抗ＨＩＶ剤
【課題】従来とは異なった作用機序に基づく抗ＨＩＶ剤を提供すること。
【解決手段】有効成分として、抗ＣＤ８７抗体又は当該抗体のＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片であってよい、ＣＤ８７に対するリガンドを含むことを特徴とする、抗ＨＩＶ剤。該リガンドは、抗ＣＤ８７抗体（モノクローナル又はポリクローナル）であってもよい。更にはまた、該リガンドは、抗ＣＤ８７抗体の、ＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片又は類縁体であってもよい。
【解決手段】有効成分として、抗ＣＤ８７抗体又は当該抗体のＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片であってよい、ＣＤ８７に対するリガンドを含むことを特徴とする、抗ＨＩＶ剤。該リガンドは、抗ＣＤ８７抗体（モノクローナル又はポリクローナル）であってもよい。更にはまた、該リガンドは、抗ＣＤ８７抗体の、ＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片又は類縁体であってもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＨＩＶ剤に関し、更に詳しくはＨＩＶ感染者におけるＨＩＶの増殖を抑制するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであるＨＩＶは、レトロウイルス科レンチウイルス亜科に属するＲＮＡウイルスである。ＨＩＶの感染及び増殖は以下の機構で行われる。最初にＨＩＶ粒子のエンベロープタンパク質の一つであるｇｐ120が標的細胞表面のＣＤ４に結合する。続いて、それらはコレセプターであるケモカインレセプター（主にマクロファージ表面のCCR5又はＴ細胞表面のCXCR4）と結合し、ｇｐ120、ＣＤ４及びケモカインレセプターの複合体を形成する。その後、別のエンベロープタンパク質であるｇｐ41が標的細胞の細胞膜に結合し、エンベロープと細胞膜との膜融合を引き起こし、その結果細胞内にウイルス本体が侵入する。細胞内に侵入したＨＩＶは、脱殻し、次いで自身の有する逆転写酵素の働きで、ＲＮＡゲノムから二本鎖ＤＮＡであるプロウイルスＤＮＡが合成される。プロウイルスＤＮＡは、やはりウイルス自身の有するインテグラーゼの働きにより、宿主細胞の染色体中に組み込まれる。組み込まれたプロウイルスからは、その5'末端のＬＴＲ（Long Terminal Repeat）領域をプロモーターとして、ウイルスｍＲＮＡが転写される。このｍＲＮＡには、長さの異なった幾つかのものが存在し、それらはウイルスタンパク質を合成するためのものとウイルスゲノムＲＮＡになるものに大別される。ウイルスタンパク質には、ウイルス粒子の構造タンパク質、ウイルスの増殖を促進するタンパク質等が含まれる。例えば、ウイルスタンパク質Tatは、宿主ゲノム中に組み込まれたプロウイルスの5'-ＬＴＲ領域に結合し、ウイルスＲＮＡの転写を数百倍にも増強させる働きをする。一方、ウイルス粒子の構造タンパク質は、細胞内においてウイルスゲノムＲＮＡと細胞膜近傍で会合し、それによりウイルス粒子が形成（アセンブル）される。アセンブルされたウイルス粒子は、出芽により細胞外へ放出される。このアセンブルと出芽の機構については、未だ不明な点が多い。ウイルス粒子の放出後、粒子内ではプロテアーゼが活性化し、プロセッシングが行われ、その結果、感染価を持つ成熟ウイルスが生じる。以上の過程、すなわち標的細胞表面のＣＤ４への結合から、宿主染色体ＤＮＡへの組み込み、増殖及び出芽、成熟の過程を頻繁に繰り返すことにより、ＨＩＶは急激に増殖する。ＨＩＶの増殖に伴い、宿主のＣＤ４陽性細胞が破壊される。これに対抗して宿主は、新たなＣＤ４陽性細胞を、補充のため急速に増殖させる。感染後の数年間はこの動的平衡状態が維持されるが、やがてはＣＤ４陽性細胞の補充が追い付かなくなり、免疫系全体が破綻するに至り、ＡＩＤＳの諸症状が現れる。
【０００３】
ＨＩＶ感染者の体内では、ＨＩＶを排除するために様々な免疫応答が行われている。例えば、ウイルス抗原に対する中和抗体の産生や細胞障害性Ｔ細胞による感染細胞の排除が挙げられる。それ以外に、ＣＤ８陽性細胞が産生する幾つかの液性因子が、ＨＩＶ感染者の無症候期の維持に大きな役割を果たしていることが知られている（Levy, J.A., et al., Immunol. Today, 17: 217-224(1996), Fauci, A.S., Nature, 384: 529-534(1996)）。それらの因子として、既にケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−α、１β、ＳＤＦ−１）やＩＬ−１６が同定されているが、それらのみではＣＤ８陽性細胞由来の抗ＨＩＶ活性の全てを説明できないため、未だ同定されていないＨＩＶ抑制因子の存在が示唆されている。
【０００４】
ケモカインは、標的細胞（マクロファージ及びＴ細胞）へのＨＩＶの侵入を阻害するが、その一方、マクロファージにおいてはケモカインがＨＩＶ増殖を促進することを示唆する報告もある。ＩＬ−１６はＨＩＶの転写を抑制することが知られているが、効果を発揮させるためには極めて高濃度のＩＬ−１６の使用が必要とされている。これらはＡＩＤＳ治療薬として開発されつつはあるが、実用化には至っていない。一方、未だ同定されていない抗ＨＩＶ因子の一部は、これまでのところＨＩＶの転写を抑制すると推測されているが、その本体が明らかとなっていないため、作用機序そのものについても推測の域を出ない。
【０００５】
ＨＩＶ増殖抑制能を有するとしてこれまで報告されている生体由来因子のＨＩＶ増殖抑制率についてまとめると、次の通りである。
（１）ＲＡＮＴＥＳ（分子量 7,851）： ＰＭ１細胞とＨＩＶ−１BaL株を用いた場合、0.78ｎｇ／ｍＬ（＝0.1ｎＭ）で５％、1.56ｎｇ／ｍＬ（＝0.2ｎＭ）で50％、3.12ｎｇ／ｍＬ（＝0.4ｎＭ）で90％ (Cocchi, F. et al., Science 270:p.1811-1815(1995))。
（２）ＭＩＰ−１α（分子量 7,717）： 上記ＲＡＮＴＥＳと同条件下、3.12ｎｇ／ｍＬで０％、6.25ｎｇ／ｍＬ（0.8ｎＭ）で５％、12.5ｎｇ／ｍＬ（＝1.6ｎＭ）で50％ (Cocchi, F. et al.、前掲)。
（３）ＭＩＰ−１β（分子量7,819）： 上記ＲＡＮＴＥＳと同条件下、0.78ｎｇ／ｍＬで０％、1.56ｎｇ／ｍＬ（＝0.2ｎＭで）５％、3.12ｎｇ／ｍＬ（0.4ｎＭ）で15％、6.25ｎｇ／ｍＬ（0.8ｎＭ）で60％ (Cocchi, F. et al.、前掲)。
（４）ＩＬ−１６（分子量 12,422）： 活性型４量体40〜70ｎｇ／ｍＬ（≒１ｎＭ）で61％、400〜700ｎｇ／ｍＬ（＝10ｎＭ）で76％。単量体では20μｇ／ｍＬで50％ (Baier, M. et al., Nature 378;p.563(1995), Amiel, C. et al., J. Infect. Dis.:179,p.83-91(1999))。
（５）ＭＤＣ（分子量 7,936）： 25ｎｇ／ｍＬ（＝3.15ｎＭ）で20％、50ｎｇ／ｍＬ（＝6.3ｎＭ）で50％、200ｎｇ／ｍＬ（＝25ｎＭ）で78％ (Pal, R. et al., Science 278:p.695-698(1997))。
（６）ＳＤＦ−１（分子量 8,698）： 侵入抑制率で見た場合、500ｎｇ／ｍＬ（＝57.5ｎＭ）で30％、１μｇ／ｍＬ（＝115ｎＭ）で60％、増殖抑制率で見た場合、700μｇ／ｍＬ（＝80.5ｎＭ）で80〜85％ (Oberlin, E. et al., Nature 382:p.833-835(1996))。
【０００６】
現在、ＡＩＤＳ治療薬として、逆転写酵素阻害剤（プロウイルスＤＮＡの形成を抑制する）及びプロテアーゼインヒビター（ウイルス粒子の成熟を抑制する）が実用化されるに至っている。すなわち、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤６剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤２剤、プロテアーゼインヒビター５剤が既に市販されており、このうち３つの薬剤（主に逆転写酵素阻害剤２剤プロテアーゼインヒビター１剤）を併用する三剤併用療法（HAART）が実施され、それにより血中のウイルスレベルを検出限界以下にすることが可能となった。
【０００７】
しかし、三薬剤併用療法でも、ＨＩＶを感染者の体内から完全に排除することはできない。このため、ＡＩＤＳ発症阻止のためには、ＨＩＶ感染者はそれらの薬剤を一生服用し続けなければならない。効果を現すためにはそれらの薬剤は大量に服用しなければならず、しかも各薬剤毎に服用の間隔が厳密に定められているため、規則通りの服用が困難な場合があり、コンプライアンスが悪いことが治療効果を減殺するという問題を生じている。更には、これらの薬剤は強い副作用を引き起こす場合が少なくない。
【０００８】
一方、ＨＩＶは非常に変異を起こしやすく、取り分け単一薬剤の投与では数ヶ月のうちに耐性ウイルスが出現する。また、一旦薬剤治療を開始した後にそれを中断すると、耐性ＨＩＶが急速に増殖し、たとえ治療を再開しても最早その薬では効果が得られなくなる。更には、耐性ＨＩＶは、単に何れか一薬剤に耐性であるだけでなく、作用機序を同じくする別の抗ＨＩＶ剤に対しても交差耐性を獲得することが多い。従って、ＡＩＤＳの発症の抑制及び治療のためには、耐性ＨＩＶの出現を極力回避することが必要である。そのためには、ＨＩＶのライフサイクルにおける複数の段階を同時に抑制することが重要である。このことから、現在用いられている抗ＨＩＶ剤が作用するのとは異なった段階でＨＩＶ増殖を阻害する新たな治療薬が渇望されている。この点、特に、ＣＤ８陽性細胞の産生する液性因子は、作用機序は不確かであるがＨＩＶ増殖抑制に大きな役割を果たしていることから、新たなＡＩＤＳ治療薬の候補となる可能性があるものと期待されている。
【０００９】
また、ＡＩＤＳ治療中に強い副作用や、耐性ＨＩＶが出現した場合には、使用する薬剤の変更が必要となるが、現在採り得る選択肢は極めて限られている。これらのことから、ＡＩＤＳ治療のために採り得る選択肢を広げ、且つ耐性ＨＩＶの問題を回避するために、従来のものとは作用機序の異なったタイプの抗ＨＩＶ剤が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような状況において、本発明は、既に臨床使用されたり開発されつつあるものとは作用機序の異なった、新しいタイプの抗ＨＩＶ剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、ＨＩＶ感染者より単離したＣＤ８陽性細胞をＨＴＬＶ−１を用いて不死化してクローニング化し、その培養上清中の抗ＨＩＶ活性を示す未知の因子を精製しその構造及び作用を調べた。その結果、該因子は、高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターのアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ：amino-terminal fragment）であることを見出した。該因子は、(1) 極めて微量（0.74ｎｇ／ｍＬ）で抗ＨＩＶ活性を示すこと、(2) マクロファージ指向性及びＴ細胞指向性のＨＩＶの何れに対しても有効であること、及び、(3) 該因子がＨＩＶウイルスの増殖サイクルにおいてウイルスｍＲＮＡの翻訳より後の段階すなわちウイルス粒子のアセンブル又は出芽の段階を抑制するらしいことも見出した。また、ＡＴＦは、細胞表面のＣＤ８７に特異的に結合する性質を有するが、ＡＴＦを分子末端に含みＣＤ８７のリガンドであることの既に知られている高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター（ＨＭＷ−ｕＰＡ）にも
同様に抗ＨＩＶ活性が存在することを、健常者の尿由来ウロキナーゼを用いて見出した。更には、健常者の尿由来ウロキナーゼの分解産物として得られたＡＴＦも、同様の抗ＨＩＶ活性を有することが確認された。更には、抗ＣＤ８７抗体がＡＴＦと類似の抗ＨＩＶ作用を有すること、及びＡＴＦの抗ＨＩＶ作用が抗ＣＤ８７抗体と同一の標的分子（ＣＤ８７）を介して行われることも見出した。これらの知見から、ＨＩＶ宿主細胞表面のＣＤ８７を、これと特異的に結合するＡＴＦ、ＨＭＷ−ｕＰＡやそれらの断片又は類縁体、抗ＣＤ８７抗体その他のリガンドと接触させてこれを封鎖することにより、ＨＩＶの増殖を抑制できることが判明した。
【００１２】
すなわち、本発明は、ＣＤ８７に対するリガンドを有効成分として含むことを特徴とする、抗ＨＩＶ剤を提供するものである。
【００１３】
本発明において、該リガンドは、例えば高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターであってよい。
【００１４】
また、該リガンドは、高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターの、ＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片又は類縁体であってもよい。
【００１５】
また、該リガンドは、高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターのアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ）であってもよい。
【００１６】
また、該リガンドは、ＡＴＦの、ＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片又は類縁体であってもよい。
【００１７】
また、該リガンドは、抗ＣＤ８７抗体（モノクローナル又はポリクローナル）であってもよい。
【００１８】
更にはまた、該リガンドは、抗ＣＤ８７抗体の、ＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片又は類縁体であってもよい。
【００１９】
本発明はまた、有効成分としてＡＴＦ、又はＣＤ８７に特異的な結合性を有するＡＴＦの断片若しくは類縁体を含有することを特徴とする、医薬組成物をも提供する。
【００２０】
本発明はまた、ＣＤ８７に被検物質を接触させ、ＣＤ８７に特異的に結合する物質を選択することを特徴とする、抗ＨＩＶ薬のスクリーニング方法をも提供する。
【００２１】
本発明はまた、ＣＤ８７に被検物質を接触させてＣＤ８７に特異的に結合する被検物質を選択するステップと、選択された物質に抗ＨＩＶ活性の存することを確認するステップと、抗ＨＩＶ活性の存することの確認された該物質を抗ＨＩＶ薬としてヒトへの投与のために製剤化するステップとを含んでなる、抗ＨＩＶ剤の製造方法をも提供する。
【００２２】
本発明はまた、持続的ＨＩＶ感染細胞と非感染細胞の共存培養系を用意するステップと、該共存培養系に既知濃度の被験物質を加えて共存培養を行うステップと、該共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量を測定するステップと、測定されたＨＩＶ粒子量を、被検物質を加えずに行ったとき共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量と比較するステップと、該比較に基づき、ＨＩＶ粒子の放出を抑制した被検物質を抗ＨＩＶ薬として選択するステップを含むことを特徴とする、抗ＨＩＶ薬のスクリーニング方法をも提供する。
【００２３】
本発明は更に、持続的ＨＩＶ感染細胞と非感染細胞の共存培養系を用意するステップと、該共存培養系に既知濃度の被験物質を加えて共存培養を行うステップと、該共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量を測定するステップと、測定されたＨＩＶ粒子量を、被検物質を加えずに行ったとき共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量と比較するステップと、該比較に基づき、ＨＩＶ粒子の放出を抑制した被検物質を抗ＨＩＶ薬として選択するステップと、該抗ＨＩＶ薬をヒトへの投与のために製剤化するステップとを含む、抗ＨＩＶ剤の製造方法をも提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、感染者の体内におけるＨＩＶの増殖を従来とは異なった機序で抑制する、新しいタイプの抗ＨＩＶ剤を提供し、それにより発症予防及び発症後の治療を含めたＡＩＤＳ治療手段の選択肢を広げ、現行の抗ＨＩＶ剤との併用の形でＡＩＤＳ治療の有効性を改善するのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
ＣＤ抗原の一つであるＣＤ８７は、細胞内ドメインを持たないＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカー型のファミリーに属する膜タンパク質であり、Ｔ細胞及び単球（マクロファージを含む）等の細胞表面に発現されている。このタンパク質は、プロウロキナーゼ及び高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターに対して高い親和性を有し、Ｔ細胞及び単球等の細胞表面でそれらのレセプターとして働いていることが知られている。ヒトＣＤ８７は、先ずアミノ酸１〜335よりなるプレプロ体として合成された後、シグナルペプチド部分（アミノ酸１〜22）が切除され、更にそのカルボキシル末端領域アミノ酸306〜335）がプロセシングにより切除されることによって生じた新たなカルボキシル末端（305 Gly）に糖脂質（GPI）の付加修飾を受け、そのGPIを介して細胞膜に固定される。ＣＤ８７においてリガンドであるプロウロキナーゼ及び高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターとの結合に主たる役割を演じているのは、そのＮ−末端ドメイン１（ＣＤ８７のアミノ酸１〜92）である（関他、生化学、71(5):350-352(1999)）。
【００２６】
本発明において、「ＣＤ８７に対するリガンド」とは、ＣＤ８７に対して特異的な結合性を有する物質を意味し、プロウロキナーゼ、高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター、ＡＴＦ、抗ＣＤ８７抗体やそれらの断片又は類縁体であってＣＤ８７に対し特異的な結合性を有するポリペプチド／タンパク質が代表的なものとして挙げられるが、これらに限定されず、ＣＤ８７に対し特異的に結合する能力を有し且つ生体に投与可能な他の如何なる物質をも包含する。
【００２７】
またＨＩＶは、サブタイプとしてはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２とに区別できるが、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２は共に出芽により宿主細胞から放出されるタイプのウイルスであり、相互に遺伝子的に殆ど異ならず、それらの生活環も同一で、同じメカニズムで増殖するため、抗ＨＩＶ剤との関係では区別する必要がなく、実際、既存の抗ＨＩＶ剤では通常区別されていない。本明細書においても、単に「ＨＩＶ」というときは、「ＨＩＶ−１」及び「ＨＩＶ−２」を包含する。
【００２８】
高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター（ＨＭＷ−ｕＰＡ）（図１(b)、アミノ酸21〜178＋アミノ酸179〜431）は、一本鎖のタンパク質プレプロウロキナーゼ（ｓｃ−ｕＰＡ）（図１(a)、アミノ酸１〜431）が、そのＮ末端のシグナルペプチド（アミノ酸１〜20）を失ってプロウロキナーゼとなった後、アミノ酸178とアミノ酸179との間で酵素（プラスミン、カリクレイン、カテプシンＢ等）による開裂を受け、ジスルフィド結合によって連結された長Ａ鎖とＢ鎖とに分かれることによって生じた二本鎖のタンパク質である。ＨＭＷ−ｕＰＡは、各１つのＥＧＦ様ドメインと、クリングルドメイン及びウロキナーゼレセプター（ＣＤ８７）結合ドメインを含んでいる。
【００２９】
ＨＭＷ−ｕＰＡは更に、アミノ酸155とアミノ酸156との間で生体内で切断され、低分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター（ＬＭＷ−ｕＰＡ）（図１(c)、アミノ酸156〜178及びアミノ酸179〜431）及びプラスミノーゲンアクティベーター活性を有しないアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ）（図１(d)、アミノ酸21〜155）を生じる。また、アミノ酸155とアミノ酸156との間の切断は、例えばｐＨ８のリン酸緩衝液中でのインキュベーションによっても生じるため、ＡＴＦの製造は、ＨＭＷ−ｕＰＡを緩衝液で単にインキュベート（25〜37℃）することによりＡＴＦを製造することができる。ＡＴＦは、ＨＭＷ−ｕＰＡが有するＥＧＦ様ドメイン、クリングルドメイン及びウロキナーゼレセプター（ＣＤ８７）結合ドメインをそのまま含んでいる。ｓｃ−ｕＰＡをコードするヌクレオチド配列及びｓｃ−ｕＰＡのアミノ酸配列を配列表の配列番号１及び２にそれぞれ示す。配列番号１又は２に示した各配列おいて、アミノ酸１〜20がシグナルペプチドを、アミノ酸21〜431がプロウロキナーゼを、アミノ酸21〜431（アミノ酸178とアミノ酸179との間で開裂）がＨＭＷ−ｕＰＡを、アミノ酸21〜155がＡＴＦを、アミノ酸156〜431（アミノ酸178とアミノ酸179との間で開裂）がＬＭＷ−ｕＰＡを、それぞれ表す。
【００３０】
ヒトからヒトへのＨＩＶ伝播は、マクロファージ指向性のＨＩＶによって引き起こされる。感染後、時間の経過と共に、感染者の体内でＴ細胞指向性のＨＩＶが出現してくるが、これは予後不良因子と考えられている。ＣＤ８７はＴ細胞上にもマクロファージ上にも共通に存在しており、ＡＴＦは、ＨＩＶに感染したＴ細胞及びマクロファージの何れに対しても、細胞からのＨＩＶ放出を抑制することによりＨＩＶ増殖抑制効果を現す。このことは、ＡＴＦが感染後の時期の如何に関わりなく抗ＨＩＶ剤として効果を有することを意味する。また、ＡＴＦは極めて微量（0.74ｎｇ／ｍＬ）で効果を発揮する。従ってヒトへの投与量も従来の抗ＨＩＶ剤より少ない量で済ませることができ、投与に伴う患者の身体に対する負担も相対的に軽くすることができる。ＡＴＦをそのＮ末端に含んでいるＨＭＷ−ｕＰＡも、ＡＴＦより幾分弱いものの、抗ＨＩＶ活性を有しており、ＡＴＦと同様に使用できる。感染者に投与されたＨＭＷ−ｕＰＡは、それ自身としてのみならず、体内で切断されてＡＴＦとしても抗ＨＩＶ活性を現すと予測される。また抗ＣＤ８７抗体は、ＨＩＶ感染Ｔ細胞に対してＨＩＶ増殖抑制作用を有するため、感染後Ｔ細胞指向性のＨＩＶが出現た段階においてＨＩＶ増殖を抑制するのに有用である。
【００３１】
後述の試験結果は、本発明の抗ＨＩＶ剤の一有効成分であるＡＴＦが、ウイルスの増殖サイクルにおいて、ウイルスｍＲＮＡの翻訳よりも後の段階、すなわちウイルス粒子の形成（アセンブル）又は出芽の段階において抑制作用を表すということを示しており、これは、これまで知られている抗ＨＩＶ剤の作用機序とは異なる。またＡＴＦは宿主細胞の増殖にも悪影響を与えないことから、細胞毒性も認められない。従ってこれを既存の抗ＨＩＶ剤と併用することにより、感染者の体内でのＨＩＶの増殖における動的平衡状態を感染者側に有利に導くと共に、耐性ウイルスや副作用の問題の回避を容易にする、より優れたＡＩＤＳ治療が可能となる。
【００３２】
＜天然及び組換えＡＴＦ＞
本発明において、ＡＴＦは、例えば健常人尿ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターから得ることができる（Stoppelli, P.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: p. 4939-4943 (1985)を参照）。例えば、ＨＭＷ−ｕＰＡを、0.2Ｍの塩化ナトリウムを含有する50ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中で約８時間又はそれ以上にわたってインキュベートし、反応産物をゲル濾過（例えば、Sephadex G-100を使用）に掛け、溶出液のＵＶ吸収曲線に現れる最後のピーク（ピーク３：ＡＴＦ）に対応する画分を先行のピーク１（ＨＭＷ−ｕＰＡ）及びピーク２（ＬＭＷ−ｕＰＡ）に対応する画分から分離することにより得ることができる。更なる精製は、ＡＴＦを含む画分をイオン交換クロマトグラフィー（例えば、50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ4.8、塩化ナトリウム勾配０〜1.0Ｍ、Mono S HR5/5カラム）に掛けることにより行うことができる。
【００３３】
ＡＴＦはまた、ＡＴＦをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、これにより適当な宿主（例えば、大腸菌、酵母及び哺乳類細胞）を形質転換することにより組換えペプチドとして製造することができる。ＡＴＦは糖鎖構造を有しないことから、天然のＡＴＦをコードするｃＤＮＡを用いて作成した形質転換体が産生する組換えＡＴＦは、天然のＡＴＦと同一構造であり、従って、天然のＡＴＦと同等の活性を有することとなる。また、また、ＡＴＦやＨＭＷ−ｕＰＡの断片又は類縁体でＣＤ８７に対し特異的な結合能力を有するペプチドは、例えばＡＴＦやＨＭＷ−ｕＰＡの部分的修飾、例えば末端アミノ酸残基の削除又は末端へのアミノ酸残基付加、化学的性質の類似したアミノ酸による置換等により行うことができる。それらの操作は化学的に行ってもよいが、ＡＴＦやウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターをコードするｃＤＮＡに対して、周知の何れかの手段を用いて変異を導入することによって行うのが極めて容易である。
【００３４】
＜リガンドのスクリーニング方法＞
ＣＤ８７に被検物質を接触させ、ＣＤ８７に特異的に結合する物質を選択することを特徴とする本発明の抗ＨＩＶ薬のスクリーニング方法は、ＣＤ８７を表面上に有する細胞（Ｔ細胞株、マクロファージ細胞株）を用いて行うことができる。また、ＣＤ８７への被検物質の特異的結合の検出は、レセプター分子へのリガンドの特異的結合の検出のために当業者に知られた種々の手段をＣＤ８７に適用することによって、任意の方法で適宜行うことができる。例えば、被検物質を組み換え技術を用いて作成したＣＤ８７と混和し、インキュイベートした後に、抗ＣＤ８７抗体で免疫沈澱させ、共沈される物質の有無により、特異的な結合を確認することができる。
【００３５】
また、本発明の別のスクリーニング方法である、持続的ＨＩＶ感染細胞と非感染細胞の共存培養系を用意するステップと、該共存培養系に既知濃度の被験物質を加えて共存培養を行うステップと、該共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量を測定するステップと、測定されたＨＩＶ粒子量を、被検物質を加えずに行ったとき共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量と比較するステップと、該比較に基づき、ＨＩＶ粒子の放出を抑制した被検物質を抗ＨＩＶ薬として選択するステップを含むことを特徴とする、抗ＨＩＶ薬のスクリーニング方法は、例えば後述の実施例を参照して行うことができる。使用する細胞及び培養上清中のＨＩＶ粒子量の測定方法の選択においては実施例に拘束される必要はなく、目的に適う材料及び方法を当業者は適宜選択できる。
【００３６】
本発明の抗ＨＩＶ剤は、注射、埋込み等の非経口的方法で、又は、経鼻、経肺等の方法でＨＩＶ感染者に投与することができる。本発明の抗ＨＩＶ剤を注射剤の形態とする場合、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内及び皮下注射用剤とすることができる。注射のためには、本発明の抗ＨＩＶ剤は、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液及び乳濁液の形態をとってよい。水性の媒質としては、水又は、薬剤学的に許容し得る不活性な溶質例えば塩類、多糖類若しくは多価アルコール等を含有した水溶液が挙げられ、それらはまた、薬剤学的に許容し得る緩衝剤により所定のｐＨ範囲に緩衝されていてよい。そのような水性媒質の例としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖液、乳酸リンゲル液等が挙げられるが、それらに限定されない。また、製剤の貯蔵安定性を高めるためには、製剤を凍結乾燥粉末とすることができる。
【００３７】
注射用の製剤のための非水性の媒質としては、グリセロールやプロピレングリコール等の多価アルコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油、ダイズ油、ナタネ油等）、及びオレイン酸エチル等のような有機エステルその他、非経口投与のために通常用いられる非水性の媒質を適宜用いることができる。
【００３８】
本発明の抗ＨＩＶ剤を埋込み用の製剤とする場合、ＡＴＦ等のＣＤ８７のリガンドの持続的な放出を可能にする徐放性担体を適宜用いることができる。そのような担体の使用は、リガンドの投与頻度の減少及び／又は投与量の低下、取扱の容易さ、及びより大きな又はより長期間の効果をもたらすため好ましい。そのような担体の例としては、リポソーム、マイクロスフェア、又は天然又は合成のポリマーよりなるマイクロカプセルその他が挙げられるが、それらに限定されない。また殆どの環境において持続的な遅延された放出のために適した担体の例として、ゼラチン、アラビアゴム、キサンタンポリマー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸／グリコール酸コポリマー等が挙げられる。
【００３９】
経鼻投与及び経肺投与（吸入）は、投薬に伴う患者の負担を軽減するのに特に有効な投与経路である。経鼻投与及び経肺投与（吸入）のためには、本発明の抗ＨＩＶ剤は、溶液、粉末その他、微細な粒子として噴霧及び吸入するのに適した製剤形態とすればよい。そのような製剤の例としては、ＡＴＦ等のＣＤ８７のリガンドと担体との混合物とからなる直径10μｍ以下の乾燥粉末が挙げられる。担体としては、例えばブドウ糖、果糖その他の単糖類、乳糖、麦芽糖、ショ糖その他二糖類、デンプン、セルロース、ヒアルロン酸、キチン、キトサンその他の多糖類、ソルビトール、マンニトールその他の糖アルコール等、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体やポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールその他の有機結合剤、非イオン界面活性剤、ゼラチン、カゼインその他のタンパク質、ポリエチレングリコール等の合成ポリマー等を用いることができる。また、経鼻投与及び経肺投与のための製剤の別の例としては、乾燥ＡＴＦ等のＣＤ８７のリガンドの粉末を弗化炭素プロペラント中に懸濁させたものが挙げられる。
【００４０】
本発明において抗ＨＩＶ剤の有効成分の感染者体重あたり投与量は、ＡＴＦの場合１０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、ＨＭＷ−ｕＰＡの場合１０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、抗ＣＤ８７抗体の場合１０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日程度が適当である。
【実施例】
【００４１】
以下実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されることは意図しない。
ＡＴＦの精製、同定、並びにＡＴＦ、ＨＭＷ−ｕＰＡ及び抗ＣＤ８７抗体の抗ＨＩＶ活性測定に用いた材料及び方法を以下に述べる。
【００４２】
＜材料＞
１）プラスミド
(i) pNL4-3： NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, catalog No. 114として寄託されているものを入手して用いた（図５を参照）。これはＨＩＶ−１感染者のゲノムより単離されたＴ細胞指向性ＨＩＶ−１プロウイルスゲノムＤＮＡをプラスミドベクターpUC18に組み込んだものであり（Adachi, A. et al., J. Virol., 59(2):284-291(1986)）、これで細胞をトランスフェクトスフェクトすることにより、細胞に感染性ＨＩＶ−１ウイルスを産生させることができる。
(ii) pSBR-HIV： pSEAP-Basic（CLONTECH, Palo Alto, CA, USA）を基本骨格として、レポーター遺伝子である分泌型アルカリフォスファターゼ(SEAP)遺伝子の上流に、プロモーターとしてpNL4-3のＬＴＲ領域を組み込み、更にハイグロマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして導入したもの。
このプラスミドは、次の工程により製造した。すなわち：
(a) pSEAP-Basic（図２）（CLONTECH）をNotIとSalIで消化し、SEAP遺伝子を含む領域（図２中、円弧で示した領域）を取り出し、NotI部位をT4ポリメラーゼで平滑化した。
(b) 別に、pREP7（図３）（INVITROGEN, 9704CH, Groningen, the Netherlands）をSalIとClaIで消化し、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Hygromycin）とColE1とアンピシリン耐性遺伝子(Amp)を含む領域（図３中、円弧で示した領域）を取り出し、ClaI部位をT4ポリメラーゼで平滑化した。
(c) 上記(a)及び(b)で得られたプラスミド断片をライゲーションすることにより、pSBR（図４）を構築した。
(d) pNL4-3から、XhoI部位又はHindIII部位を付加したプライマーを用いてＰＣＲ法によりHIV-LTRを増幅し（図５）、増幅産物をXhoI及びHindIIIで消化した。
(e) 上記(c)で得たpSBRをXhoI及びHindIIIで消化し、これに、上記(d)で得られたHIV-LTRを挿入してpSBR-HIV（図６）を構築した。
なお、pSBR-HIVは、HIV-LTRをプロモーターとして持ちレポーター遺伝子（実施例ではSEAP）を発現するプラスミドの一例として構築したものであり、HIV-LTRをプロモーターとして持ち適宜のレポーター遺伝子を発現する、任意のプラスミドを構築して同様に使用してもよい。
【００４３】
２）細胞
(i) HUT.78： NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, catalog No. 89として寄託されているものを用いた。これは慢性皮膚性リンパ腫セザリー症候群患者の末梢血から確立されたＣＤ４陽性Ｔ細胞株である。この細胞は、10％FCS（ウシ胎仔血清）を含むRPMI1640培地（Gibco/BRL）で培養した。
(ii) U937： ATCC（American Type Culture Collection）に catalog No. CRL-1593.2として、及び国立衛生試験所細胞バンクにJCRB, catalog No. 9021として寄託されているものを用いた。これは組織球性リンパ腫患者の腹水から確立されたＣＤ４陽性単芽球株である。この細胞は、10％FCSを含むRPMI1640培地で培養した。
(iii) TALL-1： 国立衛生試験所細胞バンクにJCRB catalog No. 0086として寄託されているものを入手した。これは急性リンパ性白血病患者の末梢血から確立されたＣＤ４陽性Ｔ細胞株である。この細胞は、10％FCSを含むRPMI1640培地で培養した。
(iv) T4/NL4-3： TALL-1にpNL4-3をトランスフェクトすることにより作成した。これは持続的ＨＩＶ−１感染細胞である。この細胞は、10％FCS及び５μＭ ＡＺＴを含むRPMI1640培地で培養した。
(v) U1： NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, catalog No. 165として寄託されているものを入手した。これはU937にＨＩＶ−１感染者末梢血由来ＨＩＶ−１臨床株を感染させ樹立されたマクロファージ指向性ＨＩＶ−１持続感染株である（Chen, B.K., et al., J. Virol., 68(2):654-660(1994)）。この細胞は、10％FCS及び５μＭ ＡＺＴを含むRPMI1640培地で培養した。
(vi) MC141： HUT.78細胞にpSBR-HIVをトランスフェクトすることによりHIV-LTR-SEAPレポーター遺伝子を導入することにより作成した。これは安定的SEAP発現トランスフェクト体である。この細胞は、10％FCS及びハイグロマイシン300μｇ／ｍＬを含むRPMI1640培地で培養した。
(vii) CL-35： U937にpSBR-HIVをトランスフェクトすることによりHIV-LTR-SEAPレポーター遺伝子を導入して得た安定的SEAP発現トランスフェクト体である。この細胞は、10％FCS及びハイグロマイシン300μｇ／ｍＬを含むRPMI1640培地で培養した。
(viii) クローン＃62： 日本人長期無症候ＨＩＶ−１感染者末梢血由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ８抗体でコートした磁性ビーズを用いた正の選択により単離し、これにMT-2 HTLV-1産生Ｔ細胞株（1000 ｒａｄ照射）の同数を接触させることにより感染させて不死化し、１ヶ月間培養の後、限界希釈法によりクローニングして得た。このクローンの培養上清は強いSHIF（可溶性ＨＩＶ増殖抑制因子）活性を示す。この細胞は、15％FCS、ＩＬ−２ 10単位／ｍＬ、10％PBMC（ヒト末梢血由来単核球）条件培養液を含む、RPMI1640培地で継代した。
(ix) ・PBMC：献血由来バフィーコートよりFicoll-Paque（Amersham Pharmacia）を用いて精製した。これは、３μｇ／ｍＬのPHA、１単位／ｍＬのＩＬ−２及び10％FCSを含むRPMI1640培地で３日間培養した後、PHAを含まない同じ培地に交換して更に６日間培養したものを、条件培養液として使用した。
【００４４】
＜ＣＤ８陽性クローン培養上清の調製＞
RPMI1640培地で継代維持しているクローン＃62を、５％FCS及び10単位／ｍＬのＩＬ−２を含むPM1000培地（栄研化学）に培地交換し、３〜４日間培養した。1/2量の培養上清を回収し、細胞には等量の培地を新たに加えて連続的に培養を続けた。回収した培養上清は、0.22μｍのフィルターに通して沈殿物を除き、-80℃で保存した。
【００４５】
＜抗ＨＩＶ活性測定＞
１） 共存培養アッセイ：
共存培養アッセイにおいては、ＨＩＶ持続感染細胞株と非感染細胞株との混合培養が行われる。それにより、非感染細胞へのウイルス吸着、感染、感染細胞内でのウイルス増殖及びウイルス粒子放出の全ての段階からなるウイルスのライフサイクルを含んだ試験系が得られる。このため、共存培養において、細胞外に放出されるウイルス量を測定し、被検物質の添加の有無で放出ウイルス量を比較することにより、ウイルスのライフサイクル中の何れかの段階に対する被検物質の抗ウイルス活性を検出することができる。また、ＨＩＶ持続感染細胞株と非感染細胞株の組み合わせとして、Ｔ細胞株同志の組み合わせ（HUT.78及びT4/NL4-3）並びにマクロファージ株同志の組み合わせ（U1及びU937）を用いることにより、Ｔ細胞指向性ＨＩＶ及びマクロファージ指向性ＨＩＶの各々に対し、被検物質の抗ＨＩＶ活性を評価することができる。
試験操作： 48穴プレートにPM1000培地で希釈したサンプル300μＬと６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び20％FCSを含むRPMI1640培地100μＬを加えておき、そこにOPTI-MEM I 培地で２×105個／ｍＬに調製したHUT.78細胞100μＬと、RPMI1640培地で５×104個／ｍＬに懸濁したT4/NL4-3細胞100μＬを加え（感染T4/NL4-3：未感染HUT.78＝１：４）、３日間培養した。３日後、培養上清の1/2量を同濃度のサンプルを含む新鮮な培地と交換し、更に３日間培養した。培養６日後の培養上清を回収し、培養上清中のウイルス量（p17）とHIV-LTR転写量（SEAP）を測定した。測定には、HIVp17抗原ELISAキット（栄研化学）及び、SEAP レポーター・ジーン・アッセイ化学ルミネセント（ROCHE）を、添付の説明書に従って使用した。６日間培養した細胞には、50μＬのMTSアッセイ試薬(水溶性テトラゾリウム塩)（PROMEGA）を加え、更に４時間培養後、発色をＯＤ490ｎｍで測定し、その時点での生細胞数とした。
同様の方法で、U1（持続感染株）及びU937（非感染株）の共存培養系（U1：U937＝１：４）についても試験を行った。
【００４６】
２） 持続感染細胞単独培養アッセイ：
ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性がＨＩＶのライフサイクルのどの段階を抑制することによるものかについての知見を得るため、持続感染細胞であるU1細胞の単独培養におけるＡＴＦの抗ＨＩＶ活性の有無を検討した。U1細胞はＨＩＶの重複感染を起こさないことが知られていることから、U1細胞の単独培養において抗ＨＩＶ活性が認められた場合、それはＨＩＶプロウイルスＤＮＡの転写ないしそれ以降の段階に対してＡＴＦが作用したことを示す証拠となる。
試験操作： 48穴プレートにPM1000培地で希釈したサンプル300μＬと、６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び15％FCSを含むRPMI1640培地200μＬを加えておき、そこにOPTI-MEM I 培地で２×105個／ｍＬに調製した持続感染細胞（U1）100μＬを加え、３日間培養した。３日後、培養上清の1/2量を同濃度のサンプルを含む新鮮な培地と交換し、更に３日間培養した。培養６日後の培養上清を回収し、培養上清中のウイルス量（p17）を測定した。
【００４７】
３） 感染性ＨＩＶ−ＤＮＡ一過性トランスフェクション：
感染性ＨＩＶ―ＤＮＡをリポソームを用いて強制的に細胞内に導入することにより、ウイルスＤＮＡの核への移行の段階までを強制的に行わせることができる。この系を用いることにより、宿主細胞へのＨＩＶ侵入段階より後のＨＩＶライフサイクルに対する被検物質の抑制作用の有無を検討することができる。
試験操作： 感染性ＨＩＶ−１ ＤＮＡ（pNL4-3）４μｇとDMRIE-C試薬（GIBCO／BRL）10μＬを混和し、２×106個のMC141細胞にトランスフェクトした。24時間後、細胞を回収し、OPTI-MEM I 培地で２×105個／ｍＬに調製した。48穴プレートにPM1000培地で希釈したサンプル300μＬと、６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び15％FCSを含むRPMI1640培地200μＬを加えておき、そこにトランスフェクトしたMC141細胞（２×105／ｍＬ）を100μＬ加え、３日間培養した。３日後、培養上清の1/2量を同濃度のサンプルを含む新鮮な培地と交換し、更に４日間培養した。トランスフェクトから８日後、培養上清を回収し、培養上清中のウイルス量（p17）とHIV-LTR転写量（SEAP）を測定した。
【００４８】
４） 非感染細胞におけるSEAPレポーターアッセイ：
HIV-LTR-SEAPレポーター遺伝子を導入したＨＩＶ非感染細胞（MC141細胞及びCL35細胞）において、TNFα刺激は、ＨＩＶのプロモーターＬＴＲを活性化させその下流に組み込まれた分泌型アルカリフォスファターゼ（SEAP）遺伝子を発現させる。従ってこれらの細胞は、ＨＩＶのライフサイクルの各段階のうち、ＨＩＶプロウイルス転写の段階に対して被検物質が阻害活性を有するか否かを、実際のＨＩＶ増殖を伴うことなく調べるのために用いられる。ＨＩＶ−LTRの転写活性の強さの測定は、培養上清中のSEAPを定量することにより行われる。
試験操作： 96穴プレートに、血清を含まないPM1000培地で希釈したサンプル50μＬと、６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び20％FCSを含むRPMI1640培地25μＬを加えておき、そこにOPTI-MEM I 培地（GIBCO/BRL）で２×105／ｍＬに調整したMC141細胞又はCL35細胞25μＬを播いた。細胞をＡＴＦ添加又は無添加の下にぞれぞれ培養し、培養６日後の培養上清を回収し、そこに含まれるSEAP量を、SEAP レポーター・ジーン・アッセイ化学ルミネセント（ROCHE）を用いて測定した。
【００４９】
５）急性感染ＨＩＶ増殖抑制活性測定（トランスフェクションアッセイ）：
感染性ＨＩＶ−１ ＤＮＡ（pNL4-3）４μｇとDMRIE-C試薬（GIBCO／BRL）10μＬを混和し２×106個のHUT.78細胞にトランスフェクトした。24時間後、細胞を回収し、OPTI-MEM I 培地で洗浄後、２×105個／ｍＬに調製した。48穴プレートに、段階希釈したサンプル又は緩衝液を含むPM1000培地300μＬと、６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び15％FCSを含むRPMI1640培地200μＬを加えておき、そこにトランスフェクトしたHUT.78細胞（２×105個／ｍＬ）を100μＬ加え、４日間培養した。４日後、培地の1/2量を回収し、同濃度のサンプル又は緩衝液を含む新鮮な培地と交換した。以後、４日毎にサンプリングと1/2量の培地交換とを行い、感染から12日後まで培養した。
アッセイはｎ＝２で行い、各培養上清中のウイルス量は、HIVp17抗原ELISAキット（栄研化学）を用いて測定した。
【００５０】
６）ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性に対する抗CD87抗体の影響の検討：
ＡＴＦ及びＨＭＷ−ｕＰＡは細胞表面状のＣＤ８７に特異的に結合することが知られていることから。ＡＴＦ及びＨＭＷ−ｕＰＡの何れにも認められた抗ＨＩＶ活性は、ＣＤ８７への結合を介したものであると推定された。これを確認するため、抗ＣＤ８７抗体がＡＴＦの抗ＨＩＶ活性を遮断し得るか否かを検討した。
試験操作： 48穴プレートにPM1000培地で希釈した抗CD87モノクローナル抗体（＃3936：AMERICAN DIAGNOSTICA INC.）300μＬと、６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び20％FCSを含むRPMI1640培地100μＬを加えておき、そこにOPTI-MEM I 培地で２×105個／ｍＬに調製したMC141細胞100μＬと、RPMI1640培地で５×104個／ｍＬに懸濁したT4/NL4-3細胞100μＬを加え、２時間培養した（抗体の最終濃度は10μｇ／ｍＬ）。２時間後、ＡＴＦを含むサンプル12μＬ（ＡＴＦの最終濃度は約3.3ｎｇ／ｍＬ）を加えた。３日間培養した後、培養上清の1/2量を同濃度の抗体及びサンプルを含む新鮮な培地と交換し、更に３日間培養した。培養６日後の培養上清を回収し、培養上清中のウイルス量（p17）を測定した。また、対照として、抗体及びＡＴＦの一方又は双方を含まない培地、及び抗ＣＤ８７抗体の代わりに非特異的なＩｇＧを添加した培地を用いた培養を、同様の手順で行った。
同様の方法で、感染U1：未感染CL35＝１：４の共存培養系についても試験を行った。
【００５１】
＜抗ＨＩＶ活性因子の調製＞
以下の精製操作は、特に断らない限り、全て４℃にて行った。
１） 先ず、培養上清に１Ｎ塩酸を加えｐＨ2.5に調整し、４℃にて24時間処理した。この処理により、潜在的なウイルス感染のリスクを排除するとともに、多量に含まれるインターフェロンγを失活させた。次いで、１Ｎ水酸化ナトリウムを加えｐＨ3.8に調整した。ｐＨ処理を行った培養上清500ｍＬを、50ｍＭの塩化ナトリウムを含有する25ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ3.8）で平衡化したSPセファロースHigh Performance（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（26ｍｍ×10ｃｍ）に添加した。同緩衝液175ｍＬで洗った後、50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液175ｍＬで溶出し（Ｅ１）、更に250ｍＭの塩化ナトリウムを含有する50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液175ｍＬで溶出した（Ｅ２）。各画分につき、NAP-5カラムで緩衝液交換した後、濃度50％で抗ＨＩＶ活性を測定した。
【００５２】
２） 活性は、SPセファロースHigh PerformanceカラムのＥ２画分に回収された。２ロット分のＥ２画分（１Ｌの培養上清に相当）に塩化ナトリウムを加え最終濃度500ｍＭに調製した。これを、500ｍＭの塩化ナトリウムを含有する50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液で平衡化したBlue Sepharose 6FF（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（26ｍｍ×10ｃｍ）に添加した。同緩衝液175ｍＬで洗った後、1.8Ｍの塩化ナトリウムと0.1％のCHAPSを含有する50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液200ｍＬで溶出した（Ｅ１）。NAP-5カラムで緩衝液交換を行った後、濃度33％で抗ＨＩＶ活性を測定した。
【００５３】
３） 活性は、Blue Sepharose 6FF のＥ１画分に回収された。これを1.8Ｍの塩化ナトリウムと0.1％のCHAPSを含有する50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液で平衡化したHiPreP Butyl 4FF（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（16ｍｍ×10ｃｍ）に添加した（Ｐ）。同緩衝液50ｍＬで洗った後（Ｗ）、100ｍＬの0.1％CHAPS／水で溶出した（Ｅ）。NAP-5カラムで緩衝液交換を行った後、濃度33％で抗ＨＩＶ活性を測定した。
【００５４】
４） 活性はButyl Sepharoseの非吸着画分（Ｐ及びＷ）に回収された。３ロット分の非吸着画分（３Ｌの培養上清に相当）に塩化ナトリウムを加えて最終濃度２Ｍに調整した。これを、２Ｍの塩化ナトリウムと0.1％のCHAPSを含有する50ｍＭ HEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液で平衡化したHiPrep Phenyl（HighSub）6FF （AMERSHAM PHARMACIA）カラム（16ｍｍ×10ｃｍ）に添加した。同緩衝液175ｍＬで洗った後、250ｍＭの塩化ナトリウムと0.1％のCHAPSを含有する50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液150ｍＬで溶出し（Ｅ１）、更に0.1％CHAPS／水の100ｍＬで溶出した（Ｅ２）。NAP-5カラムで緩衝液交換を行った後、濃度25％で抗ＨＩＶ活性を測定した。
【００５５】
５） 活性はＥ１画分に回収された。これを、0.1％のCHAPSを含有する10ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ7.3）緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイト（CHT-2、20μｍ； BioRad）カラム（10ｍｍ×10ｃｍ）に添加した。同緩衝液50ｍＬで洗った後（Ｗ）、0.1％のCHAPSを含有する200ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ7.3）で溶出した（Ｅ200）。NAP-5カラムで緩衝液交換を行った後、濃度25％で抗ＨＩＶ活性を測定した。
【００５６】
６） 活性はヒドロキシアパタイトの非吸着画分（Ｐ）に回収された。これをCentriPlus-10（分子量10,000カット）限外濾過膜（AMICON MILLIPORE）を用いて約40倍に濃縮した。濃縮した活性画分（3.75ｍＬ）を、0.1％のCHAPSと５％のグリセロールを含有する10ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ6.4）緩衝液で平衡化したHiPrep Sephacryl S-100 HR（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（16ｍｍ×60ｃｍ）に添加した。同緩衝液144ｍＬで溶出し、2.5ｍＬずつ分取した。NAP-5カラムで緩衝液交換を行った後、濃度12.5％で抗ＨＩＶを測定した。
【００５７】
７） 活性を有する画分を回収し、0.1％のCHAPSを含有する10ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ6.4）緩衝液で２倍希釈した後、同緩衝液で平衡化したResource S（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（0.64×３ｃｍ）に添加した。同緩衝液10ｍＬで洗った後、0.1％のCHAPSを含有する10ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ6.4）緩衝液を用い、０から500ｍＭまでの塩化ナトリウムグラジエントで溶出し（全25ｍＬ）、１ｍＬずつ分取した。抗ＨＩＶ活性は濃度2.5％で測定した。
【００５８】
８） 活性を有する画分を回収し、３ロット分のResource S活性画分（９Ｌの培養上清に相当）を、0.1％のCHAPSを含有する10ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ6.35）緩衝液で2.5倍に希釈した後、同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイト（CHT-2、20μｍ； BioRad）カラム（0.5×５ｃｍ）に添加した。同緩衝液５ｍＬで洗った後、0.1％のCHAPSを含有する、10ｍＭから400ｍＭまでのリン酸カリウム（ｐＨ6.35）のグラジエントで溶出し（全25ｍＬ）、0.5ｍＬずつ分取した。抗ＨＩＶ活性は濃度１％で測定した。各画分について抗ウイルス活性の測定は、ＨＩＶ持続感染株と非感染株の１：４の割合の共存培養系で培養上清中に放出されるp17抗原を指標とするELISAにより行った。
アッセイ時のサンプル濃度が５％以上になる場合は、血清を含まないPM1000培地で平衡化したNAP-5カラム（AMERSHAM PHARMACIA）を用いてサンプルを同培地に緩衝液交換し、クロマトグラフィーから持ち込まれる過剰の塩等が影響しないようにした。サンプル濃度が５％以下になる場合は、サンプルを直接添加する一方、クロマトグラフィーの際にブランクランを行い、その各画分を対照とすることで持ち込まれる塩の影響を排除した。
結果を図７及び８に示す。図７において、黒四角は測定した画分の抗ウイルス活性を、破線は溶出液のＵＶ吸収曲線を、そして右上がりの直線は、各画分に対応するリン酸カリウム濃度を、それぞれ示す。図８は、画分No.８〜No. 19についてのSDS/PAGE（還元性条件）泳動像を示す。図７と図８とから分かるように、p17放出の抑制でみた抗ＨＩＶ活性画分に対応して分子量約18ｋＤａのバンドが確認された。
【００５９】
９） 活性を有する画分を回収し、Centricon-10（分子量10,000カット）限外濾過膜（MILLIPORE）を用いて15倍に濃縮した。２ロット分の濃縮したヒドロキシアパタイト活性画分（18Ｌの培養上清に相当）に最終濃度0.2％のトリフルオロ酢酸（TFA）を加え、0.2％トリフルオロ酢酸／水で平衡化したResource RPC（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（0.64×３ｃｍ）に添加した。同緩衝液５ｍＬで洗った後、0.2％TFA、30％アセトニトリルまで５ｍＬ、0.2％TFA、50％アセトニトリルまで15ｍＬ、0.2％TFA、100％アセトニトリルまで５ｍＬのグラジエントで溶出し、0.5ｍＬずつ分取した。この逆相カラムクロマトグラフィーのに10℃にて行った。抗ＨＩＶ活性は濃度0.2％で測定した。その結果、このResource RPCカラムからの溶出液においても、抗ＨＩＶ活性を示す画分に対応して18ｋＤａのバンドがSDS/PAGEにより確認された。
【００６０】
活性な画分を回収して減圧乾燥し、約0.9μｇ（500 pmol）の18ｋＤａタンパク質を得た。活性測定用には、これを、0.5％BSAと0.1％CHAPSを含むリン酸緩衝液（PBS）に溶解した。また配列決定用には、SDS/PAGEサンプル緩衝液に溶解した。
【００６１】
＜アミノ酸配列決定＞
上記で精製された18ｋＤａタンパク質サンプルをSDS/PAGEに供し、クマジー・ブリリアント・ブルー（CBB）染色後、バンドを切り出した。切り出したゲル片を直接トリプシン消化し、ペプチドマッピングを行った。また得られたピークのうち３つのアミノ酸配列をシーケンサーにより決定した。その結果、次の内部配列の存在が確認された。
・配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列（断片１）。
・配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列（断片２）。
・配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列（断片３）。
【００６２】
これら断片１、２及び３のアミノ酸配列は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター（ｕＰＡ）のアミノ末端断片（Amino Terminal Fragment（ＡＴＦ）又はLong A chainと呼ばれる）の配列と一致した。ペプチドマッピング及びアミノ酸配列決定結果より、上記で精製されたタンパク質がＡＴＦであることが判明した。
【００６３】
＜ウロキナーゼ原体からのＡＴＦの精製＞
活性画分には一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター、ＨＭＷ−ｕＰＡ、ＬＭＷ−ｕＰＡの何れに対応するバンドも認められなかったことから、ＡＴＦが抗ＨＩＶ活性を有することが上記により強く示唆された。そこで本発明らは、以下に述べるように、ヒト尿由来ウロキナーゼ原体からＡＴＦを得、その抗ＨＩＶ活性を評価した。
【００６４】
日本ケミカルリサーチ株式会社西神工場で製造したヒト尿由来ウロキナーゼ原体（JUN-9604）4.5ｍＬ（約50000単位のウロキナーゼを含有）を、0.1％のCHAPSと100ｍＭの塩化ナトリウムを含む10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.4）で平衡化したHiPrep Sephacryl S-100カラム(16ｍｍ×60ｃｍ)に添加した。同緩衝液144ｍＬで溶出し、2.5ｍＬずつ分取した。活性は、濃度１％で測定した。
【００６５】
分析の結果、上記ウロキナーゼ原体には、ＨＭＷ−ｕＰＡ、ＬＭＷ−ｕＰＡ及びＡＴＦが、およそ９：１：１の割合で含まれていることが判明した。HiPrep Sephacryl S-100カラムを通して得られた画分において、ＡＴＦのみを含む画分（No. 27〜No. 33）に強い抗ＨＩＶ活性（p17放出抑制）が確認された（図９及び１０を参照）。このことは、クローン＃62培養上清から精製された可溶性ＨＩＶ増殖抑制因子についての前記試験から予測された通り、ＡＴＦが抗ＨＩＶ活性を有することを示している。
【００６６】
ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性に加えて、ＨＭＷ−ｕＰＡを含有する画分（No. 15〜No. 18）にも、ＡＴＦに比して弱いながらも、やはり抗ＨＩＶ活性（p17）があることが見出された（図９及び１０を参照）。
【００６７】
＜共存培養系におけるＡＴＦの抗ＨＩＶ活性測定結果＞
精製したＡＴＦは、Ｔ細胞株及びマクロファージ株の何れの共存培養系においても、濃度依存的に培養上清中のp17量を抑制し、濃度1.5ｎｇ／ｍＬでの抑制率は約40％であった（図１１、１２）。また、ＡＴＦの添加によっても培養細胞の増殖率は対照に比して変化しなかった（図１１、１２）ことから、ＡＴＦが細胞の増殖に影響せず毒性のないことも判明した。これらのことは、ＡＴＦが示す抗ＨＩＶ活性が細胞毒性によるものでないこと、ＡＴＦが非常に低濃度で抗ＨＩＶ活性を表すこと、及び該抗ＨＩＶ活性がＴ細胞指向性及びマクロファージ指向性の何れのＨＩＶに対しても実質的に同等の強さであることを示している。
【００６８】
＜非感染細胞培養におけるSEAPレポーターアッセイ結果＞
図１３及び１４を参照。MC141及びCL35の単独培養でのSEAPレポーターアッセイでは、ＡＴＦは、何れの細胞についても培養上清中のアルカリホスファターゼ量に影響を及ぼさなかった（図１３及び１４）。このことは、ＡＴＦが、ＨＩＶ−ＬＴＲからの転写やそれに続く翻訳の段階でＨＩＶの増殖を抑制しているのではないことを示している。またこの条件でも、ＡＴＦは細胞の増殖率に影響を及ぼさなかった（図１３及び１４）。
【００６９】
＜感染性ＨＩＶ−ＤＮＡ一過性トランスフェクションアッセイ結果＞
図１５を参照。感染性ＨＩＶ−ＤＮＡ（pNL4-3）により一過性トランスフェクションしたMC141細胞を用いたアッセイにおいても、1.5ｎｇ／ｍＬのＡＴＦは、培養上清中へのＨＩＶのp17の放出を約60％抑制した。しかしながら、SEAP発現量、すなわちＬＴＲ転写活性には影響しなかった。また細胞の増殖率にも影響を及ぼさなかった。
ＬＴＲからの転写量がＡＴＦによって影響を受けなかった一方でp17の放出が抑制されたことは、ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性が、ＨＩＶ−ＬＴＲからの転写、ＨＩＶ tatによる転写の増強、又はそれに続く翻訳の何れの段階の抑制によるものでもないことを示すと共に、翻訳より後の段階すなわちＨＩＶ粒子形成又はその出芽の段階の抑制によるものであることを示唆している。
【００７０】
＜持続感染細胞単独培養アッセイ結果＞
図１６を参照。持続感染細胞（U1）の単独培養において培養上清中へのウイルス抗原p17の放出量は、ＡＴＦ 1.5ｎｇ／ｍＬで約50％抑制された。しかしながら、細胞内のp17量に対してはＡＴＦは影響を及ぼさなかった。また、ＡＴＦは細胞の増殖率に影響を及ぼさなかった。
U1細胞はＨＩＶの重複感染を起こさないことが知られていることから、U1細胞の単独培養において検出される抗ＨＩＶ活性は、プロウイルスＤＮＡの転写以降の段階に対するものに限定される。従って、U1細胞単独培養でＡＴＦがウイルス粒子（p17）放出を抑制したことは、ＡＴＦがＨＩＶのプロウイルスＤＮＡの転写以降の段階を抑制していることを示している。一方、ＡＴＦは、細胞内のp17量にも影響を及ぼしていないことから、ＨＩＶのプロウイルスＤＮＡの転写からＨＩＶｍＲＮＡの翻訳までの段階を抑制するものでもないこと明らかである。この持続感染細胞単独培養アッセイと同じ結果は、前記一過性トランスフェクションアッセイによっても得られており、これらのことは、ＡＴＦが、ＨＩＶｍＲＮＡの翻訳よりも後の段階、すなわちウイルス粒子の形成からウイルス粒子の出芽に至る段階を抑制するものであることを強く示唆している。
【００７１】
＜急性感染ＨＩＶ増殖抑制活性測定（トランスフェクションアッセイ）＞
培養開始後の日数経過に伴うウイルス量の変化を示す図１７を参照。図より、対照群では、ウイルス量は培養開始後８日〜12日の間に急激に増加することが判る。使用した緩衝液の影響は殆ど認められなかった。一方、ＡＴＦ添加群では、ウイルスの増殖速度は顕著に低下し、ウイルス増殖抑制効果は、ＡＴＦ濃度に依存的であった。更に、ウイルス増殖抑制率は培養日数の経過につれて増強され（図１８を参照）、感染から12日後の時点においては、ＡＴＦ濃度0.74ｎｇ／ｍＬで75％以上、2.22ｎｇ／ｍＬでは87％以上の抑制率が得られた。
【００７２】
＜ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性に対する抗CD87抗体の影響＞
図１９を参照。Ｔ細胞株であるT4/NL4-3細胞及びMC141細胞の共存培養系において培養上清中へのp17の放出は、ＡＴＦやＨＭＷ−ｕＰＡのレセプターであるＣＤ８７に対するモノクローナル抗体10μｇ／ｍＬとＡＴＦ 3.3ｎｇ／ｍＬの双方を含んだ培地を用いたときと、ＡＴＦ 3.3ｎｇ／ｍＬのみを含んだ培地を用いたときとで、ほぼ同程度に抑制されていた。一方、抗ＣＤ８７抗体は、それ自身抗体10μｇ／ｍＬの濃度でＡＴＦ3.3ｎｇ／ｍＬとほぼ同程度の抗ＨＩＶ活性を有していることが見出された。抗ＣＤ８７抗体とＡＴＦの何れか片方又は双方を含有する培地での培養によるp17放出抑制の程度が相互にほぼ同等であることから、ＡＴＦと抗ＣＤ８７抗体とは、細胞表面上の同一の標的分子を介して作用しているものと考えられる。一方、抗ＣＤ８７抗体の代わりに非特異的IgGを用いた培養での結果は、何らの抗体をも含有しない培養での結果と変わるところがなかった。このことは抗ＣＤ８７が示した抗ＨＩＶ活性が、該抗体の特異性に依存することを示すものである。従って細胞表面上のＣＤ８７に該抗体が特異的に結合したことによってＨＩＶ放出の抑制が引き起こされたものと考えられる。また、抗ＣＤ８７抗体を含む培地にＡＴＦを添加しても抗ＣＤ８７抗体によるＨＩＶ放出抑制効果が更に増強されなかったのは、抗ＣＤ８７抗体によりＣＤ８７が封鎖されこれにＡＴＦが結合できなくなった結果であると考えられる。更に重要なことに、抗ＣＤ８７抗体及びＡＴＦが共にＴ細胞株において抗ＨＩＶ活性（p17）を示し、その何れもがＣＤ８７と特異的に結合する物質であることから、上記の試験結果は、ＣＤ８７がそのリガンドと特異的に結合することが、細胞内の何らかのメカニズムを介して、ＨＩＶ放出（アセンブル及び出芽）を抑制する結果をもたらすものであることを示している。
【００７３】
一方、マクロファージ株であるU1及びU937の共存培養系においては（図２０を参照）、抗ＣＤ８７抗体の添加はＡＴＦの抗ＨＩＶ活性をほぼ遮断した。またこの細胞株に対しては抗ＣＤ８７抗体自身は抗ＨＩＶ活性を示さなかった。従ってこれらの結果は、Ｔ細胞株での上記の結果と異なっている。しかしながら、これは、抗ＣＤ８７抗体がマクロファージにおいては何らかの理由で抗ＨＩＶ活性を示さず、ＡＴＦと抗ＣＤ８７抗体の両方を含む培地中での細胞培養において、抗ＣＤ８７抗体が単にＣＤ８７を封鎖してＡＴＦのＣＤ８７への結合を阻止したことによるものであると考えられる。従って、ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性がこれらのマクロファージ株において抗ＣＤ８７抗体で遮断されたことは、ＡＴＦがＣＤ８７への結合を介してＨＩＶの増殖を抑制しているという上記の結論をやはり支持している。
【００７４】
ＣＤ８７とその複合体は、脂質ラフト（lipid raft）と呼ばれるスフィンゴ脂質に富む細胞表面構造上に局在しており（Koshelnic, Y. et a., Thromb. Haemost., 82(2):305-311(1999)）、一方、ＨＩＶの出芽は脂質ラフト領域で選択的に行われていることが報告されている（Nguyen, D.H. et al., J. Virol., 74(7):3264-3272(2000)）。また、ＣＤ８７と同じく脂質ラフトに局在するＴｈｙ−１は、ＨＩＶエンベロープに選択的に取り込まれることが知られている（Nguyen, D.H. et al., J. Virol., 74(7):3264-3272(2000)）。これらの報告と本発明者等の実験結果とを総合すると、ＡＴＦ等のＣＤ８７のリガンドが、ＣＤ８７を介して脂質ラフトの構成分子に作用することによってＨＩＶの出芽を抑制しているという可能性が示唆される。
【００７５】
＜製剤実施例１＞ 静脈、皮下、又は筋肉内投与用製剤
下記の処方に従って必要量の成分を混合して溶液とし、ポアサイズ0.22μｍのメンブランフィルターにより濾過滅菌して目的の製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・・・10 ｍｇ
マンニトール・・・・・・・・・・・・50 ｍｇ
蒸留水・・・・・・・・・・・・・・ 全量1ｍＬ
【００７６】
＜製剤実施例２＞ 静脈、皮下、又は筋肉内投与用製剤
下記の処方に従って必要量の基剤成分を混合して溶解し、これにＡＴＦを溶解させ、所定液量とし、ポアサイズ0.22μｍのメンブランフィルターにより濾過滅菌して目的の製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・・・・ 50 ｍｇ
塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・8.6 ｍｇ
塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・0.3 ｍｇ
塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・0.33 ｍｇ
注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・ 全量1 ｍＬ
【００７７】
＜製剤実施例３＞ 静脈、皮下、又は筋肉内投与用製剤
下記の処方に従って必要量の基剤成分を混合して溶解し、これにＡＴＦを溶解させ、所定液量とし、ポアサイズ0.22μｍのメンブランフィルターにより濾過滅菌して目的の製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・・・・・50 ｍｇ
塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・8.3 ｍｇ
塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・0.3 ｍｇ
塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・0.33 ｍｇ
リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・1.8 ｍｇ
１Ｎ塩酸・・・・・・・・・・・・・・・ 適量（ｐＨ7.4）
注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・ 全量１ｍＬ
【００７８】
＜製剤実施例４＞ 静脈、皮下、又は筋肉内投与用製剤
下記の処方に従って必要量の基剤成分を混合して溶解し、これにＡＴＦを溶解させ、所定液量とし、ポアサイズ0.22μｍのメンブランフィルターにより濾過滅菌して目的の製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・50 ｍｇ
塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.3 ｍｇ
塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3 ｍｇ
塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33 ｍｇ
グルコース・・・・・・・・・・・・・・・・・0.4 ｍｇ
リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・・・1.8 ｍｇ
１Ｎ塩酸・・・・・・・・・・・・・・・・・ 適量（ｐＨ7.4）
注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・・・ 全量１ｍＬ
【００７９】
＜製剤実施例５＞ 経肺投与用製剤
下記の処方に従い、ＡＴＦ及び乳糖を秤取し、120ｍＬの精製水に溶解させて噴霧溶液とし、常法により噴霧乾燥して経肺投与用製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・ 100 ｍｇ
乳糖（１水和物）・・・・・2900 ｍｇ
計 3000 ｍｇ
【００８０】
＜製剤実施例６＞ 経肺投与用製剤
下記の処方に従い、ＡＴＦ及びヒドロキシプロピルセルロースを秤取し、120ｍＬの精製水に溶解させて噴霧溶液とし、常法により噴霧乾燥して経肺投与用製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・ 100 ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース・・2900 ｍｇ
計・・・・・・・・・・・・・・・3000 ｍｇ
【００８１】
＜製剤実施例７＞ 経肺投与用製剤
下記の処方に従い、ＡＴＦ及び水素添加レシチンを秤取し、120ｍＬの精製水に溶解させて噴霧溶液とし、常法により噴霧乾燥して経肺投与用製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・ 100 ｍｇ
水素添加レシチン・・・・・・・・2900 ｍｇ
計・・・・・・・・・・・・・・・3000 ｍｇ
【００８２】
＜製剤実施例８＞ 経肺投与用製剤
下記の処方に従い、ＡＴＦ、ヒドロキシプロピルセルロース及びＤ−マンニトールを秤取し、90ｍＬの精製水に溶解させて噴霧溶液とし、常法により噴霧乾燥して経肺投与用製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・ 240 ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース・・ 129 ｍｇ
Ｄ−マンニトール・・・・・・・・2631 ｍｇ
計・・・・・・・・・・・・・・・3000 ｍｇ
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、ＡＩＤＳ治療手段の選択肢を広げ、現行の抗ＨＩＶ剤との併用の形でＡＩＤＳ治療の有効性を改善するのに役立つ，感染者の体内におけるＨＩＶの増殖を従来とは異なった機序で抑制する、新しいタイプの抗ＨＩＶ剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター及びＡＴＦの一次構造を示す。
【図２】pSEAP-Basicの構造を示す。
【図３】pREP7の構造を示す。
【図４】pSBRの構造を示す。
【図５】pNL4-3の構造及びＰＣＲによる増幅部位を示す。
【図６】pSBR-HIVの構造を示す。
【図７】ヒドロキシアパタイトカラムからの各溶出画分の抗ＨＩＶ活性及び該画分に対応するタンパク質濃度を示すグラフ。
【図８】ヒドロキシアパタイトカラムからの各溶出画分のSDS/PAGE泳動像を示す。
【図９】ヒト尿由来ウロキナーゼ原体のHiPrep Sephacryl S-100カラムからの各溶出画分の抗ＨＩＶ活性及び該画分に対応するタンパク質濃度を示すグラフ。
【図１０】ヒト尿由来ウロキナーゼ原体のHiPrep Sephacryl S-100カラムからの各溶出画分のSDS/PAGE泳動像を示す。
【図１１】共存培養（Ｔ細胞株）における抗ＨＩＶ活性測定（p17）の結果を示すグラフ。
【図１２】共存培養（マクロファージ株）における抗ＨＩＶ活性測定（p17）の結果を示すグラフ。
【図１３】非感染細胞培養（MC141）におけるSEAPレポーターアッセイの結果を示すグラフ。
【図１４】非感染細胞培養（CL35）におけるSEAPレポーターアッセイの結果を示すグラフ。
【図１５】感染性ＨＩＶ−ＤＮＡの一過性トランスフェクションアッセイの結果を示すグラフ。
【図１６】持続感染細胞（U1）の単独培養アッセイの結果を示すグラフ。
【図１７】急性感染後の日数経過に伴うＨＩＶ量の変化を示すグラフ。
【図１８】ＡＴＦによるウイルス増殖抑制を、感染後の各経過日数別に示すグラフ。
【図１９】Ｔ細胞株におけるＡＴＦの抗ＨＩＶ活性に対する抗CD87抗体の影響を示すグラフ。
【図２０】マクロファージ株におけるＡＴＦの抗ＨＩＶ活性に対する抗CD87抗体の影響を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＨＩＶ剤に関し、更に詳しくはＨＩＶ感染者におけるＨＩＶの増殖を抑制するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであるＨＩＶは、レトロウイルス科レンチウイルス亜科に属するＲＮＡウイルスである。ＨＩＶの感染及び増殖は以下の機構で行われる。最初にＨＩＶ粒子のエンベロープタンパク質の一つであるｇｐ120が標的細胞表面のＣＤ４に結合する。続いて、それらはコレセプターであるケモカインレセプター（主にマクロファージ表面のCCR5又はＴ細胞表面のCXCR4）と結合し、ｇｐ120、ＣＤ４及びケモカインレセプターの複合体を形成する。その後、別のエンベロープタンパク質であるｇｐ41が標的細胞の細胞膜に結合し、エンベロープと細胞膜との膜融合を引き起こし、その結果細胞内にウイルス本体が侵入する。細胞内に侵入したＨＩＶは、脱殻し、次いで自身の有する逆転写酵素の働きで、ＲＮＡゲノムから二本鎖ＤＮＡであるプロウイルスＤＮＡが合成される。プロウイルスＤＮＡは、やはりウイルス自身の有するインテグラーゼの働きにより、宿主細胞の染色体中に組み込まれる。組み込まれたプロウイルスからは、その5'末端のＬＴＲ（Long Terminal Repeat）領域をプロモーターとして、ウイルスｍＲＮＡが転写される。このｍＲＮＡには、長さの異なった幾つかのものが存在し、それらはウイルスタンパク質を合成するためのものとウイルスゲノムＲＮＡになるものに大別される。ウイルスタンパク質には、ウイルス粒子の構造タンパク質、ウイルスの増殖を促進するタンパク質等が含まれる。例えば、ウイルスタンパク質Tatは、宿主ゲノム中に組み込まれたプロウイルスの5'-ＬＴＲ領域に結合し、ウイルスＲＮＡの転写を数百倍にも増強させる働きをする。一方、ウイルス粒子の構造タンパク質は、細胞内においてウイルスゲノムＲＮＡと細胞膜近傍で会合し、それによりウイルス粒子が形成（アセンブル）される。アセンブルされたウイルス粒子は、出芽により細胞外へ放出される。このアセンブルと出芽の機構については、未だ不明な点が多い。ウイルス粒子の放出後、粒子内ではプロテアーゼが活性化し、プロセッシングが行われ、その結果、感染価を持つ成熟ウイルスが生じる。以上の過程、すなわち標的細胞表面のＣＤ４への結合から、宿主染色体ＤＮＡへの組み込み、増殖及び出芽、成熟の過程を頻繁に繰り返すことにより、ＨＩＶは急激に増殖する。ＨＩＶの増殖に伴い、宿主のＣＤ４陽性細胞が破壊される。これに対抗して宿主は、新たなＣＤ４陽性細胞を、補充のため急速に増殖させる。感染後の数年間はこの動的平衡状態が維持されるが、やがてはＣＤ４陽性細胞の補充が追い付かなくなり、免疫系全体が破綻するに至り、ＡＩＤＳの諸症状が現れる。
【０００３】
ＨＩＶ感染者の体内では、ＨＩＶを排除するために様々な免疫応答が行われている。例えば、ウイルス抗原に対する中和抗体の産生や細胞障害性Ｔ細胞による感染細胞の排除が挙げられる。それ以外に、ＣＤ８陽性細胞が産生する幾つかの液性因子が、ＨＩＶ感染者の無症候期の維持に大きな役割を果たしていることが知られている（Levy, J.A., et al., Immunol. Today, 17: 217-224(1996), Fauci, A.S., Nature, 384: 529-534(1996)）。それらの因子として、既にケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−α、１β、ＳＤＦ−１）やＩＬ−１６が同定されているが、それらのみではＣＤ８陽性細胞由来の抗ＨＩＶ活性の全てを説明できないため、未だ同定されていないＨＩＶ抑制因子の存在が示唆されている。
【０００４】
ケモカインは、標的細胞（マクロファージ及びＴ細胞）へのＨＩＶの侵入を阻害するが、その一方、マクロファージにおいてはケモカインがＨＩＶ増殖を促進することを示唆する報告もある。ＩＬ−１６はＨＩＶの転写を抑制することが知られているが、効果を発揮させるためには極めて高濃度のＩＬ−１６の使用が必要とされている。これらはＡＩＤＳ治療薬として開発されつつはあるが、実用化には至っていない。一方、未だ同定されていない抗ＨＩＶ因子の一部は、これまでのところＨＩＶの転写を抑制すると推測されているが、その本体が明らかとなっていないため、作用機序そのものについても推測の域を出ない。
【０００５】
ＨＩＶ増殖抑制能を有するとしてこれまで報告されている生体由来因子のＨＩＶ増殖抑制率についてまとめると、次の通りである。
（１）ＲＡＮＴＥＳ（分子量 7,851）： ＰＭ１細胞とＨＩＶ−１BaL株を用いた場合、0.78ｎｇ／ｍＬ（＝0.1ｎＭ）で５％、1.56ｎｇ／ｍＬ（＝0.2ｎＭ）で50％、3.12ｎｇ／ｍＬ（＝0.4ｎＭ）で90％ (Cocchi, F. et al., Science 270:p.1811-1815(1995))。
（２）ＭＩＰ−１α（分子量 7,717）： 上記ＲＡＮＴＥＳと同条件下、3.12ｎｇ／ｍＬで０％、6.25ｎｇ／ｍＬ（0.8ｎＭ）で５％、12.5ｎｇ／ｍＬ（＝1.6ｎＭ）で50％ (Cocchi, F. et al.、前掲)。
（３）ＭＩＰ−１β（分子量7,819）： 上記ＲＡＮＴＥＳと同条件下、0.78ｎｇ／ｍＬで０％、1.56ｎｇ／ｍＬ（＝0.2ｎＭで）５％、3.12ｎｇ／ｍＬ（0.4ｎＭ）で15％、6.25ｎｇ／ｍＬ（0.8ｎＭ）で60％ (Cocchi, F. et al.、前掲)。
（４）ＩＬ−１６（分子量 12,422）： 活性型４量体40〜70ｎｇ／ｍＬ（≒１ｎＭ）で61％、400〜700ｎｇ／ｍＬ（＝10ｎＭ）で76％。単量体では20μｇ／ｍＬで50％ (Baier, M. et al., Nature 378;p.563(1995), Amiel, C. et al., J. Infect. Dis.:179,p.83-91(1999))。
（５）ＭＤＣ（分子量 7,936）： 25ｎｇ／ｍＬ（＝3.15ｎＭ）で20％、50ｎｇ／ｍＬ（＝6.3ｎＭ）で50％、200ｎｇ／ｍＬ（＝25ｎＭ）で78％ (Pal, R. et al., Science 278:p.695-698(1997))。
（６）ＳＤＦ−１（分子量 8,698）： 侵入抑制率で見た場合、500ｎｇ／ｍＬ（＝57.5ｎＭ）で30％、１μｇ／ｍＬ（＝115ｎＭ）で60％、増殖抑制率で見た場合、700μｇ／ｍＬ（＝80.5ｎＭ）で80〜85％ (Oberlin, E. et al., Nature 382:p.833-835(1996))。
【０００６】
現在、ＡＩＤＳ治療薬として、逆転写酵素阻害剤（プロウイルスＤＮＡの形成を抑制する）及びプロテアーゼインヒビター（ウイルス粒子の成熟を抑制する）が実用化されるに至っている。すなわち、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤６剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤２剤、プロテアーゼインヒビター５剤が既に市販されており、このうち３つの薬剤（主に逆転写酵素阻害剤２剤プロテアーゼインヒビター１剤）を併用する三剤併用療法（HAART）が実施され、それにより血中のウイルスレベルを検出限界以下にすることが可能となった。
【０００７】
しかし、三薬剤併用療法でも、ＨＩＶを感染者の体内から完全に排除することはできない。このため、ＡＩＤＳ発症阻止のためには、ＨＩＶ感染者はそれらの薬剤を一生服用し続けなければならない。効果を現すためにはそれらの薬剤は大量に服用しなければならず、しかも各薬剤毎に服用の間隔が厳密に定められているため、規則通りの服用が困難な場合があり、コンプライアンスが悪いことが治療効果を減殺するという問題を生じている。更には、これらの薬剤は強い副作用を引き起こす場合が少なくない。
【０００８】
一方、ＨＩＶは非常に変異を起こしやすく、取り分け単一薬剤の投与では数ヶ月のうちに耐性ウイルスが出現する。また、一旦薬剤治療を開始した後にそれを中断すると、耐性ＨＩＶが急速に増殖し、たとえ治療を再開しても最早その薬では効果が得られなくなる。更には、耐性ＨＩＶは、単に何れか一薬剤に耐性であるだけでなく、作用機序を同じくする別の抗ＨＩＶ剤に対しても交差耐性を獲得することが多い。従って、ＡＩＤＳの発症の抑制及び治療のためには、耐性ＨＩＶの出現を極力回避することが必要である。そのためには、ＨＩＶのライフサイクルにおける複数の段階を同時に抑制することが重要である。このことから、現在用いられている抗ＨＩＶ剤が作用するのとは異なった段階でＨＩＶ増殖を阻害する新たな治療薬が渇望されている。この点、特に、ＣＤ８陽性細胞の産生する液性因子は、作用機序は不確かであるがＨＩＶ増殖抑制に大きな役割を果たしていることから、新たなＡＩＤＳ治療薬の候補となる可能性があるものと期待されている。
【０００９】
また、ＡＩＤＳ治療中に強い副作用や、耐性ＨＩＶが出現した場合には、使用する薬剤の変更が必要となるが、現在採り得る選択肢は極めて限られている。これらのことから、ＡＩＤＳ治療のために採り得る選択肢を広げ、且つ耐性ＨＩＶの問題を回避するために、従来のものとは作用機序の異なったタイプの抗ＨＩＶ剤が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような状況において、本発明は、既に臨床使用されたり開発されつつあるものとは作用機序の異なった、新しいタイプの抗ＨＩＶ剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、ＨＩＶ感染者より単離したＣＤ８陽性細胞をＨＴＬＶ−１を用いて不死化してクローニング化し、その培養上清中の抗ＨＩＶ活性を示す未知の因子を精製しその構造及び作用を調べた。その結果、該因子は、高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターのアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ：amino-terminal fragment）であることを見出した。該因子は、(1) 極めて微量（0.74ｎｇ／ｍＬ）で抗ＨＩＶ活性を示すこと、(2) マクロファージ指向性及びＴ細胞指向性のＨＩＶの何れに対しても有効であること、及び、(3) 該因子がＨＩＶウイルスの増殖サイクルにおいてウイルスｍＲＮＡの翻訳より後の段階すなわちウイルス粒子のアセンブル又は出芽の段階を抑制するらしいことも見出した。また、ＡＴＦは、細胞表面のＣＤ８７に特異的に結合する性質を有するが、ＡＴＦを分子末端に含みＣＤ８７のリガンドであることの既に知られている高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター（ＨＭＷ−ｕＰＡ）にも
同様に抗ＨＩＶ活性が存在することを、健常者の尿由来ウロキナーゼを用いて見出した。更には、健常者の尿由来ウロキナーゼの分解産物として得られたＡＴＦも、同様の抗ＨＩＶ活性を有することが確認された。更には、抗ＣＤ８７抗体がＡＴＦと類似の抗ＨＩＶ作用を有すること、及びＡＴＦの抗ＨＩＶ作用が抗ＣＤ８７抗体と同一の標的分子（ＣＤ８７）を介して行われることも見出した。これらの知見から、ＨＩＶ宿主細胞表面のＣＤ８７を、これと特異的に結合するＡＴＦ、ＨＭＷ−ｕＰＡやそれらの断片又は類縁体、抗ＣＤ８７抗体その他のリガンドと接触させてこれを封鎖することにより、ＨＩＶの増殖を抑制できることが判明した。
【００１２】
すなわち、本発明は、ＣＤ８７に対するリガンドを有効成分として含むことを特徴とする、抗ＨＩＶ剤を提供するものである。
【００１３】
本発明において、該リガンドは、例えば高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターであってよい。
【００１４】
また、該リガンドは、高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターの、ＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片又は類縁体であってもよい。
【００１５】
また、該リガンドは、高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターのアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ）であってもよい。
【００１６】
また、該リガンドは、ＡＴＦの、ＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片又は類縁体であってもよい。
【００１７】
また、該リガンドは、抗ＣＤ８７抗体（モノクローナル又はポリクローナル）であってもよい。
【００１８】
更にはまた、該リガンドは、抗ＣＤ８７抗体の、ＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片又は類縁体であってもよい。
【００１９】
本発明はまた、有効成分としてＡＴＦ、又はＣＤ８７に特異的な結合性を有するＡＴＦの断片若しくは類縁体を含有することを特徴とする、医薬組成物をも提供する。
【００２０】
本発明はまた、ＣＤ８７に被検物質を接触させ、ＣＤ８７に特異的に結合する物質を選択することを特徴とする、抗ＨＩＶ薬のスクリーニング方法をも提供する。
【００２１】
本発明はまた、ＣＤ８７に被検物質を接触させてＣＤ８７に特異的に結合する被検物質を選択するステップと、選択された物質に抗ＨＩＶ活性の存することを確認するステップと、抗ＨＩＶ活性の存することの確認された該物質を抗ＨＩＶ薬としてヒトへの投与のために製剤化するステップとを含んでなる、抗ＨＩＶ剤の製造方法をも提供する。
【００２２】
本発明はまた、持続的ＨＩＶ感染細胞と非感染細胞の共存培養系を用意するステップと、該共存培養系に既知濃度の被験物質を加えて共存培養を行うステップと、該共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量を測定するステップと、測定されたＨＩＶ粒子量を、被検物質を加えずに行ったとき共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量と比較するステップと、該比較に基づき、ＨＩＶ粒子の放出を抑制した被検物質を抗ＨＩＶ薬として選択するステップを含むことを特徴とする、抗ＨＩＶ薬のスクリーニング方法をも提供する。
【００２３】
本発明は更に、持続的ＨＩＶ感染細胞と非感染細胞の共存培養系を用意するステップと、該共存培養系に既知濃度の被験物質を加えて共存培養を行うステップと、該共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量を測定するステップと、測定されたＨＩＶ粒子量を、被検物質を加えずに行ったとき共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量と比較するステップと、該比較に基づき、ＨＩＶ粒子の放出を抑制した被検物質を抗ＨＩＶ薬として選択するステップと、該抗ＨＩＶ薬をヒトへの投与のために製剤化するステップとを含む、抗ＨＩＶ剤の製造方法をも提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、感染者の体内におけるＨＩＶの増殖を従来とは異なった機序で抑制する、新しいタイプの抗ＨＩＶ剤を提供し、それにより発症予防及び発症後の治療を含めたＡＩＤＳ治療手段の選択肢を広げ、現行の抗ＨＩＶ剤との併用の形でＡＩＤＳ治療の有効性を改善するのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
ＣＤ抗原の一つであるＣＤ８７は、細胞内ドメインを持たないＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカー型のファミリーに属する膜タンパク質であり、Ｔ細胞及び単球（マクロファージを含む）等の細胞表面に発現されている。このタンパク質は、プロウロキナーゼ及び高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターに対して高い親和性を有し、Ｔ細胞及び単球等の細胞表面でそれらのレセプターとして働いていることが知られている。ヒトＣＤ８７は、先ずアミノ酸１〜335よりなるプレプロ体として合成された後、シグナルペプチド部分（アミノ酸１〜22）が切除され、更にそのカルボキシル末端領域アミノ酸306〜335）がプロセシングにより切除されることによって生じた新たなカルボキシル末端（305 Gly）に糖脂質（GPI）の付加修飾を受け、そのGPIを介して細胞膜に固定される。ＣＤ８７においてリガンドであるプロウロキナーゼ及び高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターとの結合に主たる役割を演じているのは、そのＮ−末端ドメイン１（ＣＤ８７のアミノ酸１〜92）である（関他、生化学、71(5):350-352(1999)）。
【００２６】
本発明において、「ＣＤ８７に対するリガンド」とは、ＣＤ８７に対して特異的な結合性を有する物質を意味し、プロウロキナーゼ、高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター、ＡＴＦ、抗ＣＤ８７抗体やそれらの断片又は類縁体であってＣＤ８７に対し特異的な結合性を有するポリペプチド／タンパク質が代表的なものとして挙げられるが、これらに限定されず、ＣＤ８７に対し特異的に結合する能力を有し且つ生体に投与可能な他の如何なる物質をも包含する。
【００２７】
またＨＩＶは、サブタイプとしてはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２とに区別できるが、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２は共に出芽により宿主細胞から放出されるタイプのウイルスであり、相互に遺伝子的に殆ど異ならず、それらの生活環も同一で、同じメカニズムで増殖するため、抗ＨＩＶ剤との関係では区別する必要がなく、実際、既存の抗ＨＩＶ剤では通常区別されていない。本明細書においても、単に「ＨＩＶ」というときは、「ＨＩＶ−１」及び「ＨＩＶ−２」を包含する。
【００２８】
高分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター（ＨＭＷ−ｕＰＡ）（図１(b)、アミノ酸21〜178＋アミノ酸179〜431）は、一本鎖のタンパク質プレプロウロキナーゼ（ｓｃ−ｕＰＡ）（図１(a)、アミノ酸１〜431）が、そのＮ末端のシグナルペプチド（アミノ酸１〜20）を失ってプロウロキナーゼとなった後、アミノ酸178とアミノ酸179との間で酵素（プラスミン、カリクレイン、カテプシンＢ等）による開裂を受け、ジスルフィド結合によって連結された長Ａ鎖とＢ鎖とに分かれることによって生じた二本鎖のタンパク質である。ＨＭＷ−ｕＰＡは、各１つのＥＧＦ様ドメインと、クリングルドメイン及びウロキナーゼレセプター（ＣＤ８７）結合ドメインを含んでいる。
【００２９】
ＨＭＷ−ｕＰＡは更に、アミノ酸155とアミノ酸156との間で生体内で切断され、低分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター（ＬＭＷ−ｕＰＡ）（図１(c)、アミノ酸156〜178及びアミノ酸179〜431）及びプラスミノーゲンアクティベーター活性を有しないアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ）（図１(d)、アミノ酸21〜155）を生じる。また、アミノ酸155とアミノ酸156との間の切断は、例えばｐＨ８のリン酸緩衝液中でのインキュベーションによっても生じるため、ＡＴＦの製造は、ＨＭＷ−ｕＰＡを緩衝液で単にインキュベート（25〜37℃）することによりＡＴＦを製造することができる。ＡＴＦは、ＨＭＷ−ｕＰＡが有するＥＧＦ様ドメイン、クリングルドメイン及びウロキナーゼレセプター（ＣＤ８７）結合ドメインをそのまま含んでいる。ｓｃ−ｕＰＡをコードするヌクレオチド配列及びｓｃ−ｕＰＡのアミノ酸配列を配列表の配列番号１及び２にそれぞれ示す。配列番号１又は２に示した各配列おいて、アミノ酸１〜20がシグナルペプチドを、アミノ酸21〜431がプロウロキナーゼを、アミノ酸21〜431（アミノ酸178とアミノ酸179との間で開裂）がＨＭＷ−ｕＰＡを、アミノ酸21〜155がＡＴＦを、アミノ酸156〜431（アミノ酸178とアミノ酸179との間で開裂）がＬＭＷ−ｕＰＡを、それぞれ表す。
【００３０】
ヒトからヒトへのＨＩＶ伝播は、マクロファージ指向性のＨＩＶによって引き起こされる。感染後、時間の経過と共に、感染者の体内でＴ細胞指向性のＨＩＶが出現してくるが、これは予後不良因子と考えられている。ＣＤ８７はＴ細胞上にもマクロファージ上にも共通に存在しており、ＡＴＦは、ＨＩＶに感染したＴ細胞及びマクロファージの何れに対しても、細胞からのＨＩＶ放出を抑制することによりＨＩＶ増殖抑制効果を現す。このことは、ＡＴＦが感染後の時期の如何に関わりなく抗ＨＩＶ剤として効果を有することを意味する。また、ＡＴＦは極めて微量（0.74ｎｇ／ｍＬ）で効果を発揮する。従ってヒトへの投与量も従来の抗ＨＩＶ剤より少ない量で済ませることができ、投与に伴う患者の身体に対する負担も相対的に軽くすることができる。ＡＴＦをそのＮ末端に含んでいるＨＭＷ−ｕＰＡも、ＡＴＦより幾分弱いものの、抗ＨＩＶ活性を有しており、ＡＴＦと同様に使用できる。感染者に投与されたＨＭＷ−ｕＰＡは、それ自身としてのみならず、体内で切断されてＡＴＦとしても抗ＨＩＶ活性を現すと予測される。また抗ＣＤ８７抗体は、ＨＩＶ感染Ｔ細胞に対してＨＩＶ増殖抑制作用を有するため、感染後Ｔ細胞指向性のＨＩＶが出現た段階においてＨＩＶ増殖を抑制するのに有用である。
【００３１】
後述の試験結果は、本発明の抗ＨＩＶ剤の一有効成分であるＡＴＦが、ウイルスの増殖サイクルにおいて、ウイルスｍＲＮＡの翻訳よりも後の段階、すなわちウイルス粒子の形成（アセンブル）又は出芽の段階において抑制作用を表すということを示しており、これは、これまで知られている抗ＨＩＶ剤の作用機序とは異なる。またＡＴＦは宿主細胞の増殖にも悪影響を与えないことから、細胞毒性も認められない。従ってこれを既存の抗ＨＩＶ剤と併用することにより、感染者の体内でのＨＩＶの増殖における動的平衡状態を感染者側に有利に導くと共に、耐性ウイルスや副作用の問題の回避を容易にする、より優れたＡＩＤＳ治療が可能となる。
【００３２】
＜天然及び組換えＡＴＦ＞
本発明において、ＡＴＦは、例えば健常人尿ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターから得ることができる（Stoppelli, P.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: p. 4939-4943 (1985)を参照）。例えば、ＨＭＷ−ｕＰＡを、0.2Ｍの塩化ナトリウムを含有する50ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中で約８時間又はそれ以上にわたってインキュベートし、反応産物をゲル濾過（例えば、Sephadex G-100を使用）に掛け、溶出液のＵＶ吸収曲線に現れる最後のピーク（ピーク３：ＡＴＦ）に対応する画分を先行のピーク１（ＨＭＷ−ｕＰＡ）及びピーク２（ＬＭＷ−ｕＰＡ）に対応する画分から分離することにより得ることができる。更なる精製は、ＡＴＦを含む画分をイオン交換クロマトグラフィー（例えば、50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ4.8、塩化ナトリウム勾配０〜1.0Ｍ、Mono S HR5/5カラム）に掛けることにより行うことができる。
【００３３】
ＡＴＦはまた、ＡＴＦをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、これにより適当な宿主（例えば、大腸菌、酵母及び哺乳類細胞）を形質転換することにより組換えペプチドとして製造することができる。ＡＴＦは糖鎖構造を有しないことから、天然のＡＴＦをコードするｃＤＮＡを用いて作成した形質転換体が産生する組換えＡＴＦは、天然のＡＴＦと同一構造であり、従って、天然のＡＴＦと同等の活性を有することとなる。また、また、ＡＴＦやＨＭＷ−ｕＰＡの断片又は類縁体でＣＤ８７に対し特異的な結合能力を有するペプチドは、例えばＡＴＦやＨＭＷ−ｕＰＡの部分的修飾、例えば末端アミノ酸残基の削除又は末端へのアミノ酸残基付加、化学的性質の類似したアミノ酸による置換等により行うことができる。それらの操作は化学的に行ってもよいが、ＡＴＦやウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーターをコードするｃＤＮＡに対して、周知の何れかの手段を用いて変異を導入することによって行うのが極めて容易である。
【００３４】
＜リガンドのスクリーニング方法＞
ＣＤ８７に被検物質を接触させ、ＣＤ８７に特異的に結合する物質を選択することを特徴とする本発明の抗ＨＩＶ薬のスクリーニング方法は、ＣＤ８７を表面上に有する細胞（Ｔ細胞株、マクロファージ細胞株）を用いて行うことができる。また、ＣＤ８７への被検物質の特異的結合の検出は、レセプター分子へのリガンドの特異的結合の検出のために当業者に知られた種々の手段をＣＤ８７に適用することによって、任意の方法で適宜行うことができる。例えば、被検物質を組み換え技術を用いて作成したＣＤ８７と混和し、インキュイベートした後に、抗ＣＤ８７抗体で免疫沈澱させ、共沈される物質の有無により、特異的な結合を確認することができる。
【００３５】
また、本発明の別のスクリーニング方法である、持続的ＨＩＶ感染細胞と非感染細胞の共存培養系を用意するステップと、該共存培養系に既知濃度の被験物質を加えて共存培養を行うステップと、該共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量を測定するステップと、測定されたＨＩＶ粒子量を、被検物質を加えずに行ったとき共存培養の上清中に放出されるＨＩＶ粒子量と比較するステップと、該比較に基づき、ＨＩＶ粒子の放出を抑制した被検物質を抗ＨＩＶ薬として選択するステップを含むことを特徴とする、抗ＨＩＶ薬のスクリーニング方法は、例えば後述の実施例を参照して行うことができる。使用する細胞及び培養上清中のＨＩＶ粒子量の測定方法の選択においては実施例に拘束される必要はなく、目的に適う材料及び方法を当業者は適宜選択できる。
【００３６】
本発明の抗ＨＩＶ剤は、注射、埋込み等の非経口的方法で、又は、経鼻、経肺等の方法でＨＩＶ感染者に投与することができる。本発明の抗ＨＩＶ剤を注射剤の形態とする場合、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内及び皮下注射用剤とすることができる。注射のためには、本発明の抗ＨＩＶ剤は、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液及び乳濁液の形態をとってよい。水性の媒質としては、水又は、薬剤学的に許容し得る不活性な溶質例えば塩類、多糖類若しくは多価アルコール等を含有した水溶液が挙げられ、それらはまた、薬剤学的に許容し得る緩衝剤により所定のｐＨ範囲に緩衝されていてよい。そのような水性媒質の例としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖液、乳酸リンゲル液等が挙げられるが、それらに限定されない。また、製剤の貯蔵安定性を高めるためには、製剤を凍結乾燥粉末とすることができる。
【００３７】
注射用の製剤のための非水性の媒質としては、グリセロールやプロピレングリコール等の多価アルコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油、ダイズ油、ナタネ油等）、及びオレイン酸エチル等のような有機エステルその他、非経口投与のために通常用いられる非水性の媒質を適宜用いることができる。
【００３８】
本発明の抗ＨＩＶ剤を埋込み用の製剤とする場合、ＡＴＦ等のＣＤ８７のリガンドの持続的な放出を可能にする徐放性担体を適宜用いることができる。そのような担体の使用は、リガンドの投与頻度の減少及び／又は投与量の低下、取扱の容易さ、及びより大きな又はより長期間の効果をもたらすため好ましい。そのような担体の例としては、リポソーム、マイクロスフェア、又は天然又は合成のポリマーよりなるマイクロカプセルその他が挙げられるが、それらに限定されない。また殆どの環境において持続的な遅延された放出のために適した担体の例として、ゼラチン、アラビアゴム、キサンタンポリマー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸／グリコール酸コポリマー等が挙げられる。
【００３９】
経鼻投与及び経肺投与（吸入）は、投薬に伴う患者の負担を軽減するのに特に有効な投与経路である。経鼻投与及び経肺投与（吸入）のためには、本発明の抗ＨＩＶ剤は、溶液、粉末その他、微細な粒子として噴霧及び吸入するのに適した製剤形態とすればよい。そのような製剤の例としては、ＡＴＦ等のＣＤ８７のリガンドと担体との混合物とからなる直径10μｍ以下の乾燥粉末が挙げられる。担体としては、例えばブドウ糖、果糖その他の単糖類、乳糖、麦芽糖、ショ糖その他二糖類、デンプン、セルロース、ヒアルロン酸、キチン、キトサンその他の多糖類、ソルビトール、マンニトールその他の糖アルコール等、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体やポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールその他の有機結合剤、非イオン界面活性剤、ゼラチン、カゼインその他のタンパク質、ポリエチレングリコール等の合成ポリマー等を用いることができる。また、経鼻投与及び経肺投与のための製剤の別の例としては、乾燥ＡＴＦ等のＣＤ８７のリガンドの粉末を弗化炭素プロペラント中に懸濁させたものが挙げられる。
【００４０】
本発明において抗ＨＩＶ剤の有効成分の感染者体重あたり投与量は、ＡＴＦの場合１０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、ＨＭＷ−ｕＰＡの場合１０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、抗ＣＤ８７抗体の場合１０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日程度が適当である。
【実施例】
【００４１】
以下実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されることは意図しない。
ＡＴＦの精製、同定、並びにＡＴＦ、ＨＭＷ−ｕＰＡ及び抗ＣＤ８７抗体の抗ＨＩＶ活性測定に用いた材料及び方法を以下に述べる。
【００４２】
＜材料＞
１）プラスミド
(i) pNL4-3： NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, catalog No. 114として寄託されているものを入手して用いた（図５を参照）。これはＨＩＶ−１感染者のゲノムより単離されたＴ細胞指向性ＨＩＶ−１プロウイルスゲノムＤＮＡをプラスミドベクターpUC18に組み込んだものであり（Adachi, A. et al., J. Virol., 59(2):284-291(1986)）、これで細胞をトランスフェクトスフェクトすることにより、細胞に感染性ＨＩＶ−１ウイルスを産生させることができる。
(ii) pSBR-HIV： pSEAP-Basic（CLONTECH, Palo Alto, CA, USA）を基本骨格として、レポーター遺伝子である分泌型アルカリフォスファターゼ(SEAP)遺伝子の上流に、プロモーターとしてpNL4-3のＬＴＲ領域を組み込み、更にハイグロマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして導入したもの。
このプラスミドは、次の工程により製造した。すなわち：
(a) pSEAP-Basic（図２）（CLONTECH）をNotIとSalIで消化し、SEAP遺伝子を含む領域（図２中、円弧で示した領域）を取り出し、NotI部位をT4ポリメラーゼで平滑化した。
(b) 別に、pREP7（図３）（INVITROGEN, 9704CH, Groningen, the Netherlands）をSalIとClaIで消化し、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Hygromycin）とColE1とアンピシリン耐性遺伝子(Amp)を含む領域（図３中、円弧で示した領域）を取り出し、ClaI部位をT4ポリメラーゼで平滑化した。
(c) 上記(a)及び(b)で得られたプラスミド断片をライゲーションすることにより、pSBR（図４）を構築した。
(d) pNL4-3から、XhoI部位又はHindIII部位を付加したプライマーを用いてＰＣＲ法によりHIV-LTRを増幅し（図５）、増幅産物をXhoI及びHindIIIで消化した。
(e) 上記(c)で得たpSBRをXhoI及びHindIIIで消化し、これに、上記(d)で得られたHIV-LTRを挿入してpSBR-HIV（図６）を構築した。
なお、pSBR-HIVは、HIV-LTRをプロモーターとして持ちレポーター遺伝子（実施例ではSEAP）を発現するプラスミドの一例として構築したものであり、HIV-LTRをプロモーターとして持ち適宜のレポーター遺伝子を発現する、任意のプラスミドを構築して同様に使用してもよい。
【００４３】
２）細胞
(i) HUT.78： NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, catalog No. 89として寄託されているものを用いた。これは慢性皮膚性リンパ腫セザリー症候群患者の末梢血から確立されたＣＤ４陽性Ｔ細胞株である。この細胞は、10％FCS（ウシ胎仔血清）を含むRPMI1640培地（Gibco/BRL）で培養した。
(ii) U937： ATCC（American Type Culture Collection）に catalog No. CRL-1593.2として、及び国立衛生試験所細胞バンクにJCRB, catalog No. 9021として寄託されているものを用いた。これは組織球性リンパ腫患者の腹水から確立されたＣＤ４陽性単芽球株である。この細胞は、10％FCSを含むRPMI1640培地で培養した。
(iii) TALL-1： 国立衛生試験所細胞バンクにJCRB catalog No. 0086として寄託されているものを入手した。これは急性リンパ性白血病患者の末梢血から確立されたＣＤ４陽性Ｔ細胞株である。この細胞は、10％FCSを含むRPMI1640培地で培養した。
(iv) T4/NL4-3： TALL-1にpNL4-3をトランスフェクトすることにより作成した。これは持続的ＨＩＶ−１感染細胞である。この細胞は、10％FCS及び５μＭ ＡＺＴを含むRPMI1640培地で培養した。
(v) U1： NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, catalog No. 165として寄託されているものを入手した。これはU937にＨＩＶ−１感染者末梢血由来ＨＩＶ−１臨床株を感染させ樹立されたマクロファージ指向性ＨＩＶ−１持続感染株である（Chen, B.K., et al., J. Virol., 68(2):654-660(1994)）。この細胞は、10％FCS及び５μＭ ＡＺＴを含むRPMI1640培地で培養した。
(vi) MC141： HUT.78細胞にpSBR-HIVをトランスフェクトすることによりHIV-LTR-SEAPレポーター遺伝子を導入することにより作成した。これは安定的SEAP発現トランスフェクト体である。この細胞は、10％FCS及びハイグロマイシン300μｇ／ｍＬを含むRPMI1640培地で培養した。
(vii) CL-35： U937にpSBR-HIVをトランスフェクトすることによりHIV-LTR-SEAPレポーター遺伝子を導入して得た安定的SEAP発現トランスフェクト体である。この細胞は、10％FCS及びハイグロマイシン300μｇ／ｍＬを含むRPMI1640培地で培養した。
(viii) クローン＃62： 日本人長期無症候ＨＩＶ−１感染者末梢血由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ８抗体でコートした磁性ビーズを用いた正の選択により単離し、これにMT-2 HTLV-1産生Ｔ細胞株（1000 ｒａｄ照射）の同数を接触させることにより感染させて不死化し、１ヶ月間培養の後、限界希釈法によりクローニングして得た。このクローンの培養上清は強いSHIF（可溶性ＨＩＶ増殖抑制因子）活性を示す。この細胞は、15％FCS、ＩＬ−２ 10単位／ｍＬ、10％PBMC（ヒト末梢血由来単核球）条件培養液を含む、RPMI1640培地で継代した。
(ix) ・PBMC：献血由来バフィーコートよりFicoll-Paque（Amersham Pharmacia）を用いて精製した。これは、３μｇ／ｍＬのPHA、１単位／ｍＬのＩＬ−２及び10％FCSを含むRPMI1640培地で３日間培養した後、PHAを含まない同じ培地に交換して更に６日間培養したものを、条件培養液として使用した。
【００４４】
＜ＣＤ８陽性クローン培養上清の調製＞
RPMI1640培地で継代維持しているクローン＃62を、５％FCS及び10単位／ｍＬのＩＬ−２を含むPM1000培地（栄研化学）に培地交換し、３〜４日間培養した。1/2量の培養上清を回収し、細胞には等量の培地を新たに加えて連続的に培養を続けた。回収した培養上清は、0.22μｍのフィルターに通して沈殿物を除き、-80℃で保存した。
【００４５】
＜抗ＨＩＶ活性測定＞
１） 共存培養アッセイ：
共存培養アッセイにおいては、ＨＩＶ持続感染細胞株と非感染細胞株との混合培養が行われる。それにより、非感染細胞へのウイルス吸着、感染、感染細胞内でのウイルス増殖及びウイルス粒子放出の全ての段階からなるウイルスのライフサイクルを含んだ試験系が得られる。このため、共存培養において、細胞外に放出されるウイルス量を測定し、被検物質の添加の有無で放出ウイルス量を比較することにより、ウイルスのライフサイクル中の何れかの段階に対する被検物質の抗ウイルス活性を検出することができる。また、ＨＩＶ持続感染細胞株と非感染細胞株の組み合わせとして、Ｔ細胞株同志の組み合わせ（HUT.78及びT4/NL4-3）並びにマクロファージ株同志の組み合わせ（U1及びU937）を用いることにより、Ｔ細胞指向性ＨＩＶ及びマクロファージ指向性ＨＩＶの各々に対し、被検物質の抗ＨＩＶ活性を評価することができる。
試験操作： 48穴プレートにPM1000培地で希釈したサンプル300μＬと６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び20％FCSを含むRPMI1640培地100μＬを加えておき、そこにOPTI-MEM I 培地で２×105個／ｍＬに調製したHUT.78細胞100μＬと、RPMI1640培地で５×104個／ｍＬに懸濁したT4/NL4-3細胞100μＬを加え（感染T4/NL4-3：未感染HUT.78＝１：４）、３日間培養した。３日後、培養上清の1/2量を同濃度のサンプルを含む新鮮な培地と交換し、更に３日間培養した。培養６日後の培養上清を回収し、培養上清中のウイルス量（p17）とHIV-LTR転写量（SEAP）を測定した。測定には、HIVp17抗原ELISAキット（栄研化学）及び、SEAP レポーター・ジーン・アッセイ化学ルミネセント（ROCHE）を、添付の説明書に従って使用した。６日間培養した細胞には、50μＬのMTSアッセイ試薬(水溶性テトラゾリウム塩)（PROMEGA）を加え、更に４時間培養後、発色をＯＤ490ｎｍで測定し、その時点での生細胞数とした。
同様の方法で、U1（持続感染株）及びU937（非感染株）の共存培養系（U1：U937＝１：４）についても試験を行った。
【００４６】
２） 持続感染細胞単独培養アッセイ：
ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性がＨＩＶのライフサイクルのどの段階を抑制することによるものかについての知見を得るため、持続感染細胞であるU1細胞の単独培養におけるＡＴＦの抗ＨＩＶ活性の有無を検討した。U1細胞はＨＩＶの重複感染を起こさないことが知られていることから、U1細胞の単独培養において抗ＨＩＶ活性が認められた場合、それはＨＩＶプロウイルスＤＮＡの転写ないしそれ以降の段階に対してＡＴＦが作用したことを示す証拠となる。
試験操作： 48穴プレートにPM1000培地で希釈したサンプル300μＬと、６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び15％FCSを含むRPMI1640培地200μＬを加えておき、そこにOPTI-MEM I 培地で２×105個／ｍＬに調製した持続感染細胞（U1）100μＬを加え、３日間培養した。３日後、培養上清の1/2量を同濃度のサンプルを含む新鮮な培地と交換し、更に３日間培養した。培養６日後の培養上清を回収し、培養上清中のウイルス量（p17）を測定した。
【００４７】
３） 感染性ＨＩＶ−ＤＮＡ一過性トランスフェクション：
感染性ＨＩＶ―ＤＮＡをリポソームを用いて強制的に細胞内に導入することにより、ウイルスＤＮＡの核への移行の段階までを強制的に行わせることができる。この系を用いることにより、宿主細胞へのＨＩＶ侵入段階より後のＨＩＶライフサイクルに対する被検物質の抑制作用の有無を検討することができる。
試験操作： 感染性ＨＩＶ−１ ＤＮＡ（pNL4-3）４μｇとDMRIE-C試薬（GIBCO／BRL）10μＬを混和し、２×106個のMC141細胞にトランスフェクトした。24時間後、細胞を回収し、OPTI-MEM I 培地で２×105個／ｍＬに調製した。48穴プレートにPM1000培地で希釈したサンプル300μＬと、６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び15％FCSを含むRPMI1640培地200μＬを加えておき、そこにトランスフェクトしたMC141細胞（２×105／ｍＬ）を100μＬ加え、３日間培養した。３日後、培養上清の1/2量を同濃度のサンプルを含む新鮮な培地と交換し、更に４日間培養した。トランスフェクトから８日後、培養上清を回収し、培養上清中のウイルス量（p17）とHIV-LTR転写量（SEAP）を測定した。
【００４８】
４） 非感染細胞におけるSEAPレポーターアッセイ：
HIV-LTR-SEAPレポーター遺伝子を導入したＨＩＶ非感染細胞（MC141細胞及びCL35細胞）において、TNFα刺激は、ＨＩＶのプロモーターＬＴＲを活性化させその下流に組み込まれた分泌型アルカリフォスファターゼ（SEAP）遺伝子を発現させる。従ってこれらの細胞は、ＨＩＶのライフサイクルの各段階のうち、ＨＩＶプロウイルス転写の段階に対して被検物質が阻害活性を有するか否かを、実際のＨＩＶ増殖を伴うことなく調べるのために用いられる。ＨＩＶ−LTRの転写活性の強さの測定は、培養上清中のSEAPを定量することにより行われる。
試験操作： 96穴プレートに、血清を含まないPM1000培地で希釈したサンプル50μＬと、６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び20％FCSを含むRPMI1640培地25μＬを加えておき、そこにOPTI-MEM I 培地（GIBCO/BRL）で２×105／ｍＬに調整したMC141細胞又はCL35細胞25μＬを播いた。細胞をＡＴＦ添加又は無添加の下にぞれぞれ培養し、培養６日後の培養上清を回収し、そこに含まれるSEAP量を、SEAP レポーター・ジーン・アッセイ化学ルミネセント（ROCHE）を用いて測定した。
【００４９】
５）急性感染ＨＩＶ増殖抑制活性測定（トランスフェクションアッセイ）：
感染性ＨＩＶ−１ ＤＮＡ（pNL4-3）４μｇとDMRIE-C試薬（GIBCO／BRL）10μＬを混和し２×106個のHUT.78細胞にトランスフェクトした。24時間後、細胞を回収し、OPTI-MEM I 培地で洗浄後、２×105個／ｍＬに調製した。48穴プレートに、段階希釈したサンプル又は緩衝液を含むPM1000培地300μＬと、６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び15％FCSを含むRPMI1640培地200μＬを加えておき、そこにトランスフェクトしたHUT.78細胞（２×105個／ｍＬ）を100μＬ加え、４日間培養した。４日後、培地の1/2量を回収し、同濃度のサンプル又は緩衝液を含む新鮮な培地と交換した。以後、４日毎にサンプリングと1/2量の培地交換とを行い、感染から12日後まで培養した。
アッセイはｎ＝２で行い、各培養上清中のウイルス量は、HIVp17抗原ELISAキット（栄研化学）を用いて測定した。
【００５０】
６）ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性に対する抗CD87抗体の影響の検討：
ＡＴＦ及びＨＭＷ−ｕＰＡは細胞表面状のＣＤ８７に特異的に結合することが知られていることから。ＡＴＦ及びＨＭＷ−ｕＰＡの何れにも認められた抗ＨＩＶ活性は、ＣＤ８７への結合を介したものであると推定された。これを確認するため、抗ＣＤ８７抗体がＡＴＦの抗ＨＩＶ活性を遮断し得るか否かを検討した。
試験操作： 48穴プレートにPM1000培地で希釈した抗CD87モノクローナル抗体（＃3936：AMERICAN DIAGNOSTICA INC.）300μＬと、６ｎｇ／ｍＬのTNFα及び20％FCSを含むRPMI1640培地100μＬを加えておき、そこにOPTI-MEM I 培地で２×105個／ｍＬに調製したMC141細胞100μＬと、RPMI1640培地で５×104個／ｍＬに懸濁したT4/NL4-3細胞100μＬを加え、２時間培養した（抗体の最終濃度は10μｇ／ｍＬ）。２時間後、ＡＴＦを含むサンプル12μＬ（ＡＴＦの最終濃度は約3.3ｎｇ／ｍＬ）を加えた。３日間培養した後、培養上清の1/2量を同濃度の抗体及びサンプルを含む新鮮な培地と交換し、更に３日間培養した。培養６日後の培養上清を回収し、培養上清中のウイルス量（p17）を測定した。また、対照として、抗体及びＡＴＦの一方又は双方を含まない培地、及び抗ＣＤ８７抗体の代わりに非特異的なＩｇＧを添加した培地を用いた培養を、同様の手順で行った。
同様の方法で、感染U1：未感染CL35＝１：４の共存培養系についても試験を行った。
【００５１】
＜抗ＨＩＶ活性因子の調製＞
以下の精製操作は、特に断らない限り、全て４℃にて行った。
１） 先ず、培養上清に１Ｎ塩酸を加えｐＨ2.5に調整し、４℃にて24時間処理した。この処理により、潜在的なウイルス感染のリスクを排除するとともに、多量に含まれるインターフェロンγを失活させた。次いで、１Ｎ水酸化ナトリウムを加えｐＨ3.8に調整した。ｐＨ処理を行った培養上清500ｍＬを、50ｍＭの塩化ナトリウムを含有する25ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ3.8）で平衡化したSPセファロースHigh Performance（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（26ｍｍ×10ｃｍ）に添加した。同緩衝液175ｍＬで洗った後、50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液175ｍＬで溶出し（Ｅ１）、更に250ｍＭの塩化ナトリウムを含有する50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液175ｍＬで溶出した（Ｅ２）。各画分につき、NAP-5カラムで緩衝液交換した後、濃度50％で抗ＨＩＶ活性を測定した。
【００５２】
２） 活性は、SPセファロースHigh PerformanceカラムのＥ２画分に回収された。２ロット分のＥ２画分（１Ｌの培養上清に相当）に塩化ナトリウムを加え最終濃度500ｍＭに調製した。これを、500ｍＭの塩化ナトリウムを含有する50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液で平衡化したBlue Sepharose 6FF（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（26ｍｍ×10ｃｍ）に添加した。同緩衝液175ｍＬで洗った後、1.8Ｍの塩化ナトリウムと0.1％のCHAPSを含有する50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液200ｍＬで溶出した（Ｅ１）。NAP-5カラムで緩衝液交換を行った後、濃度33％で抗ＨＩＶ活性を測定した。
【００５３】
３） 活性は、Blue Sepharose 6FF のＥ１画分に回収された。これを1.8Ｍの塩化ナトリウムと0.1％のCHAPSを含有する50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液で平衡化したHiPreP Butyl 4FF（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（16ｍｍ×10ｃｍ）に添加した（Ｐ）。同緩衝液50ｍＬで洗った後（Ｗ）、100ｍＬの0.1％CHAPS／水で溶出した（Ｅ）。NAP-5カラムで緩衝液交換を行った後、濃度33％で抗ＨＩＶ活性を測定した。
【００５４】
４） 活性はButyl Sepharoseの非吸着画分（Ｐ及びＷ）に回収された。３ロット分の非吸着画分（３Ｌの培養上清に相当）に塩化ナトリウムを加えて最終濃度２Ｍに調整した。これを、２Ｍの塩化ナトリウムと0.1％のCHAPSを含有する50ｍＭ HEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液で平衡化したHiPrep Phenyl（HighSub）6FF （AMERSHAM PHARMACIA）カラム（16ｍｍ×10ｃｍ）に添加した。同緩衝液175ｍＬで洗った後、250ｍＭの塩化ナトリウムと0.1％のCHAPSを含有する50ｍＭのHEPES／NaOH（ｐＨ7.4）緩衝液150ｍＬで溶出し（Ｅ１）、更に0.1％CHAPS／水の100ｍＬで溶出した（Ｅ２）。NAP-5カラムで緩衝液交換を行った後、濃度25％で抗ＨＩＶ活性を測定した。
【００５５】
５） 活性はＥ１画分に回収された。これを、0.1％のCHAPSを含有する10ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ7.3）緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイト（CHT-2、20μｍ； BioRad）カラム（10ｍｍ×10ｃｍ）に添加した。同緩衝液50ｍＬで洗った後（Ｗ）、0.1％のCHAPSを含有する200ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ7.3）で溶出した（Ｅ200）。NAP-5カラムで緩衝液交換を行った後、濃度25％で抗ＨＩＶ活性を測定した。
【００５６】
６） 活性はヒドロキシアパタイトの非吸着画分（Ｐ）に回収された。これをCentriPlus-10（分子量10,000カット）限外濾過膜（AMICON MILLIPORE）を用いて約40倍に濃縮した。濃縮した活性画分（3.75ｍＬ）を、0.1％のCHAPSと５％のグリセロールを含有する10ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ6.4）緩衝液で平衡化したHiPrep Sephacryl S-100 HR（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（16ｍｍ×60ｃｍ）に添加した。同緩衝液144ｍＬで溶出し、2.5ｍＬずつ分取した。NAP-5カラムで緩衝液交換を行った後、濃度12.5％で抗ＨＩＶを測定した。
【００５７】
７） 活性を有する画分を回収し、0.1％のCHAPSを含有する10ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ6.4）緩衝液で２倍希釈した後、同緩衝液で平衡化したResource S（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（0.64×３ｃｍ）に添加した。同緩衝液10ｍＬで洗った後、0.1％のCHAPSを含有する10ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ6.4）緩衝液を用い、０から500ｍＭまでの塩化ナトリウムグラジエントで溶出し（全25ｍＬ）、１ｍＬずつ分取した。抗ＨＩＶ活性は濃度2.5％で測定した。
【００５８】
８） 活性を有する画分を回収し、３ロット分のResource S活性画分（９Ｌの培養上清に相当）を、0.1％のCHAPSを含有する10ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ6.35）緩衝液で2.5倍に希釈した後、同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイト（CHT-2、20μｍ； BioRad）カラム（0.5×５ｃｍ）に添加した。同緩衝液５ｍＬで洗った後、0.1％のCHAPSを含有する、10ｍＭから400ｍＭまでのリン酸カリウム（ｐＨ6.35）のグラジエントで溶出し（全25ｍＬ）、0.5ｍＬずつ分取した。抗ＨＩＶ活性は濃度１％で測定した。各画分について抗ウイルス活性の測定は、ＨＩＶ持続感染株と非感染株の１：４の割合の共存培養系で培養上清中に放出されるp17抗原を指標とするELISAにより行った。
アッセイ時のサンプル濃度が５％以上になる場合は、血清を含まないPM1000培地で平衡化したNAP-5カラム（AMERSHAM PHARMACIA）を用いてサンプルを同培地に緩衝液交換し、クロマトグラフィーから持ち込まれる過剰の塩等が影響しないようにした。サンプル濃度が５％以下になる場合は、サンプルを直接添加する一方、クロマトグラフィーの際にブランクランを行い、その各画分を対照とすることで持ち込まれる塩の影響を排除した。
結果を図７及び８に示す。図７において、黒四角は測定した画分の抗ウイルス活性を、破線は溶出液のＵＶ吸収曲線を、そして右上がりの直線は、各画分に対応するリン酸カリウム濃度を、それぞれ示す。図８は、画分No.８〜No. 19についてのSDS/PAGE（還元性条件）泳動像を示す。図７と図８とから分かるように、p17放出の抑制でみた抗ＨＩＶ活性画分に対応して分子量約18ｋＤａのバンドが確認された。
【００５９】
９） 活性を有する画分を回収し、Centricon-10（分子量10,000カット）限外濾過膜（MILLIPORE）を用いて15倍に濃縮した。２ロット分の濃縮したヒドロキシアパタイト活性画分（18Ｌの培養上清に相当）に最終濃度0.2％のトリフルオロ酢酸（TFA）を加え、0.2％トリフルオロ酢酸／水で平衡化したResource RPC（AMERSHAM PHARMACIA）カラム（0.64×３ｃｍ）に添加した。同緩衝液５ｍＬで洗った後、0.2％TFA、30％アセトニトリルまで５ｍＬ、0.2％TFA、50％アセトニトリルまで15ｍＬ、0.2％TFA、100％アセトニトリルまで５ｍＬのグラジエントで溶出し、0.5ｍＬずつ分取した。この逆相カラムクロマトグラフィーのに10℃にて行った。抗ＨＩＶ活性は濃度0.2％で測定した。その結果、このResource RPCカラムからの溶出液においても、抗ＨＩＶ活性を示す画分に対応して18ｋＤａのバンドがSDS/PAGEにより確認された。
【００６０】
活性な画分を回収して減圧乾燥し、約0.9μｇ（500 pmol）の18ｋＤａタンパク質を得た。活性測定用には、これを、0.5％BSAと0.1％CHAPSを含むリン酸緩衝液（PBS）に溶解した。また配列決定用には、SDS/PAGEサンプル緩衝液に溶解した。
【００６１】
＜アミノ酸配列決定＞
上記で精製された18ｋＤａタンパク質サンプルをSDS/PAGEに供し、クマジー・ブリリアント・ブルー（CBB）染色後、バンドを切り出した。切り出したゲル片を直接トリプシン消化し、ペプチドマッピングを行った。また得られたピークのうち３つのアミノ酸配列をシーケンサーにより決定した。その結果、次の内部配列の存在が確認された。
・配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列（断片１）。
・配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列（断片２）。
・配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列（断片３）。
【００６２】
これら断片１、２及び３のアミノ酸配列は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター（ｕＰＡ）のアミノ末端断片（Amino Terminal Fragment（ＡＴＦ）又はLong A chainと呼ばれる）の配列と一致した。ペプチドマッピング及びアミノ酸配列決定結果より、上記で精製されたタンパク質がＡＴＦであることが判明した。
【００６３】
＜ウロキナーゼ原体からのＡＴＦの精製＞
活性画分には一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター、ＨＭＷ−ｕＰＡ、ＬＭＷ−ｕＰＡの何れに対応するバンドも認められなかったことから、ＡＴＦが抗ＨＩＶ活性を有することが上記により強く示唆された。そこで本発明らは、以下に述べるように、ヒト尿由来ウロキナーゼ原体からＡＴＦを得、その抗ＨＩＶ活性を評価した。
【００６４】
日本ケミカルリサーチ株式会社西神工場で製造したヒト尿由来ウロキナーゼ原体（JUN-9604）4.5ｍＬ（約50000単位のウロキナーゼを含有）を、0.1％のCHAPSと100ｍＭの塩化ナトリウムを含む10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.4）で平衡化したHiPrep Sephacryl S-100カラム(16ｍｍ×60ｃｍ)に添加した。同緩衝液144ｍＬで溶出し、2.5ｍＬずつ分取した。活性は、濃度１％で測定した。
【００６５】
分析の結果、上記ウロキナーゼ原体には、ＨＭＷ−ｕＰＡ、ＬＭＷ−ｕＰＡ及びＡＴＦが、およそ９：１：１の割合で含まれていることが判明した。HiPrep Sephacryl S-100カラムを通して得られた画分において、ＡＴＦのみを含む画分（No. 27〜No. 33）に強い抗ＨＩＶ活性（p17放出抑制）が確認された（図９及び１０を参照）。このことは、クローン＃62培養上清から精製された可溶性ＨＩＶ増殖抑制因子についての前記試験から予測された通り、ＡＴＦが抗ＨＩＶ活性を有することを示している。
【００６６】
ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性に加えて、ＨＭＷ−ｕＰＡを含有する画分（No. 15〜No. 18）にも、ＡＴＦに比して弱いながらも、やはり抗ＨＩＶ活性（p17）があることが見出された（図９及び１０を参照）。
【００６７】
＜共存培養系におけるＡＴＦの抗ＨＩＶ活性測定結果＞
精製したＡＴＦは、Ｔ細胞株及びマクロファージ株の何れの共存培養系においても、濃度依存的に培養上清中のp17量を抑制し、濃度1.5ｎｇ／ｍＬでの抑制率は約40％であった（図１１、１２）。また、ＡＴＦの添加によっても培養細胞の増殖率は対照に比して変化しなかった（図１１、１２）ことから、ＡＴＦが細胞の増殖に影響せず毒性のないことも判明した。これらのことは、ＡＴＦが示す抗ＨＩＶ活性が細胞毒性によるものでないこと、ＡＴＦが非常に低濃度で抗ＨＩＶ活性を表すこと、及び該抗ＨＩＶ活性がＴ細胞指向性及びマクロファージ指向性の何れのＨＩＶに対しても実質的に同等の強さであることを示している。
【００６８】
＜非感染細胞培養におけるSEAPレポーターアッセイ結果＞
図１３及び１４を参照。MC141及びCL35の単独培養でのSEAPレポーターアッセイでは、ＡＴＦは、何れの細胞についても培養上清中のアルカリホスファターゼ量に影響を及ぼさなかった（図１３及び１４）。このことは、ＡＴＦが、ＨＩＶ−ＬＴＲからの転写やそれに続く翻訳の段階でＨＩＶの増殖を抑制しているのではないことを示している。またこの条件でも、ＡＴＦは細胞の増殖率に影響を及ぼさなかった（図１３及び１４）。
【００６９】
＜感染性ＨＩＶ−ＤＮＡ一過性トランスフェクションアッセイ結果＞
図１５を参照。感染性ＨＩＶ−ＤＮＡ（pNL4-3）により一過性トランスフェクションしたMC141細胞を用いたアッセイにおいても、1.5ｎｇ／ｍＬのＡＴＦは、培養上清中へのＨＩＶのp17の放出を約60％抑制した。しかしながら、SEAP発現量、すなわちＬＴＲ転写活性には影響しなかった。また細胞の増殖率にも影響を及ぼさなかった。
ＬＴＲからの転写量がＡＴＦによって影響を受けなかった一方でp17の放出が抑制されたことは、ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性が、ＨＩＶ−ＬＴＲからの転写、ＨＩＶ tatによる転写の増強、又はそれに続く翻訳の何れの段階の抑制によるものでもないことを示すと共に、翻訳より後の段階すなわちＨＩＶ粒子形成又はその出芽の段階の抑制によるものであることを示唆している。
【００７０】
＜持続感染細胞単独培養アッセイ結果＞
図１６を参照。持続感染細胞（U1）の単独培養において培養上清中へのウイルス抗原p17の放出量は、ＡＴＦ 1.5ｎｇ／ｍＬで約50％抑制された。しかしながら、細胞内のp17量に対してはＡＴＦは影響を及ぼさなかった。また、ＡＴＦは細胞の増殖率に影響を及ぼさなかった。
U1細胞はＨＩＶの重複感染を起こさないことが知られていることから、U1細胞の単独培養において検出される抗ＨＩＶ活性は、プロウイルスＤＮＡの転写以降の段階に対するものに限定される。従って、U1細胞単独培養でＡＴＦがウイルス粒子（p17）放出を抑制したことは、ＡＴＦがＨＩＶのプロウイルスＤＮＡの転写以降の段階を抑制していることを示している。一方、ＡＴＦは、細胞内のp17量にも影響を及ぼしていないことから、ＨＩＶのプロウイルスＤＮＡの転写からＨＩＶｍＲＮＡの翻訳までの段階を抑制するものでもないこと明らかである。この持続感染細胞単独培養アッセイと同じ結果は、前記一過性トランスフェクションアッセイによっても得られており、これらのことは、ＡＴＦが、ＨＩＶｍＲＮＡの翻訳よりも後の段階、すなわちウイルス粒子の形成からウイルス粒子の出芽に至る段階を抑制するものであることを強く示唆している。
【００７１】
＜急性感染ＨＩＶ増殖抑制活性測定（トランスフェクションアッセイ）＞
培養開始後の日数経過に伴うウイルス量の変化を示す図１７を参照。図より、対照群では、ウイルス量は培養開始後８日〜12日の間に急激に増加することが判る。使用した緩衝液の影響は殆ど認められなかった。一方、ＡＴＦ添加群では、ウイルスの増殖速度は顕著に低下し、ウイルス増殖抑制効果は、ＡＴＦ濃度に依存的であった。更に、ウイルス増殖抑制率は培養日数の経過につれて増強され（図１８を参照）、感染から12日後の時点においては、ＡＴＦ濃度0.74ｎｇ／ｍＬで75％以上、2.22ｎｇ／ｍＬでは87％以上の抑制率が得られた。
【００７２】
＜ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性に対する抗CD87抗体の影響＞
図１９を参照。Ｔ細胞株であるT4/NL4-3細胞及びMC141細胞の共存培養系において培養上清中へのp17の放出は、ＡＴＦやＨＭＷ−ｕＰＡのレセプターであるＣＤ８７に対するモノクローナル抗体10μｇ／ｍＬとＡＴＦ 3.3ｎｇ／ｍＬの双方を含んだ培地を用いたときと、ＡＴＦ 3.3ｎｇ／ｍＬのみを含んだ培地を用いたときとで、ほぼ同程度に抑制されていた。一方、抗ＣＤ８７抗体は、それ自身抗体10μｇ／ｍＬの濃度でＡＴＦ3.3ｎｇ／ｍＬとほぼ同程度の抗ＨＩＶ活性を有していることが見出された。抗ＣＤ８７抗体とＡＴＦの何れか片方又は双方を含有する培地での培養によるp17放出抑制の程度が相互にほぼ同等であることから、ＡＴＦと抗ＣＤ８７抗体とは、細胞表面上の同一の標的分子を介して作用しているものと考えられる。一方、抗ＣＤ８７抗体の代わりに非特異的IgGを用いた培養での結果は、何らの抗体をも含有しない培養での結果と変わるところがなかった。このことは抗ＣＤ８７が示した抗ＨＩＶ活性が、該抗体の特異性に依存することを示すものである。従って細胞表面上のＣＤ８７に該抗体が特異的に結合したことによってＨＩＶ放出の抑制が引き起こされたものと考えられる。また、抗ＣＤ８７抗体を含む培地にＡＴＦを添加しても抗ＣＤ８７抗体によるＨＩＶ放出抑制効果が更に増強されなかったのは、抗ＣＤ８７抗体によりＣＤ８７が封鎖されこれにＡＴＦが結合できなくなった結果であると考えられる。更に重要なことに、抗ＣＤ８７抗体及びＡＴＦが共にＴ細胞株において抗ＨＩＶ活性（p17）を示し、その何れもがＣＤ８７と特異的に結合する物質であることから、上記の試験結果は、ＣＤ８７がそのリガンドと特異的に結合することが、細胞内の何らかのメカニズムを介して、ＨＩＶ放出（アセンブル及び出芽）を抑制する結果をもたらすものであることを示している。
【００７３】
一方、マクロファージ株であるU1及びU937の共存培養系においては（図２０を参照）、抗ＣＤ８７抗体の添加はＡＴＦの抗ＨＩＶ活性をほぼ遮断した。またこの細胞株に対しては抗ＣＤ８７抗体自身は抗ＨＩＶ活性を示さなかった。従ってこれらの結果は、Ｔ細胞株での上記の結果と異なっている。しかしながら、これは、抗ＣＤ８７抗体がマクロファージにおいては何らかの理由で抗ＨＩＶ活性を示さず、ＡＴＦと抗ＣＤ８７抗体の両方を含む培地中での細胞培養において、抗ＣＤ８７抗体が単にＣＤ８７を封鎖してＡＴＦのＣＤ８７への結合を阻止したことによるものであると考えられる。従って、ＡＴＦの抗ＨＩＶ活性がこれらのマクロファージ株において抗ＣＤ８７抗体で遮断されたことは、ＡＴＦがＣＤ８７への結合を介してＨＩＶの増殖を抑制しているという上記の結論をやはり支持している。
【００７４】
ＣＤ８７とその複合体は、脂質ラフト（lipid raft）と呼ばれるスフィンゴ脂質に富む細胞表面構造上に局在しており（Koshelnic, Y. et a., Thromb. Haemost., 82(2):305-311(1999)）、一方、ＨＩＶの出芽は脂質ラフト領域で選択的に行われていることが報告されている（Nguyen, D.H. et al., J. Virol., 74(7):3264-3272(2000)）。また、ＣＤ８７と同じく脂質ラフトに局在するＴｈｙ−１は、ＨＩＶエンベロープに選択的に取り込まれることが知られている（Nguyen, D.H. et al., J. Virol., 74(7):3264-3272(2000)）。これらの報告と本発明者等の実験結果とを総合すると、ＡＴＦ等のＣＤ８７のリガンドが、ＣＤ８７を介して脂質ラフトの構成分子に作用することによってＨＩＶの出芽を抑制しているという可能性が示唆される。
【００７５】
＜製剤実施例１＞ 静脈、皮下、又は筋肉内投与用製剤
下記の処方に従って必要量の成分を混合して溶液とし、ポアサイズ0.22μｍのメンブランフィルターにより濾過滅菌して目的の製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・・・10 ｍｇ
マンニトール・・・・・・・・・・・・50 ｍｇ
蒸留水・・・・・・・・・・・・・・ 全量1ｍＬ
【００７６】
＜製剤実施例２＞ 静脈、皮下、又は筋肉内投与用製剤
下記の処方に従って必要量の基剤成分を混合して溶解し、これにＡＴＦを溶解させ、所定液量とし、ポアサイズ0.22μｍのメンブランフィルターにより濾過滅菌して目的の製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・・・・ 50 ｍｇ
塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・8.6 ｍｇ
塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・0.3 ｍｇ
塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・0.33 ｍｇ
注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・ 全量1 ｍＬ
【００７７】
＜製剤実施例３＞ 静脈、皮下、又は筋肉内投与用製剤
下記の処方に従って必要量の基剤成分を混合して溶解し、これにＡＴＦを溶解させ、所定液量とし、ポアサイズ0.22μｍのメンブランフィルターにより濾過滅菌して目的の製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・・・・・50 ｍｇ
塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・8.3 ｍｇ
塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・0.3 ｍｇ
塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・0.33 ｍｇ
リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・1.8 ｍｇ
１Ｎ塩酸・・・・・・・・・・・・・・・ 適量（ｐＨ7.4）
注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・ 全量１ｍＬ
【００７８】
＜製剤実施例４＞ 静脈、皮下、又は筋肉内投与用製剤
下記の処方に従って必要量の基剤成分を混合して溶解し、これにＡＴＦを溶解させ、所定液量とし、ポアサイズ0.22μｍのメンブランフィルターにより濾過滅菌して目的の製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・50 ｍｇ
塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.3 ｍｇ
塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3 ｍｇ
塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33 ｍｇ
グルコース・・・・・・・・・・・・・・・・・0.4 ｍｇ
リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・・・1.8 ｍｇ
１Ｎ塩酸・・・・・・・・・・・・・・・・・ 適量（ｐＨ7.4）
注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・・・ 全量１ｍＬ
【００７９】
＜製剤実施例５＞ 経肺投与用製剤
下記の処方に従い、ＡＴＦ及び乳糖を秤取し、120ｍＬの精製水に溶解させて噴霧溶液とし、常法により噴霧乾燥して経肺投与用製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・ 100 ｍｇ
乳糖（１水和物）・・・・・2900 ｍｇ
計 3000 ｍｇ
【００８０】
＜製剤実施例６＞ 経肺投与用製剤
下記の処方に従い、ＡＴＦ及びヒドロキシプロピルセルロースを秤取し、120ｍＬの精製水に溶解させて噴霧溶液とし、常法により噴霧乾燥して経肺投与用製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・ 100 ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース・・2900 ｍｇ
計・・・・・・・・・・・・・・・3000 ｍｇ
【００８１】
＜製剤実施例７＞ 経肺投与用製剤
下記の処方に従い、ＡＴＦ及び水素添加レシチンを秤取し、120ｍＬの精製水に溶解させて噴霧溶液とし、常法により噴霧乾燥して経肺投与用製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・ 100 ｍｇ
水素添加レシチン・・・・・・・・2900 ｍｇ
計・・・・・・・・・・・・・・・3000 ｍｇ
【００８２】
＜製剤実施例８＞ 経肺投与用製剤
下記の処方に従い、ＡＴＦ、ヒドロキシプロピルセルロース及びＤ−マンニトールを秤取し、90ｍＬの精製水に溶解させて噴霧溶液とし、常法により噴霧乾燥して経肺投与用製剤とする。
ＡＴＦ・・・・・・・・・・・・・ 240 ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース・・ 129 ｍｇ
Ｄ−マンニトール・・・・・・・・2631 ｍｇ
計・・・・・・・・・・・・・・・3000 ｍｇ
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、ＡＩＤＳ治療手段の選択肢を広げ、現行の抗ＨＩＶ剤との併用の形でＡＩＤＳ治療の有効性を改善するのに役立つ，感染者の体内におけるＨＩＶの増殖を従来とは異なった機序で抑制する、新しいタイプの抗ＨＩＶ剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター及びＡＴＦの一次構造を示す。
【図２】pSEAP-Basicの構造を示す。
【図３】pREP7の構造を示す。
【図４】pSBRの構造を示す。
【図５】pNL4-3の構造及びＰＣＲによる増幅部位を示す。
【図６】pSBR-HIVの構造を示す。
【図７】ヒドロキシアパタイトカラムからの各溶出画分の抗ＨＩＶ活性及び該画分に対応するタンパク質濃度を示すグラフ。
【図８】ヒドロキシアパタイトカラムからの各溶出画分のSDS/PAGE泳動像を示す。
【図９】ヒト尿由来ウロキナーゼ原体のHiPrep Sephacryl S-100カラムからの各溶出画分の抗ＨＩＶ活性及び該画分に対応するタンパク質濃度を示すグラフ。
【図１０】ヒト尿由来ウロキナーゼ原体のHiPrep Sephacryl S-100カラムからの各溶出画分のSDS/PAGE泳動像を示す。
【図１１】共存培養（Ｔ細胞株）における抗ＨＩＶ活性測定（p17）の結果を示すグラフ。
【図１２】共存培養（マクロファージ株）における抗ＨＩＶ活性測定（p17）の結果を示すグラフ。
【図１３】非感染細胞培養（MC141）におけるSEAPレポーターアッセイの結果を示すグラフ。
【図１４】非感染細胞培養（CL35）におけるSEAPレポーターアッセイの結果を示すグラフ。
【図１５】感染性ＨＩＶ−ＤＮＡの一過性トランスフェクションアッセイの結果を示すグラフ。
【図１６】持続感染細胞（U1）の単独培養アッセイの結果を示すグラフ。
【図１７】急性感染後の日数経過に伴うＨＩＶ量の変化を示すグラフ。
【図１８】ＡＴＦによるウイルス増殖抑制を、感染後の各経過日数別に示すグラフ。
【図１９】Ｔ細胞株におけるＡＴＦの抗ＨＩＶ活性に対する抗CD87抗体の影響を示すグラフ。
【図２０】マクロファージ株におけるＡＴＦの抗ＨＩＶ活性に対する抗CD87抗体の影響を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ８７に対するリガンドを有効成分として含むことを特徴とする抗ＨＩＶ剤であって、該リガンドが抗ＣＤ８７抗体である、抗ＨＩＶ剤。
【請求項２】
該抗体がモノクローナル抗体である，請求項１の抗ＨＩＶ剤。
【請求項３】
ＣＤ８７に対するリガンドが抗ＣＤ８７抗体の、ＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片である、請求項１又は２の抗ＨＩＶ剤。
【請求項１】
ＣＤ８７に対するリガンドを有効成分として含むことを特徴とする抗ＨＩＶ剤であって、該リガンドが抗ＣＤ８７抗体である、抗ＨＩＶ剤。
【請求項２】
該抗体がモノクローナル抗体である，請求項１の抗ＨＩＶ剤。
【請求項３】
ＣＤ８７に対するリガンドが抗ＣＤ８７抗体の、ＣＤ８７に特異的な結合性を有する断片である、請求項１又は２の抗ＨＩＶ剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２００７−３３２１５８（Ｐ２００７−３３２１５８Ａ）
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１９０９９（Ｐ２００７−２１９０９９）
【出願日】平成１９年８月２４日（２００７．８．２４）
【分割の表示】特願２００１−１８４２８４（Ｐ２００１−１８４２８４）の分割
【原出願日】平成１３年６月１９日（２００１．６．１９）
【出願人】（０００２２８５４５）日本ケミカルリサーチ株式会社 (27)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２４日（２００７．８．２４）
【分割の表示】特願２００１−１８４２８４（Ｐ２００１−１８４２８４）の分割
【原出願日】平成１３年６月１９日（２００１．６．１９）
【出願人】（０００２２８５４５）日本ケミカルリサーチ株式会社 (27)
【Ｆターム（参考）】
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