抗肥満剤
【課題】抗肥満作用に優れ、しかも、安全性の高い成分を有効成分とする抗肥満剤を提供する。
【解決手段】１’−アセトキシチャビコールアセテート、１−アセトキシ−１−（２,４−ジアセトキシフェニル）−２−プロペン、及び１−アセトキシ−１−（３,４−ジアセトキシフェニル)−２−プロペン及びその誘導体と４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート、及び２−アセトキシ−４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート、及び３−アセトキシ−４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート及びその誘導体を有効成分とする抗肥満剤。
【解決手段】１’−アセトキシチャビコールアセテート、１−アセトキシ−１−（２,４−ジアセトキシフェニル）−２−プロペン、及び１−アセトキシ−１−（３,４−ジアセトキシフェニル)−２−プロペン及びその誘導体と４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート、及び２−アセトキシ−４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート、及び３−アセトキシ−４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート及びその誘導体を有効成分とする抗肥満剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗肥満剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肥満症、特に、腹腔内の脂肪蓄積に加えて、高血糖、高血圧、脂質異常のうちいずれか２つ以上を併せ持った状態をメタボリックシンドロームと言い、動脈硬化が進行し易い状態である。動脈硬化症は、日本人の３大死因の２つである、心疾患と脳卒中の発症の原因となっている。このように近年深刻化してきているメタボリックシンドロームのベースとなっている肥満症を改善するため、食事療法や運動療法など生活習慣に関わる処置法とともに、各種の抗肥満剤が開発・提案されている。例えば、特許文献には、リパーゼ活性を阻害して抗肥満効果を発揮するもの（特許文献１、２）、脂肪分解を促進するもの（特許文献３）、体内に蓄積された脂肪の利用率を促進するもの（特許文献４）、血中脂質濃度を下げるもの（特許文献５）、前駆脂肪細胞の分化を抑制するもの（特許文献６、７、８）及び脂肪吸収を抑制するもの（特許文献９）などが提案報告されている。しかしながら、メタボリックシンドロームが重大な社会問題となっている中で、より確実な抗肥満効果と、より高い安全性の抗肥満剤が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−３２０２３号公報
【特許文献２】特開２００８−７４７３５号公報
【特許文献３】特開２００５−６０３６６号公報
【特許文献４】特開平１１−２２８４３４号公報
【特許文献５】特開２００３−１４６９０１号公報
【特許文献６】特開２００５−２３９６５９号公報
【特許文献７】特開２００７−１８６４２７号公報
【特許文献８】特開２００９−１３２６３４号公報
【特許文献９】特開２００７−２３０９８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、抗肥満作用に優れ、しかも、安全性の高い成分を有効成分とする抗肥満剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、様々な化合物について抗肥満効果の有無を評価した結果、ナンキョウ由来の成分に優れた抗肥満効果があることを確認し、更にその成分の類縁化合物であり、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物群に強力な抗肥満効果があり、また安全性も良好であることを見出した。
【０００６】
本発明は、一般式（１）又は（２）で表される化合物が抗肥満効果を有し、しかも安全性も良好であるという新規な知見に基づき、完成に至ったものである。すなわち、本発明にかかる抗肥満剤は、一般式（１）又は（２）で表される化合物を有効成分とする抗肥満剤を提供するものである。
【０００７】
一般式（１）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ３は水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ６は、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ９又は−Ｃ≡Ｃ−Ｒ９を示す。Ｒ９は水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）で表される化合物を有効成分とする抗肥満剤。
一般式（２）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜４のアルキル基を示す。Ｒ３は、水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ６は水素又は炭素数１〜４のアルキル基又は−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ９を示す。Ｒ９は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）で表される化合物を有効成分とする抗肥満剤。
【０００８】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
【０００９】
本発明の抗肥満剤は、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物を有効成分とする：
一般式（１）
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましい例の一つはＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５が全て水素の場合である。
【００１０】
Ｒ３は、水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましくは−Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ３を示す。
【００１１】
Ｒ６は、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ９又は−Ｃ≡Ｃ−Ｒ９を示す。Ｒ９は水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましくは−ＣＨ＝ＣＨ２を示す。
【００１２】
具体的に、一般式（１）で表される化合物には、
1’-アセトキシチャビコールアセテート（1’-Acetoxychavicol acetate、以下、ＡＣＡとも称する）、
1-アセトキシ-1-(2,4-ジアセトキシフェニル)-2-プロペン（1-Acetoxy-1-(2,4-diacetoxyphenyl)-2-propene、以下、２,４−ＡＣＡとも称する)、
1-アセトキシ-1-(3,4-ジアセトキシフェニル)-2-プロペン（1-Acetoxy-1-(3,4-diacetoxyphenyl)-2-propene、
以下、３,４−ＡＣＡとも称する）などが含まれる。
【００１３】
一般式（１）で表される化合物については不斉炭素を有しているが、(Ｒ)−体、(Ｓ)−体、ラセミ体のいずれでもよい。
【００１４】
一般式（２）
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましい例の一つはＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５が全て水素の場合である。
【００１５】
Ｒ３は、水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましくは−Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ３を示す。
【００１６】
Ｒ６は水素又は炭素数１〜４のアルキル基又は−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ９を示す。Ｒ９は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましくは水素を示す。
【００１７】
具体的に、一般式（２）で表される化合物には、
4-((E)-3-ヒドロキシ-1-プロペニル)フェニルアセテート（4-((E)-3-Hydroxyprop-1-enyl)phenyl
acetateもしくはp-acetoxy cinnamic alcohol、以下、HPAとも称する）、
2-アセトキシ-4-((E)-3-ヒドロキシ-1-プロペニル)フェニルアセテート（2-Acetoxy-4-((E)-3-hydroxyprop-1-enyl)phenyl
acetate、以下、2,4-HPAとも称する）、
3-アセトキシ-4-((E)-3-ヒドロキシ-1-プロペニル)フェニルアセテート（3-Acetoxy-4-((E)-3-hydroxyprop-1-enyl)phenyl
acetate、以下、3,4-HPAとも称する）などが含まれる。
【００１８】
上記の化合物は、公知の方法に従って製造することができる。
【００１９】
例えば、４位及び２位又は３位の位置に水酸基を有するベンズアルデヒド化合物を原料とし、水酸基を保護した後、グリニャール試薬等の有機金属試薬を用いて、二重結合又は三重結合を有するアルキル基を導入した２級アルコールを合成する。次いで、脱保護及びアシル化を行い、目的とする一般式（１）で表される化合物を得ることができる。好ましくは、実施例に記載の方法に従って得ることができる。
【００２０】
また例えば、４−ヨードフェノールを原料とし、水酸基をアセチル化した後、有機金属反応によりアリルアルコール部位を導入し、目的とする一般式（２）で表される化合物を得ることができる。
【００２１】
本発明の抗肥満剤は、一般式（１）もしくは（２）で表される化合物群のうち１種類又はそれ以上の種類の化合物を有効成分とし、優れた抗肥満効果を有する。
【００２２】
本発明にかかる抗肥満剤は、一般式（１）もしくは（２）で表される化合物そのものからなるものでもよいし、当該化合物を有効成分とし、薬学上又は食品衛生上許容される担体等の他の成分を更に含んでなるものであってもよい。かかる担体又は成分の種類及び配合量は本発明の効果を損なわないことを限度として適宜設定することができる。
【００２３】
抗肥満剤として、例えば、ヒト用あるいは動物用を問わず、医薬、医薬部外品、健康食品などに好適に利用することができる。
【００２４】
医薬品、医薬郊外品としては、例えば、医薬等の剤形は特に限定されないが、例えばカプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、散剤、顆粒剤、輸液剤および注射剤等が挙げられるが、好ましくはカプセル剤、錠剤、顆粒剤または散剤が挙げられる。健康食品としては、例えば、液剤、半固形剤、固形剤等があり、具体的にはドリンク剤、ペースト剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの他、種々の食品の添加剤として使用する形態が挙げられる。
【００２５】
本発明の抗肥満剤における、一般式（１）もしくは（２）で表される化合物の摂取量は、通常経口又は非経口投与され、その投与量は年齢、体重、症状により適宜調整することができるが、例えば、ＡＣＡの場合、通常成人１人当り１〜３０００ｍｇ／日、好ましくは１０〜５００ｍｇ／日の範囲がよい。
また、健康食品としての使用時には、食品の味や品質に悪影響を及ぼさない程度の量、例えば、最終製品形態となる食品１ｋｇに対して、ＡＣＡを１０００〜５０００ｍｇの範囲で添加することが適当である。
【００２６】
一般式（１）もしくは（２）で表される化合物を抗肥満剤の有効成分として各種用途に適用する際において、薬学上又は食品衛生上許容される慣用の各種有機あるいは無機担体物質を併用することができ、例えば、固形形態の場合においては賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤を用いることができ、また、液状形態の場合においては溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、非水性賦形剤、保存剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などを用いることができる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの添加物を用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施例３の結果である３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の脂肪蓄積を示す図である。
【図２】図２は、実施例３の結果である３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の脂肪蓄積量を示す図である。
【図３】図３は、実施例３の結果である３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞のＧＰＤＨ活性の変化を示す図である。
【図４】図４は、実施例３の結果である３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の細胞生存率を示す図である。
【図５】図５は、実施例４の結果である肥満モデルラットの脂肪組織重量を示す図である。
【図６】図６は、実施例４の結果である肥満モデルラットの腹腔内脂肪組織重量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２８】
以下に、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１）
１．ラセミＡＣＡの調製
ラセミＡＣＡを以下に示す方法に従って調製した。なお、同様の方法で出発原料に２,４-ジヒドロキシベンズアルデヒド又３,４-ジヒドロキシベンズアルデヒドを用いることにより、２,４-ＡＣＡ又は３,４-ＡＣＡを合成することが可能である。
【００３０】
4-Hydroxybenzaldehyde (Wako,
12.5 g, 102.4 mmol), triethylamine
(Wako, 15.5 g, 1.5 eq)及び4-dimethylaminopyridine (Wako, 500 mg, 0.04
eq) を乾燥ジクロロメタン３００ｍＬに溶解し、０℃で撹拌しながら、tert-butyldimethylsilyl chloride (TCI, 18.5 g, 1.2 eq) を少しずつ加えた。室温で３時間撹拌後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane:EtOAc =
20:1）にて精製を行い、化合物１を得た (21.5g, 87%)。
【００３１】
化合物１ (20 g, 84.6 mmol) を乾燥ＴＨＦ３００ｍＬに溶解し、窒素気流下、０℃でvinylmagnesium bromide (TCI, 1 mol/L in THF, 102 mL, 1.2 eq) を滴下した。室温で３時間撹拌後、０．５
Ｍ ＨＣｌ水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane : EtOAc = 8 : 1）にて精製を行い、化合物２を得た (17.1 g, 76.4%)。
【００３２】
化合物２(12g, 45.4mmol)を乾燥ＴＨＦ(２００ｍＬ) に溶解し、tetra-n-butylammonium Fluoride (TCI, 1 mol/L
in THF, 54.5 mL, 1.2 eq) を０℃で滴下した。０℃で１時間撹拌後、飽和食塩水を加え、エーテル及びジクロロメタンで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した後、ピリジン
３００ ｍＬに溶解し、無水酢酸（18.5 g, 4 eq）を加えて室温で一晩撹拌した。ピリジンを減圧留去したあとクロロホルムに溶解し、１
Ｍ ＨＣｌ水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane
: EtOAc = 4 : 1）にて精製を行った。ヘキサンを加えて結晶化させた後、ヘキサンより再結晶を行い、ラセミＡＣＡを得た (7.01 g, 65.9%, mp. 68℃)。ラセミＡＣＡのスペクトル解析の結果を下記に示す。
【００３３】
HRMS (FAB, direct) calcd for C13H14O4,
[M]+ 234.0892; found, 234.0916.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); d 2.10 (s, 3 H), 2.29 (s, 3 H), 5.25 (d, 1
H, J = 10.5 Hz), 5.30 (d, 1 H, J = 17.1 Hz), 5.98 (ddd, 1 H, J = 5.9, 10.5, 17.1 Hz), 6.26 (d, 1 H, J
= 5.9 Hz), 7.08 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 7.37 (d, 2 H, J = 8.5 Hz).
【００３４】
（実施例２）
２．(Ｓ)-ＡＣＡ及び(Ｒ)-ＡＣＡの調製
(Ｓ)-ＡＣＡ及び(Ｒ)-ＡＣＡを以下に示す方法に従って調製した。
【００３５】
化合物２ (1 g, 3.78 mmol)、重合阻害剤として2,6-di-tert-butyl
p-cresol (25 mg, 0.11 mmol) を乾燥ＴＨＦ １５ ｍＬ及び酢酸ビニル
１５ ｍＬの混合溶媒に溶解し、lipase PS (Amano, 1.8 g) を加え、遮光下、６５℃で２４時間撹拌した。冷却後、リパーゼをろ別し、ろ液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane : EtOAc = 10 : 1 → 5 : 1）にて精製を行い、わずかに不純物を含むアセチル化物 (Ｒ)-３ (580 mg) 及び未反応物 (Ｓ)-２ (500 mg, 50%) を得た。
【００３６】
不純物を含む (Ｒ)-３ (580 mg) 及びlipase
PS (Amano, 140 mg) を０．１ Ｍリン酸緩衝液 (pH 7.0) ５０ ｍＬに分散し、室温で２０時間撹拌した。反応終了後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane : EtOAc = 5: 1）にて精製を行い、(Ｒ)-２を得た (420
mg)。
【００３７】
化合物２ (500mg, 1.89mmol) を乾燥ＴＨＦ(２０ｍＬ) に溶解し、tetra-n-butylammonium Fluoride (TCI, 1 mol/L
in THF, 2.8 mL, 1.5 eq) を０℃で滴下した。０℃で１時間撹拌後、飽和食塩水を加え、エーテル及びジクロロメタンで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した後、ピリジン
２０ ｍＬに溶解し、無水酢酸（770 mg, 4 eq）を加えて室温で一晩撹拌した。ピリジンを減圧留去したあとクロロホルムに溶解し、１
Ｍ ＨＣｌ水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane
: EtOAc = 4 : 1）にて精製を行い、(Ｓ)-ＡＣＡを得た (270 mg, 61%)。また、(Ｒ)-２より同様の操作を行い、(Ｒ)-ＡＣＡを合成した。(Ｓ)-ＡＣＡ及び(Ｒ)-ＡＣＡのスペクトル解析の結果を下記に示す。
【００３８】
(Ｓ)-ＡＣＡ: [a]25D
= -60.1 (c 1.442, EtOH), -57.4
(c 1.67, CHCl3).
HRMS (FAB, direct) calcd for C13H14O4, [M]+
234.0892; found, 234.0900.
Anal. Calcd:
C, 66.66; H, 6.02. Found: C, 66.54; H, 6.03.
(Ｒ)-ＡＣＡ: [a]25D
= -60.0 (c 1.282, EtOH), +57.4 (c 1.67, CHCl3).
HRMS (FAB, direct) calcd for C13H14O4, [M]+
234.0892; found, 234.0901.
Anal. Calcd:
C, 66.66; H, 6.02. Found: C, 66.37; H, 6.03.
【００３９】
（実施例３）
＜細胞を用いた抗肥満効果の検証＞
以下のようにして、細胞培養および分化誘導を行った。
【００４０】
ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクより入手した３Ｔ３-Ｌ１前駆脂肪細胞を１０% ＦＢＳ含有ＭＥＭダルベッコ培地（DMEM, 100 U/mL ペニシリン−ストレプトマイシン含有）で細胞数1.0´105
cells になるよう調整し、細胞がコンフルエント状態になるまで培養した。次に、脂肪細胞形態への分化は、ＦＢＳを１０% 、ＩＢＭＸ を０．５ ｍＭ、ＤＥＸを０．２ μＭ含有するＤＭＥＭ 中で１０５個の細胞を２日間培養することにより誘導した。その後、ＦＢＳ
を１０%およびＩＮＳ を０．２ μＭ含有するＤＭＥＭ中で細胞をもう２日間培養した。その後、培地を通常の培地に変更し、２日毎に新しい培地に取り替えた。分化開始から８日後に細胞を回収した。細胞は、加湿された５% ＣＯ２存在下の培養器中、３７℃で培養した。
【００４１】
次に、オイルレッドＯによるトリアシルグリセロール（TG）蓄積量の評価、および、グリセロール-３-リン酸デヒドロゲナーゼ（GPDH）活性の測定によるＴＧ合成能の評価を行い、また、ニュートラルレッド法により細胞生存率を測定し、これらにより抗肥満効果を評価した。
以下、それぞれについて詳述する。
【００４２】
＜オイルレッドＯ によるＴＧ蓄積量の評価＞
ＴＧのマーカーであるオイルレッドＯを用い、細胞内ＴＧ蓄積量を評価した。３Ｔ３-Ｌ１前駆脂肪細胞を、上記のように脂肪細胞に分化するよう誘導する際、各段階でのＤＭＥＭ培地に(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡを２．５もしくは５ μＭの濃度となるよう添加した。細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２ 回洗浄した後、３０秒間、７０% エタノールで固定した。その後、オイルレッドＯ を９９% イソプロピルアルコール中に飽和させた溶液で２時間培養した後、５０% エタノールで３秒間洗浄後、脱イオン水で２回洗浄した。その後、赤色の染色強度より、細胞内ＴＧ蓄積量を評価した。
【００４３】
＜ＧＰＤＨ活性の測定によるＴＧ合成能の評価＞
ＧＰＤＨはＴＧ合成の律速酵素であり、その活性が抑えられるほど、ＴＧの合成が抑えられるため、ＧＰＤＨ活性を指標にＴＧ合成能を評価した。
３Ｔ３-Ｌ１前駆脂肪細胞を、上記のように脂肪細胞に分化するよう誘導する際、各段階でのＤＭＥＭ培地に(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡを２．５もしくは５ μＭの濃度となるよう添加した。氷冷ＰＢＳで２回、細胞を丹念に洗浄した後、２ ｍＭ ＥＤＴＡを含む １００ｍＭ
トリエタノールアミン/塩酸緩衝液（pH
7.5）を加えてセルスクレーパーで剥がして回収し、全量を３００μＬとした。回収した細胞懸濁液を、最大出力２５０Ｗのバイオラプター（トウショウ電機社製、DU-250）を用い、氷冷しながら１０秒問、２５超音波バーストで超音波洗浄した。４℃で５分間、１３，０００ｇで遠心分離した後、上清のＧＰＤＨ活性をＷｉｓｅ
ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ法（1979）により分析した。測定は分光光度計（ベックマン・コールター社製、DU530）を用いて行い、ゼロオーダーの運動力学および最適な基質および共ファクタ一条件下、２５℃で１８０ 秒間測定した。標準反応混合物として、１２ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１００ｍＭトリエタノールアミン/塩酸緩衝液（pH 7.5）にＮＡＤＨが０．１２ｍＭ、２-メルカプトエタノールが０．１ｍＭとなるように調製したものを使用した。 反応開始剤であるジヒドロキシアセトンホスフェートを終濃度０．２ｍＭとなるように添加し、ＮＡＤＨ酸化反応の指標である３４０ｎｍでの吸光度変化について添加後６０
秒間の経時変化を測定した。
【００４４】
＜ニュートラルレッド法による細胞生存率の測定＞
細胞生存率を、ニュートラルレッドのリソソーム取込に基づくニュートラルレッド取込評価により測定した。３Ｔ３-Ｌ１前駆脂肪細胞を、上記のように脂肪細胞に分化するよう誘導する際、各段階でのＤＭＥＭ培地に(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡを１、５、１０、２０μＭの濃度となるよう添加した。その後、細胞培地にニュートラルレッド溶液（0.25 mg/mL）を最終濃度が５０ μｇ/ｍＬになるように添却した。細胞を３７℃で２時間培養した後、１％（重量比）塩化カルシウムを含む１％（体積比）ホルムアルデヒド水溶液で２回洗浄した。その後、脱色緩衝液として１％（体積比）酢酸を含む５０％（体積比）エタノール水溶液１ｍＬを細胞に添加し、３０分間放置した。溶出されたニュートラルレッド量を、分光光度計で５４０ｎｍ
における吸光度を測定することによって定量し、細胞生存率（％）を下式に基づき評価した。
【００４５】
【００４６】
＜結果と考察＞
図１にオイルレッドＯ による細胞内ＴＧ の染色像、図２にオイルレッドＯ
染色結果より定量した細胞内ＴＧ蓄積量、図３にＧＰＤＨ活性、図４に細胞生存率の結果を示す。各グラフにおいて、数値は、サンプル無添加の場合（コントロール）を１００とし、これに対する割合で規定したものである。
図１及び図２より、(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡのいずれにおいても添加濃度に依存して細胞内ＴＧ
蓄積量の有意な低下が確認された。またＡＣＡのキラリティーによる活性差はほとんど見られなかった。
【００４７】
さらに図３より、ＴＧ合成の指標であるＧＰＤＨ活性についても、(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡのいずれにおいても添加濃度に依存して細胞内ＴＧ
蓄積量の有意な低下が確認された。またＡＣＡのキラリティーによる活性差はほとんど見られなかった。
【００４８】
また図４より、(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡはいずれも細胞生存率に影響を及ぼさず、安全性が高いことも確認された。
【００４９】
（実施例４）
＜動物実験による抗肥満効果の検証＞
４週齢のＳＤ系雄性ラットを１週間予備飼育したのち、ラットを４匹ずつ、表１に示す群に分けて、各実験食を３０日間摂取させた。このとき、各群における摂食量の差は認められなかった。
【００５０】
【表１】
【００５１】
上記表１において、高脂肪食＋ラセミＡＣＡ添加群では、ラセミＡＣＡの結晶を乳鉢ですり潰して粉末状にし、飼料全量に対して０．１％あるいは０．５％濃度の配合割合で用いた。また、表中の数値はｇ数を表す。
各実験食を３０日間摂取させた各ラットについて、脂肪組織重量及び腹腔内脂肪重量を測定して各群ごとにその平均値を算出し、これを各群の測定結果とした。
【００５２】
それぞれの結果を図５及び図６に示す。
【００５３】
図５及び図６より、脂肪組織重量、腹腔内脂肪重量はいずれも、高脂肪食群、高脂肪食＋ラセミＡＣＡ添加群ともに、コントロール食群に比べて有意に増加したが、高脂肪食群と高脂肪食＋ラセミＡＣＡ添加群を比較したとき、高脂肪食群に比べて高脂肪食＋ラセミＡＣＡ添加群の方がＡＣＡ含有量に応じて減少傾向を示すことが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗肥満剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肥満症、特に、腹腔内の脂肪蓄積に加えて、高血糖、高血圧、脂質異常のうちいずれか２つ以上を併せ持った状態をメタボリックシンドロームと言い、動脈硬化が進行し易い状態である。動脈硬化症は、日本人の３大死因の２つである、心疾患と脳卒中の発症の原因となっている。このように近年深刻化してきているメタボリックシンドロームのベースとなっている肥満症を改善するため、食事療法や運動療法など生活習慣に関わる処置法とともに、各種の抗肥満剤が開発・提案されている。例えば、特許文献には、リパーゼ活性を阻害して抗肥満効果を発揮するもの（特許文献１、２）、脂肪分解を促進するもの（特許文献３）、体内に蓄積された脂肪の利用率を促進するもの（特許文献４）、血中脂質濃度を下げるもの（特許文献５）、前駆脂肪細胞の分化を抑制するもの（特許文献６、７、８）及び脂肪吸収を抑制するもの（特許文献９）などが提案報告されている。しかしながら、メタボリックシンドロームが重大な社会問題となっている中で、より確実な抗肥満効果と、より高い安全性の抗肥満剤が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−３２０２３号公報
【特許文献２】特開２００８−７４７３５号公報
【特許文献３】特開２００５−６０３６６号公報
【特許文献４】特開平１１−２２８４３４号公報
【特許文献５】特開２００３−１４６９０１号公報
【特許文献６】特開２００５−２３９６５９号公報
【特許文献７】特開２００７−１８６４２７号公報
【特許文献８】特開２００９−１３２６３４号公報
【特許文献９】特開２００７−２３０９８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、抗肥満作用に優れ、しかも、安全性の高い成分を有効成分とする抗肥満剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、様々な化合物について抗肥満効果の有無を評価した結果、ナンキョウ由来の成分に優れた抗肥満効果があることを確認し、更にその成分の類縁化合物であり、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物群に強力な抗肥満効果があり、また安全性も良好であることを見出した。
【０００６】
本発明は、一般式（１）又は（２）で表される化合物が抗肥満効果を有し、しかも安全性も良好であるという新規な知見に基づき、完成に至ったものである。すなわち、本発明にかかる抗肥満剤は、一般式（１）又は（２）で表される化合物を有効成分とする抗肥満剤を提供するものである。
【０００７】
一般式（１）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ３は水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ６は、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ９又は−Ｃ≡Ｃ−Ｒ９を示す。Ｒ９は水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）で表される化合物を有効成分とする抗肥満剤。
一般式（２）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜４のアルキル基を示す。Ｒ３は、水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ６は水素又は炭素数１〜４のアルキル基又は−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ９を示す。Ｒ９は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）で表される化合物を有効成分とする抗肥満剤。
【０００８】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
【０００９】
本発明の抗肥満剤は、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物を有効成分とする：
一般式（１）
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましい例の一つはＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５が全て水素の場合である。
【００１０】
Ｒ３は、水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましくは−Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ３を示す。
【００１１】
Ｒ６は、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ９又は−Ｃ≡Ｃ−Ｒ９を示す。Ｒ９は水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましくは−ＣＨ＝ＣＨ２を示す。
【００１２】
具体的に、一般式（１）で表される化合物には、
1’-アセトキシチャビコールアセテート（1’-Acetoxychavicol acetate、以下、ＡＣＡとも称する）、
1-アセトキシ-1-(2,4-ジアセトキシフェニル)-2-プロペン（1-Acetoxy-1-(2,4-diacetoxyphenyl)-2-propene、以下、２,４−ＡＣＡとも称する)、
1-アセトキシ-1-(3,4-ジアセトキシフェニル)-2-プロペン（1-Acetoxy-1-(3,4-diacetoxyphenyl)-2-propene、
以下、３,４−ＡＣＡとも称する）などが含まれる。
【００１３】
一般式（１）で表される化合物については不斉炭素を有しているが、(Ｒ)−体、(Ｓ)−体、ラセミ体のいずれでもよい。
【００１４】
一般式（２）
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましい例の一つはＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５が全て水素の場合である。
【００１５】
Ｒ３は、水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましくは−Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ３を示す。
【００１６】
Ｒ６は水素又は炭素数１〜４のアルキル基又は−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ９を示す。Ｒ９は炭素数１〜８のアルキル基を示す。好ましくは水素を示す。
【００１７】
具体的に、一般式（２）で表される化合物には、
4-((E)-3-ヒドロキシ-1-プロペニル)フェニルアセテート（4-((E)-3-Hydroxyprop-1-enyl)phenyl
acetateもしくはp-acetoxy cinnamic alcohol、以下、HPAとも称する）、
2-アセトキシ-4-((E)-3-ヒドロキシ-1-プロペニル)フェニルアセテート（2-Acetoxy-4-((E)-3-hydroxyprop-1-enyl)phenyl
acetate、以下、2,4-HPAとも称する）、
3-アセトキシ-4-((E)-3-ヒドロキシ-1-プロペニル)フェニルアセテート（3-Acetoxy-4-((E)-3-hydroxyprop-1-enyl)phenyl
acetate、以下、3,4-HPAとも称する）などが含まれる。
【００１８】
上記の化合物は、公知の方法に従って製造することができる。
【００１９】
例えば、４位及び２位又は３位の位置に水酸基を有するベンズアルデヒド化合物を原料とし、水酸基を保護した後、グリニャール試薬等の有機金属試薬を用いて、二重結合又は三重結合を有するアルキル基を導入した２級アルコールを合成する。次いで、脱保護及びアシル化を行い、目的とする一般式（１）で表される化合物を得ることができる。好ましくは、実施例に記載の方法に従って得ることができる。
【００２０】
また例えば、４−ヨードフェノールを原料とし、水酸基をアセチル化した後、有機金属反応によりアリルアルコール部位を導入し、目的とする一般式（２）で表される化合物を得ることができる。
【００２１】
本発明の抗肥満剤は、一般式（１）もしくは（２）で表される化合物群のうち１種類又はそれ以上の種類の化合物を有効成分とし、優れた抗肥満効果を有する。
【００２２】
本発明にかかる抗肥満剤は、一般式（１）もしくは（２）で表される化合物そのものからなるものでもよいし、当該化合物を有効成分とし、薬学上又は食品衛生上許容される担体等の他の成分を更に含んでなるものであってもよい。かかる担体又は成分の種類及び配合量は本発明の効果を損なわないことを限度として適宜設定することができる。
【００２３】
抗肥満剤として、例えば、ヒト用あるいは動物用を問わず、医薬、医薬部外品、健康食品などに好適に利用することができる。
【００２４】
医薬品、医薬郊外品としては、例えば、医薬等の剤形は特に限定されないが、例えばカプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、散剤、顆粒剤、輸液剤および注射剤等が挙げられるが、好ましくはカプセル剤、錠剤、顆粒剤または散剤が挙げられる。健康食品としては、例えば、液剤、半固形剤、固形剤等があり、具体的にはドリンク剤、ペースト剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの他、種々の食品の添加剤として使用する形態が挙げられる。
【００２５】
本発明の抗肥満剤における、一般式（１）もしくは（２）で表される化合物の摂取量は、通常経口又は非経口投与され、その投与量は年齢、体重、症状により適宜調整することができるが、例えば、ＡＣＡの場合、通常成人１人当り１〜３０００ｍｇ／日、好ましくは１０〜５００ｍｇ／日の範囲がよい。
また、健康食品としての使用時には、食品の味や品質に悪影響を及ぼさない程度の量、例えば、最終製品形態となる食品１ｋｇに対して、ＡＣＡを１０００〜５０００ｍｇの範囲で添加することが適当である。
【００２６】
一般式（１）もしくは（２）で表される化合物を抗肥満剤の有効成分として各種用途に適用する際において、薬学上又は食品衛生上許容される慣用の各種有機あるいは無機担体物質を併用することができ、例えば、固形形態の場合においては賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤を用いることができ、また、液状形態の場合においては溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、非水性賦形剤、保存剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などを用いることができる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの添加物を用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施例３の結果である３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の脂肪蓄積を示す図である。
【図２】図２は、実施例３の結果である３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の脂肪蓄積量を示す図である。
【図３】図３は、実施例３の結果である３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞のＧＰＤＨ活性の変化を示す図である。
【図４】図４は、実施例３の結果である３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の細胞生存率を示す図である。
【図５】図５は、実施例４の結果である肥満モデルラットの脂肪組織重量を示す図である。
【図６】図６は、実施例４の結果である肥満モデルラットの腹腔内脂肪組織重量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２８】
以下に、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１）
１．ラセミＡＣＡの調製
ラセミＡＣＡを以下に示す方法に従って調製した。なお、同様の方法で出発原料に２,４-ジヒドロキシベンズアルデヒド又３,４-ジヒドロキシベンズアルデヒドを用いることにより、２,４-ＡＣＡ又は３,４-ＡＣＡを合成することが可能である。
【００３０】
4-Hydroxybenzaldehyde (Wako,
12.5 g, 102.4 mmol), triethylamine
(Wako, 15.5 g, 1.5 eq)及び4-dimethylaminopyridine (Wako, 500 mg, 0.04
eq) を乾燥ジクロロメタン３００ｍＬに溶解し、０℃で撹拌しながら、tert-butyldimethylsilyl chloride (TCI, 18.5 g, 1.2 eq) を少しずつ加えた。室温で３時間撹拌後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane:EtOAc =
20:1）にて精製を行い、化合物１を得た (21.5g, 87%)。
【００３１】
化合物１ (20 g, 84.6 mmol) を乾燥ＴＨＦ３００ｍＬに溶解し、窒素気流下、０℃でvinylmagnesium bromide (TCI, 1 mol/L in THF, 102 mL, 1.2 eq) を滴下した。室温で３時間撹拌後、０．５
Ｍ ＨＣｌ水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane : EtOAc = 8 : 1）にて精製を行い、化合物２を得た (17.1 g, 76.4%)。
【００３２】
化合物２(12g, 45.4mmol)を乾燥ＴＨＦ(２００ｍＬ) に溶解し、tetra-n-butylammonium Fluoride (TCI, 1 mol/L
in THF, 54.5 mL, 1.2 eq) を０℃で滴下した。０℃で１時間撹拌後、飽和食塩水を加え、エーテル及びジクロロメタンで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した後、ピリジン
３００ ｍＬに溶解し、無水酢酸（18.5 g, 4 eq）を加えて室温で一晩撹拌した。ピリジンを減圧留去したあとクロロホルムに溶解し、１
Ｍ ＨＣｌ水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane
: EtOAc = 4 : 1）にて精製を行った。ヘキサンを加えて結晶化させた後、ヘキサンより再結晶を行い、ラセミＡＣＡを得た (7.01 g, 65.9%, mp. 68℃)。ラセミＡＣＡのスペクトル解析の結果を下記に示す。
【００３３】
HRMS (FAB, direct) calcd for C13H14O4,
[M]+ 234.0892; found, 234.0916.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); d 2.10 (s, 3 H), 2.29 (s, 3 H), 5.25 (d, 1
H, J = 10.5 Hz), 5.30 (d, 1 H, J = 17.1 Hz), 5.98 (ddd, 1 H, J = 5.9, 10.5, 17.1 Hz), 6.26 (d, 1 H, J
= 5.9 Hz), 7.08 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 7.37 (d, 2 H, J = 8.5 Hz).
【００３４】
（実施例２）
２．(Ｓ)-ＡＣＡ及び(Ｒ)-ＡＣＡの調製
(Ｓ)-ＡＣＡ及び(Ｒ)-ＡＣＡを以下に示す方法に従って調製した。
【００３５】
化合物２ (1 g, 3.78 mmol)、重合阻害剤として2,6-di-tert-butyl
p-cresol (25 mg, 0.11 mmol) を乾燥ＴＨＦ １５ ｍＬ及び酢酸ビニル
１５ ｍＬの混合溶媒に溶解し、lipase PS (Amano, 1.8 g) を加え、遮光下、６５℃で２４時間撹拌した。冷却後、リパーゼをろ別し、ろ液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane : EtOAc = 10 : 1 → 5 : 1）にて精製を行い、わずかに不純物を含むアセチル化物 (Ｒ)-３ (580 mg) 及び未反応物 (Ｓ)-２ (500 mg, 50%) を得た。
【００３６】
不純物を含む (Ｒ)-３ (580 mg) 及びlipase
PS (Amano, 140 mg) を０．１ Ｍリン酸緩衝液 (pH 7.0) ５０ ｍＬに分散し、室温で２０時間撹拌した。反応終了後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane : EtOAc = 5: 1）にて精製を行い、(Ｒ)-２を得た (420
mg)。
【００３７】
化合物２ (500mg, 1.89mmol) を乾燥ＴＨＦ(２０ｍＬ) に溶解し、tetra-n-butylammonium Fluoride (TCI, 1 mol/L
in THF, 2.8 mL, 1.5 eq) を０℃で滴下した。０℃で１時間撹拌後、飽和食塩水を加え、エーテル及びジクロロメタンで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した後、ピリジン
２０ ｍＬに溶解し、無水酢酸（770 mg, 4 eq）を加えて室温で一晩撹拌した。ピリジンを減圧留去したあとクロロホルムに溶解し、１
Ｍ ＨＣｌ水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane
: EtOAc = 4 : 1）にて精製を行い、(Ｓ)-ＡＣＡを得た (270 mg, 61%)。また、(Ｒ)-２より同様の操作を行い、(Ｒ)-ＡＣＡを合成した。(Ｓ)-ＡＣＡ及び(Ｒ)-ＡＣＡのスペクトル解析の結果を下記に示す。
【００３８】
(Ｓ)-ＡＣＡ: [a]25D
= -60.1 (c 1.442, EtOH), -57.4
(c 1.67, CHCl3).
HRMS (FAB, direct) calcd for C13H14O4, [M]+
234.0892; found, 234.0900.
Anal. Calcd:
C, 66.66; H, 6.02. Found: C, 66.54; H, 6.03.
(Ｒ)-ＡＣＡ: [a]25D
= -60.0 (c 1.282, EtOH), +57.4 (c 1.67, CHCl3).
HRMS (FAB, direct) calcd for C13H14O4, [M]+
234.0892; found, 234.0901.
Anal. Calcd:
C, 66.66; H, 6.02. Found: C, 66.37; H, 6.03.
【００３９】
（実施例３）
＜細胞を用いた抗肥満効果の検証＞
以下のようにして、細胞培養および分化誘導を行った。
【００４０】
ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクより入手した３Ｔ３-Ｌ１前駆脂肪細胞を１０% ＦＢＳ含有ＭＥＭダルベッコ培地（DMEM, 100 U/mL ペニシリン−ストレプトマイシン含有）で細胞数1.0´105
cells になるよう調整し、細胞がコンフルエント状態になるまで培養した。次に、脂肪細胞形態への分化は、ＦＢＳを１０% 、ＩＢＭＸ を０．５ ｍＭ、ＤＥＸを０．２ μＭ含有するＤＭＥＭ 中で１０５個の細胞を２日間培養することにより誘導した。その後、ＦＢＳ
を１０%およびＩＮＳ を０．２ μＭ含有するＤＭＥＭ中で細胞をもう２日間培養した。その後、培地を通常の培地に変更し、２日毎に新しい培地に取り替えた。分化開始から８日後に細胞を回収した。細胞は、加湿された５% ＣＯ２存在下の培養器中、３７℃で培養した。
【００４１】
次に、オイルレッドＯによるトリアシルグリセロール（TG）蓄積量の評価、および、グリセロール-３-リン酸デヒドロゲナーゼ（GPDH）活性の測定によるＴＧ合成能の評価を行い、また、ニュートラルレッド法により細胞生存率を測定し、これらにより抗肥満効果を評価した。
以下、それぞれについて詳述する。
【００４２】
＜オイルレッドＯ によるＴＧ蓄積量の評価＞
ＴＧのマーカーであるオイルレッドＯを用い、細胞内ＴＧ蓄積量を評価した。３Ｔ３-Ｌ１前駆脂肪細胞を、上記のように脂肪細胞に分化するよう誘導する際、各段階でのＤＭＥＭ培地に(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡを２．５もしくは５ μＭの濃度となるよう添加した。細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２ 回洗浄した後、３０秒間、７０% エタノールで固定した。その後、オイルレッドＯ を９９% イソプロピルアルコール中に飽和させた溶液で２時間培養した後、５０% エタノールで３秒間洗浄後、脱イオン水で２回洗浄した。その後、赤色の染色強度より、細胞内ＴＧ蓄積量を評価した。
【００４３】
＜ＧＰＤＨ活性の測定によるＴＧ合成能の評価＞
ＧＰＤＨはＴＧ合成の律速酵素であり、その活性が抑えられるほど、ＴＧの合成が抑えられるため、ＧＰＤＨ活性を指標にＴＧ合成能を評価した。
３Ｔ３-Ｌ１前駆脂肪細胞を、上記のように脂肪細胞に分化するよう誘導する際、各段階でのＤＭＥＭ培地に(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡを２．５もしくは５ μＭの濃度となるよう添加した。氷冷ＰＢＳで２回、細胞を丹念に洗浄した後、２ ｍＭ ＥＤＴＡを含む １００ｍＭ
トリエタノールアミン/塩酸緩衝液（pH
7.5）を加えてセルスクレーパーで剥がして回収し、全量を３００μＬとした。回収した細胞懸濁液を、最大出力２５０Ｗのバイオラプター（トウショウ電機社製、DU-250）を用い、氷冷しながら１０秒問、２５超音波バーストで超音波洗浄した。４℃で５分間、１３，０００ｇで遠心分離した後、上清のＧＰＤＨ活性をＷｉｓｅ
ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ法（1979）により分析した。測定は分光光度計（ベックマン・コールター社製、DU530）を用いて行い、ゼロオーダーの運動力学および最適な基質および共ファクタ一条件下、２５℃で１８０ 秒間測定した。標準反応混合物として、１２ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１００ｍＭトリエタノールアミン/塩酸緩衝液（pH 7.5）にＮＡＤＨが０．１２ｍＭ、２-メルカプトエタノールが０．１ｍＭとなるように調製したものを使用した。 反応開始剤であるジヒドロキシアセトンホスフェートを終濃度０．２ｍＭとなるように添加し、ＮＡＤＨ酸化反応の指標である３４０ｎｍでの吸光度変化について添加後６０
秒間の経時変化を測定した。
【００４４】
＜ニュートラルレッド法による細胞生存率の測定＞
細胞生存率を、ニュートラルレッドのリソソーム取込に基づくニュートラルレッド取込評価により測定した。３Ｔ３-Ｌ１前駆脂肪細胞を、上記のように脂肪細胞に分化するよう誘導する際、各段階でのＤＭＥＭ培地に(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡを１、５、１０、２０μＭの濃度となるよう添加した。その後、細胞培地にニュートラルレッド溶液（0.25 mg/mL）を最終濃度が５０ μｇ/ｍＬになるように添却した。細胞を３７℃で２時間培養した後、１％（重量比）塩化カルシウムを含む１％（体積比）ホルムアルデヒド水溶液で２回洗浄した。その後、脱色緩衝液として１％（体積比）酢酸を含む５０％（体積比）エタノール水溶液１ｍＬを細胞に添加し、３０分間放置した。溶出されたニュートラルレッド量を、分光光度計で５４０ｎｍ
における吸光度を測定することによって定量し、細胞生存率（％）を下式に基づき評価した。
【００４５】
【００４６】
＜結果と考察＞
図１にオイルレッドＯ による細胞内ＴＧ の染色像、図２にオイルレッドＯ
染色結果より定量した細胞内ＴＧ蓄積量、図３にＧＰＤＨ活性、図４に細胞生存率の結果を示す。各グラフにおいて、数値は、サンプル無添加の場合（コントロール）を１００とし、これに対する割合で規定したものである。
図１及び図２より、(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡのいずれにおいても添加濃度に依存して細胞内ＴＧ
蓄積量の有意な低下が確認された。またＡＣＡのキラリティーによる活性差はほとんど見られなかった。
【００４７】
さらに図３より、ＴＧ合成の指標であるＧＰＤＨ活性についても、(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡのいずれにおいても添加濃度に依存して細胞内ＴＧ
蓄積量の有意な低下が確認された。またＡＣＡのキラリティーによる活性差はほとんど見られなかった。
【００４８】
また図４より、(Ｓ)-ＡＣＡ、(Ｒ)-ＡＣＡ及びラセミＡＣＡはいずれも細胞生存率に影響を及ぼさず、安全性が高いことも確認された。
【００４９】
（実施例４）
＜動物実験による抗肥満効果の検証＞
４週齢のＳＤ系雄性ラットを１週間予備飼育したのち、ラットを４匹ずつ、表１に示す群に分けて、各実験食を３０日間摂取させた。このとき、各群における摂食量の差は認められなかった。
【００５０】
【表１】
【００５１】
上記表１において、高脂肪食＋ラセミＡＣＡ添加群では、ラセミＡＣＡの結晶を乳鉢ですり潰して粉末状にし、飼料全量に対して０．１％あるいは０．５％濃度の配合割合で用いた。また、表中の数値はｇ数を表す。
各実験食を３０日間摂取させた各ラットについて、脂肪組織重量及び腹腔内脂肪重量を測定して各群ごとにその平均値を算出し、これを各群の測定結果とした。
【００５２】
それぞれの結果を図５及び図６に示す。
【００５３】
図５及び図６より、脂肪組織重量、腹腔内脂肪重量はいずれも、高脂肪食群、高脂肪食＋ラセミＡＣＡ添加群ともに、コントロール食群に比べて有意に増加したが、高脂肪食群と高脂肪食＋ラセミＡＣＡ添加群を比較したとき、高脂肪食群に比べて高脂肪食＋ラセミＡＣＡ添加群の方がＡＣＡ含有量に応じて減少傾向を示すことが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ３は水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ６は、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ９又は−Ｃ≡Ｃ−Ｒ９を示す。Ｒ９は水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）で表される化合物を有効成分とする抗肥満剤。
【請求項２】
前記一般式（１）で表される化合物が、１’−アセトキシチャビコールアセテート、１−アセトキシ−１−（２,４−ジアセトキシフェニル）−２−プロペン、及び１−アセトキシ−１−（３,４−ジアセトキシフェニル)−２−プロペンである請求項１に記載の抗肥満剤。
【請求項３】
一般式（２）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜４のアルキル基を示す。Ｒ３は、水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ６は水素又は炭素数１〜４のアルキル基又は−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ９を示す。Ｒ９は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）で表される化合物を有効成分とする抗肥満剤。
【請求項４】
前記一般式（２）で表される化合物が、４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート、及び２−アセトキシ−４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート、及び３−アセトキシ−４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテートである請求項３に記載の抗肥満剤。
【請求項１】
一般式（１）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ３は水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ６は、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ９又は−Ｃ≡Ｃ−Ｒ９を示す。Ｒ９は水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）で表される化合物を有効成分とする抗肥満剤。
【請求項２】
前記一般式（１）で表される化合物が、１’−アセトキシチャビコールアセテート、１−アセトキシ−１−（２,４−ジアセトキシフェニル）−２−プロペン、及び１−アセトキシ−１−（３,４−ジアセトキシフェニル)−２−プロペンである請求項１に記載の抗肥満剤。
【請求項３】
一般式（２）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５
は同一又は異なって、水素又は−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ７を示す。Ｒ７は炭素数１〜４のアルキル基を示す。Ｒ３は、水素又は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８を示す。Ｒ８は炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ６は水素又は炭素数１〜４のアルキル基又は−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ９を示す。Ｒ９は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）で表される化合物を有効成分とする抗肥満剤。
【請求項４】
前記一般式（２）で表される化合物が、４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート、及び２−アセトキシ−４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート、及び３−アセトキシ−４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテートである請求項３に記載の抗肥満剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−５６８８６（Ｐ２０１２−５６８８６Ａ）
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０１８９２（Ｐ２０１０−２０１８９２）
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者 第６４回日本栄養・食糧学会大会 会頭 武田 英二 刊行物名「第６４回日本栄養・食糧学会大会 講演要旨集」 発行日 平成２２年５月１日
【出願人】（３０９０１６２０１）
【出願人】（３０９０１６０９４）
【出願人】（７１０００５９０２）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者 第６４回日本栄養・食糧学会大会 会頭 武田 英二 刊行物名「第６４回日本栄養・食糧学会大会 講演要旨集」 発行日 平成２２年５月１日
【出願人】（３０９０１６２０１）
【出願人】（３０９０１６０９４）
【出願人】（７１０００５９０２）
【Ｆターム（参考）】
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