抗酸菌ＤＮＡの抽出精製法
【課題】 有害な有機溶媒を必要とせず、操作が容易で検査者の技術的熟練を要せず、かつ多検体処理が可能な抗酸菌DNAの抽出精製法を提供すること。
【解決手段】 次の各工程からなる抗酸菌からのDNA抽出精製法。
Ａ）生物学的サンプルに、0.01〜10重量％の陰イオン性界面活性剤およびpH7〜13の緩衝剤を含むDNA抽出用溶液並びにRNA分解酵素を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出する第一工程
Ｂ）次にpH2〜6の酸性緩衝液を添加し、サンプル由来の夾雑物や前記陰イオン性界面活性剤を析出させ、除去する第二工程
Ｃ）さらにカオトロピックイオンを含む溶液を添加し、容器に内蔵された担体にDNAを吸着させ、アルコールを含む溶液で担体を洗浄した後、塩濃度が50 mM以下である低塩濃度の溶液または、水にて担体からDNAを解離させて回収する第三工程
【解決手段】 次の各工程からなる抗酸菌からのDNA抽出精製法。
Ａ）生物学的サンプルに、0.01〜10重量％の陰イオン性界面活性剤およびpH7〜13の緩衝剤を含むDNA抽出用溶液並びにRNA分解酵素を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出する第一工程
Ｂ）次にpH2〜6の酸性緩衝液を添加し、サンプル由来の夾雑物や前記陰イオン性界面活性剤を析出させ、除去する第二工程
Ｃ）さらにカオトロピックイオンを含む溶液を添加し、容器に内蔵された担体にDNAを吸着させ、アルコールを含む溶液で担体を洗浄した後、塩濃度が50 mM以下である低塩濃度の溶液または、水にて担体からDNAを解離させて回収する第三工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便中等の微生物に関する情報を得る技術に関し、より詳細には、精製が困難とされる糞便や組織等の生物学的サンプル中から、抽出が困難とされるマイコバクテリウム属の細菌（抗酸菌）のDNAを簡便・迅速に抽出精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
重要な抗酸菌感染症の一つであるヨーネ病は、反芻動物の慢性消化器感染症であり、長い潜伏期間の後、栄養状態の悪化、慢性の下痢、削痩等の症状を示し、やがて死に至る。我が国では、ヨーネ病を家畜伝染病予防法の中でも最重要伝染病の一つに指定し、撲滅を目的とした防疫が進められている。
【０００３】
また、近年諸外国ではヨーネ菌がヒトから分離されるとの報告がある為、本菌の公衆衛生上の問題についても注目を集めており、様々な生物学的サンプルからヨーネ菌を検出する高感度で精度の高い検査法の確立が求められている。
【０００４】
病原体であるヨーネ菌の人工培地上での発育が極めて遅い為、ヨーネ菌の遺伝子検査法は、長期間を必要とするヨーネ菌培養検査に代わる簡便で迅速な診断法として期待されている。特に、遺伝子検査の実施に当たっては、糞便等からヨーネ菌DNAを効率よく抽出する方法の確立が重要である。
【０００５】
加熱法やDNA簡易抽出試薬を応用する方法等、牛の糞便等の生物学的サンプルからヨーネ菌を含む抗酸菌DNAを抽出する方法は、これまでにも種々報告されている。
【０００６】
これらの中で、特許文献１〜３記載の技術を応用した牛糞便等からのヨーネ菌DNAの抽出・精製キットが現在市販されている。このキットでは、糞便等の試料を、キレート試薬及び第四級アンモニウム塩を含む水溶液と有機溶媒（クロロホルム・ブタノール）との混合液中でビーズ破砕することにより、核酸を抽出・精製する。
【０００７】
上記の現行市販キットでは、基本的に有機溶媒による除タンパクとアルコールによるDNAの沈殿という、従来からの基礎技術を応用している。
この技術の問題点として、DNAの沈殿・洗浄操作、乾燥と再溶解を行う上である程度の技術的熟練を要する点、検査実施者によりDNAの抽出効率が大きく変わることがある点、さらに、クロロホルム等人体に有害な有機溶媒を用いる為、その廃液管理が必要である点等が挙げられる。また、多検体処理に向かないことも問題点として解決が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−３７７９８号公報
【特許文献２】特開２００４−８０９４号公報
【特許文献３】特開２００４−８１０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
かかる状況下、本発明は、有害な有機溶媒を必要としない、簡便かつ迅速なヨーネ菌等の抗酸菌DNAの抽出精製法を提供し、抗酸菌感染症の遺伝子検査技術の発展に資することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、有機溶媒やキレート剤を用いない抗酸菌DNA抽出法を開発した。
さらに、抗酸菌DNAを効率的に吸着するDNA吸着担体を見出し、それを装着したマイクロチューブ（スピンカラム）方式により、DNAを精製する系を構築した。
【００１１】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、0.01〜10重量％の陰イオン性界面活性剤およびpH7〜13の緩衝剤を含む、抗酸菌からのDNA抽出用溶液である。
請求項２に記載の本発明は、さらに0.01〜2.0 Mのアルカリ金属塩を含む、請求項１に記載の溶液である。
請求項３に記載の本発明は、陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、またはN−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムである請求項１又は２に記載の溶液である。
【００１２】
請求項４に記載の本発明は、生物学的サンプルに、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出することを特徴とする、抗酸菌からのDNA抽出法である。
請求項５に記載の本発明は、次の各工程からなる抗酸菌からのDNA抽出精製法である。
Ａ）生物学的サンプルに、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液およびRNA分解酵素を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出する第一工程
Ｂ）次にpH2〜6の酸性緩衝液を添加し、サンプル由来の夾雑物や請求項１〜３のいずれかに記載の溶液由来の陰イオン性界面活性剤を析出させ、除去する第二工程
Ｃ）さらにカオトロピックイオンを含む溶液を添加し、容器に内蔵された担体にDNAを吸着させ、アルコールを含む溶液で担体を洗浄した後、塩濃度が50 mM以下である低塩濃度の溶液または、水にて担体からDNAを解離させて回収する第三工程
【００１３】
請求項６に記載の本発明は、酸性緩衝液の添加によって、陰イオン性界面活性剤のカウンターイオンを変更させ、溶解度を変えることにより、陰イオン性界面活性剤を析出させる、請求項５に記載の方法である。
請求項７に記載の本発明は、フェノール、クロロホルムおよびブタノールを用いない請求項５又は６に記載の方法である。
請求項８に記載の本発明は、請求項５〜７に記載の方法に使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液；RNA分解酵素；pH2〜6の酸性緩衝液；カオトロピックイオンを含む溶液；アルコールを含む溶液；低塩濃度の溶液；微粒子または微粒子を内蔵した容器；および担体を内蔵した容器、を含む抗酸菌DNA抽出精製用キットである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、キレート試薬並びにフェノール、クロロホルムおよびブタノールなどの有害な有機溶媒を使用せず、ヨーネ菌をはじめとする抗酸菌DNAを効率的に抽出・精製することができる。
さらに、従来の糞便等からのヨーネ菌DNA抽出技術との比較では、本発明の方が高い抽出効率を示し、抽出試料中のPCR阻害物質の除去効率も本発明の方が高い。
また、有機溶媒を使用しないDNA抽出方法である為、クロロホルム等の廃液管理も不要となる。
【００１５】
さらに、本発明では、スピンカラム方式を応用することにより、DNAの洗浄、回収ステップが簡便化し、検査実施者の技術的熟練を必要としないDNA精製法となっている。
また、DNA吸着担体を96穴プレートカラムに装着することにより、多検体の同時処理が可能なDNA抽出精製法の開発へも繋げられる。
このように、本発明は高い実用性を備えた新規技術であると言える。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】検定用糞便を用いたDNA抽出効率を示す図である。白棒は従来のキット、黒棒は本発明方法により抽出されたDNA量（pg／PCR）を示す。
【図２】PCR阻害物質の除去効果を示す図である。棒グラフにおいて、白棒は従来のキット、黒棒は本発明方法によりそれぞれ抽出精製後、リアルタイムPCRにより定量したDNA量（pg／PCR）を示す。また曲線グラフはリアルタイムPCRによる増幅曲線であり、縦軸は蛍光強度を、横軸はPCRサイクル数を、それぞれ示す。
【図３】RNA分解酵素の添加による効果を示す図である。黒棒は酵素を添加した場合、白棒は酵素を未添加の場合で本発明方法によりそれぞれ抽出精製後、リアルタイムPCRにより定量したDNA量（pg／PCR）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抗酸菌からのDNA抽出精製法は、次の各工程からなることを特徴とする。
Ａ）糞便等の生物学的サンプルに、陰イオン性界面活性剤および緩衝剤を含むDNA抽出用溶液並びにRNA分解酵素を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出する第一工程
Ｂ）次に酸性緩衝液を添加し、サンプル由来の夾雑物や前記陰イオン性界面活性剤を析出させ、除去する第二工程
Ｃ）さらにカオトロピックイオンを含む溶液を添加し、担体にDNAを吸着させ、アルコールを含む溶液で担体を洗浄した後、低塩濃度の溶液または水にて担体からDNAを解離させて回収する第三工程
【００１８】
本発明でいう「抗酸菌」としては、ヨーネ菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）、ヒト型結核菌（M. tuberculosis）、ウシ型結核菌（M. bovis）、M. africanum、ネズミ型結核菌（M. microti）、ライ菌（M. leprae）、M. avium、M. intracellulare、M. kansasiiなどのマイコバクテリウム属細菌が挙げられる。
【００１９】
本発明における「DNA抽出用溶液（以下、抽出液ともいう。）」は、少なくとも陰イオン性界面活性剤および緩衝剤を含む。
【００２０】
本発明の抽出液に用いる「陰イオン性界面活性剤」としては、ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium dodecyl sulfate：SDS）、ドデシル硫酸リチウム（Lithium dodecyl sulfate：LDS）、N−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（Sodium lauroyl sarcosinate）などが挙げられ、特にSDSやLDSが好ましい。
本発明の抽出液における陰イオン性界面活性剤の濃度は、0.01〜10重量％、好ましくは0.5〜5.0重量％、さらに好ましくは1.0〜3.0重量％とすればよい。
【００２１】
本発明の抽出液に用いる「緩衝剤」としては、トリス（tris（hydroxymethyl）aminomethane：Tris）、トリシン（Tricine）、ヘペス（HEPES）などが挙げられ、特にトリスが好ましい。本発明の抽出液における緩衝剤のpHは、7.0〜13.0、好ましくは7.5〜10.0とすればよい。
【００２２】
本発明の抽出液は、さらにアルカリ金属塩を含有することが好ましい。
本発明における「アルカリ金属塩」としては、塩化リチウム（LiCl）、塩化ナトリウム（NaCl）などが挙げられ、特にLiClが好ましい。
本発明の抽出液におけるアルカリ金属塩の濃度は、0.01〜2.0 M、好ましくは0.1〜1.0 M、さらに好ましくは0.4〜0.8 Mとすればよい。
【００２３】
本発明のDNA抽出法は、被検体である生物学的サンプルに上記の抽出液を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出することを特徴とする。
【００２４】
本発明における「生物学的サンプル」としては、糞便、唾液、血液、毛髪、体毛、細胞、組織などDNAを含むものであれば何でも用いることができる。糞便としては、ヒト、牛、山羊、羊などの糞が挙げられる。
本発明において生物学的サンプルはそのままでも懸濁液でも用いることができるが、好ましくは、サンプル1.0 gに対し、溶媒を15〜25 ml添加し、20〜40分間激しく攪拌した後、20〜40分間静置した懸濁液の上清を用いる。懸濁液の溶媒としては生理食塩水、滅菌蒸留水などが好適である。
検査のために必要なサンプル懸濁液の量は0.5〜2.0 mlであり、懸濁液の上清を10,000〜30,000×gの条件で遠心分離した後、上清を除去した検体に対し、抽出液を0.1〜2.0 ml、好ましくは0.3〜0.9 ml加えればよい。
【００２５】
抗酸菌は細胞を破壊することが難しいため、本発明では抽出液中で糞便等のサンプルを微粒子と共に激しく攪拌して細胞を破砕する。
【００２６】
ここで「微粒子」としては、DNAに影響を与えない素材のものであればよく、例えばジルコニア製、ガラス製、シリカ製、金属製もしくはそれらの混合物などを用いることができ、特にジルコニアビーズが好ましい。直径は0.05〜5.0 mm、好ましくは0.1〜1.0 mmとすればよい。
サンプルの破砕に用いる微粒子の量は、2.0mL容チューブで行う場合、重量では0.5 g〜3.0 g、容積では0.2 ml〜0.4 mlとすればよい。微粒子は、予め破砕用のポリプロピレン製のマイクロチューブ等の容器に充填しておいても良いし、被検体や抽出液などと同時またはその後に添加しても良い。
【００２７】
本発明のDNA抽出法において、細胞を破砕する方法としては、例えばビーズ式破砕機によるものが挙げられる。
攪拌条件は用いる破砕機により異なるが、例えば、ミニビードビーター（和研薬株式会社）の場合は4,600rpm、3分；マルチビーズショッカー（安井機器株式会社）の場合は4,000rpm、5分；シェイクマスター（株バイオメディカルサイエンス）の場合は1,500rpm、30分；マイクロスマッシュ（トミー精工）の場合は4,600rpm、3分；ファーストプレップ（フナコシ）の場合は90秒（45秒×2）；プリセリーズ24（エムエス機器株式会社）の場合は5,000rpm、90秒×2回とすればよい。
【００２８】
本発明では、後の精製工程においてスピンカラム方式を採用する場合、DNA抽出時にRNA分解酵素を添加してサンプル中のRNAを分解すると、DNAの検出感度を10倍以上高めることができるので好ましい。RNAは一本鎖ということもあり、DNAよりもスピンカラムに充填された担体に吸着しやすいため、RNAが混在しているとDNAと競合してしまうためと考えられる。
【００２９】
ここで、本発明における「RNA分解酵素」としては、RNAを分解してオリゴヌクレオチド又はモノヌクレオチドを生成する反応を触媒する酵素であれば特に制限なく用いることができ、例えばRNase Aなどが挙げられる。RNase Aとしては市販の酵素剤を用いればよく、例えばRNase A (100 mg/ml)（318-06391、ニッポンジーン）などが挙げられる。
【００３０】
本発明のDNA抽出法において、被検体である生物学的サンプル、抽出液、微粒子（および必要であればRNA分解酵素）を添加する順序は特に問わず、破砕前に全てが添加されていればよい。
【００３１】
次に、上記のDNA抽出法により抽出されたDNA液に、pH2〜6、好ましくはpH3.5〜5.5の酸性緩衝液を添加することにより、サンプル由来の夾雑物や抽出液由来の陰イオン性界面活性剤を析出させ、除去する。すなわち、酸性緩衝液の添加によって、陰イオン性界面活性剤のカウンターイオンを変更させ、溶解度を低下させることにより、陰イオン性界面活性剤を析出させるのである。
【００３２】
ここで、本発明における「酸性緩衝液」としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられ、特に酢酸緩衝液が好ましい。また、市販されているGE2−K Buffer（ニッポンジーン）などを使用することもできる。酸性緩衝液の添加量は特に限定されないが、例えばDNA粗抽出液600μLに対して25〜200μL、好ましくは50〜100μLとすることができる。
なお、析出させた陰イオン性界面活性剤の除去は、例えば遠心分離により沈殿させる方法など、常法により行うことができる。
【００３３】
本発明のDNA抽出精製法では、続いて、カオトロピックイオンを含む溶液を添加し、担体にDNAを吸着させ、アルコールを含む溶液で担体を洗浄した後、低塩濃度の溶液にて担体からDNAを解離させて、DNAを回収する。
【００３４】
本発明における「カオトロピックイオンを含む溶液」（以下、「吸着液」ともいう。）には、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジンといったグアニジウムイオンやヨウ化ナトリウムといったヨウ素イオンなどのカオトロピックイオンが含まれていれば良く、溶媒としてはイソプロパノール、エタノール、水などが挙げられる。具体的には、市販されているGB3 Buffer（ニッポンジーン）とイソプロパノールを１：１の割合（容量比）で混合したものなどが挙げられる。溶液中のカオトロピックイオンの濃度は0.5 M〜4.0 Mとすることができる。
なお、この吸着液の添加量は特に限定されないが、例えばDNA粗抽出液500μLに対して100〜1000μL、好ましくは300〜600μLとすることができる。
【００３５】
本発明における「担体」とは、DNAを吸着できるものであればなんでも良く、例えばガラス繊維、ガラス粒子、石英濾紙、シリカ粒子、シリカコーティングした素材などが挙げられ、特にガラス繊維が好ましい。
本発明においてこの担体は、「容器」、例えばポリプロピレンもしくはポリスチレン製のスピンカラムなどに内蔵（充填）された状態で用いられる。当該容器に内蔵させる担体の量に特に制限はないが、例えば1 mL容スピンカラムの場合は、直径1〜10 mmのガラス繊維フィルターを1〜5枚内蔵することができる。
前記担体にDNAを吸着させる方法としては、DNAを含む溶液を担体に接触させればよく、例えば容器としてスピンカラムを用いる場合は、DNAを含む溶液をスピンカラムに入れて遠心分離（500〜30,000×g，0.5〜10分間）を行う方法が挙げられる。
【００３６】
本発明における「アルコールを含む溶液」（以下、「洗浄液」ともいう。）には、エタノールなどのアルコールが含まれていれば良く、溶媒としては蒸留水やTE緩衝液などが挙げられる。また、市販されているGW Buffer（ニッポンジーン）などを用いることもできる。溶液中のアルコールの濃度は70〜100 容量％とすることができる。
なお、担体の洗浄に用いる洗浄液の量は特に限定されないが、例えば直径7 mmのシート状の担体2枚に対して0.1〜5.0 mlとすることができる。
【００３７】
本発明における「低塩濃度の溶液」（以下、「溶出液」ともいう。）としては、水やTE溶液など塩濃度が低い溶液を用いれば良く、市販のElution Bufferを用いることもできる。ここで「低塩濃度」とは、塩濃度が0.1〜50 mMであることを指す。この溶出液には、トリスなどの緩衝剤や、EDTAなどのキレート剤が含まれていることが好ましく、溶媒としては例えば滅菌蒸留水やトリス緩衝液などを用いることができる。
【００３８】
本発明のDNA抽出精製法では、この溶出液を前記担体に添加して、0.1〜10分間担体中に保持させた後、担体を通過させることにより、DNAを担体から解離（溶出）し、精製DNA液を得る。担体がスピンカラムに内蔵されている場合は、溶出液をスピンカラムに添加して遠心分離（500〜30,000×g，0.5〜10分間）することにより、濾液として精製DNA液を得ることができる。
なお、DNAの溶出に用いる溶出液の量は特に限定されないが、例えば直径7 mmのシート状の担体2枚に対して0.03〜0.5 mlとすることができる。
【００３９】
このようにして抽出精製されたDNA液は、そのままPCRやリアルタイムPCRなどのサンプルとして使用することができる。
さらに、このDNAサンプル液を用いてヨーネ菌をはじめとする抗酸菌DNAの検出（ヨーネ病等の抗酸菌感染症の遺伝子診断）を行うことができる。すなわち、上記の方法で得られたDNA液を、ヨーネ菌等の抗酸菌DNAに特有の塩基配列からなるプライマー（例えば配列表の配列番号１、２）を用いたPCRに供し、抗酸菌参照DNAと同様に所定の増幅産物が得られた場合には、抗酸菌DNAと同定される。
【００４０】
本発明は、上述のDNA抽出精製法に必要な溶液、微粒子、および担体を内蔵した容器を含む、抗酸菌DNA抽出精製用キットを提供する。すなわち、本発明のDNA抽出精製用キットは、少なくとも、DNA抽出用溶液；RNA分解酵素；酸性緩衝液；カオトロピックイオンを含む溶液（吸着液）；アルコールを含む溶液（洗浄液）；低塩濃度の溶液または水（溶出液）；微粒子または微粒子を内蔵した容器；および担体を内蔵した容器、を含むものである。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例等を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４２】
〔本発明の方法によるヨーネ菌DNA抽出精製法〕
以下の実施例において、本発明の方法によるヨーネ菌DNAの抽出・精製は、以下の方法により行った。
【００４３】
（試薬及び器具）
・抽出液：250mM Tris-HCl（pH9.0），750mM LiCl，2重量％ SDS
・酸性緩衝液：GE2-K Buffer（株式会社ニッポンジーン）
・吸着液：GB3 Buffer（カオトロピックイオンとしてグアニジウムイオンを含む、株式会社ニッポンジーン）とイソプロパノールを１：１で混合した溶液
・洗浄液：GW Buffer（アルコールとしてエタノールを含む、株式会社ニッポンジーン）
・溶出液：TE溶液（Tris-HCl（pH8.0）10 mM、EDTA 1 mM）
・酵素液：RNase A（100 mg／ml）
・2.0 mLマイクロチューブ：ジルコニアビーズ（1.2 g、直径0.2 mm）入り
・スピンカラム：ガラス繊維フィルター（直径7 mm）を2枚充填したもの
・マイクロピペット
・ピペットチップ
・1.5mLマイクロチューブ
・50mL遠沈管
・ビーズ式破砕機
・遠心分離機
・ボルテックスミキサー
【００４４】
（試験方法）
（１）牛糞便1gを50mL遠沈管に採取し、滅菌蒸留水を20mL添加、ボルテックスミキサーで激しく混合攪拌（30分間）した後、30分間静置する。（牛糞便懸濁液）
（２）2.0mLマイクロチューブ（ジルコニアビーズ入り）に、（１）の牛糞便懸濁液の上清より1mLを移し、遠心（20K×g，5分間，室温）した後、その上清を除去する。
（３）（２）のチューブに600μLの抽出液及び6μLのRNase Aを添加する。
（４）ビーズ式破砕機に（３）のチューブをセットし、4,000rpm、5分間の条件（安井機器（株）製「マルチビーズショッカー」使用の場合）で破砕する。
（５）5分間、室温にて静置する。
（６）75μLのGE2-K Bufferを添加し、10〜12回チューブを転倒し、よく混和する。
（７）遠心（20K×g，10分間，室温）する。
（８）上清500μLを新しい1.5mLマイクロチューブに移す。
（９）400μLの吸着液を添加し、10〜12回チューブを激しく転倒させ、よく混和する。
（10）（９）の混合液900μLをスピンカラムに移し、遠心（13K×g，60秒間，室温）し、濾液はマイクロピペットで除去する。
（11）600μLのGW Bufferを（10）で使用したスピンカラムに添加した後、遠心（13K×g，60秒間，室温）し、濾液はマイクロピペットで除去する。
（12）（11）のスピンカラムを新しい1.5mLマイクロチューブにセットする。
（13）50μLのTE溶液を（12）のスピンカラムに滴下した後、3分間室温で静置する。
（14）スピンカラムを遠心（13K×g，60秒間，室温）し、濾液を回収してDNA液とする。
【００４５】
〔従来キットによるヨーネ菌DNA抽出精製法〕
以下の実施例において、従来キットによるヨーネ菌DNAの抽出・精製は、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究所の「ヨーネ病検査マニュアル」（http://ss.niah.affrc.go.jp/disease/paratuberculosis/NIAH_yone_kensahou_090331.pdf）記載の方法により、牛糞便用ヨーネ菌核酸調製試薬「ヨーネプレップ（登録商標）」（共立製薬KK）を用いて行った。以下にその方法を示す。
【００４６】
（１）2mLチューブ（破砕、抽出用）に、ジルコニアビーズ（微粒子）を容積で0.3mL、若しくは重量で1.5gずつ分注する。
（２）糞便１ｇを20mLの滅菌蒸留水で希釈し、激しく混合撹拌する（30分間）。30分間静置後、上清1mLを（１）の微粒子入りのチューブに移す。
（３）（２）のチューブを遠心（10,000rpmで5分）し、マイクロピペットを用いて微粒子より上の上清を除去する。
（４）（３）のチューブに、キットに添付の糞便洗浄試薬1mLを加え、ミキサーを用いて再懸濁する。さらに、チューブを遠心（10,000rpｍで5分）し、マイクロピペットを用いて微粒子より上の上清を除去する。
（５）（４）のチューブに、キットに添付の核酸抽出試薬700μLと有機溶媒（クロロホルム：イソブタノール＝１：１の混合液、要時調製）700μLを加える。
（６）（５）のチューブをビーズ式細胞破砕機を用いて激しく攪拌（安井機器（株）製「マルチビーズショッカー」使用の場合は4,000rpmで5分）後、遠心（10,000rpmで5分）する。
（７）遠心分離後、上清350μLを新しい1.5mLチューブに移し、さらにイソプロパノール350μLを加える。チューブを転倒混和した後、遠心（15,000rpmで10分）する。
（８）遠心分離後、上清をマイクロピペットで除去する。
（９）沈査の残った（８）のチューブに70％エタノールを1mL加え、チューブの底を指ではじき、チューブ壁面から核酸ペレットを剥がすようにしてリンスする。
（10）（９）のチューブを遠心（15,000rpmで3分）し、上清をマイクロピペットで除去する。チューブを再度遠心（15,000rpm、30秒〜１分）し、管底に溜まった70％エタノールを、細いチップ等を用いて出来る限り完全に取り除く。風乾せずに次のステップへ進む。
（11）核酸ペレットの残った（10）のチューブに、マイクロピペットを用いてTE緩衝液（Tris-HCl（pH8.0）10mM、EDTA 1mM）あるいは蒸留水50μLを加え、核酸ペレットを溶解してDNA液とする。DNA液は、検査を行うまで氷上に保存する。調製当日に検査を行わない場合は、−20℃で凍結保存する。
【００４７】
〔ヨーネ菌DNAの検出〕
以下の実施例において、ヨーネ菌DNAの検出は、前出の「ヨーネ病検査マニュアル」により、リアルタイムPCR法（蛍光色素を用いたインターカレーション法）で行った。
この方法では、ヨーネ菌のみが持つIS900遺伝子中の特定塩基配列を、下記のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により試験管内で増幅する。この時、二本鎖DNAに特異的に結合する蛍光色素であるSYBR Green Iを反応系に添加しておくと、反応の進行に伴って増幅された二本鎖DNA にSYBR Green Iが結合し、DNAへの結合により蛍光強度が増強される。PCRの伸展反応過程で反応液の蛍光強度を測定することにより、PCR産物の増加を検出する。
【００４８】
（プライマー）
MP10−1：5’ ATGCGCCACGACTTGCAGCCT 3’（配列番号１）
MP11−1：5’ GGCACGGCTCTTGTTGTAGTCG 3’（配列番号２）
【００４９】
（１）サンプル当たり以下のようにPCR反応液を調製する。サンプル数が多い場合は、DNA液を除いた各試薬を必要量混合してまとめて調製してもよい。
【００５０】
PCR Master Mix（「QuantiTect SYBR Green PCR Kit」キアゲン社） 25 （μL）
Primer 10−1（100pmol／μL） 0.25
Primer 11−1（100pmol／μL） 0.25
ウラシル−DNA グリコシラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン社）
（2 units／μL） 0.25
蒸留水 19.25
糞便由来DNA液 5.0
全量 50
【００５１】
（２）0.6mLのチューブ等に、（１）のDNA液以外のPCR反応液を45μLずつ分注する。サンプルのDNA液を5μL添加し、マイクロピペットで良く攪拌後、PCR用96−wellプレートの１well当たり25μLずつ、２wellに分注する。
（３）ヨーネ菌参照DNAを所定の濃度に希釈し、陽性対照wellに分注する。陰性対照として、DNA液の代わりにTE緩衝液（Tris-HCl（pH8.0）10mM、EDTA 1mM）あるいは蒸留水を添加した反応液を、所定のwellに分注する。
（４）キャップあるいはシールを用いて96−wellプレートを密封した後、PCRサイクル等の条件を以下のように設定し、PCR及び産物の解離曲線解析(Melt curve解析、Dissociation curve解析)を行う。
【００５２】
【表１】
【００５３】
（リアルタイムPCRの判定）
PCRに伴い反応液の蛍光強度が上昇し、かつ解離曲線解析においてヨーネ菌参照DNAと同様の解離曲線像を示したサンプルを陽性、つまりヨーネ菌DNAが存在する、と判定する。反対に、蛍光強度が上昇しなかった、あるいはヨーネ菌参照DNAと異なる解離曲線像を示したサンプルは陰性、つまりヨーネ菌DNAが存在しないとする。
上記の基準によりPCR陽性となったサンプルについては、参照DNAを用いた用量−反応直線式から、サンプル中のヨーネ菌DNA濃度が計算される。
なお、リアルタイムPCRを行わない場合は、PCR終了後反応液の一部を電気泳動し、183bpのPCR産物が確認された場合にPCR陽性とし、ヨーネ菌と同定する。
【００５４】
〔実施例１〕
本発明の方法および対照として従来のキット（「ヨーネプレップ（登録商標）」共立製薬KK）を用いて、所定濃度の検定用糞便希釈液からヨーネ菌DNAを抽出、精製し、抽出効率を比較した。
すなわち、ヨーネ菌実験感染牛の糞便を生理食塩液で希釈（1：10、1：100、1：1,000）し、所定のヨーネ菌DNAが含まれることを確認した糞便希釈液を、検定用糞便として使用した。
本発明の方法を利用した糞便からのDNA抽出精製は、前出の〔本発明の方法によるヨーネ菌DNA抽出精製法〕に記載した方法により実施した。
従来キットによる糞便からのDNAの抽出精製方法については、前出の〔従来キットによるヨーネ菌DNA抽出精製法〕に従って実施した。
ヨーネ菌DNAの定量は、前出の〔ヨーネ菌DNAの検出〕に記載した方法により行った。
【００５５】
結果を図１に示す。図１中、白棒は従来のキット、黒棒は本発明方法により抽出されたDNA量（pg／PCR）を示す。
本発明の方法により抽出された計算上のDNA量（pg/PCR）は、糞便希釈液のいずれの濃度においても従来のキットを用いた方法よりも高いDNA量（pg/PCR）を示した。これは、実際にDNA量が多く抽出精製されているか、精製度が高いため、糞便由来のPCR阻害物質の影響が少なく、良好にDNAが増幅したためと考えられる。
【００５６】
〔実施例２〕
ヨーネ菌実験感染牛の腸管乳剤よりDNAを抽出精製後、リアルタイムPCRにより乳剤中ヨーネ菌DNAを定量し、本発明方法によるPCR阻害物質の除去効果を調べた。
すなわち、ヨーネ菌実験感染牛の解剖実験で得られた腸管（回腸部分）から、生理食塩液を用いて約10％臓器乳剤を作製し、実験に供した。
本発明の方法を利用した腸管乳剤からのDNA抽出精製は、前出の〔本発明の方法によるヨーネ菌DNA抽出精製法〕に記載した方法において、糞便の代わりに腸管乳剤を用いることにより実施した。
従来キットによる腸管乳剤からのDNAの抽出精製方法については、前出の〔従来キットによるヨーネ菌DNA抽出精製法〕に従って、糞便の代わりに腸管乳剤を用いて実施した。
ヨーネ菌DNAの定量は、前出の〔ヨーネ菌DNAの検出〕に記載した方法により行った。
【００５７】
結果を図２に示す。図２の棒グラフにおいて、白棒は従来のキット、黒棒は本発明方法によりそれぞれ抽出精製後、リアルタイムPCRにより定量したDNA量（pg／PCR）を示す。また、図２の曲線グラフはリアルタイムPCRによる増幅曲線であり、縦軸は蛍光強度を、横軸はPCRサイクル数を、それぞれ示す。
図２から、従来キットでは、抽出DNA液中にPCR阻害物質が多く含まれる為、PCR効率が落ち、その結果として計算上のヨーネ菌DNA含有量が大きく低下することが分かった。
【００５８】
〔実施例３〕
本発明の方法で添加するRNA分解酵素の効果を確認するため、前出の〔本発明の方法によるヨーネ菌DNA抽出精製法〕に記載した方法に従って、RNA分解酵素を添加した場合と未添加の場合で、所定濃度の検定用糞便希釈液からヨーネ菌DNAを抽出精製し、抽出効率を比較した。
すなわち、ヨーネ菌実験感染牛の糞便を生理食塩液で希釈（1：10、1：100）し、所定のヨーネ菌DNAが含まれることを確認した糞便希釈液を、検定用糞便として使用した。
ヨーネ菌DNAの定量は、前出の〔ヨーネ菌DNAの検出〕に記載した方法により行った。
【００５９】
結果を図３に示す。図３中、黒棒はRNA分解酵素を添加した場合、白棒はRNA分解酵素を未添加の場合で抽出された計算上のDNA量（pg／PCR）を示す。
RNA分解酵素を未添加の場合では、添加した場合に比べ、10倍希釈では、計算上のDNA量（pg/PCR）が極端に少く、100倍希釈では、未添加の場合にヨーネ菌DNAを検出出来ないという結果であった。リアルタイムPCRの反応液にRNAが混入した場合でもPCRを阻害するとは考えられないため、RNAが本発明の方法において、ヨーネ菌DNAの精製に大きく影響していることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、ヨーネ病等の抗酸菌の遺伝子検査において、糞便等の精製困難なサンプルからも抗酸菌DNAを抽出精製できる方法として、畜産・獣医、並びに医学領域での利用が大いに期待される。本発明を応用したヨーネ菌DNA抽出キットが既に完成しており、早期の販売開始を目指している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便中等の微生物に関する情報を得る技術に関し、より詳細には、精製が困難とされる糞便や組織等の生物学的サンプル中から、抽出が困難とされるマイコバクテリウム属の細菌（抗酸菌）のDNAを簡便・迅速に抽出精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
重要な抗酸菌感染症の一つであるヨーネ病は、反芻動物の慢性消化器感染症であり、長い潜伏期間の後、栄養状態の悪化、慢性の下痢、削痩等の症状を示し、やがて死に至る。我が国では、ヨーネ病を家畜伝染病予防法の中でも最重要伝染病の一つに指定し、撲滅を目的とした防疫が進められている。
【０００３】
また、近年諸外国ではヨーネ菌がヒトから分離されるとの報告がある為、本菌の公衆衛生上の問題についても注目を集めており、様々な生物学的サンプルからヨーネ菌を検出する高感度で精度の高い検査法の確立が求められている。
【０００４】
病原体であるヨーネ菌の人工培地上での発育が極めて遅い為、ヨーネ菌の遺伝子検査法は、長期間を必要とするヨーネ菌培養検査に代わる簡便で迅速な診断法として期待されている。特に、遺伝子検査の実施に当たっては、糞便等からヨーネ菌DNAを効率よく抽出する方法の確立が重要である。
【０００５】
加熱法やDNA簡易抽出試薬を応用する方法等、牛の糞便等の生物学的サンプルからヨーネ菌を含む抗酸菌DNAを抽出する方法は、これまでにも種々報告されている。
【０００６】
これらの中で、特許文献１〜３記載の技術を応用した牛糞便等からのヨーネ菌DNAの抽出・精製キットが現在市販されている。このキットでは、糞便等の試料を、キレート試薬及び第四級アンモニウム塩を含む水溶液と有機溶媒（クロロホルム・ブタノール）との混合液中でビーズ破砕することにより、核酸を抽出・精製する。
【０００７】
上記の現行市販キットでは、基本的に有機溶媒による除タンパクとアルコールによるDNAの沈殿という、従来からの基礎技術を応用している。
この技術の問題点として、DNAの沈殿・洗浄操作、乾燥と再溶解を行う上である程度の技術的熟練を要する点、検査実施者によりDNAの抽出効率が大きく変わることがある点、さらに、クロロホルム等人体に有害な有機溶媒を用いる為、その廃液管理が必要である点等が挙げられる。また、多検体処理に向かないことも問題点として解決が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−３７７９８号公報
【特許文献２】特開２００４−８０９４号公報
【特許文献３】特開２００４−８１０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
かかる状況下、本発明は、有害な有機溶媒を必要としない、簡便かつ迅速なヨーネ菌等の抗酸菌DNAの抽出精製法を提供し、抗酸菌感染症の遺伝子検査技術の発展に資することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、有機溶媒やキレート剤を用いない抗酸菌DNA抽出法を開発した。
さらに、抗酸菌DNAを効率的に吸着するDNA吸着担体を見出し、それを装着したマイクロチューブ（スピンカラム）方式により、DNAを精製する系を構築した。
【００１１】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、0.01〜10重量％の陰イオン性界面活性剤およびpH7〜13の緩衝剤を含む、抗酸菌からのDNA抽出用溶液である。
請求項２に記載の本発明は、さらに0.01〜2.0 Mのアルカリ金属塩を含む、請求項１に記載の溶液である。
請求項３に記載の本発明は、陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、またはN−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムである請求項１又は２に記載の溶液である。
【００１２】
請求項４に記載の本発明は、生物学的サンプルに、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出することを特徴とする、抗酸菌からのDNA抽出法である。
請求項５に記載の本発明は、次の各工程からなる抗酸菌からのDNA抽出精製法である。
Ａ）生物学的サンプルに、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液およびRNA分解酵素を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出する第一工程
Ｂ）次にpH2〜6の酸性緩衝液を添加し、サンプル由来の夾雑物や請求項１〜３のいずれかに記載の溶液由来の陰イオン性界面活性剤を析出させ、除去する第二工程
Ｃ）さらにカオトロピックイオンを含む溶液を添加し、容器に内蔵された担体にDNAを吸着させ、アルコールを含む溶液で担体を洗浄した後、塩濃度が50 mM以下である低塩濃度の溶液または、水にて担体からDNAを解離させて回収する第三工程
【００１３】
請求項６に記載の本発明は、酸性緩衝液の添加によって、陰イオン性界面活性剤のカウンターイオンを変更させ、溶解度を変えることにより、陰イオン性界面活性剤を析出させる、請求項５に記載の方法である。
請求項７に記載の本発明は、フェノール、クロロホルムおよびブタノールを用いない請求項５又は６に記載の方法である。
請求項８に記載の本発明は、請求項５〜７に記載の方法に使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液；RNA分解酵素；pH2〜6の酸性緩衝液；カオトロピックイオンを含む溶液；アルコールを含む溶液；低塩濃度の溶液；微粒子または微粒子を内蔵した容器；および担体を内蔵した容器、を含む抗酸菌DNA抽出精製用キットである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、キレート試薬並びにフェノール、クロロホルムおよびブタノールなどの有害な有機溶媒を使用せず、ヨーネ菌をはじめとする抗酸菌DNAを効率的に抽出・精製することができる。
さらに、従来の糞便等からのヨーネ菌DNA抽出技術との比較では、本発明の方が高い抽出効率を示し、抽出試料中のPCR阻害物質の除去効率も本発明の方が高い。
また、有機溶媒を使用しないDNA抽出方法である為、クロロホルム等の廃液管理も不要となる。
【００１５】
さらに、本発明では、スピンカラム方式を応用することにより、DNAの洗浄、回収ステップが簡便化し、検査実施者の技術的熟練を必要としないDNA精製法となっている。
また、DNA吸着担体を96穴プレートカラムに装着することにより、多検体の同時処理が可能なDNA抽出精製法の開発へも繋げられる。
このように、本発明は高い実用性を備えた新規技術であると言える。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】検定用糞便を用いたDNA抽出効率を示す図である。白棒は従来のキット、黒棒は本発明方法により抽出されたDNA量（pg／PCR）を示す。
【図２】PCR阻害物質の除去効果を示す図である。棒グラフにおいて、白棒は従来のキット、黒棒は本発明方法によりそれぞれ抽出精製後、リアルタイムPCRにより定量したDNA量（pg／PCR）を示す。また曲線グラフはリアルタイムPCRによる増幅曲線であり、縦軸は蛍光強度を、横軸はPCRサイクル数を、それぞれ示す。
【図３】RNA分解酵素の添加による効果を示す図である。黒棒は酵素を添加した場合、白棒は酵素を未添加の場合で本発明方法によりそれぞれ抽出精製後、リアルタイムPCRにより定量したDNA量（pg／PCR）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抗酸菌からのDNA抽出精製法は、次の各工程からなることを特徴とする。
Ａ）糞便等の生物学的サンプルに、陰イオン性界面活性剤および緩衝剤を含むDNA抽出用溶液並びにRNA分解酵素を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出する第一工程
Ｂ）次に酸性緩衝液を添加し、サンプル由来の夾雑物や前記陰イオン性界面活性剤を析出させ、除去する第二工程
Ｃ）さらにカオトロピックイオンを含む溶液を添加し、担体にDNAを吸着させ、アルコールを含む溶液で担体を洗浄した後、低塩濃度の溶液または水にて担体からDNAを解離させて回収する第三工程
【００１８】
本発明でいう「抗酸菌」としては、ヨーネ菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）、ヒト型結核菌（M. tuberculosis）、ウシ型結核菌（M. bovis）、M. africanum、ネズミ型結核菌（M. microti）、ライ菌（M. leprae）、M. avium、M. intracellulare、M. kansasiiなどのマイコバクテリウム属細菌が挙げられる。
【００１９】
本発明における「DNA抽出用溶液（以下、抽出液ともいう。）」は、少なくとも陰イオン性界面活性剤および緩衝剤を含む。
【００２０】
本発明の抽出液に用いる「陰イオン性界面活性剤」としては、ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium dodecyl sulfate：SDS）、ドデシル硫酸リチウム（Lithium dodecyl sulfate：LDS）、N−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（Sodium lauroyl sarcosinate）などが挙げられ、特にSDSやLDSが好ましい。
本発明の抽出液における陰イオン性界面活性剤の濃度は、0.01〜10重量％、好ましくは0.5〜5.0重量％、さらに好ましくは1.0〜3.0重量％とすればよい。
【００２１】
本発明の抽出液に用いる「緩衝剤」としては、トリス（tris（hydroxymethyl）aminomethane：Tris）、トリシン（Tricine）、ヘペス（HEPES）などが挙げられ、特にトリスが好ましい。本発明の抽出液における緩衝剤のpHは、7.0〜13.0、好ましくは7.5〜10.0とすればよい。
【００２２】
本発明の抽出液は、さらにアルカリ金属塩を含有することが好ましい。
本発明における「アルカリ金属塩」としては、塩化リチウム（LiCl）、塩化ナトリウム（NaCl）などが挙げられ、特にLiClが好ましい。
本発明の抽出液におけるアルカリ金属塩の濃度は、0.01〜2.0 M、好ましくは0.1〜1.0 M、さらに好ましくは0.4〜0.8 Mとすればよい。
【００２３】
本発明のDNA抽出法は、被検体である生物学的サンプルに上記の抽出液を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出することを特徴とする。
【００２４】
本発明における「生物学的サンプル」としては、糞便、唾液、血液、毛髪、体毛、細胞、組織などDNAを含むものであれば何でも用いることができる。糞便としては、ヒト、牛、山羊、羊などの糞が挙げられる。
本発明において生物学的サンプルはそのままでも懸濁液でも用いることができるが、好ましくは、サンプル1.0 gに対し、溶媒を15〜25 ml添加し、20〜40分間激しく攪拌した後、20〜40分間静置した懸濁液の上清を用いる。懸濁液の溶媒としては生理食塩水、滅菌蒸留水などが好適である。
検査のために必要なサンプル懸濁液の量は0.5〜2.0 mlであり、懸濁液の上清を10,000〜30,000×gの条件で遠心分離した後、上清を除去した検体に対し、抽出液を0.1〜2.0 ml、好ましくは0.3〜0.9 ml加えればよい。
【００２５】
抗酸菌は細胞を破壊することが難しいため、本発明では抽出液中で糞便等のサンプルを微粒子と共に激しく攪拌して細胞を破砕する。
【００２６】
ここで「微粒子」としては、DNAに影響を与えない素材のものであればよく、例えばジルコニア製、ガラス製、シリカ製、金属製もしくはそれらの混合物などを用いることができ、特にジルコニアビーズが好ましい。直径は0.05〜5.0 mm、好ましくは0.1〜1.0 mmとすればよい。
サンプルの破砕に用いる微粒子の量は、2.0mL容チューブで行う場合、重量では0.5 g〜3.0 g、容積では0.2 ml〜0.4 mlとすればよい。微粒子は、予め破砕用のポリプロピレン製のマイクロチューブ等の容器に充填しておいても良いし、被検体や抽出液などと同時またはその後に添加しても良い。
【００２７】
本発明のDNA抽出法において、細胞を破砕する方法としては、例えばビーズ式破砕機によるものが挙げられる。
攪拌条件は用いる破砕機により異なるが、例えば、ミニビードビーター（和研薬株式会社）の場合は4,600rpm、3分；マルチビーズショッカー（安井機器株式会社）の場合は4,000rpm、5分；シェイクマスター（株バイオメディカルサイエンス）の場合は1,500rpm、30分；マイクロスマッシュ（トミー精工）の場合は4,600rpm、3分；ファーストプレップ（フナコシ）の場合は90秒（45秒×2）；プリセリーズ24（エムエス機器株式会社）の場合は5,000rpm、90秒×2回とすればよい。
【００２８】
本発明では、後の精製工程においてスピンカラム方式を採用する場合、DNA抽出時にRNA分解酵素を添加してサンプル中のRNAを分解すると、DNAの検出感度を10倍以上高めることができるので好ましい。RNAは一本鎖ということもあり、DNAよりもスピンカラムに充填された担体に吸着しやすいため、RNAが混在しているとDNAと競合してしまうためと考えられる。
【００２９】
ここで、本発明における「RNA分解酵素」としては、RNAを分解してオリゴヌクレオチド又はモノヌクレオチドを生成する反応を触媒する酵素であれば特に制限なく用いることができ、例えばRNase Aなどが挙げられる。RNase Aとしては市販の酵素剤を用いればよく、例えばRNase A (100 mg/ml)（318-06391、ニッポンジーン）などが挙げられる。
【００３０】
本発明のDNA抽出法において、被検体である生物学的サンプル、抽出液、微粒子（および必要であればRNA分解酵素）を添加する順序は特に問わず、破砕前に全てが添加されていればよい。
【００３１】
次に、上記のDNA抽出法により抽出されたDNA液に、pH2〜6、好ましくはpH3.5〜5.5の酸性緩衝液を添加することにより、サンプル由来の夾雑物や抽出液由来の陰イオン性界面活性剤を析出させ、除去する。すなわち、酸性緩衝液の添加によって、陰イオン性界面活性剤のカウンターイオンを変更させ、溶解度を低下させることにより、陰イオン性界面活性剤を析出させるのである。
【００３２】
ここで、本発明における「酸性緩衝液」としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられ、特に酢酸緩衝液が好ましい。また、市販されているGE2−K Buffer（ニッポンジーン）などを使用することもできる。酸性緩衝液の添加量は特に限定されないが、例えばDNA粗抽出液600μLに対して25〜200μL、好ましくは50〜100μLとすることができる。
なお、析出させた陰イオン性界面活性剤の除去は、例えば遠心分離により沈殿させる方法など、常法により行うことができる。
【００３３】
本発明のDNA抽出精製法では、続いて、カオトロピックイオンを含む溶液を添加し、担体にDNAを吸着させ、アルコールを含む溶液で担体を洗浄した後、低塩濃度の溶液にて担体からDNAを解離させて、DNAを回収する。
【００３４】
本発明における「カオトロピックイオンを含む溶液」（以下、「吸着液」ともいう。）には、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジンといったグアニジウムイオンやヨウ化ナトリウムといったヨウ素イオンなどのカオトロピックイオンが含まれていれば良く、溶媒としてはイソプロパノール、エタノール、水などが挙げられる。具体的には、市販されているGB3 Buffer（ニッポンジーン）とイソプロパノールを１：１の割合（容量比）で混合したものなどが挙げられる。溶液中のカオトロピックイオンの濃度は0.5 M〜4.0 Mとすることができる。
なお、この吸着液の添加量は特に限定されないが、例えばDNA粗抽出液500μLに対して100〜1000μL、好ましくは300〜600μLとすることができる。
【００３５】
本発明における「担体」とは、DNAを吸着できるものであればなんでも良く、例えばガラス繊維、ガラス粒子、石英濾紙、シリカ粒子、シリカコーティングした素材などが挙げられ、特にガラス繊維が好ましい。
本発明においてこの担体は、「容器」、例えばポリプロピレンもしくはポリスチレン製のスピンカラムなどに内蔵（充填）された状態で用いられる。当該容器に内蔵させる担体の量に特に制限はないが、例えば1 mL容スピンカラムの場合は、直径1〜10 mmのガラス繊維フィルターを1〜5枚内蔵することができる。
前記担体にDNAを吸着させる方法としては、DNAを含む溶液を担体に接触させればよく、例えば容器としてスピンカラムを用いる場合は、DNAを含む溶液をスピンカラムに入れて遠心分離（500〜30,000×g，0.5〜10分間）を行う方法が挙げられる。
【００３６】
本発明における「アルコールを含む溶液」（以下、「洗浄液」ともいう。）には、エタノールなどのアルコールが含まれていれば良く、溶媒としては蒸留水やTE緩衝液などが挙げられる。また、市販されているGW Buffer（ニッポンジーン）などを用いることもできる。溶液中のアルコールの濃度は70〜100 容量％とすることができる。
なお、担体の洗浄に用いる洗浄液の量は特に限定されないが、例えば直径7 mmのシート状の担体2枚に対して0.1〜5.0 mlとすることができる。
【００３７】
本発明における「低塩濃度の溶液」（以下、「溶出液」ともいう。）としては、水やTE溶液など塩濃度が低い溶液を用いれば良く、市販のElution Bufferを用いることもできる。ここで「低塩濃度」とは、塩濃度が0.1〜50 mMであることを指す。この溶出液には、トリスなどの緩衝剤や、EDTAなどのキレート剤が含まれていることが好ましく、溶媒としては例えば滅菌蒸留水やトリス緩衝液などを用いることができる。
【００３８】
本発明のDNA抽出精製法では、この溶出液を前記担体に添加して、0.1〜10分間担体中に保持させた後、担体を通過させることにより、DNAを担体から解離（溶出）し、精製DNA液を得る。担体がスピンカラムに内蔵されている場合は、溶出液をスピンカラムに添加して遠心分離（500〜30,000×g，0.5〜10分間）することにより、濾液として精製DNA液を得ることができる。
なお、DNAの溶出に用いる溶出液の量は特に限定されないが、例えば直径7 mmのシート状の担体2枚に対して0.03〜0.5 mlとすることができる。
【００３９】
このようにして抽出精製されたDNA液は、そのままPCRやリアルタイムPCRなどのサンプルとして使用することができる。
さらに、このDNAサンプル液を用いてヨーネ菌をはじめとする抗酸菌DNAの検出（ヨーネ病等の抗酸菌感染症の遺伝子診断）を行うことができる。すなわち、上記の方法で得られたDNA液を、ヨーネ菌等の抗酸菌DNAに特有の塩基配列からなるプライマー（例えば配列表の配列番号１、２）を用いたPCRに供し、抗酸菌参照DNAと同様に所定の増幅産物が得られた場合には、抗酸菌DNAと同定される。
【００４０】
本発明は、上述のDNA抽出精製法に必要な溶液、微粒子、および担体を内蔵した容器を含む、抗酸菌DNA抽出精製用キットを提供する。すなわち、本発明のDNA抽出精製用キットは、少なくとも、DNA抽出用溶液；RNA分解酵素；酸性緩衝液；カオトロピックイオンを含む溶液（吸着液）；アルコールを含む溶液（洗浄液）；低塩濃度の溶液または水（溶出液）；微粒子または微粒子を内蔵した容器；および担体を内蔵した容器、を含むものである。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例等を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４２】
〔本発明の方法によるヨーネ菌DNA抽出精製法〕
以下の実施例において、本発明の方法によるヨーネ菌DNAの抽出・精製は、以下の方法により行った。
【００４３】
（試薬及び器具）
・抽出液：250mM Tris-HCl（pH9.0），750mM LiCl，2重量％ SDS
・酸性緩衝液：GE2-K Buffer（株式会社ニッポンジーン）
・吸着液：GB3 Buffer（カオトロピックイオンとしてグアニジウムイオンを含む、株式会社ニッポンジーン）とイソプロパノールを１：１で混合した溶液
・洗浄液：GW Buffer（アルコールとしてエタノールを含む、株式会社ニッポンジーン）
・溶出液：TE溶液（Tris-HCl（pH8.0）10 mM、EDTA 1 mM）
・酵素液：RNase A（100 mg／ml）
・2.0 mLマイクロチューブ：ジルコニアビーズ（1.2 g、直径0.2 mm）入り
・スピンカラム：ガラス繊維フィルター（直径7 mm）を2枚充填したもの
・マイクロピペット
・ピペットチップ
・1.5mLマイクロチューブ
・50mL遠沈管
・ビーズ式破砕機
・遠心分離機
・ボルテックスミキサー
【００４４】
（試験方法）
（１）牛糞便1gを50mL遠沈管に採取し、滅菌蒸留水を20mL添加、ボルテックスミキサーで激しく混合攪拌（30分間）した後、30分間静置する。（牛糞便懸濁液）
（２）2.0mLマイクロチューブ（ジルコニアビーズ入り）に、（１）の牛糞便懸濁液の上清より1mLを移し、遠心（20K×g，5分間，室温）した後、その上清を除去する。
（３）（２）のチューブに600μLの抽出液及び6μLのRNase Aを添加する。
（４）ビーズ式破砕機に（３）のチューブをセットし、4,000rpm、5分間の条件（安井機器（株）製「マルチビーズショッカー」使用の場合）で破砕する。
（５）5分間、室温にて静置する。
（６）75μLのGE2-K Bufferを添加し、10〜12回チューブを転倒し、よく混和する。
（７）遠心（20K×g，10分間，室温）する。
（８）上清500μLを新しい1.5mLマイクロチューブに移す。
（９）400μLの吸着液を添加し、10〜12回チューブを激しく転倒させ、よく混和する。
（10）（９）の混合液900μLをスピンカラムに移し、遠心（13K×g，60秒間，室温）し、濾液はマイクロピペットで除去する。
（11）600μLのGW Bufferを（10）で使用したスピンカラムに添加した後、遠心（13K×g，60秒間，室温）し、濾液はマイクロピペットで除去する。
（12）（11）のスピンカラムを新しい1.5mLマイクロチューブにセットする。
（13）50μLのTE溶液を（12）のスピンカラムに滴下した後、3分間室温で静置する。
（14）スピンカラムを遠心（13K×g，60秒間，室温）し、濾液を回収してDNA液とする。
【００４５】
〔従来キットによるヨーネ菌DNA抽出精製法〕
以下の実施例において、従来キットによるヨーネ菌DNAの抽出・精製は、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究所の「ヨーネ病検査マニュアル」（http://ss.niah.affrc.go.jp/disease/paratuberculosis/NIAH_yone_kensahou_090331.pdf）記載の方法により、牛糞便用ヨーネ菌核酸調製試薬「ヨーネプレップ（登録商標）」（共立製薬KK）を用いて行った。以下にその方法を示す。
【００４６】
（１）2mLチューブ（破砕、抽出用）に、ジルコニアビーズ（微粒子）を容積で0.3mL、若しくは重量で1.5gずつ分注する。
（２）糞便１ｇを20mLの滅菌蒸留水で希釈し、激しく混合撹拌する（30分間）。30分間静置後、上清1mLを（１）の微粒子入りのチューブに移す。
（３）（２）のチューブを遠心（10,000rpmで5分）し、マイクロピペットを用いて微粒子より上の上清を除去する。
（４）（３）のチューブに、キットに添付の糞便洗浄試薬1mLを加え、ミキサーを用いて再懸濁する。さらに、チューブを遠心（10,000rpｍで5分）し、マイクロピペットを用いて微粒子より上の上清を除去する。
（５）（４）のチューブに、キットに添付の核酸抽出試薬700μLと有機溶媒（クロロホルム：イソブタノール＝１：１の混合液、要時調製）700μLを加える。
（６）（５）のチューブをビーズ式細胞破砕機を用いて激しく攪拌（安井機器（株）製「マルチビーズショッカー」使用の場合は4,000rpmで5分）後、遠心（10,000rpmで5分）する。
（７）遠心分離後、上清350μLを新しい1.5mLチューブに移し、さらにイソプロパノール350μLを加える。チューブを転倒混和した後、遠心（15,000rpmで10分）する。
（８）遠心分離後、上清をマイクロピペットで除去する。
（９）沈査の残った（８）のチューブに70％エタノールを1mL加え、チューブの底を指ではじき、チューブ壁面から核酸ペレットを剥がすようにしてリンスする。
（10）（９）のチューブを遠心（15,000rpmで3分）し、上清をマイクロピペットで除去する。チューブを再度遠心（15,000rpm、30秒〜１分）し、管底に溜まった70％エタノールを、細いチップ等を用いて出来る限り完全に取り除く。風乾せずに次のステップへ進む。
（11）核酸ペレットの残った（10）のチューブに、マイクロピペットを用いてTE緩衝液（Tris-HCl（pH8.0）10mM、EDTA 1mM）あるいは蒸留水50μLを加え、核酸ペレットを溶解してDNA液とする。DNA液は、検査を行うまで氷上に保存する。調製当日に検査を行わない場合は、−20℃で凍結保存する。
【００４７】
〔ヨーネ菌DNAの検出〕
以下の実施例において、ヨーネ菌DNAの検出は、前出の「ヨーネ病検査マニュアル」により、リアルタイムPCR法（蛍光色素を用いたインターカレーション法）で行った。
この方法では、ヨーネ菌のみが持つIS900遺伝子中の特定塩基配列を、下記のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により試験管内で増幅する。この時、二本鎖DNAに特異的に結合する蛍光色素であるSYBR Green Iを反応系に添加しておくと、反応の進行に伴って増幅された二本鎖DNA にSYBR Green Iが結合し、DNAへの結合により蛍光強度が増強される。PCRの伸展反応過程で反応液の蛍光強度を測定することにより、PCR産物の増加を検出する。
【００４８】
（プライマー）
MP10−1：5’ ATGCGCCACGACTTGCAGCCT 3’（配列番号１）
MP11−1：5’ GGCACGGCTCTTGTTGTAGTCG 3’（配列番号２）
【００４９】
（１）サンプル当たり以下のようにPCR反応液を調製する。サンプル数が多い場合は、DNA液を除いた各試薬を必要量混合してまとめて調製してもよい。
【００５０】
PCR Master Mix（「QuantiTect SYBR Green PCR Kit」キアゲン社） 25 （μL）
Primer 10−1（100pmol／μL） 0.25
Primer 11−1（100pmol／μL） 0.25
ウラシル−DNA グリコシラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン社）
（2 units／μL） 0.25
蒸留水 19.25
糞便由来DNA液 5.0
全量 50
【００５１】
（２）0.6mLのチューブ等に、（１）のDNA液以外のPCR反応液を45μLずつ分注する。サンプルのDNA液を5μL添加し、マイクロピペットで良く攪拌後、PCR用96−wellプレートの１well当たり25μLずつ、２wellに分注する。
（３）ヨーネ菌参照DNAを所定の濃度に希釈し、陽性対照wellに分注する。陰性対照として、DNA液の代わりにTE緩衝液（Tris-HCl（pH8.0）10mM、EDTA 1mM）あるいは蒸留水を添加した反応液を、所定のwellに分注する。
（４）キャップあるいはシールを用いて96−wellプレートを密封した後、PCRサイクル等の条件を以下のように設定し、PCR及び産物の解離曲線解析(Melt curve解析、Dissociation curve解析)を行う。
【００５２】
【表１】
【００５３】
（リアルタイムPCRの判定）
PCRに伴い反応液の蛍光強度が上昇し、かつ解離曲線解析においてヨーネ菌参照DNAと同様の解離曲線像を示したサンプルを陽性、つまりヨーネ菌DNAが存在する、と判定する。反対に、蛍光強度が上昇しなかった、あるいはヨーネ菌参照DNAと異なる解離曲線像を示したサンプルは陰性、つまりヨーネ菌DNAが存在しないとする。
上記の基準によりPCR陽性となったサンプルについては、参照DNAを用いた用量−反応直線式から、サンプル中のヨーネ菌DNA濃度が計算される。
なお、リアルタイムPCRを行わない場合は、PCR終了後反応液の一部を電気泳動し、183bpのPCR産物が確認された場合にPCR陽性とし、ヨーネ菌と同定する。
【００５４】
〔実施例１〕
本発明の方法および対照として従来のキット（「ヨーネプレップ（登録商標）」共立製薬KK）を用いて、所定濃度の検定用糞便希釈液からヨーネ菌DNAを抽出、精製し、抽出効率を比較した。
すなわち、ヨーネ菌実験感染牛の糞便を生理食塩液で希釈（1：10、1：100、1：1,000）し、所定のヨーネ菌DNAが含まれることを確認した糞便希釈液を、検定用糞便として使用した。
本発明の方法を利用した糞便からのDNA抽出精製は、前出の〔本発明の方法によるヨーネ菌DNA抽出精製法〕に記載した方法により実施した。
従来キットによる糞便からのDNAの抽出精製方法については、前出の〔従来キットによるヨーネ菌DNA抽出精製法〕に従って実施した。
ヨーネ菌DNAの定量は、前出の〔ヨーネ菌DNAの検出〕に記載した方法により行った。
【００５５】
結果を図１に示す。図１中、白棒は従来のキット、黒棒は本発明方法により抽出されたDNA量（pg／PCR）を示す。
本発明の方法により抽出された計算上のDNA量（pg/PCR）は、糞便希釈液のいずれの濃度においても従来のキットを用いた方法よりも高いDNA量（pg/PCR）を示した。これは、実際にDNA量が多く抽出精製されているか、精製度が高いため、糞便由来のPCR阻害物質の影響が少なく、良好にDNAが増幅したためと考えられる。
【００５６】
〔実施例２〕
ヨーネ菌実験感染牛の腸管乳剤よりDNAを抽出精製後、リアルタイムPCRにより乳剤中ヨーネ菌DNAを定量し、本発明方法によるPCR阻害物質の除去効果を調べた。
すなわち、ヨーネ菌実験感染牛の解剖実験で得られた腸管（回腸部分）から、生理食塩液を用いて約10％臓器乳剤を作製し、実験に供した。
本発明の方法を利用した腸管乳剤からのDNA抽出精製は、前出の〔本発明の方法によるヨーネ菌DNA抽出精製法〕に記載した方法において、糞便の代わりに腸管乳剤を用いることにより実施した。
従来キットによる腸管乳剤からのDNAの抽出精製方法については、前出の〔従来キットによるヨーネ菌DNA抽出精製法〕に従って、糞便の代わりに腸管乳剤を用いて実施した。
ヨーネ菌DNAの定量は、前出の〔ヨーネ菌DNAの検出〕に記載した方法により行った。
【００５７】
結果を図２に示す。図２の棒グラフにおいて、白棒は従来のキット、黒棒は本発明方法によりそれぞれ抽出精製後、リアルタイムPCRにより定量したDNA量（pg／PCR）を示す。また、図２の曲線グラフはリアルタイムPCRによる増幅曲線であり、縦軸は蛍光強度を、横軸はPCRサイクル数を、それぞれ示す。
図２から、従来キットでは、抽出DNA液中にPCR阻害物質が多く含まれる為、PCR効率が落ち、その結果として計算上のヨーネ菌DNA含有量が大きく低下することが分かった。
【００５８】
〔実施例３〕
本発明の方法で添加するRNA分解酵素の効果を確認するため、前出の〔本発明の方法によるヨーネ菌DNA抽出精製法〕に記載した方法に従って、RNA分解酵素を添加した場合と未添加の場合で、所定濃度の検定用糞便希釈液からヨーネ菌DNAを抽出精製し、抽出効率を比較した。
すなわち、ヨーネ菌実験感染牛の糞便を生理食塩液で希釈（1：10、1：100）し、所定のヨーネ菌DNAが含まれることを確認した糞便希釈液を、検定用糞便として使用した。
ヨーネ菌DNAの定量は、前出の〔ヨーネ菌DNAの検出〕に記載した方法により行った。
【００５９】
結果を図３に示す。図３中、黒棒はRNA分解酵素を添加した場合、白棒はRNA分解酵素を未添加の場合で抽出された計算上のDNA量（pg／PCR）を示す。
RNA分解酵素を未添加の場合では、添加した場合に比べ、10倍希釈では、計算上のDNA量（pg/PCR）が極端に少く、100倍希釈では、未添加の場合にヨーネ菌DNAを検出出来ないという結果であった。リアルタイムPCRの反応液にRNAが混入した場合でもPCRを阻害するとは考えられないため、RNAが本発明の方法において、ヨーネ菌DNAの精製に大きく影響していることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、ヨーネ病等の抗酸菌の遺伝子検査において、糞便等の精製困難なサンプルからも抗酸菌DNAを抽出精製できる方法として、畜産・獣医、並びに医学領域での利用が大いに期待される。本発明を応用したヨーネ菌DNA抽出キットが既に完成しており、早期の販売開始を目指している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
0.01〜10重量％の陰イオン性界面活性剤およびpH7〜13の緩衝剤を含む、抗酸菌からのDNA抽出用溶液。
【請求項２】
さらに0.01〜2.0 Mのアルカリ金属塩を含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、またはN−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムである請求項１又は２に記載の溶液。
【請求項４】
生物学的サンプルに、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出することを特徴とする、抗酸菌からのDNA抽出法。
【請求項５】
次の各工程からなる抗酸菌からのDNA抽出精製法。
Ａ）生物学的サンプルに、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液およびRNA分解酵素を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出する第一工程
Ｂ）次にpH2〜6の酸性緩衝液を添加し、サンプル由来の夾雑物や請求項１〜３のいずれかに記載の溶液由来の陰イオン性界面活性剤を析出させ、除去する第二工程
Ｃ）さらにカオトロピックイオンを含む溶液を添加し、容器に内蔵された担体にDNAを吸着させ、アルコールを含む溶液で担体を洗浄した後、塩濃度が50 mM以下である低塩濃度の溶液または、水にて担体からDNAを解離させて回収する第三工程
【請求項６】
酸性緩衝液の添加によって、陰イオン性界面活性剤のカウンターイオンを変更させ、溶解度を変えることにより、陰イオン性界面活性剤を析出させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
フェノール、クロロホルムおよびブタノールを用いない請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
請求項５〜７に記載の方法に使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液；RNA分解酵素；pH2〜6の酸性緩衝液；カオトロピックイオンを含む溶液；アルコールを含む溶液；低塩濃度の溶液；微粒子または微粒子を内蔵した容器；および担体を内蔵した容器、を含む抗酸菌DNA抽出精製用キット。
【請求項１】
0.01〜10重量％の陰イオン性界面活性剤およびpH7〜13の緩衝剤を含む、抗酸菌からのDNA抽出用溶液。
【請求項２】
さらに0.01〜2.0 Mのアルカリ金属塩を含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、またはN−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムである請求項１又は２に記載の溶液。
【請求項４】
生物学的サンプルに、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出することを特徴とする、抗酸菌からのDNA抽出法。
【請求項５】
次の各工程からなる抗酸菌からのDNA抽出精製法。
Ａ）生物学的サンプルに、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液およびRNA分解酵素を添加して、微粒子と共に攪拌し、DNAを抽出する第一工程
Ｂ）次にpH2〜6の酸性緩衝液を添加し、サンプル由来の夾雑物や請求項１〜３のいずれかに記載の溶液由来の陰イオン性界面活性剤を析出させ、除去する第二工程
Ｃ）さらにカオトロピックイオンを含む溶液を添加し、容器に内蔵された担体にDNAを吸着させ、アルコールを含む溶液で担体を洗浄した後、塩濃度が50 mM以下である低塩濃度の溶液または、水にて担体からDNAを解離させて回収する第三工程
【請求項６】
酸性緩衝液の添加によって、陰イオン性界面活性剤のカウンターイオンを変更させ、溶解度を変えることにより、陰イオン性界面活性剤を析出させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
フェノール、クロロホルムおよびブタノールを用いない請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
請求項５〜７に記載の方法に使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の溶液；RNA分解酵素；pH2〜6の酸性緩衝液；カオトロピックイオンを含む溶液；アルコールを含む溶液；低塩濃度の溶液；微粒子または微粒子を内蔵した容器；および担体を内蔵した容器、を含む抗酸菌DNA抽出精製用キット。
【図１】
【図３】
【図２】
【図３】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−８０８５３（Ｐ２０１２−８０８５３Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２３２０５１（Ｐ２０１０−２３２０５１）
【出願日】平成２２年１０月１５日（２０１０．１０．１５）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【出願人】（０００１３５１６２）株式会社ニッポンジーン (7)
【出願人】（５０３３３５１７９）株式会社ファスマック (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１５日（２０１０．１０．１５）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【出願人】（０００１３５１６２）株式会社ニッポンジーン (7)
【出願人】（５０３３３５１７９）株式会社ファスマック (1)
【Ｆターム（参考）】
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