改変バクテリオファージ
本発明は、標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするα／β低分子量酸可溶性胞子タンパク質（ＳＡＳＰ）遺伝子を含み、前記ＳＡＳＰ遺伝子が、バクテリオファージおよびＳＡＳＰ遺伝子に対して外来である構成的プロモーターの制御下にある、改変バクテリオファージを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変バクテリオファージおよび改変バクテリオファージの作製プロセスに関連する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、入院期間中に罹る感染症（院内感染症）の最も一般的な原因である（Ｎｏｓｋｉｎら、２００５年）。黄色ブドウ球菌は、肺、創傷部、皮膚および血液においてしばしば感染症を引き起こし、また、この細菌が産生し得る毒素の数のために、これらの感染症は命を脅かすことがある。
【０００３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのほとんどすべての菌株が、薬物を分解する酵素（ペニシリナーゼ）を産生することができるために、ペニシリンに対して今や耐性を有し、また、１９５９年のメチシリン（ペニシリナーゼ耐性ペニシリン）の導入の４５年後、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株が多くの病院で広がっている。より近年では、ＭＲＳＡ株は社会においても問題となっている。多くのＭＲＳＡ株が、現在では多数の抗生物質に対して耐性がある。
【０００４】
ＭＲＳＡのレベルはアメリカ合衆国および英国の両国の病院において劇的に上昇しており、加えて、新しい市中感染型ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）株が、１９９０年代後半に初めて報告されて以降、世界中で急速に蔓延している。これらのＣＡ−ＭＲＳＡ株は、非常に伝染性が強いこと、および多くの場合、これらの株の毒性を非常に強くし得る毒素であるパントン・バレンタイン型ロイコシジンをコードする一連の遺伝子を保有することが証明されている。これらのＣＡ−ＭＲＳＡ株のせいで、ＭＲＳＡ感染症を病院において抑制することがより困難になるのではないかと懸念される（Ｄｏｎｅｇａｎ、２００６年）。
【０００５】
実際、ＭＲＳＡは今や、病院における重大（かつ致命的）な問題であるので、病院におけるＭＲＳＡの蔓延を最小限に抑え、それによって感染者の数を減らす一手段として感染抑制対策を実行することにかなりの努力が注がれ続けている。特にＭＲＳＡに関しては、感染抑制対策には、様々ではあるが、医療従事者による手消毒剤の使用；感染患者および保菌患者のスクリーニング、隔離および隔離看護；ならびにＭＲＳＡを保菌する患者および医療従事者の除染が含まれる。細菌の保菌は、何らの関連する病状（例えば、炎症など）も有することなく、通常は低いレベルで細菌が存在することとして定義される。しかしながら、ＭＲＳＡ保菌者は、ＭＲＳＡのより広範囲の病院社会への蔓延についての著しい危険性を実際に生じさせており、保菌者からのＭＲＳＡの除去、特に入院時または入院前における保菌者からのＭＲＳＡの除去が、感染抑制プロセスの非常に重要な部分である。
【０００６】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（したがって、ＭＲＳＡ）の保菌は、表層の皮膚病変部においてだけでなく、鼻、腋窩、鼠蹊部および会陰部において、また、それらの周りで生じる。数多くの研究により、一般集団の２５％〜３０％がＳ．ａｕｒｅｕｓを鼻に保菌し、約１％がＭＲＳＡを保菌することが報告される。入院患者の間では、保菌率がこれより著しく高くなる。合衆国では、８９００万人がその鼻にＳ．ａｕｒｅｕｓを保菌し、そのうちの２３０万人がＭＲＳＡを保菌すると推定されている（Ｍａｉｎｏｕｓら、２００６年）。したがって、ＭＲＳＡの鼻内除去が、病院におけるこの潜在的に致死的な生物の蔓延の抑制にとって欠かせないことである。
【０００７】
従来の抗生物質に代わるものとして、広い作用スペクトルの抗菌活性を細菌の内部において示すあるタンパク質のファミリーが、α／β型の低分子量の酸可溶性胞子タンパク質（以降、ＳＡＳＰとして理解される）を含む。細菌の内部において、ＳＡＳＰは細菌ＤＮＡに結合する：極低温電子顕微鏡観察を使用したこのプロセスの可視化により、ＳｓｐＣ（最も研究されているＳＡＳＰ）がＤＮＡを覆い、突き出たドメインを形成し、ＤＮＡ構造をＢ様（３．４ｎｍのピッチ）からＡ様（３．１８ｎｍ；Ａ様ＤＮＡは２．８ｎｍのピッチを有する）へと改変させることが示されている（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉら、１９８８年；Ｆｒｅｎｋｉｅｌ−Ｋｒｉｓｐｉｎら、２００４年）。突き出たＳｓｐＣモチーフは近くのＤＮＡ−ＳｓｐＣフィラメントと相互作用し、フィラメントを核タンパク質らせんのすき間のない集合体にする。このようにして、ＤＮＡの複製が停止させられ、また、結合した場合、ＳＡＳＰはＤＮＡの転写を妨げる。ＳＡＳＰは、細菌ＤＮＡにおける変異がＳＡＳＰの結合に影響を及ぼさないように、配列非特異的な様式でＤＮＡに結合する（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９０年）。
【０００８】
特許文献１は、ＳＡＳＰ遺伝子を取り込むように改変されたバクテリオファージの抗菌剤としての使用を記載する。細菌宿主における改変バクテリオファージの効果的な産生を提供するために、特許文献１は、産生宿主の増殖期間中におけるＳＡＳＰ遺伝子の発現を回避することを目的とする。この目的を達成するために、ＳＡＳＰ遺伝子が好ましくは、バクテリオファージの生活環の最後においてのみ活性である溶菌遺伝子プロモーターの制御下にＳＡＳＰ遺伝子を置くように、バクテリオファージの溶菌遺伝子の中に挿入された。そうでない場合には、特にＳＡＳＰ遺伝子が構成的プロモーターの制御下にあったならば、ＳＡＳＰ遺伝子産物の存在のために細菌産生宿主の増殖が妨げられると考えられた。あまり好ましくないアレンジメントにおいて、ＳＡＳＰ遺伝子は、バクテリオファージ染色体のどこかほかの所に存在させ、かつ、バクテリオファージまたは細菌のプロモーターの制御下に置くことができ、それにより、溶菌サイクルそのまま残され得る。このアレンジメントでは、細菌のプロモーターは非構成的であり、環境刺激によって発現増加され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０２／４０６７８
【発明の概要】
【００１０】
今回、驚くべきことに、バクテリオファージに依存することなく制御され、かつ、外因的調節またはトランス作用の調節を必要とすることなく、あるいは、それらを有することなく構成的であるプロモーターの制御下にＳＡＳＰをコードする遺伝子を保有するようにバクテリオファージが改変されている場合、バクテリオファージの効果的な産生が達成され得ることが見出された。多数のコピー体で存在するとき、例えば、標的細胞に感染した後で、前記プロモーターは毒性レベルのＳＡＳＰ発現を行わせる。
【００１１】
したがって、第１の局面において、本発明は、標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするα／β低分子量酸可溶性胞子タンパク質（ＳＡＳＰ）遺伝子を含み、ＳＡＳＰ遺伝子が、バクテリオファージおよびＳＡＳＰ遺伝子に対して外来である構成的プロモーターの制御下にある、改変バクテリオファージを提供する。
【００１２】
第２の局面において、標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージを作製するためのプロセスが提供され、このプロセスは、このバクテリオファージをコードする遺伝物質を含む細菌宿主を成長培地において成長させる工程、このバクテリオファージを細菌宿主において複製させる工程、およびこのバクテリオファージを採取する工程を含む。
【００１３】
ＳＡＳＰ遺伝子が構成的プロモーターの制御下にある改変バクテリオファージの使用は、数多くの利点を有する。ＳＡＳＰ遺伝子の発現の制御がバクテリオファージから除かれ、それにより、ＳＡＳＰの産生がファージ遺伝子の発現に依存しなくなる。このことは、バクテリオファージがその完全な生活環を行うことができないときでさえ、ＳＡＳＰが産生されることを可能にする；これは、（バクテリオファージが、プロファージを既に保有する細菌宿主に感染する）重複感染の場合に、また、バクテリオファージＤＮＡの宿主制限の場合に起こり得る。したがって、後述するように、この戦略は、１つのファージタイプが１つの細菌種の多くの異なる菌株を阻害することを可能にする。
【００１４】
バクテリオファージは、一般に狭い宿主範囲を有する傾向があるが、ＳＡＳＰ遺伝子を構成的プロモーターの制御下に置くことにより、改変バクテリオファージの宿主範囲を広げることができる。これは、細菌がその宿主範囲を限定する重要な手段の１つが、バクテリオファージＤＮＡを、細菌細胞内に入ったときに分解することであるからである。その産生がバクテリオファージに依存しないＳＡＳＰ遺伝子を送達するためのバクテリオファージの使用は、バクテリオファージＤＮＡの死滅がＳＡＳＰの効力に影響を与え得ないことを意味する。このように、バクテリオファージは、ＳＡＳＰをコードする遺伝子を標的細菌細胞に送達することによって送達ベクターとして作用する。
【００１５】
本発明による改変バクテリオファージの産生では、バクテリオファージによって溶原化され得る細菌宿主が要求される。この溶原菌はバクテリオファージの増殖を誘導時に可能にするはずであり、その結果、採取のために十分なバクテリオファージ力価を得ることができる。本発明によれば、ＳＡＳＰは、製造プロセスによって要求される時間範囲内において、すなわち、宿主細胞が死ぬ前において十分なファージ力価の産生を妨げない。
【００１６】
本発明による好ましい取り組み方法の１つは、ＳＡＳＰ遺伝子を制御するために構成的プロモーターを使用し、その結果、改変バクテリオファージが採取されることになる宿主産生菌株を殺すのに十分なＳＡＳＰの発現がプロモーターによって促進されないようにすることである。そのようなプロモーターは、細菌のプロモーター（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のプロモーターなど）であり得る。好ましいプロモーターとしては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのプロモーターである、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分αサブユニットのためのｐｄｈＡ、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２のためのｒｐｓＢ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼのためのｐｇｉが挙げられる。これらの配列に対して９０％超の同一性を有する配列もまた、本発明に従ってプロモーターに使用することができる。特に好ましいプロモーターは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｎ３１５（アクセッション番号ＢＡＢ４３２１１）に由来する、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ遺伝子のためのプロモーター（ｆｂａＡ）、またはこの配列に対して９０％超の相同性を示す配列である。ＳＡＳＰ遺伝子を発現させるためにｆｂａＡプロモーターを使用することの利点は、このプロモーターが細菌細胞において構成的に発現すること、かつ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞内のどのような機構によっても調節を受けないと思われることである。加えて、１コピーのｆｂａＡ：：ＳＡＳＰ−Ｃエレメントは、以下に詳述するように、宿主細胞に対して致死的であるのに十分なＳＡＳＰ−Ｃを産生せず、そのため、ＰＴＳＡ１．２／Ａバクテリオファージの維持および産生を可能にする。しかしながら、標的細菌に感染したときは、（多重感染事象または標的細胞内でのファージ複製に由来する）多数コピーのｆｂａＡプロモーターは、標的の生存性を失わせるようにＳＡＳＰ−Ｃの十分な発現を行わせる。
【００１７】
したがって、バクテリオファージ構築物においてＳＡＳＰの上流側で使用されるために好適であるプロモーター（例えば、ｆｂａＡプロモーターなど）は、２つの特徴的な性質を有する；そのようなプロモーターは、宿主細菌の成長期間中にバクテリオファージの宿主を殺すほど十分には強くない；そのようなプロモーターは、十分なファージ力価の産生を、製造プロセスによって要求される時間範囲内において、すなわち、宿主細胞が死ぬ前において妨げない。しかしながら、そのようなプロモーターは、多数コピーで存在するとき、すなわち、多数コピーのＳＡＳＰ遺伝子が標的細胞に送達された後において、または、標的細胞におけるファージ複製に起因して、毒性レベルのＳＡＳＰの産生を行わせるようにするには十分に強い。そのような活性を有するプロモーターの選択を、バクテリオファージ構築物をこれらの特性について分析することによって行うことができる。
【００１８】
ＳＡＳＰ遺伝子の転写、ひいては、ＳＡＳＰ遺伝子の発現を制御するプロモーターは、該プロモーターがバクテリオファージに由来せず、かつＳＡＳＰ遺伝子の本来のプロモーターでないという意味で、バクテリオファージおよびＳＡＳＰ遺伝子の両方にとって外来である。このように、ファージはＳＡＳＰ遺伝子の発現の制御に関与しない。
【００１９】
細菌宿主は、所与のバクテリオファージに好適な任意の宿主であればよい。宿主は、成熟したバクテリオファージ粒子の宿主内での増殖を行うように誘導されるとき、そのような増殖が終わるまではバクテリオファージを養わなければならない。国際公開ＷＯ０２／４０６７８は、付録４において、一般的な病原体およびそれらのファージの一部からなるリストを示す。この付録を、本出願において付録１として再利用する。ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の宿主、好ましくは黄色ブドウ球菌およびクロストリジウム・デフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は特に有用な宿主である。バクテリオファージφ１１は黄色ブドウ球菌に感染することができる。バクテリオファージφ１１について以下に詳述する。本発明によれば、このバクテリオファージを改変することができる。
【００２０】
α／β型ＳＡＳＰの配列を、好ましいα／β型ＳＡＳＰであるバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＳＡＳＰ−Ｃを含めて、国際公開ＷＯ０２／４０６７８の付録１に見出すことができる。
【００２１】
ＳＡＳＰ遺伝子を含有するように改変されたバクテリオファージベクターは、一般に、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターと名づけられている。ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターＰＴＳＡ１．２／Ａの、ＳＡＳＰ遺伝子のＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡを含む）への送達について以下に詳述する。ＳＡＳＰ遺伝子が標的細菌に送達されると、それら細菌の内部でＳＡＳＰが産生され、菌体内において、ＳＡＳＰが細菌ＤＮＡに結合し、ＤＮＡの立体配座をＢ様からＡ様へと変化させる。標的細菌細胞の内部においてＳＡＳＰが十分に産生されると、病的細胞の生存性の低下を生じさせる；したがって、ＳＡＳＰによって引き起こされる毒性は用量依存的であり、その毒性は結果として、プロモーター活性および存在するプロモーター：：ＳＡＳＰコピー体の数に依存する。
【００２２】
一般に、ＳＡＳＰ遺伝子およびそのプロモーターはバクテリオファージゲノム内のどこにでも配置することができる。しかしながら、改変バクテリオファージが非溶菌性であることが、病原性細菌を標的化するためには好ましい。これは、感染した細菌を溶解するためにファージにより要求される１つまたは複数の遺伝子の除去または不活性化によって達成することができ、最も好ましくは、溶菌遺伝子の少なくとも１つを不活性化することによって達成することができる。好ましい実施形態において、ＳＡＳＰ遺伝子は溶菌遺伝子の１つに挿入されるか、または溶菌遺伝子が毒素遺伝子で置き換えられる。感染した細菌を溶解するための遺伝子としては、バクテリオファージホリン遺伝子および／またはアミダーゼ遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子の１つまたは複数をＳＡＳＰ遺伝子によって中断または置換することができる。改変バクテリオファージにその標的細菌宿主を溶解させないようにすることにより、ＳＡＳＰの継続した発現および蓄積が、場合により、細菌宿主の溶解をこのバクテリオファージが通常の場合に生じさせる時間を超えて可能になる。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中で定義する改変バクテリオファージと、そのためのキャリアとを含む、細菌の細胞成長を阻害または予防するための組成物を提供する。そのような組成物は広範囲の様々な用途を有することができ、意図された用途に応じて処方される。そのような組成物は、特にヒトの処置のための医薬品として処方することができ、また、細菌感染症を含めて、様々な状態を処置することができる。本発明に従って処置可能なそのような感染症には、局所的な感染症、虫歯、呼吸器感染症、眼感染症、ならびに限局性の組織感染症および臓器感染症がある。キャリアは、医薬的に許容される受容体または希釈剤であり得る。そのような組成物の成分の正確な性質および量は経験的に決定することができ、部分的には組成物の投与経路に依存する。
【００２４】
被投与者に対する投与経路としては、経口、口内、舌下、経鼻、吸入、局所的（眼科的を含む）、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下および関節内が挙げられる。使用の便宜上、本発明による投与量は、治療または予防される感染の部位および種類による。呼吸器感染症を吸入投与によって処置することができ、眼感染症を、点眼薬を使用して処置することができる。改変バクテリオファージを含有する口腔衛生製品もまた提供される；歯垢形成に関連する細菌を除くために処方された本発明による改変バクテリオファージを含有する口内洗浄剤または練り歯磨きを使用することができる。
【００２５】
本発明による改変バクテリオファージは、例えば、表面の細菌汚染の処理においてだけでなく、土壌修復または水処理においても、細菌除染剤として使用することができる。バクテリオファージは、除染用薬剤として、例えば、手消毒剤における除染用薬剤として、医療関係者および／または患者の処置において使用することができる。作業表面および作業設備の処置、特に、病院での行為において、または食品調理において使用される作業表面および作業設備の処置もまた提供される。１つの具体的な実施形態は、細菌の保菌および個体から個体への汚染を予防し、排除し、または減らすための局所使用のために処方された組成物を含む。これは、従来の抗生物質に対して耐性を有する細菌が蔓延している病院環境では、特に、微生物感染症の伝染を制限するために重要である。そのような使用のために、改変バクテリオファージは、ＣａＣｌ２（１０ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１ｍＭ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水に含有され得るか、あるいは、ゲルまたはクリームに処方され得る。複数回の使用のために、保存剤を加えることができる。あるいは、製造物を凍結乾燥することができ、賦形剤、例えば、糖（例えば、スクロースなど）などを加えることができる。
【００２６】
次に、単に例として、添付の図面および下記の実施例を参照して、本発明をさらに詳しく記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ホリン遺伝子およびアミダーゼ遺伝子、ならびにこれらの遺伝子および隣接ＤＮＡを増幅するためのプライマー作用部位を示す、Ｓ．ａｕｒｅｕｓファージφ１１の領域。
【図２】クローン化された領域と、ｐＳＡ１の逆ＰＣＲのためのプライマー作用部位の存在位置とを示す、ｐＳＡ１の図。
【図３】カドミウム耐性（ＣｄＲ）遺伝子および隣接するφ１１ＤＮＡを伴うクローン化されたプロモーター−ｓａｓｐＣ領域を、関連するプライマー作用部位の存在位置と一緒に示す、ｐＳＡ４の図。
【図４】外来遺伝子によるホリン遺伝子の置換を示す、ＰＴＬ１００３のゲノムにおけるＤＮＡの配置。野生型φ１１のゲノムにおける遺伝子の配置を比較のために示す。
【図５】Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌株に対するＰＴＳＡ１．２／Ａの効力を示す殺菌曲線の一例。ＳＡＳＰｊｅｃｔ ＰＴＳＡ１．２／Ａを感染させたＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞の生存性の低下を示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株を５×１０７細胞／ｍｌの密度に成長させた。その後、培養物を分け、生成物ＰＴＳＡ１．２／Ａ（１×１０１０個）を１つのアリコートに加え、インキュベーションを続けた。サンプルを感染後３０分および１時間毎に採取して、残存する生細菌の数を数えた。
【図６】ＰＴＳＡ１．２／Ａの殺菌能を、ＳＡＳＰ遺伝子を有しない同じファージと比較する殺菌曲線。ＳＡＳＰｊｅｃｔ ＰＴＳＡ１．２／Ａ（φ１１：ホリン：：ＳＡＳＰ−Ｃ＋）を感染させたＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞とＳＡ０／Ａ（φ１１：ホリン：：ＳＡＳＰ−Ｃ）との比較を示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株を５×１０７細胞／ｍｌの密度に成長させた。その後、培養物を分け、生成物ＰＴＳＡ１．２／Ａ（１×１０１０個）を１つのアリコートに加え、ファージＳＡ０／Ａ（１×１０１０個）を１つのアリコートに加え、インキュベーションを続けた。サンプルを感染後３０分および１時間毎に採取して、残存する生細菌の数を数えた。
【図７】Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌株に感染するＰＴＳＡ１．２／Ａの殺菌曲線。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＰＴＳＡ１．２／Ａモノ溶原菌に対するＳＡＳＰｊｅｃｔ ＰＴＳＡ１．２／Ａの影響を示すグラフである。ＰＴＳＡ１．２／Ａにより溶原菌化されたＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株を５×１０７細胞／ｍｌまたは５×１０５細胞／ｍｌの密度に成長させた。密度が５×１０７細胞／ｍｌである細胞には１×１０１０個のＰＴＳＡ１．２／Ａ粒子を加え、密度が５×１０５細胞／ｍｌである細胞には１×１０９個のＰＴＳＡ１．２／Ａ粒子を加えた。サンプルを感染後３０分および１時間毎に採取して、残存する生細菌の数を数えた。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ＳＡＳＰ−Ｃをフルクトースビスリン酸アルドラーゼホモログ（ｆｂａＡ）プロモーターの制御下に保有する遺伝子改変バクテリオファージの構築の概要
遺伝子を、相同組換えを使用して除くことができ、またファージゲノムに加えることができる。外来の遺伝子およびプロモーターを保有するファージを構築することができる方法がいくつかあり、下記はそのような方法の一例である。
【００２９】
φ１１誘導体を構築するために、単に一例としてであるが、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ａｕｒｅｕｓのシャトルベクターを使用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのフルクトースビスリン酸プロモーターホモログの制御下において、ファージのホリン遺伝子がどのようにしてＳＡＳＰ−Ｃのための遺伝子により置換されているかを示す（これ以降、フルクトースビスリン酸アルドラーゼプロモーターを示すためにｆｂａＡを使用する）。重金属カドミウムに対する耐性のための遺伝子（以降、ＣｄＲという）が、非抗生物質耐性マーカーとして使用される。
【００３０】
ｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−Ｃ領域およびＣｄＲ領域が、φ１１ホリン遺伝子に隣接するφ１１ ＤＮＡの２つの領域の間にクローン化された。続いて、このプラスミドが細胞に導入され、ホリンがｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−Ｃ領域およびＣｄＲ領域により置換された二重組換え体が選択された。
【００３１】
実験手順
すべてのＰＣＲ反応が、製造者の説明書に従って、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム、およびプライマーの融解温度（Ｔｍ）に依存するストリンジェントな条件を使用して行われた。別途の記載がない限り、一般的な分子生物学的手法、例えば、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ依存性連結、コンピテント細胞の調製および形質転換などは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）に記載の方法に基づいた。ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ精製キットを使用して酵素反応液から精製し、細胞から調製した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞を、ＳｃｈｅｎｃｋおよびＬａｄａｇｇａ（１９９２年）によって記載されるような方法を使用して、エレクトロポレーションによってプラスミドＤＮＡで形質転換した。
【００３２】
プライマーを、Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓから得た。プライマーが制限酵素のための制限配列を含む場合、追加の２ヌクレオチド〜６ヌクレオチドが、増幅されたＰＣＲ ＤＮＡの消化を確実にするために５’末端に付加された。
【００３３】
すべてのクローン化が、別途の記載がない限り、各書（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）に記載されるように、ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結し、その後、ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉクローニング株（例えば、ＤＨ５ａまたはＸＬ１−Ｂｌｕｅなど）に形質転換し、選択培地での単離を行うことによって達成される。
【００３４】
Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ａｕｒｅｕｓのシャトルベクター（ｐＳＭ１９８と呼ばれる）が、遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉと、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとの間で移し替えるために使用された。プラスミドｐＳＭ１９８は、Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターｐＵＣ１８と、Ｓ．ａｕｒｅｕｓプラスミドｐＴ１８１のテトラサイクリン耐性領域および複製領域とを組み合わせることによって前もって作製された。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓにおいて選抜され得る耐性マーカーを保有する。このプラスミドはｐＵＣ１８の多重クローニング部位（ＭＣＳ）を保持しているが、必ずしもすべての部位が特異的部位として残存するわけではない。ｐＳＭ１９８のＭＣＳにおける残存する特異的部位は、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩである。
【００３５】
ｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−Ｃ／ＣｄＲによるφ１１ホリン遺伝子の標的置換のためのプラスミドの構築
１．溶菌遺伝子にまたがるφ１１の１．８ｋｂフラグメントを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋を含むプラスミドｐＳＡ１を下記のように構築した。図１は、φ１１ゲノム由来領域を増幅するための下記のオリゴヌクレオチドについてのプライマー作用部位を示す。
【００３６】
プライマーＢ１００１およびプライマーＢ１００２を使用してφ１１ＤＮＡのＰＣＲ増幅を行い、１．８ｋｂのフラグメントを得て、これを洗浄し、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩにより消化した。消化後、ＤＮＡを洗浄し、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩにより消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋にクローン化し、これにより、ｐＳＡ１を得た。
【００３７】
プライマーＢ１００１（配列番号１）は５’側のＰｓｔＩ部位（下線部）を含み、その後に、塩基３９７７９から塩基３９７９８までのφ１１の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＦ４２４７８１）が続く（図１参照）。プライマーＢ１００２（配列番号２）はＸｂａＩ部位（下線部）を含み、その後に、塩基４１５３７から塩基４１５５６までのφ１１の逆相補配列が続く（図１参照）。
Ｂ１００１（配列番号１）
5'-AACTGCAGGTGTATTGCAACAGATTGGCTC-3'
Ｂ１００２（配列番号２）
5'-GCTCTAGACTTTGCTCCCTGCGTCGTTG-3'
【００３８】
２．逆ＰＣＲを、プライマーＢ１００３（配列番号３）およびプライマーＢ１００４（配列番号４）を使用して、テンプレートとしてのｐＳＡ１に対して行った（図２参照）。
【００３９】
プライマーＢ１００３は５’側のＢａｍＨＩ部位（下線部）を含み、その後に、塩基４０４５４から塩基４０４６９までのφ１１の逆相補配列が続く（図２参照）。プライマーＢ１００４は５’側のＳｐｅＩ部位（下線部）を含み、その後に、塩基４０８９１から塩基４０９１１までのφ１１の配列が続く（図２参照）。
Ｂ１００３（配列番号３）
5'-CGGGATCCGACTAAAAATTAGTCG-3'
Ｂ１００４（配列番号４）
5'-GGACTAGTGAATGAGTATCATCATGGAGG-3'
【００４０】
このＰＣＲ反応により、φ１１のレフトアーム、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋プラスミド全体およびφ１１のライトアームから成る約４．２ｋｂのフラグメントが得られた。このフラグメントをＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩにより消化し、洗浄し、続いて、下記のフラグメントでクローン化するためにベクターとして使用した。
【００４１】
３．ｐＩ２５８由来のカドミウム耐性領域を、プライマーＢ１００５およびプライマーＢ１００６を使用してＰＣＲによって増幅し、これにより、約２．８ｋｂのフラグメントを得た。このＰＣＲ産物を洗浄し、ＢａｍＨＩおよびＸＢａＩにより消化した。消化されたＰＣＲ産物を洗浄し、（ＰＣＲ増幅され、消化された）ｐＳＡ１（上記）にクローン化し、これにより、ｐＳＡ２を作製した。
【００４２】
プライマーＢ１００５（配列番号５）は、ｐＩ２５８由来の推定されるカドミウム応答性調節タンパク質遺伝子ｃａｄＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｊ０４５５１）のためのＡＴＧから３０８ｂｐ上流側のＤＮＡに対して相補的であり、その３’末端がＡＴＧに最も近い（図３参照）。このプライマーの５’末端は、クローン化を助けるためのＢａｍＨＩ部位（下線部）を伴う非相補的なテールを有する。
【００４３】
プライマーＢ１００６（配列番号６）は、最後の３つの相補的なヌクレオチドがｃａｄＡ遺伝子の停止コドンＴＡＧに対して相補的であるように、プラスミドｐＩ２５８由来のカドミウム耐性タンパク質のためのｃａｄＡ遺伝子の３’末端においてＤＮＡに対して相補的である（図３参照）。５’末端は、クローン化を助けるための非相補的なＸｂａＩ部位（下線部）を有する。
Ｂ１００５（配列番号５）
5'-CGATGGATCCTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTC-3'
Ｂ１００６（配列番号６）
5'-GCAGACCGCGGCTATTTATCCTTCACTCTCATC-3'
【００４４】
４．φ１１のレフトアームおよびライトアームと、ＣｄＲとを含有するＤＮＡを、ＰｓｔＩおよびＳａｃＩを使用してｐＳＡ２から切り出し、ゲル精製してベクターから分離した。このフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＳａｃＩにより同様に切断されたシャトルベクターｐＳＭ１９８にクローン化した。クローンを制限フラグメントについてスクリーニングし、候補体を配列決定のために送った。正しいプラスミド構築物を確認し、ｐＳＡ３と名づけた。このプラスミドを、下記のフラグメントでクローン化するために使用した。
【００４５】
５．Ｂ１００７およびＢ１００８を使用してｆｂａＡプロモーターのＰＣＲ増幅により、約３００ｂｐのフラグメントが得られ、これを洗浄し、続いて、ＮｃｏＩにより消化し、その後、再び洗浄した。
【００４６】
ｆｂａＡのＰＣＲフラグメントをＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＳＡＳＰ−Ｃコード配列に連結した。ＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の増幅および調製を下記に記載する。
【００４７】
プライマーＢ１００７（配列番号７）は、ＢａｍＨＩ部位を含む５’側の配列テールを含み、その後には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ８３２５のゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＰ０００２５３）に由来する塩基２１８９４０４から塩基２１８９４２７までの逆向き相補部分が続く（図３参照）。
【００４８】
オリゴヌクレオチドＢ１００８（配列番号８）は、ＮｃｏＩ部位と、その後に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ８３２５のゲノムに由来する塩基２１８９２１４から塩基２１８９２３２までの配列とを含む配列テールを含む（図３参照）。ＰＣＲ産物が、このプライマーを使用して作製されるとき、遺伝子のＡＴＧにおいてプライマーに取り込まれるＮｃｏＩ部位により、ＡＴＧの２ヌクレオチド上流側の塩基の、ＴからＣへの変化が生じる。
Ｂ１００７（配列番号７）
5'-CTACGGATCCTTTATCCTCCAATCTACTTATAAA-3'
Ｂ１００８（配列番号８）
5'-CATGCCATGGAAGTTCCTCCTTGAGTGCT-3'
【００４９】
６．Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのＫＭ株（ＡＴＣＣ１３６３２）に由来するＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子をプライマーＢ１００９およびプライマーＢ１０１０によるＰＣＲによって増幅し、約３００ｂｐのフラグメントを得た。このＰＣＲ産物を洗浄し、ＮｃｏＩにより消化した。消化されたＰＣＲ産物を洗浄し、下記のように、ｆｂａＡのＰＣＲフラグメントとの連結において使用した。
【００５０】
オリゴヌクレオチドＢ１００９（配列番号９）は、ＮｃｏＩ部位を含有する５’側のテールを含み、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのＫＭ株に由来する、ＳＡＳＰ−Ｃ（寄託番号Ｋ０１８３３）のＡＴＧから始まる最初の２０ヌクレオチドに対して相補的である（図３参照）。このオリゴヌクレオチドの開始部におけるＮｃｏＩ部位はＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子のＡＴＧを取り込む。
Ｂ１００９（配列番号９）
5'-CGATCCATGGCAAATTATCAAAACGC-3'
【００５１】
オリゴヌクレオチドＢ１０１０（配列番号１０）は、ＢｇｌＩＩ部位（下線部）、およびＥｃｏＲＩ部位（二重下線部）、それに続いて、ＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の停止コドンの５９塩基下流側から始まり、停止コドンの７４塩基下流側までのＤＮＡの逆相補部分を含む。（図３参照）。
Ｂ１０１０（配列番号１０）
5'-AGTGAGATCTGAATTCGCTGATTAAAAGAAAC-3'
【００５２】
７．ｆｂａＡおよびＳＡＳＰ−ＣのＰＣＲフラグメント（これらはともに、ＮｃｏＩにより切断された）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。連結されたＤＮＡをＰＣＲのためのテンプレートとして使用して、連結されたｆｂａＡ ＤＮＡおよびＳＡＳＰ−Ｃ ＤＮＡを増幅した。ＰＣＲを、プライマーＢ１００７およびプライマーＢ１０１０を使用して行った。約５００ｂｐの主ＰＣＲ産物をゲル精製した。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩにより消化し、洗浄した。このフラグメントを、下記のように調製されたｐＳＡ３にクローン化した。プラスミドをＢａｍＨＩにより切断し、両端を、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）を使用して脱リン酸化した。ＤＮＡを再び洗浄した。
【００５３】
プラスミドをスクリーニングし、その結果、ＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の末端がφ１１の「レフトアーム」領域に隣接するようにし、かつ、ｆｂａＡプロモーターの開始部が塩化カドミウム耐性領域に隣接するようにした。ｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−Ｃを有する得られたプラスミドをｐＳＡ４と名づけた。
【００５４】
ｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−ＣおよびＣｄＲマーカーによるＳ．ａｕｒｅｕｓファージφ１１由来のホリン遺伝子の置換
１．ｐＳＡ４をＳ．ａｕｒｅｕｓのＰＴＬ４７株に形質転換した。ＰＴＬ４７はＲＮ４２２０におけるφ１１のモノ溶原菌である。
【００５５】
２．ｐＳＡ４のφ１１レフトアームと、φ１１ライトアームとの間に含有されるＤＮＡが、ファージゲノムにおけるφ１１レフトアームと、φ１１ライトアームとの間のＤＮＡ（すなわち、ホリン遺伝子）により置き換えられている二重乗換えを受けた細胞は、下記の表現型を有するコロニーを生じさせた：ＣｄＣｌ２（０．１ｍＭ）耐性、テトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）感受性。シャトルベクターｐＳＭ１９８はテトラサイクリン耐性を有する。テトラサイクリン耐性の喪失はｐＳＭ１９８の喪失を示す。ＣｄＣｌ２Ｒ、テトラサイクリンＳの表現型を有したコロニーを、コロニーＰＣＲによってさらにスクリーニングした。
【００５６】
３．ＰＣＲ反応を行って、ホリン遺伝子がもはや存在しないこと、ならびにｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子およびＣｄＣｌ２Ｒ遺伝子がφ１１プロファージゲノムに存在し、かつ正しく配置されることを調べた。ＰＣＲフラグメントを配列決定して、単離体が、特にｆｂａＡおよびＳＡＳＰ−Ｃの領域において、予想された配列を有することを確実にした。
【００５７】
確認されたプロファージ構築物をこのように特定し、代表物を選択し、ＰＴＬ１００１と名づけた。
【００５８】
４．ファージを熱ショックによってＰＴＬ１００１株の培養物から誘導し、細胞をリソスタフィン（０．２５μｇ／ｍｌ）により溶解し、その後、０．２μｍのフィルターでろ過し、これにより、粗製の無細胞ファージ溶解物を得た。
【００５９】
５．この溶解物を使用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの８３２５−４株に感染させた。感染混合物をφＶＰＢ（１０ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含有する植物ペプトン培養液）＋ＣｄＣｌ２（０．１ｍＭ）の寒天平板に置床して、溶原菌について、３７℃での一晩の成長の後で選択した。
【００６０】
６．溶原菌を、上述したコロニーＰＣＲによって調べた。確認された溶原菌を特定し、ＰＴＬ１００２と名づけた。
【００６１】
７．ＰＴＬ１００２をφＶＰＢ寒天で５回継代した。このとき、それぞれの継代で、単一コロニーを選び、単一コロニーに再び画線培養した。
【００６２】
８．単一コロニーを選び、ＰＣＲおよび配列決定によって再び分析した。確認された単離体をＰＴＬ１００３と名づけた。この溶原菌株によって保有されるファージはＰＴＳＡ１．２／Ａと呼ばれる（図４参照）。
【００６３】
ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターＰＴＳＡ１．２／Ａは、５つの認識されているｓｃｃ−ｍｅｃタイプのそれぞれに属するメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）株およびＭＲＳＡ株を含めて、Ｓ．ａｕｒｅｓｕの様々な菌株および臨床単離体のパネルに対して試験されている。１つのＳ．ａｕｒｅｕｓ株に対するＰＴＳＡ１．２／Ａの効力を示す殺菌曲線の一例を図５に示す。
【００６４】
ＰＴＳＡ１．２／Ａの殺菌能を、ＳＡＳＰ遺伝子を有しない同じファージ（ファージＳＡ０／Ａ）と比較した殺菌曲線を図６に示す。この図により、殺菌速度がＳＡＳＰの存在に起因することが確認される。
【００６５】
ＰＴＳＡ１．２／Ａのモノ溶原菌であるＳ．ａｕｒｅｕｓ株に感染するＰＴＳＡ１．２／Ａの殺菌曲線を図７に示す。この図は、このファージに対する重複感染免疫性が、ＳＡＳＰが感染細胞を阻害することを妨げないことを示す。
【００６６】
参考文献
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Ｎｏｓｋｉｎ，Ｇ．Ａ．、Ｒｕｂｉｎ，Ｒ．Ｊ．、Ｓｃｈｅｎｔａｇ，Ｊ．Ｊ．、Ｋｌｕｙｔｍａｎｓ，Ｊ．、Ｈｅｄｂｌｏｍ，Ｅ．Ｃ．、Ｓｍｕｌｄｅｒｓ，Ｍ．、Ｌａｐｅｔｉｎａ，Ｅ．およびＧｅｍｍｅｎ，Ｅ．、２００５年、合衆国における病院での黄色ブドウ球菌感染症の負担：２０００年および２００１年の全国入院サンプルデータベースの分析、Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １６５：１７５６−１７６１。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年）。
Ｓｃｈｅｎｋ，Ｓ．およびＲ．Ａ．Ｌａｄｄａｇａ、１９９２年、黄色ブドウ球菌のエレクトロポレーションのための改善された方法、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７３：１３３−１３８。
【００６７】
付録１
一般的な病原体およびそれらのファージの一部のリスト（このリストは網羅的ではなく、代表的なものである）。
大腸菌ファージ：
バクテリオファージλ
バクテリオファージ９３３Ｗ（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７）
バクテリオファージＶＴ２−Ｓａ（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７）
大腸菌ファージ１８６
大腸菌ファージＰ１
大腸菌ファージＰ２
大腸菌ファージＮ１５
バクテリオファージＴ３
バクテリオファージＴ４
バクテリオファージＴ７
バクテリオファージＫＵ１
サルモネラ菌種（Salmonella spp）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＦｅｌｉｘ
バクテリオファージＰ２２
バクテリオファージＬ
バクテリオファージ１０２
バクテリオファージ３１
バクテリオファージＦ０
バクテリオファージ１４
バクテリオファージ１６３
バクテリオファージ１７５
バクテリオファージＶｉｒ
バクテリオファージＶｉＶＩ
バクテリオファージ８
バクテリオファージ２３
バクテリオファージ２５
バクテリオファージ４６
バクテリオファージＥ１５
バクテリオファージＥ３４
バクテリオファージ９Ｂ
志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）のバクテリオファージ：
バクテリオファージφ８０
バクテリオファージＰ２
バクテリオファージ２
バクテリオファージ３７
コレラ菌（Vibrio cholerae）のバクテリオファージ：
バクテリオファージｆｓ−２
バクテリオファージ１３８
バクテリオファージ１４５
バクテリオファージ１４９
バクテリオファージ１６３
マイコプラズマ・アルスリチジス（Mycoplasma arthritidis）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＭＡＶ１
連鎖球菌属細菌のバクテリオファージ：
バクテリオファージＣＰ−１
バクテリオファージφＸｚ４０
バクテリオファージ１Ａ
バクテリオファージ１Ｂ
バクテリオファージ１２／１２
バクテリオファージ１１３
バクテリオファージ１２０
バクテリオファージ１２４
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＤ３
バクテリオファージφＣＴＸ
バクテリオファージＰＰ７
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＳ２
バクテリオファージＨＰ１
バクテリオファージｆｌｕ
バクテリオファージＭｕ
黄色ブドウ球菌のバクテリオファージ：
バクテリオファージＴｗｏｒｔ
バクテリオファージｔＩＩＩ−２９Ｓ
バクテリオファージφＰＶＬ
バクテリオファージφＰＶ８３
バクテリオファージφ１１
バクテリオファージφ１２
バクテリオファージφ１３
バクテリオファージφ４２
バクテリオファージφ８１２
バクテリオファージＫ
バクテリオファージＰ３
バクテリオファージＰ１４
バクテリオファージＵＣ１８
バクテリオファージ１５
バクテリオファージ１７
バクテリオファージ２９
バクテリオファージ４２ｄ
バクテリオファージ４７
バクテリオファージ５２
バクテリオファージ５３
バクテリオファージ７９
バクテリオファージ８０
バクテリオファージ８１
バクテリオファージ８３
バクテリオファージ８５
バクテリオファージ９３
バクテリオファージ９５
バクテリオファージ１８７
クラミジア属細菌のバクテリオファージ：
バクテリオファージφＣＰＡＲ３９
マイコバクテリオファージ：
バクテリオファージＬ５
バクテリオファージＬＧ
バクテリオファージＤ２９
バクテリオファージＲｖ１
バクテリオファージＲｖ２
バクテリオファージＤＳＧＡ
リステリア菌（Listeria monocytogenes）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＡ１１８
バクテリオファージ２４３
バクテリオファージＡ５００
バクテリオファージＡ５１１
バクテリオファージ１０
バクテリオファージ２６８５
バクテリオファージ１２０２９
バクテリオファージ５２
バクテリオファージ３２７４
肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）のバクテリオファージ：
バクテリオファージ６０
バクテリオファージ９２
ペスト菌（Yersinia pestis）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＲ
バクテリオファージＹ
バクテリオファージＰ１
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変バクテリオファージおよび改変バクテリオファージの作製プロセスに関連する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、入院期間中に罹る感染症（院内感染症）の最も一般的な原因である（Ｎｏｓｋｉｎら、２００５年）。黄色ブドウ球菌は、肺、創傷部、皮膚および血液においてしばしば感染症を引き起こし、また、この細菌が産生し得る毒素の数のために、これらの感染症は命を脅かすことがある。
【０００３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのほとんどすべての菌株が、薬物を分解する酵素（ペニシリナーゼ）を産生することができるために、ペニシリンに対して今や耐性を有し、また、１９５９年のメチシリン（ペニシリナーゼ耐性ペニシリン）の導入の４５年後、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株が多くの病院で広がっている。より近年では、ＭＲＳＡ株は社会においても問題となっている。多くのＭＲＳＡ株が、現在では多数の抗生物質に対して耐性がある。
【０００４】
ＭＲＳＡのレベルはアメリカ合衆国および英国の両国の病院において劇的に上昇しており、加えて、新しい市中感染型ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）株が、１９９０年代後半に初めて報告されて以降、世界中で急速に蔓延している。これらのＣＡ−ＭＲＳＡ株は、非常に伝染性が強いこと、および多くの場合、これらの株の毒性を非常に強くし得る毒素であるパントン・バレンタイン型ロイコシジンをコードする一連の遺伝子を保有することが証明されている。これらのＣＡ−ＭＲＳＡ株のせいで、ＭＲＳＡ感染症を病院において抑制することがより困難になるのではないかと懸念される（Ｄｏｎｅｇａｎ、２００６年）。
【０００５】
実際、ＭＲＳＡは今や、病院における重大（かつ致命的）な問題であるので、病院におけるＭＲＳＡの蔓延を最小限に抑え、それによって感染者の数を減らす一手段として感染抑制対策を実行することにかなりの努力が注がれ続けている。特にＭＲＳＡに関しては、感染抑制対策には、様々ではあるが、医療従事者による手消毒剤の使用；感染患者および保菌患者のスクリーニング、隔離および隔離看護；ならびにＭＲＳＡを保菌する患者および医療従事者の除染が含まれる。細菌の保菌は、何らの関連する病状（例えば、炎症など）も有することなく、通常は低いレベルで細菌が存在することとして定義される。しかしながら、ＭＲＳＡ保菌者は、ＭＲＳＡのより広範囲の病院社会への蔓延についての著しい危険性を実際に生じさせており、保菌者からのＭＲＳＡの除去、特に入院時または入院前における保菌者からのＭＲＳＡの除去が、感染抑制プロセスの非常に重要な部分である。
【０００６】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（したがって、ＭＲＳＡ）の保菌は、表層の皮膚病変部においてだけでなく、鼻、腋窩、鼠蹊部および会陰部において、また、それらの周りで生じる。数多くの研究により、一般集団の２５％〜３０％がＳ．ａｕｒｅｕｓを鼻に保菌し、約１％がＭＲＳＡを保菌することが報告される。入院患者の間では、保菌率がこれより著しく高くなる。合衆国では、８９００万人がその鼻にＳ．ａｕｒｅｕｓを保菌し、そのうちの２３０万人がＭＲＳＡを保菌すると推定されている（Ｍａｉｎｏｕｓら、２００６年）。したがって、ＭＲＳＡの鼻内除去が、病院におけるこの潜在的に致死的な生物の蔓延の抑制にとって欠かせないことである。
【０００７】
従来の抗生物質に代わるものとして、広い作用スペクトルの抗菌活性を細菌の内部において示すあるタンパク質のファミリーが、α／β型の低分子量の酸可溶性胞子タンパク質（以降、ＳＡＳＰとして理解される）を含む。細菌の内部において、ＳＡＳＰは細菌ＤＮＡに結合する：極低温電子顕微鏡観察を使用したこのプロセスの可視化により、ＳｓｐＣ（最も研究されているＳＡＳＰ）がＤＮＡを覆い、突き出たドメインを形成し、ＤＮＡ構造をＢ様（３．４ｎｍのピッチ）からＡ様（３．１８ｎｍ；Ａ様ＤＮＡは２．８ｎｍのピッチを有する）へと改変させることが示されている（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉら、１９８８年；Ｆｒｅｎｋｉｅｌ−Ｋｒｉｓｐｉｎら、２００４年）。突き出たＳｓｐＣモチーフは近くのＤＮＡ−ＳｓｐＣフィラメントと相互作用し、フィラメントを核タンパク質らせんのすき間のない集合体にする。このようにして、ＤＮＡの複製が停止させられ、また、結合した場合、ＳＡＳＰはＤＮＡの転写を妨げる。ＳＡＳＰは、細菌ＤＮＡにおける変異がＳＡＳＰの結合に影響を及ぼさないように、配列非特異的な様式でＤＮＡに結合する（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９０年）。
【０００８】
特許文献１は、ＳＡＳＰ遺伝子を取り込むように改変されたバクテリオファージの抗菌剤としての使用を記載する。細菌宿主における改変バクテリオファージの効果的な産生を提供するために、特許文献１は、産生宿主の増殖期間中におけるＳＡＳＰ遺伝子の発現を回避することを目的とする。この目的を達成するために、ＳＡＳＰ遺伝子が好ましくは、バクテリオファージの生活環の最後においてのみ活性である溶菌遺伝子プロモーターの制御下にＳＡＳＰ遺伝子を置くように、バクテリオファージの溶菌遺伝子の中に挿入された。そうでない場合には、特にＳＡＳＰ遺伝子が構成的プロモーターの制御下にあったならば、ＳＡＳＰ遺伝子産物の存在のために細菌産生宿主の増殖が妨げられると考えられた。あまり好ましくないアレンジメントにおいて、ＳＡＳＰ遺伝子は、バクテリオファージ染色体のどこかほかの所に存在させ、かつ、バクテリオファージまたは細菌のプロモーターの制御下に置くことができ、それにより、溶菌サイクルそのまま残され得る。このアレンジメントでは、細菌のプロモーターは非構成的であり、環境刺激によって発現増加され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０２／４０６７８
【発明の概要】
【００１０】
今回、驚くべきことに、バクテリオファージに依存することなく制御され、かつ、外因的調節またはトランス作用の調節を必要とすることなく、あるいは、それらを有することなく構成的であるプロモーターの制御下にＳＡＳＰをコードする遺伝子を保有するようにバクテリオファージが改変されている場合、バクテリオファージの効果的な産生が達成され得ることが見出された。多数のコピー体で存在するとき、例えば、標的細胞に感染した後で、前記プロモーターは毒性レベルのＳＡＳＰ発現を行わせる。
【００１１】
したがって、第１の局面において、本発明は、標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするα／β低分子量酸可溶性胞子タンパク質（ＳＡＳＰ）遺伝子を含み、ＳＡＳＰ遺伝子が、バクテリオファージおよびＳＡＳＰ遺伝子に対して外来である構成的プロモーターの制御下にある、改変バクテリオファージを提供する。
【００１２】
第２の局面において、標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージを作製するためのプロセスが提供され、このプロセスは、このバクテリオファージをコードする遺伝物質を含む細菌宿主を成長培地において成長させる工程、このバクテリオファージを細菌宿主において複製させる工程、およびこのバクテリオファージを採取する工程を含む。
【００１３】
ＳＡＳＰ遺伝子が構成的プロモーターの制御下にある改変バクテリオファージの使用は、数多くの利点を有する。ＳＡＳＰ遺伝子の発現の制御がバクテリオファージから除かれ、それにより、ＳＡＳＰの産生がファージ遺伝子の発現に依存しなくなる。このことは、バクテリオファージがその完全な生活環を行うことができないときでさえ、ＳＡＳＰが産生されることを可能にする；これは、（バクテリオファージが、プロファージを既に保有する細菌宿主に感染する）重複感染の場合に、また、バクテリオファージＤＮＡの宿主制限の場合に起こり得る。したがって、後述するように、この戦略は、１つのファージタイプが１つの細菌種の多くの異なる菌株を阻害することを可能にする。
【００１４】
バクテリオファージは、一般に狭い宿主範囲を有する傾向があるが、ＳＡＳＰ遺伝子を構成的プロモーターの制御下に置くことにより、改変バクテリオファージの宿主範囲を広げることができる。これは、細菌がその宿主範囲を限定する重要な手段の１つが、バクテリオファージＤＮＡを、細菌細胞内に入ったときに分解することであるからである。その産生がバクテリオファージに依存しないＳＡＳＰ遺伝子を送達するためのバクテリオファージの使用は、バクテリオファージＤＮＡの死滅がＳＡＳＰの効力に影響を与え得ないことを意味する。このように、バクテリオファージは、ＳＡＳＰをコードする遺伝子を標的細菌細胞に送達することによって送達ベクターとして作用する。
【００１５】
本発明による改変バクテリオファージの産生では、バクテリオファージによって溶原化され得る細菌宿主が要求される。この溶原菌はバクテリオファージの増殖を誘導時に可能にするはずであり、その結果、採取のために十分なバクテリオファージ力価を得ることができる。本発明によれば、ＳＡＳＰは、製造プロセスによって要求される時間範囲内において、すなわち、宿主細胞が死ぬ前において十分なファージ力価の産生を妨げない。
【００１６】
本発明による好ましい取り組み方法の１つは、ＳＡＳＰ遺伝子を制御するために構成的プロモーターを使用し、その結果、改変バクテリオファージが採取されることになる宿主産生菌株を殺すのに十分なＳＡＳＰの発現がプロモーターによって促進されないようにすることである。そのようなプロモーターは、細菌のプロモーター（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のプロモーターなど）であり得る。好ましいプロモーターとしては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのプロモーターである、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分αサブユニットのためのｐｄｈＡ、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２のためのｒｐｓＢ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼのためのｐｇｉが挙げられる。これらの配列に対して９０％超の同一性を有する配列もまた、本発明に従ってプロモーターに使用することができる。特に好ましいプロモーターは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｎ３１５（アクセッション番号ＢＡＢ４３２１１）に由来する、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ遺伝子のためのプロモーター（ｆｂａＡ）、またはこの配列に対して９０％超の相同性を示す配列である。ＳＡＳＰ遺伝子を発現させるためにｆｂａＡプロモーターを使用することの利点は、このプロモーターが細菌細胞において構成的に発現すること、かつ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞内のどのような機構によっても調節を受けないと思われることである。加えて、１コピーのｆｂａＡ：：ＳＡＳＰ−Ｃエレメントは、以下に詳述するように、宿主細胞に対して致死的であるのに十分なＳＡＳＰ−Ｃを産生せず、そのため、ＰＴＳＡ１．２／Ａバクテリオファージの維持および産生を可能にする。しかしながら、標的細菌に感染したときは、（多重感染事象または標的細胞内でのファージ複製に由来する）多数コピーのｆｂａＡプロモーターは、標的の生存性を失わせるようにＳＡＳＰ−Ｃの十分な発現を行わせる。
【００１７】
したがって、バクテリオファージ構築物においてＳＡＳＰの上流側で使用されるために好適であるプロモーター（例えば、ｆｂａＡプロモーターなど）は、２つの特徴的な性質を有する；そのようなプロモーターは、宿主細菌の成長期間中にバクテリオファージの宿主を殺すほど十分には強くない；そのようなプロモーターは、十分なファージ力価の産生を、製造プロセスによって要求される時間範囲内において、すなわち、宿主細胞が死ぬ前において妨げない。しかしながら、そのようなプロモーターは、多数コピーで存在するとき、すなわち、多数コピーのＳＡＳＰ遺伝子が標的細胞に送達された後において、または、標的細胞におけるファージ複製に起因して、毒性レベルのＳＡＳＰの産生を行わせるようにするには十分に強い。そのような活性を有するプロモーターの選択を、バクテリオファージ構築物をこれらの特性について分析することによって行うことができる。
【００１８】
ＳＡＳＰ遺伝子の転写、ひいては、ＳＡＳＰ遺伝子の発現を制御するプロモーターは、該プロモーターがバクテリオファージに由来せず、かつＳＡＳＰ遺伝子の本来のプロモーターでないという意味で、バクテリオファージおよびＳＡＳＰ遺伝子の両方にとって外来である。このように、ファージはＳＡＳＰ遺伝子の発現の制御に関与しない。
【００１９】
細菌宿主は、所与のバクテリオファージに好適な任意の宿主であればよい。宿主は、成熟したバクテリオファージ粒子の宿主内での増殖を行うように誘導されるとき、そのような増殖が終わるまではバクテリオファージを養わなければならない。国際公開ＷＯ０２／４０６７８は、付録４において、一般的な病原体およびそれらのファージの一部からなるリストを示す。この付録を、本出願において付録１として再利用する。ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の宿主、好ましくは黄色ブドウ球菌およびクロストリジウム・デフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は特に有用な宿主である。バクテリオファージφ１１は黄色ブドウ球菌に感染することができる。バクテリオファージφ１１について以下に詳述する。本発明によれば、このバクテリオファージを改変することができる。
【００２０】
α／β型ＳＡＳＰの配列を、好ましいα／β型ＳＡＳＰであるバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＳＡＳＰ−Ｃを含めて、国際公開ＷＯ０２／４０６７８の付録１に見出すことができる。
【００２１】
ＳＡＳＰ遺伝子を含有するように改変されたバクテリオファージベクターは、一般に、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターと名づけられている。ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターＰＴＳＡ１．２／Ａの、ＳＡＳＰ遺伝子のＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡを含む）への送達について以下に詳述する。ＳＡＳＰ遺伝子が標的細菌に送達されると、それら細菌の内部でＳＡＳＰが産生され、菌体内において、ＳＡＳＰが細菌ＤＮＡに結合し、ＤＮＡの立体配座をＢ様からＡ様へと変化させる。標的細菌細胞の内部においてＳＡＳＰが十分に産生されると、病的細胞の生存性の低下を生じさせる；したがって、ＳＡＳＰによって引き起こされる毒性は用量依存的であり、その毒性は結果として、プロモーター活性および存在するプロモーター：：ＳＡＳＰコピー体の数に依存する。
【００２２】
一般に、ＳＡＳＰ遺伝子およびそのプロモーターはバクテリオファージゲノム内のどこにでも配置することができる。しかしながら、改変バクテリオファージが非溶菌性であることが、病原性細菌を標的化するためには好ましい。これは、感染した細菌を溶解するためにファージにより要求される１つまたは複数の遺伝子の除去または不活性化によって達成することができ、最も好ましくは、溶菌遺伝子の少なくとも１つを不活性化することによって達成することができる。好ましい実施形態において、ＳＡＳＰ遺伝子は溶菌遺伝子の１つに挿入されるか、または溶菌遺伝子が毒素遺伝子で置き換えられる。感染した細菌を溶解するための遺伝子としては、バクテリオファージホリン遺伝子および／またはアミダーゼ遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子の１つまたは複数をＳＡＳＰ遺伝子によって中断または置換することができる。改変バクテリオファージにその標的細菌宿主を溶解させないようにすることにより、ＳＡＳＰの継続した発現および蓄積が、場合により、細菌宿主の溶解をこのバクテリオファージが通常の場合に生じさせる時間を超えて可能になる。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中で定義する改変バクテリオファージと、そのためのキャリアとを含む、細菌の細胞成長を阻害または予防するための組成物を提供する。そのような組成物は広範囲の様々な用途を有することができ、意図された用途に応じて処方される。そのような組成物は、特にヒトの処置のための医薬品として処方することができ、また、細菌感染症を含めて、様々な状態を処置することができる。本発明に従って処置可能なそのような感染症には、局所的な感染症、虫歯、呼吸器感染症、眼感染症、ならびに限局性の組織感染症および臓器感染症がある。キャリアは、医薬的に許容される受容体または希釈剤であり得る。そのような組成物の成分の正確な性質および量は経験的に決定することができ、部分的には組成物の投与経路に依存する。
【００２４】
被投与者に対する投与経路としては、経口、口内、舌下、経鼻、吸入、局所的（眼科的を含む）、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下および関節内が挙げられる。使用の便宜上、本発明による投与量は、治療または予防される感染の部位および種類による。呼吸器感染症を吸入投与によって処置することができ、眼感染症を、点眼薬を使用して処置することができる。改変バクテリオファージを含有する口腔衛生製品もまた提供される；歯垢形成に関連する細菌を除くために処方された本発明による改変バクテリオファージを含有する口内洗浄剤または練り歯磨きを使用することができる。
【００２５】
本発明による改変バクテリオファージは、例えば、表面の細菌汚染の処理においてだけでなく、土壌修復または水処理においても、細菌除染剤として使用することができる。バクテリオファージは、除染用薬剤として、例えば、手消毒剤における除染用薬剤として、医療関係者および／または患者の処置において使用することができる。作業表面および作業設備の処置、特に、病院での行為において、または食品調理において使用される作業表面および作業設備の処置もまた提供される。１つの具体的な実施形態は、細菌の保菌および個体から個体への汚染を予防し、排除し、または減らすための局所使用のために処方された組成物を含む。これは、従来の抗生物質に対して耐性を有する細菌が蔓延している病院環境では、特に、微生物感染症の伝染を制限するために重要である。そのような使用のために、改変バクテリオファージは、ＣａＣｌ２（１０ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１ｍＭ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水に含有され得るか、あるいは、ゲルまたはクリームに処方され得る。複数回の使用のために、保存剤を加えることができる。あるいは、製造物を凍結乾燥することができ、賦形剤、例えば、糖（例えば、スクロースなど）などを加えることができる。
【００２６】
次に、単に例として、添付の図面および下記の実施例を参照して、本発明をさらに詳しく記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ホリン遺伝子およびアミダーゼ遺伝子、ならびにこれらの遺伝子および隣接ＤＮＡを増幅するためのプライマー作用部位を示す、Ｓ．ａｕｒｅｕｓファージφ１１の領域。
【図２】クローン化された領域と、ｐＳＡ１の逆ＰＣＲのためのプライマー作用部位の存在位置とを示す、ｐＳＡ１の図。
【図３】カドミウム耐性（ＣｄＲ）遺伝子および隣接するφ１１ＤＮＡを伴うクローン化されたプロモーター−ｓａｓｐＣ領域を、関連するプライマー作用部位の存在位置と一緒に示す、ｐＳＡ４の図。
【図４】外来遺伝子によるホリン遺伝子の置換を示す、ＰＴＬ１００３のゲノムにおけるＤＮＡの配置。野生型φ１１のゲノムにおける遺伝子の配置を比較のために示す。
【図５】Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌株に対するＰＴＳＡ１．２／Ａの効力を示す殺菌曲線の一例。ＳＡＳＰｊｅｃｔ ＰＴＳＡ１．２／Ａを感染させたＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞の生存性の低下を示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株を５×１０７細胞／ｍｌの密度に成長させた。その後、培養物を分け、生成物ＰＴＳＡ１．２／Ａ（１×１０１０個）を１つのアリコートに加え、インキュベーションを続けた。サンプルを感染後３０分および１時間毎に採取して、残存する生細菌の数を数えた。
【図６】ＰＴＳＡ１．２／Ａの殺菌能を、ＳＡＳＰ遺伝子を有しない同じファージと比較する殺菌曲線。ＳＡＳＰｊｅｃｔ ＰＴＳＡ１．２／Ａ（φ１１：ホリン：：ＳＡＳＰ−Ｃ＋）を感染させたＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞とＳＡ０／Ａ（φ１１：ホリン：：ＳＡＳＰ−Ｃ）との比較を示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株を５×１０７細胞／ｍｌの密度に成長させた。その後、培養物を分け、生成物ＰＴＳＡ１．２／Ａ（１×１０１０個）を１つのアリコートに加え、ファージＳＡ０／Ａ（１×１０１０個）を１つのアリコートに加え、インキュベーションを続けた。サンプルを感染後３０分および１時間毎に採取して、残存する生細菌の数を数えた。
【図７】Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌株に感染するＰＴＳＡ１．２／Ａの殺菌曲線。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＰＴＳＡ１．２／Ａモノ溶原菌に対するＳＡＳＰｊｅｃｔ ＰＴＳＡ１．２／Ａの影響を示すグラフである。ＰＴＳＡ１．２／Ａにより溶原菌化されたＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株を５×１０７細胞／ｍｌまたは５×１０５細胞／ｍｌの密度に成長させた。密度が５×１０７細胞／ｍｌである細胞には１×１０１０個のＰＴＳＡ１．２／Ａ粒子を加え、密度が５×１０５細胞／ｍｌである細胞には１×１０９個のＰＴＳＡ１．２／Ａ粒子を加えた。サンプルを感染後３０分および１時間毎に採取して、残存する生細菌の数を数えた。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ＳＡＳＰ−Ｃをフルクトースビスリン酸アルドラーゼホモログ（ｆｂａＡ）プロモーターの制御下に保有する遺伝子改変バクテリオファージの構築の概要
遺伝子を、相同組換えを使用して除くことができ、またファージゲノムに加えることができる。外来の遺伝子およびプロモーターを保有するファージを構築することができる方法がいくつかあり、下記はそのような方法の一例である。
【００２９】
φ１１誘導体を構築するために、単に一例としてであるが、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ａｕｒｅｕｓのシャトルベクターを使用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのフルクトースビスリン酸プロモーターホモログの制御下において、ファージのホリン遺伝子がどのようにしてＳＡＳＰ−Ｃのための遺伝子により置換されているかを示す（これ以降、フルクトースビスリン酸アルドラーゼプロモーターを示すためにｆｂａＡを使用する）。重金属カドミウムに対する耐性のための遺伝子（以降、ＣｄＲという）が、非抗生物質耐性マーカーとして使用される。
【００３０】
ｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−Ｃ領域およびＣｄＲ領域が、φ１１ホリン遺伝子に隣接するφ１１ ＤＮＡの２つの領域の間にクローン化された。続いて、このプラスミドが細胞に導入され、ホリンがｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−Ｃ領域およびＣｄＲ領域により置換された二重組換え体が選択された。
【００３１】
実験手順
すべてのＰＣＲ反応が、製造者の説明書に従って、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム、およびプライマーの融解温度（Ｔｍ）に依存するストリンジェントな条件を使用して行われた。別途の記載がない限り、一般的な分子生物学的手法、例えば、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ依存性連結、コンピテント細胞の調製および形質転換などは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）に記載の方法に基づいた。ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ精製キットを使用して酵素反応液から精製し、細胞から調製した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞を、ＳｃｈｅｎｃｋおよびＬａｄａｇｇａ（１９９２年）によって記載されるような方法を使用して、エレクトロポレーションによってプラスミドＤＮＡで形質転換した。
【００３２】
プライマーを、Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓから得た。プライマーが制限酵素のための制限配列を含む場合、追加の２ヌクレオチド〜６ヌクレオチドが、増幅されたＰＣＲ ＤＮＡの消化を確実にするために５’末端に付加された。
【００３３】
すべてのクローン化が、別途の記載がない限り、各書（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）に記載されるように、ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結し、その後、ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉクローニング株（例えば、ＤＨ５ａまたはＸＬ１−Ｂｌｕｅなど）に形質転換し、選択培地での単離を行うことによって達成される。
【００３４】
Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ａｕｒｅｕｓのシャトルベクター（ｐＳＭ１９８と呼ばれる）が、遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉと、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとの間で移し替えるために使用された。プラスミドｐＳＭ１９８は、Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターｐＵＣ１８と、Ｓ．ａｕｒｅｕｓプラスミドｐＴ１８１のテトラサイクリン耐性領域および複製領域とを組み合わせることによって前もって作製された。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓにおいて選抜され得る耐性マーカーを保有する。このプラスミドはｐＵＣ１８の多重クローニング部位（ＭＣＳ）を保持しているが、必ずしもすべての部位が特異的部位として残存するわけではない。ｐＳＭ１９８のＭＣＳにおける残存する特異的部位は、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩである。
【００３５】
ｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−Ｃ／ＣｄＲによるφ１１ホリン遺伝子の標的置換のためのプラスミドの構築
１．溶菌遺伝子にまたがるφ１１の１．８ｋｂフラグメントを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋を含むプラスミドｐＳＡ１を下記のように構築した。図１は、φ１１ゲノム由来領域を増幅するための下記のオリゴヌクレオチドについてのプライマー作用部位を示す。
【００３６】
プライマーＢ１００１およびプライマーＢ１００２を使用してφ１１ＤＮＡのＰＣＲ増幅を行い、１．８ｋｂのフラグメントを得て、これを洗浄し、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩにより消化した。消化後、ＤＮＡを洗浄し、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩにより消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋にクローン化し、これにより、ｐＳＡ１を得た。
【００３７】
プライマーＢ１００１（配列番号１）は５’側のＰｓｔＩ部位（下線部）を含み、その後に、塩基３９７７９から塩基３９７９８までのφ１１の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＦ４２４７８１）が続く（図１参照）。プライマーＢ１００２（配列番号２）はＸｂａＩ部位（下線部）を含み、その後に、塩基４１５３７から塩基４１５５６までのφ１１の逆相補配列が続く（図１参照）。
Ｂ１００１（配列番号１）
5'-AACTGCAGGTGTATTGCAACAGATTGGCTC-3'
Ｂ１００２（配列番号２）
5'-GCTCTAGACTTTGCTCCCTGCGTCGTTG-3'
【００３８】
２．逆ＰＣＲを、プライマーＢ１００３（配列番号３）およびプライマーＢ１００４（配列番号４）を使用して、テンプレートとしてのｐＳＡ１に対して行った（図２参照）。
【００３９】
プライマーＢ１００３は５’側のＢａｍＨＩ部位（下線部）を含み、その後に、塩基４０４５４から塩基４０４６９までのφ１１の逆相補配列が続く（図２参照）。プライマーＢ１００４は５’側のＳｐｅＩ部位（下線部）を含み、その後に、塩基４０８９１から塩基４０９１１までのφ１１の配列が続く（図２参照）。
Ｂ１００３（配列番号３）
5'-CGGGATCCGACTAAAAATTAGTCG-3'
Ｂ１００４（配列番号４）
5'-GGACTAGTGAATGAGTATCATCATGGAGG-3'
【００４０】
このＰＣＲ反応により、φ１１のレフトアーム、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋プラスミド全体およびφ１１のライトアームから成る約４．２ｋｂのフラグメントが得られた。このフラグメントをＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩにより消化し、洗浄し、続いて、下記のフラグメントでクローン化するためにベクターとして使用した。
【００４１】
３．ｐＩ２５８由来のカドミウム耐性領域を、プライマーＢ１００５およびプライマーＢ１００６を使用してＰＣＲによって増幅し、これにより、約２．８ｋｂのフラグメントを得た。このＰＣＲ産物を洗浄し、ＢａｍＨＩおよびＸＢａＩにより消化した。消化されたＰＣＲ産物を洗浄し、（ＰＣＲ増幅され、消化された）ｐＳＡ１（上記）にクローン化し、これにより、ｐＳＡ２を作製した。
【００４２】
プライマーＢ１００５（配列番号５）は、ｐＩ２５８由来の推定されるカドミウム応答性調節タンパク質遺伝子ｃａｄＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｊ０４５５１）のためのＡＴＧから３０８ｂｐ上流側のＤＮＡに対して相補的であり、その３’末端がＡＴＧに最も近い（図３参照）。このプライマーの５’末端は、クローン化を助けるためのＢａｍＨＩ部位（下線部）を伴う非相補的なテールを有する。
【００４３】
プライマーＢ１００６（配列番号６）は、最後の３つの相補的なヌクレオチドがｃａｄＡ遺伝子の停止コドンＴＡＧに対して相補的であるように、プラスミドｐＩ２５８由来のカドミウム耐性タンパク質のためのｃａｄＡ遺伝子の３’末端においてＤＮＡに対して相補的である（図３参照）。５’末端は、クローン化を助けるための非相補的なＸｂａＩ部位（下線部）を有する。
Ｂ１００５（配列番号５）
5'-CGATGGATCCTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTC-3'
Ｂ１００６（配列番号６）
5'-GCAGACCGCGGCTATTTATCCTTCACTCTCATC-3'
【００４４】
４．φ１１のレフトアームおよびライトアームと、ＣｄＲとを含有するＤＮＡを、ＰｓｔＩおよびＳａｃＩを使用してｐＳＡ２から切り出し、ゲル精製してベクターから分離した。このフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＳａｃＩにより同様に切断されたシャトルベクターｐＳＭ１９８にクローン化した。クローンを制限フラグメントについてスクリーニングし、候補体を配列決定のために送った。正しいプラスミド構築物を確認し、ｐＳＡ３と名づけた。このプラスミドを、下記のフラグメントでクローン化するために使用した。
【００４５】
５．Ｂ１００７およびＢ１００８を使用してｆｂａＡプロモーターのＰＣＲ増幅により、約３００ｂｐのフラグメントが得られ、これを洗浄し、続いて、ＮｃｏＩにより消化し、その後、再び洗浄した。
【００４６】
ｆｂａＡのＰＣＲフラグメントをＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＳＡＳＰ−Ｃコード配列に連結した。ＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の増幅および調製を下記に記載する。
【００４７】
プライマーＢ１００７（配列番号７）は、ＢａｍＨＩ部位を含む５’側の配列テールを含み、その後には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ８３２５のゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＰ０００２５３）に由来する塩基２１８９４０４から塩基２１８９４２７までの逆向き相補部分が続く（図３参照）。
【００４８】
オリゴヌクレオチドＢ１００８（配列番号８）は、ＮｃｏＩ部位と、その後に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ８３２５のゲノムに由来する塩基２１８９２１４から塩基２１８９２３２までの配列とを含む配列テールを含む（図３参照）。ＰＣＲ産物が、このプライマーを使用して作製されるとき、遺伝子のＡＴＧにおいてプライマーに取り込まれるＮｃｏＩ部位により、ＡＴＧの２ヌクレオチド上流側の塩基の、ＴからＣへの変化が生じる。
Ｂ１００７（配列番号７）
5'-CTACGGATCCTTTATCCTCCAATCTACTTATAAA-3'
Ｂ１００８（配列番号８）
5'-CATGCCATGGAAGTTCCTCCTTGAGTGCT-3'
【００４９】
６．Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのＫＭ株（ＡＴＣＣ１３６３２）に由来するＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子をプライマーＢ１００９およびプライマーＢ１０１０によるＰＣＲによって増幅し、約３００ｂｐのフラグメントを得た。このＰＣＲ産物を洗浄し、ＮｃｏＩにより消化した。消化されたＰＣＲ産物を洗浄し、下記のように、ｆｂａＡのＰＣＲフラグメントとの連結において使用した。
【００５０】
オリゴヌクレオチドＢ１００９（配列番号９）は、ＮｃｏＩ部位を含有する５’側のテールを含み、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのＫＭ株に由来する、ＳＡＳＰ−Ｃ（寄託番号Ｋ０１８３３）のＡＴＧから始まる最初の２０ヌクレオチドに対して相補的である（図３参照）。このオリゴヌクレオチドの開始部におけるＮｃｏＩ部位はＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子のＡＴＧを取り込む。
Ｂ１００９（配列番号９）
5'-CGATCCATGGCAAATTATCAAAACGC-3'
【００５１】
オリゴヌクレオチドＢ１０１０（配列番号１０）は、ＢｇｌＩＩ部位（下線部）、およびＥｃｏＲＩ部位（二重下線部）、それに続いて、ＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の停止コドンの５９塩基下流側から始まり、停止コドンの７４塩基下流側までのＤＮＡの逆相補部分を含む。（図３参照）。
Ｂ１０１０（配列番号１０）
5'-AGTGAGATCTGAATTCGCTGATTAAAAGAAAC-3'
【００５２】
７．ｆｂａＡおよびＳＡＳＰ−ＣのＰＣＲフラグメント（これらはともに、ＮｃｏＩにより切断された）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。連結されたＤＮＡをＰＣＲのためのテンプレートとして使用して、連結されたｆｂａＡ ＤＮＡおよびＳＡＳＰ−Ｃ ＤＮＡを増幅した。ＰＣＲを、プライマーＢ１００７およびプライマーＢ１０１０を使用して行った。約５００ｂｐの主ＰＣＲ産物をゲル精製した。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩにより消化し、洗浄した。このフラグメントを、下記のように調製されたｐＳＡ３にクローン化した。プラスミドをＢａｍＨＩにより切断し、両端を、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）を使用して脱リン酸化した。ＤＮＡを再び洗浄した。
【００５３】
プラスミドをスクリーニングし、その結果、ＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の末端がφ１１の「レフトアーム」領域に隣接するようにし、かつ、ｆｂａＡプロモーターの開始部が塩化カドミウム耐性領域に隣接するようにした。ｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−Ｃを有する得られたプラスミドをｐＳＡ４と名づけた。
【００５４】
ｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−ＣおよびＣｄＲマーカーによるＳ．ａｕｒｅｕｓファージφ１１由来のホリン遺伝子の置換
１．ｐＳＡ４をＳ．ａｕｒｅｕｓのＰＴＬ４７株に形質転換した。ＰＴＬ４７はＲＮ４２２０におけるφ１１のモノ溶原菌である。
【００５５】
２．ｐＳＡ４のφ１１レフトアームと、φ１１ライトアームとの間に含有されるＤＮＡが、ファージゲノムにおけるφ１１レフトアームと、φ１１ライトアームとの間のＤＮＡ（すなわち、ホリン遺伝子）により置き換えられている二重乗換えを受けた細胞は、下記の表現型を有するコロニーを生じさせた：ＣｄＣｌ２（０．１ｍＭ）耐性、テトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）感受性。シャトルベクターｐＳＭ１９８はテトラサイクリン耐性を有する。テトラサイクリン耐性の喪失はｐＳＭ１９８の喪失を示す。ＣｄＣｌ２Ｒ、テトラサイクリンＳの表現型を有したコロニーを、コロニーＰＣＲによってさらにスクリーニングした。
【００５６】
３．ＰＣＲ反応を行って、ホリン遺伝子がもはや存在しないこと、ならびにｆｂａＡ−ＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子およびＣｄＣｌ２Ｒ遺伝子がφ１１プロファージゲノムに存在し、かつ正しく配置されることを調べた。ＰＣＲフラグメントを配列決定して、単離体が、特にｆｂａＡおよびＳＡＳＰ−Ｃの領域において、予想された配列を有することを確実にした。
【００５７】
確認されたプロファージ構築物をこのように特定し、代表物を選択し、ＰＴＬ１００１と名づけた。
【００５８】
４．ファージを熱ショックによってＰＴＬ１００１株の培養物から誘導し、細胞をリソスタフィン（０．２５μｇ／ｍｌ）により溶解し、その後、０．２μｍのフィルターでろ過し、これにより、粗製の無細胞ファージ溶解物を得た。
【００５９】
５．この溶解物を使用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの８３２５−４株に感染させた。感染混合物をφＶＰＢ（１０ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含有する植物ペプトン培養液）＋ＣｄＣｌ２（０．１ｍＭ）の寒天平板に置床して、溶原菌について、３７℃での一晩の成長の後で選択した。
【００６０】
６．溶原菌を、上述したコロニーＰＣＲによって調べた。確認された溶原菌を特定し、ＰＴＬ１００２と名づけた。
【００６１】
７．ＰＴＬ１００２をφＶＰＢ寒天で５回継代した。このとき、それぞれの継代で、単一コロニーを選び、単一コロニーに再び画線培養した。
【００６２】
８．単一コロニーを選び、ＰＣＲおよび配列決定によって再び分析した。確認された単離体をＰＴＬ１００３と名づけた。この溶原菌株によって保有されるファージはＰＴＳＡ１．２／Ａと呼ばれる（図４参照）。
【００６３】
ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターＰＴＳＡ１．２／Ａは、５つの認識されているｓｃｃ−ｍｅｃタイプのそれぞれに属するメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）株およびＭＲＳＡ株を含めて、Ｓ．ａｕｒｅｓｕの様々な菌株および臨床単離体のパネルに対して試験されている。１つのＳ．ａｕｒｅｕｓ株に対するＰＴＳＡ１．２／Ａの効力を示す殺菌曲線の一例を図５に示す。
【００６４】
ＰＴＳＡ１．２／Ａの殺菌能を、ＳＡＳＰ遺伝子を有しない同じファージ（ファージＳＡ０／Ａ）と比較した殺菌曲線を図６に示す。この図により、殺菌速度がＳＡＳＰの存在に起因することが確認される。
【００６５】
ＰＴＳＡ１．２／Ａのモノ溶原菌であるＳ．ａｕｒｅｕｓ株に感染するＰＴＳＡ１．２／Ａの殺菌曲線を図７に示す。この図は、このファージに対する重複感染免疫性が、ＳＡＳＰが感染細胞を阻害することを妨げないことを示す。
【００６６】
参考文献
Ｄｏｎｅｇａｎ，Ｎ．、２００６年、米国医療疫学学会年会。
Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉ，Ｓ．Ｃ．、ＭａｃＡｌｉｓｔｅｒ，Ｔ．Ｊ．、Ｓｅｔｌｏｗ，Ｂ．およびＳｅｔｌｏｗ，Ｐ．、１９８８年、枯草菌の出芽細胞における低分子量酸可溶性胞子タンパク質の免疫電子顕微鏡法による位置確認、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５９６３−５９６７。
Ｆｒｅｎｋｉｅｌ−Ｋｒｉｓｐｉｎ，Ｄ．、Ｓａｃｋ Ｒ．、Ｅｎｇｌａｎｄｅｒ，Ｊ．、Ｅ．Ｓｈｉｍｏｎｉ、Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、Ｂｕｌｌｉｔｔ，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ−Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｅ．Ｒ．、Ｈａｙｅｓ，Ｃ．Ｓ．、Ｓｅｔｌｏｗ，Ｐ．、Ｍｉｎｓｋｙ，Ａ．およびＷｏｌｆ，Ｓ．Ｇ．、２００４年、ＤＮＡ−ＳｓｐＣ複合体の構造：細菌胞子におけるＤＮＡパッケージング、保護および修復についての意味、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：３５２５−３５３０。
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Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｗ．Ｌ．、Ｓｅｔｌｏｗ，Ｂ．およびＳｅｔｌｏｗ，Ｐ．、１９９０年、枯草菌由来の低分子量酸可溶性胞子タンパク質によるインビトロでのＤＮＡの結合およびＤＮＡトポロジーに対するこの結合の影響、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６９００−６９０６。
Ｎｏｓｋｉｎ，Ｇ．Ａ．、Ｒｕｂｉｎ，Ｒ．Ｊ．、Ｓｃｈｅｎｔａｇ，Ｊ．Ｊ．、Ｋｌｕｙｔｍａｎｓ，Ｊ．、Ｈｅｄｂｌｏｍ，Ｅ．Ｃ．、Ｓｍｕｌｄｅｒｓ，Ｍ．、Ｌａｐｅｔｉｎａ，Ｅ．およびＧｅｍｍｅｎ，Ｅ．、２００５年、合衆国における病院での黄色ブドウ球菌感染症の負担：２０００年および２００１年の全国入院サンプルデータベースの分析、Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １６５：１７５６−１７６１。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年）。
Ｓｃｈｅｎｋ，Ｓ．およびＲ．Ａ．Ｌａｄｄａｇａ、１９９２年、黄色ブドウ球菌のエレクトロポレーションのための改善された方法、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７３：１３３−１３８。
【００６７】
付録１
一般的な病原体およびそれらのファージの一部のリスト（このリストは網羅的ではなく、代表的なものである）。
大腸菌ファージ：
バクテリオファージλ
バクテリオファージ９３３Ｗ（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７）
バクテリオファージＶＴ２−Ｓａ（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７）
大腸菌ファージ１８６
大腸菌ファージＰ１
大腸菌ファージＰ２
大腸菌ファージＮ１５
バクテリオファージＴ３
バクテリオファージＴ４
バクテリオファージＴ７
バクテリオファージＫＵ１
サルモネラ菌種（Salmonella spp）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＦｅｌｉｘ
バクテリオファージＰ２２
バクテリオファージＬ
バクテリオファージ１０２
バクテリオファージ３１
バクテリオファージＦ０
バクテリオファージ１４
バクテリオファージ１６３
バクテリオファージ１７５
バクテリオファージＶｉｒ
バクテリオファージＶｉＶＩ
バクテリオファージ８
バクテリオファージ２３
バクテリオファージ２５
バクテリオファージ４６
バクテリオファージＥ１５
バクテリオファージＥ３４
バクテリオファージ９Ｂ
志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）のバクテリオファージ：
バクテリオファージφ８０
バクテリオファージＰ２
バクテリオファージ２
バクテリオファージ３７
コレラ菌（Vibrio cholerae）のバクテリオファージ：
バクテリオファージｆｓ−２
バクテリオファージ１３８
バクテリオファージ１４５
バクテリオファージ１４９
バクテリオファージ１６３
マイコプラズマ・アルスリチジス（Mycoplasma arthritidis）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＭＡＶ１
連鎖球菌属細菌のバクテリオファージ：
バクテリオファージＣＰ−１
バクテリオファージφＸｚ４０
バクテリオファージ１Ａ
バクテリオファージ１Ｂ
バクテリオファージ１２／１２
バクテリオファージ１１３
バクテリオファージ１２０
バクテリオファージ１２４
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＤ３
バクテリオファージφＣＴＸ
バクテリオファージＰＰ７
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＳ２
バクテリオファージＨＰ１
バクテリオファージｆｌｕ
バクテリオファージＭｕ
黄色ブドウ球菌のバクテリオファージ：
バクテリオファージＴｗｏｒｔ
バクテリオファージｔＩＩＩ−２９Ｓ
バクテリオファージφＰＶＬ
バクテリオファージφＰＶ８３
バクテリオファージφ１１
バクテリオファージφ１２
バクテリオファージφ１３
バクテリオファージφ４２
バクテリオファージφ８１２
バクテリオファージＫ
バクテリオファージＰ３
バクテリオファージＰ１４
バクテリオファージＵＣ１８
バクテリオファージ１５
バクテリオファージ１７
バクテリオファージ２９
バクテリオファージ４２ｄ
バクテリオファージ４７
バクテリオファージ５２
バクテリオファージ５３
バクテリオファージ７９
バクテリオファージ８０
バクテリオファージ８１
バクテリオファージ８３
バクテリオファージ８５
バクテリオファージ９３
バクテリオファージ９５
バクテリオファージ１８７
クラミジア属細菌のバクテリオファージ：
バクテリオファージφＣＰＡＲ３９
マイコバクテリオファージ：
バクテリオファージＬ５
バクテリオファージＬＧ
バクテリオファージＤ２９
バクテリオファージＲｖ１
バクテリオファージＲｖ２
バクテリオファージＤＳＧＡ
リステリア菌（Listeria monocytogenes）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＡ１１８
バクテリオファージ２４３
バクテリオファージＡ５００
バクテリオファージＡ５１１
バクテリオファージ１０
バクテリオファージ２６８５
バクテリオファージ１２０２９
バクテリオファージ５２
バクテリオファージ３２７４
肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）のバクテリオファージ：
バクテリオファージ６０
バクテリオファージ９２
ペスト菌（Yersinia pestis）のバクテリオファージ：
バクテリオファージＲ
バクテリオファージＹ
バクテリオファージＰ１
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするα／β低分子量酸可溶性胞子タンパク質（ＳＡＳＰ）遺伝子を含み、前記ＳＡＳＰ遺伝子が、バクテリオファージおよびＳＡＳＰ遺伝子に対して外来である構成的プロモーターの制御下にある、改変バクテリオファージ。
【請求項２】
前記ＳＡＳＰがＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのＳＡＳＰ−Ｃを含む、請求項１に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３】
改変されたＳ．ａｕｒｅｕｓバクテリオファージを含む、請求項１または請求項２に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項４】
前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓバクテリオファージがφ１１バクテリオファージである、請求項３に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項５】
前記プロモーターが、ｐｄｈＡ、ｒｐｓＢ、ｐｇｉ、ｆｂａＡ、およびそれらに対して９０％超の同一性を有する配列から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項６】
前記細菌ｆｂａＡプロモーターがＳ．ａｕｒｅｕｓ由来である、請求項５に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項７】
非溶菌性である、先行する請求項のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項８】
毒素遺伝子がその溶菌遺伝子に挿入される、請求項７に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項９】
ホリン−である、請求項７または請求項８に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１０】
標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、ｆｂａＡ構成的プロモーターの制御下にＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのＳＡＳＰ−Ｃをコードする遺伝子が挿入されるホリン遺伝子を有するφ１１バクテリオファージを含む、改変バクテリオファージ。
【請求項１１】
非抗生物質耐性マーカーをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１２】
前記非抗生物質耐性マーカーがカドミウム耐性マーカーである、請求項１１に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１３】
先行する請求項のいずれかに記載の改変バクテリオファージと、そのためのキャリアとを含む、細菌の細胞成長を阻害または予防するための組成物。
【請求項１４】
局所使用のために処方される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
医薬品として使用される、請求項１〜１２のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１６】
細菌除染剤としての、請求項１〜１２のいずれかに記載の改変バクテリオファージの使用。
【請求項１７】
細菌の細胞成長を阻害または予防するための医薬品を調製するための、請求項１〜１２のいずれかに記載の改変バクテリオファージの使用。
【請求項１８】
標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージを作製するためのプロセスであって、先行する請求項のいずれかに記載のバクテリオファージをコードする遺伝物質を含む細菌宿主を成長培地において成長させる工程、前記バクテリオファージを前記細菌宿主において複製させる工程、および前記バクテリオファージを採取する工程を含む、プロセス。
【請求項１】
標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするα／β低分子量酸可溶性胞子タンパク質（ＳＡＳＰ）遺伝子を含み、前記ＳＡＳＰ遺伝子が、バクテリオファージおよびＳＡＳＰ遺伝子に対して外来である構成的プロモーターの制御下にある、改変バクテリオファージ。
【請求項２】
前記ＳＡＳＰがＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのＳＡＳＰ−Ｃを含む、請求項１に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３】
改変されたＳ．ａｕｒｅｕｓバクテリオファージを含む、請求項１または請求項２に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項４】
前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓバクテリオファージがφ１１バクテリオファージである、請求項３に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項５】
前記プロモーターが、ｐｄｈＡ、ｒｐｓＢ、ｐｇｉ、ｆｂａＡ、およびそれらに対して９０％超の同一性を有する配列から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項６】
前記細菌ｆｂａＡプロモーターがＳ．ａｕｒｅｕｓ由来である、請求項５に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項７】
非溶菌性である、先行する請求項のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項８】
毒素遺伝子がその溶菌遺伝子に挿入される、請求項７に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項９】
ホリン−である、請求項７または請求項８に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１０】
標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、ｆｂａＡ構成的プロモーターの制御下にＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのＳＡＳＰ−Ｃをコードする遺伝子が挿入されるホリン遺伝子を有するφ１１バクテリオファージを含む、改変バクテリオファージ。
【請求項１１】
非抗生物質耐性マーカーをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１２】
前記非抗生物質耐性マーカーがカドミウム耐性マーカーである、請求項１１に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１３】
先行する請求項のいずれかに記載の改変バクテリオファージと、そのためのキャリアとを含む、細菌の細胞成長を阻害または予防するための組成物。
【請求項１４】
局所使用のために処方される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
医薬品として使用される、請求項１〜１２のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１６】
細菌除染剤としての、請求項１〜１２のいずれかに記載の改変バクテリオファージの使用。
【請求項１７】
細菌の細胞成長を阻害または予防するための医薬品を調製するための、請求項１〜１２のいずれかに記載の改変バクテリオファージの使用。
【請求項１８】
標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージを作製するためのプロセスであって、先行する請求項のいずれかに記載のバクテリオファージをコードする遺伝物質を含む細菌宿主を成長培地において成長させる工程、前記バクテリオファージを前記細菌宿主において複製させる工程、および前記バクテリオファージを採取する工程を含む、プロセス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５３５４８２（Ｐ２０１０−５３５４８２Ａ）
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１９４６２（Ｐ２０１０−５１９４６２）
【出願日】平成２０年８月６日（２００８．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０３６０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１９２９３
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０３１８１１５２）フィコ セラピューティクス リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月６日（２００８．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０３６０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１９２９３
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０３１８１１５２）フィコ セラピューティクス リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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