位置５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、及び６１Ｈは、非常に有意な差を持ってＮＮＫ分布から逸脱しており、これらの残基がループの配座及び／又はＣＤＲ−Ｈ１とＣＤＲ−Ｈ２の相対的な位置を修正することを示唆した。位置２６及び５７は有意な差を示し、これらの位置が親和性に影響を及ぼし得るものの、置換に対する耐性がより高いことを示唆した。
【００９９】
得られたＦａｂの特性
更なる特性評価のために、図９に示されている生成された４Ａ５のＦａｂクローン７０〜７５を選択した。これらのＦａｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される配列を有するＶＬと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、１３、及び１４に示される配列を有するＶＨとをそれぞれ有していた。これら６つのクローンのそれぞれのシングルコロニーを１０ｍＬの２ｘＹＴ／カルベニシリンにて一晩成長させた。この一晩成長させた培養物を１Ｌの新鮮な２ｘＹＴ／カルベニシリンに接種し、ＯＤ６００が０．８〜１．０Ｏ．Ｄ．に達するまで成長させた。タンパク質の発現は、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、その培養物を一晩、３０℃で振った。翌朝、１Ｌの培養物を４５００ｒｐｍで３０分間、遠心分離した。その上清を廃棄し、ペレットを１００ｍＬの２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）／３５０ｍＭＮａＣｌ／７．５ｍＭイミダゾールにて再懸濁し、完成品である蛋白質分解酵素抑制剤１錠を加えた（ＥＤＴＡなし）。この均質の細胞をマイクロフルイダイザー（３Ｘ）で溶解し、氷上にて保存した。マイクロフルイダイザーで処理した細胞を９Ｋｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を清浄な試験管に注ぎ入れ、遠心分離を繰り返した。
【０１００】
タロン樹脂を２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）／３５０ｍＭ ＮａＣｌ／７．５ｍＭイミダゾールで平衡化した（タロン／ＥｔＯＨを２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＥｔＯＨを注ぎ出し、同量の２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）にて再懸濁を２回繰り返した）。平衡化されたタロン樹脂２ｍＬを、濾過したそれぞれの上清に添加した。この混合物を、２時間やさしく振りながら室温で培養した。Ｈｉｓ結合された樹脂と上清を５００ｍＬの遠心分離用ボトルに移し入れ、４，５００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。上清のほとんどを注ぎ出し、約３０ｍＬを使用して、タロンペレットを再懸濁したものをＢｉｏＲａｄカラムに充填した。樹脂を約５分間沈殿させた後、重力の流れによって上清を取り出した。次いで、この樹脂を５０ｍＬの２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）／３５０ｍＭ ＮａＣｌ／７．５ｍＭイミダゾール樹脂で２回洗浄した。１５０ｍＭ ＥＤＴＡ／２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）を用いてカラムからタンパク質を溶離した。この溶離液を４℃で一晩、トリス（ｐＨ８．５）にて透析した。
【０１０１】
Ｑ−ＦＦアニオン交換樹脂を２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）で平衡化した。透析されたＨｉｓ生成材料に、Ｑ−ＦＦアニオン交換樹脂５〜７．５ｍＬを添加し、やさしく振りながら室温で２時間培養した。次いで、樹脂及び上清をカラムに充填し、貫流を回収し、約１ｍＬに濃縮した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ｕｖ／ｖｉｓ分光光度計で、２８０ｎｍと３２０ｎｍ波長の吸光度差から濃度を判定した。精製した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、次いでゲルをＣｏｍｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅで染めることにより、濃度及び純度も決定した。
【０１０２】
４Ａ５と並んだ、精製後のＦａｂ試料のＣＤ１４７結合をＳＰＲで評価した。表面結合したヒトＮ末端ＣＤ１４７（１２０ＲＵ）を用いて、４Ａ５キメラ及びＡＤＲ Ｆａｂ変異型との親和性を、１１〜６００ｎＭへ濃度を漸増して、Ｆａｂ結合の動力学から算出した。ヒトＮ末端ＣＤ１４７ドメインに対して、ヒト化及び親和性成熟されたＦａｂは１５〜１００ｎＭの範囲であり、一方、キメラの４Ａ５ Ｆａｂは１２０ｎＭという親和性を示した（表３）。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
エピトープのマッピング
親和性成熟された変異型によって認識されるエピトープの保持を確保するために、ヒト／マウスキメラＣＤ１４７タンパク質上の４Ａ５の結合を評価することによって、エピトープのマッピングを行った。ヒト（ＢＡＢ８８９３８．１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びマウス（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＨ１０２７０．１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）のＣＤ１４７Ｈｉｓタグ付きＮ末端ドメイン及びいくつかのヒト／マウスキメラＣＤ１４７分子をｐＣＥＰ４ベクターにクローンし、標準の方法を用いて２９３の細胞に過渡的に発現した。発現されたキメラ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、１８、及び１９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有していた。ヒト化及び親和性成熟された全てのＦａｂは、４Ａ５と類似した結合プロファイルを呈し、負対照として使用した非特異的なＦａｂとは異なっていた。したがって、ＣＤ１４７において４Ａ５によって認識されるエピトープは、ＳＤＲＲヒト化及びその後の親和性成熟の後、保持された。
【０１０５】
（実施例３）
ＳＤＲＵ多様性の導入による集中的親和性成熟
抗ＩＬ１３抗体の親和性成熟
親和性成熟のために選択したＩＬ１３−６２抗体は、ヒトフレームワークに適合された、ハイブリドーマＣ８３６が分泌する親マウス抗体のＩｇＧ１の変異型であった。フレームワークの配列はＨｃ２〜Ｌｃ６の重鎖及び軽鎖の遺伝子であった。ＩＬ１３−６２の重鎖及び軽鎖の配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される。
【０１０６】
ＩＬ１３−６２ランダムファージライブラリは、高使用量の４つの抗タンパク質ＳＤＲＵ残基（残基Ｈ９１、Ｎ９２、Ｅ９３、及びＹ９４）のバリエゲーションによって生成した。このライブラリは、ＮＮＫコドンを使用する完全な多様性を導入するように設計され、理論上の多様性である１．９×１０5の変異型をもたらした。
【０１０７】
Ｆａｂライブラリは、米国特許第６，４７２，１４７号及びＷＯ２００９０８５４６２Ａ１号に記述されているｐｌＸファージディスプレイシステムにおいて構築した。ＩＬ１３−６２は、Ｌｃ６及びＨｃ２の可変領域を含有するダイシストロニック（dicistronic）単位として発現した。ライブラリは、標準の方法を用いて、入れ子になったＰＣＲによって、３つのフラグメントから組み立てられた。完全な長さのフラグメントをクローンして、ファージベクターｐＣＮＴＯ−ｌａｃｌ−ｐｌＸに導入した。
【０１０８】
軽鎖ＣＤＲ３ファージライブラリを、Ｒ１３０Ｑ置換を有するビオチニル化ＩＬ−１３（ニュージャージー州ロッキーヒル所在のＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）に対してパニングした（ＩＬ−１３野生型アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されている）。端的に、パニングの前に、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビード（カリフォルニア州カールスバッド所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（カリフォルニア州テメキュラ所在のＣｈｅｍｉｃｏｎ）でブロックした。同様に、ＣＤＲＬ３ファージライブラリを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｔ）とともにトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）にて１：１に希釈したＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒにて、室温で３０分間、予めブロックし、次いで、予吸着工程において、ＣＤＲＬ３ライブラリを、ブロックされた磁性ビードを用いて培養して、特異的でないバインダーをライブラリから取り除いた。次いで、３回連続パニングするために、ビオチニル化ＩＬ−１３変異型Ｒ１３０Ｑを異なる濃度（１０ｎＭ〜０．０１ｎＭ）でファージライブラリに添加した。磁性ビードを用い、抗原結合したファージを捕らえ、指数関数的に成長する大腸菌ＴＧ−１細胞１ｍＬを添加し（ＯＤ（６００ｎｍ）＝０．５）、３７℃で３０分間培養して、レスキューした。次いで、ファージを生成し、次のパニングのために準備した。Ｆａｂ−ｐｌＸは、ＴＧ−１コロニーのバクテリア細胞租溶解物から生成した。
【０１０９】
ＣＤＲＬ３ライブラリの質は、１９２のランダムに取り出したクローンの配列を決定することによって評価した。１９２のうち１７８は少なくとも８０％の配列カバレッジを有していた（Ｎｈｅｌ部位からＲｓｒＩＩまで）。１７８のうち１６３（９２％）は挿入及び／又は削除（すなわち、使用可能なクローンのパーセンテージ）を有さず、１６３のクローン全てが固有のものであった。残基の分布は、自社占有プログラムを使用して、配列カバレッジを有する全てのクローンを元に計算した。
【０１１０】
ハイスループットのシングルポイント（１０ｎＭ）ＥＬＩＳＡを使用し、得られた変異型をランキングした。ＴＢＳ中で、Ｂｌａｃｋ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（デンマークのロスキルド所在のＮｕｎｃ）に１μｇ／ｍＬのヒツジ抗Ｆｄ抗体（ヒトＩｇＧのＣＨ１ドメインを結合）を４℃で一晩コーティングした。プレートをＴＢＳＴ中で５回洗浄し、次いで、室温で１時間、５０％Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／ＴＢＳＴにてブロッキングした。租Ｆａｂ−ｐｌＸ細胞溶解物５０μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間、培養した。プレートを洗浄し、１０％Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／ＴＢＳＴにて希釈された一定の希釈範囲のビオチニル化ＩＬ１３Ｒ１３０Ｑ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）をそれらのウェルに添加し、室温で１時間培養した。平行プレートにて、１：５，０００希釈（１０％Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／ＴＢＳＴにて）でＨＲＰ共役ヤギ抗Ｆａｂ抗体（ペンシルベニア州ウェストグローブ所在のＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、Ｆａｂの捕獲を検出した。ビオチニル化ＩＬ１３Ｒ１３０Ｑは、１：５，０００希釈のストレプトアビジン−ＨＲＰによって検出した。最終洗浄後、化学発光基質（Ｒｏｃｈｅ販売元の指示に従って調製したＰＯＤ）を添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎの計器（マサチューセッツ州ウォルサム所在のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でプレートを計測した。いくつかの変異型は、使用した対照Ｆａｂ（親ネズミＩＬ１３−６２Ｆａｂ及びネズミとヒトのキメラＦａｂＩＬ１３−１６７）に比べて高い化学発光信号を示した。
【０１１１】
Ｆａｂ−ｐｌＸ形式での高い結合信号及び配列解析に基づき、関心対象のクローンは、完全なＩｇＧ ｍＡｂ形式に変換された。ファージスクリーンからのＦａｂを制限酵素で消化し、ＣＭＶプロモーターベクターｐＵＮＤＥＲにクローンし、配列を確認した。Ｌｃ６変異型を、Ｈｃ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）と、又はグルタミン酸塩、セリン、バリン、グルタミン又はロイシンの代わりに位置３４及び１００にメチオニンを有するＨｃ２と、ペアリングした。得られたＦａｂを、ヒトＩｇＧ１を含有するベクターにおいてクローンし、標準の方法を用いて精製した。
【０１１２】
選択された抗体の親和性は、ＥＬＩＳＡ及びＢｉｏａｃｏｒｅ（商標）によって決定し、表５に示した。最も優れた１０の親和性成熟された変異型の親和性は、１０ｐＭの範囲以上であった。
【０１１３】
抗ＩＬ１７抗体の親和性成熟
親和性成熟のために選んだＩＬ１７の抗体ＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２は、ヒトフレームワーク適合された変異型の、ハイブリドーマＣ１８６３Ａによって選択された親マウス抗体のＩｇＧ１サブタイプであった。フレームワーク配列は、Ｈｃ９〜Ｌｃ４であり、Ｈｃ１１重鎖遺伝子についてはＩＬ−１７Ｍ７０、Ｌｃ２軽鎖遺伝子についてはＩＬ−１７Ｍ８２とした。ＩＬ−１７Ｍ７０の重鎖及び軽鎖の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４にそれぞれ示されており、ＩＬ−１７Ｍ８２の重鎖及び軽鎖の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６にそれぞれ示されている。ヒトＩＬ−１７に対する抗体の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、ＩＬ−１７Ｍ７０では４３８ｎＭであり、ＩＬ−１７Ｍ８２では４３１ｎＭであった。ＩＬ−１３抗体ＩＬ１３−６２の親和性成熟に使用した方法は、基本的に上述の通りである。
【０１１４】
ファージの成熟のためのＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２ライブラリは、ｐＣＮＴＯ−Ｆａｂ−ｐＩＸにおいて構築した。タンパク質ＳＤＲＵ残基（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、及びＣＤＲ−Ｈ２のｐＳＤＲＵ）をランダマイズすることによって構築した。各抗体の２つのライブラリ（ＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２の重鎖ライブラリとＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｌ３の軽鎖ライブラリ）を合成したライブラリでランダマイズされた残基は、コチア残基Ｈ３２、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、及びＬ９６である。
【０１１５】
軽鎖ライブラリのベクターは、親重鎖配列を有していた（ＩＬ−１７Ｍ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）についてはＨｃ９、及びＩＬ−１７Ｍ８２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）についてはＨｃ１１）。
【０１１６】
【表５−１】
【０１１７】
【表５−２】
【０１１８】
同様に、重鎖ライブラリのベクターは親軽鎖配列を有する（ＩＬ−１７Ｍ７０についてはＬｃ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）及びＩＬ−１７Ｍ８２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）についてはＬｃ２）。
【０１１９】
ＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２の軽鎖及び重鎖の配列、ｐＳＤＲＵ、コチア及びカバット記述を図１１に示す。ライブラリの残基のうち、ランダマイズされたものに下線を付した。ライブラリの合成は、各位置に、メチオニン、システイン、リシン、グルタミン、グルタミン酸塩を除く全てのアミノ酸を導入するように設計された。ライブラリの理論上の多様性は２×１０9メンバーであった。ライブラリのサイズを制限するために、ｐＳＤＲＵ残基（Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ５０ａ、及びＬ９１）はランダマイズしなかった。得られたライブラリによってコードされたアミノ酸配列は、ＩＬ−１７Ｍ７０についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に、及びＩＬ−１７Ｍ８２についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されている。
【０１２０】
形質転換されたライブラリプレートからのファージ調製及びパニングは、上述のように、１０ｎＭ〜０．０１ｎＭの様々な濃度でビオチニル化ヒトＩＬ−１７Ａ Ｋ３Ｒ／Ｋ７４Ｑ／Ａ１３６Ｑ変異型を使用して実行した（ＩＬ−１７野生型はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されている）。第２回及び第３回目のパニングからのコロニーを、Ｆａｂの精製及び配列の決定のために取り出した。ＦａｂのＥＬＩＳＡ及び配列解析に基づいて、親Ｆａｂより優れた結合信号を有する固有のクローンが識別された。ＩＬ−１７Ｍ７０ライブラリからの合計６の重鎖及び１４の軽鎖と、ＩＬ−１７Ｍ８２ライブラリからの９の重鎖及び２２の軽鎖の配列を決定した。それらの重鎖及び軽鎖変異型の配列を図１２に示す。選択された重鎖及び軽鎖をｍＡｂに変換し、標準のプロトコルを用いてマトリックストランスフェクションにて発現させた。１２ｎｇ／ｍＬでのヒトＩＬ−１７Ａ変異型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）への結合率（％）をＩＬ−１７Ｍ７０及びＩＬ−１７Ｍ８２の両方の変異型Ｆａｂについて評価し、それぞれ表６及び７に示した。更なる特性評価のために、それぞれの親の４つの変異型ｍＡｂを選択した（表８）。結果すなわち特性を表９に示す。親和性成熟されたｍＡｂは、ＩＬ１７に対して、親抗体に比べて最高２倍の改善された親和性を有していた。
【０１２１】
【表６】
【０１２２】
【表７】
【０１２３】
【表８】
【０１２４】
【表９】
【０１２５】
以上のように、本発明の全てを説明してきたが、当業者には、添付の請求項の意図又は範囲から逸脱せずに本発明に多くの変更及び修正を行うことが可能であることは明白となるであろう。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体をヒト化する方法であって、
ａ．非ヒト抗体可変領域のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記非ヒト抗体可変領域の第１のカノニカル構造クラスを決定する工程と、
ｃ．生殖細胞系列遺伝子によってコードされるヒト抗体可変領域のアミノ酸配列の第１のライブラリを得る工程と、
ｄ．前記第１のライブラリから、アミノ酸配列の一群を選択する工程と、
（この選択する工程は、
ｉ．前記第１のライブラリのそれぞれのアミノ酸配列に関する第２のカノニカル構造クラスと、ＳＤＲＵランクスコアとを決定する工程と、
ｉｉ．前記第１のカノニカル構造クラスと同一の第２のカノニカル構造クラスを有し、最高のＳＤＲＵランクスコアを更に有する、アミノ酸配列の一群を前記第１のライブラリから識別する工程と、を含む）
ｅ．ヒト化抗体を生成するために、工程ｄ）で選択されたアミノ酸配列の群において、ＳＤＲＵ残基を、対応する非ヒトＳＤＲＵ残基と置換する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記生殖細胞系列遺伝子が、ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ、ＪＨ、Ｊκ、又はＪλ配列から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記可変領域が、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト化抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＡ型である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ライブラリから前記アミノ酸配列の群を選択する工程を更に含み、この工程が、
ａ．抗体可変領域のペアリングを評価すること、又は
ｂ．前記第１のカノニカル構造クラスが前記第１のライブラリの前記アミノ酸配列の群に存在しないときに、非ヒト抗体可変領域を伴う少なくとも１つのＨＶループのために、同一のカノニカル構造を有する前記第１のライブラリから前記アミノ酸配列の群を選択すること、のうち１つの選択基準を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ｅ−ｉ：工程ｄで選択されたアミノ酸配列の群の親和力決定残基（ＡＤＲ）を決定する工程と、
ｅ−ｉｉ：少なくとも１つのＡＤＲ残基をバリエゲートすることによって、ヒト抗体可変領域のアミノ酸配列の第２のライブラリを生成する工程と、
ｅ−ｉｉｉ：宿主において前記第２のライブラリを発現する又は前記第２のライブラリを生体外で翻訳する工程と、
ｅ−ｉｖ：前記第２のライブラリから、望ましい生物活性を有するそれらの可変領域を選択する工程と、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのＡＤＲ残基がバリエゲートされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２つのＡＤＲ残基がバリエゲートされる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも３つのＡＤＲ残基がバリエゲートされる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、重鎖のＡＤＲ残基から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、軽鎖のＡＤＲ残基から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）残基３４Ｈ、５１Ｈ、又は５５Ｈから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、又は６１Ｈから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記バリエゲートされるＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、又は５５Ｈから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記バリエゲートされるＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、又は６１Ｈから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＤＲライブラリが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、又はＦａｂ抗体フラグメントとして発現される、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＤＲライブラリが、融合タンパク質として発現される、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が、ファージコートタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記コートタンパク質が、ファージｐＩＸである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
宿主が、哺乳類細胞、細菌、又は酵母菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
抗体を親和性成熟する方法であって、
ａ．前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記抗体中の親和性決定残基（ＡＤＲ）を決定する工程と、
ｃ．少なくとも１つのＡＤＲ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
ｄ．前記ライブラリを宿主において発現する又は前記ライブラリを生体外で翻訳する工程と、
ｅ．前記ライブラリから、対抗原に対して改善された親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【請求項２２】
少なくとも２つのＡＤＲ残基がバリエゲートされる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも３つのＡＤＲ残基がバリエゲートされる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、軽鎖のＡＤＲ残基から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、重鎖のＡＤＲ残基から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、又は５５Ｈから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、又は６１Ｈから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記バリエゲートされるＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、又は５５Ｈから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記バリエゲートされるＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、又は６１Ｈから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体がＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、又はＦａｂフラグメントである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ライブラリが融合タンパク質として発現されるか、又は生体外において翻訳される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質が、ファージコートタンパク質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記コートタンパク質が、ｐＩＸである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
宿主が、哺乳類細胞、細菌、又は酵母菌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヒト化抗体が、請求項１に記載の方法によりヒト化される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
親和性成熟された抗体を作製する方法であって、
ａ．前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記抗体内の特異性決定残基使用（ＳＤＲＵ）残基を決定する工程と、
ｃ．少なくとも１つのＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
ｄ．前記ライブラリを宿主において発現する又は前記ライブラリを生体外で翻訳する工程と、
ｅ．前記ライブラリから、対抗原に対する改善された親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【請求項３８】
少なくとも２つのＳＤＲＵ残基が、バリエゲートされる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも３つのＳＤＲＵ残基が、バリエゲートされる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＳＤＲＵ残基が、軽鎖のＳＤＲＵ残基から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＳＤＲＵ残基が、重鎖のＳＤＲＵ残基から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのＳＤＲＵ残基が、コチア残基９１Ｌ、９２Ｌ、又は９３Ｌから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのＳＤＲＵ残基が、コチア残基３０Ｌ、３１Ｌ、３２Ｌ、９２Ｌ、９３Ｌ、９４Ｌ、又は９６Ｌから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＳＤＲＵ残基が、コチア残基３２Ｈ、５０Ｈ、５２Ｈ、５３Ｈ、５４Ｈ、５６Ｈ、又は５８Ｈから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記バリエゲートされるＳＤＲＵ残基が、コチア残基９１Ｌ、９２Ｌ、及び９３Ｌから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記バリエゲートされるＳＤＲＵ残基が、コチア残基３０Ｌ、３１Ｌ、３２Ｌ、９２Ｌ、９３Ｌ、９４Ｌ、及び９６Ｌから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記バリエゲートされるＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５７Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、又は６１Ｈから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、又はＦａｂフラグメントである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ライブラリが、融合タンパク質として発現される、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
前記融合タンパク質が、ファージコートタンパク質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記コートタンパク質が、ｐＩＸである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
宿主が、哺乳類細胞、細菌、又は酵母菌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５４】
前記ヒト化抗体が、請求項１に記載の方法によりヒト化される、請求項３７に記載の方法。
【請求項１】
抗体をヒト化する方法であって、
ａ．非ヒト抗体可変領域のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記非ヒト抗体可変領域の第１のカノニカル構造クラスを決定する工程と、
ｃ．生殖細胞系列遺伝子によってコードされるヒト抗体可変領域のアミノ酸配列の第１のライブラリを得る工程と、
ｄ．前記第１のライブラリから、アミノ酸配列の一群を選択する工程と、
（この選択する工程は、
ｉ．前記第１のライブラリのそれぞれのアミノ酸配列に関する第２のカノニカル構造クラスと、ＳＤＲＵランクスコアとを決定する工程と、
ｉｉ．前記第１のカノニカル構造クラスと同一の第２のカノニカル構造クラスを有し、最高のＳＤＲＵランクスコアを更に有する、アミノ酸配列の一群を前記第１のライブラリから識別する工程と、を含む）
ｅ．ヒト化抗体を生成するために、工程ｄ）で選択されたアミノ酸配列の群において、ＳＤＲＵ残基を、対応する非ヒトＳＤＲＵ残基と置換する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記生殖細胞系列遺伝子が、ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ、ＪＨ、Ｊκ、又はＪλ配列から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記可変領域が、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト化抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＡ型である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ライブラリから前記アミノ酸配列の群を選択する工程を更に含み、この工程が、
ａ．抗体可変領域のペアリングを評価すること、又は
ｂ．前記第１のカノニカル構造クラスが前記第１のライブラリの前記アミノ酸配列の群に存在しないときに、非ヒト抗体可変領域を伴う少なくとも１つのＨＶループのために、同一のカノニカル構造を有する前記第１のライブラリから前記アミノ酸配列の群を選択すること、のうち１つの選択基準を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ｅ−ｉ：工程ｄで選択されたアミノ酸配列の群の親和力決定残基（ＡＤＲ）を決定する工程と、
ｅ−ｉｉ：少なくとも１つのＡＤＲ残基をバリエゲートすることによって、ヒト抗体可変領域のアミノ酸配列の第２のライブラリを生成する工程と、
ｅ−ｉｉｉ：宿主において前記第２のライブラリを発現する又は前記第２のライブラリを生体外で翻訳する工程と、
ｅ−ｉｖ：前記第２のライブラリから、望ましい生物活性を有するそれらの可変領域を選択する工程と、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのＡＤＲ残基がバリエゲートされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２つのＡＤＲ残基がバリエゲートされる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも３つのＡＤＲ残基がバリエゲートされる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、重鎖のＡＤＲ残基から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、軽鎖のＡＤＲ残基から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）残基３４Ｈ、５１Ｈ、又は５５Ｈから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、又は６１Ｈから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記バリエゲートされるＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、又は５５Ｈから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記バリエゲートされるＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、又は６１Ｈから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＤＲライブラリが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、又はＦａｂ抗体フラグメントとして発現される、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＤＲライブラリが、融合タンパク質として発現される、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が、ファージコートタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記コートタンパク質が、ファージｐＩＸである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
宿主が、哺乳類細胞、細菌、又は酵母菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
抗体を親和性成熟する方法であって、
ａ．前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記抗体中の親和性決定残基（ＡＤＲ）を決定する工程と、
ｃ．少なくとも１つのＡＤＲ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
ｄ．前記ライブラリを宿主において発現する又は前記ライブラリを生体外で翻訳する工程と、
ｅ．前記ライブラリから、対抗原に対して改善された親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【請求項２２】
少なくとも２つのＡＤＲ残基がバリエゲートされる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも３つのＡＤＲ残基がバリエゲートされる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、軽鎖のＡＤＲ残基から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、重鎖のＡＤＲ残基から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、又は５５Ｈから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、又は６１Ｈから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記バリエゲートされるＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、又は５５Ｈから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記バリエゲートされるＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、又は６１Ｈから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体がＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、又はＦａｂフラグメントである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ライブラリが融合タンパク質として発現されるか、又は生体外において翻訳される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質が、ファージコートタンパク質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記コートタンパク質が、ｐＩＸである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
宿主が、哺乳類細胞、細菌、又は酵母菌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヒト化抗体が、請求項１に記載の方法によりヒト化される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
親和性成熟された抗体を作製する方法であって、
ａ．前記抗体のアミノ酸配列を得る工程と、
ｂ．前記抗体内の特異性決定残基使用（ＳＤＲＵ）残基を決定する工程と、
ｃ．少なくとも１つのＳＤＲＵ残基をバリエゲートすることによって前記抗体のアミノ酸配列のライブラリを生成する工程と、
ｄ．前記ライブラリを宿主において発現する又は前記ライブラリを生体外で翻訳する工程と、
ｅ．前記ライブラリから、対抗原に対する改善された親和性を有する１つ以上の抗体を選択する工程と、を含む、方法。
【請求項３８】
少なくとも２つのＳＤＲＵ残基が、バリエゲートされる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも３つのＳＤＲＵ残基が、バリエゲートされる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＳＤＲＵ残基が、軽鎖のＳＤＲＵ残基から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＳＤＲＵ残基が、重鎖のＳＤＲＵ残基から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのＳＤＲＵ残基が、コチア残基９１Ｌ、９２Ｌ、又は９３Ｌから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのＳＤＲＵ残基が、コチア残基３０Ｌ、３１Ｌ、３２Ｌ、９２Ｌ、９３Ｌ、９４Ｌ、又は９６Ｌから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記バリエゲートされる少なくとも１つのＳＤＲＵ残基が、コチア残基３２Ｈ、５０Ｈ、５２Ｈ、５３Ｈ、５４Ｈ、５６Ｈ、又は５８Ｈから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記バリエゲートされるＳＤＲＵ残基が、コチア残基９１Ｌ、９２Ｌ、及び９３Ｌから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記バリエゲートされるＳＤＲＵ残基が、コチア残基３０Ｌ、３１Ｌ、３２Ｌ、９２Ｌ、９３Ｌ、９４Ｌ、及び９６Ｌから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記バリエゲートされるＡＤＲ残基が、コチア残基３４Ｈ、５１Ｈ、５５Ｈ、５７Ｈ、５９Ｈ、６０Ｈ、又は６１Ｈから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、又はＦａｂフラグメントである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ライブラリが、融合タンパク質として発現される、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
前記融合タンパク質が、ファージコートタンパク質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記コートタンパク質が、ｐＩＸである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
宿主が、哺乳類細胞、細菌、又は酵母菌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５４】
前記ヒト化抗体が、請求項１に記載の方法によりヒト化される、請求項３７に記載の方法。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【公表番号】特表２０１２−５０５６５４（Ｐ２０１２−５０５６５４Ａ）
【公表日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３２２１０（Ｐ２０１１−５３２２１０）
【出願日】平成２１年１０月１４日（２００９．１０．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０６５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４５３４０
【国際公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１４日（２００９．１０．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０６５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４５３４０
【国際公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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