新規なジンクフィンガーヌクレアーゼ及びその用途
本発明は、ゲノム配列の標的化された切断と標的化された変更、ゲノム領域およびそのゲノム領域と相同性がある外来性ポリヌクレオチド間または、ゲノム配列の標的化された切断部位の非相同末端連結による標的化された組換えおよびそのための組成物に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム配列の標的化された切断および変更、標的化された切断に続いて外来性ポリヌクレオチドとゲノム配列間の相同性組換え、または、標的化された切断に続いて非相同性末端連結に有用な方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、制限酵素は、遺伝工学および分子生物学において、重要なツールである。９以上の塩基対(bp)からなったＤＮＡを認識して切ることができる“rare cutter”として知られた新規制限酵素を作るための様々な試みがあって来た。そのうち、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術は、様々なＤＮＡ基盤配列の認識および切断に、ジンクフィンガーＤＮＡ−認識ドメインおよびＤＮＡ−切断ドメインを含むキメラヌクレアーゼである制限酵素を使用することである。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、細胞内に導入された時にゲノム性ＤＮＡから標的化された二重鎖切断(double strand break，ＤＳＢ)を誘導できるから、哺乳類、植物細胞または他の細胞で効率的な遺伝子変更をさせるのに使用され得る。細胞で二重鎖切断が発生すると、細胞は自体的に持っている修理(repair)システムを用いて損傷した部位を直す。この時、損傷した部分と類似したＤＮＡ配列を有した供与者ＤＮＡを細胞内に導入すると、損傷したＤＮＡと供与者ＤＮＡ鋳型の間に相同組換えが生じる。遺伝体上の特定部位に所望の変形のために、標的塩基配列を供与者ＤＮＡ内に組み込ませる。一方、供与者ＤＮＡがない場合にも、損傷した細胞は、非相同末端連結(non-homologous end joining，ＮＨＥＪ)方式で損傷した部位が修理され得る。非相同末端連結(ＮＨＥＪ)は、２つの切断末端などを共に接合して損傷したＤＮＡを修理し、一般的に変異などを形成しない。しかし、一部の場合に切断されたＤＮＡ末端で塩基対などの挿入または欠失が起こるエラーが発生しやすい方向に修理が進行されることもある。従って、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて特定塩基配列の部分に二重鎖切断を生じて非相同末端連結を誘導すると、ＤＮＡに突然変異が生じ、ノックアウト細胞株を作ることができる。
【０００３】
ジンクフィンガー(ＺＦｓ)は、真核細胞のゲノム内に暗号化されている最も豊富なＤＮＡ−結合モチーフであって、最もよく理解されている蛋白質−ＤＮＡ結合メカニズムの１つを提供しているものとして見なされる(Wolfe，S．A．et al.,(2000) Annu． Rev． Biophys． Biomol． Struct.，29，183-212；Pabo，C．O. et al.，(2001) Annu． Rev． Biochem.，70，313-340；Moore，M．et al.，(2003) Brief Funct． Genomic． Proteomic.，1，342-355；およびKlug，A．et al.，(2005) FEBS Lett.，579，892-894)。エンジニアリングされたジンクフィンガー蛋白質(ＺＦＰ)などは、遺伝子調節およびゲノム修正のためのツールとして重大な潜在力を持っているが、これはそれらが如何なるゲノム内で如何なる実質的に所望の位置に機能的なドメインなどを標的化するのに使用され得るためである。ジンクフィンガー蛋白質などは、ＤＮＡ塩基配列を認識する時に持つアミノ酸残基などと塩基などとの間の塩基特異的相互作用およびモジュール化的な構造的特徴のために、新しいＤＮＡ結合特異性を有する蛋白質をデザインするための様々なフレームワークを提供する。
【０００４】
効果的なジンクフィンガーヌクレアーゼを作るためには、遺伝体上の所望の標的ＤＮＡ配列を認識するジンクフィンガー蛋白質を作ることが必要であり、このために、位置選択的突然変異(ＳＭＤ)を用いて各対応アミノ酸を１つずつ変える方法またはファージディスプレイのような大規模スケールでスクリーニングする方法など生体外と生体内で様々なジンクフィンガー選択方法などが使用されている(米国特許５，７８９，５３８号、５，９２５，５２３号、６，００７，９８８号、６，０１３，４５３号および６，２００，７５９号；国際公開特許ＷＯ９５／１９４３１号、ＷＯ９６／０６１６６号、ＷＯ９８／５３０５７号、ＷＯ９８／５４３１１号、ＷＯ００／２７８７８号、ＷＯ０１／６０９７０号、ＷＯ０１／８８１９７号およびＷＯ０２／０９９０８４号参考)。しかし、選択を基盤とした方法などは、非常に多くの労働と時間が要求され、訓練された実験者を必要とする。ＺＦＮを作る他の方法は、一般的なＤＮＡ組換え技術を使用してすでに良く知られているジンクフィンガーモジュールなどを組み立てて所望の特異性を有するジンクフィンガーアレイを作る方法である。それぞれのジンクフィンガーモジュールは、ＤＮＡの３ｂｐ(塩基対)を認識し、適切に互いに結合される時に引き起こされるジンクフィンガーアレイなどは、さらに長いＤＮＡ配列モチーフなどを特異的に認識することができる。このような方法を使用すると、容易に塩基配列を特異的に認識するジンクフィンガーヌクレアーゼを作ることができるだろう。一部の研究グループなどは、マルチ−フィンガーアレイなどの製作のためのジンクフィンガーモジュールのそれぞれ詳細化され、特性化された別の成果物などを有している。第１には、スクリップス研究所(The Scripps Research Institute)のバルバス研究室(Barbas laboratory)のバルバスモジュールであって、これらのジンクフィンガーモジュールなどは、ファージディスプレイおよび理論的なデザイン方法の組み合わせを使用して開発されたものである。このモジュールなどは、すべてのＧＮＮトリプレット、大部分のＡＮＮおよびＣＮＮトリプレット、およびいくつかのＴＮＮトリプレットの認識に有用である。このようなバルバスモジュールなどは、それぞれのジンクフィンガーモジュールなどが実質的に完全な位置上の独立性を有するという仮定下で開発された。すなわち、それらの認識能力は、アレイ内でのそれらの位置または隣接するジンクフィンガーなどの特性などによって大きく影響されないという仮定である。第２に、サンガモバイオサイエンス社(Sangamo BioScienceInc.)でデザインしたサンガモモジュールは、すべてのＧＮＮトリプレットおよびさらに小さい数の非−ＧＮＮ’トリプレットに対して使用可能である。サンガモモジュールなどは、３−フィンガーアレイ内のモジュールなどの位置は、それらの認識特性に影響を及ぼすことができるという仮定下で開発された。３−フィンガーアレイ内での３つの位置のそれぞれは、そのような位置で与えられたトリプレットのために開発された別個のジンクフィンガーモジュールを有する。しかし、このようなモジュールなどは、自然発生的なモジュールでない人工的なモジュールであって、このようなモジュールを使用してジンクフィンガーヌクレアーゼを製造するのは容易でなく、実際使用時にその効率が非常に低いという問題点がある。特に、これらのモジュールは、ＧＮＮ−反復配列を標的化することを特徴とする。しかし、このような配列などは、関心のある与えられた遺伝子内でほとんど希薄に生じる問題点がある。例えば、３−フィンガージンクフィンガーヌクレアーゼ対は、平均的に４０９６ｂｐ(４６)配列内で一度だけ生じるＧＮＮ−反復ＤＮＡ配列である、５’−ＮＮＣＮＮＣＮＮＣＮＮＮＮＮＮＧＮＮＧＮＮＧＮＮ−３’を標的化するようにデザインされ得る。４−フィンガージンクヌクレアーゼに対するＧＮＮ−反復サイトは、さらに珍しくて、６５，５３６ｂｐ(＝４８)配列で一度だけ生じる。従って、そのようなサイトは、所望の数多くの遺伝子内に現れないこともある。このような見地から、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼ(zinc finger nuclease)は、大部分がＧＮＮ−反復配列を認識しなくて作用するという長所がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許５，７８９，５３８号
【特許文献２】米国特許５，９２５，５２３号
【特許文献３】米国特許６，００７，９８８号
【特許文献４】米国特許６，０１３，４５３号
【特許文献５】米国特許６，２００，７５９号
【特許文献６】国際公開特許ＷＯ９５／１９４３１号
【特許文献７】ＷＯ９６／０６１６６号
【特許文献８】ＷＯ９８／５３０５７号
【特許文献９】ＷＯ９８／５４３１１号
【特許文献１０】ＷＯ００／２７８７８号
【特許文献１１】ＷＯ０１／６０９７０号
【特許文献１２】ＷＯ０１／８８１９７号
【特許文献１３】ＷＯ０２／０９９０８４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wolfe，S．A．et al.,(2000) Annu．Rev．Biophys．Biomol． Struct.，29，183-212
【非特許文献２】Pabo，C．O. et al.，(2001) Annu． Rev． Biochem.，70，313-340
【非特許文献３】Moore，M．et al.，(2003) Brief Funct． Genomic． Proteomic.，1，342-355
【非特許文献４】Klug，A．et al.，(2005) FEBS Lett.，579，892-894)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一つの目的は、ジンクフィンガードメインおよび切断ドメインを含む融合蛋白質であって、前記ジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうち、１つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来し、前記融合蛋白質は、細胞染色質内の関心領域を含むヌクレオチド配列を認識して切断することを特徴とするジンクフィンガーヌクレアーゼを提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて関心領域内の細胞染色質を切断する方法を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列を交替する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列を変更する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた遺伝子治療方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、迅速に製造されることができ、ゲノム配列の標的化された切断および変更に非常に有用であるため、遺伝子のノックアウトなどを介した遺伝子治療などに適用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このように、標的化されたゲノムの編集を可能にするジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を広範囲に適用することは、機能的なジンクフィンガーヌクレアーゼの合成のための便利で、迅速且つ公衆に利用可能な方法の不在によって妨害を受けている。従って、本発明者らは、ヒト細胞内のいくつかの異なるゲノム性サイトのＤＮＡ配列を修正できるジンクフィンガーヌクレアーゼを作るために鋭意研究した結果、公衆に使用可能なジンクフィンガーなどを使用する、非常に効率的で、実施するのに容易なモジュール性組み立て方法を使用してジンクフィンガーヌクレアーゼを製造することができ、組み立てられたジンクフィンガーヌクレアーゼを用いてゲノムで標的化された切断と変更などが従来の方法に比べてより容易であることを発見した。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造のために使用されたジンクフィンガーの起源、アミノ酸配列および標的下部部位(subsite)などを示す。
【図２】図２は、本発明者らが合成したジンクフィンガーヌクレアーゼの中で代表的な一対のアミノ酸配列を示す；細胞内発現を確認するために含んだＨＡ標識配列と核内伝達信号配列に下線をひいて示し、標的塩基配列と結合すると予想されるジンクフィンガーのαヘリックス部分を太く示した。
【図３】図３は、ＣＣＲ５コード部位内のＺＦＮ標的部位に対する図式的な概要である；ＺＦＮ標的部位は、ボックスで示し、数字は、開始コドンに比例してＺＦＮ標的部位の位置を示す。網状性ボックスは、Δ３２変異の位置を示す。
【図４】図４は、インビトロ転写および翻訳システムを介して生産されたＺＦＮｓを使用して行われたＤＮＡ切断分析を示した概要図である。
【図５】図５は、アガロースゲル電気泳動を介したＤＮＡ切断分析の結果を示した写真である。
【図６】図６は、ＺＦＮ活性評価で細胞−基盤単一鎖アニーリング(ＳＳＡ)を使用することに対する図式的な概要である；ＺＦＮ発現プラスミドは、非活性状態、部分的に複製され、破裂した状態であるルシフェラーゼ遺伝子を含んでいるゲノムを有するＨＥＫ２９３細胞に形質導入され、もし、ＺＦＮｓが細胞内標的部位を切断すると、ＤＮＡはＳＳＡメカニズムによって効果的に復旧され、機能的ルシフェラーゼ遺伝子は回復されるようになる。
【図７】図７は、ＺＦＮ活性評価で細胞−基盤単一鎖アニーリング(ＳＳＡ)を使用することに対する図式的な概要である；細胞のルシフェラーゼ活性は、様々なＺＦＮｓが発現されたことを意味する。Ｐ３は、プラスミドがない状態であり、陰性対照群として使用された。Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位を含んでいる標的塩基は、陽性対照群として使用された。それぞれのＺＦＮ対の活性は、Ｉ−ＳｃｅＩ対照群に対する百分率で示した。ＺＦＮ対とそれらの構成単量体などを示した。追加的な研究に使用したＺＦＮ対は、三角形で表記した。平均値と標準偏差(エラーバー)は、少なくとも３回の独立的な実験を介して求めたものである。
【図８】図８は、Ｔ７Ｅ１分析法を使用してヒト細胞内ＺＦＮ−媒介性ゲノム編集の不一致探知に対する図式的な概要である；ゲノム性ＤＮＡは、ＺＦＮｓをエンコードするプラスミドが形質導入された細胞から精製した。ＺＦＮ認識部位を含むＤＮＡ断片などは、ＰＣＲ−増幅し、ＤＮＡ増幅産物は、熱を加えて溶かして、アニーリングした。もし、ＤＮＡ増幅産物などが野生型と変異されたＤＮＡ配列の両方とも含んでいると、ヘテロ二重鎖が形成されるだろう。Ｔ７Ｅ１は、ヘテロ二重鎖を認識して切断する。しかし、ホモ二重鎖は切断できない。ＤＮＡ断片などは、アガロースゲル電気泳動によって評価した。
【図９】図９は、Ｔ７Ｅ１分析によって明らかになったＺＦＮ−媒介性ゲノムの変形を示す；ＺＦＮ対は、アガロースゲルの上段に示されている。収得されたＤＮＡバンドの予想される位置は、ゲルパネルの左側に矢印(切られなかった状態)と角括弧(切られた状態)で示した。Ｐ３は、プラスミドがない状態であり、陰性対照群として使用された。サンガモのＣＣＲ５−標的化するＺＦＮ対(サンガモＣＣＲ５)を本分析に含んだ。
【図１０】図１０は、Ｚ８３６ＺＦＮ対によって標的されるゲノムの部位に対するＤＮＡ配列を示す。ＺＦＮ認識要素などは、下線で示した。欠失は点線で示し、挿入された塩基などは、小文字で示した。変異が１つ以上探知された場合、その変異の発生個数を括弧内に示した。ｗｔは、野生型を示す。
【図１１】図１１は、Ｚ３０およびＺ２６６ＺＦＮ対によって標的化されるゲノム部位などに対するＤＮＡ配列を示す；ＺＦＮ認識要素などは下線で示し、欠失は点線で示し、挿入された塩基などは小文字で示した。変異が１つ以上探知された場合、その変異の発生個数を括弧内に示した。
【図１２】図１２は、Ｚ３６０およびＺ４１１ＺＦＮ対によって標的化されるゲノム部位などに対するＤＮＡ配列を示す；ＺＦＮ認識要素などは下線で示し、欠失は点線で示し、挿入された塩基などは小文字で示した。変異が１つ以上探知された場合、その変異の発生個数を括弧内に示した。
【図１３】図１３は、Ｚ４２６およびＺ４３０ＺＦＮ対の標的部位などに対するＤＮＡ配列を示す；ＺＦＮ認識要素などは下線で示し、欠失は点線で示し、挿入された塩基などは小文字で示した。１つ以上の変異が探知された場合、その変異の発生する数は、括弧内に示した。
【図１４】図１４は、Ｚ８９１ＺＦＮ対の標的部位などに対するＤＮＡ配列を示す；ＺＦＮ認識要素などは下線で示し、欠失は点線で示し、挿入された塩基などは小文字で示した。１つ以上の変異が探知された場合、その変異の発生する数は、括弧内に示した。
【図１５】図１５は、様々なＺＦＮ−標的部位の変異類型を示す；それぞれのＺＦＮ対に対する欠失、挿入、そして、複合的な変異の数を確認し、それらの変異発生数を百分率で示した。
【図１６】図１６は、野生型と強制的ヘテロ二量体ＺＦＮｓに対する時間進行による分析結果である。Ｔ７Ｅ１不一致探知分析は、細胞から分離したＤＮＡを異なる種類のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインで色々な時間帯で処理した(ＷＴ、野生型ヌクレアーゼドメイン；ＲＲ／ＤＤまたはＫＫ／ＥＬ、強制的ヘテロ二量体ヌクレアーゼドメインなど）。
【図１７】図１７は、５３ＢＰ１染色の結果である；野生型と強制的ヘテロ二量体Ｚ８９１ＺＦＮ対いずれもＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞内に形質導入させ、形質導入した後２日目に細胞内の５３ＢＰ１フォーカスなど(foci)を免疫蛍光によって観察した。エトポシド(１μＭ)は、陽性対照群として使用した。
【図１８】図１８は、図１６の結果をプロットしたものである；５３ＢＰ１フォーカス数に対する分布をプロットしたものである。最小１００個の細胞などを２回独立的に測定して、各処理について分析した。
【図１９】図１９は、突然変異クローンなどのＤＮＡ配列を示す；ＲＲ／ＤＤＺＦＮ二量体を処理した細胞などから制限的希釈によって７個の突然変異クローンなどを分離した。これらのクローン細胞内標的部位のＤＮＡ配列を示した。欠失は点線で示し、挿入された塩基などは小文字で示した。クローン１ａと１ｂは、１つのクローン内の両対立性形質変異の結果から生じたＤＮＡ配列を示す。
【図２０】図２０は、ＣＣＲ２部位でＴ７Ｅ１分析を示す。ＺＦＮ対で処理した細胞からＣＣＲ２コード部位に対応するＰＣＲ−増幅ＤＮＡ(ゲルパネルの上部に表示されている)を分析した。ＣＣＲ２部位で変形を生じたＺＦＮ対は“＋”で示した。Ｐ３は、プラスミドがない状態であり、陰性対照群として使用された。サンガモのＣＣＲ５−標的化ＺＦＮ対(サンガモＣＣＲ５)が本分析に含まれている。
【図２１】図２１は、ＣＣＲ２部分(locus)でＺＦＮｓの脱標的(off-target)効果およびＣＣＲ５とＣＣＲ２部分でＺＦＮ認識要素など(recognition elements)を示す。ＺＦＮ対はＤＮＡ配列の左側に示した。ＣＣＲ５とＣＣＲ２部分の間で一致する塩基の数は括弧内に示し、不一致する塩基などは太い小文字で示した。ＺＦＮ認識要素などのハーフ−部位(half-site)は下線で示した。
【図２２】図２２は、モジュール交換実験のために使用されたジンクフィンガーなどを示す。
【図２３】図２３は、新しいＺＦＮなどが同一の配列を認識する本発明のＺＦＮなどを機能的に代替できるどうかを試験するためのモジュール交換分析において、細胞−基盤ＳＳＡシステムの結果を示す；“ＢＲ４”のように“Ｂ”で始まる名称のＺＦＮ単量体などは、ただバルバスモジュールのみで構成されているものであり、“ＳＲ４”のように“Ｓ”で始まる名称のＺＦＮ単量体などは、サンガモモジュールのみで構成されたものである。細胞のルシフェラーゼ活性は、様々なＺＦＮなどの発現を示す。ｐ３は、プラスミドがない状態であり、陰性対照群として使用した。Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位を含む標的配列は、陽性対照群として使用した。それぞれのＺＦＮ対の活性は、Ｉ−ＳｃｅＩ対照群に対する百分率として評価した。ＺＦＮ対とそれらの構成単量体などを示した。平均値と標準偏差(エラーバー)は、少なくとも３回の独立的な実験を介して求めたものである。
【図２４】図２４は、新しいＺＦＮｓが同一の配列を認識する本発明のＺＦＮｓを機能的に代替できるどうかを試験するためのモジュール交換分析において、Ｔ７Ｅ１分析を介してＺＦＮ−媒介性ゲノム変形を示す；ＺＦＮ対とそれらの構成単量体などは、アガロースゲルの上段に表示されている。陽性遺伝子標的化効果を有するＺＦＮ対は、“＋”で示した。
【図２５】図２５は、ＺＦＮ分析に対する要約である；それぞれの分析で陽性結果を有するＺＦＮ対の数または標的部位の数が示されている。
【図２６】図２６は、異なる類型のＺＦＮｓの成功率を示す。成功的なＺＦＮ対または標的部位は、Ｔ７Ｅ１不一致探知分析で陽性結果を有するものとして定義される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一つの態様として、本発明は、ジンクフィンガードメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含む融合蛋白質であって、前記ジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうち、２つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来し、前記融合蛋白質は、細胞染色質内の関心領域を含むヌクレオチド配列を認識および切断することを特徴とするジンクフィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)に関するものである。
【００１５】
本発明のジンクフィンガードメインは、１つ以上のジンクフィンガーモジュールを介して配列特異性を有する方式でヌクレオチドと結合する蛋白質をいう。ジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含む。ジンクフィンガードメインは、たびたびジンクフィンガー蛋白質またはＺＦＰで簡略に表示されたりもする。
【００１６】
本発明のジンクフィンガーモジュールとは、亜鉛イオンの配位結合を介して安定化される構造を有するドメインの内部にあるアミノ酸配列領域をいう。本発明のジンクフィンガーモジュールは、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールと同一の配列を有したり、野生型配列のうち、任意のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変形された配列を有する。前記野生型ジンクフィンガーモジュールは、任意の真核細胞、例えば、真菌細胞(例えば、酵母)、植物または動物細胞(例えば、ヒトやマウスのような哺乳動物細胞)から由来することができる。 好ましくは、本発明のジンクフィンガーモジュールは、ヒトなどから由来した図１に示されたアミノ酸配列を含む。
【００１７】
ジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガードメインは、それぞれ３ｂｐ(塩基対)の下部部位を認識する３つ以上のジンクフィンガーモジュールが直列に連結されている。それぞれのモジュールなどは、独立的にＤＮＡ配列を認識するから、３つまたは４つのモジュールから構成されたジンクフィンガードメインは、９または１２ｂｐ配列に結合することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、二量体として作用し、従って、３−４個のモジュールから構成されたジンクフィンガーヌクレアーゼ１対は、１８−２４ｂｐ配列を特異的に認識する。一つの具体的な例として、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガードメインが３つまたは４つ、好ましくは４つのジンクフィンガーモジュールから構成されている。また、一つの好ましい態様として、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼに含まれているジンクフィンガードメインは、好ましくはジンクフィンガーモジュールを含む。具体的な実施例において、３つのジンクフィンガーモジュールを含むジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的化された切断成功率が９．１％であるのに反して４つのジンクフィンガーモジュールを含むジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的化された切断成功率が２６％である。
【００１８】
ジンクフィンガードメインは、予め決まったヌクレオチド配列に結合するように加工され得る。ジンクフィンガー蛋白質操作方法の非制限的な例としては、設計(design)および選択である。設計されたジンクフィンガー蛋白質は、自然的に発生しない蛋白質であり、その設計および組成は、主に合理的な基準に応じて出る。設計のための合理的な基準としては、置換法則の適用および現存するＺＦＰ設計および結合データに関するデータベースを情報処理するコンピュータアルゴリズムを含む(大韓民国登録特許第０７６６９５２号参照)。選択されたジンクフィンガー蛋白質は、自然状態で発見されない蛋白質であり、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたは混成化選択のような実験過程を介して得られた結果物である。
【００１９】
前記加工されたジンクフィンガードメインを構成するジンクフィンガーモジュールのうち、最小限２つまたはそれ以上は、野生型ジンクフィンガーモジュールであるのが好ましく、より好ましくは、３つまたはそれ以上の野生型ジンクフィンガーモジュールを含む。一つの具体例において、本発明者らは、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼを従来のファージディスプレイまたは点突然変異によって操作され、分離されたジンクフィンガーヌクレアーゼから形成されたものなどに置換するモジュール交換分析を行った。その結果、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼがＳＳＡシステムおよびＴ７Ｅ１分析で明確な活性を示すことを発見した。従って、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、自然的に発生された野生型ジンクフィンガーモジュールを含むのが好ましい。本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたジンクフィンガードメインを含むのがより好ましい。また、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、従来の操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼとは異なり、ＧＮＮ−反復配列を標的化しない。具体例において、下記の表２に記載されたように、ＣＣＲ５配列を成功的に変形させた１６個のジンクフィンガーヌクレアーゼなどのうちから２つのジンクフィンガーヌクレアーゼ(Ｚ４３０Ｒ３およびＺ３０Ｆ４)がＧＮＮモチーフのない認識−部位(ハーフ−サイト(half-site))要素を認識し、１２個のジンクフィンガーヌクレアーゼがＧＮＮおよび非ＧＮＮモチーフなどの両方を含む部位を認識する反面、単に２つのジンクフィンガーヌクレアーゼ(Ｚ４２６Ｆ３およびＺ３６０Ｒ４)だけがＧＮＮ−反復部位を認識する。ＧＮＮ−反復配列でない部位を標的化できる能力は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術の有用性を大きく広めてあげる。
【００２０】
本発明の用語“切断”は、ＤＮＡ分子の共有結合基本骨格を切断することを意味し、“切断ドメイン”は、ＤＮＡ切断のための酵素活性を有するポリペプチド配列を意味する。
【００２１】
前記切断ドメインは、エンドまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを得ることができるエンドヌクレアーゼの非制限的な例としては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミング(homing)エンドヌクレアーゼがある。このような酵素などは、切断ドメインの供給源として使用され得る。また、単一鎖切断および二重鎖切断の両方が可能であり、二重鎖切断は、切断ドメインの供給源に応じて発生することができる。これに係って、二重鎖切断活性を有する切断ドメインを切断ハーフドメインとして使用され得る。但し、本明細書では切断ドメインを単一鎖切断および二重鎖切断に対して、混用して使用することができる。
【００２２】
切断ドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部分から由来することができる。一般的に、もし、融合蛋白質が二重鎖切断活性を有する切断ハーフドメインから構成されると、切断のために２つの融合蛋白質が必要である。２つの切断ハーフドメインは、同一のエンドヌクレアーゼ(または、その機能的な断片など)から由来することができ、または各切断ハーフドメインは、互いに異なるエンドヌクレアーゼ(または、その機能的な断片など)から由来することができる。さらに、各標的部位に２つの融合蛋白質が結合すると、切断ハーフドメインなどの相互間の空間的配向は、例えば、二量体化によって切断ハーフドメインなどが機能的な切断ドメインを形成するようにする。従って、すべての整数値のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの標的部位の間に介在することができる(例えば、２〜５０ヌクレオチドまたはそれ以上)。
【００２３】
一般的に、それぞれ切断ハーフドメインを含む２つの融合蛋白質を使用すると、各融合蛋白質のジンクフィンガー部分が互いに異なるＤＮＡ鎖上に逆方向に接触する。すなわち、一対のＺＦＰ／切断ハーフドメイン融合の場合、標的配列は、正反対のＤＮＡ鎖上に位置し、２つの蛋白質は逆方向に結合する。
【００２４】
制限エンドヌクレアーゼは、多くの種(species)に存在し、ＤＮＡ(認識部位)に配列特異性結合をすることができ、結合部位の近傍でＤＮＡを切断することができる。一部の制限酵素など(例えば、タイプＩＩｓ)は、認識部位から離れているＤＮＡを切断して分離可能な結合ドメインと切断ドメインを持つ。例えば、タイプＩＩｓ酵素であるＦｏｋＩは、１つの鎖上の認識部位から９ヌクレオチド離れた位置で、そして、他の一つの鎖上の認識部位から１３ヌクレオチド離れた位置でＤＮＡの二重鎖切断の触媒作用をする。従って、一つの具体例においては、融合蛋白質は、少なくとも１つのタイプＩＩｓ制限酵素から出た切断ドメイン(または、切断ハーフドメイン)と１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【００２５】
タイプＩＩｓ制限酵素の例としては、ＦｏｋＩ、ＡａｒＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＣｄｉＩ、ＣｊｅＰＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦｉｎＩ、ＭｂｏＩ、ｓａｐＩ、ＳｓｐＤ５１などがあるが、これに制限されるのではない。より具体的には、ロバーツらの文献［(２００３) Nucleic acid Res．31：418-420］を参照する。一つの具体例においては、ＴｙｐｅIIｓ制限酵素であるＦｏｋＩからＤＮＡ結合ドメインを分離して得たＦｏｋＩ切断ドメインを切断ドメイン(または、ハーフ切断ドメイン)として使用した。
【００２６】
本発明の融合蛋白質は、異なる２つ以上のポリペプチドをペプチド結合で連結して形成させたポリペプチドを意味する。前記ポリペプチドは、ジンクフィンガードメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含み、ヌクレオチド配列内の任意の標的部位を切断することができる。本発明において、融合蛋白質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＺＦＮと混用され得る。
【００２７】
融合蛋白質(または、融合蛋白質暗号化ポリヌクレオチド)を設計および製作する方法は、当該技術分野で広く知られている。一つの具体例において、ジンクフィンガードメインと切断ドメインを含む融合蛋白質を暗号化するポリヌクレオチドを製作した。前記ポリヌクレオチドは、ベクターに挿入されることができ、挿入されたベクターは、細胞内に導入され得る。一般的に、融合蛋白質(例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合)の構成要素などは、ジンクフィンガードメインが融合蛋白質のアミノ末端(Ｎ末端)の近傍に、切断ハーフドメインがカルボキシ末端(Ｃ末端)の近傍に位置するように配列されている。これは、ＦｏｋＩ制限酵素から由来したもののように、天然型切断ドメイン二量体にある切断ドメインの相対的位置と似ているが、この時、ＤＮＡ結合ドメインはアミノ末端の近傍に位置し、切断ハーフドメインはカルボキシ末端の近傍に位置する。
【００２８】
本発明において、“配列”とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る様々な長さのヌクレオチド配列を意味する；直線形、円形または枝形であることができ、単一鎖または二重鎖であり得る。
【００２９】
本発明において、“結合”とは、蛋白質と核酸どの間のような高分子間の配列特異的または非共有相互作用を意味する。相互作用が全体的に配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素などがＤＮＡ骨格のリン酸残基と接触することのように、配列特異的である必要はない。このような相互作用は、一般的に解離定数(Ｋｄ)値が１０−６Ｍ−１以下であるのが特徴である。また、“親和度”とは、結合力を意味し、結合親和度の増加は、解離定数(Ｋｄ)の減少と関連している。
【００３０】
他の一つの態様として、本発明は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを１対以上含み、標的化関心領域内でＤＮＡ配列の切断、交替または変更のための組換えキットに関するものである。
【００３１】
一般的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)は、二量体として作用するから、１つのＤＮＡ部位を標的化するためには、２つのＺＦＮ単量体を用意するのが必要である。ＺＦＮ対を構成する２つのＺＦＮ単量体のそれぞれは、５〜６ｂｐのスペーサー配列によって分離されている２つの９または１２ｂｐの２つのハーフ部位のうち、１つに結合する。１つのハーフ部位に対して同一または類似のＤＮＡ結合特異性を有した異なるセットのＺＦなどから構成された多重単量体ＺＦＮを製作することができる。１つの具体例において、同一または異なるジンクフィンガードメインから構成されたＺＦＮ対が表２に示されているが、これに限定されるのではない。前記単一部位は、様々な組み合わせのＺＦＮ対によって標的化され得る。
【００３２】
本発明において使用された用語“交替”とは、１つのヌクレオチド配列が他のヌクレオチド配列に交替されること(すなわち、情報を持ったセンス配列の交替)を意味し、必ず１つのポリヌクレオチドが他のポリヌクレオチドに化学的または物理的に交替されることを意味するのではない。本発明において使用された用語“変更”とは、突然変異または非相同末端連結によるＤＮＡ配列内の変化を意味する。前記の突然変異は、点突然変異、置換、欠失、挿入などを含む。前記交替または変更は、不完全な遺伝情報を有するヌクレオチドを完全な遺伝的情報を有するヌクレオチドに交替または変更させ得る。また、このような突然変異によってヌクレオチド配列にエンコードされたペプチドが機能的に不活性化することもできる。このような方式によって、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、遺伝子治療法手段として使用され得る。一つの具体例において、ヒト免疫欠乏ウイルス(ＨＩＶ)が標的細胞を感染するのに使用される主要共同受容体であるＣＣＲ蛋白質をコードするケモカイン(C-C motif)受容体５(ＣＣＲ５)遺伝子をＺＦＮが欠失させ得ることを確認した。
【００３３】
例えば、細胞、核酸、蛋白質またはベクターに対して言及しながら使用される時、“組換え”は、細胞、核酸、蛋白質またはベクターが異種性核酸または蛋白質の導入、または天然核酸または蛋白質の変更によって変形されたり、または細胞がそのように変形された細胞から由来されたことをいう。従って、例えば、組換え細胞は、天然(自然発生)形の細胞内で発見されない遺伝子を発現したり、または、正常的または非正常的に発現される２次コピーの天然遺伝子を発現したり、または全く発現しない。
【００３４】
他の一つの態様として、本発明は、（ａ）関心領域内のヌクレオチド配列を選択する段階；（ｂ）前記配列に結合するジンクフィンガーモジュールを選択し、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含みながら、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来したものであるジンクフィンガードメインを工学的に製造する段階；（ｃ）前記工学的に製造されたジンクフィンガードメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含む融合蛋白質を発現させる段階を含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法に関するものである。
【００３５】
本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼを製造する方法において、前記（ａ）段階は、関心領域内のヌクレオチド配列を選択する段階である。前記ヌクレオチド配列は、細胞の内または外に存在することができ、その長さは制限がない。また、前記ヌクレオチド配列は、線形または円形、単一鎖または二重鎖の形態であり得る。
【００３６】
前記（ｂ）段階は、関心領域内のヌクレオチド配列と結合するジンクフィンガーモジュールなどを選択し、ジンクフィンガードメインを工学的に製造する段階である。前記ジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、２つ以上のジンクフィンガーモジュールは、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来するのが好ましく、より好ましくは、図１に示されたジンクフィンガーモジュールから由来し、より好ましくは、図２に示されたジンクフィンガーモジュールから由来する。
【００３７】
前記（ｃ）段階は、ジンクフィンガードメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含む融合蛋白質を発現させる段階である。前記発現は、生体内または生体外の発現を含む。生体内の発現は、当該分野で知られた方法を用いて行うことができ、例えば、ベクターを用いる方法である。前記ベクターの例として、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクターおよびウイルスベクターなどがあるが、これに制限されない。適した発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーのような発現調節要素の他にも分泌シグナル配列などを目的に応じて含み、様々に製造され得る。
【００３８】
他の一つの態様として、本発明は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて関心領域内の細胞染色質を切断する方法に関するものである。
【００３９】
一つの具体的態様として、本発明は（ａ）関心領域内の第１のヌクレオチド配列を選択する段階；（ｂ）第１のヌクレオチド配列と結合する本発明の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを選択する段階；（ｃ）前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを前記ヌクレオチド配列を有する細胞内で発現させたり、前記細胞外で発現させて前記細胞内へ導入させる段階；および（ｄ）(細胞内で発現されたり、細胞内に導入された)第１のジンクフィンガーヌクレアーゼが前記配列と結合して前記関心領域内で細胞染色質を切断する段階を含む関心領域内の細胞染色質切断方法である。
【００４０】
本発明の前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来したものである。
【００４１】
他の一つの具体的な態様として、本発明は、（ａ）関心領域内の第１のヌクレオチド配列を選択する段階；（ｂ）第１のヌクレオチド配列と結合する本発明の第１のジンクフィンガドメインおよび第１のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを選択する段階；（ｃ）第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを前記ヌクレオチド配列を有する細胞内で発現させたり、前記細胞外で発現して前記細胞内へ導入させる段階；および（ｄ）(細胞内で発現されたり、細胞内に導入された)第１のジンクフィンガーヌクレアーゼが前記配列と結合させて前記関心領域内の細胞染色質を切断させる段階；（ｅ）第２のジンクフィンガードメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む本発明の第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを選択し、前記ヌクレオチド配列を有する細胞内で発現させたり、細胞外で発現して前記細胞内へ導入させる段階；（ｆ）(細胞内で発現されたり、導入された)第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを、前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼが結合する第１のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れている関心領域内の第２のヌクレオチド配列と結合させる段階を含む関心領域内の細胞染色質切断方法である。
【００４２】
本発明において“染色質”は、細胞のゲノムを構成する核蛋白質の構造を意味する。細胞の染色質は、核酸、主にＤＮＡ、そして、ヒストンおよび非ヒストン系染色体蛋白質を含んだ蛋白質を含む。細胞染色質は、原核細胞、真核細胞(例えば、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞)を含むすべての形態の細胞内に存在することができる。大部分の真核細胞染色質は、ヌクレオソームの形態で存在するが、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４のそれぞれ２つで構成された八量体と結合された略１５０塩基対のＤＮＡを含み、(有機体に応じて長さが様々な)リンカーＤＮＡがヌクレオソームコアの間に拡張されている。ヒストンＨＩ分子は、一般的にリンカーＤＮＡと結合されている。本発明の目的上、用語“染色質”は、すべての形態の細胞核蛋白質、原核および真核いずれも含む意味として使用される。細胞の染色質は、染色体およびエピソームの染色質のすべてを含む。前記“染色体”は、細胞のゲノムの全部または部分を含む染色質複合体をいう。前記“エピソーム”は、複製性核酸、核蛋白質複合体または細胞の染色体核型の一部でない核酸を含む他の構造体である。例としては、プラスミドおよびウイルス性ゲノムがある。
【００４３】
他の一つの具体的な態様として、本発明は、（ａ）関心領域を選択する段階；（ｂ）前記関心領域内の第１のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを提供する段階；（ｃ）前記第１の配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れている関心領域内の第２のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；（ｄ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第１のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で同時または、分離して発現させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在するジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガドメインは、前記第１のヌクレオチド配列と結合し、前記第２のジンクフィンガードメインは、前記第２のヌクレオチド配列と結合し、前記結合によって前記ヌクレオチド切断ドメインを位置させて関心領域内の前記細胞染色質を切断させる、関心領域内の細胞染色質切断方法に関するものである。
【００４４】
本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた標的化された切断の場合、ジンクフィンガードメインの結合部位は、切断部位を含むことができたり、結合部位の端が切断部位から１〜５０ヌクレオチド離れて位置することができる。切断部位をマッピングする方法は、当該技術分野で広く知られている。
【００４５】
通常ＤＮＡが切断される部位は、２つの融合蛋白質の結合部位の間に存在する。ＤＮＡ二重鎖の切断は、２つの単一鎖切断または１、２、３、４、５、６または、それ以上のヌクレオチドなどがオフセットされた“ニック”の結果物である。例えば、天然型ＦｏｋＩ制限酵素による二重鎖ＤＮＡの切断は、４つのヌクレオチドがオフセットされた単一鎖切断の結果物である。従って、切断は、必ず各ＤＮＡ鎖上に正確な反対側で生じる必要はない。さらに、融合蛋白質の構造と標的部位との間の距離は、切断が１つのヌクレオチド対の近傍で生じるかどうか、または色々な部位で生じるかどうかに影響を及ぼすことができる。
【００４６】
本発明において、“標的部位”は、ジンクフィンガードメインによって認識される核酸配列である。単一標的部位は、一般的に約６または約１２塩基対を有する。一般的に、３つのジンクフィンガーモジュールを有するジンクフィンガー蛋白質は、２つの隣接した６〜１０塩基対の標的部位を認識し、４つのジンクフィンガーモジュールを有するジンクフィンガー蛋白質は、２つの隣接した９〜１２塩基対の標的部位を認識する。用語“隣接した標的部位”は、０〜約５塩基対まで離れている非重複標的部位を意味する。
【００４７】
前述したように、融合蛋白質は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド形態で導入され得る。例えば、それぞれ前述したポリペプチドなどのうちの１つを暗号化する配列を含む２つのポリヌクレオチドが細胞内に導入されることができ、切断は、標的配列の近傍で生じる。または、２つのポリペプチドすべてを暗号化する配列を含む１つのポリヌクレオチドが細胞内に導入され得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよび／またはＲＮＡの任意の変異体または類似体であり得る。
【００４８】
他の一つの態様として、本発明は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列を交替する方法に関するものである。
【００４９】
一つの具体的な態様として、本発明は、細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列交替方法であって、（ａ）関心領域内で９個以上のヌクレオチドを含む第２のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを工学的に製造する段階；（ｂ）前記第２のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れて位置し、９個以上のヌクレオチドを含む第３のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；（ｃ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第３のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる段階；（ｄ）前記細胞を前記第１のヌクレオチド配列と相同性があるが同一ではない第４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに接触させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの１つ以上は、自然界に存在するジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第２配列の結合および前記第２のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第３配列の結合によって切断ドメインを位置させ、前記細胞染色質が関心領域内で切断され、これによって前記第１のヌクレオチド配列と前記第４のヌクレオチド配列との間の相同組換えを容易にして前記第１のヌクレオチド配列を前記第４のヌクレオチド配列に交替することを特徴とする方法に関するものである。
【００５０】
本発明は、標的化された組換え効率を高め、非特異的な挿入頻度を減少させることを特徴とする標的化された配列変更方法を提供する。細胞ＤＮＡの二重鎖切断は、切断部位の近傍で数千倍程度の相同組換えを刺激するため、このような標的化された切断は、実質的にゲノムのどんな部位でも(相同組換えを介して)配列の変換または置換を可能にする。
【００５１】
選択されたゲノム配列の標的化された置換は、融合蛋白質(ジンクフィンガーヌクレアーゼ)だけでなく、ドナー配列を必要とする。ドナー配列は、融合蛋白質(など)の発現以前、同時または以後のいつでも細胞内に導入され得る。ドナー配列は、通常置換するゲノム配列と同一ではないことが明確である。例えば、相同組換えができる十分な相同性を有している限り、ドナーポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列に対して１つの塩基変化、挿入、欠乏、逆位、または再配列のうちから１つまたはそれ以上を含むことができる。また、ドナー配列は、類似する２つの相同性に接している非相同配列を含むことができる。さらに、ドナー配列は、細胞染色質の関心領域と相同性のない配列を含むことができる。
【００５２】
また、前記の方法において、第１のヌクレオチド配列は、遺伝子内に突然変異を含む配列が好ましいかもしれない。この場合、ドナー配列、特に、第４のヌクレオチド配列は、前記遺伝子の野生型配列であるのが好ましい。前記の突然変異は、点突然変異、置換、欠失または挿入などであり得る。
【００５３】
また、他の一つの具体的な態様として、本発明は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列を変更する方法を提供する。
【００５４】
具体的に、本発明は、細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列変更方法であって、（ａ）関心領域内の９個以上のヌクレオチドを含む第２のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを工学的に製造する段階；（ｂ）前記第２のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れて位置し、９個以上のヌクレオチドを含む第３のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；（ｃ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第３のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの１つ以上は、自然界に存在するジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第２配列の結合および前記第２のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第３配列の結合によって切断ドメインを位置させ、前記細胞染色質を関心領域内で切断させ、前記切断部位で前記第１のヌクレオチド配列を変更させることを特徴とする方法に関するものである。
【００５５】
本発明において、１つまたは２つ以上のＺＦＰまたはＺＦＰ融合蛋白質を暗号化する核酸は、複製および発現のために原核細胞または真核細胞へ形質転換させる発現ベクターにクローニングされ得る。ベクターは、例えば、プラスミド、シャトルベクター、昆虫ベクターなどの真核ベクターまたは原核ベクターを含む。ＺＦＰを暗号化する核酸は、また発現ベクターにクローニングされて植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞またはヒト細胞、菌類細胞、細菌細胞または原生動物細胞に導入され得る。
【００５６】
発現ベクターは、宿主細胞で特定の核酸の転写、および選択的に宿主細胞で発現ベクターの統合または複製が可能にする一連の特性化された核酸要素などであって、組換えまたは合成を介して生成された核酸作製物である。発現ベクターは、ウイルスまたは非−ウイルス起源のプラスミド、ウイルスまたは、核酸断片の部分であり得る。一般的に、発現ベクターは、“発現カセット”を含み、これはプロモーターに作動可能に連結され、転写される核酸を含む。また、発現ベクター用語は、プロモーターに作動可能に連結されたネイキッド(naked)ＤＮＡを含む。
【００５７】
クローンされた遺伝子または核酸を発現させるために、ＺＦＰまたはＺＦＰ融合蛋白質を暗号化する配列は、一般的に転写を誘導するプロモーターを有したベクターにサブクローニングされる。適した細菌性プロモーターまたは原核プロモーターは、当該分野で広く知られている。
【００５８】
用語“作動可能に連結された”は、核酸発現調節配列(プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイなど)と第２の核酸配列との間の機能的結合を意味する。
【００５９】
本発明において、“宿主細胞”は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または選択的にジンクフィンガーヌクレアーゼをコード化する発現ベクターまたは核酸を含有する細胞を意味する。宿主細胞は、一般的に発現ベクターの複製または発現をサポートする。宿主細胞は、エシェリキア・コリのような原核細胞、または真核細胞、例えば、酵母、真菌、原生動物、高等植物、昆虫細胞、または両生類細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ２９３、ＣＯＳ−１、ＨＥＫのような哺乳類細胞、例えば、培養された細胞(試験管内)、移植片および１次培養物(試験管内および生体外)、および生体内細胞であり得る。
【００６０】
“核酸”は、単一または二重鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらの重合体を意味する。この用語は、公知のヌクレオチド類似体または、変形された骨格残基または、結合を含有する核酸を含み、これは合成的、自然発生的、および非−自然発生的なことがあり、基準核酸と類似する結合特性を有する。このような類似体の例は、制限なく、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(ＰＮＡ)などを含む。
【００６１】
用語“ポリペプチド”、“ペプチド”および“蛋白質”は、本明細書において、相互交換されて使用され、アミノ酸残基の重合体を意味する。また、この用語などは、自然発生アミノ酸重合体および非−自然発生アミノ酸重合体だけでなく、１つ以上のアミノ酸残基が相応する自然発生アミノ酸の人工化学的擬態体であるアミノ酸重合体にも適用する。
【００６２】
用語“アミノ酸”は、自然発生および合成アミノ酸だけでなく、自然発生アミノ酸と類似する方式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸擬態体を意味する。 自然発生アミノ酸は、遺伝コードによってコード化されるものなどだけでなく、後で変形されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンを含む。アミノ酸類似体は、自然発生アミノ酸と基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合されたα−炭素が同一の化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を含む。そのようなアミノ酸類似体は、変形されたＲ基(例えば、ノルロイシン)または、変形されたペプチド骨格を有するが、自然発生アミノ酸と同一の基本的な化学構造を維持する。アミノ酸擬態体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持つが、自然発生アミノ酸と類似する方式で機能する化学的化合物を意味する。
【００６３】
本発明において、アミノ酸は、通常的に公知された３−文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法協約によって推薦された１−文字記号で表現され得る。同様に、ヌクレオチドも通常的に承認された単一の文字コードによって表現され得る。
【００６４】
以下、本発明を実施例を介してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例
実施例１：ＺＦＮ設計およびＺＦＮ−含有プラスミドの製作
３−または、４−フィンガー配列(arrays)をエンコードするＤＮＡ断片などは、“Human zinc fingers as building blocks in the construction of artificial transcription factor”(Bae，K.H．et al．Nat Biotechnol 21，275-280(2003))に記載された方法によって組み立てた。これらの３−または、４−フィンガー配列などのうちから様々なＤＮＡ結合特異性を有した５４個のジンクフィンガーモジュール(以下、ＺＦモジュールという)を選択した。選択されたＺＦモジュールおよびこのアミノ酸配列を図１および図２に示した。選択された５４個のＺＦモジュールのうち、３１個のＺＦモジュールは、ヒトゲノムにあるＤＮＡ配列から由来したものであり、２つのＺＦモジュールは、ショウジョウバエ(Drosophila)ゲノムにあるＤＮＡ配列から由来したものである(図１)。前記のヒトおよびショウジョウバエから由来したＺＦモジュールは、トルゼン(ToolGen)モジュールと便宜上、称する。その他の２１個のＺＦモジュールは、ファージディスプレイ技術を使用したＺＦ変異体などのライブラリー(バルバスモジュール)から選択したり、部位特異的突然変異技術によって製作された(サンガモモジュール)。
【００６５】
次に、マルチ−フィンガーＺＦＮの設計のために、トルゼンで開発したコンピュータアルゴリズムを使用してヒトケモカイン(Ｃ−Ｃモチーフ)受容体５(ＣＣＲ５)コード部位のＤＮＡ配列にある可能性のあるＺＦＮ標的部位を探索した。その探索結果に基づいて、本発明者らは前記５４個のＺＦモジュールを組み合わせた２０８個のジンクフィンガー蛋白質単量体を合成し、代表的なＺＦＮ対のアミノ酸配列を図２に示した。総体的に、これら３１５個のＺＦＮ対でＣＣＲ５遺伝子内３３個の部位などを標的化しようとした(図３参照)。
【００６６】
３または４つのＺＦモジュールから構成されたジンクフィンガードメインをフラボバクテリウム・オケアノコイテス(Flavobacterium okeanokoites)ゲノムＤＮＡから由来したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインに統合させ、統合された配列をｐｃＤＮＡ３．０プラスミド(インビトロジェン)の改造されたバージョンであるｐ３クローニングベクタープラスミド内にクローニングした。
【００６７】
実施例２：ＺＦＮ活性の試験管内(in vitro)および生体内(invivo)分析
２−１．試験管内遺伝子消化分析
先ず、試験管内転写と翻訳(in vitro transcription and translation；ＩＶＴＴ)システムを使用してＺＦＮを準備し、ＣＣＲ５コード配列を含むＤＮＡ断片と共に培養して試験管内制限酵素としての活性を分析した。具体的に、TnT-Quick coupled transcription/translation system(プロメガ)を製作者の使用説明書に記述された方法(in vitro transcription and translation；ＩＶＴＴ)を使用して前記実施例１で設計したＺＦＮｓを試験管内を転写および翻訳した。簡略に、ＺＦＮｓを暗号化するプラスミド(各０．５μｌ)をTnT Quick master mix(２０μｌ)および１ｍＭメチオニン(０．５μｌ)に添加した後、３０℃で９０分間培養した。ＣＣＲ５コード配列を含む標的プラスミドは、制限酵素を処理して線形化した後、標的プラスミド(１μｇ)を前記ＺＦＮ ＩＶＴＴ分解物(それぞれ１μｌ)と共にＮＥＢｕｆｆｅｒ４(New England Biolabs)で３７℃、２時間培養させて消化させた。この反応混合物を６５℃の熱で不活性化させた後、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液を使用してアガロースゲル分析を行った。図４は、前記の分析過程を簡略に示したものであり、その実験結果は図５に示されている。
【００６８】
図５に示すように、多くのＺＦＮ対など(４０％)が標的ＤＮＡを効果的に部位−特異的に切断した。
【００６９】
２−２：単一鎖アニーリングシステム
本発明者らは、哺乳動物細胞基盤の単一鎖アニーリング(ＳＳＡ)システムを使用してＺＦＮｓがヒト細胞で相同組換えを誘導することができるかどうかを試験した。
【００７０】
２−２−１．細胞−基盤分析に使用されるレポータープラスミド
ホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’−部分を下記表１のプライマー１と２を使用してｐＧＬ３−対照群(プロメガ)から増幅し、増幅された産物をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ(インビトロジェン)のＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位内にクローニングした。下記表１のプライマー３と４を使用して増幅したルシフェラーゼ遺伝子の５’−部分を前記クローニング結果物のプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位内に連続的にクローニングした。Ｉ−ＳｃｅＩ結合部位を下記表１のプライマー５と６を使用してレポータープラスミドのＢａｍＨＩ部位内にクローニングした。プライマー７と８を使用して増幅したＣＣＲ５コード塩基配列をレポータープラスミドのＢａｍＨＩ部位内にクローニングした。
【００７１】
【表１】
【００７２】
２−２−２．細胞培養およびレポーター細胞株の設立
前記実施例１でＺＦＮコード配列を有するプラスミドで形質転換させたＨＥＫ２９３Ｔ／１７(ATCC，CRL-11268TM）細胞とＦｌｐ−ＩｎＴＭＴ−ＲＥＸＴＭ２９３細胞(インビトロジェン)を１００units／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸と１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)が添加されたダルベッコ修正イーグル培地(ＤＭＥＭ)で培養した。破裂したルシフェラーゼ遺伝子をエンコードするレポータープラスミドを製作者説明書に応じてＦｌｐ−ＩｎＴＭＴ−ＲｅｘＴＭ２９３細胞内に安定的に統合させた。要約すると、細胞をレポータープラスミドとｐＯＧ４４、Ｆｌｐ組換え酵素発現ベクターに形質転換させ、ハイグロマイシンＢを使用して選別した。破裂したルシフェラーゼ遺伝子を有しているクローン細胞株を確認し、ＳＳＡ分析に使用した。
【００７３】
２−２−３．ＳＳＡシステムを使用した細胞−基盤分析
９６−ウェルプレート型の各ウェル当り３０，０００個のレポーター細胞内に各対のＺＦＮ発現プラスミド(それぞれ１００ｎｇ)をリポフェクタミン２０００(インビトロジェン)を使用して形質導入させた。４８時間後、ドキシサイクリン(１μｇ／ｍｌ)と共に培養してルシフェラーゼ遺伝子を誘導させた。２４時間培養後に、細胞を２０μｌの１Ｘ分解緩衝溶液(プロメガ)で溶解させ、２μｌの細胞分解物に１０μｌのルシフェラーゼ分析試薬(プロメガ)を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。
【００７４】
２−２−４．結果
ＺＦＮｓを暗号化したプラスミドをヒト胎児腎臓細胞(ＨＥＫ細胞)に形質導入させた。ＣＣＲ５配列の挿入によって破壊されたホタルルシフェラーゼ遺伝子がゲノムに安定に統合され、部分的に複製された。効果的なＺＦＮｓは、ＣＣＲ５配列内に二重鎖切断(ＤＳＢ)を生じるはずであり、ＳＳＡを介して機能的なルシフェラーゼ遺伝子に復旧できるようにする。ＺＦＮｓによるＤＮＡ切断効率は、ルシフェラーゼ酵素活性によって測定できる。高効率性のメガヌクレアーゼであるＩ−ＳｃｅＩを陽性対照群として使用した。前記実験過程を図６に示し、その具体的な実験結果を図７で示した。
【００７５】
図７に示すように、多くのＺＦＮ対などが相当のルシフェラーゼ活性を示した。３１５個のＺＦＮ対のうち、２３個対は、陽性対照群Ｉ−ＳｃｅＩ対比１５−５７％のルシフェラーゼ活性を示した。１５％より低い活性を示したＺＦＮ対なども細胞内で二重鎖切断を誘導することができるが、本発明者らは、非常に高い酵素活性を示した２３対に重点を置いてさらなる研究を進行した。２３個のＺＦＮ二量体などは、ＣＣＲ５と関連のないＤＮＡ配列によって破壊された部分的に複製されたルシフェラーゼ遺伝子を有したゲノムを保有する標的無しレポーター細胞を使用した時、明らかなルシフェラーゼ活性を示さなかった(実験結果は、図示せず)。本結果を介してＺＦＮ−媒介性ＤＮＡ復旧は、ＣＣＲ５−特異性ということを示唆する。
【００７６】
実施例３：ＺＦＮなどで処理したＨＥＫ２９３細胞における突然変異の検出
ＩＶＴＴ分析でエンドヌクレアーゼ活性を示し、細胞−基盤分析でルシフェラーゼ活性を誘導させたＺＦＮｓが細胞で内因性の標的配列を修正できるかどうかを調査した。ＺＦＮｓによって誘導された二重鎖切断は、エラー発生しやすい非相同末端連結(ＮＨＥＪ)によって復旧され得る。結果産物であるＤＮＡは、たびたびＤＳＢ部位の近くに小さい挿入または欠失(挿入−欠失突然変異)を含む。挿入欠失(indel)突然変異などは、増幅されたＤＮＡ断片などを不一致−敏感性Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ(Ｔ７Ｅ１)で処理して検出することができた(図８参照)。
【００７７】
具体的に、９６−ウェルプレートで前−培養したＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞をＺＦＮ対(それぞれ１００ｎｇ)を暗号化した２つのプラスミドでリポフェクトアミン２０００(インビトロジェン)を使用して形質導入させた。培養７２時間後、製作者説明書に記載されたようにＧ−ｓｐｉｎＴＭ遺伝体ＤＮＡ抽出キット(iNtRON BIOTECHNOLOGY)を使用してＺＦＮ−形質導入された細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。ＺＦＮ標的部位を含むゲノムの部分を増幅し、溶かし且つアニーリングしてヘテロ接合ＤＮＡを形成した。Ｚ３０部位のためにプライマー９と１２を使用し、Ｚ２６６とＺ３６０部位のためにプライマー１０と１２、Ｚ４１０、Ｚ４２６とＺ４３０部位のためにはプライマー１１と１２、Ｚ８３６とＺ８９１部位のためのプライマー１３と１４を使用した(表１参照)。アニーリングされたＤＮＡを３７℃で１５分間５unitsのＴ７エンドヌクレアーゼ１(New England BioLabs)で処理した後、２．５倍体積のエタノールを添加して沈殿させた。沈殿されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分析した。その結果を図９に示した。
【００７８】
図９に示すように、ＺＦＮが処理された細胞から増幅されたＤＮＡの小さい断片などをＴ７Ｅ１で切断した。各ＺＦＮ対は、ＺＦＮなどが８個の異なる部位などを標的化する事実を反映する特有の切断パターンを形成した。さらに、結果として出た、ＤＮＡバンドなどのサイズは予想したところようであった。Ｔ７Ｅ１分析で試験した２３個のＺＦＮ対のうちで、２１個のＺＦＮ対は予想したサイズを有した検出可能なＤＮＡバンドなどを示した(実験結果は、図示せず)。
【００７９】
また、本発明者らは、ＩＶＴＴ分析で明確なエンドヌクレアーゼ活性を示さなかったり、細胞−基盤ＳＳＡシステムで意味のあるルシフェラーゼ活性を示さなかった代表的なＺＦＮ対を試験するためにＴ７Ｅ１分析を使用したが、ＩＶＴＴ試験は行わなかった。Ｔ７Ｅ１分析結果、いずれのＺＦＮ対も検出可能な水準でＤＮＡ突然変異を誘導しなかった。
【００８０】
実施例４：ＺＦＮなどによって誘導された突然変異に対するＤＮＡ配列の分析
本発明者らは、ＣＣＲ５遺伝子内の他の部位をそれぞれ標的化する代表的なＺＦＮ対８個を選択して付加的な研究を行った(表２参照)。先ず、任意の個別的な８個のＺＦＮなどがホモ二量体として機能できるかどうかを検査した。単独ＺＦＮ単量体それぞれの遺伝子標的化活性度をＴ７Ｅ１分析を使用して評価した。予想した通りに、ＺＦＮ単量体などのうち、いずれも検出可能なＤＮＡ切断を生じなかった(実験結果は、図示せず)。
【００８１】
【表２】
【００８２】
本発明者らは、標的化された領域のＤＮＡ配列を確認してＺＦＮなどによって誘導された突然変異などを確認し、突然変異発生率を測定した。８個のＺＦＮ対のそれぞれに形質導入された細胞などから増幅されたＤＮＡをクローニングし、配列を確認した。様々な挿入および欠失などがＤＳＢ部位近傍で観察された(図１０〜１４参照)。これらの突然変異パターンなどは、エラー発生しやすいＮＨＥＪ−連関突然変異の表示として、これらと類似するパターンなどが他の文献によって報告されたことがある(Bibikova, M., Golic, M., Golic, K.G. & Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophilausing zinc-finger nucleases. Genetics 161, 1169-1175 (2002); Morton, J., Davis, M.W., Jorgensen, E.M. & Carroll, D. Induction and repair of zinc-finger nuclease-targeted double-strand breaks in Caenorhabditiselegans somatic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 16370-16375 (2006); Santiago, Y. et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proc Natl Acad Sci U S A105, 5809-5814 (2008))。小さい部分の挿入−欠失突然変異および置換に加えて、本発明者らは、２つのＺＦＮ対(図１１のＺ３０と、図１２のＺ３６０参照)により相対的に大きい挿入など(それぞれ互いに異なる８１ヌクレオチド)を観察した。ＤＮＡ配列分析によれば、挿入された配列などがＺＦＮなどを暗号化したプラスミドから出たことが明らかになった。
【００８３】
区別される部位などを標的化する８個のＺＦＮ対は、突然変異率が２．４％から１７％に示され(図１５参照)、この時、突然変異率は、突然変異クローンの数を分析された全体クローンの数で割って計算した。ＺＦＮ誘導突然変異の高い効率性は、ただ１０個〜１００個の単一細胞由来のコロニーなどをスクリーニングしてクローニングされた突然変異細胞を分離できるということを示唆する。
【００８４】
実施例５：ＺＦＮ処理後のクローン細胞の分離
５−１．本発明のＺＦＮの非標的化(off-target)効果
他の研究者らの先行研究に示されたように(Szczepek, M. et al. Structure-based redesign of the dimerizationinterface reduces the toxicity of zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol25, 786-793 (2007); Miller, J.C. et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat Biotechnol25, 778-785 (2007))、あるＺＦＮなどは、非標的化(off-target)効果を持って哺乳動物細胞で発現させた時に細胞毒性を示す。しかし、本発明者らは、本発明のＺＦＮなどで形質転換されたＨＥＫ２９３細胞で明確な成長遅延が観察されなかった。しかし、初期に制限された数の単一細胞コロニーなどをスクリーニングした時、ＺＦＮ処理によってゲノム配列が修正されたクローン性突然変異細胞などを分離することができなかった。このような事実は、ＺＦＮによって誘導された突然変異を保有した哺乳類細胞の成長が損傷されたことを示す。
【００８５】
従って、本発明者らは、ＺＦＮ−誘導突然変異を有する哺乳類細胞の成長が損傷されて修正されない細胞に比べて顕著に成長が抑制されるかどうかを調査するために、ＺＦＮ形質導入の後、３日、６日、そして９日目になる日に細胞から分離したＤＮＡに対してＴ７Ｅ１分析を行った。その分析のために、Ｚ８９１対を選択し、図１６に示すように、切断されたＤＮＡの断片などは、３日目になる日に比べて６日目に顕著に減少し、ＺＦＮを処理した以後の９日目になる日では、ほとんど検出できなかった。このような結果は、ＺＦＮ媒介性突然変異は、細胞成長に細胞毒性効果を持っていることを示唆する。
【００８６】
５−２．本発明のＺＦＮヘテロ二量体の非標的化(off-target)効果
ＺＦＮなどの非標的化(off-target)効果は、主に、ヘテロ二量体およびホモ二量体の両方を形成するＺＦＮなどの活性によって引き起こされる。このような効果は、ホモ二量体を形成できず、ヘテロ二量体だけを形成するＦｏｋＩヌクレアーゼ変形体を使用することによって、顕著に減少させ得た。従って、ＺＦＮｓの細胞毒性効果を減少させるために、本発明者らは、いわゆる強制的なへテロ二量体(obligatory heterodimers)を２つの異なる類型で準備(図１６で“ＲＲ／ＤＤ”二量体などと、“ＫＫ／ＥＬ”二量体などとして示した)し、Ｔ７Ｅ１分析を行った。Ｔ７Ｅ１分析結果、細胞がＲＲ／ＤＤＺＦＮ対に形質転換される時、切断されたＤＮＡ断片などがＺＦＮ処理９日以後でも維持されたこととして明らかになった。強制的なへテロ二量体ＺＦＮの減少した細胞毒性が細胞内ＤＮＡ切断特異性強化によるものであるということを確認するために、本発明者らは、ＺＦＮを処理した細胞でＤＳＢ個数をＤＳＢにリクルートされる蛋白質である５３ＢＰ１に対する抗体を使用して分析した。具体的に、５３ＢＰ１に対する核内染色をＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞で行った。カバー(ＮＵＮＣ)が装着されたＬａｂ−Ｔｅｋのチャンバースライドを使用して細胞を付着させ、３．７％ホルムアルデヒドで固定させてスライドを準備した。続いて、常温(RT)で１０分間ＰＢＳ(phosphate-buffered saline)内０．２％トリトンＸ−１００で処理することによって、細胞を透過性があるように作った。続いて、細胞を５％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)の存在下で抗−５３ＢＰ１ウサギポリクローナル抗体(Bethyl Laboratories)とインキュベーションして非特異的染色を遮断させ、続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−接合された二次抗体(インビトロジェン−Molecular Probes)とインキュベーションした。スライドをＤＡＰＩ(シグマ)存在下で搭載して細胞核を対比染色し、免疫蛍光顕微鏡(Carl Zeiss−LSM510)で検査した。その結果を図１７および１８に示した。図１７および１８に示すように、ＲＲ／ＤＤＺＦＮ対で処理した細胞で、対応する野生型ＺＦＮ対で処理した細胞と比較した時、５３ＢＰ１フォーカスなど(foci)の数が顕著に減少した。
【００８７】
５−３．ＺＦＮで処理したゲノムでの突然変異確認
次に、９６−ウェルプレートで分離成長させた２２５個の単一細胞コロニーをスクリーニングした後、Ｚ８９１ＲＲ／ＤＤＺＦＮ対を用いて７個の互いに異なる突然変異クローンＨＥＫ２９３細胞などを分離した。本発明者らは、これらのクローン細胞内のＣＣＲ５領域などのＤＮＡ塩基配列を分析してＺＦＮ−誘導ゲノム修正を確認した。修正された細胞でゲノムのＤＮＡ塩基配列を分析した結果、これら７個のクローンなどのうち、６個のクローンではＣＣＲ５対立遺伝子のうち、一ヶ所で欠失あるいは挿入が生じられ、他の１つのクローンは、２つの対立遺伝子で修正が示された(図１９参照)。２９３細胞の遺伝体は、部分的に３つの染色体を示すからＣＣＲ５遺伝子が３つ存在する。２つのＣＣＲ５対立遺伝子の両方で修正されたクローンで１つの修正されなかった野生型配列が観察された(図１９参照)。ＺＦＮ処理によって対立遺伝子２つを修正できるということは、選択マーカーを使用せず単一段階でホモ接合ノックアウト細胞を分離できるということを示唆する。
【００８８】
実施例６：ホモＣＣＲ２部位でＣＣＲ−５標的化ＺＦＮなどの非標的化(off-target)効果
ＣＣＲ２遺伝子は、ＣＣＲ５遺伝子と非常に高い相同性を有しており、多くのＣＣＲ５ＺＦＮ認識要素などがＣＣＲ２部位でも保存されている。従って、本発明者らは、ＣＣＲ５部位に対して設計された８個のＺＦＮなどがＣＣＲ２部位での相同性または同一配列も変異させ得るかどうかを検査した。ＣＣＲ２遺伝子にある同一の認識要素などを持っている３つのＺＦＮ対(Ｚ３６０、Ｚ４１０とＺ４３０)は、Ｔ７Ｅ１分析で効果的な遺伝体修正を誘導することができた(図２０参照)。ＣＣＲ２遺伝子の場合、Ｚ８９１対の認識要素はＣＣＲ５遺伝子の相応する部分と完璧に一致し、１つの塩基が不一致する１２−ｂｐハーフ部位(half-site)から構成されている。予想した通りに、Ｚ８９１対は、またＣＣＲ２部位で相当な遺伝子標的化活性を示した。また、本発明者らは、ＣＣＲ２部位内の認識要素が各１２−ｂｐハーフ部位(half-site)で１つの塩基が不一致するサンガモ社のＣＣＲ５標的化ＺＦＮ対を試験し、サンガモ社のＺＦＮは、相同性ＣＣＲ２部位で非標的化(off-target)ゲノム修正を示した(図２０参照)。一方、ＣＣＲ２部位で認識要素が２つ以上の不一致を示すＺＦＮ対(Ｚ３０、Ｚ２６６とＺ８３６)は、ＺＦＮ活性が観察されなかった。
【００８９】
また、本発明者らは、Ｚ８９１対にＨＥＫ２９３細胞を形質導入させて獲得した７個の突然変異クローン細胞が、意図したＣＣＲ５部位での突然変異に加えて高い相同性を有したＣＣＲ２部位のＤＮＡ塩基配列においても突然変異を誘導するかどうかを実験した。その結果を図２１に示した。図２０に示すように、Ｚ８９１対は、Ｔ７Ｅ１分析でＣＣＲ５部位だけでなく、ＣＣＲ２部分に対しても相当の遺伝子標的化活性を示したが、ＣＣＲ２部位はこれらのクローン細胞株などで変異が起きなかった。このような結果は、ＺＮＦ処理の後、細胞をスクリーニングしてただ意図した標的部位のみ変異が起きて、相同性部位では変異が起きない細胞を分離することができるということを立証した。
【００９０】
実施例７：モジュール交換分析
本発明者らは、モジュラー組み立てを介したＺＦＮなどの製作が、なぜゲノム編集において高い成功率を導くのか調査した。具体的に、本発明のＺＦＮを同一のＤＮＡ−結合特異性を示すバルバスまたはサンガモのモジュールから製作したＺＦＮで置換するモジュール交換実験を行った。
【００９１】
このために、バルバスまたはサンガモモジュールのみで構成された８個の新しいＺＦＮ単量体を準備し、これでトルゼンモジュールのみで構成された６個の異なるＺＦＮ単量体などを代替した(表３および図２２参照)。これらの新しいＺＦＮ単量体のそれぞれは、適切な対であるＺＦＮ単量体などと対をなすようにし、その結果産物であるＺＦＮ対をＳＳＡとＴ７Ｅ１分析を介して検査した。図２３および２４に示すように、新しく合成されたＺＦＮ単量体などのうち、少なくとも１つで構成されたＺＦＮ対は、いずれもＳＳＡシステムでなんらの明確な活性を示さなかった(図２３参照)。さらに、それらの中でどんなＺＦＮもＴ７Ｅ１分析で遺伝子標的化活性を示さなかった(図２４参照)。
【００９２】
【表３】
【００９３】
このような結果などは、機能的ＺＦアレイなどのモジュール組み立てにおいて工学的に製作されたＺＦなどより自然発生ＺＦなどがより信頼できるような構造を構成するという提案を強力に裏付ける。
【００９４】
実施例８：本発明のＺＦモジュール評価
本発明者らが製作した３１５個のＺＦＮ対に対する統計学的分析は、関心のある追加的な内在性遺伝子の標的化された突然変異のために使用され得る新しいＺＦＮ設計の基礎を提供することができる。このために、本発明者らは、ＳＳＡシステムで陽性点数を有する２３個のＺＦＮ対で各ＺＦの発生頻度数を測定した。続いて、各ＺＦに対する“活性指数”を全体２０８ＺＦＮ単量体内モジュールの発生頻度数で割ることによって決定した(図１および２)。一部高い活性を示すＺＦなど、例えば、“ＱＮＴＱ”と“ＲＳＨＲ”は、それぞれ５０％と３８％の活性指数を持ち、それらの高い活性指数は、生体内部位特異的なヌクレアーゼ活性を予測できるから、それらのモジュールなどが信頼性があるということを提案している。“ＱＳＮＫ”と“ｒｄａｅ”のような他のＺＦなどは、本分析で非効率的なモジュールとして示され、活性指数０値を示した。それらの２種類のＺＦなどのいずれもそれぞれ１５回使用したが、そのモジュールなどを含むＺＦＮなどのうち、何も本分析で活性を示さなかった。また、本発明者らは、同一のＤＮＡ認識特異性を持ったＺＦなどの活性指数を比較した。一部のＺＦなどは、他の標的−等価物モジュールよりも顕著に優れた。例えば、“ＤＳＮＲ”と“ＨＳＮＫ”の両方とも同一のＧＡＣ塩基配列を認識した。ＺＦＮなどの製作に“ＤＳＮＲ”を使用すれば、多くの活性ヌクレアーゼ(活性指数＝３５％)を生産できるようにしたが、一方“ＨＳＮＫ”の統合は、単に非活性ＺＦＮなどのみを生産するようにした(活性指数＝０％)。
【００９５】
前記の統計学的分析に基づいて、本発明者らは、以後の遺伝子編集研究のために、試験的に３７個のＺＦなど(２４個のトルゼンモジュール、１つのサンガモモジュール、１２個のバルバスモジュール)を使用することができることを提案する(図１および２参照)。もし、本発明者らが実験にそれら３７個のモジュールのみを使用したとすれば、これは現在の比率(２４％)よりもはるかに大きい５３％の全体的な成功率数値が出てきただろう(図２６参照)。それら３７個のモジュールのすべては、活性ＺＦＮなどで少なくとも一回ずつは発見された。２つあるいはそれ以上の標的−等価物ＺＦなどが存在した時、非常に高い活性指数を持ったモジュールを選択した。３７個のＺＦなどは、全体的に３−ｂｐ下位部位６４個のうち、３８個を認識した。与えられた１−ｋｂｐのランダムＤＮＡ配列の場合、３−フィンガーＺＦＮ二量体に対する８８[＝(３８／６４)６Ｘ１０００Ｘ２]の可能性のある認識部位など(ハーフ部位などの間に５または６個の塩基スペーサー含む)が存在することができ、４−フィンガー二量体では、３１個の認識部位を予想することができる。本発明の成功率を９．１％から２６％と(もし、３７個のＺＦなどを使用するとすれば、実際成功率は顕著に高いが、残りは非効率的なモジュールではない)仮定すると、１−ｋｂｐの標的配列で平均８部位でＺＦＮ−媒介性ゲノム編集が可能であるだろう。このような結果は、大部分の真核遺伝子が本発明のＺＦＮ組み立て方法で“標的化”が可能であるということを示す。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
多くの遺伝子治療の適用時、前記したジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＣＣＲ５遺伝子をノックアウトさせるのに使用してエイズ患者などでＨＩＶ感染に抵抗性のあるＴ細胞を生産することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム配列の標的化された切断および変更、標的化された切断に続いて外来性ポリヌクレオチドとゲノム配列間の相同性組換え、または、標的化された切断に続いて非相同性末端連結に有用な方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、制限酵素は、遺伝工学および分子生物学において、重要なツールである。９以上の塩基対(bp)からなったＤＮＡを認識して切ることができる“rare cutter”として知られた新規制限酵素を作るための様々な試みがあって来た。そのうち、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術は、様々なＤＮＡ基盤配列の認識および切断に、ジンクフィンガーＤＮＡ−認識ドメインおよびＤＮＡ−切断ドメインを含むキメラヌクレアーゼである制限酵素を使用することである。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、細胞内に導入された時にゲノム性ＤＮＡから標的化された二重鎖切断(double strand break，ＤＳＢ)を誘導できるから、哺乳類、植物細胞または他の細胞で効率的な遺伝子変更をさせるのに使用され得る。細胞で二重鎖切断が発生すると、細胞は自体的に持っている修理(repair)システムを用いて損傷した部位を直す。この時、損傷した部分と類似したＤＮＡ配列を有した供与者ＤＮＡを細胞内に導入すると、損傷したＤＮＡと供与者ＤＮＡ鋳型の間に相同組換えが生じる。遺伝体上の特定部位に所望の変形のために、標的塩基配列を供与者ＤＮＡ内に組み込ませる。一方、供与者ＤＮＡがない場合にも、損傷した細胞は、非相同末端連結(non-homologous end joining，ＮＨＥＪ)方式で損傷した部位が修理され得る。非相同末端連結(ＮＨＥＪ)は、２つの切断末端などを共に接合して損傷したＤＮＡを修理し、一般的に変異などを形成しない。しかし、一部の場合に切断されたＤＮＡ末端で塩基対などの挿入または欠失が起こるエラーが発生しやすい方向に修理が進行されることもある。従って、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて特定塩基配列の部分に二重鎖切断を生じて非相同末端連結を誘導すると、ＤＮＡに突然変異が生じ、ノックアウト細胞株を作ることができる。
【０００３】
ジンクフィンガー(ＺＦｓ)は、真核細胞のゲノム内に暗号化されている最も豊富なＤＮＡ−結合モチーフであって、最もよく理解されている蛋白質−ＤＮＡ結合メカニズムの１つを提供しているものとして見なされる(Wolfe，S．A．et al.,(2000) Annu． Rev． Biophys． Biomol． Struct.，29，183-212；Pabo，C．O. et al.，(2001) Annu． Rev． Biochem.，70，313-340；Moore，M．et al.，(2003) Brief Funct． Genomic． Proteomic.，1，342-355；およびKlug，A．et al.，(2005) FEBS Lett.，579，892-894)。エンジニアリングされたジンクフィンガー蛋白質(ＺＦＰ)などは、遺伝子調節およびゲノム修正のためのツールとして重大な潜在力を持っているが、これはそれらが如何なるゲノム内で如何なる実質的に所望の位置に機能的なドメインなどを標的化するのに使用され得るためである。ジンクフィンガー蛋白質などは、ＤＮＡ塩基配列を認識する時に持つアミノ酸残基などと塩基などとの間の塩基特異的相互作用およびモジュール化的な構造的特徴のために、新しいＤＮＡ結合特異性を有する蛋白質をデザインするための様々なフレームワークを提供する。
【０００４】
効果的なジンクフィンガーヌクレアーゼを作るためには、遺伝体上の所望の標的ＤＮＡ配列を認識するジンクフィンガー蛋白質を作ることが必要であり、このために、位置選択的突然変異(ＳＭＤ)を用いて各対応アミノ酸を１つずつ変える方法またはファージディスプレイのような大規模スケールでスクリーニングする方法など生体外と生体内で様々なジンクフィンガー選択方法などが使用されている(米国特許５，７８９，５３８号、５，９２５，５２３号、６，００７，９８８号、６，０１３，４５３号および６，２００，７５９号；国際公開特許ＷＯ９５／１９４３１号、ＷＯ９６／０６１６６号、ＷＯ９８／５３０５７号、ＷＯ９８／５４３１１号、ＷＯ００／２７８７８号、ＷＯ０１／６０９７０号、ＷＯ０１／８８１９７号およびＷＯ０２／０９９０８４号参考)。しかし、選択を基盤とした方法などは、非常に多くの労働と時間が要求され、訓練された実験者を必要とする。ＺＦＮを作る他の方法は、一般的なＤＮＡ組換え技術を使用してすでに良く知られているジンクフィンガーモジュールなどを組み立てて所望の特異性を有するジンクフィンガーアレイを作る方法である。それぞれのジンクフィンガーモジュールは、ＤＮＡの３ｂｐ(塩基対)を認識し、適切に互いに結合される時に引き起こされるジンクフィンガーアレイなどは、さらに長いＤＮＡ配列モチーフなどを特異的に認識することができる。このような方法を使用すると、容易に塩基配列を特異的に認識するジンクフィンガーヌクレアーゼを作ることができるだろう。一部の研究グループなどは、マルチ−フィンガーアレイなどの製作のためのジンクフィンガーモジュールのそれぞれ詳細化され、特性化された別の成果物などを有している。第１には、スクリップス研究所(The Scripps Research Institute)のバルバス研究室(Barbas laboratory)のバルバスモジュールであって、これらのジンクフィンガーモジュールなどは、ファージディスプレイおよび理論的なデザイン方法の組み合わせを使用して開発されたものである。このモジュールなどは、すべてのＧＮＮトリプレット、大部分のＡＮＮおよびＣＮＮトリプレット、およびいくつかのＴＮＮトリプレットの認識に有用である。このようなバルバスモジュールなどは、それぞれのジンクフィンガーモジュールなどが実質的に完全な位置上の独立性を有するという仮定下で開発された。すなわち、それらの認識能力は、アレイ内でのそれらの位置または隣接するジンクフィンガーなどの特性などによって大きく影響されないという仮定である。第２に、サンガモバイオサイエンス社(Sangamo BioScienceInc.)でデザインしたサンガモモジュールは、すべてのＧＮＮトリプレットおよびさらに小さい数の非−ＧＮＮ’トリプレットに対して使用可能である。サンガモモジュールなどは、３−フィンガーアレイ内のモジュールなどの位置は、それらの認識特性に影響を及ぼすことができるという仮定下で開発された。３−フィンガーアレイ内での３つの位置のそれぞれは、そのような位置で与えられたトリプレットのために開発された別個のジンクフィンガーモジュールを有する。しかし、このようなモジュールなどは、自然発生的なモジュールでない人工的なモジュールであって、このようなモジュールを使用してジンクフィンガーヌクレアーゼを製造するのは容易でなく、実際使用時にその効率が非常に低いという問題点がある。特に、これらのモジュールは、ＧＮＮ−反復配列を標的化することを特徴とする。しかし、このような配列などは、関心のある与えられた遺伝子内でほとんど希薄に生じる問題点がある。例えば、３−フィンガージンクフィンガーヌクレアーゼ対は、平均的に４０９６ｂｐ(４６)配列内で一度だけ生じるＧＮＮ−反復ＤＮＡ配列である、５’−ＮＮＣＮＮＣＮＮＣＮＮＮＮＮＮＧＮＮＧＮＮＧＮＮ−３’を標的化するようにデザインされ得る。４−フィンガージンクヌクレアーゼに対するＧＮＮ−反復サイトは、さらに珍しくて、６５，５３６ｂｐ(＝４８)配列で一度だけ生じる。従って、そのようなサイトは、所望の数多くの遺伝子内に現れないこともある。このような見地から、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼ(zinc finger nuclease)は、大部分がＧＮＮ−反復配列を認識しなくて作用するという長所がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許５，７８９，５３８号
【特許文献２】米国特許５，９２５，５２３号
【特許文献３】米国特許６，００７，９８８号
【特許文献４】米国特許６，０１３，４５３号
【特許文献５】米国特許６，２００，７５９号
【特許文献６】国際公開特許ＷＯ９５／１９４３１号
【特許文献７】ＷＯ９６／０６１６６号
【特許文献８】ＷＯ９８／５３０５７号
【特許文献９】ＷＯ９８／５４３１１号
【特許文献１０】ＷＯ００／２７８７８号
【特許文献１１】ＷＯ０１／６０９７０号
【特許文献１２】ＷＯ０１／８８１９７号
【特許文献１３】ＷＯ０２／０９９０８４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wolfe，S．A．et al.,(2000) Annu．Rev．Biophys．Biomol． Struct.，29，183-212
【非特許文献２】Pabo，C．O. et al.，(2001) Annu． Rev． Biochem.，70，313-340
【非特許文献３】Moore，M．et al.，(2003) Brief Funct． Genomic． Proteomic.，1，342-355
【非特許文献４】Klug，A．et al.，(2005) FEBS Lett.，579，892-894)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一つの目的は、ジンクフィンガードメインおよび切断ドメインを含む融合蛋白質であって、前記ジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうち、１つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来し、前記融合蛋白質は、細胞染色質内の関心領域を含むヌクレオチド配列を認識して切断することを特徴とするジンクフィンガーヌクレアーゼを提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて関心領域内の細胞染色質を切断する方法を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列を交替する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列を変更する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた遺伝子治療方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、迅速に製造されることができ、ゲノム配列の標的化された切断および変更に非常に有用であるため、遺伝子のノックアウトなどを介した遺伝子治療などに適用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このように、標的化されたゲノムの編集を可能にするジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を広範囲に適用することは、機能的なジンクフィンガーヌクレアーゼの合成のための便利で、迅速且つ公衆に利用可能な方法の不在によって妨害を受けている。従って、本発明者らは、ヒト細胞内のいくつかの異なるゲノム性サイトのＤＮＡ配列を修正できるジンクフィンガーヌクレアーゼを作るために鋭意研究した結果、公衆に使用可能なジンクフィンガーなどを使用する、非常に効率的で、実施するのに容易なモジュール性組み立て方法を使用してジンクフィンガーヌクレアーゼを製造することができ、組み立てられたジンクフィンガーヌクレアーゼを用いてゲノムで標的化された切断と変更などが従来の方法に比べてより容易であることを発見した。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造のために使用されたジンクフィンガーの起源、アミノ酸配列および標的下部部位(subsite)などを示す。
【図２】図２は、本発明者らが合成したジンクフィンガーヌクレアーゼの中で代表的な一対のアミノ酸配列を示す；細胞内発現を確認するために含んだＨＡ標識配列と核内伝達信号配列に下線をひいて示し、標的塩基配列と結合すると予想されるジンクフィンガーのαヘリックス部分を太く示した。
【図３】図３は、ＣＣＲ５コード部位内のＺＦＮ標的部位に対する図式的な概要である；ＺＦＮ標的部位は、ボックスで示し、数字は、開始コドンに比例してＺＦＮ標的部位の位置を示す。網状性ボックスは、Δ３２変異の位置を示す。
【図４】図４は、インビトロ転写および翻訳システムを介して生産されたＺＦＮｓを使用して行われたＤＮＡ切断分析を示した概要図である。
【図５】図５は、アガロースゲル電気泳動を介したＤＮＡ切断分析の結果を示した写真である。
【図６】図６は、ＺＦＮ活性評価で細胞−基盤単一鎖アニーリング(ＳＳＡ)を使用することに対する図式的な概要である；ＺＦＮ発現プラスミドは、非活性状態、部分的に複製され、破裂した状態であるルシフェラーゼ遺伝子を含んでいるゲノムを有するＨＥＫ２９３細胞に形質導入され、もし、ＺＦＮｓが細胞内標的部位を切断すると、ＤＮＡはＳＳＡメカニズムによって効果的に復旧され、機能的ルシフェラーゼ遺伝子は回復されるようになる。
【図７】図７は、ＺＦＮ活性評価で細胞−基盤単一鎖アニーリング(ＳＳＡ)を使用することに対する図式的な概要である；細胞のルシフェラーゼ活性は、様々なＺＦＮｓが発現されたことを意味する。Ｐ３は、プラスミドがない状態であり、陰性対照群として使用された。Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位を含んでいる標的塩基は、陽性対照群として使用された。それぞれのＺＦＮ対の活性は、Ｉ−ＳｃｅＩ対照群に対する百分率で示した。ＺＦＮ対とそれらの構成単量体などを示した。追加的な研究に使用したＺＦＮ対は、三角形で表記した。平均値と標準偏差(エラーバー)は、少なくとも３回の独立的な実験を介して求めたものである。
【図８】図８は、Ｔ７Ｅ１分析法を使用してヒト細胞内ＺＦＮ−媒介性ゲノム編集の不一致探知に対する図式的な概要である；ゲノム性ＤＮＡは、ＺＦＮｓをエンコードするプラスミドが形質導入された細胞から精製した。ＺＦＮ認識部位を含むＤＮＡ断片などは、ＰＣＲ−増幅し、ＤＮＡ増幅産物は、熱を加えて溶かして、アニーリングした。もし、ＤＮＡ増幅産物などが野生型と変異されたＤＮＡ配列の両方とも含んでいると、ヘテロ二重鎖が形成されるだろう。Ｔ７Ｅ１は、ヘテロ二重鎖を認識して切断する。しかし、ホモ二重鎖は切断できない。ＤＮＡ断片などは、アガロースゲル電気泳動によって評価した。
【図９】図９は、Ｔ７Ｅ１分析によって明らかになったＺＦＮ−媒介性ゲノムの変形を示す；ＺＦＮ対は、アガロースゲルの上段に示されている。収得されたＤＮＡバンドの予想される位置は、ゲルパネルの左側に矢印(切られなかった状態)と角括弧(切られた状態)で示した。Ｐ３は、プラスミドがない状態であり、陰性対照群として使用された。サンガモのＣＣＲ５−標的化するＺＦＮ対(サンガモＣＣＲ５)を本分析に含んだ。
【図１０】図１０は、Ｚ８３６ＺＦＮ対によって標的されるゲノムの部位に対するＤＮＡ配列を示す。ＺＦＮ認識要素などは、下線で示した。欠失は点線で示し、挿入された塩基などは、小文字で示した。変異が１つ以上探知された場合、その変異の発生個数を括弧内に示した。ｗｔは、野生型を示す。
【図１１】図１１は、Ｚ３０およびＺ２６６ＺＦＮ対によって標的化されるゲノム部位などに対するＤＮＡ配列を示す；ＺＦＮ認識要素などは下線で示し、欠失は点線で示し、挿入された塩基などは小文字で示した。変異が１つ以上探知された場合、その変異の発生個数を括弧内に示した。
【図１２】図１２は、Ｚ３６０およびＺ４１１ＺＦＮ対によって標的化されるゲノム部位などに対するＤＮＡ配列を示す；ＺＦＮ認識要素などは下線で示し、欠失は点線で示し、挿入された塩基などは小文字で示した。変異が１つ以上探知された場合、その変異の発生個数を括弧内に示した。
【図１３】図１３は、Ｚ４２６およびＺ４３０ＺＦＮ対の標的部位などに対するＤＮＡ配列を示す；ＺＦＮ認識要素などは下線で示し、欠失は点線で示し、挿入された塩基などは小文字で示した。１つ以上の変異が探知された場合、その変異の発生する数は、括弧内に示した。
【図１４】図１４は、Ｚ８９１ＺＦＮ対の標的部位などに対するＤＮＡ配列を示す；ＺＦＮ認識要素などは下線で示し、欠失は点線で示し、挿入された塩基などは小文字で示した。１つ以上の変異が探知された場合、その変異の発生する数は、括弧内に示した。
【図１５】図１５は、様々なＺＦＮ−標的部位の変異類型を示す；それぞれのＺＦＮ対に対する欠失、挿入、そして、複合的な変異の数を確認し、それらの変異発生数を百分率で示した。
【図１６】図１６は、野生型と強制的ヘテロ二量体ＺＦＮｓに対する時間進行による分析結果である。Ｔ７Ｅ１不一致探知分析は、細胞から分離したＤＮＡを異なる種類のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインで色々な時間帯で処理した(ＷＴ、野生型ヌクレアーゼドメイン；ＲＲ／ＤＤまたはＫＫ／ＥＬ、強制的ヘテロ二量体ヌクレアーゼドメインなど）。
【図１７】図１７は、５３ＢＰ１染色の結果である；野生型と強制的ヘテロ二量体Ｚ８９１ＺＦＮ対いずれもＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞内に形質導入させ、形質導入した後２日目に細胞内の５３ＢＰ１フォーカスなど(foci)を免疫蛍光によって観察した。エトポシド(１μＭ)は、陽性対照群として使用した。
【図１８】図１８は、図１６の結果をプロットしたものである；５３ＢＰ１フォーカス数に対する分布をプロットしたものである。最小１００個の細胞などを２回独立的に測定して、各処理について分析した。
【図１９】図１９は、突然変異クローンなどのＤＮＡ配列を示す；ＲＲ／ＤＤＺＦＮ二量体を処理した細胞などから制限的希釈によって７個の突然変異クローンなどを分離した。これらのクローン細胞内標的部位のＤＮＡ配列を示した。欠失は点線で示し、挿入された塩基などは小文字で示した。クローン１ａと１ｂは、１つのクローン内の両対立性形質変異の結果から生じたＤＮＡ配列を示す。
【図２０】図２０は、ＣＣＲ２部位でＴ７Ｅ１分析を示す。ＺＦＮ対で処理した細胞からＣＣＲ２コード部位に対応するＰＣＲ−増幅ＤＮＡ(ゲルパネルの上部に表示されている)を分析した。ＣＣＲ２部位で変形を生じたＺＦＮ対は“＋”で示した。Ｐ３は、プラスミドがない状態であり、陰性対照群として使用された。サンガモのＣＣＲ５−標的化ＺＦＮ対(サンガモＣＣＲ５)が本分析に含まれている。
【図２１】図２１は、ＣＣＲ２部分(locus)でＺＦＮｓの脱標的(off-target)効果およびＣＣＲ５とＣＣＲ２部分でＺＦＮ認識要素など(recognition elements)を示す。ＺＦＮ対はＤＮＡ配列の左側に示した。ＣＣＲ５とＣＣＲ２部分の間で一致する塩基の数は括弧内に示し、不一致する塩基などは太い小文字で示した。ＺＦＮ認識要素などのハーフ−部位(half-site)は下線で示した。
【図２２】図２２は、モジュール交換実験のために使用されたジンクフィンガーなどを示す。
【図２３】図２３は、新しいＺＦＮなどが同一の配列を認識する本発明のＺＦＮなどを機能的に代替できるどうかを試験するためのモジュール交換分析において、細胞−基盤ＳＳＡシステムの結果を示す；“ＢＲ４”のように“Ｂ”で始まる名称のＺＦＮ単量体などは、ただバルバスモジュールのみで構成されているものであり、“ＳＲ４”のように“Ｓ”で始まる名称のＺＦＮ単量体などは、サンガモモジュールのみで構成されたものである。細胞のルシフェラーゼ活性は、様々なＺＦＮなどの発現を示す。ｐ３は、プラスミドがない状態であり、陰性対照群として使用した。Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位を含む標的配列は、陽性対照群として使用した。それぞれのＺＦＮ対の活性は、Ｉ−ＳｃｅＩ対照群に対する百分率として評価した。ＺＦＮ対とそれらの構成単量体などを示した。平均値と標準偏差(エラーバー)は、少なくとも３回の独立的な実験を介して求めたものである。
【図２４】図２４は、新しいＺＦＮｓが同一の配列を認識する本発明のＺＦＮｓを機能的に代替できるどうかを試験するためのモジュール交換分析において、Ｔ７Ｅ１分析を介してＺＦＮ−媒介性ゲノム変形を示す；ＺＦＮ対とそれらの構成単量体などは、アガロースゲルの上段に表示されている。陽性遺伝子標的化効果を有するＺＦＮ対は、“＋”で示した。
【図２５】図２５は、ＺＦＮ分析に対する要約である；それぞれの分析で陽性結果を有するＺＦＮ対の数または標的部位の数が示されている。
【図２６】図２６は、異なる類型のＺＦＮｓの成功率を示す。成功的なＺＦＮ対または標的部位は、Ｔ７Ｅ１不一致探知分析で陽性結果を有するものとして定義される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一つの態様として、本発明は、ジンクフィンガードメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含む融合蛋白質であって、前記ジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうち、２つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来し、前記融合蛋白質は、細胞染色質内の関心領域を含むヌクレオチド配列を認識および切断することを特徴とするジンクフィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)に関するものである。
【００１５】
本発明のジンクフィンガードメインは、１つ以上のジンクフィンガーモジュールを介して配列特異性を有する方式でヌクレオチドと結合する蛋白質をいう。ジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含む。ジンクフィンガードメインは、たびたびジンクフィンガー蛋白質またはＺＦＰで簡略に表示されたりもする。
【００１６】
本発明のジンクフィンガーモジュールとは、亜鉛イオンの配位結合を介して安定化される構造を有するドメインの内部にあるアミノ酸配列領域をいう。本発明のジンクフィンガーモジュールは、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールと同一の配列を有したり、野生型配列のうち、任意のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変形された配列を有する。前記野生型ジンクフィンガーモジュールは、任意の真核細胞、例えば、真菌細胞(例えば、酵母)、植物または動物細胞(例えば、ヒトやマウスのような哺乳動物細胞)から由来することができる。 好ましくは、本発明のジンクフィンガーモジュールは、ヒトなどから由来した図１に示されたアミノ酸配列を含む。
【００１７】
ジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガードメインは、それぞれ３ｂｐ(塩基対)の下部部位を認識する３つ以上のジンクフィンガーモジュールが直列に連結されている。それぞれのモジュールなどは、独立的にＤＮＡ配列を認識するから、３つまたは４つのモジュールから構成されたジンクフィンガードメインは、９または１２ｂｐ配列に結合することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、二量体として作用し、従って、３−４個のモジュールから構成されたジンクフィンガーヌクレアーゼ１対は、１８−２４ｂｐ配列を特異的に認識する。一つの具体的な例として、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガードメインが３つまたは４つ、好ましくは４つのジンクフィンガーモジュールから構成されている。また、一つの好ましい態様として、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼに含まれているジンクフィンガードメインは、好ましくはジンクフィンガーモジュールを含む。具体的な実施例において、３つのジンクフィンガーモジュールを含むジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的化された切断成功率が９．１％であるのに反して４つのジンクフィンガーモジュールを含むジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的化された切断成功率が２６％である。
【００１８】
ジンクフィンガードメインは、予め決まったヌクレオチド配列に結合するように加工され得る。ジンクフィンガー蛋白質操作方法の非制限的な例としては、設計(design)および選択である。設計されたジンクフィンガー蛋白質は、自然的に発生しない蛋白質であり、その設計および組成は、主に合理的な基準に応じて出る。設計のための合理的な基準としては、置換法則の適用および現存するＺＦＰ設計および結合データに関するデータベースを情報処理するコンピュータアルゴリズムを含む(大韓民国登録特許第０７６６９５２号参照)。選択されたジンクフィンガー蛋白質は、自然状態で発見されない蛋白質であり、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたは混成化選択のような実験過程を介して得られた結果物である。
【００１９】
前記加工されたジンクフィンガードメインを構成するジンクフィンガーモジュールのうち、最小限２つまたはそれ以上は、野生型ジンクフィンガーモジュールであるのが好ましく、より好ましくは、３つまたはそれ以上の野生型ジンクフィンガーモジュールを含む。一つの具体例において、本発明者らは、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼを従来のファージディスプレイまたは点突然変異によって操作され、分離されたジンクフィンガーヌクレアーゼから形成されたものなどに置換するモジュール交換分析を行った。その結果、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼがＳＳＡシステムおよびＴ７Ｅ１分析で明確な活性を示すことを発見した。従って、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、自然的に発生された野生型ジンクフィンガーモジュールを含むのが好ましい。本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたジンクフィンガードメインを含むのがより好ましい。また、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、従来の操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼとは異なり、ＧＮＮ−反復配列を標的化しない。具体例において、下記の表２に記載されたように、ＣＣＲ５配列を成功的に変形させた１６個のジンクフィンガーヌクレアーゼなどのうちから２つのジンクフィンガーヌクレアーゼ(Ｚ４３０Ｒ３およびＺ３０Ｆ４)がＧＮＮモチーフのない認識−部位(ハーフ−サイト(half-site))要素を認識し、１２個のジンクフィンガーヌクレアーゼがＧＮＮおよび非ＧＮＮモチーフなどの両方を含む部位を認識する反面、単に２つのジンクフィンガーヌクレアーゼ(Ｚ４２６Ｆ３およびＺ３６０Ｒ４)だけがＧＮＮ−反復部位を認識する。ＧＮＮ−反復配列でない部位を標的化できる能力は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術の有用性を大きく広めてあげる。
【００２０】
本発明の用語“切断”は、ＤＮＡ分子の共有結合基本骨格を切断することを意味し、“切断ドメイン”は、ＤＮＡ切断のための酵素活性を有するポリペプチド配列を意味する。
【００２１】
前記切断ドメインは、エンドまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを得ることができるエンドヌクレアーゼの非制限的な例としては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミング(homing)エンドヌクレアーゼがある。このような酵素などは、切断ドメインの供給源として使用され得る。また、単一鎖切断および二重鎖切断の両方が可能であり、二重鎖切断は、切断ドメインの供給源に応じて発生することができる。これに係って、二重鎖切断活性を有する切断ドメインを切断ハーフドメインとして使用され得る。但し、本明細書では切断ドメインを単一鎖切断および二重鎖切断に対して、混用して使用することができる。
【００２２】
切断ドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部分から由来することができる。一般的に、もし、融合蛋白質が二重鎖切断活性を有する切断ハーフドメインから構成されると、切断のために２つの融合蛋白質が必要である。２つの切断ハーフドメインは、同一のエンドヌクレアーゼ(または、その機能的な断片など)から由来することができ、または各切断ハーフドメインは、互いに異なるエンドヌクレアーゼ(または、その機能的な断片など)から由来することができる。さらに、各標的部位に２つの融合蛋白質が結合すると、切断ハーフドメインなどの相互間の空間的配向は、例えば、二量体化によって切断ハーフドメインなどが機能的な切断ドメインを形成するようにする。従って、すべての整数値のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの標的部位の間に介在することができる(例えば、２〜５０ヌクレオチドまたはそれ以上)。
【００２３】
一般的に、それぞれ切断ハーフドメインを含む２つの融合蛋白質を使用すると、各融合蛋白質のジンクフィンガー部分が互いに異なるＤＮＡ鎖上に逆方向に接触する。すなわち、一対のＺＦＰ／切断ハーフドメイン融合の場合、標的配列は、正反対のＤＮＡ鎖上に位置し、２つの蛋白質は逆方向に結合する。
【００２４】
制限エンドヌクレアーゼは、多くの種(species)に存在し、ＤＮＡ(認識部位)に配列特異性結合をすることができ、結合部位の近傍でＤＮＡを切断することができる。一部の制限酵素など(例えば、タイプＩＩｓ)は、認識部位から離れているＤＮＡを切断して分離可能な結合ドメインと切断ドメインを持つ。例えば、タイプＩＩｓ酵素であるＦｏｋＩは、１つの鎖上の認識部位から９ヌクレオチド離れた位置で、そして、他の一つの鎖上の認識部位から１３ヌクレオチド離れた位置でＤＮＡの二重鎖切断の触媒作用をする。従って、一つの具体例においては、融合蛋白質は、少なくとも１つのタイプＩＩｓ制限酵素から出た切断ドメイン(または、切断ハーフドメイン)と１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【００２５】
タイプＩＩｓ制限酵素の例としては、ＦｏｋＩ、ＡａｒＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＣｄｉＩ、ＣｊｅＰＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦｉｎＩ、ＭｂｏＩ、ｓａｐＩ、ＳｓｐＤ５１などがあるが、これに制限されるのではない。より具体的には、ロバーツらの文献［(２００３) Nucleic acid Res．31：418-420］を参照する。一つの具体例においては、ＴｙｐｅIIｓ制限酵素であるＦｏｋＩからＤＮＡ結合ドメインを分離して得たＦｏｋＩ切断ドメインを切断ドメイン(または、ハーフ切断ドメイン)として使用した。
【００２６】
本発明の融合蛋白質は、異なる２つ以上のポリペプチドをペプチド結合で連結して形成させたポリペプチドを意味する。前記ポリペプチドは、ジンクフィンガードメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含み、ヌクレオチド配列内の任意の標的部位を切断することができる。本発明において、融合蛋白質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＺＦＮと混用され得る。
【００２７】
融合蛋白質(または、融合蛋白質暗号化ポリヌクレオチド)を設計および製作する方法は、当該技術分野で広く知られている。一つの具体例において、ジンクフィンガードメインと切断ドメインを含む融合蛋白質を暗号化するポリヌクレオチドを製作した。前記ポリヌクレオチドは、ベクターに挿入されることができ、挿入されたベクターは、細胞内に導入され得る。一般的に、融合蛋白質(例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合)の構成要素などは、ジンクフィンガードメインが融合蛋白質のアミノ末端(Ｎ末端)の近傍に、切断ハーフドメインがカルボキシ末端(Ｃ末端)の近傍に位置するように配列されている。これは、ＦｏｋＩ制限酵素から由来したもののように、天然型切断ドメイン二量体にある切断ドメインの相対的位置と似ているが、この時、ＤＮＡ結合ドメインはアミノ末端の近傍に位置し、切断ハーフドメインはカルボキシ末端の近傍に位置する。
【００２８】
本発明において、“配列”とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る様々な長さのヌクレオチド配列を意味する；直線形、円形または枝形であることができ、単一鎖または二重鎖であり得る。
【００２９】
本発明において、“結合”とは、蛋白質と核酸どの間のような高分子間の配列特異的または非共有相互作用を意味する。相互作用が全体的に配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素などがＤＮＡ骨格のリン酸残基と接触することのように、配列特異的である必要はない。このような相互作用は、一般的に解離定数(Ｋｄ)値が１０−６Ｍ−１以下であるのが特徴である。また、“親和度”とは、結合力を意味し、結合親和度の増加は、解離定数(Ｋｄ)の減少と関連している。
【００３０】
他の一つの態様として、本発明は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを１対以上含み、標的化関心領域内でＤＮＡ配列の切断、交替または変更のための組換えキットに関するものである。
【００３１】
一般的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)は、二量体として作用するから、１つのＤＮＡ部位を標的化するためには、２つのＺＦＮ単量体を用意するのが必要である。ＺＦＮ対を構成する２つのＺＦＮ単量体のそれぞれは、５〜６ｂｐのスペーサー配列によって分離されている２つの９または１２ｂｐの２つのハーフ部位のうち、１つに結合する。１つのハーフ部位に対して同一または類似のＤＮＡ結合特異性を有した異なるセットのＺＦなどから構成された多重単量体ＺＦＮを製作することができる。１つの具体例において、同一または異なるジンクフィンガードメインから構成されたＺＦＮ対が表２に示されているが、これに限定されるのではない。前記単一部位は、様々な組み合わせのＺＦＮ対によって標的化され得る。
【００３２】
本発明において使用された用語“交替”とは、１つのヌクレオチド配列が他のヌクレオチド配列に交替されること(すなわち、情報を持ったセンス配列の交替)を意味し、必ず１つのポリヌクレオチドが他のポリヌクレオチドに化学的または物理的に交替されることを意味するのではない。本発明において使用された用語“変更”とは、突然変異または非相同末端連結によるＤＮＡ配列内の変化を意味する。前記の突然変異は、点突然変異、置換、欠失、挿入などを含む。前記交替または変更は、不完全な遺伝情報を有するヌクレオチドを完全な遺伝的情報を有するヌクレオチドに交替または変更させ得る。また、このような突然変異によってヌクレオチド配列にエンコードされたペプチドが機能的に不活性化することもできる。このような方式によって、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、遺伝子治療法手段として使用され得る。一つの具体例において、ヒト免疫欠乏ウイルス(ＨＩＶ)が標的細胞を感染するのに使用される主要共同受容体であるＣＣＲ蛋白質をコードするケモカイン(C-C motif)受容体５(ＣＣＲ５)遺伝子をＺＦＮが欠失させ得ることを確認した。
【００３３】
例えば、細胞、核酸、蛋白質またはベクターに対して言及しながら使用される時、“組換え”は、細胞、核酸、蛋白質またはベクターが異種性核酸または蛋白質の導入、または天然核酸または蛋白質の変更によって変形されたり、または細胞がそのように変形された細胞から由来されたことをいう。従って、例えば、組換え細胞は、天然(自然発生)形の細胞内で発見されない遺伝子を発現したり、または、正常的または非正常的に発現される２次コピーの天然遺伝子を発現したり、または全く発現しない。
【００３４】
他の一つの態様として、本発明は、（ａ）関心領域内のヌクレオチド配列を選択する段階；（ｂ）前記配列に結合するジンクフィンガーモジュールを選択し、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含みながら、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来したものであるジンクフィンガードメインを工学的に製造する段階；（ｃ）前記工学的に製造されたジンクフィンガードメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含む融合蛋白質を発現させる段階を含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法に関するものである。
【００３５】
本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼを製造する方法において、前記（ａ）段階は、関心領域内のヌクレオチド配列を選択する段階である。前記ヌクレオチド配列は、細胞の内または外に存在することができ、その長さは制限がない。また、前記ヌクレオチド配列は、線形または円形、単一鎖または二重鎖の形態であり得る。
【００３６】
前記（ｂ）段階は、関心領域内のヌクレオチド配列と結合するジンクフィンガーモジュールなどを選択し、ジンクフィンガードメインを工学的に製造する段階である。前記ジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、２つ以上のジンクフィンガーモジュールは、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来するのが好ましく、より好ましくは、図１に示されたジンクフィンガーモジュールから由来し、より好ましくは、図２に示されたジンクフィンガーモジュールから由来する。
【００３７】
前記（ｃ）段階は、ジンクフィンガードメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含む融合蛋白質を発現させる段階である。前記発現は、生体内または生体外の発現を含む。生体内の発現は、当該分野で知られた方法を用いて行うことができ、例えば、ベクターを用いる方法である。前記ベクターの例として、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクターおよびウイルスベクターなどがあるが、これに制限されない。適した発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーのような発現調節要素の他にも分泌シグナル配列などを目的に応じて含み、様々に製造され得る。
【００３８】
他の一つの態様として、本発明は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて関心領域内の細胞染色質を切断する方法に関するものである。
【００３９】
一つの具体的態様として、本発明は（ａ）関心領域内の第１のヌクレオチド配列を選択する段階；（ｂ）第１のヌクレオチド配列と結合する本発明の第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを選択する段階；（ｃ）前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを前記ヌクレオチド配列を有する細胞内で発現させたり、前記細胞外で発現させて前記細胞内へ導入させる段階；および（ｄ）(細胞内で発現されたり、細胞内に導入された)第１のジンクフィンガーヌクレアーゼが前記配列と結合して前記関心領域内で細胞染色質を切断する段階を含む関心領域内の細胞染色質切断方法である。
【００４０】
本発明の前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来したものである。
【００４１】
他の一つの具体的な態様として、本発明は、（ａ）関心領域内の第１のヌクレオチド配列を選択する段階；（ｂ）第１のヌクレオチド配列と結合する本発明の第１のジンクフィンガドメインおよび第１のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを選択する段階；（ｃ）第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを前記ヌクレオチド配列を有する細胞内で発現させたり、前記細胞外で発現して前記細胞内へ導入させる段階；および（ｄ）(細胞内で発現されたり、細胞内に導入された)第１のジンクフィンガーヌクレアーゼが前記配列と結合させて前記関心領域内の細胞染色質を切断させる段階；（ｅ）第２のジンクフィンガードメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む本発明の第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを選択し、前記ヌクレオチド配列を有する細胞内で発現させたり、細胞外で発現して前記細胞内へ導入させる段階；（ｆ）(細胞内で発現されたり、導入された)第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを、前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼが結合する第１のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れている関心領域内の第２のヌクレオチド配列と結合させる段階を含む関心領域内の細胞染色質切断方法である。
【００４２】
本発明において“染色質”は、細胞のゲノムを構成する核蛋白質の構造を意味する。細胞の染色質は、核酸、主にＤＮＡ、そして、ヒストンおよび非ヒストン系染色体蛋白質を含んだ蛋白質を含む。細胞染色質は、原核細胞、真核細胞(例えば、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞)を含むすべての形態の細胞内に存在することができる。大部分の真核細胞染色質は、ヌクレオソームの形態で存在するが、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４のそれぞれ２つで構成された八量体と結合された略１５０塩基対のＤＮＡを含み、(有機体に応じて長さが様々な)リンカーＤＮＡがヌクレオソームコアの間に拡張されている。ヒストンＨＩ分子は、一般的にリンカーＤＮＡと結合されている。本発明の目的上、用語“染色質”は、すべての形態の細胞核蛋白質、原核および真核いずれも含む意味として使用される。細胞の染色質は、染色体およびエピソームの染色質のすべてを含む。前記“染色体”は、細胞のゲノムの全部または部分を含む染色質複合体をいう。前記“エピソーム”は、複製性核酸、核蛋白質複合体または細胞の染色体核型の一部でない核酸を含む他の構造体である。例としては、プラスミドおよびウイルス性ゲノムがある。
【００４３】
他の一つの具体的な態様として、本発明は、（ａ）関心領域を選択する段階；（ｂ）前記関心領域内の第１のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを提供する段階；（ｃ）前記第１の配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れている関心領域内の第２のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；（ｄ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第１のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で同時または、分離して発現させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在するジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガドメインは、前記第１のヌクレオチド配列と結合し、前記第２のジンクフィンガードメインは、前記第２のヌクレオチド配列と結合し、前記結合によって前記ヌクレオチド切断ドメインを位置させて関心領域内の前記細胞染色質を切断させる、関心領域内の細胞染色質切断方法に関するものである。
【００４４】
本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた標的化された切断の場合、ジンクフィンガードメインの結合部位は、切断部位を含むことができたり、結合部位の端が切断部位から１〜５０ヌクレオチド離れて位置することができる。切断部位をマッピングする方法は、当該技術分野で広く知られている。
【００４５】
通常ＤＮＡが切断される部位は、２つの融合蛋白質の結合部位の間に存在する。ＤＮＡ二重鎖の切断は、２つの単一鎖切断または１、２、３、４、５、６または、それ以上のヌクレオチドなどがオフセットされた“ニック”の結果物である。例えば、天然型ＦｏｋＩ制限酵素による二重鎖ＤＮＡの切断は、４つのヌクレオチドがオフセットされた単一鎖切断の結果物である。従って、切断は、必ず各ＤＮＡ鎖上に正確な反対側で生じる必要はない。さらに、融合蛋白質の構造と標的部位との間の距離は、切断が１つのヌクレオチド対の近傍で生じるかどうか、または色々な部位で生じるかどうかに影響を及ぼすことができる。
【００４６】
本発明において、“標的部位”は、ジンクフィンガードメインによって認識される核酸配列である。単一標的部位は、一般的に約６または約１２塩基対を有する。一般的に、３つのジンクフィンガーモジュールを有するジンクフィンガー蛋白質は、２つの隣接した６〜１０塩基対の標的部位を認識し、４つのジンクフィンガーモジュールを有するジンクフィンガー蛋白質は、２つの隣接した９〜１２塩基対の標的部位を認識する。用語“隣接した標的部位”は、０〜約５塩基対まで離れている非重複標的部位を意味する。
【００４７】
前述したように、融合蛋白質は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド形態で導入され得る。例えば、それぞれ前述したポリペプチドなどのうちの１つを暗号化する配列を含む２つのポリヌクレオチドが細胞内に導入されることができ、切断は、標的配列の近傍で生じる。または、２つのポリペプチドすべてを暗号化する配列を含む１つのポリヌクレオチドが細胞内に導入され得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよび／またはＲＮＡの任意の変異体または類似体であり得る。
【００４８】
他の一つの態様として、本発明は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列を交替する方法に関するものである。
【００４９】
一つの具体的な態様として、本発明は、細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列交替方法であって、（ａ）関心領域内で９個以上のヌクレオチドを含む第２のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを工学的に製造する段階；（ｂ）前記第２のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れて位置し、９個以上のヌクレオチドを含む第３のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；（ｃ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第３のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる段階；（ｄ）前記細胞を前記第１のヌクレオチド配列と相同性があるが同一ではない第４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに接触させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの１つ以上は、自然界に存在するジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第２配列の結合および前記第２のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第３配列の結合によって切断ドメインを位置させ、前記細胞染色質が関心領域内で切断され、これによって前記第１のヌクレオチド配列と前記第４のヌクレオチド配列との間の相同組換えを容易にして前記第１のヌクレオチド配列を前記第４のヌクレオチド配列に交替することを特徴とする方法に関するものである。
【００５０】
本発明は、標的化された組換え効率を高め、非特異的な挿入頻度を減少させることを特徴とする標的化された配列変更方法を提供する。細胞ＤＮＡの二重鎖切断は、切断部位の近傍で数千倍程度の相同組換えを刺激するため、このような標的化された切断は、実質的にゲノムのどんな部位でも(相同組換えを介して)配列の変換または置換を可能にする。
【００５１】
選択されたゲノム配列の標的化された置換は、融合蛋白質(ジンクフィンガーヌクレアーゼ)だけでなく、ドナー配列を必要とする。ドナー配列は、融合蛋白質(など)の発現以前、同時または以後のいつでも細胞内に導入され得る。ドナー配列は、通常置換するゲノム配列と同一ではないことが明確である。例えば、相同組換えができる十分な相同性を有している限り、ドナーポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列に対して１つの塩基変化、挿入、欠乏、逆位、または再配列のうちから１つまたはそれ以上を含むことができる。また、ドナー配列は、類似する２つの相同性に接している非相同配列を含むことができる。さらに、ドナー配列は、細胞染色質の関心領域と相同性のない配列を含むことができる。
【００５２】
また、前記の方法において、第１のヌクレオチド配列は、遺伝子内に突然変異を含む配列が好ましいかもしれない。この場合、ドナー配列、特に、第４のヌクレオチド配列は、前記遺伝子の野生型配列であるのが好ましい。前記の突然変異は、点突然変異、置換、欠失または挿入などであり得る。
【００５３】
また、他の一つの具体的な態様として、本発明は、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列を変更する方法を提供する。
【００５４】
具体的に、本発明は、細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列変更方法であって、（ａ）関心領域内の９個以上のヌクレオチドを含む第２のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを工学的に製造する段階；（ｂ）前記第２のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れて位置し、９個以上のヌクレオチドを含む第３のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；（ｃ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第３のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの１つ以上は、自然界に存在するジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第２配列の結合および前記第２のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第３配列の結合によって切断ドメインを位置させ、前記細胞染色質を関心領域内で切断させ、前記切断部位で前記第１のヌクレオチド配列を変更させることを特徴とする方法に関するものである。
【００５５】
本発明において、１つまたは２つ以上のＺＦＰまたはＺＦＰ融合蛋白質を暗号化する核酸は、複製および発現のために原核細胞または真核細胞へ形質転換させる発現ベクターにクローニングされ得る。ベクターは、例えば、プラスミド、シャトルベクター、昆虫ベクターなどの真核ベクターまたは原核ベクターを含む。ＺＦＰを暗号化する核酸は、また発現ベクターにクローニングされて植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞またはヒト細胞、菌類細胞、細菌細胞または原生動物細胞に導入され得る。
【００５６】
発現ベクターは、宿主細胞で特定の核酸の転写、および選択的に宿主細胞で発現ベクターの統合または複製が可能にする一連の特性化された核酸要素などであって、組換えまたは合成を介して生成された核酸作製物である。発現ベクターは、ウイルスまたは非−ウイルス起源のプラスミド、ウイルスまたは、核酸断片の部分であり得る。一般的に、発現ベクターは、“発現カセット”を含み、これはプロモーターに作動可能に連結され、転写される核酸を含む。また、発現ベクター用語は、プロモーターに作動可能に連結されたネイキッド(naked)ＤＮＡを含む。
【００５７】
クローンされた遺伝子または核酸を発現させるために、ＺＦＰまたはＺＦＰ融合蛋白質を暗号化する配列は、一般的に転写を誘導するプロモーターを有したベクターにサブクローニングされる。適した細菌性プロモーターまたは原核プロモーターは、当該分野で広く知られている。
【００５８】
用語“作動可能に連結された”は、核酸発現調節配列(プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイなど)と第２の核酸配列との間の機能的結合を意味する。
【００５９】
本発明において、“宿主細胞”は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または選択的にジンクフィンガーヌクレアーゼをコード化する発現ベクターまたは核酸を含有する細胞を意味する。宿主細胞は、一般的に発現ベクターの複製または発現をサポートする。宿主細胞は、エシェリキア・コリのような原核細胞、または真核細胞、例えば、酵母、真菌、原生動物、高等植物、昆虫細胞、または両生類細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ２９３、ＣＯＳ−１、ＨＥＫのような哺乳類細胞、例えば、培養された細胞(試験管内)、移植片および１次培養物(試験管内および生体外)、および生体内細胞であり得る。
【００６０】
“核酸”は、単一または二重鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらの重合体を意味する。この用語は、公知のヌクレオチド類似体または、変形された骨格残基または、結合を含有する核酸を含み、これは合成的、自然発生的、および非−自然発生的なことがあり、基準核酸と類似する結合特性を有する。このような類似体の例は、制限なく、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(ＰＮＡ)などを含む。
【００６１】
用語“ポリペプチド”、“ペプチド”および“蛋白質”は、本明細書において、相互交換されて使用され、アミノ酸残基の重合体を意味する。また、この用語などは、自然発生アミノ酸重合体および非−自然発生アミノ酸重合体だけでなく、１つ以上のアミノ酸残基が相応する自然発生アミノ酸の人工化学的擬態体であるアミノ酸重合体にも適用する。
【００６２】
用語“アミノ酸”は、自然発生および合成アミノ酸だけでなく、自然発生アミノ酸と類似する方式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸擬態体を意味する。 自然発生アミノ酸は、遺伝コードによってコード化されるものなどだけでなく、後で変形されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンを含む。アミノ酸類似体は、自然発生アミノ酸と基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合されたα−炭素が同一の化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を含む。そのようなアミノ酸類似体は、変形されたＲ基(例えば、ノルロイシン)または、変形されたペプチド骨格を有するが、自然発生アミノ酸と同一の基本的な化学構造を維持する。アミノ酸擬態体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持つが、自然発生アミノ酸と類似する方式で機能する化学的化合物を意味する。
【００６３】
本発明において、アミノ酸は、通常的に公知された３−文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法協約によって推薦された１−文字記号で表現され得る。同様に、ヌクレオチドも通常的に承認された単一の文字コードによって表現され得る。
【００６４】
以下、本発明を実施例を介してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例
実施例１：ＺＦＮ設計およびＺＦＮ−含有プラスミドの製作
３−または、４−フィンガー配列(arrays)をエンコードするＤＮＡ断片などは、“Human zinc fingers as building blocks in the construction of artificial transcription factor”(Bae，K.H．et al．Nat Biotechnol 21，275-280(2003))に記載された方法によって組み立てた。これらの３−または、４−フィンガー配列などのうちから様々なＤＮＡ結合特異性を有した５４個のジンクフィンガーモジュール(以下、ＺＦモジュールという)を選択した。選択されたＺＦモジュールおよびこのアミノ酸配列を図１および図２に示した。選択された５４個のＺＦモジュールのうち、３１個のＺＦモジュールは、ヒトゲノムにあるＤＮＡ配列から由来したものであり、２つのＺＦモジュールは、ショウジョウバエ(Drosophila)ゲノムにあるＤＮＡ配列から由来したものである(図１)。前記のヒトおよびショウジョウバエから由来したＺＦモジュールは、トルゼン(ToolGen)モジュールと便宜上、称する。その他の２１個のＺＦモジュールは、ファージディスプレイ技術を使用したＺＦ変異体などのライブラリー(バルバスモジュール)から選択したり、部位特異的突然変異技術によって製作された(サンガモモジュール)。
【００６５】
次に、マルチ−フィンガーＺＦＮの設計のために、トルゼンで開発したコンピュータアルゴリズムを使用してヒトケモカイン(Ｃ−Ｃモチーフ)受容体５(ＣＣＲ５)コード部位のＤＮＡ配列にある可能性のあるＺＦＮ標的部位を探索した。その探索結果に基づいて、本発明者らは前記５４個のＺＦモジュールを組み合わせた２０８個のジンクフィンガー蛋白質単量体を合成し、代表的なＺＦＮ対のアミノ酸配列を図２に示した。総体的に、これら３１５個のＺＦＮ対でＣＣＲ５遺伝子内３３個の部位などを標的化しようとした(図３参照)。
【００６６】
３または４つのＺＦモジュールから構成されたジンクフィンガードメインをフラボバクテリウム・オケアノコイテス(Flavobacterium okeanokoites)ゲノムＤＮＡから由来したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインに統合させ、統合された配列をｐｃＤＮＡ３．０プラスミド(インビトロジェン)の改造されたバージョンであるｐ３クローニングベクタープラスミド内にクローニングした。
【００６７】
実施例２：ＺＦＮ活性の試験管内(in vitro)および生体内(invivo)分析
２−１．試験管内遺伝子消化分析
先ず、試験管内転写と翻訳(in vitro transcription and translation；ＩＶＴＴ)システムを使用してＺＦＮを準備し、ＣＣＲ５コード配列を含むＤＮＡ断片と共に培養して試験管内制限酵素としての活性を分析した。具体的に、TnT-Quick coupled transcription/translation system(プロメガ)を製作者の使用説明書に記述された方法(in vitro transcription and translation；ＩＶＴＴ)を使用して前記実施例１で設計したＺＦＮｓを試験管内を転写および翻訳した。簡略に、ＺＦＮｓを暗号化するプラスミド(各０．５μｌ)をTnT Quick master mix(２０μｌ)および１ｍＭメチオニン(０．５μｌ)に添加した後、３０℃で９０分間培養した。ＣＣＲ５コード配列を含む標的プラスミドは、制限酵素を処理して線形化した後、標的プラスミド(１μｇ)を前記ＺＦＮ ＩＶＴＴ分解物(それぞれ１μｌ)と共にＮＥＢｕｆｆｅｒ４(New England Biolabs)で３７℃、２時間培養させて消化させた。この反応混合物を６５℃の熱で不活性化させた後、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液を使用してアガロースゲル分析を行った。図４は、前記の分析過程を簡略に示したものであり、その実験結果は図５に示されている。
【００６８】
図５に示すように、多くのＺＦＮ対など(４０％)が標的ＤＮＡを効果的に部位−特異的に切断した。
【００６９】
２−２：単一鎖アニーリングシステム
本発明者らは、哺乳動物細胞基盤の単一鎖アニーリング(ＳＳＡ)システムを使用してＺＦＮｓがヒト細胞で相同組換えを誘導することができるかどうかを試験した。
【００７０】
２−２−１．細胞−基盤分析に使用されるレポータープラスミド
ホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’−部分を下記表１のプライマー１と２を使用してｐＧＬ３−対照群(プロメガ)から増幅し、増幅された産物をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ(インビトロジェン)のＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位内にクローニングした。下記表１のプライマー３と４を使用して増幅したルシフェラーゼ遺伝子の５’−部分を前記クローニング結果物のプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位内に連続的にクローニングした。Ｉ−ＳｃｅＩ結合部位を下記表１のプライマー５と６を使用してレポータープラスミドのＢａｍＨＩ部位内にクローニングした。プライマー７と８を使用して増幅したＣＣＲ５コード塩基配列をレポータープラスミドのＢａｍＨＩ部位内にクローニングした。
【００７１】
【表１】
【００７２】
２−２−２．細胞培養およびレポーター細胞株の設立
前記実施例１でＺＦＮコード配列を有するプラスミドで形質転換させたＨＥＫ２９３Ｔ／１７(ATCC，CRL-11268TM）細胞とＦｌｐ−ＩｎＴＭＴ−ＲＥＸＴＭ２９３細胞(インビトロジェン)を１００units／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸と１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)が添加されたダルベッコ修正イーグル培地(ＤＭＥＭ)で培養した。破裂したルシフェラーゼ遺伝子をエンコードするレポータープラスミドを製作者説明書に応じてＦｌｐ−ＩｎＴＭＴ−ＲｅｘＴＭ２９３細胞内に安定的に統合させた。要約すると、細胞をレポータープラスミドとｐＯＧ４４、Ｆｌｐ組換え酵素発現ベクターに形質転換させ、ハイグロマイシンＢを使用して選別した。破裂したルシフェラーゼ遺伝子を有しているクローン細胞株を確認し、ＳＳＡ分析に使用した。
【００７３】
２−２−３．ＳＳＡシステムを使用した細胞−基盤分析
９６−ウェルプレート型の各ウェル当り３０，０００個のレポーター細胞内に各対のＺＦＮ発現プラスミド(それぞれ１００ｎｇ)をリポフェクタミン２０００(インビトロジェン)を使用して形質導入させた。４８時間後、ドキシサイクリン(１μｇ／ｍｌ)と共に培養してルシフェラーゼ遺伝子を誘導させた。２４時間培養後に、細胞を２０μｌの１Ｘ分解緩衝溶液(プロメガ)で溶解させ、２μｌの細胞分解物に１０μｌのルシフェラーゼ分析試薬(プロメガ)を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。
【００７４】
２−２−４．結果
ＺＦＮｓを暗号化したプラスミドをヒト胎児腎臓細胞(ＨＥＫ細胞)に形質導入させた。ＣＣＲ５配列の挿入によって破壊されたホタルルシフェラーゼ遺伝子がゲノムに安定に統合され、部分的に複製された。効果的なＺＦＮｓは、ＣＣＲ５配列内に二重鎖切断(ＤＳＢ)を生じるはずであり、ＳＳＡを介して機能的なルシフェラーゼ遺伝子に復旧できるようにする。ＺＦＮｓによるＤＮＡ切断効率は、ルシフェラーゼ酵素活性によって測定できる。高効率性のメガヌクレアーゼであるＩ−ＳｃｅＩを陽性対照群として使用した。前記実験過程を図６に示し、その具体的な実験結果を図７で示した。
【００７５】
図７に示すように、多くのＺＦＮ対などが相当のルシフェラーゼ活性を示した。３１５個のＺＦＮ対のうち、２３個対は、陽性対照群Ｉ−ＳｃｅＩ対比１５−５７％のルシフェラーゼ活性を示した。１５％より低い活性を示したＺＦＮ対なども細胞内で二重鎖切断を誘導することができるが、本発明者らは、非常に高い酵素活性を示した２３対に重点を置いてさらなる研究を進行した。２３個のＺＦＮ二量体などは、ＣＣＲ５と関連のないＤＮＡ配列によって破壊された部分的に複製されたルシフェラーゼ遺伝子を有したゲノムを保有する標的無しレポーター細胞を使用した時、明らかなルシフェラーゼ活性を示さなかった(実験結果は、図示せず)。本結果を介してＺＦＮ−媒介性ＤＮＡ復旧は、ＣＣＲ５−特異性ということを示唆する。
【００７６】
実施例３：ＺＦＮなどで処理したＨＥＫ２９３細胞における突然変異の検出
ＩＶＴＴ分析でエンドヌクレアーゼ活性を示し、細胞−基盤分析でルシフェラーゼ活性を誘導させたＺＦＮｓが細胞で内因性の標的配列を修正できるかどうかを調査した。ＺＦＮｓによって誘導された二重鎖切断は、エラー発生しやすい非相同末端連結(ＮＨＥＪ)によって復旧され得る。結果産物であるＤＮＡは、たびたびＤＳＢ部位の近くに小さい挿入または欠失(挿入−欠失突然変異)を含む。挿入欠失(indel)突然変異などは、増幅されたＤＮＡ断片などを不一致−敏感性Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ(Ｔ７Ｅ１)で処理して検出することができた(図８参照)。
【００７７】
具体的に、９６−ウェルプレートで前−培養したＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞をＺＦＮ対(それぞれ１００ｎｇ)を暗号化した２つのプラスミドでリポフェクトアミン２０００(インビトロジェン)を使用して形質導入させた。培養７２時間後、製作者説明書に記載されたようにＧ−ｓｐｉｎＴＭ遺伝体ＤＮＡ抽出キット(iNtRON BIOTECHNOLOGY)を使用してＺＦＮ−形質導入された細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。ＺＦＮ標的部位を含むゲノムの部分を増幅し、溶かし且つアニーリングしてヘテロ接合ＤＮＡを形成した。Ｚ３０部位のためにプライマー９と１２を使用し、Ｚ２６６とＺ３６０部位のためにプライマー１０と１２、Ｚ４１０、Ｚ４２６とＺ４３０部位のためにはプライマー１１と１２、Ｚ８３６とＺ８９１部位のためのプライマー１３と１４を使用した(表１参照)。アニーリングされたＤＮＡを３７℃で１５分間５unitsのＴ７エンドヌクレアーゼ１(New England BioLabs)で処理した後、２．５倍体積のエタノールを添加して沈殿させた。沈殿されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分析した。その結果を図９に示した。
【００７８】
図９に示すように、ＺＦＮが処理された細胞から増幅されたＤＮＡの小さい断片などをＴ７Ｅ１で切断した。各ＺＦＮ対は、ＺＦＮなどが８個の異なる部位などを標的化する事実を反映する特有の切断パターンを形成した。さらに、結果として出た、ＤＮＡバンドなどのサイズは予想したところようであった。Ｔ７Ｅ１分析で試験した２３個のＺＦＮ対のうちで、２１個のＺＦＮ対は予想したサイズを有した検出可能なＤＮＡバンドなどを示した(実験結果は、図示せず)。
【００７９】
また、本発明者らは、ＩＶＴＴ分析で明確なエンドヌクレアーゼ活性を示さなかったり、細胞−基盤ＳＳＡシステムで意味のあるルシフェラーゼ活性を示さなかった代表的なＺＦＮ対を試験するためにＴ７Ｅ１分析を使用したが、ＩＶＴＴ試験は行わなかった。Ｔ７Ｅ１分析結果、いずれのＺＦＮ対も検出可能な水準でＤＮＡ突然変異を誘導しなかった。
【００８０】
実施例４：ＺＦＮなどによって誘導された突然変異に対するＤＮＡ配列の分析
本発明者らは、ＣＣＲ５遺伝子内の他の部位をそれぞれ標的化する代表的なＺＦＮ対８個を選択して付加的な研究を行った(表２参照)。先ず、任意の個別的な８個のＺＦＮなどがホモ二量体として機能できるかどうかを検査した。単独ＺＦＮ単量体それぞれの遺伝子標的化活性度をＴ７Ｅ１分析を使用して評価した。予想した通りに、ＺＦＮ単量体などのうち、いずれも検出可能なＤＮＡ切断を生じなかった(実験結果は、図示せず)。
【００８１】
【表２】
【００８２】
本発明者らは、標的化された領域のＤＮＡ配列を確認してＺＦＮなどによって誘導された突然変異などを確認し、突然変異発生率を測定した。８個のＺＦＮ対のそれぞれに形質導入された細胞などから増幅されたＤＮＡをクローニングし、配列を確認した。様々な挿入および欠失などがＤＳＢ部位近傍で観察された(図１０〜１４参照)。これらの突然変異パターンなどは、エラー発生しやすいＮＨＥＪ−連関突然変異の表示として、これらと類似するパターンなどが他の文献によって報告されたことがある(Bibikova, M., Golic, M., Golic, K.G. & Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophilausing zinc-finger nucleases. Genetics 161, 1169-1175 (2002); Morton, J., Davis, M.W., Jorgensen, E.M. & Carroll, D. Induction and repair of zinc-finger nuclease-targeted double-strand breaks in Caenorhabditiselegans somatic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 16370-16375 (2006); Santiago, Y. et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proc Natl Acad Sci U S A105, 5809-5814 (2008))。小さい部分の挿入−欠失突然変異および置換に加えて、本発明者らは、２つのＺＦＮ対(図１１のＺ３０と、図１２のＺ３６０参照)により相対的に大きい挿入など(それぞれ互いに異なる８１ヌクレオチド)を観察した。ＤＮＡ配列分析によれば、挿入された配列などがＺＦＮなどを暗号化したプラスミドから出たことが明らかになった。
【００８３】
区別される部位などを標的化する８個のＺＦＮ対は、突然変異率が２．４％から１７％に示され(図１５参照)、この時、突然変異率は、突然変異クローンの数を分析された全体クローンの数で割って計算した。ＺＦＮ誘導突然変異の高い効率性は、ただ１０個〜１００個の単一細胞由来のコロニーなどをスクリーニングしてクローニングされた突然変異細胞を分離できるということを示唆する。
【００８４】
実施例５：ＺＦＮ処理後のクローン細胞の分離
５−１．本発明のＺＦＮの非標的化(off-target)効果
他の研究者らの先行研究に示されたように(Szczepek, M. et al. Structure-based redesign of the dimerizationinterface reduces the toxicity of zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol25, 786-793 (2007); Miller, J.C. et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat Biotechnol25, 778-785 (2007))、あるＺＦＮなどは、非標的化(off-target)効果を持って哺乳動物細胞で発現させた時に細胞毒性を示す。しかし、本発明者らは、本発明のＺＦＮなどで形質転換されたＨＥＫ２９３細胞で明確な成長遅延が観察されなかった。しかし、初期に制限された数の単一細胞コロニーなどをスクリーニングした時、ＺＦＮ処理によってゲノム配列が修正されたクローン性突然変異細胞などを分離することができなかった。このような事実は、ＺＦＮによって誘導された突然変異を保有した哺乳類細胞の成長が損傷されたことを示す。
【００８５】
従って、本発明者らは、ＺＦＮ−誘導突然変異を有する哺乳類細胞の成長が損傷されて修正されない細胞に比べて顕著に成長が抑制されるかどうかを調査するために、ＺＦＮ形質導入の後、３日、６日、そして９日目になる日に細胞から分離したＤＮＡに対してＴ７Ｅ１分析を行った。その分析のために、Ｚ８９１対を選択し、図１６に示すように、切断されたＤＮＡの断片などは、３日目になる日に比べて６日目に顕著に減少し、ＺＦＮを処理した以後の９日目になる日では、ほとんど検出できなかった。このような結果は、ＺＦＮ媒介性突然変異は、細胞成長に細胞毒性効果を持っていることを示唆する。
【００８６】
５−２．本発明のＺＦＮヘテロ二量体の非標的化(off-target)効果
ＺＦＮなどの非標的化(off-target)効果は、主に、ヘテロ二量体およびホモ二量体の両方を形成するＺＦＮなどの活性によって引き起こされる。このような効果は、ホモ二量体を形成できず、ヘテロ二量体だけを形成するＦｏｋＩヌクレアーゼ変形体を使用することによって、顕著に減少させ得た。従って、ＺＦＮｓの細胞毒性効果を減少させるために、本発明者らは、いわゆる強制的なへテロ二量体(obligatory heterodimers)を２つの異なる類型で準備(図１６で“ＲＲ／ＤＤ”二量体などと、“ＫＫ／ＥＬ”二量体などとして示した)し、Ｔ７Ｅ１分析を行った。Ｔ７Ｅ１分析結果、細胞がＲＲ／ＤＤＺＦＮ対に形質転換される時、切断されたＤＮＡ断片などがＺＦＮ処理９日以後でも維持されたこととして明らかになった。強制的なへテロ二量体ＺＦＮの減少した細胞毒性が細胞内ＤＮＡ切断特異性強化によるものであるということを確認するために、本発明者らは、ＺＦＮを処理した細胞でＤＳＢ個数をＤＳＢにリクルートされる蛋白質である５３ＢＰ１に対する抗体を使用して分析した。具体的に、５３ＢＰ１に対する核内染色をＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞で行った。カバー(ＮＵＮＣ)が装着されたＬａｂ−Ｔｅｋのチャンバースライドを使用して細胞を付着させ、３．７％ホルムアルデヒドで固定させてスライドを準備した。続いて、常温(RT)で１０分間ＰＢＳ(phosphate-buffered saline)内０．２％トリトンＸ−１００で処理することによって、細胞を透過性があるように作った。続いて、細胞を５％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)の存在下で抗−５３ＢＰ１ウサギポリクローナル抗体(Bethyl Laboratories)とインキュベーションして非特異的染色を遮断させ、続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−接合された二次抗体(インビトロジェン−Molecular Probes)とインキュベーションした。スライドをＤＡＰＩ(シグマ)存在下で搭載して細胞核を対比染色し、免疫蛍光顕微鏡(Carl Zeiss−LSM510)で検査した。その結果を図１７および１８に示した。図１７および１８に示すように、ＲＲ／ＤＤＺＦＮ対で処理した細胞で、対応する野生型ＺＦＮ対で処理した細胞と比較した時、５３ＢＰ１フォーカスなど(foci)の数が顕著に減少した。
【００８７】
５−３．ＺＦＮで処理したゲノムでの突然変異確認
次に、９６−ウェルプレートで分離成長させた２２５個の単一細胞コロニーをスクリーニングした後、Ｚ８９１ＲＲ／ＤＤＺＦＮ対を用いて７個の互いに異なる突然変異クローンＨＥＫ２９３細胞などを分離した。本発明者らは、これらのクローン細胞内のＣＣＲ５領域などのＤＮＡ塩基配列を分析してＺＦＮ−誘導ゲノム修正を確認した。修正された細胞でゲノムのＤＮＡ塩基配列を分析した結果、これら７個のクローンなどのうち、６個のクローンではＣＣＲ５対立遺伝子のうち、一ヶ所で欠失あるいは挿入が生じられ、他の１つのクローンは、２つの対立遺伝子で修正が示された(図１９参照)。２９３細胞の遺伝体は、部分的に３つの染色体を示すからＣＣＲ５遺伝子が３つ存在する。２つのＣＣＲ５対立遺伝子の両方で修正されたクローンで１つの修正されなかった野生型配列が観察された(図１９参照)。ＺＦＮ処理によって対立遺伝子２つを修正できるということは、選択マーカーを使用せず単一段階でホモ接合ノックアウト細胞を分離できるということを示唆する。
【００８８】
実施例６：ホモＣＣＲ２部位でＣＣＲ−５標的化ＺＦＮなどの非標的化(off-target)効果
ＣＣＲ２遺伝子は、ＣＣＲ５遺伝子と非常に高い相同性を有しており、多くのＣＣＲ５ＺＦＮ認識要素などがＣＣＲ２部位でも保存されている。従って、本発明者らは、ＣＣＲ５部位に対して設計された８個のＺＦＮなどがＣＣＲ２部位での相同性または同一配列も変異させ得るかどうかを検査した。ＣＣＲ２遺伝子にある同一の認識要素などを持っている３つのＺＦＮ対(Ｚ３６０、Ｚ４１０とＺ４３０)は、Ｔ７Ｅ１分析で効果的な遺伝体修正を誘導することができた(図２０参照)。ＣＣＲ２遺伝子の場合、Ｚ８９１対の認識要素はＣＣＲ５遺伝子の相応する部分と完璧に一致し、１つの塩基が不一致する１２−ｂｐハーフ部位(half-site)から構成されている。予想した通りに、Ｚ８９１対は、またＣＣＲ２部位で相当な遺伝子標的化活性を示した。また、本発明者らは、ＣＣＲ２部位内の認識要素が各１２−ｂｐハーフ部位(half-site)で１つの塩基が不一致するサンガモ社のＣＣＲ５標的化ＺＦＮ対を試験し、サンガモ社のＺＦＮは、相同性ＣＣＲ２部位で非標的化(off-target)ゲノム修正を示した(図２０参照)。一方、ＣＣＲ２部位で認識要素が２つ以上の不一致を示すＺＦＮ対(Ｚ３０、Ｚ２６６とＺ８３６)は、ＺＦＮ活性が観察されなかった。
【００８９】
また、本発明者らは、Ｚ８９１対にＨＥＫ２９３細胞を形質導入させて獲得した７個の突然変異クローン細胞が、意図したＣＣＲ５部位での突然変異に加えて高い相同性を有したＣＣＲ２部位のＤＮＡ塩基配列においても突然変異を誘導するかどうかを実験した。その結果を図２１に示した。図２０に示すように、Ｚ８９１対は、Ｔ７Ｅ１分析でＣＣＲ５部位だけでなく、ＣＣＲ２部分に対しても相当の遺伝子標的化活性を示したが、ＣＣＲ２部位はこれらのクローン細胞株などで変異が起きなかった。このような結果は、ＺＮＦ処理の後、細胞をスクリーニングしてただ意図した標的部位のみ変異が起きて、相同性部位では変異が起きない細胞を分離することができるということを立証した。
【００９０】
実施例７：モジュール交換分析
本発明者らは、モジュラー組み立てを介したＺＦＮなどの製作が、なぜゲノム編集において高い成功率を導くのか調査した。具体的に、本発明のＺＦＮを同一のＤＮＡ−結合特異性を示すバルバスまたはサンガモのモジュールから製作したＺＦＮで置換するモジュール交換実験を行った。
【００９１】
このために、バルバスまたはサンガモモジュールのみで構成された８個の新しいＺＦＮ単量体を準備し、これでトルゼンモジュールのみで構成された６個の異なるＺＦＮ単量体などを代替した(表３および図２２参照)。これらの新しいＺＦＮ単量体のそれぞれは、適切な対であるＺＦＮ単量体などと対をなすようにし、その結果産物であるＺＦＮ対をＳＳＡとＴ７Ｅ１分析を介して検査した。図２３および２４に示すように、新しく合成されたＺＦＮ単量体などのうち、少なくとも１つで構成されたＺＦＮ対は、いずれもＳＳＡシステムでなんらの明確な活性を示さなかった(図２３参照)。さらに、それらの中でどんなＺＦＮもＴ７Ｅ１分析で遺伝子標的化活性を示さなかった(図２４参照)。
【００９２】
【表３】
【００９３】
このような結果などは、機能的ＺＦアレイなどのモジュール組み立てにおいて工学的に製作されたＺＦなどより自然発生ＺＦなどがより信頼できるような構造を構成するという提案を強力に裏付ける。
【００９４】
実施例８：本発明のＺＦモジュール評価
本発明者らが製作した３１５個のＺＦＮ対に対する統計学的分析は、関心のある追加的な内在性遺伝子の標的化された突然変異のために使用され得る新しいＺＦＮ設計の基礎を提供することができる。このために、本発明者らは、ＳＳＡシステムで陽性点数を有する２３個のＺＦＮ対で各ＺＦの発生頻度数を測定した。続いて、各ＺＦに対する“活性指数”を全体２０８ＺＦＮ単量体内モジュールの発生頻度数で割ることによって決定した(図１および２)。一部高い活性を示すＺＦなど、例えば、“ＱＮＴＱ”と“ＲＳＨＲ”は、それぞれ５０％と３８％の活性指数を持ち、それらの高い活性指数は、生体内部位特異的なヌクレアーゼ活性を予測できるから、それらのモジュールなどが信頼性があるということを提案している。“ＱＳＮＫ”と“ｒｄａｅ”のような他のＺＦなどは、本分析で非効率的なモジュールとして示され、活性指数０値を示した。それらの２種類のＺＦなどのいずれもそれぞれ１５回使用したが、そのモジュールなどを含むＺＦＮなどのうち、何も本分析で活性を示さなかった。また、本発明者らは、同一のＤＮＡ認識特異性を持ったＺＦなどの活性指数を比較した。一部のＺＦなどは、他の標的−等価物モジュールよりも顕著に優れた。例えば、“ＤＳＮＲ”と“ＨＳＮＫ”の両方とも同一のＧＡＣ塩基配列を認識した。ＺＦＮなどの製作に“ＤＳＮＲ”を使用すれば、多くの活性ヌクレアーゼ(活性指数＝３５％)を生産できるようにしたが、一方“ＨＳＮＫ”の統合は、単に非活性ＺＦＮなどのみを生産するようにした(活性指数＝０％)。
【００９５】
前記の統計学的分析に基づいて、本発明者らは、以後の遺伝子編集研究のために、試験的に３７個のＺＦなど(２４個のトルゼンモジュール、１つのサンガモモジュール、１２個のバルバスモジュール)を使用することができることを提案する(図１および２参照)。もし、本発明者らが実験にそれら３７個のモジュールのみを使用したとすれば、これは現在の比率(２４％)よりもはるかに大きい５３％の全体的な成功率数値が出てきただろう(図２６参照)。それら３７個のモジュールのすべては、活性ＺＦＮなどで少なくとも一回ずつは発見された。２つあるいはそれ以上の標的−等価物ＺＦなどが存在した時、非常に高い活性指数を持ったモジュールを選択した。３７個のＺＦなどは、全体的に３−ｂｐ下位部位６４個のうち、３８個を認識した。与えられた１−ｋｂｐのランダムＤＮＡ配列の場合、３−フィンガーＺＦＮ二量体に対する８８[＝(３８／６４)６Ｘ１０００Ｘ２]の可能性のある認識部位など(ハーフ部位などの間に５または６個の塩基スペーサー含む)が存在することができ、４−フィンガー二量体では、３１個の認識部位を予想することができる。本発明の成功率を９．１％から２６％と(もし、３７個のＺＦなどを使用するとすれば、実際成功率は顕著に高いが、残りは非効率的なモジュールではない)仮定すると、１−ｋｂｐの標的配列で平均８部位でＺＦＮ−媒介性ゲノム編集が可能であるだろう。このような結果は、大部分の真核遺伝子が本発明のＺＦＮ組み立て方法で“標的化”が可能であるということを示す。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
多くの遺伝子治療の適用時、前記したジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＣＣＲ５遺伝子をノックアウトさせるのに使用してエイズ患者などでＨＩＶ感染に抵抗性のあるＴ細胞を生産することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジンクフィンガードメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含む融合蛋白質であって、
前記ジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、
前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来し、
前記融合蛋白質は、細胞染色質内の関心領域を含むヌクレオチド配列を認識および切断することを特徴とするジンクフィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)。
【請求項２】
前記ジンクフィンガードメインは、３または４つのジンクフィンガーモジュールを含むものである請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項３】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つである請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項４】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、二量体形態で作用してヌクレオチド配列を切断することを特徴とする請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項５】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１つである請求項４に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項６】
前記ヌクレオチド切断ドメインは、タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項７】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項６に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項８】
請求項１のジンクフィンガーヌクレアーゼを１対以上含む、標的化された領域内でヌクレオチド配列の切断、交替または、変更のためのキット。
【請求項９】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼ対は、同一または異なるジンクフィンガードメインであることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼ対は、表２に記載されたもののうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド切断ドメインは、タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
（ａ）関心領域のヌクレオチド配列を選択する段階；
（ｂ）前記配列に結合するジンクフィンガーモジュールを選択し、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含みながら、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来したものであるジンクフィンガードメインを工学的に製造する段階；
（ｃ）前記ジンクフィンガードメインとヌクレオチド切断ドメインを含む融合蛋白質を発現させる段階を含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項１５】
前記ジンクフィンガードメインは、３または４つのジンクフィンガーモジュールを含むものである請求項１４に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項１６】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つである請求項１４に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項１７】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、二量体形態で作用してヌクレオチド配列を切断することを特徴とする請求項１４に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項１８】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１つである請求項１７に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド切断ドメインは、タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１４に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項２０】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項１９に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項２１】
（ａ）関心領域内の第１のヌクレオチド配列を選択する段階；
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と結合する請求項１のジンクフィンガーヌクレアーゼを選択する段階；
（ｃ）前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを前記ヌクレオチド配列を有する細胞内で発現させたり、前記細胞外で発現させて前記細胞内へ導入させる段階；および
（ｄ）(細胞内で発現されたり、細胞内に導入された)第１のジンクフィンガーヌクレアーゼが前記配列と結合して前記関心領域内の細胞染色質を切断する段階を含む関心領域内のヌクレオチド切断方法。
【請求項２２】
前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、第１のジンクフィンガドメインおよび第１のヌクレオチド切断ドメインを含み、
（ｅ）第２のジンクフィンガードメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを選択し、前記ヌクレオチド配列を有する細胞内で発現させたり、細胞外で発現して前記細胞内へ導入させる段階；および
（ｆ）(前記細胞内で発現されたり、導入された)第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを、前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼが結合する第１のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れている関心領域内の第２のヌクレオチド配列と結合させる段階を含む請求項２１に記載の関心領域内の細胞染色質切断方法。
【請求項２３】
前記第１および第２のヌクレオチド配列の間で切断がなされることを特徴とする請求項２１又は２２に記載の切断方法。
【請求項２４】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項２１又は２２に記載の切断方法。
【請求項２５】
前記第１および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１対である請求項２１又は２２に記載の切断方法。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド切断ドメインは、タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項２１又は２２に記載の切断方法。
【請求項２７】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項２６に記載の切断方法。
【請求項２８】
（ａ）関心領域を選択する段階；
（ｂ）前記関心領域内の第１のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを提供する段階；
（ｃ）前記第１の配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れている関心領域内の第２のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；
（ｄ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第１のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で同時または、分離して発現させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在するジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガドメインは、前記第１のヌクレオチド配列と結合し、前記第２のジンクフィンガードメインは、前記第２のヌクレオチド配列と結合し、前記結合によって前記ヌクレオチド切断ドメインを位置させて関心領域内の細胞染色質を切断させる、関心領域内の細胞染色質切断方法。
【請求項２９】
前記第１および第２のヌクレオチド配列の間で切断がなされることを特徴とする請求項２８に記載の切断方法。
【請求項３０】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項２８に記載の切断方法。
【請求項３１】
前記第１および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１対である請求項２８に記載の切断方法。
【請求項３２】
前記第１および第２のヌクレオチド切断ドメインは、同一のエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項２８に記載の切断方法。
【請求項３３】
前記エンドヌクレアーゼがタイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項３２に記載の切断方法。
【請求項３４】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項３３に記載の切断方法。
【請求項３５】
細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列交替方法であって、
（ａ）関心領域内で９個以上のヌクレオチドを含む第２のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを工学的に製造する段階；
（ｂ）前記第２のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れて位置し、９個以上のヌクレオチドを含む第３のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；
（ｃ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第３のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる段階；
（ｄ）前記細胞を前記第１のヌクレオチド配列と相同性があるが同一ではない第４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに接触させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在するジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第２配列の結合および前記第２のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第３配列の結合によって切断ドメインを位置させ、前記細胞染色質が関心領域内で切断され、これによって前記第１のヌクレオチド配列と前記第４のヌクレオチド配列との間の相同組換えを容易にして前記第１のヌクレオチド配列を前記第４のヌクレオチド配列に交替することを特徴とする交替方法。
【請求項３６】
前記第２および第３のヌクレオチド配列の間で切断がなされることを特徴とする請求項３５に記載の交替方法。
【請求項３７】
前記第４のヌクレオチド配列は、前記関心領域と相同性がある配列などに隣接している関心領域内に存在しない配列を含むことを特徴とする請求項３５に記載の交替方法。
【請求項３８】
前記第１のヌクレオチド配列が遺伝子内突然変異を含むことを特徴とする請求項３５に記載の交替方法。
【請求項３９】
前記突然変異は、点突然変異、置換、欠失および挿入から構成される群からいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項３８に記載の交替方法。
【請求項４０】
前記第４のヌクレオチド配列は、前記遺伝子の野生型配列を含むことを特徴とする請求項３８に記載の交替方法。
【請求項４１】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項３５に記載の交替方法。
【請求項４２】
前記第１および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１対である請求項３５に記載の交替方法。
【請求項４３】
前記第１および第２のヌクレオチド切断ドメインは、同一のエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項３５に記載の交替方法。
【請求項４４】
前記エンドヌクレアーゼがタイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項４３に記載の交替方法。
【請求項４５】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項４４に記載の交替方法。
【請求項４６】
細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列変更方法であって、
（ａ）関心領域内の９個以上のヌクレオチドを含む第２のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを工学的に製造する段階；
（ｂ）前記第２のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れて位置し、９個以上のヌクレオチドを含む第３のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；
（ｃ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第３のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの１つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第２配列の結合および前記第２のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第３配列の結合によって切断ドメインを位置させ、前記細胞染色質を関心領域内で切断させ、前記切断部位で前記第１のヌクレオチド配列を変更させることを特徴とする変更方法。
【請求項４７】
前記突然変異は、点突然変異、置換、欠失および挿入から構成される群からいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項４６に記載の変更方法。
【請求項４８】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項４６に記載の変更方法。
【請求項４９】
前記第１および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１対である請求項４６に記載の変更方法。
【請求項５０】
前記第１および第２のヌクレオチド切断ドメインは、同一のエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項４６に記載の変更方法。
【請求項５１】
前記エンドヌクレアーゼがタイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項５０に記載の変更方法。
【請求項５２】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項５１に記載の変更方法。
【請求項１】
ジンクフィンガードメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含む融合蛋白質であって、
前記ジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、
前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来し、
前記融合蛋白質は、細胞染色質内の関心領域を含むヌクレオチド配列を認識および切断することを特徴とするジンクフィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)。
【請求項２】
前記ジンクフィンガードメインは、３または４つのジンクフィンガーモジュールを含むものである請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項３】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つである請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項４】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、二量体形態で作用してヌクレオチド配列を切断することを特徴とする請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項５】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１つである請求項４に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項６】
前記ヌクレオチド切断ドメインは、タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項７】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項６に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項８】
請求項１のジンクフィンガーヌクレアーゼを１対以上含む、標的化された領域内でヌクレオチド配列の切断、交替または、変更のためのキット。
【請求項９】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼ対は、同一または異なるジンクフィンガードメインであることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼ対は、表２に記載されたもののうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド切断ドメインは、タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
（ａ）関心領域のヌクレオチド配列を選択する段階；
（ｂ）前記配列に結合するジンクフィンガーモジュールを選択し、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含みながら、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来したものであるジンクフィンガードメインを工学的に製造する段階；
（ｃ）前記ジンクフィンガードメインとヌクレオチド切断ドメインを含む融合蛋白質を発現させる段階を含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項１５】
前記ジンクフィンガードメインは、３または４つのジンクフィンガーモジュールを含むものである請求項１４に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項１６】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つである請求項１４に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項１７】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、二量体形態で作用してヌクレオチド配列を切断することを特徴とする請求項１４に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項１８】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１つである請求項１７に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド切断ドメインは、タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１４に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項２０】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項１９に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの製造方法。
【請求項２１】
（ａ）関心領域内の第１のヌクレオチド配列を選択する段階；
（ｂ）第１のヌクレオチド配列と結合する請求項１のジンクフィンガーヌクレアーゼを選択する段階；
（ｃ）前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを前記ヌクレオチド配列を有する細胞内で発現させたり、前記細胞外で発現させて前記細胞内へ導入させる段階；および
（ｄ）(細胞内で発現されたり、細胞内に導入された)第１のジンクフィンガーヌクレアーゼが前記配列と結合して前記関心領域内の細胞染色質を切断する段階を含む関心領域内のヌクレオチド切断方法。
【請求項２２】
前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼは、第１のジンクフィンガドメインおよび第１のヌクレオチド切断ドメインを含み、
（ｅ）第２のジンクフィンガードメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを選択し、前記ヌクレオチド配列を有する細胞内で発現させたり、細胞外で発現して前記細胞内へ導入させる段階；および
（ｆ）(前記細胞内で発現されたり、導入された)第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを、前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼが結合する第１のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れている関心領域内の第２のヌクレオチド配列と結合させる段階を含む請求項２１に記載の関心領域内の細胞染色質切断方法。
【請求項２３】
前記第１および第２のヌクレオチド配列の間で切断がなされることを特徴とする請求項２１又は２２に記載の切断方法。
【請求項２４】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項２１又は２２に記載の切断方法。
【請求項２５】
前記第１および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１対である請求項２１又は２２に記載の切断方法。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド切断ドメインは、タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項２１又は２２に記載の切断方法。
【請求項２７】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項２６に記載の切断方法。
【請求項２８】
（ａ）関心領域を選択する段階；
（ｂ）前記関心領域内の第１のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを提供する段階；
（ｃ）前記第１の配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れている関心領域内の第２のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；
（ｄ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第１のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で同時または、分離して発現させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在するジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガドメインは、前記第１のヌクレオチド配列と結合し、前記第２のジンクフィンガードメインは、前記第２のヌクレオチド配列と結合し、前記結合によって前記ヌクレオチド切断ドメインを位置させて関心領域内の細胞染色質を切断させる、関心領域内の細胞染色質切断方法。
【請求項２９】
前記第１および第２のヌクレオチド配列の間で切断がなされることを特徴とする請求項２８に記載の切断方法。
【請求項３０】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項２８に記載の切断方法。
【請求項３１】
前記第１および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１対である請求項２８に記載の切断方法。
【請求項３２】
前記第１および第２のヌクレオチド切断ドメインは、同一のエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項２８に記載の切断方法。
【請求項３３】
前記エンドヌクレアーゼがタイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項３２に記載の切断方法。
【請求項３４】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項３３に記載の切断方法。
【請求項３５】
細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列交替方法であって、
（ａ）関心領域内で９個以上のヌクレオチドを含む第２のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを工学的に製造する段階；
（ｂ）前記第２のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れて位置し、９個以上のヌクレオチドを含む第３のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；
（ｃ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第３のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる段階；
（ｄ）前記細胞を前記第１のヌクレオチド配列と相同性があるが同一ではない第４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに接触させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの２つ以上は、自然界に存在するジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第２配列の結合および前記第２のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第３配列の結合によって切断ドメインを位置させ、前記細胞染色質が関心領域内で切断され、これによって前記第１のヌクレオチド配列と前記第４のヌクレオチド配列との間の相同組換えを容易にして前記第１のヌクレオチド配列を前記第４のヌクレオチド配列に交替することを特徴とする交替方法。
【請求項３６】
前記第２および第３のヌクレオチド配列の間で切断がなされることを特徴とする請求項３５に記載の交替方法。
【請求項３７】
前記第４のヌクレオチド配列は、前記関心領域と相同性がある配列などに隣接している関心領域内に存在しない配列を含むことを特徴とする請求項３５に記載の交替方法。
【請求項３８】
前記第１のヌクレオチド配列が遺伝子内突然変異を含むことを特徴とする請求項３５に記載の交替方法。
【請求項３９】
前記突然変異は、点突然変異、置換、欠失および挿入から構成される群からいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項３８に記載の交替方法。
【請求項４０】
前記第４のヌクレオチド配列は、前記遺伝子の野生型配列を含むことを特徴とする請求項３８に記載の交替方法。
【請求項４１】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項３５に記載の交替方法。
【請求項４２】
前記第１および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１対である請求項３５に記載の交替方法。
【請求項４３】
前記第１および第２のヌクレオチド切断ドメインは、同一のエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項３５に記載の交替方法。
【請求項４４】
前記エンドヌクレアーゼがタイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項４３に記載の交替方法。
【請求項４５】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項４４に記載の交替方法。
【請求項４６】
細胞染色質で関心領域内の第１のヌクレオチド配列変更方法であって、
（ａ）関心領域内の９個以上のヌクレオチドを含む第２のヌクレオチド配列と結合する第１のジンクフィンガドメインを工学的に製造する段階；
（ｂ）前記第２のヌクレオチド配列から２〜５０ヌクレオチドほど離れて位置し、９個以上のヌクレオチドを含む第３のヌクレオチド配列と結合する第２のジンクフィンガードメインを提供する段階；
（ｃ）前記第１のジンクフィンガドメインおよび第２のヌクレオチド切断ドメインを含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、および前記第２のジンクフィンガードメインおよび第３のヌクレオチド切断ドメインを含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる段階を含み；
前記第１および第２のジンクフィンガードメインは、３つ以上のジンクフィンガーモジュールを含み、前記ジンクフィンガーモジュールのうちの１つ以上は、自然界に存在する野生型ジンクフィンガーモジュールから由来したものであり、
前記第１のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第２配列の結合および前記第２のジンクフィンガーヌクレアーゼと前記第３配列の結合によって切断ドメインを位置させ、前記細胞染色質を関心領域内で切断させ、前記切断部位で前記第１のヌクレオチド配列を変更させることを特徴とする変更方法。
【請求項４７】
前記突然変異は、点突然変異、置換、欠失および挿入から構成される群からいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項４６に記載の変更方法。
【請求項４８】
前記ジンクフィンガーモジュールは、図１に記載されたモジュールのうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項４６に記載の変更方法。
【請求項４９】
前記第１および第２のジンクフィンガーヌクレアーゼは、表２に記載されたもののうちのいずれか１対である請求項４６に記載の変更方法。
【請求項５０】
前記第１および第２のヌクレオチド切断ドメインは、同一のエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項４６に記載の変更方法。
【請求項５１】
前記エンドヌクレアーゼがタイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項５０に記載の変更方法。
【請求項５２】
前記タイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであることを特徴とする請求項５１に記載の変更方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１８】
【図１９】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２５】
【図２６】
【図５】
【図９】
【図１６】
【図１７】
【図２０】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１８】
【図１９】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２５】
【図２６】
【図５】
【図９】
【図１６】
【図１７】
【図２０】
【図２４】
【公表番号】特表２０１２−５１４５９５（Ｐ２０１２−５１４５９５Ａ）
【公表日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４４３５４（Ｐ２０１１−５４４３５４）
【出願日】平成２１年９月１８日（２００９．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００５３１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６９３９
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５１１１５８６１６）ツールゲン インコーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１８日（２００９．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００５３１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６９３９
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５１１１５８６１６）ツールゲン インコーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
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