抗体を得るための方法
本開示は、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、抽出バッファーをサンプルに加えること、及びサンプルに熱処理ステップを施すことを含み、抽出バッファーの添加後サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、熱処理ステップの前に確実にサンプルのｐＨが６〜９となるようにする方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え抗体、特に治療用抗体の産生及び単離における収率を増大するための方法に関する。これらの方法は、治療用抗体の大規模な工業的生産に特に適している。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技法は急速に開発されており、抗体、特に治療用抗体の産生において特に有用である。組換え遺伝子の発現に関する系は、問題の技術分野の当業者にはよく知られている。これらは、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、並びにトランスジェニック動物及び植物における発現を含む。発現系の選択は、コードタンパク質の特徴、例えば翻訳後修飾に依存する。他の考慮事項は時間、及び特に、所望量の必要とされる品質の物質の産生に関するコストを含む。これらの後者の考慮事項は、監督機関の承認が必要な品質及び多数の患者の治療に必要とされる量の、治療用抗体の産生において特に重要である。
【０００３】
組換えタンパク質の産生に最も広く使用されている系は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に基づいている。大腸菌の使用で直面する具体的な問題は、治療に必要な量の必要とされる品質の物質を産生する際の困難である。特に、関連する時間及びコストは禁じられ得る。顕著な１つの具体的な問題は、大腸菌からの抗体の抽出中の抗体の収率において被る損失である。
【０００４】
比例して、精製コストは治療用抗体産物の全コストの一部分であるが、精製コストの割合は、上流産生コストが安くなるとさらに増大する。したがって、抗体の回収及び精製の改善は、産生の手段とは無関係に産生コストをさらに低減する（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ＆ Ｇｌｏｖｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ／’ｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００１、４：１７２〜１８５）。したがって、例えば産物の回収を高めること、及び／又は産物の流れの品質を改善することによって、治療用抗体産生、及び特に精製に時間及び／又はコスト節約をもたらす方法が必要とされる。
【０００５】
発酵又は培養当たりの低い産物収率は、一次抽出段階で示される特定の問題であることが多く、抗体の発現は細胞内では高いが、一次抽出段階での高い回収率を得るのは非常に難しい。
【０００６】
この後者の問題を部分的に処理し、治療用途に許容可能な抗体の産生を可能にする方法は、米国特許第５，６５５，８６６号中に記載されている。この方法は、非機能性抗体からの抗体機能性Ｆａｂ’断片の後の単離を容易にするための熱処理の使用を含み、熱処理は発酵若しくは培養中の任意の時間、又は抗体の抽出及び精製中の任意の段階で実施する。室温を超える高温において、機能性抗体は非常に安定性があり、一方で宿主細胞タンパク質及び遊離軽鎖及び重鎖種及び抗体の非機能性断片を含めた、多くの他のタンパク質は、濾過若しくは遠心分離若しくは流動床クロマトグラフィーなどの一次精製手順中に機能性抗体から容易に分離される沈殿及び／又は凝集体を形成する。細胞抽出物は、ＥＤＴＡ１０ｍＭを含有するトリスＨＣｌバッファー１００ｍＭ、ｐＨ７．４中で完全細胞をインキュベートすることによって、米国特許第５，６５５，８６６号中に記載された方法で調製した。
【０００７】
ＷＯ２００６／０５４０６３は、熱処理と組合せた非溶解処理を含めることによる、一次抽出段階での機能性抗体の収率の増大を記載する。この方法は、遠心分離後、１００ｍＭのＥＤＴＡを含有する１Ｍのトリス、ｐＨ７．４を含むサンプル中に細胞ペレットを再懸濁し、次に非溶解処理、次いで熱処理を行ったことを教示する。
【０００８】
ＷＯ２００５／０１９４６６は、発酵後ただし抽出を含めた下流処理前に定義した温度及びｐＨ条件下での中断ステップを含めることによる、組換えタンパク質の収率の増大について記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本明細書に記載する本発明は、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養した後、一次回収プロセス中に生成したサンプルのｐＨの増大は、抗体の収率に対して著しく有益な影響があるという、驚くべき予想外の観察結果に基づく。
【００１０】
抗体は加熱などの処理前に範囲６〜９のｐＨで開始することはできるが、驚くべきことに緩衝処理したときでさえ、おそらく細胞代謝の結果としてｐＨは低下する。本発明者らは、これは収率／回収に対して悪影響があると現在考えており、適切な場合、確実にｐＨが標的範囲内に留まるようにするための処理の前及び／又は最中に物質のｐＨを調整することによって、これに取り組むことを提案している。
【００１１】
熱処理ステップ前のサンプルのｐＨは、細胞サンプルからの抗体の収率に対して相当な影響があることが、驚くべきことに分かっている。サンプルのｐＨが熱処理ステップ前にｐＨ６〜９となるようにサンプルのｐＨを調整することによって、４０％までの抗体の収率の増大をもたらすことが分かっている。これは、治療品質の量の機能性抗体の産生の、時間及びコストの非常に有益な節約を可能にする。実際、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）及び保持（ｈｏｌｄ）ステップなどの、収率を増大するために使用されることが多い他のステップは、高レベルの抗体収率を得るのに、もはや必要とされない可能性がある。
【００１２】
例えば米国特許第５，６５５，８６６号中で、以前に使用された方法中では、７．４のｐＨを有するバッファー中で完全細胞をインキュベートすることによって、細胞抽出物が調製された。サンプルのｐＨを一定レベルに維持すると予想されるバッファーの添加にもかかわらず、実際細胞サンプルのｐＨは経時的に低下することが分かっている。バッファーの添加後長時間などの特定の状況では、サンプルのｐＨは熱処理ステップ前にｐＨ５．５ほど低いことが分かっている。確実にサンプルのｐＨが６〜９となるようにするための、熱処理前のｐＨの検出、及び場合によっては調整は、抗体の収率の驚くべき増大をもたらすことが分かっている。
【００１３】
理論によって束縛されることは望まないが、熱処理などの処理ステップ中に６〜９の範囲内にｐＨを維持することは重要であると考えられる。（熱処理ステップなどの）処理前のｐＨ調整は、適正範囲内にｐＨを維持するのを手助けする。したがって、一態様では、実質的にプロセスの時間中、実質的に６〜９の範囲内でｐＨを維持する抗体抽出ステップを提供する。
【００１４】
理論によって束縛されるものではないが、本発明によって提供される方法は、標準的抽出条件下において切り離されない一次単離中のペリプラズムからの組換えタンパク質の回収を可能にすると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明の第一の態様では、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、抽出バッファーをサンプルに加えること、及びサンプルに熱処理ステップを施すことを含み、抽出バッファーの添加後サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、熱処理ステップの前に確実にサンプルのｐＨが６〜９となるようにする方法を提供する。
【００１６】
この段階でのｐＨのモニタリングは、ｐＨに対する調節を確立するのに必要不可欠である。
【００１７】
代替の態様では、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルから組換え抗体分子を抽出する方法であって、
前記細胞の組成物のｐＨを６〜９の範囲内で調整して、後の抽出ステップ中にｐＨがその範囲内に維持されるようにするステップ、
熱処理ステップなどの抽出ステップを細胞に施すステップを含み、
抽出ステップの直前及び／又は最中に少なくとも１つの時点でｐＨをモニタリングする方法を提供する。
【００１８】
サンプルを熱処理ステップに施した後、抽出バッファーのｐＨの上昇は、抗体の収率の驚くべき増大をもたらすことも分かっている。
【００１９】
したがって、本発明の第二の態様では、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、７．５〜９．０のｐＨを有するサンプルに抽出バッファーを加えること、及びサンプルに熱処理ステップを施すことを含む方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書で利用する抗体分子は、完全抗体又はその結合断片、特に完全抗体又はＦａｂ断片を指すものとする。
【００２１】
本発明の第一の態様では、サンプルは熱処理ステップ前に６〜９のｐＨを有している、又は有するように調整する。
【００２２】
好ましい実施形態では、サンプルは、熱処理ステップの前に、６．５〜８．５のｐＨ、ｐＨ６．５〜８．０、ｐＨ７．０〜９．０、ｐＨ７．０〜８．５、ｐＨ７．０〜８．０、ｐＨ７．１〜８．０、ｐＨ７．５〜８．０、ｐＨ７．０〜７．８、ｐＨ７．１〜７．８、ｐＨ７．１〜７．７、ｐＨ７．２〜７．６、ｐＨ７．３〜７．５、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８又はｐＨ７．９、ｐＨ７．４など、特にｐＨ６．８を有する。
【００２３】
本明細書で言及するｐＨ測定値は一般に２０℃に標準化する。
【００２４】
本発明の方法中の熱処理ステップは、加熱段階中に望ましい高温に達した後、この望ましい高温にサンプルの温度を維持するステップである。熱処理ステップの適切な温度範囲は３０〜７０℃を含む。
【００２５】
本発明の文脈では、語句「熱処理ステップの前」は、サンプルが望ましい高温に達し、（高温で保持する）熱処理ステップが始まる時点以前を意味する。熱処理ステップに望ましい高温に到達するため、サンプルを「加熱段階」に施し、その間にサンプルの温度が望ましい高温に上昇する。一実施形態では、本発明による方法は、サンプルに加熱段階及び熱処理ステップを施すことを含む。
【００２６】
本発明の方法において、熱処理ステップの前に、サンプルは６〜９のｐＨ、例えばｐＨ６．８を有する。この文脈では、「熱処理ステップの前」は、サンプルが熱処理ステップに望ましい高温に達する時点又はそれより前に、サンプルのｐＨが必要とされるレベルにあることを意味する。その方法がサンプルに加熱段階及び熱処理ステップを施すことを含む実施形態では、サンプルは、加熱段階の開始前に必要とされるｐＨレベル、及び／又は加熱段階の最中に必要とされるｐＨレベルにあり得る。
【００２７】
好ましい実施形態では、サンプルは加熱段階の開始前に６〜９の必要とされるｐＨレベルにある。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、抽出バッファーをサンプルに加えること、及びサンプルに加熱段階及び熱処理ステップを施すことを含み、抽出バッファーの添加後サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、加熱段階の前に確実にサンプルのｐＨがｐＨ６〜９、例えばｐＨ７〜９、ｐＨ７〜８などとなるようにする方法を提供する。
【００２９】
代替の実施形態では、本発明は、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、抽出バッファーをサンプルに加えること、及びサンプルに加熱段階及び熱処理ステップを施すことを含み、抽出バッファーの添加後サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、加熱段階の最中に確実にサンプルのｐＨがｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ６〜７となるようにする方法を提供する。
【００３０】
一実施形態では、サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、確実にサンプルのｐＨが加熱段階の前に第一のｐＨ、加熱段階の最中に第二のｐＨとなるようにする。第一のｐＨと第二のｐＨのレベルは異なることが好ましい。第二のｐＨは第一のｐＨより低いことが好ましい。したがって、本発明は、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、抽出バッファーをサンプルに加えること、及びサンプルに加熱段階及び熱処理ステップを施すことを含み、抽出バッファーの添加後サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、加熱段階の前に確実にサンプルのｐＨがｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ７〜８となるようにし、加熱段階の最中に確実にサンプルのｐＨがｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６〜７となるようにする方法を提供する。この実施形態では、加熱段階の前にサンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整することができ、加熱段階の最中に検出し、場合によっては調整することができる。
【００３１】
好ましい実施形態では、加熱段階の直前に、サンプルは６〜９のｐＨ、好ましくはｐＨ７〜９、より好ましくはｐＨ７〜８を有する。それに加えて又はその代わりに、サンプルが望ましい高温に達し熱処理ステップが始まる時点を場合によっては含めた熱処理ステップの直前、加熱段階の最中に、サンプルは６〜９のｐＨ、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ６〜７を有する。加熱段階の直前又は熱処理ステップの直前のサンプルのｐＨは、組換え抗体の収率に対して有意な影響があることが分かっている。
【００３２】
本発明の文脈では、用語「直前」は、加熱段階、熱処理ステップの前の、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、１分以下、３０秒以下、１０秒以下、５秒以下、１秒以下の時間を意味することが好ましい。用語「直前」は、加熱段階の開始時又は熱処理ステップの開始時に６〜９である溶液のｐＨも包含し得る。
【００３３】
サンプルのｐＨは抽出バッファーの添加後に検出する。サンプルのｐＨは、当技術分野で知られている任意の適切なｐＨ測定機器を使用して検出することができる。サンプルのｐＨは、抽出バッファーの添加時点、抽出バッファーの添加直後、加熱段階の開始直前、加熱段階の開始時点、サンプルが熱処理ステップに望ましい高温に達する時点を含めた加熱段階の最中、熱処理ステップ中及び熱処理ステップ後などの、その方法中の１つ又は複数の別個の時点で検出することができる。或いは、連続モニタリングによってサンプルのｐＨを検出する。サンプルのｐＨを連続的にモニタリングするこの実施形態では、細胞を培養するステップ後、好ましくは培養後の遠心分離のステップ後から、熱処理ステップの開始まで、ｐＨを連続的にモニタリングすることが好ましい。好ましい実施形態では、サンプルのｐＨは、抽出バッファーの添加時点から熱処理ステップの開始まで、連続的にモニタリングする。しかしながら、培養ステップ中及び／又は熱処理ステップ中に、ｐＨをモニタリングすることもできる。
【００３４】
したがって一実施形態では、加熱ステップのｐＨプロファイルを調節する。
【００３５】
好ましい実施形態では、サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整し、サンプルが望ましいｐＨに達したとき、加熱段階を好ましくは自動的に開始させる。
【００３６】
抽出バッファーは細胞サンプルを培養するステップ後に加える。その方法が培養のステップ後に遠心分離のステップを含む場合、遠心分離のステップ前及び／又は最中及び／又は後に、抽出バッファーを加えることができる。遠心分離のステップ後に抽出バッファーを加えて、遠心分離から得られた細胞ペレットを再懸濁することが好ましい。
【００３７】
本発明の一実施形態では、抽出バッファーは、熱処理ステップの前に、確実にサンプルのｐＨがｐＨ６〜９、例えばｐＨ６〜８となるようにする適切なｐＨを有する。抽出バッファーが、熱処理の前に確実にサンプルのｐＨが６〜９、例えばｐＨ６〜８となるようにするのに適したｐＨを有するこの実施形態では、抽出バッファーは例えば、ｐＨ７．５〜９．０、ｐＨ７．５〜８．８、ｐＨ７．５〜８．５、ｐＨ８．０〜９．０、ｐＨ８．５〜９．０、ｐＨ８．６〜８．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９又はｐＨ９．０のｐＨを有する。加熱段階及び熱処理ステップは、確実にサンプルが熱処理ステップ前に必要なｐＨを有するようにするために、抽出バッファーの添加後すぐに、好ましくは直後に実施することが好ましい。例えば、加熱段階又は熱処理ステップは、抽出バッファーの添加後、４時間以下、３時間以下、２時間以下、１時間以下、３０分以下、１０分以下又は５分以下で実施することができる。
【００３８】
したがって、本発明の方法は、サンプルのｐＨ調整のステップを必要としない可能性がある。サンプルのｐＨは、抽出バッファーの添加後に検出して、必要に応じてｐＨ６〜９にすることができる。例えば前に記載したように抽出バッファーのｐＨがサンプルのｐＨを６〜９にするのに適している場合、例えば抽出バッファーが７．５〜９．０のｐＨを有し、熱処理ステップをその後まもなく実施する場合、これが当てはまる可能性がある。
【００３９】
しかしながら典型的には、抽出バッファーの添加と熱処理ステップの間の時間の長さが原因で、本発明による方法は、抽出バッファーの添加によって引き起こすことができる任意のｐＨ調整以外に、熱処理ステップの前に確実にサンプルのｐＨが６〜９となるようにするために、サンプルのｐＨを検出及び調整するステップを必要とする。
【００４０】
その方法がｐＨ検出及び調整のステップを含むこの実施形態では、抽出バッファーのｐＨは、ｐＨ８未満、ｐＨ７．４以下など、例えばｐＨ６．０〜７．４、ｐＨ６．５〜７．４又はｐＨ７．０〜７．４、ｐＨ６．８などであってよい。
【００４１】
或いは、好ましい実施形態では、抽出バッファーは、７．５〜９．０のｐＨ、ｐＨ７．５〜８．８、ｐＨ７．５〜８．５、ｐＨ８．０〜９．０、ｐＨ８．５〜９．０、ｐＨ８．６〜８．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、ｐＨ９．０、最も好ましくはｐＨ８．０を有する。
【００４２】
この実施形態では、サンプルのｐＨは、その方法中の任意の適切な時間で、任意の適切な手段によって調整することができる。サンプルのｐＨは、抽出バッファーの添加前及び／又は後に調整することができる。
【００４３】
一実施形態では、抽出バッファーの添加前にサンプルのｐＨを調整する。この実施形態では、その方法が培養のステップ後に遠心分離のステップを含む場合、ｐＨ調整のステップは遠心分離のステップの前及び／又は後に実施することができる。細胞培養後、及び場合によっては遠心分離後のサンプルのｐＨは典型的には低い。例えば、サンプルは約ｐＨ５．５のｐＨを有し得る。したがって、細胞培養後、及び場合によっては遠心分離などの１つ又は複数の他のステップ後に、サンプルのｐＨを調整することができる。例えば、サンプルのｐＨを抽出バッファーの添加前に、ｐＨ６．５〜８．０、好ましくはｐＨ７．０〜８．０、ｐＨ６．５〜７．５、ｐＨ６．６〜７．４、ｐＨ６．７〜７．３、ｐＨ６．８〜７．２、ｐＨ６．９〜７．１、最も好ましくはｐＨ６．９に調整することができる。
【００４４】
抽出バッファー添加前のサンプルのｐＨが、ｐＨ７未満、ｐＨ６．９などであり、熱処理ステップ前のサンプルのｐＨがｐＨ７〜９であることが必要とされる一実施形態では、サンプルのｐＨは、熱処理ステップ前のサンプルのｐＨが７〜９であるような、抽出バッファーの添加及び／又は抽出バッファー添加後のさらなるｐＨ調整によるさらなる上昇を必要とする。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、抽出バッファーの添加後、ただし熱処理ステップの前に、サンプルのｐＨをｐＨ６〜９に調整する。この段階で、好ましくはサンプルを、ｐＨ７．０〜９．０、ｐＨ７．０〜８．５、ｐＨ７．０〜８．０、ｐＨ７．１〜８．０、ｐＨ７．５〜８．０、ｐＨ７．０〜７．８、ｐＨ７．１〜７．８、ｐＨ７．１〜７．７、ｐＨ７．２〜７．６、ｐＨ７．３〜７．５、ｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８又は７．９、最も好ましくはｐＨ７．４に調整する。一実施形態では、加熱段階の前にサンプルのｐＨを調整する。好ましくは、サンプルのｐＨを、加熱段階の前にｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ７〜８に調整する。その代わりに又はそれに加えて、加熱段階の最中にサンプルのｐＨを調整する。好ましくは、サンプルのｐＨを、加熱段階の最中にｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６〜７に調整する。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、７．４のｐＨ又はｐＨ８を有する抽出バッファーをサンプルに加え、サンプルのｐＨを検出し、熱処理ステップの前、好ましくは加熱段階の前、より好ましくは加熱段階の直前に、７．４のｐＨにその後調整する。
【００４７】
サンプルのｐＨを抽出バッファーの添加後に検出し、熱処理ステップの前に調整する実施形態では、サンプルのｐＨは加熱段階の開始前に検出し調整することができる。それに加えて又はその代わりに、加熱段階の最中に、サンプルのｐＨを検出し調整することができる。
【００４８】
好ましい実施形態では、加熱段階の直前にサンプルのｐＨを検出し調整する。それに加えて又はその代わりに、サンプルのｐＨは、サンプルが望ましい高温に達し熱処理ステップが始まる時点を場合によっては含めた熱処理ステップの直前、加熱段階の最中に検出し調整する。
【００４９】
本発明の文脈では、用語「直前」は、加熱段階前又は熱処理ステップの前に、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、１分以下、３０秒以下、１０秒以下、５秒以下、１秒以下で、サンプルのｐＨを検出しｐＨ６〜９に調整することを、意味することが好ましい。用語「直前」は、加熱段階の開始時又は熱処理ステップの開始時に、溶液のｐＨを検出し調整することも包含し得る。好ましい実施形態では、サンプルのｐＨがｐＨ６〜９であることを検出するとき、加熱段階及び／又は熱処理ステップを、好ましくは自動的に引き起こす。
【００５０】
サンプルのｐＨは、前に記載したｐＨ調整の任意の単回又は複数回ステップによって、検出し調整することができる。したがってｐＨは、
●抽出バッファーの添加前のみ、
●抽出バッファーの添加後のみ、ただし熱処理ステップの前、又は
●抽出バッファーの添加前及び抽出バッファーの添加後、ただし熱処理ステップの前に調整することができる。
【００５１】
ｐＨは抽出バッファーの添加後に複数回、例えば１、２、３、４又はそれより多く調整することができる。
【００５２】
一実施形態では、サンプルのｐＨは、好ましくは抽出バッファーの添加と熱処理ステップ前の間に、連続的に調整する。
【００５３】
一実施形態では、サンプルのｐＨは、熱処理ステップの最中に、追加的に検出し場合によっては調整することができる。したがって、本発明による方法は、熱処理ステップの最中にサンプルのｐＨを調整するステップをさらに含むことができる。サンプルのｐＨは、ｐＨ６．０〜９．０、ｐＨ６．５〜８．５、ｐＨ６．５〜８．０、ｐＨ７．０〜９．０、ｐＨ７．０〜８．５、ｐＨ７．０〜８．０、ｐＨ７．１〜８．０、ｐＨ７．５〜８．０、ｐＨ７．０〜７．８、ｐＨ７．１〜７．８、ｐＨ７．１〜７．７、ｐＨ７．２〜７．６、ｐＨ７．３〜７．５、ｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８又は７．９に、熱処理ステップの最中に調整することが好ましい。
【００５４】
本発明による第二の態様では、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、７．５〜９．０のｐＨを有するサンプルに抽出バッファーを加えること、及びサンプルに熱処理ステップを施すことを含む方法を提供する。
【００５５】
本発明の第一の態様において前に記載したように、抽出バッファーは７．５〜９．０のｐＨ、ｐＨ７．５〜８．８、ｐＨ７．５〜８．５、ｐＨ８．０〜９．０、ｐＨ８．５〜９．０、ｐＨ８．６〜８．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９又はｐＨ９．０を有することが好ましい。本発明のこの態様では、サンプルのｐＨを検出することは必須ではない。本発明の第二の態様による方法は、本発明の第一の態様において記載したように、サンプルのｐＨの検出及びサンプルのｐＨの調整を含むことができる。しかしながら、ｐＨ検出及びｐＨ調整のステップを含めることは必須ではない。一実施形態では、本発明の第二の態様による方法は、サンプルのｐＨを検出するステップ又はｐＨ調整のステップを含まない。
【００５６】
本発明の以下の詳細な説明は、本発明の第一の態様と第二の態様の両方の実施形態に適用する。
【００５７】
ｐＨ調整剤及び抽出バッファー
ｐＨ調整は、熱処理ステップ中ｐＨ６〜９の所望の範囲に、ｐＨが持続／維持されるようなものでなければならない。
【００５８】
一実施形態では、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、又はトリエチルアミン若しくはトリメチルアミンなどの有機塩基などの塩基を用いてｐＨを調整する。
【００５９】
任意の適切な作用物質を使用して、サンプルのｐＨを調整することができる。作用物質は抽出バッファーであってよく、又は抽出バッファーの前及び／又は後に加えることができる。ｐＨを調整するために使用することができる典型的な作用物質は、以下の、ＮａＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、硫酸、ＥＤＴＡ、トリスバッファーの１つ又は複数を含む、又はこれらからなる。水酸化ナトリウム又は水酸化アンモニウムなどの塩基を使用して、サンプルのｐＨを調整することが好ましい。
【００６０】
一実施形態では、抽出バッファーは、典型的にはＨＣｌの添加によって所望のｐＨに調整した、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／エチレンジニトリロ四酢酸二ナトリウム塩二水和物（トリス／ＥＤＴＡ）バッファーである。理論によって束縛されるものではないが、大腸菌の外膜からのリポ多糖（ＬＰＳ）の放出において、トリスとＥＤＴＡは相乗的に働くと考えられる。ＥＤＴＡは、外膜のＬＰＳを安定化させる二価カチオンを除去する。トリスはＬＰＳと結合しＣａ２＋及びＭｇ２＋を置換すると考えられる。これはＬＰＳ分子間の相互作用の低下、したがって外膜の透過性の増大をもたらす（Ｖａａｒａ，Ｍ．１９９２．「外膜の透過性を増大する作用物質（Ａｇｅｎｔｓ Ｔｈａｔ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）」Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５６：３９５〜４１１）。
【００６１】
熱処理ステップ
本発明の方法中の熱処理ステップは、（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）米国特許第５，６６５，８６６号中に詳細に記載されたのと同様であることが好ましい。熱処理ステップは、他の抗体関連物質の除去を容易にすることによって、可溶性の、正確にフォールディング及び構築された抗体のサンプルを得ることを可能にする。「正確にフォールディング及び構築された」抗体は、非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ上に構築された重鎖及び軽鎖に関する予想分子量に対応する一本のバンドの存在によって示される。他の抗体関連物質は、典型的には、正確にフォールディング及び構築された抗体の遊離重鎖及び軽鎖又はそれらの一部分、部分的に分解した断片である。
【００６２】
熱処理ステップは、所望の高温をサンプルに施すことによって実施する。熱処理ステップは、３０℃〜７０℃の範囲内で実施することが最も好ましい。温度は必要に応じて選択することができ、精製用抗体の安定性に依存し得る。別の実施形態では、温度は４０℃〜６５℃の範囲内、又は好ましくは４０℃〜６０℃の範囲内、より好ましくは４５℃〜６０℃の範囲内、さらにより好ましくは５０℃〜６０℃の範囲内、最も好ましくは５５℃〜６０℃、５８℃〜６０℃又は５９℃である。したがって、最小温度は３０℃、３５℃又は４０℃であり、最高温度は６０℃、６５℃又は７０℃である。
【００６３】
熱処理ステップは長時間実施することが好ましい。熱処理の長さは、好ましくは１〜２４時間の間、より好ましくは４〜１８時間の間、さらにより好ましくは６〜１６時間の間、最も好ましくは１０〜１４時間の間又は１０〜１２時間の間、例えば１２時間である。したがって、熱処理に関する最小時間は１、２又は３時間であり、最大時間は２０、２２又は２４時間である。
【００６４】
特定の実施形態では、１０〜１６時間５０℃〜６０℃で、及びより好ましくは１０〜１２時間５９℃で、熱処理を実施する。当業者は、問題のサンプル及び産生される抗体の特性に適合するように、温度及び時間を選択することができることを理解している。
【００６５】
一実施形態では、本開示による方法は、熱処理ステップを実施する前に、調節条件下に細胞を保持する前処理ステップを含まない。
【００６６】
好ましい実施形態では、本発明は、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、及び抽出バッファーをサンプルに加えること、及び最大１５時間、好ましくは１０〜１２時間の間、４０℃〜７０℃の範囲内、好ましくは５９℃の熱処理ステップをサンプルに施すことを含み、熱処理ステップの前に、サンプルのｐＨが、熱処理ステップの前に、好ましくは加熱段階の直前にｐＨ７〜８、好ましくはｐＨ７．４となるように、サンプルのｐＨをモニタリング及び調整する方法を提供する。７．４又は８．０のｐＨを有する抽出バッファーを、サンプルに加えることが好ましい。
【００６７】
熱処理ステップは、２００ＲＰＭなどの適切なＲＰＭに設定したシェイカーで実施することが好ましい。しかしながら、適切なＲＰＭはその方法の規模に応じて変わる。
【００６８】
発酵
宿主細胞サンプルを培養するステップは、任意の望ましい規模での発酵を含むことができる。本発明の方法中、サンプルは、細菌、特にグラム陰性細菌、又は酵母、細胞培養物、例えばただし非制限的に、哺乳動物若しくは昆虫細胞培養物を含む発酵の産物であってよい。最も好ましくは、サンプルは組換え抗体を発現する大腸菌を含む発酵の産物であり、産生される前記抗体は機能性抗体と非機能性抗体の混合物であり得る。望む場合、宿主細胞に発酵培地からの回収を施すことができ、例えば宿主細胞は遠心分離、濾過又は濃縮によってサンプルから回収することができる。特に、本発明の方法は、治療性の抗体の大規模な工業的生産に適している。
【００６９】
さらなるステップ
本発明による方法は、１つ又は複数のさらなるステップを含むことができる。
【００７０】
一実施形態では、本発明による方法は、培養のステップ後に遠心分離のステップ、次に抽出バッファーの添加による細胞の懸濁のステップを含む。
【００７１】
その方法は、濾過及び／又は遠心分離などの一次精製手順を追加的に含むことができる。流動床クロマトグラフィーも含まれる。好ましい下流精製手順には、イオン交換クロマトグラフィー、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、並びに固定床捕捉及び膨張床捕捉、並びにこれらの任意の組合せが含まれる。
【００７２】
非溶解処理ステップ
その方法は、サンプルに熱処理ステップを施す前に、サンプルに非溶解処理ステップを施すことをさらに含むことができる。このステップは、均質化ステップ（ｈｏｍｏｇ．ステップ）と呼ぶこともできる。非溶解処理ステップは、単離される又は得られる機能性抗体の収率、及び大規模なサンプル処理の容易さをさらに増大することができる。溶解は粘性の増大を引き起こし、機能性抗体の下流処理及び精製において問題を引き起こす可能性がある。特に、宿主細胞の溶解は宿主細胞タンパク質の放出を引き起こし、精製をより高価で時間を浪費するものにする。さらなる精製ステップが必要とされる可能性があり、及び／又はより多量のクロマトグラフィー物質が必要純度を得るのに必要とされるからである。宿主細胞ＤＮＡの相当な放出はサンプルの粘性を増大させ、浄化中のタンパク質消失の主な原因である濾過及び遠心分離における難題を引き起こす。溶解サンプル（即ち、宿主細胞タンパク質及びＤＮＡを含有する）も、クロマトグラフィー物質の閉塞を引き起こす可能性がある。非溶解処理ステップは、（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）ＷＯ２００６／０５４０６３中に記載されたように実施することが好ましい。ＷＯ２００６／０５４０６３中に記載されたように、非溶解処理ステップは、相当な割合の細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞、又は組換え抗体発現に使用される他の生物、例えば大腸菌の溶解を生じさせない任意の処理を含む。最も好ましい実施形態では、非溶解処理は圧力処理を含む。或いは、非溶解処理は、振動又は撹拌の事前調整ステップを含む。「相当な割合」は、発酵又は培養中に８０％以上の割合の生物が完全な形で存在すること、より好ましくは８５％を超えて、さらにより好ましくは９０％を超えて、最も好ましくは９５％以上が完全であることを含む。
【００７３】
顕微鏡下での観察、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析、及び全タンパク質対上清中及び／又は生物（細胞）ペレット中のタンパク質のアッセイを含めた、当技術分野で知られている任意の方法で溶解を判断することができる。一実施形態では、処理前後にサンプル中の全タンパク質を比較することによって、非溶解処理後に溶解を判断することができる。処理が溶解を引き起こしている場合、処理サンプルの上清中に存在する全タンパク質は、例えばブラッドフォードアッセイを使用して測定した、前記未処理サンプル中に存在する全タンパク質と比較して増大し得る。好ましい実施形態ではＦＡＣＳ分析を実施し、サンプルを蛍光色素で標識し、次に非溶解処理及びＦＡＣＳ分析を行う。処理前にＦＡＣＳ分析を実施し、比較用のベースライン値を与えることが最も好ましい。
【００７４】
したがって、非溶解処理は、例えばバッファー中での一定時間の軽い再懸濁、例えば振動若しくは撹拌による、又はピペッティングなどの手作業の再懸濁による事前調整を含むことができる。一実施形態では、１時間〜２４時間の間、好ましくは１時間〜２０時間の間、より好ましくは２時間〜１８時間の間、４時間〜１６時間、６時間〜１６時間、最も好ましくは１２、１４又は１６時間、事前調整を実施する。したがって、事前調整の最小時間は１、２又は４時間であり、最大時間は１６、１８又は２４時間である。事前調整は、５０〜２５０ｒｐｍ、好ましくは６０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍでの回転によって、最も好ましくは１４又は１６時間実施することができる。事前調整中、４℃〜３０℃、より好ましくは４℃〜２０℃の間の範囲内の温度、最も好ましくは室温に細胞を維持する。
【００７５】
一実施形態では、事前調整ステップは、このプロセスの一部を含まない。
【００７６】
好ましい実施形態では、非溶解処理は、例えばフレンチプレス又は窒素減圧を使用して、高圧に宿主細胞を曝すことを含む。具体例では、サンプルは大腸菌発酵の産物であり、前記大腸菌は組換え抗体を発現し、それにフレンチプレス中での圧力処理を施す。圧力は７５０ｐｓｉ又はその周辺〜５０００ｐｓｉ又はその周辺の範囲であってよい。一実施形態では、圧力処理は１０００ｐｓｉ、又は１２５０ｐｓｉ、１５００ｐｓｉ、１７５０ｐｓｉ、２０００ｐｓｉ、２２５０ｐｓｉ、２５００ｐｓｉ、２７５０ｐｓｉ、３０００ｐｓｉ、３２５０ｐｓｉ、３５００ｐｓｉ、４０００ｐｓｉ、４２５０ｐｓｉ、４５００ｐｓｉ又は４７５０ｐｓｉで実施する。圧力処理は１０００ｐｓｉ〜３０００ｐｓｉの間で実施することがより好ましく、２０００ｐｓｉで実施することが最も好ましい。実質的に非溶解である（即ち、２０％未満の溶解を引き起こす）圧力処理は、サンプルを含むバッファー及び細胞型、及び圧力に応じて、簡単な実験によって決定することができる。
【００７７】
本発明の一実施形態では、その方法は、高圧への宿主細胞の暴露又は一定時間の軽い再懸濁による事前調整などの、前に記載した非溶解処理ステップを含まない。このような非溶解処理ステップを含めることは、組換えタンパク質の収率を改善することが知られている（ＷＯ２００６／０５４０６３）。しかしながら、このような非溶解処理ステップ有り又は無しで本発明の方法によって、抗体の改善された収率が得られることが驚くべきことに分かっている。したがって、その方法が非溶解処理ステップを含まない実施形態では、本発明は、組換え抗体を得るのにより簡潔でコスト効率の良い手段を提供する。
【００７８】
保持ステップ
一実施形態では、本発明による方法は、宿主細胞サンプルを培養するステップと抽出バッファー添加前の間に、その方法を中断するステップを含む。中断ステップの最中、サンプルは適切な温度で維持する。その方法を中断するこのステップは、ＷＯ２００５／０１９４６６中に記載されたように実施することが好ましい。このステップは、細胞スラリー保持ステップ（ＣＳＨ）と呼ぶこともできる。その方法は、少なくとも約１時間、１時間〜７２時間、１２時間〜４８時間、１２時間、２４時間、３３時間又は４８時間の間、中断することが好ましい。
【００７９】
サンプルは、その方法の中断中、１８℃などの適切な温度で保持することが好ましい。
【００８０】
本発明の一実施形態では、その方法は、ＷＯ２００５／０１９４６６中に記載されたような、宿主細胞サンプルを培養するステップ後の中断ステップを含まない。このような中断を含めることは、組換えタンパク質の収率を改善することが知られている（ＷＯ２００５／０１９４６６）。このような中断ステップ有り又は無しで本発明の方法によって、抗体収率の同様の改善が得られること、即ち、中断ステップをその方法中に含めたとき、収率のさらなる増大は観察されなかったことが驚くべきことに分かっている。したがって、その方法が中断ステップを含まない実施形態では、本発明は、組換え抗体を得るのにより簡潔でコスト効率の良い手段を提供する。したがって、一実施形態では、宿主細胞サンプルを培養するステップと抽出バッファー添加ステップの間の時間期間は、１２時間未満、好ましくは１０時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下又は１時間以下又は１時間未満である。
【００８１】
抗体
本明細書で使用する「機能性抗体」は、それらに対して産生した抗原（同族抗原）を特異的に認識する又はそれと結合する能力を保持する抗体分子を含む。機能性抗体の産生は、抗体の予想分子量に対応する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の一本のバンドの存在によって、又はＢＩＡｃｏｒｅ、又は当業者に知られている他の方法、例えばそれだけに限らないがＥＬＩＳＡを使用した直接結合アッセイによって示される。非機能性抗体は、それらの同族抗原を認識しない断片を含み、それらの同族抗原を認識しない又はそれらと結合しない、不正確にフォールディング又は不正確に構築された抗体、遊離重鎖及び軽鎖、及び部分的に分解した抗体断片を含めたそれらの断片を含む。
【００８２】
好ましい例では、組換え抗体分子は、抗体軽鎖の少なくとも一部分と抗体重鎖の少なくとも一部分であり、したがって、発現される軽鎖と重鎖抗体分子の少なくともある部分を組合せて、機能性抗体を形成することができる。
【００８３】
本明細書で使用する「抗体」は、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３３１中に記載されたように、完全長重鎖及び軽鎖を有する抗体、それらの機能活性断片、誘導体又はアナログを含み、それだけに限らないが、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、変更ヒンジＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ断片、軽鎖又は重鎖モノマー又はダイマー、単鎖抗体、例えば重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがペプチドリンカーによってつながった単鎖Ｆｖ、又はＦａｂ−ｄＡｂなどの二重特異性抗体であってよい。
【００８４】
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、二、三、又は四価抗体、ヒト化又はキメラ抗体であってよい。これらの抗体及びそれらの断片は、天然に存在する、ヒト化、キメラ又はＣＤＲ移植抗体であってよく、標準的な分子生物学の技法を使用して、必要に応じてアミノ酸若しくはドメインを改変、付加又は欠失することができる。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照）。本発明の方法を使用して精製した抗体分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）又はサブクラスの免疫グロブリン分子であってよい。
【００８５】
これらの抗体分子を作製するための方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｓｈｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ、ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４；Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２：３２３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ、米国特許第５，５８５，０８９号；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ ａｎｄ Ａｄａｉｒ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０：１〜１４２；Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６：１６５〜１８１）を参照）。
【００８６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ、「モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ｐｐ７７〜９６、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５）などの、当技術分野で知られている任意の方法によって調製することができる。
【００８７】
キメラ抗体は、軽鎖及び重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントで構成されるように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる抗体である。これらのキメラ抗体はおそらく低抗原性である。二価抗体は、当技術分野で知られている方法によって作製することができる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７〜５３９；ＷＯ９３／０８８２９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５〜３６５９）。二、三、及び四価抗体は多重特異性を含むことができ、又は単一特異性であってよい（例えばＷＯ９２／２２８５３を参照）。
【００８８】
Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ ａｌ、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３〜７８４８によって、及びＷＯ９２／０２５５１中に記載されたように、特異的抗体の産生用に選択した単一リンパ球から作製した免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡの分子クローニング及び発現に基づき、単一リンパ球抗体法を使用して抗体配列を作製することもできる。後者の方法は個々の抗体産生細胞の単離を利用するものであり、次いでそれらをクローン増殖し、次にその同族抗原を認識する抗体を産生するこれらのクローンをスクリーニングし、且つ望ましい場合、それらの可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）遺伝子の配列を後に同定する。或いは、その同族抗原を認識する抗体を産生する細胞を一緒に培養して、次にスクリーニングすることができる。
【００８９】
本発明の方法を使用して調製した抗体は、患者に投与すると抗体の半減期を延長する、毒素、薬剤、細胞毒性化合物、又はポリマー、又は他の化合物と後に連結することが可能である、ヒト化抗体であることが最も好ましい。
【００９０】
抗体は、任意の標的抗原に特異的であってよい。抗原は、細胞関連タンパク質、例えば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であってよく、又は抗原は可溶性タンパク質であってよい。対象の抗原は、疾患又は感染中に上方制御されるタンパク質、例えば受容体及び／又はそれらの対応するリガンドなどの、任意の医学的関連があるタンパク質であってもよい。細胞表面タンパク質の個々の例には、接着分子、例えば、β１インテグリンなどのインテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１又はＣＳＦ１−受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦ、及び適切な場合、これらの受容体が含まれる。
【００９１】
可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、又はＩＬ１７Ａ及び／又はＩＬ１７ＦなどのＩＬ−１７などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば呼吸系発疹ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子ＴＮＦ（以前は腫瘍壊死因子−αとして知られていた）、腫瘍壊死因子−β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α、及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来増殖因子、及び適切な場合、これらの受容体が含まれる。他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣなどのウイルス、バイオテロリズム物質、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモ毒及び毒素が含まれる。
【００９２】
一実施形態では、抗体を使用して、対象の抗原の活性を機能的に変えることができる。例えば、抗体は、直接的又は間接的に、前記抗原の活性を中和、アンタゴナイズ又はアゴナイズすることができる。
【００９３】
好ましい実施形態では、（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）ＷＯ０１／０９４５８５中に記載されたように、抗体は抗ＴＮＦ抗体、より好ましくは抗ＴＮＦ Ｆａｂ’である。
【００９４】
組換えタンパク質の発現のための方法は、当技術分野でよく知られている。組換え抗体分子の発現に適した宿主細胞の例には、グラム陽性又はグラム陰性細菌、例えば大腸菌、又は酵母細胞、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの細菌、又は哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞及びミエローマ又はハイブリドーマ細胞系、例えばＮＳＯ細胞が含まれる。本発明の方法中、細菌、例えば大腸菌において組換え抗体が産生されることが最も好ましい（Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１６：１６５〜１８１；Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３〜１４７を参照）。
【００９５】
細胞
本発明中で使用する用語「サンプル」は、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した細胞の集団を指す。サンプルは、小規模な抗体産生から商業目的の大規模な抗体生産まで、任意の適切な規模であってよい。
【００９６】
本発明中で使用する細胞は、例えばそれだけに限らないが、細菌、特にグラム陰性細菌、酵母、哺乳動物又は昆虫であってよい。細胞は大腸菌であることが最も好ましい。細胞は野生型細胞、又は遺伝子操作された組換え細胞であってよい。大腸菌宿主細胞は、天然に存在する大腸菌株、又は組換えタンパク質を産生することができる突然変異株であってよい。具体的な宿主大腸菌株の例には、ＭＣ４１００、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＢＬ２１、Ｋ１２、ＸＬ１Ｂｌｕｅ及びＪＭ１０９が含まれる。一例は、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、組換えタンパク質発酵に一般に使用される宿主株である。例には、改変型大腸菌株、例えば、代謝突然変異体及びプロテアーゼ欠損株も含まれる。
【００９７】
本発明の方法を使用して産生した組換え抗体は、タンパク質の性質及び産生の規模に応じて、大腸菌宿主細胞のペリプラズム中、又は宿主細胞培養上清中のいずれかにおいて典型的に発現される。これらの区画にタンパク質を標的化するための方法は当技術分野でよく知られており、総説に関してはＭａｋｒｉｄｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９６、６０、５１２〜５３８を参照。大腸菌のペリプラズムにタンパク質を誘導するのに適したシグナル配列の例には、大腸菌ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、ＬａｍＢ及びＯｍｐＦシグナル配列が含まれる。本来の分泌経路の利用によって、又はタンパク質分泌を引き起こすための外膜の限られた漏出の誘導によって、上清にタンパク質を標的化することができ、それらの例は、ｐｅｌＢリーダー、プロテインＡリーダーの使用、培養培地へのグリシンの添加を伴うバクテリオシン放出タンパク質、マイトマイシン誘導型バクテリオシン放出タンパク質の同時発現、及び膜透過用のｋｉｌ遺伝子の同時発現である。本発明の方法中、組換えタンパク質は宿主大腸菌のペリプラズムにおいて発現されることが最も好ましい。
【００９８】
大腸菌宿主細胞における組換えタンパク質の発現は誘導系の調節下であってもよく、大腸菌における組換え抗体の発現は誘導性プロモーターの調節下にある。大腸菌における使用に適した多くの誘導性プロモーターは当技術分野でよく知られており、且つプロモーターに応じて、組換えタンパク質の発現は、増殖培地中の温度又は特定物質の濃度などの要因を変えることによって誘導することができる（Ｂａｎｅｙｘ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９、１０：４１１〜４２１；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄｏｉ、１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ、１０５〜１２８）。誘導性プロモーターの例には、ラクトース又は非加水分解性ラクトースアナログ、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能である大腸菌ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｃプロモーター、並びにそれぞれホスフェート、トリプトファン及びＬ−アラビノースによって誘導されるｐｈｏＡ、ｔｒｐ及びａｒａＢＡＤプロモーターが含まれる。例えば、誘導物質の添加、又は誘導が温度依存性である場合は温度の変化によって、発現を誘導することができる。組換えタンパク質の発現の誘導が培養物への誘導物質の添加によって達成される場合、発酵系及び誘導物質に応じて任意の適切な方法によって、例えば、シングル又はマルチショット添加によって、又は供給を介した誘導物質の段階的添加によって、誘導物質を加えることができる。誘導物質の添加と実際のタンパク質発現の誘導の間に遅延がある可能性があり、例えば誘導物質がラクトースである場合、任意の既存の炭素源をラクトース前に利用しながら、タンパク質発現の誘導が起こる前に遅延がある可能性があることは理解されよう。
【００９９】
大腸菌宿主細胞培養物（発酵物）は、大腸菌の増殖及び組換えタンパク質の発現を支持する任意の培地中で培養することができる。培地は、本明細書に記載するように必要に応じて増殖率を調節するように改変した、Ｐｉｒｔ Ｓ．Ｊ．（１９７５）「微生物及び細胞培養の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ中に提供された培地などの任意の化学的に定義された培地であってよい。適切な培地の一例は、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ、２００２、「タンパク質の発現及び精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、２６：３０９〜３２０により記載された「ＳＭ６Ｅ」である。
【０１００】
大腸菌宿主細胞の培養は、必要とされる産生の規模に応じて、振とうフラスコ又は発酵槽などの任意の適切な容器内で行うことができる。１，０００リットルを超える、最大約１００，０００リットルまでの容量を有する様々な大規模発酵槽が利用可能である。好ましくは１，０００〜５０，０００リットル、より好ましくは１，０００〜１０，０００又は１２，０００リットルの発酵槽を利用する。０．５リットル〜１，０００リットルの間の容量を有するより小規模な発酵槽を使用することもできる。
【０１０１】
大腸菌の発酵は、必要とされるタンパク質及び収率に応じて、任意の適切な系、例えば連続、回分又は流加形式（Ｔｈｉｒｙ ＆ Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ、２００２、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：１０３〜１０５）で実施することができる。必要な場合は栄養素又は誘導物質のショット添加で、回分形式を使用することができる。或いは、流加培養を使用することができ、発酵槽中に最初に存在した栄養素を使用して維持することができる最大特異的増殖率で回分形式事前誘導において培養物を増殖し、１つ又は複数の栄養素供給レジメを使用して、発酵が終了するまで増殖率を調節することができる。流加形式を事前誘導に使用して大腸菌宿主細胞の代謝を調節し、より高い細胞密度に到達させることも可能である（Ｌｅｅ、１９９６、Ｔｉｂｔｅｃｈ、１４：９８〜１０５）。
【０１０２】
本発明の各実施形態の好ましい特徴は、必要な変更を加えて他の各実施形態と同様である。それだけに限らないが本明細書中に列挙する特許及び特許出願を含めた全ての刊行物は、それぞれ個々の刊行物が、完全に言及されるように参照により本明細書に組み込まれることが具体的且つ個別に示されるが如く、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
一態様では、前記方法から得られるか又は得ることができる抗体を提供する。
【０１０４】
一態様では、特に調節で確実にｐＨが熱抽出ステップなどの抽出ステップの最中にｐＨ６〜９の範囲内に維持されるようにする場合の、抗体抽出、例えば一次抽出を改善するための、バッファーなどのｐＨ調節手段の使用を提供する。
【０１０５】
本明細書で利用するｐＨ調節手段は、バッファー、塩基及び／又は酸である。
【０１０６】
ここで本発明を、以下の実施例を参照しながら記載する。これらは単なる例示的なものであり、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】経時的なｐＨ７．４及びｐＨ８のトリス／ＥＤＴＡ抽出バッファー中に再懸濁した細胞のｐＨを示すグラフである。
【図２ａ】抗体Ａの収率に対する抽出バッファーのｐＨの影響を示すヒストグラムである。
【図２ｂ】７．４〜９．０のｐＨを有する抽出バッファーの添加直後の細胞サンプル（再懸濁した細胞スラリー）のｐＨ、及び加熱段階前の抽出バッファーの添加後１時間での細胞サンプルのｐＨを示すヒストグラムである。
【図３ａ】抗体Ａの収率に対する、熱処理ステップ前にサンプルのｐＨを調整する影響を示すヒストグラムである。それぞれのバーの上の数字は、ｐＨ調整のステップが無い対照と比較した収率の増大率を示す。
【図３ｂ】その方法の様々な段階：細胞スラリー（培養及び遠心分離後）、バッファー添加後（抽出バッファー添加直後）、ｐＨ調整前、ｐＨ調整後ただし加熱段階前、及び熱処理ステップ後にわたっての、サンプルの様々なｐＨを示すグラフである。
【図４】熱処理後に細胞から抽出した抗体ＡサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２は抗体Ａのサンプルであり、レーン３は無ｐＨ調整後のサンプルであり、且つレーン４〜８は熱処理ステップ前のそれぞれ７．０、７．２、７．４、７．６及び７．８へのｐＨ調整後のサンプルを示す。
【図５】抗体Ａの収率に対する、ｐＨ８での抽出バッファーの使用、及び熱処理ステップ前のｐＨ７．４へのサンプルのｐＨ調整の影響を示すヒストグラムである。図５は、均質化ステップ又は細胞スラリー保持ステップを含めた影響も示す。それぞれのバーの上の数字は、均質化ステップ有りただしｐＨ調整ステップ無しの対照と比較した収率の増大率を示す。
【図６】熱処理後に細胞から抽出した抗体ＡサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 レーン１は分子量マーカーであり、 レーン２は抗体Ａのサンプルであり、 レーン３は、均質化ステップ後、ただし無ｐＨ調整及び無細胞スラリー保持のサンプルであり、 レーン４は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、並びに均質化ステップ及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、 レーン５は、無ｐＨ調整、無均質化及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、 レーン６は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、並びに無均質化及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、 レーン７は、細胞スラリー保持、ただし無ｐＨ調整及び無均質化後のサンプルであり、 レーン８は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、及び細胞スラリー保持、ただし無均質化後のサンプルである。
【図７】ｐＨ調整無しの対照サンプル、ｐＨ８の抽出バッファーで処理したサンプル、ｐＨ７．４の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプル、及びｐＨ８の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプルに関する、経時的なサンプルのｐＨを示すグラフである。第一のピークは抽出バッファーを加えた時点を示し、第二のピークは熱処理ステップ前に２サンプルのｐＨを調整した時点を示す。
【図８】抗体Ａの収率に対する、ｐＨ調整無しの対照サンプル、ｐＨ７．４の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプル、ｐＨ８の抽出バッファーで処理したサンプル、及びｐＨ８の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプルの影響を示すヒストグラムである。それぞれのバーの上の数字は、ｐＨ調整のステップが無い対照と比較した収率の増大率を示す。
【図９】抗体Ａの収率に対する、ｐＨ調整無しの対照サンプル、ｐＨ７．４の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前に加熱段階中にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプル、及びｐＨ８の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前に加熱段階中にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプルの影響を示すヒストグラムである。それぞれのバーの上の数字は、ｐＨ調整のステップが無い対照と比較した収率の増大率を示す。
【図１０】無ｐＨ調整対照と比較したＦａｂ’の力価に対する６．６、７．０、７．４及び７．８単位へのｐＨ調整の影響を示すヒストグラムである。実験は無前処理、細胞スラリー保持及び均質化の（抽出前の）３つの異なる前処理ステップで反復する。
【図１１】以下の条件；無ｐＨ調整、無前処理及び（範囲６．６〜７．８単位への）ｐＨ調整、均質化及び（範囲６．６〜７．８単位への）ｐＨ調整、及び全てのｐＨ調整条件（均質化及び無前処理）の、平均したＦａｂ’の力価を示すヒストグラムである。エラーバーは、平均からの一標準偏差を示す。
【０１０８】
一般的な方法
以下の実施例では、他に言及しない限り以下のようにその方法を実施する。
【０１０９】
細胞培養ステップ及び遠心分離：
抗体Ａ（Ｆａｂ’）を、挿入抗体ＡをコードするＤＮＡを有するベクターｐＴＴ０Ｄを使用して、大腸菌Ｗ３１１０細胞において発現させた。ラクトースを用いた誘導後２５℃で３０時間発酵を実施し、採取の用意をした。５０ｍｌ又は１Ｌの採取した培養物アリコートは、１時間４２００ＲＰＭ及び４℃で遠心分離した。
【０１１０】
上清をデキャンタし、産生規模で浄化をシミュレートするために、少ない割合の上清を細胞に加えて生成する細胞スラリーサンプルを採取重量の３５％にした。
【０１１１】
細胞スラリー保持ステップ（ＣＳＨ）：
いくつかの実験において、細胞スラリー保持ステップを実施し、抽出バッファーの添加前に１８℃及び２００ＲＰＭで３３時間サンプルを保持した。
【０１１２】
抽出バッファーの添加：
生成する細胞スラリーサンプル（本明細書では以後サンプルと呼ぶ）を、３００ｍＭのトリス及び３０ｍＭのＥＤＴＡストック溶液を使用して再懸濁し、ＨＣｌを使用して調整した７．４のｐＨを有する１００ｍＭのトリス及び１０ｍＭのＥＤＴＡの最終濃度にした。以下に記載する実験において、この抽出バッファーのｐＨは、７．４の対照ｐＨからｐＨ７．４〜９．０の間のより高ｐＨレベルまでに調整する。
【０１１３】
均質化ステップ（Ｈｏｍｏｇ．）：
いくつかの実験において、１５００ｐｓｉでの一回通過により抽出バッファーの添加後に、均質化ステップを実施した。
【０１１４】
加熱段階前のｐＨ調整：
いくつかの実験において、サンプルは５ＭのＮａＯＨを用いたｐＨ調整に施して、加熱段階の開始前に７．０〜７．８の間の望ましいレベルにした。
【０１１５】
加熱段階
サンプルは加熱段階に施し、サンプルの温度は１８℃から５９℃の望ましい高温まで上昇させ、５９℃で熱処理ステップを開始した。
【０１１６】
加熱段階中のｐＨ調整：
いくつかの実験において、５９℃の望ましい高温に達するまで、加熱段階中に、サンプルを５ＭのＮａＯＨを用いたｐＨ調整に施して７．４±０．０２の望ましいレベルにした。
【０１１７】
熱処理ステップ
サンプルは１０〜１２時間５９℃及び２００ＲＰＭで保持した。
【０１１８】
熱処理後、再懸濁した細胞ペレットを、４℃において１時間、４２００ｒｐｍでの遠心分離によって浄化した。機能性抗体Ａを含有する上清は、２０ｍＭのリン酸バッファーにおけるプロテインＧ ＨＰＬＣ分析を使用してＦａｂ’に関してアッセイした。注入時のｐＨ７．０から２．５のｐＨまで低下させたｐＨ勾配を使用して、抗体Ａを溶出した。
【０１１９】
還元抽出サンプルは、約１μｇの充填濃度でトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せた。
【０１２０】
（例１）
抽出バッファー添加後のサンプルのｐＨに対する影響
バッファーがｐＨ８．０又はｐＨ７．４を有した、細胞培養ステップ及び抽出バッファー添加ステップは、一般的な方法の節に記載したように実施した。サンプルのｐＨは、抽出バッファーの添加からモニタリングした。図１は、バッファーの添加後にサンプルのｐＨの急速な低下があること、及び特にバッファーが７．４のｐＨを有するとき、ｐＨがｐＨ７未満に急激に低下することを示す。
【０１２１】
（例２）
抗体収率に対する抽出バッファーのｐＨの影響
細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ、加熱段階及び熱処理ステップを、一般的な方法の節に記載したように実施した。
【０１２２】
細胞スラリー保持ステップ、均質化ステップ、及び加熱前又は最中のｐＨ調整ステップは実施しなかった。
【０１２３】
抽出バッファーのｐＨは以下のように変えた：７．４、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９及び９．０。熱抽出後のＦａｂ’の濃度を示す図２ａ中に結果を示す。７．４を超える抽出バッファーの高いｐＨは、Ｆａｂ’の回収に関する有意な増大、ｐＨ８．８まで増大した収率をもたらしたことを見ることができる。８．８を超えると、Ｆａｂ’の濃度は低下し始めた。
【表１】
【０１２４】
表１及び図２ｂは、７．４〜９．０のｐＨを有する抽出バッファーの添加直後の細胞サンプル（再懸濁した細胞スラリー）のｐＨ、及び加熱段階前の抽出バッファーの添加後１時間での細胞サンプルのｐＨを示す。
【０１２５】
（例３）
抗体収率に対する加熱段階前のｐＨの影響
細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ、均質化ステップ、加熱前のｐＨ調整ステップ、加熱段階及び熱処理ステップを、一般的な方法の節に記載したように実施した。対照にはｐＨ調整ステップを施さなかった。
【０１２６】
対照実験では、抽出バッファーはｐＨ７．４であり、他の実験では、加熱段階前にｐＨを調整したとき、抽出バッファーはｐＨ８．０であった。
【０１２７】
細胞スラリー保持ステップ、及び加熱最中のｐＨ調整ステップは実施しなかった。
【０１２８】
対照では、加熱段階前のｐＨ調整は実施しなかった。他の実験では、サンプルのｐＨは加熱段階前にｐＨ７．０、７．２、７．４、７．６及び７．８に調整した。
【０１２９】
このｐＨ調整ステップが改善されたＦａｂ’回収をもたらしたことを示す図３ａ中に、その結果を示す。図３ａは、どのようにしてｐＨ７．０〜７．８の範囲内に地点を設定するｐＨ調整が、ｐＨ調整を施さなかった対照サンプルと比較して、２６〜４０％産物回収率を増大したかを実証する。
【表２】
【０１３０】
サンプルのｐＨはその方法中の様々な時点で検出した。前の表２及び図３ｂは、その方法の様々な段階：細胞スラリー（培養及び遠心分離後）、バッファー添加後（抽出バッファー添加直後）、ｐＨ調整前、ｐＨ調整後ただし加熱段階前、及び熱処理ステップ後にわたっての、サンプルの様々なｐＨを示す。
【０１３１】
図４中のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、抽出後サンプルのタンパク質プロファイルを示す。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２は抗体Ａのサンプルであり、レーン３は無ｐＨ調整後のサンプルであり、且つレーン４〜８は熱処理ステップ前のそれぞれ７．０、７．２、７．４、７．６及び７．８へのｐＨ調整後のサンプルを示す。
【０１３２】
サンプル充填量は１μｇのＦａｂ’に標準化した。対照と加熱前ｐＨ調整したサンプルの間で、タンパク質プロファイルの有意な差は観察されなかった。
【０１３３】
（例４）
細胞スラリー保持ステップ及び均質化ステップの存在及び不在下での、抗体収率に対する抽出バッファーのｐＨ及びｐＨ調整の影響
以下の実験を一般的な方法の節に記載したように実施した。
●対照（ｈｏｍｏｇ．有り）：細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ７．４）、均質化ステップ、加熱段階及び熱処理ステップ、
●ｐＨ８におけるバッファー、及び加熱前にｐＨ７．４に調整（ｈｏｍｏｇ．有り）：細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ８）、均質化ステップ、加熱前のｐＨ７．４へのｐＨ調整ステップ、加熱段階、及び熱処理ステップ、
●対照（ｈｏｍｏｇ．又はＣＳＨ無し）：細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ７．４）、加熱段階及び熱処理ステップ、
●ｐＨ８におけるバッファー、及び加熱前にｐＨ７．４に調整（ｈｏｍｏｇ．又はＣＳＨ無し）：細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ８）、加熱前のｐＨ７．４へのｐＨ調整ステップ、加熱段階、及び熱処理ステップ、
●対照（ＣＳＨ有り）：細胞培養ステップ、細胞スラリー保持ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ７．４）、加熱段階及び熱処理ステップ、及び
●ｐＨ８におけるバッファー、及び加熱前にｐＨ７．４に調整（ＣＳＨ有り）：細胞培養ステップ、細胞スラリー保持ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ８）、加熱前のｐＨ７．４へのｐＨ調整ステップ、加熱段階、及び熱処理ステップ。
【０１３４】
図５は、前述の実験の結果を示す。加熱前にｐＨ調整ステップを加えることによって、対照と比較して約３４％高い抽出力価をもたらしたことを見ることができる。均質化ステップを含めることによって、ｐＨ調整ステップを含む方法との比較時に、収率に影響がなかったことも見ることができる。細胞スラリー保持は、ｐＨ調整ステップを有するものの比較時ではなく、対照抽出の比較時に高い収率をもたらす。
【０１３５】
図６中のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、抽出後サンプルのタンパク質プロファイルを示す。
レーン１は分子量マーカーであり、
レーン２は抗体Ａのサンプルであり、
レーン３は、均質化ステップ後、ただし無ｐＨ調整及び無細胞スラリー保持のサンプルであり、
レーン４は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、並びに均質化ステップ及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、
レーン５は、無ｐＨ調整、無均質化及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、
レーン６は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、並びに無均質化及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、
レーン７は、細胞スラリー保持、ただし無ｐＨ調整及び無均質化後のサンプルであり、
レーン８は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、及び細胞スラリー保持、ただし無均質化後のサンプルである。
【０１３６】
ｐＨ調整した抽出物のタンパク質プロファイルは、細胞スラリー保持対照と同等であった。
【０１３７】
（例５）
サンプルのｐＨ及びＦａｂ’収率に対する加熱前の抽出バッファーのｐＨ及び／又はｐＨ調整ステップの影響。
細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ、加熱段階及び熱処理ステップを、一般的な方法の節に記載したように実施した。２つの実験が加熱ステップ前にｐＨ調整を含んでおり、２つの実験はこのステップを含んでいなかった。
【０１３８】
細胞スラリー保持ステップ、均質化ステップ、及び加熱中のｐＨ調整ステップは実施しなかった。
【０１３９】
４つの異なるｐＨ調節戦略を実施した：
１．対照：抽出バッファーｐＨ７．４及び加熱前のｐＨ調整無し；
２．抽出バッファーｐＨ７．４及び加熱前に７．４にｐＨ調整；
３．バッファーｐＨ８：抽出バッファーｐＨ８．０及び加熱前のｐＨ調整無し、及び
４．抽出バッファーｐＨ８．０及び加熱前に７．４にｐＨ調整。
【０１４０】
バッファー添加（第一のピーク）、加熱前のｐＨ調整（第二のピーク）及び熱処理（ｐＨ低下）に対して細胞スラリーから開始して一次回収中にｐＨをモニタリングした。図７はそれらの方法中のｐＨプロファイルを示す。
【０１４１】
Ｆａｂ’収率に対する影響を図８中に示し、全てのｐＨ上昇戦略（１〜３）はＦａｂ’収率の増大をもたらしたこと、及び上昇バッファーと加熱前ｐＨ調整の組合せを使用した戦略４は最高のＦａｂ’回収率をもたらしたことを見ることができる。
【０１４２】
（例６）
サンプルのｐＨ及びＦａｂ’収率に対する加熱中の抽出バッファーのｐＨ及び／又はｐＨ調整ステップの影響。
細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ、加熱段階及び熱処理ステップを、一般的な方法の節に記載したように実施した。２つの実験が加熱ステップ中にｐＨ調整を含んでおり、対照はこのステップを含んでいなかった。
【０１４３】
細胞スラリー保持ステップ、均質化ステップ、及び加熱前のｐＨ調整ステップは実施しなかった。
【０１４４】
３つの異なるｐＨ調節戦略を実施した：
１．対照：抽出バッファーｐＨ７．４及び加熱中のｐＨ調整無し；
２．抽出バッファーｐＨ７．４及び加熱中に７．４にｐＨ調整；
３．抽出バッファーｐＨ８．０及び加熱中に７．４にｐＨ調整。
【０１４５】
Ｆａｂ’収率に対する影響を図９中に示し、全てのｐＨ上昇戦略（２及び３）はＦａｂ’収率の増大をもたらしたこと、及び上昇バッファーと加熱中のｐＨ調整の組合せを使用した戦略４は最高Ｆａｂ’回収率をもたらしたことを見ることができる。
【０１４６】
（例７）
発酵ブロスを得、それを遠心分離して大部分の使用済み培地を除去し、それによって細胞スラリーを生成することによって実験を実施した。この細胞スラリーは、細胞スラリー保持（ｃｅｌｌ ｓｌｕｒｒｙ ｈｏｌｄ）の場合３３時間保持した。均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ）及び無前処理条件の場合、細胞は抽出バッファー中に再懸濁し、均質化又はいかなる前処理もしない熱抽出のいずれかを行った。細胞スラリー保持の後、細胞は抽出バッファー中に再懸濁した。全条件のものを抽出バッファー中に再懸濁した後、それらは（図１２中に示す）望ましい設定地点にｐＨ調整し、熱抽出（５９℃で１０時間）を開始した。熱抽出の後、液相中のＦａｂ’力価を決定するために抽出物を遠心分離によって浄化した。
以下のデータは図１２中にも示す。
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え抗体、特に治療用抗体の産生及び単離における収率を増大するための方法に関する。これらの方法は、治療用抗体の大規模な工業的生産に特に適している。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技法は急速に開発されており、抗体、特に治療用抗体の産生において特に有用である。組換え遺伝子の発現に関する系は、問題の技術分野の当業者にはよく知られている。これらは、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、並びにトランスジェニック動物及び植物における発現を含む。発現系の選択は、コードタンパク質の特徴、例えば翻訳後修飾に依存する。他の考慮事項は時間、及び特に、所望量の必要とされる品質の物質の産生に関するコストを含む。これらの後者の考慮事項は、監督機関の承認が必要な品質及び多数の患者の治療に必要とされる量の、治療用抗体の産生において特に重要である。
【０００３】
組換えタンパク質の産生に最も広く使用されている系は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に基づいている。大腸菌の使用で直面する具体的な問題は、治療に必要な量の必要とされる品質の物質を産生する際の困難である。特に、関連する時間及びコストは禁じられ得る。顕著な１つの具体的な問題は、大腸菌からの抗体の抽出中の抗体の収率において被る損失である。
【０００４】
比例して、精製コストは治療用抗体産物の全コストの一部分であるが、精製コストの割合は、上流産生コストが安くなるとさらに増大する。したがって、抗体の回収及び精製の改善は、産生の手段とは無関係に産生コストをさらに低減する（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ＆ Ｇｌｏｖｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ／’ｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００１、４：１７２〜１８５）。したがって、例えば産物の回収を高めること、及び／又は産物の流れの品質を改善することによって、治療用抗体産生、及び特に精製に時間及び／又はコスト節約をもたらす方法が必要とされる。
【０００５】
発酵又は培養当たりの低い産物収率は、一次抽出段階で示される特定の問題であることが多く、抗体の発現は細胞内では高いが、一次抽出段階での高い回収率を得るのは非常に難しい。
【０００６】
この後者の問題を部分的に処理し、治療用途に許容可能な抗体の産生を可能にする方法は、米国特許第５，６５５，８６６号中に記載されている。この方法は、非機能性抗体からの抗体機能性Ｆａｂ’断片の後の単離を容易にするための熱処理の使用を含み、熱処理は発酵若しくは培養中の任意の時間、又は抗体の抽出及び精製中の任意の段階で実施する。室温を超える高温において、機能性抗体は非常に安定性があり、一方で宿主細胞タンパク質及び遊離軽鎖及び重鎖種及び抗体の非機能性断片を含めた、多くの他のタンパク質は、濾過若しくは遠心分離若しくは流動床クロマトグラフィーなどの一次精製手順中に機能性抗体から容易に分離される沈殿及び／又は凝集体を形成する。細胞抽出物は、ＥＤＴＡ１０ｍＭを含有するトリスＨＣｌバッファー１００ｍＭ、ｐＨ７．４中で完全細胞をインキュベートすることによって、米国特許第５，６５５，８６６号中に記載された方法で調製した。
【０００７】
ＷＯ２００６／０５４０６３は、熱処理と組合せた非溶解処理を含めることによる、一次抽出段階での機能性抗体の収率の増大を記載する。この方法は、遠心分離後、１００ｍＭのＥＤＴＡを含有する１Ｍのトリス、ｐＨ７．４を含むサンプル中に細胞ペレットを再懸濁し、次に非溶解処理、次いで熱処理を行ったことを教示する。
【０００８】
ＷＯ２００５／０１９４６６は、発酵後ただし抽出を含めた下流処理前に定義した温度及びｐＨ条件下での中断ステップを含めることによる、組換えタンパク質の収率の増大について記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本明細書に記載する本発明は、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養した後、一次回収プロセス中に生成したサンプルのｐＨの増大は、抗体の収率に対して著しく有益な影響があるという、驚くべき予想外の観察結果に基づく。
【００１０】
抗体は加熱などの処理前に範囲６〜９のｐＨで開始することはできるが、驚くべきことに緩衝処理したときでさえ、おそらく細胞代謝の結果としてｐＨは低下する。本発明者らは、これは収率／回収に対して悪影響があると現在考えており、適切な場合、確実にｐＨが標的範囲内に留まるようにするための処理の前及び／又は最中に物質のｐＨを調整することによって、これに取り組むことを提案している。
【００１１】
熱処理ステップ前のサンプルのｐＨは、細胞サンプルからの抗体の収率に対して相当な影響があることが、驚くべきことに分かっている。サンプルのｐＨが熱処理ステップ前にｐＨ６〜９となるようにサンプルのｐＨを調整することによって、４０％までの抗体の収率の増大をもたらすことが分かっている。これは、治療品質の量の機能性抗体の産生の、時間及びコストの非常に有益な節約を可能にする。実際、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）及び保持（ｈｏｌｄ）ステップなどの、収率を増大するために使用されることが多い他のステップは、高レベルの抗体収率を得るのに、もはや必要とされない可能性がある。
【００１２】
例えば米国特許第５，６５５，８６６号中で、以前に使用された方法中では、７．４のｐＨを有するバッファー中で完全細胞をインキュベートすることによって、細胞抽出物が調製された。サンプルのｐＨを一定レベルに維持すると予想されるバッファーの添加にもかかわらず、実際細胞サンプルのｐＨは経時的に低下することが分かっている。バッファーの添加後長時間などの特定の状況では、サンプルのｐＨは熱処理ステップ前にｐＨ５．５ほど低いことが分かっている。確実にサンプルのｐＨが６〜９となるようにするための、熱処理前のｐＨの検出、及び場合によっては調整は、抗体の収率の驚くべき増大をもたらすことが分かっている。
【００１３】
理論によって束縛されることは望まないが、熱処理などの処理ステップ中に６〜９の範囲内にｐＨを維持することは重要であると考えられる。（熱処理ステップなどの）処理前のｐＨ調整は、適正範囲内にｐＨを維持するのを手助けする。したがって、一態様では、実質的にプロセスの時間中、実質的に６〜９の範囲内でｐＨを維持する抗体抽出ステップを提供する。
【００１４】
理論によって束縛されるものではないが、本発明によって提供される方法は、標準的抽出条件下において切り離されない一次単離中のペリプラズムからの組換えタンパク質の回収を可能にすると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明の第一の態様では、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、抽出バッファーをサンプルに加えること、及びサンプルに熱処理ステップを施すことを含み、抽出バッファーの添加後サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、熱処理ステップの前に確実にサンプルのｐＨが６〜９となるようにする方法を提供する。
【００１６】
この段階でのｐＨのモニタリングは、ｐＨに対する調節を確立するのに必要不可欠である。
【００１７】
代替の態様では、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルから組換え抗体分子を抽出する方法であって、
前記細胞の組成物のｐＨを６〜９の範囲内で調整して、後の抽出ステップ中にｐＨがその範囲内に維持されるようにするステップ、
熱処理ステップなどの抽出ステップを細胞に施すステップを含み、
抽出ステップの直前及び／又は最中に少なくとも１つの時点でｐＨをモニタリングする方法を提供する。
【００１８】
サンプルを熱処理ステップに施した後、抽出バッファーのｐＨの上昇は、抗体の収率の驚くべき増大をもたらすことも分かっている。
【００１９】
したがって、本発明の第二の態様では、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、７．５〜９．０のｐＨを有するサンプルに抽出バッファーを加えること、及びサンプルに熱処理ステップを施すことを含む方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書で利用する抗体分子は、完全抗体又はその結合断片、特に完全抗体又はＦａｂ断片を指すものとする。
【００２１】
本発明の第一の態様では、サンプルは熱処理ステップ前に６〜９のｐＨを有している、又は有するように調整する。
【００２２】
好ましい実施形態では、サンプルは、熱処理ステップの前に、６．５〜８．５のｐＨ、ｐＨ６．５〜８．０、ｐＨ７．０〜９．０、ｐＨ７．０〜８．５、ｐＨ７．０〜８．０、ｐＨ７．１〜８．０、ｐＨ７．５〜８．０、ｐＨ７．０〜７．８、ｐＨ７．１〜７．８、ｐＨ７．１〜７．７、ｐＨ７．２〜７．６、ｐＨ７．３〜７．５、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８又はｐＨ７．９、ｐＨ７．４など、特にｐＨ６．８を有する。
【００２３】
本明細書で言及するｐＨ測定値は一般に２０℃に標準化する。
【００２４】
本発明の方法中の熱処理ステップは、加熱段階中に望ましい高温に達した後、この望ましい高温にサンプルの温度を維持するステップである。熱処理ステップの適切な温度範囲は３０〜７０℃を含む。
【００２５】
本発明の文脈では、語句「熱処理ステップの前」は、サンプルが望ましい高温に達し、（高温で保持する）熱処理ステップが始まる時点以前を意味する。熱処理ステップに望ましい高温に到達するため、サンプルを「加熱段階」に施し、その間にサンプルの温度が望ましい高温に上昇する。一実施形態では、本発明による方法は、サンプルに加熱段階及び熱処理ステップを施すことを含む。
【００２６】
本発明の方法において、熱処理ステップの前に、サンプルは６〜９のｐＨ、例えばｐＨ６．８を有する。この文脈では、「熱処理ステップの前」は、サンプルが熱処理ステップに望ましい高温に達する時点又はそれより前に、サンプルのｐＨが必要とされるレベルにあることを意味する。その方法がサンプルに加熱段階及び熱処理ステップを施すことを含む実施形態では、サンプルは、加熱段階の開始前に必要とされるｐＨレベル、及び／又は加熱段階の最中に必要とされるｐＨレベルにあり得る。
【００２７】
好ましい実施形態では、サンプルは加熱段階の開始前に６〜９の必要とされるｐＨレベルにある。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、抽出バッファーをサンプルに加えること、及びサンプルに加熱段階及び熱処理ステップを施すことを含み、抽出バッファーの添加後サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、加熱段階の前に確実にサンプルのｐＨがｐＨ６〜９、例えばｐＨ７〜９、ｐＨ７〜８などとなるようにする方法を提供する。
【００２９】
代替の実施形態では、本発明は、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、抽出バッファーをサンプルに加えること、及びサンプルに加熱段階及び熱処理ステップを施すことを含み、抽出バッファーの添加後サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、加熱段階の最中に確実にサンプルのｐＨがｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ６〜７となるようにする方法を提供する。
【００３０】
一実施形態では、サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、確実にサンプルのｐＨが加熱段階の前に第一のｐＨ、加熱段階の最中に第二のｐＨとなるようにする。第一のｐＨと第二のｐＨのレベルは異なることが好ましい。第二のｐＨは第一のｐＨより低いことが好ましい。したがって、本発明は、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、抽出バッファーをサンプルに加えること、及びサンプルに加熱段階及び熱処理ステップを施すことを含み、抽出バッファーの添加後サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、加熱段階の前に確実にサンプルのｐＨがｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ７〜８となるようにし、加熱段階の最中に確実にサンプルのｐＨがｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６〜７となるようにする方法を提供する。この実施形態では、加熱段階の前にサンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整することができ、加熱段階の最中に検出し、場合によっては調整することができる。
【００３１】
好ましい実施形態では、加熱段階の直前に、サンプルは６〜９のｐＨ、好ましくはｐＨ７〜９、より好ましくはｐＨ７〜８を有する。それに加えて又はその代わりに、サンプルが望ましい高温に達し熱処理ステップが始まる時点を場合によっては含めた熱処理ステップの直前、加熱段階の最中に、サンプルは６〜９のｐＨ、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ６〜７を有する。加熱段階の直前又は熱処理ステップの直前のサンプルのｐＨは、組換え抗体の収率に対して有意な影響があることが分かっている。
【００３２】
本発明の文脈では、用語「直前」は、加熱段階、熱処理ステップの前の、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、１分以下、３０秒以下、１０秒以下、５秒以下、１秒以下の時間を意味することが好ましい。用語「直前」は、加熱段階の開始時又は熱処理ステップの開始時に６〜９である溶液のｐＨも包含し得る。
【００３３】
サンプルのｐＨは抽出バッファーの添加後に検出する。サンプルのｐＨは、当技術分野で知られている任意の適切なｐＨ測定機器を使用して検出することができる。サンプルのｐＨは、抽出バッファーの添加時点、抽出バッファーの添加直後、加熱段階の開始直前、加熱段階の開始時点、サンプルが熱処理ステップに望ましい高温に達する時点を含めた加熱段階の最中、熱処理ステップ中及び熱処理ステップ後などの、その方法中の１つ又は複数の別個の時点で検出することができる。或いは、連続モニタリングによってサンプルのｐＨを検出する。サンプルのｐＨを連続的にモニタリングするこの実施形態では、細胞を培養するステップ後、好ましくは培養後の遠心分離のステップ後から、熱処理ステップの開始まで、ｐＨを連続的にモニタリングすることが好ましい。好ましい実施形態では、サンプルのｐＨは、抽出バッファーの添加時点から熱処理ステップの開始まで、連続的にモニタリングする。しかしながら、培養ステップ中及び／又は熱処理ステップ中に、ｐＨをモニタリングすることもできる。
【００３４】
したがって一実施形態では、加熱ステップのｐＨプロファイルを調節する。
【００３５】
好ましい実施形態では、サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整し、サンプルが望ましいｐＨに達したとき、加熱段階を好ましくは自動的に開始させる。
【００３６】
抽出バッファーは細胞サンプルを培養するステップ後に加える。その方法が培養のステップ後に遠心分離のステップを含む場合、遠心分離のステップ前及び／又は最中及び／又は後に、抽出バッファーを加えることができる。遠心分離のステップ後に抽出バッファーを加えて、遠心分離から得られた細胞ペレットを再懸濁することが好ましい。
【００３７】
本発明の一実施形態では、抽出バッファーは、熱処理ステップの前に、確実にサンプルのｐＨがｐＨ６〜９、例えばｐＨ６〜８となるようにする適切なｐＨを有する。抽出バッファーが、熱処理の前に確実にサンプルのｐＨが６〜９、例えばｐＨ６〜８となるようにするのに適したｐＨを有するこの実施形態では、抽出バッファーは例えば、ｐＨ７．５〜９．０、ｐＨ７．５〜８．８、ｐＨ７．５〜８．５、ｐＨ８．０〜９．０、ｐＨ８．５〜９．０、ｐＨ８．６〜８．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９又はｐＨ９．０のｐＨを有する。加熱段階及び熱処理ステップは、確実にサンプルが熱処理ステップ前に必要なｐＨを有するようにするために、抽出バッファーの添加後すぐに、好ましくは直後に実施することが好ましい。例えば、加熱段階又は熱処理ステップは、抽出バッファーの添加後、４時間以下、３時間以下、２時間以下、１時間以下、３０分以下、１０分以下又は５分以下で実施することができる。
【００３８】
したがって、本発明の方法は、サンプルのｐＨ調整のステップを必要としない可能性がある。サンプルのｐＨは、抽出バッファーの添加後に検出して、必要に応じてｐＨ６〜９にすることができる。例えば前に記載したように抽出バッファーのｐＨがサンプルのｐＨを６〜９にするのに適している場合、例えば抽出バッファーが７．５〜９．０のｐＨを有し、熱処理ステップをその後まもなく実施する場合、これが当てはまる可能性がある。
【００３９】
しかしながら典型的には、抽出バッファーの添加と熱処理ステップの間の時間の長さが原因で、本発明による方法は、抽出バッファーの添加によって引き起こすことができる任意のｐＨ調整以外に、熱処理ステップの前に確実にサンプルのｐＨが６〜９となるようにするために、サンプルのｐＨを検出及び調整するステップを必要とする。
【００４０】
その方法がｐＨ検出及び調整のステップを含むこの実施形態では、抽出バッファーのｐＨは、ｐＨ８未満、ｐＨ７．４以下など、例えばｐＨ６．０〜７．４、ｐＨ６．５〜７．４又はｐＨ７．０〜７．４、ｐＨ６．８などであってよい。
【００４１】
或いは、好ましい実施形態では、抽出バッファーは、７．５〜９．０のｐＨ、ｐＨ７．５〜８．８、ｐＨ７．５〜８．５、ｐＨ８．０〜９．０、ｐＨ８．５〜９．０、ｐＨ８．６〜８．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９、ｐＨ９．０、最も好ましくはｐＨ８．０を有する。
【００４２】
この実施形態では、サンプルのｐＨは、その方法中の任意の適切な時間で、任意の適切な手段によって調整することができる。サンプルのｐＨは、抽出バッファーの添加前及び／又は後に調整することができる。
【００４３】
一実施形態では、抽出バッファーの添加前にサンプルのｐＨを調整する。この実施形態では、その方法が培養のステップ後に遠心分離のステップを含む場合、ｐＨ調整のステップは遠心分離のステップの前及び／又は後に実施することができる。細胞培養後、及び場合によっては遠心分離後のサンプルのｐＨは典型的には低い。例えば、サンプルは約ｐＨ５．５のｐＨを有し得る。したがって、細胞培養後、及び場合によっては遠心分離などの１つ又は複数の他のステップ後に、サンプルのｐＨを調整することができる。例えば、サンプルのｐＨを抽出バッファーの添加前に、ｐＨ６．５〜８．０、好ましくはｐＨ７．０〜８．０、ｐＨ６．５〜７．５、ｐＨ６．６〜７．４、ｐＨ６．７〜７．３、ｐＨ６．８〜７．２、ｐＨ６．９〜７．１、最も好ましくはｐＨ６．９に調整することができる。
【００４４】
抽出バッファー添加前のサンプルのｐＨが、ｐＨ７未満、ｐＨ６．９などであり、熱処理ステップ前のサンプルのｐＨがｐＨ７〜９であることが必要とされる一実施形態では、サンプルのｐＨは、熱処理ステップ前のサンプルのｐＨが７〜９であるような、抽出バッファーの添加及び／又は抽出バッファー添加後のさらなるｐＨ調整によるさらなる上昇を必要とする。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、抽出バッファーの添加後、ただし熱処理ステップの前に、サンプルのｐＨをｐＨ６〜９に調整する。この段階で、好ましくはサンプルを、ｐＨ７．０〜９．０、ｐＨ７．０〜８．５、ｐＨ７．０〜８．０、ｐＨ７．１〜８．０、ｐＨ７．５〜８．０、ｐＨ７．０〜７．８、ｐＨ７．１〜７．８、ｐＨ７．１〜７．７、ｐＨ７．２〜７．６、ｐＨ７．３〜７．５、ｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８又は７．９、最も好ましくはｐＨ７．４に調整する。一実施形態では、加熱段階の前にサンプルのｐＨを調整する。好ましくは、サンプルのｐＨを、加熱段階の前にｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ７〜８に調整する。その代わりに又はそれに加えて、加熱段階の最中にサンプルのｐＨを調整する。好ましくは、サンプルのｐＨを、加熱段階の最中にｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６〜７に調整する。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、７．４のｐＨ又はｐＨ８を有する抽出バッファーをサンプルに加え、サンプルのｐＨを検出し、熱処理ステップの前、好ましくは加熱段階の前、より好ましくは加熱段階の直前に、７．４のｐＨにその後調整する。
【００４７】
サンプルのｐＨを抽出バッファーの添加後に検出し、熱処理ステップの前に調整する実施形態では、サンプルのｐＨは加熱段階の開始前に検出し調整することができる。それに加えて又はその代わりに、加熱段階の最中に、サンプルのｐＨを検出し調整することができる。
【００４８】
好ましい実施形態では、加熱段階の直前にサンプルのｐＨを検出し調整する。それに加えて又はその代わりに、サンプルのｐＨは、サンプルが望ましい高温に達し熱処理ステップが始まる時点を場合によっては含めた熱処理ステップの直前、加熱段階の最中に検出し調整する。
【００４９】
本発明の文脈では、用語「直前」は、加熱段階前又は熱処理ステップの前に、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、１分以下、３０秒以下、１０秒以下、５秒以下、１秒以下で、サンプルのｐＨを検出しｐＨ６〜９に調整することを、意味することが好ましい。用語「直前」は、加熱段階の開始時又は熱処理ステップの開始時に、溶液のｐＨを検出し調整することも包含し得る。好ましい実施形態では、サンプルのｐＨがｐＨ６〜９であることを検出するとき、加熱段階及び／又は熱処理ステップを、好ましくは自動的に引き起こす。
【００５０】
サンプルのｐＨは、前に記載したｐＨ調整の任意の単回又は複数回ステップによって、検出し調整することができる。したがってｐＨは、
●抽出バッファーの添加前のみ、
●抽出バッファーの添加後のみ、ただし熱処理ステップの前、又は
●抽出バッファーの添加前及び抽出バッファーの添加後、ただし熱処理ステップの前に調整することができる。
【００５１】
ｐＨは抽出バッファーの添加後に複数回、例えば１、２、３、４又はそれより多く調整することができる。
【００５２】
一実施形態では、サンプルのｐＨは、好ましくは抽出バッファーの添加と熱処理ステップ前の間に、連続的に調整する。
【００５３】
一実施形態では、サンプルのｐＨは、熱処理ステップの最中に、追加的に検出し場合によっては調整することができる。したがって、本発明による方法は、熱処理ステップの最中にサンプルのｐＨを調整するステップをさらに含むことができる。サンプルのｐＨは、ｐＨ６．０〜９．０、ｐＨ６．５〜８．５、ｐＨ６．５〜８．０、ｐＨ７．０〜９．０、ｐＨ７．０〜８．５、ｐＨ７．０〜８．０、ｐＨ７．１〜８．０、ｐＨ７．５〜８．０、ｐＨ７．０〜７．８、ｐＨ７．１〜７．８、ｐＨ７．１〜７．７、ｐＨ７．２〜７．６、ｐＨ７．３〜７．５、ｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８又は７．９に、熱処理ステップの最中に調整することが好ましい。
【００５４】
本発明による第二の態様では、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、７．５〜９．０のｐＨを有するサンプルに抽出バッファーを加えること、及びサンプルに熱処理ステップを施すことを含む方法を提供する。
【００５５】
本発明の第一の態様において前に記載したように、抽出バッファーは７．５〜９．０のｐＨ、ｐＨ７．５〜８．８、ｐＨ７．５〜８．５、ｐＨ８．０〜９．０、ｐＨ８．５〜９．０、ｐＨ８．６〜８．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．８、ｐＨ８．９又はｐＨ９．０を有することが好ましい。本発明のこの態様では、サンプルのｐＨを検出することは必須ではない。本発明の第二の態様による方法は、本発明の第一の態様において記載したように、サンプルのｐＨの検出及びサンプルのｐＨの調整を含むことができる。しかしながら、ｐＨ検出及びｐＨ調整のステップを含めることは必須ではない。一実施形態では、本発明の第二の態様による方法は、サンプルのｐＨを検出するステップ又はｐＨ調整のステップを含まない。
【００５６】
本発明の以下の詳細な説明は、本発明の第一の態様と第二の態様の両方の実施形態に適用する。
【００５７】
ｐＨ調整剤及び抽出バッファー
ｐＨ調整は、熱処理ステップ中ｐＨ６〜９の所望の範囲に、ｐＨが持続／維持されるようなものでなければならない。
【００５８】
一実施形態では、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、又はトリエチルアミン若しくはトリメチルアミンなどの有機塩基などの塩基を用いてｐＨを調整する。
【００５９】
任意の適切な作用物質を使用して、サンプルのｐＨを調整することができる。作用物質は抽出バッファーであってよく、又は抽出バッファーの前及び／又は後に加えることができる。ｐＨを調整するために使用することができる典型的な作用物質は、以下の、ＮａＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、硫酸、ＥＤＴＡ、トリスバッファーの１つ又は複数を含む、又はこれらからなる。水酸化ナトリウム又は水酸化アンモニウムなどの塩基を使用して、サンプルのｐＨを調整することが好ましい。
【００６０】
一実施形態では、抽出バッファーは、典型的にはＨＣｌの添加によって所望のｐＨに調整した、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／エチレンジニトリロ四酢酸二ナトリウム塩二水和物（トリス／ＥＤＴＡ）バッファーである。理論によって束縛されるものではないが、大腸菌の外膜からのリポ多糖（ＬＰＳ）の放出において、トリスとＥＤＴＡは相乗的に働くと考えられる。ＥＤＴＡは、外膜のＬＰＳを安定化させる二価カチオンを除去する。トリスはＬＰＳと結合しＣａ２＋及びＭｇ２＋を置換すると考えられる。これはＬＰＳ分子間の相互作用の低下、したがって外膜の透過性の増大をもたらす（Ｖａａｒａ，Ｍ．１９９２．「外膜の透過性を増大する作用物質（Ａｇｅｎｔｓ Ｔｈａｔ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）」Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５６：３９５〜４１１）。
【００６１】
熱処理ステップ
本発明の方法中の熱処理ステップは、（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）米国特許第５，６６５，８６６号中に詳細に記載されたのと同様であることが好ましい。熱処理ステップは、他の抗体関連物質の除去を容易にすることによって、可溶性の、正確にフォールディング及び構築された抗体のサンプルを得ることを可能にする。「正確にフォールディング及び構築された」抗体は、非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ上に構築された重鎖及び軽鎖に関する予想分子量に対応する一本のバンドの存在によって示される。他の抗体関連物質は、典型的には、正確にフォールディング及び構築された抗体の遊離重鎖及び軽鎖又はそれらの一部分、部分的に分解した断片である。
【００６２】
熱処理ステップは、所望の高温をサンプルに施すことによって実施する。熱処理ステップは、３０℃〜７０℃の範囲内で実施することが最も好ましい。温度は必要に応じて選択することができ、精製用抗体の安定性に依存し得る。別の実施形態では、温度は４０℃〜６５℃の範囲内、又は好ましくは４０℃〜６０℃の範囲内、より好ましくは４５℃〜６０℃の範囲内、さらにより好ましくは５０℃〜６０℃の範囲内、最も好ましくは５５℃〜６０℃、５８℃〜６０℃又は５９℃である。したがって、最小温度は３０℃、３５℃又は４０℃であり、最高温度は６０℃、６５℃又は７０℃である。
【００６３】
熱処理ステップは長時間実施することが好ましい。熱処理の長さは、好ましくは１〜２４時間の間、より好ましくは４〜１８時間の間、さらにより好ましくは６〜１６時間の間、最も好ましくは１０〜１４時間の間又は１０〜１２時間の間、例えば１２時間である。したがって、熱処理に関する最小時間は１、２又は３時間であり、最大時間は２０、２２又は２４時間である。
【００６４】
特定の実施形態では、１０〜１６時間５０℃〜６０℃で、及びより好ましくは１０〜１２時間５９℃で、熱処理を実施する。当業者は、問題のサンプル及び産生される抗体の特性に適合するように、温度及び時間を選択することができることを理解している。
【００６５】
一実施形態では、本開示による方法は、熱処理ステップを実施する前に、調節条件下に細胞を保持する前処理ステップを含まない。
【００６６】
好ましい実施形態では、本発明は、組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、及び抽出バッファーをサンプルに加えること、及び最大１５時間、好ましくは１０〜１２時間の間、４０℃〜７０℃の範囲内、好ましくは５９℃の熱処理ステップをサンプルに施すことを含み、熱処理ステップの前に、サンプルのｐＨが、熱処理ステップの前に、好ましくは加熱段階の直前にｐＨ７〜８、好ましくはｐＨ７．４となるように、サンプルのｐＨをモニタリング及び調整する方法を提供する。７．４又は８．０のｐＨを有する抽出バッファーを、サンプルに加えることが好ましい。
【００６７】
熱処理ステップは、２００ＲＰＭなどの適切なＲＰＭに設定したシェイカーで実施することが好ましい。しかしながら、適切なＲＰＭはその方法の規模に応じて変わる。
【００６８】
発酵
宿主細胞サンプルを培養するステップは、任意の望ましい規模での発酵を含むことができる。本発明の方法中、サンプルは、細菌、特にグラム陰性細菌、又は酵母、細胞培養物、例えばただし非制限的に、哺乳動物若しくは昆虫細胞培養物を含む発酵の産物であってよい。最も好ましくは、サンプルは組換え抗体を発現する大腸菌を含む発酵の産物であり、産生される前記抗体は機能性抗体と非機能性抗体の混合物であり得る。望む場合、宿主細胞に発酵培地からの回収を施すことができ、例えば宿主細胞は遠心分離、濾過又は濃縮によってサンプルから回収することができる。特に、本発明の方法は、治療性の抗体の大規模な工業的生産に適している。
【００６９】
さらなるステップ
本発明による方法は、１つ又は複数のさらなるステップを含むことができる。
【００７０】
一実施形態では、本発明による方法は、培養のステップ後に遠心分離のステップ、次に抽出バッファーの添加による細胞の懸濁のステップを含む。
【００７１】
その方法は、濾過及び／又は遠心分離などの一次精製手順を追加的に含むことができる。流動床クロマトグラフィーも含まれる。好ましい下流精製手順には、イオン交換クロマトグラフィー、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、並びに固定床捕捉及び膨張床捕捉、並びにこれらの任意の組合せが含まれる。
【００７２】
非溶解処理ステップ
その方法は、サンプルに熱処理ステップを施す前に、サンプルに非溶解処理ステップを施すことをさらに含むことができる。このステップは、均質化ステップ（ｈｏｍｏｇ．ステップ）と呼ぶこともできる。非溶解処理ステップは、単離される又は得られる機能性抗体の収率、及び大規模なサンプル処理の容易さをさらに増大することができる。溶解は粘性の増大を引き起こし、機能性抗体の下流処理及び精製において問題を引き起こす可能性がある。特に、宿主細胞の溶解は宿主細胞タンパク質の放出を引き起こし、精製をより高価で時間を浪費するものにする。さらなる精製ステップが必要とされる可能性があり、及び／又はより多量のクロマトグラフィー物質が必要純度を得るのに必要とされるからである。宿主細胞ＤＮＡの相当な放出はサンプルの粘性を増大させ、浄化中のタンパク質消失の主な原因である濾過及び遠心分離における難題を引き起こす。溶解サンプル（即ち、宿主細胞タンパク質及びＤＮＡを含有する）も、クロマトグラフィー物質の閉塞を引き起こす可能性がある。非溶解処理ステップは、（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）ＷＯ２００６／０５４０６３中に記載されたように実施することが好ましい。ＷＯ２００６／０５４０６３中に記載されたように、非溶解処理ステップは、相当な割合の細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞、又は組換え抗体発現に使用される他の生物、例えば大腸菌の溶解を生じさせない任意の処理を含む。最も好ましい実施形態では、非溶解処理は圧力処理を含む。或いは、非溶解処理は、振動又は撹拌の事前調整ステップを含む。「相当な割合」は、発酵又は培養中に８０％以上の割合の生物が完全な形で存在すること、より好ましくは８５％を超えて、さらにより好ましくは９０％を超えて、最も好ましくは９５％以上が完全であることを含む。
【００７３】
顕微鏡下での観察、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析、及び全タンパク質対上清中及び／又は生物（細胞）ペレット中のタンパク質のアッセイを含めた、当技術分野で知られている任意の方法で溶解を判断することができる。一実施形態では、処理前後にサンプル中の全タンパク質を比較することによって、非溶解処理後に溶解を判断することができる。処理が溶解を引き起こしている場合、処理サンプルの上清中に存在する全タンパク質は、例えばブラッドフォードアッセイを使用して測定した、前記未処理サンプル中に存在する全タンパク質と比較して増大し得る。好ましい実施形態ではＦＡＣＳ分析を実施し、サンプルを蛍光色素で標識し、次に非溶解処理及びＦＡＣＳ分析を行う。処理前にＦＡＣＳ分析を実施し、比較用のベースライン値を与えることが最も好ましい。
【００７４】
したがって、非溶解処理は、例えばバッファー中での一定時間の軽い再懸濁、例えば振動若しくは撹拌による、又はピペッティングなどの手作業の再懸濁による事前調整を含むことができる。一実施形態では、１時間〜２４時間の間、好ましくは１時間〜２０時間の間、より好ましくは２時間〜１８時間の間、４時間〜１６時間、６時間〜１６時間、最も好ましくは１２、１４又は１６時間、事前調整を実施する。したがって、事前調整の最小時間は１、２又は４時間であり、最大時間は１６、１８又は２４時間である。事前調整は、５０〜２５０ｒｐｍ、好ましくは６０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍでの回転によって、最も好ましくは１４又は１６時間実施することができる。事前調整中、４℃〜３０℃、より好ましくは４℃〜２０℃の間の範囲内の温度、最も好ましくは室温に細胞を維持する。
【００７５】
一実施形態では、事前調整ステップは、このプロセスの一部を含まない。
【００７６】
好ましい実施形態では、非溶解処理は、例えばフレンチプレス又は窒素減圧を使用して、高圧に宿主細胞を曝すことを含む。具体例では、サンプルは大腸菌発酵の産物であり、前記大腸菌は組換え抗体を発現し、それにフレンチプレス中での圧力処理を施す。圧力は７５０ｐｓｉ又はその周辺〜５０００ｐｓｉ又はその周辺の範囲であってよい。一実施形態では、圧力処理は１０００ｐｓｉ、又は１２５０ｐｓｉ、１５００ｐｓｉ、１７５０ｐｓｉ、２０００ｐｓｉ、２２５０ｐｓｉ、２５００ｐｓｉ、２７５０ｐｓｉ、３０００ｐｓｉ、３２５０ｐｓｉ、３５００ｐｓｉ、４０００ｐｓｉ、４２５０ｐｓｉ、４５００ｐｓｉ又は４７５０ｐｓｉで実施する。圧力処理は１０００ｐｓｉ〜３０００ｐｓｉの間で実施することがより好ましく、２０００ｐｓｉで実施することが最も好ましい。実質的に非溶解である（即ち、２０％未満の溶解を引き起こす）圧力処理は、サンプルを含むバッファー及び細胞型、及び圧力に応じて、簡単な実験によって決定することができる。
【００７７】
本発明の一実施形態では、その方法は、高圧への宿主細胞の暴露又は一定時間の軽い再懸濁による事前調整などの、前に記載した非溶解処理ステップを含まない。このような非溶解処理ステップを含めることは、組換えタンパク質の収率を改善することが知られている（ＷＯ２００６／０５４０６３）。しかしながら、このような非溶解処理ステップ有り又は無しで本発明の方法によって、抗体の改善された収率が得られることが驚くべきことに分かっている。したがって、その方法が非溶解処理ステップを含まない実施形態では、本発明は、組換え抗体を得るのにより簡潔でコスト効率の良い手段を提供する。
【００７８】
保持ステップ
一実施形態では、本発明による方法は、宿主細胞サンプルを培養するステップと抽出バッファー添加前の間に、その方法を中断するステップを含む。中断ステップの最中、サンプルは適切な温度で維持する。その方法を中断するこのステップは、ＷＯ２００５／０１９４６６中に記載されたように実施することが好ましい。このステップは、細胞スラリー保持ステップ（ＣＳＨ）と呼ぶこともできる。その方法は、少なくとも約１時間、１時間〜７２時間、１２時間〜４８時間、１２時間、２４時間、３３時間又は４８時間の間、中断することが好ましい。
【００７９】
サンプルは、その方法の中断中、１８℃などの適切な温度で保持することが好ましい。
【００８０】
本発明の一実施形態では、その方法は、ＷＯ２００５／０１９４６６中に記載されたような、宿主細胞サンプルを培養するステップ後の中断ステップを含まない。このような中断を含めることは、組換えタンパク質の収率を改善することが知られている（ＷＯ２００５／０１９４６６）。このような中断ステップ有り又は無しで本発明の方法によって、抗体収率の同様の改善が得られること、即ち、中断ステップをその方法中に含めたとき、収率のさらなる増大は観察されなかったことが驚くべきことに分かっている。したがって、その方法が中断ステップを含まない実施形態では、本発明は、組換え抗体を得るのにより簡潔でコスト効率の良い手段を提供する。したがって、一実施形態では、宿主細胞サンプルを培養するステップと抽出バッファー添加ステップの間の時間期間は、１２時間未満、好ましくは１０時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下又は１時間以下又は１時間未満である。
【００８１】
抗体
本明細書で使用する「機能性抗体」は、それらに対して産生した抗原（同族抗原）を特異的に認識する又はそれと結合する能力を保持する抗体分子を含む。機能性抗体の産生は、抗体の予想分子量に対応する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の一本のバンドの存在によって、又はＢＩＡｃｏｒｅ、又は当業者に知られている他の方法、例えばそれだけに限らないがＥＬＩＳＡを使用した直接結合アッセイによって示される。非機能性抗体は、それらの同族抗原を認識しない断片を含み、それらの同族抗原を認識しない又はそれらと結合しない、不正確にフォールディング又は不正確に構築された抗体、遊離重鎖及び軽鎖、及び部分的に分解した抗体断片を含めたそれらの断片を含む。
【００８２】
好ましい例では、組換え抗体分子は、抗体軽鎖の少なくとも一部分と抗体重鎖の少なくとも一部分であり、したがって、発現される軽鎖と重鎖抗体分子の少なくともある部分を組合せて、機能性抗体を形成することができる。
【００８３】
本明細書で使用する「抗体」は、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３３１中に記載されたように、完全長重鎖及び軽鎖を有する抗体、それらの機能活性断片、誘導体又はアナログを含み、それだけに限らないが、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、変更ヒンジＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ断片、軽鎖又は重鎖モノマー又はダイマー、単鎖抗体、例えば重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがペプチドリンカーによってつながった単鎖Ｆｖ、又はＦａｂ−ｄＡｂなどの二重特異性抗体であってよい。
【００８４】
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、二、三、又は四価抗体、ヒト化又はキメラ抗体であってよい。これらの抗体及びそれらの断片は、天然に存在する、ヒト化、キメラ又はＣＤＲ移植抗体であってよく、標準的な分子生物学の技法を使用して、必要に応じてアミノ酸若しくはドメインを改変、付加又は欠失することができる。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照）。本発明の方法を使用して精製した抗体分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）又はサブクラスの免疫グロブリン分子であってよい。
【００８５】
これらの抗体分子を作製するための方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｓｈｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ、ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４；Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２：３２３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ、米国特許第５，５８５，０８９号；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ ａｎｄ Ａｄａｉｒ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０：１〜１４２；Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６：１６５〜１８１）を参照）。
【００８６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ、「モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ｐｐ７７〜９６、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５）などの、当技術分野で知られている任意の方法によって調製することができる。
【００８７】
キメラ抗体は、軽鎖及び重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントで構成されるように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる抗体である。これらのキメラ抗体はおそらく低抗原性である。二価抗体は、当技術分野で知られている方法によって作製することができる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７〜５３９；ＷＯ９３／０８８２９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５〜３６５９）。二、三、及び四価抗体は多重特異性を含むことができ、又は単一特異性であってよい（例えばＷＯ９２／２２８５３を参照）。
【００８８】
Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ ａｌ、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３〜７８４８によって、及びＷＯ９２／０２５５１中に記載されたように、特異的抗体の産生用に選択した単一リンパ球から作製した免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡの分子クローニング及び発現に基づき、単一リンパ球抗体法を使用して抗体配列を作製することもできる。後者の方法は個々の抗体産生細胞の単離を利用するものであり、次いでそれらをクローン増殖し、次にその同族抗原を認識する抗体を産生するこれらのクローンをスクリーニングし、且つ望ましい場合、それらの可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）遺伝子の配列を後に同定する。或いは、その同族抗原を認識する抗体を産生する細胞を一緒に培養して、次にスクリーニングすることができる。
【００８９】
本発明の方法を使用して調製した抗体は、患者に投与すると抗体の半減期を延長する、毒素、薬剤、細胞毒性化合物、又はポリマー、又は他の化合物と後に連結することが可能である、ヒト化抗体であることが最も好ましい。
【００９０】
抗体は、任意の標的抗原に特異的であってよい。抗原は、細胞関連タンパク質、例えば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であってよく、又は抗原は可溶性タンパク質であってよい。対象の抗原は、疾患又は感染中に上方制御されるタンパク質、例えば受容体及び／又はそれらの対応するリガンドなどの、任意の医学的関連があるタンパク質であってもよい。細胞表面タンパク質の個々の例には、接着分子、例えば、β１インテグリンなどのインテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１又はＣＳＦ１−受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦ、及び適切な場合、これらの受容体が含まれる。
【００９１】
可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、又はＩＬ１７Ａ及び／又はＩＬ１７ＦなどのＩＬ−１７などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば呼吸系発疹ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子ＴＮＦ（以前は腫瘍壊死因子−αとして知られていた）、腫瘍壊死因子−β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α、及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来増殖因子、及び適切な場合、これらの受容体が含まれる。他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣなどのウイルス、バイオテロリズム物質、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモ毒及び毒素が含まれる。
【００９２】
一実施形態では、抗体を使用して、対象の抗原の活性を機能的に変えることができる。例えば、抗体は、直接的又は間接的に、前記抗原の活性を中和、アンタゴナイズ又はアゴナイズすることができる。
【００９３】
好ましい実施形態では、（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）ＷＯ０１／０９４５８５中に記載されたように、抗体は抗ＴＮＦ抗体、より好ましくは抗ＴＮＦ Ｆａｂ’である。
【００９４】
組換えタンパク質の発現のための方法は、当技術分野でよく知られている。組換え抗体分子の発現に適した宿主細胞の例には、グラム陽性又はグラム陰性細菌、例えば大腸菌、又は酵母細胞、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの細菌、又は哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞及びミエローマ又はハイブリドーマ細胞系、例えばＮＳＯ細胞が含まれる。本発明の方法中、細菌、例えば大腸菌において組換え抗体が産生されることが最も好ましい（Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１６：１６５〜１８１；Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３〜１４７を参照）。
【００９５】
細胞
本発明中で使用する用語「サンプル」は、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した細胞の集団を指す。サンプルは、小規模な抗体産生から商業目的の大規模な抗体生産まで、任意の適切な規模であってよい。
【００９６】
本発明中で使用する細胞は、例えばそれだけに限らないが、細菌、特にグラム陰性細菌、酵母、哺乳動物又は昆虫であってよい。細胞は大腸菌であることが最も好ましい。細胞は野生型細胞、又は遺伝子操作された組換え細胞であってよい。大腸菌宿主細胞は、天然に存在する大腸菌株、又は組換えタンパク質を産生することができる突然変異株であってよい。具体的な宿主大腸菌株の例には、ＭＣ４１００、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＢＬ２１、Ｋ１２、ＸＬ１Ｂｌｕｅ及びＪＭ１０９が含まれる。一例は、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、組換えタンパク質発酵に一般に使用される宿主株である。例には、改変型大腸菌株、例えば、代謝突然変異体及びプロテアーゼ欠損株も含まれる。
【００９７】
本発明の方法を使用して産生した組換え抗体は、タンパク質の性質及び産生の規模に応じて、大腸菌宿主細胞のペリプラズム中、又は宿主細胞培養上清中のいずれかにおいて典型的に発現される。これらの区画にタンパク質を標的化するための方法は当技術分野でよく知られており、総説に関してはＭａｋｒｉｄｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９６、６０、５１２〜５３８を参照。大腸菌のペリプラズムにタンパク質を誘導するのに適したシグナル配列の例には、大腸菌ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、ＬａｍＢ及びＯｍｐＦシグナル配列が含まれる。本来の分泌経路の利用によって、又はタンパク質分泌を引き起こすための外膜の限られた漏出の誘導によって、上清にタンパク質を標的化することができ、それらの例は、ｐｅｌＢリーダー、プロテインＡリーダーの使用、培養培地へのグリシンの添加を伴うバクテリオシン放出タンパク質、マイトマイシン誘導型バクテリオシン放出タンパク質の同時発現、及び膜透過用のｋｉｌ遺伝子の同時発現である。本発明の方法中、組換えタンパク質は宿主大腸菌のペリプラズムにおいて発現されることが最も好ましい。
【００９８】
大腸菌宿主細胞における組換えタンパク質の発現は誘導系の調節下であってもよく、大腸菌における組換え抗体の発現は誘導性プロモーターの調節下にある。大腸菌における使用に適した多くの誘導性プロモーターは当技術分野でよく知られており、且つプロモーターに応じて、組換えタンパク質の発現は、増殖培地中の温度又は特定物質の濃度などの要因を変えることによって誘導することができる（Ｂａｎｅｙｘ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９、１０：４１１〜４２１；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄｏｉ、１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ、１０５〜１２８）。誘導性プロモーターの例には、ラクトース又は非加水分解性ラクトースアナログ、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能である大腸菌ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｃプロモーター、並びにそれぞれホスフェート、トリプトファン及びＬ−アラビノースによって誘導されるｐｈｏＡ、ｔｒｐ及びａｒａＢＡＤプロモーターが含まれる。例えば、誘導物質の添加、又は誘導が温度依存性である場合は温度の変化によって、発現を誘導することができる。組換えタンパク質の発現の誘導が培養物への誘導物質の添加によって達成される場合、発酵系及び誘導物質に応じて任意の適切な方法によって、例えば、シングル又はマルチショット添加によって、又は供給を介した誘導物質の段階的添加によって、誘導物質を加えることができる。誘導物質の添加と実際のタンパク質発現の誘導の間に遅延がある可能性があり、例えば誘導物質がラクトースである場合、任意の既存の炭素源をラクトース前に利用しながら、タンパク質発現の誘導が起こる前に遅延がある可能性があることは理解されよう。
【００９９】
大腸菌宿主細胞培養物（発酵物）は、大腸菌の増殖及び組換えタンパク質の発現を支持する任意の培地中で培養することができる。培地は、本明細書に記載するように必要に応じて増殖率を調節するように改変した、Ｐｉｒｔ Ｓ．Ｊ．（１９７５）「微生物及び細胞培養の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ中に提供された培地などの任意の化学的に定義された培地であってよい。適切な培地の一例は、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ、２００２、「タンパク質の発現及び精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、２６：３０９〜３２０により記載された「ＳＭ６Ｅ」である。
【０１００】
大腸菌宿主細胞の培養は、必要とされる産生の規模に応じて、振とうフラスコ又は発酵槽などの任意の適切な容器内で行うことができる。１，０００リットルを超える、最大約１００，０００リットルまでの容量を有する様々な大規模発酵槽が利用可能である。好ましくは１，０００〜５０，０００リットル、より好ましくは１，０００〜１０，０００又は１２，０００リットルの発酵槽を利用する。０．５リットル〜１，０００リットルの間の容量を有するより小規模な発酵槽を使用することもできる。
【０１０１】
大腸菌の発酵は、必要とされるタンパク質及び収率に応じて、任意の適切な系、例えば連続、回分又は流加形式（Ｔｈｉｒｙ ＆ Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ、２００２、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：１０３〜１０５）で実施することができる。必要な場合は栄養素又は誘導物質のショット添加で、回分形式を使用することができる。或いは、流加培養を使用することができ、発酵槽中に最初に存在した栄養素を使用して維持することができる最大特異的増殖率で回分形式事前誘導において培養物を増殖し、１つ又は複数の栄養素供給レジメを使用して、発酵が終了するまで増殖率を調節することができる。流加形式を事前誘導に使用して大腸菌宿主細胞の代謝を調節し、より高い細胞密度に到達させることも可能である（Ｌｅｅ、１９９６、Ｔｉｂｔｅｃｈ、１４：９８〜１０５）。
【０１０２】
本発明の各実施形態の好ましい特徴は、必要な変更を加えて他の各実施形態と同様である。それだけに限らないが本明細書中に列挙する特許及び特許出願を含めた全ての刊行物は、それぞれ個々の刊行物が、完全に言及されるように参照により本明細書に組み込まれることが具体的且つ個別に示されるが如く、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
一態様では、前記方法から得られるか又は得ることができる抗体を提供する。
【０１０４】
一態様では、特に調節で確実にｐＨが熱抽出ステップなどの抽出ステップの最中にｐＨ６〜９の範囲内に維持されるようにする場合の、抗体抽出、例えば一次抽出を改善するための、バッファーなどのｐＨ調節手段の使用を提供する。
【０１０５】
本明細書で利用するｐＨ調節手段は、バッファー、塩基及び／又は酸である。
【０１０６】
ここで本発明を、以下の実施例を参照しながら記載する。これらは単なる例示的なものであり、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】経時的なｐＨ７．４及びｐＨ８のトリス／ＥＤＴＡ抽出バッファー中に再懸濁した細胞のｐＨを示すグラフである。
【図２ａ】抗体Ａの収率に対する抽出バッファーのｐＨの影響を示すヒストグラムである。
【図２ｂ】７．４〜９．０のｐＨを有する抽出バッファーの添加直後の細胞サンプル（再懸濁した細胞スラリー）のｐＨ、及び加熱段階前の抽出バッファーの添加後１時間での細胞サンプルのｐＨを示すヒストグラムである。
【図３ａ】抗体Ａの収率に対する、熱処理ステップ前にサンプルのｐＨを調整する影響を示すヒストグラムである。それぞれのバーの上の数字は、ｐＨ調整のステップが無い対照と比較した収率の増大率を示す。
【図３ｂ】その方法の様々な段階：細胞スラリー（培養及び遠心分離後）、バッファー添加後（抽出バッファー添加直後）、ｐＨ調整前、ｐＨ調整後ただし加熱段階前、及び熱処理ステップ後にわたっての、サンプルの様々なｐＨを示すグラフである。
【図４】熱処理後に細胞から抽出した抗体ＡサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２は抗体Ａのサンプルであり、レーン３は無ｐＨ調整後のサンプルであり、且つレーン４〜８は熱処理ステップ前のそれぞれ７．０、７．２、７．４、７．６及び７．８へのｐＨ調整後のサンプルを示す。
【図５】抗体Ａの収率に対する、ｐＨ８での抽出バッファーの使用、及び熱処理ステップ前のｐＨ７．４へのサンプルのｐＨ調整の影響を示すヒストグラムである。図５は、均質化ステップ又は細胞スラリー保持ステップを含めた影響も示す。それぞれのバーの上の数字は、均質化ステップ有りただしｐＨ調整ステップ無しの対照と比較した収率の増大率を示す。
【図６】熱処理後に細胞から抽出した抗体ＡサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 レーン１は分子量マーカーであり、 レーン２は抗体Ａのサンプルであり、 レーン３は、均質化ステップ後、ただし無ｐＨ調整及び無細胞スラリー保持のサンプルであり、 レーン４は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、並びに均質化ステップ及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、 レーン５は、無ｐＨ調整、無均質化及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、 レーン６は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、並びに無均質化及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、 レーン７は、細胞スラリー保持、ただし無ｐＨ調整及び無均質化後のサンプルであり、 レーン８は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、及び細胞スラリー保持、ただし無均質化後のサンプルである。
【図７】ｐＨ調整無しの対照サンプル、ｐＨ８の抽出バッファーで処理したサンプル、ｐＨ７．４の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプル、及びｐＨ８の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプルに関する、経時的なサンプルのｐＨを示すグラフである。第一のピークは抽出バッファーを加えた時点を示し、第二のピークは熱処理ステップ前に２サンプルのｐＨを調整した時点を示す。
【図８】抗体Ａの収率に対する、ｐＨ調整無しの対照サンプル、ｐＨ７．４の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプル、ｐＨ８の抽出バッファーで処理したサンプル、及びｐＨ８の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプルの影響を示すヒストグラムである。それぞれのバーの上の数字は、ｐＨ調整のステップが無い対照と比較した収率の増大率を示す。
【図９】抗体Ａの収率に対する、ｐＨ調整無しの対照サンプル、ｐＨ７．４の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前に加熱段階中にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプル、及びｐＨ８の抽出バッファーで処理し熱処理ステップ前に加熱段階中にｐＨ７．４にサンプルのｐＨを調整したサンプルの影響を示すヒストグラムである。それぞれのバーの上の数字は、ｐＨ調整のステップが無い対照と比較した収率の増大率を示す。
【図１０】無ｐＨ調整対照と比較したＦａｂ’の力価に対する６．６、７．０、７．４及び７．８単位へのｐＨ調整の影響を示すヒストグラムである。実験は無前処理、細胞スラリー保持及び均質化の（抽出前の）３つの異なる前処理ステップで反復する。
【図１１】以下の条件；無ｐＨ調整、無前処理及び（範囲６．６〜７．８単位への）ｐＨ調整、均質化及び（範囲６．６〜７．８単位への）ｐＨ調整、及び全てのｐＨ調整条件（均質化及び無前処理）の、平均したＦａｂ’の力価を示すヒストグラムである。エラーバーは、平均からの一標準偏差を示す。
【０１０８】
一般的な方法
以下の実施例では、他に言及しない限り以下のようにその方法を実施する。
【０１０９】
細胞培養ステップ及び遠心分離：
抗体Ａ（Ｆａｂ’）を、挿入抗体ＡをコードするＤＮＡを有するベクターｐＴＴ０Ｄを使用して、大腸菌Ｗ３１１０細胞において発現させた。ラクトースを用いた誘導後２５℃で３０時間発酵を実施し、採取の用意をした。５０ｍｌ又は１Ｌの採取した培養物アリコートは、１時間４２００ＲＰＭ及び４℃で遠心分離した。
【０１１０】
上清をデキャンタし、産生規模で浄化をシミュレートするために、少ない割合の上清を細胞に加えて生成する細胞スラリーサンプルを採取重量の３５％にした。
【０１１１】
細胞スラリー保持ステップ（ＣＳＨ）：
いくつかの実験において、細胞スラリー保持ステップを実施し、抽出バッファーの添加前に１８℃及び２００ＲＰＭで３３時間サンプルを保持した。
【０１１２】
抽出バッファーの添加：
生成する細胞スラリーサンプル（本明細書では以後サンプルと呼ぶ）を、３００ｍＭのトリス及び３０ｍＭのＥＤＴＡストック溶液を使用して再懸濁し、ＨＣｌを使用して調整した７．４のｐＨを有する１００ｍＭのトリス及び１０ｍＭのＥＤＴＡの最終濃度にした。以下に記載する実験において、この抽出バッファーのｐＨは、７．４の対照ｐＨからｐＨ７．４〜９．０の間のより高ｐＨレベルまでに調整する。
【０１１３】
均質化ステップ（Ｈｏｍｏｇ．）：
いくつかの実験において、１５００ｐｓｉでの一回通過により抽出バッファーの添加後に、均質化ステップを実施した。
【０１１４】
加熱段階前のｐＨ調整：
いくつかの実験において、サンプルは５ＭのＮａＯＨを用いたｐＨ調整に施して、加熱段階の開始前に７．０〜７．８の間の望ましいレベルにした。
【０１１５】
加熱段階
サンプルは加熱段階に施し、サンプルの温度は１８℃から５９℃の望ましい高温まで上昇させ、５９℃で熱処理ステップを開始した。
【０１１６】
加熱段階中のｐＨ調整：
いくつかの実験において、５９℃の望ましい高温に達するまで、加熱段階中に、サンプルを５ＭのＮａＯＨを用いたｐＨ調整に施して７．４±０．０２の望ましいレベルにした。
【０１１７】
熱処理ステップ
サンプルは１０〜１２時間５９℃及び２００ＲＰＭで保持した。
【０１１８】
熱処理後、再懸濁した細胞ペレットを、４℃において１時間、４２００ｒｐｍでの遠心分離によって浄化した。機能性抗体Ａを含有する上清は、２０ｍＭのリン酸バッファーにおけるプロテインＧ ＨＰＬＣ分析を使用してＦａｂ’に関してアッセイした。注入時のｐＨ７．０から２．５のｐＨまで低下させたｐＨ勾配を使用して、抗体Ａを溶出した。
【０１１９】
還元抽出サンプルは、約１μｇの充填濃度でトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せた。
【０１２０】
（例１）
抽出バッファー添加後のサンプルのｐＨに対する影響
バッファーがｐＨ８．０又はｐＨ７．４を有した、細胞培養ステップ及び抽出バッファー添加ステップは、一般的な方法の節に記載したように実施した。サンプルのｐＨは、抽出バッファーの添加からモニタリングした。図１は、バッファーの添加後にサンプルのｐＨの急速な低下があること、及び特にバッファーが７．４のｐＨを有するとき、ｐＨがｐＨ７未満に急激に低下することを示す。
【０１２１】
（例２）
抗体収率に対する抽出バッファーのｐＨの影響
細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ、加熱段階及び熱処理ステップを、一般的な方法の節に記載したように実施した。
【０１２２】
細胞スラリー保持ステップ、均質化ステップ、及び加熱前又は最中のｐＨ調整ステップは実施しなかった。
【０１２３】
抽出バッファーのｐＨは以下のように変えた：７．４、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９及び９．０。熱抽出後のＦａｂ’の濃度を示す図２ａ中に結果を示す。７．４を超える抽出バッファーの高いｐＨは、Ｆａｂ’の回収に関する有意な増大、ｐＨ８．８まで増大した収率をもたらしたことを見ることができる。８．８を超えると、Ｆａｂ’の濃度は低下し始めた。
【表１】
【０１２４】
表１及び図２ｂは、７．４〜９．０のｐＨを有する抽出バッファーの添加直後の細胞サンプル（再懸濁した細胞スラリー）のｐＨ、及び加熱段階前の抽出バッファーの添加後１時間での細胞サンプルのｐＨを示す。
【０１２５】
（例３）
抗体収率に対する加熱段階前のｐＨの影響
細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ、均質化ステップ、加熱前のｐＨ調整ステップ、加熱段階及び熱処理ステップを、一般的な方法の節に記載したように実施した。対照にはｐＨ調整ステップを施さなかった。
【０１２６】
対照実験では、抽出バッファーはｐＨ７．４であり、他の実験では、加熱段階前にｐＨを調整したとき、抽出バッファーはｐＨ８．０であった。
【０１２７】
細胞スラリー保持ステップ、及び加熱最中のｐＨ調整ステップは実施しなかった。
【０１２８】
対照では、加熱段階前のｐＨ調整は実施しなかった。他の実験では、サンプルのｐＨは加熱段階前にｐＨ７．０、７．２、７．４、７．６及び７．８に調整した。
【０１２９】
このｐＨ調整ステップが改善されたＦａｂ’回収をもたらしたことを示す図３ａ中に、その結果を示す。図３ａは、どのようにしてｐＨ７．０〜７．８の範囲内に地点を設定するｐＨ調整が、ｐＨ調整を施さなかった対照サンプルと比較して、２６〜４０％産物回収率を増大したかを実証する。
【表２】
【０１３０】
サンプルのｐＨはその方法中の様々な時点で検出した。前の表２及び図３ｂは、その方法の様々な段階：細胞スラリー（培養及び遠心分離後）、バッファー添加後（抽出バッファー添加直後）、ｐＨ調整前、ｐＨ調整後ただし加熱段階前、及び熱処理ステップ後にわたっての、サンプルの様々なｐＨを示す。
【０１３１】
図４中のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、抽出後サンプルのタンパク質プロファイルを示す。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２は抗体Ａのサンプルであり、レーン３は無ｐＨ調整後のサンプルであり、且つレーン４〜８は熱処理ステップ前のそれぞれ７．０、７．２、７．４、７．６及び７．８へのｐＨ調整後のサンプルを示す。
【０１３２】
サンプル充填量は１μｇのＦａｂ’に標準化した。対照と加熱前ｐＨ調整したサンプルの間で、タンパク質プロファイルの有意な差は観察されなかった。
【０１３３】
（例４）
細胞スラリー保持ステップ及び均質化ステップの存在及び不在下での、抗体収率に対する抽出バッファーのｐＨ及びｐＨ調整の影響
以下の実験を一般的な方法の節に記載したように実施した。
●対照（ｈｏｍｏｇ．有り）：細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ７．４）、均質化ステップ、加熱段階及び熱処理ステップ、
●ｐＨ８におけるバッファー、及び加熱前にｐＨ７．４に調整（ｈｏｍｏｇ．有り）：細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ８）、均質化ステップ、加熱前のｐＨ７．４へのｐＨ調整ステップ、加熱段階、及び熱処理ステップ、
●対照（ｈｏｍｏｇ．又はＣＳＨ無し）：細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ７．４）、加熱段階及び熱処理ステップ、
●ｐＨ８におけるバッファー、及び加熱前にｐＨ７．４に調整（ｈｏｍｏｇ．又はＣＳＨ無し）：細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ８）、加熱前のｐＨ７．４へのｐＨ調整ステップ、加熱段階、及び熱処理ステップ、
●対照（ＣＳＨ有り）：細胞培養ステップ、細胞スラリー保持ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ７．４）、加熱段階及び熱処理ステップ、及び
●ｐＨ８におけるバッファー、及び加熱前にｐＨ７．４に調整（ＣＳＨ有り）：細胞培養ステップ、細胞スラリー保持ステップ、抽出バッファー添加ステップ（ｐＨ８）、加熱前のｐＨ７．４へのｐＨ調整ステップ、加熱段階、及び熱処理ステップ。
【０１３４】
図５は、前述の実験の結果を示す。加熱前にｐＨ調整ステップを加えることによって、対照と比較して約３４％高い抽出力価をもたらしたことを見ることができる。均質化ステップを含めることによって、ｐＨ調整ステップを含む方法との比較時に、収率に影響がなかったことも見ることができる。細胞スラリー保持は、ｐＨ調整ステップを有するものの比較時ではなく、対照抽出の比較時に高い収率をもたらす。
【０１３５】
図６中のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、抽出後サンプルのタンパク質プロファイルを示す。
レーン１は分子量マーカーであり、
レーン２は抗体Ａのサンプルであり、
レーン３は、均質化ステップ後、ただし無ｐＨ調整及び無細胞スラリー保持のサンプルであり、
レーン４は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、並びに均質化ステップ及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、
レーン５は、無ｐＨ調整、無均質化及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、
レーン６は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、並びに無均質化及び無細胞スラリー保持後のサンプルであり、
レーン７は、細胞スラリー保持、ただし無ｐＨ調整及び無均質化後のサンプルであり、
レーン８は、ｐＨ８での抽出バッファーを用いた処理、及び熱処理前のｐＨ７．４への調整、及び細胞スラリー保持、ただし無均質化後のサンプルである。
【０１３６】
ｐＨ調整した抽出物のタンパク質プロファイルは、細胞スラリー保持対照と同等であった。
【０１３７】
（例５）
サンプルのｐＨ及びＦａｂ’収率に対する加熱前の抽出バッファーのｐＨ及び／又はｐＨ調整ステップの影響。
細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ、加熱段階及び熱処理ステップを、一般的な方法の節に記載したように実施した。２つの実験が加熱ステップ前にｐＨ調整を含んでおり、２つの実験はこのステップを含んでいなかった。
【０１３８】
細胞スラリー保持ステップ、均質化ステップ、及び加熱中のｐＨ調整ステップは実施しなかった。
【０１３９】
４つの異なるｐＨ調節戦略を実施した：
１．対照：抽出バッファーｐＨ７．４及び加熱前のｐＨ調整無し；
２．抽出バッファーｐＨ７．４及び加熱前に７．４にｐＨ調整；
３．バッファーｐＨ８：抽出バッファーｐＨ８．０及び加熱前のｐＨ調整無し、及び
４．抽出バッファーｐＨ８．０及び加熱前に７．４にｐＨ調整。
【０１４０】
バッファー添加（第一のピーク）、加熱前のｐＨ調整（第二のピーク）及び熱処理（ｐＨ低下）に対して細胞スラリーから開始して一次回収中にｐＨをモニタリングした。図７はそれらの方法中のｐＨプロファイルを示す。
【０１４１】
Ｆａｂ’収率に対する影響を図８中に示し、全てのｐＨ上昇戦略（１〜３）はＦａｂ’収率の増大をもたらしたこと、及び上昇バッファーと加熱前ｐＨ調整の組合せを使用した戦略４は最高のＦａｂ’回収率をもたらしたことを見ることができる。
【０１４２】
（例６）
サンプルのｐＨ及びＦａｂ’収率に対する加熱中の抽出バッファーのｐＨ及び／又はｐＨ調整ステップの影響。
細胞培養ステップ、抽出バッファー添加ステップ、加熱段階及び熱処理ステップを、一般的な方法の節に記載したように実施した。２つの実験が加熱ステップ中にｐＨ調整を含んでおり、対照はこのステップを含んでいなかった。
【０１４３】
細胞スラリー保持ステップ、均質化ステップ、及び加熱前のｐＨ調整ステップは実施しなかった。
【０１４４】
３つの異なるｐＨ調節戦略を実施した：
１．対照：抽出バッファーｐＨ７．４及び加熱中のｐＨ調整無し；
２．抽出バッファーｐＨ７．４及び加熱中に７．４にｐＨ調整；
３．抽出バッファーｐＨ８．０及び加熱中に７．４にｐＨ調整。
【０１４５】
Ｆａｂ’収率に対する影響を図９中に示し、全てのｐＨ上昇戦略（２及び３）はＦａｂ’収率の増大をもたらしたこと、及び上昇バッファーと加熱中のｐＨ調整の組合せを使用した戦略４は最高Ｆａｂ’回収率をもたらしたことを見ることができる。
【０１４６】
（例７）
発酵ブロスを得、それを遠心分離して大部分の使用済み培地を除去し、それによって細胞スラリーを生成することによって実験を実施した。この細胞スラリーは、細胞スラリー保持（ｃｅｌｌ ｓｌｕｒｒｙ ｈｏｌｄ）の場合３３時間保持した。均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ）及び無前処理条件の場合、細胞は抽出バッファー中に再懸濁し、均質化又はいかなる前処理もしない熱抽出のいずれかを行った。細胞スラリー保持の後、細胞は抽出バッファー中に再懸濁した。全条件のものを抽出バッファー中に再懸濁した後、それらは（図１２中に示す）望ましい設定地点にｐＨ調整し、熱抽出（５９℃で１０時間）を開始した。熱抽出の後、液相中のＦａｂ’力価を決定するために抽出物を遠心分離によって浄化した。
以下のデータは図１２中にも示す。
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、抽出バッファーをサンプルに加えること、及びサンプルに熱処理ステップを施すことを含み、抽出バッファーの添加後サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、熱処理ステップの前に確実にサンプルのｐＨが６〜９となるようにする上記方法。
【請求項２】
熱処理ステップを３０℃〜７０℃の範囲内で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抽出バッファーがＮａＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、硫酸、ＥＤＴＡ、トリスバッファー及びこれらの組合せを含む群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗体がβ１インテグリンなどのインテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１又はＣＳＦ１−受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦから選択される抗原に対して選択的である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗体分子が、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、変更ヒンジＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ断片、軽鎖又は重鎖モノマー又はダイマー、単鎖抗体、例えば重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがペプチドリンカーによってつながった単鎖Ｆｖ、及びＦａｂ−ｄＡｂなどの二重特異性抗体を含む群から選択される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｐＨを調整して熱処理ステップの前に確実にサンプルのｐＨが６〜９となるようにする、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法から得られる／得ることができる抗体。
【請求項８】
特に調節で確実にｐＨが熱抽出ステップなどの抽出ステップの直前及び／又は最中にｐＨ６〜９の範囲にあるようにする場合の、抗体抽出、例えば一次抽出を改善するための、バッファーなどのｐＨ調節手段の使用。
【請求項１】
組換え抗体分子を生産するための方法であって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞サンプルを培養すること、抽出バッファーをサンプルに加えること、及びサンプルに熱処理ステップを施すことを含み、抽出バッファーの添加後サンプルのｐＨを検出し、場合によっては調整して、熱処理ステップの前に確実にサンプルのｐＨが６〜９となるようにする上記方法。
【請求項２】
熱処理ステップを３０℃〜７０℃の範囲内で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抽出バッファーがＮａＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、硫酸、ＥＤＴＡ、トリスバッファー及びこれらの組合せを含む群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗体がβ１インテグリンなどのインテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１又はＣＳＦ１−受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦから選択される抗原に対して選択的である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗体分子が、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、変更ヒンジＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ断片、軽鎖又は重鎖モノマー又はダイマー、単鎖抗体、例えば重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがペプチドリンカーによってつながった単鎖Ｆｖ、及びＦａｂ−ｄＡｂなどの二重特異性抗体を含む群から選択される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｐＨを調整して熱処理ステップの前に確実にサンプルのｐＨが６〜９となるようにする、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法から得られる／得ることができる抗体。
【請求項８】
特に調節で確実にｐＨが熱抽出ステップなどの抽出ステップの直前及び／又は最中にｐＨ６〜９の範囲にあるようにする場合の、抗体抽出、例えば一次抽出を改善するための、バッファーなどのｐＨ調節手段の使用。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１３−５１８５７２（Ｐ２０１３−５１８５７２Ａ）
【公表日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５１６０５（Ｐ２０１２−５５１６０５）
【出願日】平成２３年２月２日（２０１１．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５１４５０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９５５０６
【国際公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２日（２０１１．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５１４５０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９５５０６
【国際公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
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