新規なＲＵＢＩＳＣＯプロモーターおよびその使用
本発明は、光成長されたＢｒａｓｓｉｃａ実生から入手可能であり、子葉に発現を向けることが可能な新規な時空的に活性なＲｕｂｉｓｃｏプロモーター（配列番号：１、２または３）のファミリーおよび特定の植物組織におけるまたは植物成長の特定の段階でのトランスジーン発現に関する。プロモーターは、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子によって機能的に融合された該プロモーター配列のうちの少なくとも１つを含む、ＤＮＡ構築体またはカセットを設計するのに有用である。形質転換された同種および異種植物からのおよび形質転換された植物の引き続いての世代からの種子が収集され、遺伝子産物の、特に含有された条件での効率的な生産に使用される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、トランスジェニック植物に関する。より具体的には、植物成長の特定の段階でのトランスジーン発現に関する。さらにより具体的には、本発明は、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のＲｕｂｉｓｃｏプロモーター、および遺伝子産物の、特に含有された使用のための効率的な生産のための同種または異種植物の形質転換のための該プロモーターのうちの少なくとも１つを含むＤＮＡ構築体または発現カセットに関する。
【０００２】
発明の背景
リブロース−１，５−二リン酸との反応を介する大気中二酸化炭素のホスホグリセリン酸への同化および変換は、厳密には、Ｒｕｂｉｓｃｏ酵素の活性に依存する(Spreitzer, R.J., Arch. Biochem. Biophys. 414(2), 141-9, 2003; Spreitzer, R.J., et al., Annu. Rev. Plant Biol., 53, 449-75, 2002)。構造的には、Ｒｕｂｉｓｃｏ酵素は、８つの小さなサブユニット（ＳＳＵ）および８つの大きなサブユニット（ＬＳＵ）よりなる。ＳＳＵ蛋白質は、植物の核ゲノムに位置するいくつかの遺伝子によってコードされ、一方、ＬＳＵ遺伝子は、色素体ゲノム中で見受けられる。異なる植物中のＲｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵ遺伝子の数は、４コピーから１５コピーまたはいくつかの倍数体ゲノムにおいてはそれ以上へと変動する。Ｒｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵ遺伝子の少なくとも４コピーは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｂｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）中に存在することが分かっており、１２またはさらにそれ以上のコピー／倍数体ゲノムは、小麦中に存在することが分かっている(Sasanuma, T., Mol. Genet. Genomics. 265 (1),161-171, 2001; Sasanuma, T. and Miyashita, N.T., Genes Genet. Syst.,73(5), 297-309, 1998)。
【０００３】
Ｒｕｂｉｓｃｏ酵素は、植物中に存在する最も普遍的な酵素のうちの１つである。Ｒｕｂｉｓｃｏ酵素をコードする遺伝子のプロモーターは、それらの特定の特徴のいずれも特定することなしに、植物を形質転換するためのＤＮＡ構築体の調製に有用な強力なプロモーターとして提案されている(米国５，９９４，６２８、米国２００２／０１７００９６、米国２００３／００９７６７８)。
【０００４】
高等植物中のＲｂｃＳ遺伝子の構造、進化および制御は、Dean, C. et al (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 415-439, 1989)によって記載されており、ＲｂｃＳ遺伝子の構造および機能に基づく。Dean et al.は、核遺伝子が、マルチジェニックファミリーにグループ分けできると提案している。これらのファミリーの遺伝子構造は、アブラナ科（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、トマト、キク科（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓおよび大豆のような他の植物において、広く研究されている。トマトには、３つの染色体座に位置する５つのＲｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵ（ｒｂｃＳ）遺伝子が存在し、１つは染色体３、他の４つは染色体２にある(Sugita, M., et al., Mol. Gen. Genetic., 209 (2), 247-256,1987)。さらに、遺伝子のうちの３つは、１０ｋｂ領域内のタンデムアレイに組織されることが分かっている。状況は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｒｂｃＳ遺伝子ファミリーにおいて非常に似ている(Krebbers, E., et al., Plant Mol. Biol. 11, 745-759, 988; Niwa, Y., et al., NA Res., 4(5), 341-343, 1997; Dedonder, A., et al., Plant Physiol., 101, 3, 801-808, 1993)。Galili, S., et al., Mol. Gen. Genet., 263 (4), 674-680, 2000.
【０００５】
Outchkourov, N.S. et al. (Planta, 216 (6), 1003-1012, 2002)は、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ種（Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ Ｒａｍａｔ．)のＲｕｂｉｓｃｏ小−サブユニット遺伝子ファミリーの豊富に転写されたｒｂｃＳ１のクローンを作り、ｒｂｃＳ１−プロモーターの制御下で、ＧＵＳを発現するＵｉｄＡ遺伝子を含有する遺伝子カセットで形質転換されたタバコ植物が、葉における総可溶性蛋白の最大１０％ＧＵＳを提供したことを示した。たとえ、キク科（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）からの該Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターが、タバコ葉において、高蛋白質発現レベルを与えたとしても、他の発達段階での高発現は示されていない。
【０００６】
米国特許出願２００２／０１７００９６は、Ｒｉ−またはＴｉ−プラスミドによる形質転換システムにおける大豆ＳＳＵ遺伝子のプロモーター領域の使用を開示する。
【０００７】
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓコード配列、３つのｒｂｃＳ遺伝子の５’−および３’−制御領域（受託番号Ｘ７５３３４、Ｘ５５９３７、Ｘ６１０９７）は、クローン化され、配列決定されている(Beck, I., et al., Bot. Acta, 108, 327-333, 1995; Fiebig, C. and Link, G., Curr. Genet., 21(2), 161-8, 1995; Fiebig, C., et al., Bot. Acta, 103, 258-265, 1990)。サザーン分析によって得られたデータによると、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓは、３以下のｒｂｃＳ遺伝子を含有すると考えられる(Nantel, A. M., et al., Plant Mol. Biol., 16(6), 955-966, 1991)。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳ遺伝子のｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡ配列は、Baszczynski, et al.によって記載されている(Nucleic Acids Res. 16(10) 4732, 1988)。公開されたｃＤＮＡのうちの１つは、受託番号Ｘ０７３６７が与えられている。Beck, et al., Bot. Acta, 108, 327-333, 1995は、タバコからの葉肉細胞プロトプラスト中のＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓからのＲｂｃＳ領域の一過性発現活性を記載している。
【０００８】
他のＢｒａｓｓｉｃａ種のｒｂｃＳ遺伝子ファミリーは、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳ遺伝子ファミリーよりずっと研究されていない。事実、遺伝子構造および活性に対して入手可能なデータは、異なる植物組織においてまたは異なる時空間段階の間または種々の環境条件下で、異なって発現するＢｒａｓｓｉｃａ ｒｂｃＳ遺伝子ファミリーのメンバーの同定を可能としない。
【０００９】
葉は豊富に生成され、葉のサイズは大きいため、植物における遺伝子産物の発現および生成は、しばしば、葉において行われ、遺伝子産物はそれらから収穫される。芽を成長させる際に、トランスジェニック発現産物の生産を可能にするために、例えば、子葉成長の選択された段階の間、強力に発現するプロモーターを有することが非常に重要である。初期子葉発達、アミノ酸および油を含む種子からの栄養源は、デノボ合成のための生材料として豊富に入手可能であり、基質溶液からの発現された遺伝子産物の回収は、収穫された葉からより簡単かつより効率的であるため、植物種子および子葉は、特に、生産に有利である。
【００１０】
トランスジェニック植物を設計する時に重要な態様は、所望の植物組織においてまたは所望の植物成長位相の間、有意なレベルのトランスジーン発現を得る方法である。プロモーターの役割は、この態様において本質的に重要であり、従って、異なる特性および発現プロファイルを有する新たなプロモーターが必要である。
【００１１】
高レベルのトランスジーン発現の提供は、トランスジェニック植物において遺伝子産物を生成する時に、考慮すべき唯一の態様ではない。特に、含有された条件において、外来または異種遺伝子産物を生成する時、選択された、好ましくはかなり短時間の間の選択された植物組織における遺伝子産物の生成を可能にする、選択された、特異的な、時空様式での強力な発現の提供が、特に重要である。種子発芽または子葉の成長の間活性であるプロモーターは、適当な施設における含有された条件で、トランスジーン産物の生成に必要である。従って、異なる新たな適用のための新たなプロモーターが必要である。
【００１２】
本発明の目的は、所望の遺伝子産物または蛋白質の時空的に標的された高発現レベルを得ることである。従って、異なる成長段階にて発現するだけでなく、特に、植物の特定の成長段階および／または特定の組織において高蛋白質レベルを提供する新たなプロモーターが提供される。
【００１３】
発明の概要
本発明は、光成長されたＢｒａｓｓｉｃａ実生から入手可能である配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３を含む新規な時空的に活性なＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーに関し、特異的な植物組織におけるまたは植物成長の特定の段階でのトランスジーン発現に関する。プロモーターは、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子とフレーム内で機能的に融合された該プロモーター配列のうちの少なくとも１つを含むＤＮＡ構築体またはカセットを設計するのに有用である。形質転換された同種または異種ゼロ世代植物および、形質転換された植物の引き続いての世代からの種子が収集され、特に、含有された条件で、遺伝子産物の効率的な生産に使用される。
【００１４】
プロモーターを使用して、プロモーター配列が、所望の蛋白質または遺伝子産物をコードする異種または同種核酸配列に操作可能に連結されたヌクレオチド配列の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３を含むＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーから選択された少なくとも１つのＲｕｂｉｓｃｏプロモーターを含む発現カセットを設計する。
【００１５】
核酸配列は、天然に生じる単離された遺伝子または合成または単離された天然に生じる遺伝子から部分的に設計された半合成核酸配列を含むレポーター遺伝子によって例示される。レポーター遺伝子は、例えば、ＧＵＳ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、抗体および医学的に活性な蛋白質をコードする。
【００１６】
ＤＮＡ構築体またはカセットは、ＢｒａｓｓｉｃａおよびＣａｍｅｌｉｎａ種によって例示される宿主植物を形質転換するのに使用される。この形質転換されたいわゆるゼロ世代植物は、ＤＮＡカセットを含有する１以上のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターを含む。該ゼロ世代の形質転換された植物の種子は、植物のさらなる世代を提供するために使用されてもよいが、天然には、種子は、種子発芽および子葉成長の間、該種子の実生からの所望の遺伝子産物の生産に直接的に使用することができる。
【００１７】
従って、本発明は、形質転換された植物、該形質転換された植物の引き続いての世代ならびにＲｕｂｉｓｃｏプロモーターの該ファミリーのうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのＤＮＡ構築体またはカセットを運ぶ種子または実生に関する。
【００１８】
また、本発明は、上記で論議したＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーのものと実質的に同様である特性を有するさらなるプロモーターを生成するための方法を開示する。方法は、光成長された実生における発現を評価し、最も高度に発現された遺伝子を同定し、子葉の成長に、遺伝子発現を向ける能力を有する該遺伝子プロモーターから選択する工程を含む。
【００１９】
本図面に開示されたレポーター遺伝子は、本発明の一部ではないことは記されるべきである。それらは、単に、本発明のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターの実現可能性を例示するためだけに使用される。
【００２０】
発明の詳細な記載
本発明において使用される用語は、それらが、通常、組換えＤＮＡ技術および植物におけるトランスジーン発現の分野で有する意味を有する。しかしながら、本発明におけるいくつかの用語は、より広範にまたはいくらか異なる様式で使用される。従って、用語のうちのいくつかは、下記により詳細に定義される。
【００２１】
定義
用語「レポーター遺伝子」は、ＧＵＳ酵素としてまたは分光法、免疫学的アッセイ等のような決定の適用可能な既知の方法によってのいずれかで容易に示すことができる同種または異種蛋白質あるいは他の代謝遺伝子産物をコードする遺伝子を意味する。レポーター遺伝子は、「構造遺伝子」であり、これは、いずれかの選択されたまたは所望の蛋白質または遺伝子産物をコードし得る。レポーター遺伝子は、ＧＵＳ蛋白質をコードするｕｉｄＡ遺伝子およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）配列番号：１５をコードする遺伝子によって例示される。該遺伝子は、容易に検出可能なマーカー蛋白質をコードするため、特に、リサーチにおけるモデル遺伝子として、および産業的に有用なＤＮＡ構築体またはカセットの発達に有用である。
【００２２】
用語「同種プロモーター」は、宿主植物種に対して内因性であるプロモーターを意味する。言い換えれば、それは、宿主植物が由来するのと同じ植物種を原産とするまたはそれに存在する。
【００２３】
用語「異種プロモーター」は、プロモーターが、宿主植物種に対して外因性であることを意味する。プロモーターは、形質転換されていない植物種中に存在しない。言い換えれば、それは、宿主植物を原産とせず、宿主植物は、該プロモーターを運ぶ構築体によって形質転換されなければならない。
【００２４】
用語「同種システム」は、宿主植物と同一の種から由来したプロモーターを含むＤＮＡ構築体またはカセットを意味する。言い換えれば、該システムは、宿主植物を原産とする内因性プロモーターを含むＤＮＡ構築体またはカセットである。同種システムにおいて、同種プロモーターは、好ましくは、異種であってもよいレポーター遺伝子と、機能的にフレーム内で融合される。
【００２５】
用語「異種システム」は、宿主植物種に対して外因性であるプロモーターを含むＤＮＡ構築体またはカセットを意味する。その天然の状態での宿主植物は、該プロモーターを含まない。言い換えれば、プロモーターは、宿主植物を原産とせず、宿主植物は、もう１つの生物体から由来する外来プロモーターによって形質転換されなければならない。異種システムにおいて、異種プロモーターは、好ましくは、異種または同種であってもよいレポーター遺伝子と、フレーム内で機能的に融合される。
【００２６】
用語「同種遺伝子、蛋白質または遺伝子産物」は、遺伝子が、宿主植物種に対して内因性であることを意味する。言い換えれば、遺伝子は、宿主植物種を原産とし、また、形質転換されていない宿主植物種は、該蛋白質または遺伝子産物を生成する。
【００２７】
用語「異種遺伝子、蛋白質または遺伝子産物」は、遺伝子が宿主植物種に対して外因性であることを意味する。形質転換されていない植物は、該蛋白質を生成しない。言い換えれば、それは宿主植物種を原産とせず、宿主植物は、それが異種蛋白質または遺伝子産物を生成することができる前に、他の生物体から由来する外来遺伝子によって形質転換されなければならない。
【００２８】
用語「ゼロ世代」は、形質転換された植物を意味する。該「ゼロ世代植物」からの種子は、子葉成長の間、種子または実生の発芽から、所望の遺伝子産物の生成に直接的に使用されてもよいが、それらは、また、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３またはその組合せを含むＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーのうちの少なくとも１つのメンバーを運ぶＤＮＡ構築体またはカセットのうちの少なくとも１つを含む植物のさらなるまたは引き続いての世代を提供するのに使用することもできる。それらが少なくとも１つのＤＮＡ構築体を運ぶようにチェックされ選択された該植物の種子は、好ましくは、生成目的のために使用される。
【００２９】
発明の一般的な記載
本発明は、実生および芽を発芽する際のトランスジーン発現に関する。本発明によると、強力な蛋白質発現は、Ｂｒａｓｓｉｃａ、特にＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａからクローン化された新規なＲｕｂｉｓｃｏプロモーターと、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を融合することによって達成される。新規なプロモーターは、Ｂｒａｓｓｉｃａの光成長された子葉において豊富に発現されるｒｂｃＳ遺伝子から選択されたｒｂｃＳ遺伝子から由来するＲｕｂｉｓｃｏプロモーターの一群から選択される。
【００３０】
新規なプロモーターは、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３を含むＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーを含む。プロモーター配列は、単離された天然のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターから由来するが、同様の配列は、合成および半合成方法を含む他の手段によって調製することができる。
【００３１】
Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターは、所望の遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子と、フレーム内で機能的に融合された配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３を含む組換えＤＮＡ構築体または発現カセットを設計するのに有用である。
【００３２】
本発明のプロモーターは、Ｂｒａｓｓｉｃａ種の光成長された実生の子葉を成長させる際に高度に発現された遺伝子を選択し同定することによって入手された。該高度に発現された遺伝子の3'-ＵＴＲは、単離され、特徴付けられた。該方法を用いて、３つの強力なＲｕｂｉｓｃｏプロモーターは、配列の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３、および子葉を成長させることに、時空的様式で遺伝子発現を向ける能力を有することによって特徴付けられた。
【００３３】
本発明のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーの該３つのプロモーターは、異種蛋白質または遺伝子産物をコードする遺伝子または核酸配列に機能的に連結された該Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターのうちの少なくとも１つ、所望により２以上を含むＤＮＡ構築体または発現カセットを設計するのに使用された。通常、異種遺伝子産物は生成されるが、プロモーターは、同種蛋白質または遺伝子産物をコードする遺伝子または核酸配列に機能的に組み合わされてもよい。それにより、宿主植物は、天然の遺伝子のいくつかのコピーによって形質転換されてもよく、それにより、産業的に重要な、望ましい、天然の蛋白質の収量が増加され得る。いくつかのケースにおいて、遺伝子発現をさらに改良するために、いずれかの組合せでの該プロモーターのうちの１以上を、ＤＮＡ構築体または発現カセットに、タンデム様式で挿入してもよい。
【００３４】
本発明の好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出可能なマーカー蛋白質であるＧＵＳをコードするｕｉｄＡ遺伝子である。もう１つの例示的な「レポーター遺伝子」は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をコードする遺伝子である。有用なレポーター遺伝子は、医学的に活性な蛋白質の選択された部分と組み合わされた免疫グロブリンＩｇ（Ｇ）重鎖の選択された部分から合成的に設計されてもよい。ＥＲ−保持シグナルＫＤＥＬあるなしで、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）の免疫グロブリンＩｇ（Ｇ）重鎖および細胞外ドメインの一部よりなるそのような合成遺伝子、およびｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２抗体に対して向けられたヒト抗体の重鎖および／または軽鎖を含む抗体レポーター遺伝子を使用して、発明の実現可能性を例示する。上記の「レポーター遺伝子」は、単なる例であって、本発明のプロモーターを含むＤＮＡ構築体またはカセットが、所望の産物をコードするいずれかの他のレポーター遺伝子とフレーム内で機能的に融合され得ることは、当業者には明白である。
【００３５】
本発明による同種システムを表す１以上の内因性プロモーターあるいは本発明による異種システムを表す１以上の外因性プロモーターを含む本発明の組換え構築体または発現カセットは、それぞれ、同種および異種植物を形質転換するのに使用された。植物種は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍおよびＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａによって、本発明において例示される。植物形質転換手順は、当業者にはよく知られており、従って、いずれの他の植物種も本開示に従って、構築体によっても形質転換することができる。適用可能な形質転換システムは、例えば、慣用的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換システムを含むが、これに限定されるものではない。特に、ＷＯ０２／３８７７９および米国１０／４１６，０９１記載の新規な形質転換システムによるＣａｍｅｌｉｎａ植物の形質転換を使用してもよい。
【００３６】
宿主植物は、１以上の上記のＤＮＡ構築体または発現カセットによって形質転換された。ゼロ世代を表す形質転換された宿主植物からの種子は、収集され、含有された条件で、例えば、適切な発酵装置のような、緩衝された寒天プレート上または通気容器内で、外種子を発芽させることによって、所望の蛋白質または遺伝子産物の生産に使用されるトランスジェニック種子を提供する引き続いての植物世代の生産に使用される。形質転換種子は、優れた栄養源を供し、形質転換された種子は、適切に緩衝され、成長ホルモンおよび他の有利な成長および発芽促進剤を含有していてもよい、主に水を含む溶液中で実生へと発芽してもよい。そのような栽培は、無菌条件下での生産および、遺伝子産物の容易な回収を可能にする。
【００３７】
本発明において、Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：３を生産するための方法も提供される。該方法を使用して、本発明のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターと同様の有用な特性を有するさらなるプロモーターを提供してもよい。従って、該方法は、含有された条件で、形質転換された種子からの所望の遺伝子産物の生成のための新たな有用なプロモーターの生成を可能にする。該方法において、光成長した実生の発現は評価され、子葉の成長の間、高度に発現される遺伝子は同定され、それらのプロモーターは特徴付けられる。成長の間、子葉に、発現を向けることが可能なプロモーターは、ＤＮＡ構築体および発現カセットを設計するのに選択される。
【００３８】
以下の実施例は、説明的であるように意図され、決して、本発明の種々の具体例を制限するものではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）種子の発芽の子葉において発現されるＲｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡ型
ｃＤＮＡライブラリーを、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）種子発芽の子葉中に発現されるＲｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡの最も豊富なタイプを同定するために構築した。
【００４０】
総ＲＮＡを、４日目のＢｒａｓｓｉｃａ実生から単離し、ｍＲＮＡ画分を、オリゴ（ｄ）Ｔセルロースを用いて、総ＲＮＡ調製物から単離した。第１の鎖ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄ）Ｔを用いて、Ｍ−ＭＬＶ（点突然変異体）逆転写酵素によって合成した。次のＰＣＲ工程を、Ｒｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵコード領域の第３のエクソンに特異的な順方向プライマーe3a 5'-CAUCAUCAUCAUCAACCGTCAAGTCCAGTGCATCAGTTTCAT-3'(配列番号：４）およびCloneAmp手順（Life Technologies)によって特別に設計されたオリゴ（ｄ）Ｔ誘導体である逆方向プライマーatu 5'-CUACUACUACUATTTTTTTTTTTTTTT-3'(配列番号:５）で実施した。両方のプライマーは、５’末端上で、酵素ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）によって破壊されたいくつかのｄＵＭＰ残基を含んだ。ＰＣＲ工程を、２周期実施し、引き続いて、ＰＣＲ産物をＵＤＧによって消化し、ＲＴ−ＰＣＲ産物の３’末端からの突出と適合性のある３’末端からの特別な突出を含有する線状ｐＡＭＰ１ベクター（Life Technologies)に直接挿入した。ベクターを含有するインサートを、適切なＥ．Ｃｏｌｉ株ＸＬ−１に形質転換した。１００のプラークを選択し分析した。各タイプのインサートを含有する別々のコロニーの相対的な数を、配列分析の助けによって計算した。
【００４１】
図１を参照すると、クローン化された３’ＵＴＲの配列分析は、異なるＲｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡ種の間の顕著な定量的な差を示した。「５６」と名付けられた配列は、クローン化された全Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡの５６％を占めた。「２９」と名付けられた他の配列は、全Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡの２９％を占めた。クローンの残り１５％は、Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡの他のタイプに対応した。
【００４２】
ｃＤＮＡライブラリーから受け取られた２９タイプおよび５６タイプを、公開された配列と比較した。配列の整列は、これらのＲｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡが、新規なＲｕｂｉｓｃｏプロモーターから発現することを示した。それぞれ、２９タイプ配列はｒｂｃＳ−２と呼ばれ、５６タイプ配列はｒｂｃＳ−４と呼ばれる。
【００４３】
実施例２ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａから得られたＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのクローニング
配列の「５６」および「２９」タイプに基づき、逆方向プライマーを、プロモータークローニングの引き続いての工程において使用するために設計した。
【００４４】
ｒｂｃｓ−２プロモーターのクローニング
まず、ＥＳＴライブラリーを構築した。見受けられる最も一般的なタイプのＵＴＲはＵＴＲ２であった。このＵＴＲ−２を使用して、ゲノムウォーキング工程のために、逆方向プライマーを設計した。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＶ、ＤｒａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｍａＩおよびＳｓｐＩによって消化し、アダプター(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT (配列番号:６）および5'-p-ACCAGCCC-NH2-3'(配列番号:７）に連結して、６つのＤＮＡライブラリーを得た。
【００４５】
次のＰＣＲ増幅（第１およびネステッド）を、アダプタープライマーAP1 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(配列番号:８）およびＵＴＲ２−特異的ＬＩプライマー5'-GGCCACACTTGACAATCCGATATAACATGCCTCA-3'(配列番号:９）で実行した。
【００４６】
ネステッドＰＣＲを、ＡＰ２プライマー5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’（配列番号:１０）およびネステッドＵＴＲ２-特異的Ｌ２プライマー5'-CAAATGGAAATGAAATGAGGTAG-3’（配列番号:１１）で実施した。
【００４７】
最長の９００ｂｐ産物を、ＤｒａＩ ＤＮＡライブラリーを用いることによって入手した。この断片を、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ベクターへクローン化し、配列決定した。配列を、GenBankデータベースの配列と比較した。見つかった最も同種な配列は、Ｂ． ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳ（受託番号Ｘ６１０９７）であった。
【００４８】
受け取られたクローンのうちの１つ（Ｒｕｄ３）の５’末端近くには、Ｂ．ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳから欠けている２２ｎｔ長のストレッチがあった（Ｂ．ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳの１０３７ｎｔから始まる）。（Ｘ６１０９７との相同性に基いた）推定上の転写開始部位から下流の２つの逆方向プライマー、ＲｂＮｃｏおよびＲｂＳｉＢおよびＸ６１０９７の相同性に基づいた２つの順方向プライマーＢＮＲｂ１およびＢＮＲｂ３を設計した。全長ｒｂｃＳ−２−遺伝子を、順方向プライマーとしてＢＮＲｂ１を、逆方向プライマーとしてＵＴＲ２−Ｌ２を用いて増幅した。引き続いて、異なる長さの２つのプロモーターを、順方向プライマーとしてＢＮＲｂ３および逆方向プライマーとして（シグナルペプチドとの）ＲｂＳｉＢ、あるいは順方向プライマーとしてＢＮＲｂ３および逆方向プライマーとして（シグナルペプチドなしの）ＲｂＮｃｏの組合せを用いて、ネステッドＰＣＴにおいて増幅した。
【００４９】
ｒｂｃＳ−４プロモーターのクローニング
プロモータークローニングを、いくつかの工程で実施した。３つの公開されたＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の第１のエクソンの開始上の同じ配列と適合する（第１およびネステッドＰＣＲに対する）２つの逆方向プライマーを、ゲノムウォーキングの最初の工程に使用した。
【００５０】
ゲノムＤＮＡを、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ葉から単離し、６つの画分に分けた。各画分を、６つの制限酵素（ＥｃｏＲＶ、ＤｒａＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｔｕＩ、ＳｓｐＩ、ＸｍｎＩ）のうちの１つによって消化し、上記のゲノムウォーキングアダプター（Clontech)で連結した。各制限連結混合物は、ゲノムＤＮＡライブラリーを表す。
【００５１】
次の工程は、アダプター特異的ＡＰ１およびＡＰ２（順方向）および遺伝子特異的（逆方向）プライマーを用いる、２つの連続ＰＣＲ(第１およびネステッド）を含んだ。ＰＣＲを、３つの異なる逆方向プライマーを用いることによって開始し、下記にリストする重複ＰＣＲ産物を得るために、Ｒｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵ遺伝子の最初のエクソンの異なる部分にアニールした。
(ＲｂｃＳ−ＲＮ: 5'-ACCCGGGCCCAGGAGAGCATAGAGGAAGCC-3' (配列番号:１２）,
ＲｂｃＳ−Ｒ１: 5'-CGGTGAATGGAGCGACCATCGTGGCTTGAG-3' (配列番号:１３）,
ＲｂｃＳ−Ｒ２: 5'-CTGTGAATGGAGCAACCATGGCCGCTTGAG-3' (配列番号:１４）.
【００５２】
上記の６つのゲノムＤＮＡライブラリーは、ネステッドＰＣＲの後、増幅産物を生産した。これらの産物を、ＴＡクローニングを用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Promega)へ直接クローン化した。コロニーを、Ｍ１３ユニバーサルおよび逆方向プライマーによるＰＣＲを用いてスクリーンした。インサートを持つプラスミドＤＮＡを運ぶコロニーを、液体培養液中で成長させ、単離されたプラスミドＤＮＡを、配列決定分析に使用した。
【００５３】
クローンを含有する約９０プラスミドＤＮＡインサートの総数を分析した。配列決定分析から得られたデータに基づき、配列を、配列類似性に従って、５つの群に分けた。３つのプロモーターを、GenBankで公開されたものと似ていると同定した。さらに、クローン化されたプロモーター領域に特異的な、特別に設計された順方向プライマー、および３’ＵＴＲの「５６」型（３’ＵＴＲのｒｂｃＳ−４型）に特異的な逆方向プライマーを用いるＰＣＲによって、ゲノムにおける３’ＵＴＲの５６型（３’ＵＴＲのｒｂｃＳ−４型）を有する推定プロモーターの同定が可能になった。このプロモーターを、「５６Ａ」と呼ぶ。
【００５４】
得られた配列に基づき、新たな逆方向プライマーを設計して、同一の順方向プライマー（ＡＰ１、ＡＰ２）および新たな逆方向プライマーを有し、同一のゲノムＤＮＡライブラリーを用いる次のＰＣＲ組を作成した。この手順を４回繰り返した。４回目のＰＣＲ周期の後、得られた配列によって、プロモーター特異的順方向プライマーを設計することができた。逆方向プライマーを、ＢｐｉＩに対して特別な部位を含むように設計して、ＮｃｏＩ適合性制限部位を作った。これらのプライマーおよびＨｉＦｉ ＫＯＤポリメラーゼを用いるＰＣＲによって、他の配列の中でも、プロモーターｒｂｃＳ−４Ａ（配列番号：１）の「５６」型の同定が可能になった。ゲノムウォーキング技術の手段によって、「５６」型３’ＵＴＲを有するもう１つのプロモーターが、ゲノム中に連結していることが分かった。このｒｂｃＳ−４Ｂプロモーター（配列番号：２）は、（１９５３−２１７５ｎｔ 配列番号：１および配列番号：２において７９４−１０１６ｎｔ）における約２３０ｎｔ領域の長さに対して、ｒｂｃＳ−４Ａと９８％類似していたが、ｒｂｃＳ−４ＡおよびｒｂｃＳ−４Ｂの末端部は、４０％以下の類似性を示した。図２Ｂは、これらの２つのプロモーターの−２６７ないし＋３３ｎｔの整列を与える。また、ｒｂｃＳ−４Ｂプロモーターを、校正ＫＯＳポリメラーゼでクローン化し、その機能的活性をさらに研究した。
【００５５】
同じアプローチを用いて、ゲノムウォーキングの全４工程を、ｒｂｃＳ−４Ａプロモーター（配列番号：１）をクローン化するのに適用し、２工程を、ｒｂｃＳ−１、ｒｂｃＳ−３およびｒｂｃＳ−５プロモーター（それぞれ、配列番号：２１、配列番号：２２、および配列番号：２３）をクローン化するのに適用した。ゲノムウォーキングの最終工程の後、全長プロモーターを、校正Ｐｆｕ酵素を用いてクローン化した。クローン化されたプロモーター配列の３’末端を、それらがレポーター遺伝子と連結することができるように設計した。得られたプロモーター配列を、GenBank BLASTシステムを用いて分析した。それぞれ、受託番号Ｘ５５９３７およびＸ７５３３４を有するｒｂｃＳ−３およびｒｂｃＳ−５プロモーターと（最大９８ないし９９％）類似した、同定されたＢｒａｓｓｉｃａプロモーターが存在した。クローン化され、知られた全プロモーターを、コンピューター整列プログラムによって、相互と比較した。この分析は、全プロモーターが、ほとんど約３００ｎｔ領域に位置する大体類似した部分を有することを示した。これらの（ｒｂｃＳ−４Ｂ以外（下記参照））ｒｂｃＳプロモーターの３００ｂｐ長の近接部分の整列を、図２Aに示す（ｒｂｃＳ−２は配列番号：３であり；ｒｂｃＳ−４は配列番号：１である）。ゲノムウォーキングデータは、同一の３’ＵＴＲに接続された２つの部分的に異なるｒｂｃＳ−４（ｒｂｃＳ−４ＡおよびｒｂｃＳ−４Ｂと呼ばれる）プロモーターがあり、それらの３’末端上の最後の２３０ｂｐ上で非常に類似していることを示した（図２Ｂ）（ｒｂｃＳ−４Ａは配列番号：１であり；ｒｂｃＳ−４Ｂは配列番号：２である）。他方、プロモーターの終止（末端）部分は、他のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターと整列して示すのと同じ低レベルの相同性（４０％）を示す。
【００５６】
ｒｂｃＳ−２（配列番号：１）との公開されたＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター（受託番号Ｘ６１０９７）のうちの１つの整列は、それらの間のいくつかの差（９１％類似性）を示す（図２Ｃ)。また、３’ＵＴＲ領域において差が存在する。従って、これらの２つのプロモーターは同じものではなく、恐らく、Ｂｒａｓｓｉｃａ種のｒｂｃＳ遺伝子ファミリーの進化または選択プロセスの間に発散した。
【００５７】
図３を参照すると、ｒｂｃＳ−４Ａ（配列番号：１）プロモーター配列および公開されたＢｒａｓｓｉｃａ ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター（Ｘ６１０９７）の整列は、５２％の相違を明らかにした。
【００５８】
同様に、図４を参照すると、ｒｂｃＳ−４Ａプロモーター配列と公開されたＣｈｒｙｓａｎｔｈｍｕｍ ｒｂｃＳ−１プロモーター（ＡＹ１６３９０４）の整列は、５７％の相違を明らかにした。
【００５９】
明らかに、Ｂｒａｓｓｉｃａゲノムプロジェクトデータベースと非常に高い相同性（約９３％の類似性）を有するｒｂｓＣ−４Ａプロモーター（配列番号：１の１００７ないし１４４０ｎｔ、１７７６ないし１９５０ｎｔおよび１９５９ないし２１７５ｎｔ）において、３つのストレッチのみが存在する（図１７）。受託番号ＢＨ４８４６５１は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａのゲノムクローンを表し、ＣＤ８１１７６１はＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのｃＤＮＡクローンを表す。ｒｂｃＳ−４Ａプロモーター配列の他の部分は、Ｂｒａｓｓｉｃａゲノムプロジェクトを含むいずれのデータベースでも見受けられない。
【００６０】
明らかに、ｒｂｃＳ−２（配列番号：３）およびｒｂｃＳ−４ＡおよびＢ（それぞれ、配列番号：１および２）のヌクレオチド配列は、この開示において記載のように新規かつ有用である。
【００６１】
実施例３ 融合構築体 ｒｂｃＳ−４Ａ−ＧＵＳ、ｒｂｃＳ−４Ａ−ＨＳＡ、ｒｂｃＳ−４Ｂ−ＧＵＳ、ｒｂｃＳ−２−ＧＵＳ、ｒｂｃＳ−２−ＨＳＡ、Ｒｂｃｓ−２−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２、ｒｂｃＳ−４Ａ−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２、ｒｂｃＳ−２−ＴＮＦＲ−ＦｃおよびｒｂｃＳ−４Ａ−ＴＮＦＲ−Ｆｃ
プロモーターを、逆方向プライマーによって増幅して、それらの３’末端上に、ＮｃｏＩ適合性制限部位を得た。ＧＵＳ遺伝子とその５’末端上にＮｃｏＩ部位を含有するベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（ＣＡＭＢＩＡ）を使用した。ＨＳＡ融合構築体を、ＨＳＡ遺伝子が挿入されたｐＢＩＮ１９系プラスミドｐＧＰＴＶにおいて設計した。コドン最適化されたＨＳＡ遺伝子と人工ポリAシグナルの配列を、図１９に示されるように添加した。ＲｂｃＳ−４ＡおよびｒｂｃＳ４Ｂを、ＢｐｉＩ、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断した。ＲｂｃＳ−２を、ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断した。プロモーターＲｂｃＳ ４Ａ、ｒｂｃＳ−４Ｂ、およびｒｂｃＳ−２を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１またはＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって開環されたｐＧＰＴＶベクターへクローン化した。これらの構築体に使用されたターミネーターは以下のとおりであった：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ベクターを含有するＧＵＳにおけるｎｏｓターミネーター、ならびに３’ＵＴＲのｒｂｃＳ−４型およびGenBankからの既知のＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒｂｃＳターミネーターの一部を、ｐＧＰＴＶプラスミドを含有するＨＳＡにおいて使用した。
【００６２】
構築体Ｒｂｃｓ−２−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２およびＲｂｃＳ−４−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２は、同じ抗体領域および（ゲノムから直接の）天然のＢｒａｓｓｉｃａ ｒｕｂｉｓｃｏ ＲｂｃＳ−４遺伝子からの同じターミネーター（ポリA)シグナルを含有する。抗体蛋白質分子は、元来、ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２抗原に対して開発された。Ｒｂｃｓ−２−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２は、Ｒｂｃｓプロモーター、図２０に示される軽鎖（抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２)コード領域、図２１に示されるＲｂｃＳ−４ターミネーター（配列番号：１７）、もう１つのＲｂｃＳ−２プロモーター、図２２に示されるような重鎖（抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２)（配列番号：１８）コード領域およびもう１つのＲｂｃｓ−４ターミネーター（配列番号：２０）よりなる。ＲｂｃＳ−４−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２は、ＲｂｃＳ−４プロモーター、軽鎖（抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２（配列番号：１６）コード領域、ＲｂｃＳ-4ターミネーター、もう１つのＲｂｃｓ−４プロモーター（配列番号：２）、重鎖（抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２）（配列番号：１８）コード領域、およびもう１つのＲｂｃＳ−４ターミネーター（配列番号：２０）よりなる。
【００６３】
構築体Ｒｂｃｓ−２−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２およびＲｂｃＳ−４−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２について、ｒｂｃＳ−２およびｒｂｃＳ−４プロモーターを、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって切断し、ｐＶＫ１−ＣＨＣ（不変重鎖）-ｒｂｃＳ−４−ターミネーターと連結し、ＳａｌＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＶＫ１-ＲｂｃＳ−２（Ｒｂｃｓ−４Ａ）プロモーター−ＣＨＣ−ＲｂｃＳ−４−ターミネーターを得た。元々、ＲｂｃＳ−４ターミネーターは、ＢｓｉＷＩ、ＥｃｏＲＩによって、ＣＨＣでクローン化した。１Ｃ２抗体（ＶＨ−１Ｃ２）の可変重鎖領域を、ＢｐｉＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉによって切断し、同一部位によって、ｐＶＫ１-Ｒｂｃｓ−２（Ｒｂｃｓ−４）−プロモーター−ＣＨＣ−ＲｂｃＳ−４−ターミネーターベクターへクローン化した。得られたプラスミドは、全Ｈ（重）鎖ユニットを含有するプラスミドであった。同じ戦略を使用して、全Ｌ（軽）鎖ユニットを得た。次いで、軽鎖ユニットを３５Ｓ−ｇｕｓＡまたは３５ＳＵｉｄＡ遺伝子を除去したｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ベクターへクローン化した。これによって、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１-Ｌ−鎖を得た。最終工程において、Ｈ鎖ユニットを、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１−Ｌ−鎖ベクターへ導入して、最終ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１−Ｈ−Ｌを得た。プラスミドを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介戦略を用いる植物形質転換に使用した。
【００６４】
Ｉｇ−ＴＮＦＲ（ＥＮＢＲＥＬ）構築体は、ｒｂｃＳ−２またはｒｂｃＳ−４プロモーター、Ｉｇ ＣＨＣ部分（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）およびターミネーターを含む図２３に示されるＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子レセプター）部分（４８９ｎｔ）（配列番号：１９）を含有する。ＴＮＦＲ部分を、逆転写によって、引き続いてＰＣＲによって、ヒトｍＲＮＡから直接クローン化し、ＴＡクローニング手順によって、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙプラスミドに連結し、Ｍ１３ユニバーサルおよび逆方向プライマーによって、両方の方向から配列決定した。Ｉｇ ＣＨＣ部分を、ＰＣＲによって入手し、その後配列決定した。クローニング戦略は、ＢｓｉＷＩ部位によるＩｇ ＣＨＣ部分を連結し、ｒｂｃＳ−ターミネーターを含有するｐＶＫ１プラスミド（ｐＵＣ１９誘導体）にプロモーターを導入することを含んだ。次いで、ＢｓｍＢ１によって消化されたＴＮＦＲ部分をこのプラスミドに導入し、全インサートを、大きなｐＣＡＭＢＩＡ１３００またはｐＣＡＭＢＩＡ２３００プラスミドへ再クローン化した。
【００６５】
Ｉｇ ＣＨＣ部分を、２つの変異体において入手した。１番目は、その３’末端においていずれの変化もなく、２番目のものはその３’末端にＫＤＥＬを含有した。このシグナルは、１２ｎｔ長の配列AAAGACGAGCTG(配列番号:２４）であり、ＳＴＯＰコドンの直前に導入する。いくつかのターミネーターを、Ｉｇ−ＴＮＦＲ構築体において使用した。１つは、抗体構築体において使用されるのと同じであるｒｂｃＳ−４ターミネーター（約５００ｎｔ）であった。もう１つのターミネーターは、ｒｂｃＳ ４−ターミネーターのより長いバージョン（約２ｋｂ）であった。使用されたさらにもう１つのターミネーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＶＳＰ１（発育保存蛋白質−１遺伝子）からのものであり、ＳＴＯＰコドンのすぐ後ろおよび開裂部位のすぐ前に位置する部分を使用し、図２４に示されるｒｂｃＳ 4ターミネーター（配列番号：１７）の一部と接続した。構造体のうちのいくつかにおいて、１または２つのＭＡＲ（マトリックス付着領域）配列（約２ｋｂ）も導入した。構築体が２つのＭＡＲ配列を含有した場合、それらを、プロモーターの前およびターミネーターの後に導入した。
【００６６】
実施例４ 植物形質転換
この開示に従って、新規なプロモーターの機能性を例示するために、我々は、Ｂｒａｓｓｉｃａ種の植物、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物およびＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ植物を形質転換した。当業者は、他の種の植物を形質転換することができる。
【００６７】
Ｂｒａｓｓｉｃａ植物を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１またはｐＧＰＴＶ−ＨＰＴバイナリーベクターを運ぶＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４で、葉植菌によって形質転換した。タバコ植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． Ｓａｍｓｕｎｇを、ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴバイナリーベクターを運ぶＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４で、葉植菌によって形質転換した。推定形質転換体を３０ｍｇ／ｌヒグロマイシン上で選択した。陽性系統を、さらなる研究のために、温室に移した。
【００６８】
Ｃａｍｅｌｉｎａ植物を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００バイナリーベクターを運ぶＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株Ｃ５８（ヘルパープラスミドｐＧＶ３８５０）で、葉植菌によって形質転換した。推定形質転換体を、２０ｍｇ／ｌヒグロマイシン上で選択した。陽性系統を、さらなる研究のために、温室に移した。
【００６９】
実施例５ 発現分析のための定量ＧＵＳアッセイ
アッセイを、タバコ葉またはＣａｍｅｌｉｎａ実生で実施した。新鮮な植物材料を、２−ＭＥを含有するＴｒｉｓ緩衝液中で、機械的に分離した。抽出物中に濃縮する蛋白質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイを用いて決定した。ＧＵＳ活性を、メチルウンベリフェリル（umbelliferyl）を、酵素反応のための基質として用いて、分光光度計において決定した。インキュベーションは、＋３７℃にて、３０分間であり、生じた色は、４５０ｎｍ波長にて、分光光度計において測定した。非トランスジェニック植物を、陰性対照として使用した。
【００７０】
実施例６ リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびノーザン分析によるｍＲＮＡの発現分析
ＢｒａｓｓｉｃａまたはＣａｍｅｌｉｎａ種子またはタバコ葉の発芽の子葉から単離された総ＲＮＡを、遺伝子特異的逆方向プライマーによって、逆転写した。逆方向プライマーを、知られている全３’ＵＴＲの相違した部分ならびにＨＳＡ、ＧＵＳ、抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２抗体の重鎖および軽鎖およびＲｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵコード領域の第３のエクソンに対して設計した。得られたｃＤＮＡを、順方向および同一の逆方向プライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲ工程に使用した。
【００７１】
リアルタイム手順を、主に、方法のＳＹＢＲｇｒｅｅｎ定量変異体を用いるマニュアルに従って、ＡＰＩ７０００機械で実施した。受動的な参照色素はＲＯＸであった。較正曲線を、ゲノムから増幅され、リアルタイムプロセスにおいてと同じプライマーで精製されたＰＣＲ産物を用いて、構築した。結果を、分子の数／元々採取されたＲＮＡ試料の１ｎｇで表現した。
【００７２】
ノーザン分析につき、総ＲＮＡを植物材料から単離し、寒天ゲル上でランし、膜に移した。次いで、ＲＮＡを、ＵＶ光への短い露出によって膜に交差結合した。次の工程は、細菌Ｔ７またはＳＰ６プロモーターからインビトロ合成された特異的ＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションは、各プローブに対して特別に最適化された、最適温度にて、一晩続いた。洗浄後、膜を、プローブ上のＤＩＧ標識を認識する抗体によるインキュベーションに付す。ＲＮＡプローブ（つまり、特異的なｍＲＮＡ）の量を、陰性および陽性対照（可変濃度）を用いて、増強された発光によって検出して、実験試料中の特異的なｍＲＮＡの量の決定を可能にした。
【００７３】
実施例７ 種子を発芽する際のＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の発現レベルおよび総Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡが、子葉成長の終結に向けて増加する。
恒明条件下の総ＲＢＣＳ ｍＲＮＡ含有量は、最初の３ないし４日の間増加し、次の５ないし７日間、高レベルのままであった（図１６）。
【００７４】
異なるＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の発現レベルおよびＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ種子を発芽する際の総Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡ生産も決定するために、リアルタイムＰＣＲによる恒明条件下で、発芽の０、１、２、３および４日目の種子中の総Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡの量を測定した。
【００７５】
図９（第１列）に示される定量データは、総ｍＲＮＡのうちの１ｎｇ／平均試料中のＲｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡ分子の量または数を示す。明らかに、ｍＲＮＡ分子の量は、０日目から４日目へと増加し、４日目で最高量を示した。発芽の４日目、ほとんどの試料において決定されたＲＢＣＳ ｍＲＮＡの量は、約４ないし７ｘ１０７分子／総ｍＲＮＡのうちの４ｎｇであった。
【００７６】
実施例８ ＲＢＣＳ ｍＲＮＡのｒｂｃＳ−４型は、植物成長の種子を発芽する段階にて、ｍＲＮＡの最も普遍的かつ活性なタイプである
ＲＢＣＳ ｍＲＮＡの異なるタイプの量を、上記のリアルタイムプロセスによって分析した。ｒｂｃＳ−２、ｒｂｃＳ−３、ｒｂｃＳ−４およびｒｂｃＳ−５の発現レベルを、ｍＲＮＡ種の３’ＵＴＲの相違部分に特異的なプライマーを用いることによって、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ種子発芽の０ないし４日目に決定した（図５）。順方向プライマーを、それらが、特異的な３’ＵＴＲタイプに対応するより長い右部分を有するように設計した。各プライマーのより短い左部分は、ＲＢＣＳコード領域の末端に対応する。この左部分によって、長さ、つまりプライマーのＴｍが増加するが、その特異性を妨げない（図５）。
【００７７】
図９（３ないし６段）に要約されるデータは、発現レベルにおける著しい差を示す。種子発芽の４日目の最も豊富なタイプは、ｒｂｃＳ−４ ＲＢＣＳ ｍＲＮＡであったが、部分的に類似したプロモーター（ｒｂｃＳ−４Ａおよび-B；それぞれ、配列番号：２および配列番号：３）によって駆動され、同一の３’ＵＴＲ（３’ＵＴＲのｒｂｃＳ−４型）に接続された少なくとも２つのｒｂｃＳ遺伝子が存在することが上記で既に記している。これは、各ｒｂｃＳ−４遺伝子が、遺伝子の合計活性に寄与し得ることを意味するかもしれない。しかし、ｒｂｃＳ−４Ｂ-ＧＵＳトランスジェニックタバコ植物から得られた定量ＧＵＳ発現データ（図１０）によると、プロモーターの活性は非常に低く、３’ＵＴＲのｒｂｃＳ−４型を含有するｍＲＮＡの総量に顕著な影響を及ぼさないようである。
【００７８】
本明細書に提示されるデータは、明らかに、植物成長の種子発芽のより遅い段階での、ＲＢＣＳ ｍＲＮＡのｒｂｃＳ−４型の普遍性を示す。
【００７９】
さて、図９に示される結果を参照すると、リアルタイムＰＣＲは、ｒｂｃＳ−４プロモーターが、検査されたいずれの他のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターよりも、発芽の４日目にて、より活性であることを示した。異なるＲＢＣＳ遺伝子の発現レベルは、異なる動力学に従い、例えば、３日目には、ｒｂｃＳ−２（配列番号：３）およびｒｂｃＳ−３（配列番号：２１）は、ｒｂｃＳ−４（配列番号：２２）およびｒｂｃＳ−５（配列番号：２３）より活性であった。これらの特徴は、種子または芽を発芽する際に、生産される外来蛋白質または他の所望の遺伝子産物の生産方法に対するプロモーターを選択する時に、非常に重要である。
【００８０】
不安定なトランスジェニック蛋白質は、種子発芽の組織中の植物細胞の促進された蛋白質可動化能力のため、かなり早く劣化し得る。活性の遅延した動力学を有するｒｂｃＳ−４のようなプロモーターを用いる時、溶解液胞（lytic vacuoles)の活性からのトランスジェニック蛋白質産物の蓄積を保護する機会がより多く存在する。さらに、トランスジェニック構築体において、ｒｂｃＳ−４Ａを用いるさらなる利点は、これが、種子発芽のより遅い段階で分析された４つのプロモーターの中で最も強力なプロモーターであるという事実から生じる。
【００８１】
図１３は、ｒｂｃＳ−４-ＨＳＡに対してまたは（ｒｂｃＳ−２-ＨＳＡ）ｘ２に対してトランスジェニックなＢ． ｎａｐｕｓ種子を発芽する際のＨＳＡ ｍＲＮＡの蓄積を比較する。（ｒｂｃＳ−２-ＨＳＡ）ｘ２は、ｒｂｃＳ−２の２ユニットが直列で並べられたｒｂｃＳ−２-ＨＳＡの変異体である。ＨＳＡ ｍＲＮＡが、（ｒｂｃＳ−２-ＨＳＡ）ｘ２に対してトランスジェニックな種子においてより早く蓄積し始めることは明白である。他方、ｒｂｃＳ−４-ＨＳＡトランスジェニック植物中のＨＳＡ ｍＲＮＡは、より遅く蓄積し始めるが、蓄積する量は、いくらかより大きい。図９から分かるように、ｒｂｃＳ−４プロモーター活性の動力学は、ｒｂｃＳ−２のものよりより遅延しており、従って、両方のプロモーターが、天然でない状況にある時でさえ機能的であることが明白である。この関連において、天然の状況は、ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターおよびゲノムの適切な部位に置かれたｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子を含有する正常な非トランスジェニック植物を意味する。天然でない条件は、人工の条件、我々の場合においてのように、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子およびゲノムの不定位置に挿入された外来レポーター遺伝子を意味する。
【００８２】
実施例９ 所望の遺伝子産物の生産のために、ｒｂｃＳ−２およびｒｂｃＳ−４プロモーターを有する異種および同種トランスジェニック植物
ｒｂｃＳ−２（配列番号：１）およびｒｂｃＳ−４（配列番号：２および配列番号：３）プロモーターを、Ｂｒａｓｓｉｃａ、タバコおよびＣａｍｅｌｉｎａ植物による植物形質転換実験に使用して、「プロモーター強度」を決定し、また、同種および異種システム（つまり、同一または異なる種からのプロモーターを含有する構築体で形質転換された植物）における発現レベルを比較した。
【００８３】
プロモーターを逆方向プライマーによって増幅して、それらの３’末端上のＮｃｏＩ適合性制限部位を得た。実施例２記載のとおり設計された５’末端上にＮｃｏＩ部位を有するＧＵＳ遺伝子を含有するｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ベクター（ＣＡＭＢＩＡ）を使用した。
【００８４】
Ｂｒａｓｓｉｃａのゲノム中に挿入された構築体を含有するプロモーターｒｂｃＳ−２（配列番号：３）またはｒｂｃＳ−４ＡおよびＢ（配列番号：１および２）は、同種システムを表し、タバコおよびＣａｍｅｌｉｎａ植物のゲノム中の同一の構築体の挿入は異種システムを表す。フレーム内でレポーター遺伝子と融合されたｒｂｃＳ−２またはｒｂｃＳ−４プロモーターを含有する組換え構築体を、実施例３記載のとおり設計し、実施例４記載のとおり、植物に形質転換した。
【００８５】
ｒｂｃＳ−４Ａ−ＧＵＳまたはｒｂｃＳ−２−ＧＵＡを含有するトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ植物のｍＲＮＡ発現データを、図７に示す。レポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、４日間発芽させたトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ植物の種子の子葉から測定した。
【００８６】
図７に示される表において、
１）両方の植物形質転換体におけるトランスジーン（ＧＵＳ)ｍＲＮＡの発現は、対応する天然のｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子（ｒｂｃＳ−２またはｒｂｃＳ−４Ａ）の発現より、約５ないし６倍低く；
２）トランスジェニック植物における天然のｒｂｃＳ−４Ａ遺伝子の発現レベルは、非トランスジェニック植物におけるものに対応する（図９）が、ｒｂｃＳ−２トランスジェニック植物における天然のｒｂｃＳ−２遺伝子の発現レベルは、非トランスジェニック植物におけるものより低いようであることを示す。
この結果は、２つのプロモーターのいくつかの特性、つまり、同種植物におけるｒｂｃＳ−２プロモーターのさらなるサイレンシング依存性を指摘する。
【００８７】
タバコ形質転換実験につき、ｒｂｃＳ−２-ＨＳＡおよびｒｂｃＳ−４Ａ-ＨＳＡ構築体を使用し、それらの各々に対する７つのＨＳＡ生産植物系統を受け取った。トランスジェニックタバコ種子発芽の５日目に決定されたＨＳＡ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、これらの植物系統の両方のタイプにおいて、発現の大体同じレベルを示す（図８）。タバコ形質転換実験は、明らかに、ｒｂｃＳ−２およびｒｂｃＳ−４プロモーター強度の間に有意な差は全くないが、それらの両方は異種システムで発現していることを示す。
【００８８】
ＲｂｃＳ−２−ＧＵＳ、ＲｂｃＳ−４−ＧＵＳ、Ｒｂｃｓ−２−ＴＮＦＲ−Ｆｃ−５６ＵＴＲｓｈｏｒｔ、Ｒｂｃｓ−２−ＴＮＦＲ−ＦｃＫＤＥＬ−５６ＵＴＲｓｈｏｒｔ、Ｒｂｃｓ−４−ＴＮＦＲ−Ｆｃ−５６ＵＴＲｌｏｎｇ、Ｒｂｃｓ−４−ＴＮＦＲ−ＦｃＫＤＥＬ−５６ＵＴＲｌｏｎｇを有するトランスジェニックＣａｍｅｌｉｎａおよびタバコ植物を入手し分析した。結果を、表として、図１８ＡおよびＢに示す。ＧＵＳ活性の決定は、ｒｂｃＳ−２（ｒｂｃＳ−４）−ＧＵＳトランスジェニック植物における酵素活性レベルが、陽性対照として使用された慣用的な３５Ｓｐ−ＧＵＳ構築体を運ぶ植物においてよりも大きいことを示す。ノーザンデータは、いくつかのＴＮＦＲ−Ｆｃ含有Ｃａｍｅｌｉｎａおよびタバコ植物に対して入手可能である。（ｒｂｃＳ−４-TNFR-Fcに対する）発現レベルは、天然のｒｂｃＳ遺伝子のもの（Ｂｒａｓｓｉｃａにおいて、全ＲＢＣＳ遺伝子ファミリーに対する総ＲＮＡのうちの約５０ないし１００ｐｇ／μｇ）に相当する。
【００８９】
実施例１０ トランスジェニック植物における蛋白質発現
ＧＵＳ遺伝子コード領域を含む構築体を、ＲｕｂｉｓｃｏプロモーターｒｂｃＳ−４Ａに連結し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を用いて、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ)植物に形質転換した。トランスジェニック植物を、種子を生産するまで、温室で成長させた。トランスジェニック植物の種子を、２０℃の炭酸水、２４℃の通気した２０ｍＭのＫＮＯ３水あるいは３０℃の炭酸水中で発芽させた。培養の可変時間後、発現されたＧＵＳ蛋白質を、適切な緩衝液中のホモゲナイゼーションおよび遠心によって芽から単離した。特異的なＧＵＳ活性を、分光光度計によって決定した（図１１）。明らかに、ＧＵＳ活性／芽は、成長媒体中のＫＮＯ３を用いる培養液の７２時間後、最も高かった。
【００９０】
また、ｒｂｃＳ−２またはｒｂｃＳ−４の制御下のＨＳＡを運ぶトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａおよびタバコ植物の蛋白質発現を分析した。同様に、ＲｂｃＳ−２−ＨＳＡのタンデム構築体を運ぶ植物を分析した。蛋白質発現を、４日間の恒明および２４℃温度にて発芽した芽から分析した。図１５は、データを、総可溶性蛋白の％として示す。タンデム構築体を運ぶ植物が、単一構築体を運ぶ植物よりも、蛋白質の発現レベルが高いことが明白である。さらに、蛋白質発現が、ｒｂｃＳ−２プロモーター下よりも、ｒｂｃＳ−４プロモーター下でより高いことが明白である。２つのｒｂｃＳ−２−ＨＳＡ構築体を有するタンデム構築体は、本発明による複数の構築体の一例であり、当業者は、直列の２以上の構築体によって、植物を形質転換することも可能であろう。同様に、当業者は、ｒｂｃＳ−４Ａを駆動プロモーターとして有するタンデム構築体を使用して、より高い蛋白質含有量を得ることが可能であろう。
【００９１】
ＴＮＦＲ構築体を運ぶトランスジェニックＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａおよびタバコ植物の蛋白質発現を分析した。結果を図１８に示す。
【００９２】
実施例１１ 最大活性を提供するためには、ＲｂｃＳプロモーターは完全な長さでなければならない。
切断されたバージョンのｒｂｃＳ−２プロモーターを、レポーターｕｉｄ Ａ遺伝子で、融合構築体内でクローン化した（長さ０．３および０．６ｋｂ）。タバコ植物を、これらの構築体を運ぶＡｂｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって形質転換し、ＧＵＳ活性を、成熟したタバコ植物の葉から測定した。得られたデータを、ＧＵＳ遺伝子に接続されたｒｂｃＳ−２（１，６ｋｂ）または３５Ｓプロモーターを運ぶ高発現する成熟したタバコ植物の分析から得られたデータと比較した。図１５に示される結果は、明らかに、プロモーターの長さの減少による、現れたＧＵＳ活性の減少を示す。従って、ｒｂｃＳ−２プロモーターの末端領域が、基本的な（誘導できない）プロモーター活性を支える本質的な制御要素を含有することが明白である。既知のトマトｒｂｃＳ１プロモーターおよび我々のクローン化されたＢｒａｓｓｉｃａ ｒｂｃＳ−２およびｒｂｃＳ−４Ａプロモーターのシリコ比較分析によって、それらの全てにおける同様のコンセンサス制御要素を発見することが可能になる（図６）。既知のボックスのうちのほとんどが、−５００−６００ｎｔ領域に位置することが明らかである。プロモーターのそれらの末端部分が、いくつかの不可解な制御要素を有し得るかあるいはそれらが、例えば、ｒｂｃＳ−４Ａの５’領域において、ＭＡＲ（マトリックス付着領域）部位の潜在的な発生のために、プロモーター活性に参加し得ることを提案することができる（コンピューターＭＡＲ予測分析）。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａの種子を発芽させる際の異なる３’ＵＴＲ型ｒｂｃＳ遺伝子の相対量を示す。
【図２Ａ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３、および４は、Ｇｌｏｂａｌ ＤＮＡ整列プログラムによるＤＮＡ配列整列を示す。参照分子：ｒｂｃＳ−３００ｎｔ。領域１ないし３００。配列５。スコアリングマトリックス：線状［ミスマッチ２、OpenGAp 4m ExtGap 1］。配列一覧：類似性フォーマット、同じベース位置での高マッチの色領域。図２Ａは、クローン化されたＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒｂｃＳプロモーター（３００ｂｐ)の整列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、水平のボックスが同種領域であるクローン化されたＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒｂｃＳ−４Ａ（配列番号：１）およびｒｂｃＳ−４Ｂ（配列番号：２）プロモーター（３００ｂｐ）の整列を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、プロモーター（上部）および３’ＵＴＲ（下部）Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒｂｃＳ−２（配列番号：３）およびＢ ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳ（Ｘ６１０９７)の整列を示す。
【図３】図３は、ＲｂｃＳ−４Ａプロモーター（配列番号：１）（上部系統）および受託番号Ｘ６１０９７で公開されたＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター（下部系統）の１ｋｂ配列の整列を示す。配列は、５２％の相違を示す。
【図４】図４は、ｒｂｃＳ−４Ａプロモーター（配列番号：１）（上部系統）および受託番号ＡＹ１６３９０４で公開されたＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｒｂｃＳ１プロモーターの１ｋｂ配列の整列を示す。配列は、５７％の相違を示す。
【図５】図５は、異なるｒｕｂｉｓｃｏ ３’ＵＴＲタイプの独特の部分に対して特異的な順方向および逆方向プライマーの配列を示す。プライマーは、異なる３’ＵＴＲ種が、リアルタイムＰＣＲと識別され得ることを示す。順方向プライマーは、２つの部分に分けられる（下線かつイタリック体）：各プライマーの左部分は、関連するｒｕｂｉｓｃｏコード領域の最後のほとんどないヌクレオチドに対応し、右部分は特異的な３’ＵＴＲ配列に対応する。全ての逆方向プライマーは、特異的な３’ＵＴＲ領域にアニールする。全アンプリコンサイズは、８０ないし１００ｎｔ範囲を変動する。
【図６】図６は、ｒｂｃＳ−２（配列番号：１）およびｒｂｃＳ−４Ａ（配列番号：３）プロモーターで見受けられるコンセンサス制御要素の図である。
【図７】図７は、ｒｂｃＳ−２-ＧＵＳおよびｒｂｃＳ４Ａ−ＧＵＳ（それぞれ、Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター配列の配列番号：１および配列番号：３）によって形質転換されたトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ植物において、リアルタイムＰＣＲを用いるｒｂｃＳ−２、ｒｂｃＳ−４およびＵｉｄＡ(ＧＵＳ)からのｍＲＮＡの量を示す表である。
【図８】図８は、トランスジェニックタバコ植物のＲＮＡ試料中のＨＳＡ ｍＲＮＡ分子の量を示す（リアルタイムＰＣＲデータ）。
【図９】図９は、種々の時間に発芽したＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ種子中の異なるＲｕｂｉｓｃｏプロモーターの発現レベルを示す。データは、分子の数／試料（総ＲＮＡの１００ｎｇ）を示す。
【図１０】図１０は、構築体を含むｒｂｃＳ−４Ｂ ＵｉｄＡ遺伝子を運ぶトランスジェニックタバコ植物におけるＧＵＳ発現を示す。
【図１１】図１１は、２４℃または３０℃での恒明下でのＢｒａｓｓｉｃａ種子の発芽の間の、ＲｕｂｉｓｃｏプロモーターｒｂｃＳ−４Ａ下でのＧＵＳ発現を示す。
【図１２】図１２は、トランスジェニックＣａｍｅｌｉｎａ植物中のＨＳＡ ｍＲＮＡ含有量を示す（ノーザン分析）。
【図１３】図１３は、種々の時間でのトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ植物の種子を発芽する際のＨＳＡ ｍＲＮＡ含有量を示す。
【図１４】図１４は、％ＴＳＰ（総可溶性蛋白）として計算されたトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｍｅｌｉｎａおよびタバコ植物中のＨＳＡ蛋白質の量を示す。最小値および最大値と共に、平均値を示す。
【図１５】図１５は、レポーター遺伝子としてＧＵＳおよび全長ｒｂｃＳ−２（配列番号：２）プロモーター（１．６ｋｂ）またはプロモーターの切断されたバージョンのいずれかを含む構築体によって形質転換されたトランスジェニックタバコ植物におけるＧＵＳ活性を示す。３５Ｓプロモーターを、陽性対照として使用する。
【図１６】図１６は、ノーザンブロット分析によって明らかにされるように、Ｂｒａｓｓｉｃａ実生を発芽する際のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターの発現を示す。図１６Ａは、１２ないし１６８時間、空輸タンク中で発芽した後のＢｒａｓｓｉｃａ実生におけるＲｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵ ｍＲＮＡの合成を示すノーザンブロットである。図１６Ｂは、対照として同一のフィルター上に負荷された時に、インビトロ転写によって生産された標識されていないＲｕｂｉｓｃｏ ＲＮＡを示す。対照ＲＮＡの量は、ｐｇで示す。
【図１７】図１７は、ＲｂｃＳ−４Ａ（配列番号：１）プロモーター（上部系統）の配列および受託番号ＢＨ４８４６５１で、Ｂｒａｓｓｉｃａゲノムプロジェクトにおいて公開されたＢｒａｓｓｉｃａ配列の整列を示す。
【図１８】図１８は、ＴＮＦＲ構築体を運ぶトランスジェニックＣａｍｅｌｉｎａおよびタバコ植物に対する定量的ノーザンデータを示す。図において、Ｒｂｃｓ−２−ＴＮＦＲ−Ｆｃ−５６ＵＴＲ ｓｈｏｒｔは、ｒｂｃｓ−２プロモーター、ＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ２＋ＣＨ３ドメイン）の一部に連結されたＴＮＦＲ部分（４８９ｎｔ）、天然のｒｂｃｓ−４遺伝子（０，５ｋｂ長）からのターミネーターを含有し、先の構築体中と同一であるが、そこにはＦｃ領域の後（ＳＴＯＰコドンの直前）に、ＫＤＥＬシグナル（１２ｎｔ）も存在する。Ｒｂｃｓ−２−ＴＮＦＲ−Ｆｃ−５６ＵＴＲｌｏｎｇは、ｒｂｃｓ−４Ａプロモーター、ＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ２＋ＣＨ３ドメイン）の一部に連結されたＴＮＦＲ部分（４８９ｎｔ）、および天然のｒｂｃｓ−４遺伝子（２ｋｂ長）からのターミネーターを含有する。Ｒｂｃｓ−４−ＴＮＦＲ−ＦｃＫＤＥＬ−５６ＵＴＲｌｏｎｇは、先の構築体と同一であるが、そこにはＦｃ領域の後（ＳＴＯＰコドンの直前）にＫＤＥＬシグナル（１２ｎｔ)も存在する。
【図１９】図１９は、人工ＨＳＡ遺伝子（配列番号：１５）を示す。単離された天然のヒトゲノム（ｃＤＮＡ、つまりエクソンのみでイントロンなし）の配列は、コドン最適化されている。
【図２０】図２０は、人工または半合成軽鎖（抗−ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２）コード領域（配列番号：１６）を示す。配列は、３つの部分よりなる：マウスシグナルペプチドをコードする６６ｎｔ長配列（２２アミノ酸）。配列は、受託番号ＡＦ０７８５４８を有する部分配列と１００％類似性を有し；３２４ｎｔ長軽鎖抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２抗体可変領域は、（ＶＴＴから得られた）ファージ提示ライブラリーから単離する。受託番号ＡＢ０９５２９１（Genbank)は、図２０における可変領域の１６ないし３０５ｎｔ領域（配列番号：１６）と１００％類似性を有し；カッパ軽鎖定常領域の３２４ｎｔ長は、受託番号ＢＣ０６３５９９を有する配列と１００％類似性を有する。
【図２１】図２１は、人工のｒｂｃＳ−４ターミネーター配列（配列番号：１７）を示す。元来、この配列は、ゲノムウォーキング技術によって、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａのゲノムからクローン化された。同様の配列が、Ｂｒａｓｓｉｃａゲノムプロジェクトにおいて公開される。受託番号ＢＨ６９１８３８は、８８％の部分的類似性を有する。
【図２２】図２２は、人工の重鎖（抗-ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２）コード領域（配列番号：１８）を示す。配列は、３つの部分よりなる：マウスシグナルペプチド（１７アミノ酸）をコードする５７ｎｔ長の配列。受託番号Ｘ６７２１０を有する配列の一部は、１００%類似性を有する;（ＶＴＴから得られた）ファージ提示技術によって作成された３８７ｎｔ長の重鎖抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２抗原可変領域。受託番号ＡＢ０６７２２２(Genbank)は、図２２に示された可変領域の1ないし２９５ｎｔ領域と９５%類似性を有する; ９９０ｎｔ長のＩｇＧ１重鎖定常領域。受託番号ＢＣ０２４２８９を有する配列は、９９%類似性を有する。対立遺伝子の差のため、僅かな差が存在し得る。
【図２３】図２３は、人工シグナル配列（６９ｎｔ)およびＴＮＦＲ部分（４８９ｎｔ)を示す。受託番号ＮＭ＿００１０６６を有する配列は、米国５，６０５，６９０に開示される配列と１００％類似性を有する。同様の配列は、他のＴＮＦＲ配列から入手可能である。
【図２４】図２４は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓis ＶＳＰ１（発育保存蛋白質-1遺伝子）-３’ＵＴＲおよびｒｂｃＳ−４-ターミネーター）（Genbank受託番号ＮＭ＿１２２３８７）の人工部分を示す。本明細書中のＲｂｓＳ−４−ターミネーター部は、開裂部の後ろからｎｔ３５０までの、図２１に示される全長ｒｂｃＳ−４−ターミネーターである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、トランスジェニック植物に関する。より具体的には、植物成長の特定の段階でのトランスジーン発現に関する。さらにより具体的には、本発明は、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のＲｕｂｉｓｃｏプロモーター、および遺伝子産物の、特に含有された使用のための効率的な生産のための同種または異種植物の形質転換のための該プロモーターのうちの少なくとも１つを含むＤＮＡ構築体または発現カセットに関する。
【０００２】
発明の背景
リブロース−１，５−二リン酸との反応を介する大気中二酸化炭素のホスホグリセリン酸への同化および変換は、厳密には、Ｒｕｂｉｓｃｏ酵素の活性に依存する(Spreitzer, R.J., Arch. Biochem. Biophys. 414(2), 141-9, 2003; Spreitzer, R.J., et al., Annu. Rev. Plant Biol., 53, 449-75, 2002)。構造的には、Ｒｕｂｉｓｃｏ酵素は、８つの小さなサブユニット（ＳＳＵ）および８つの大きなサブユニット（ＬＳＵ）よりなる。ＳＳＵ蛋白質は、植物の核ゲノムに位置するいくつかの遺伝子によってコードされ、一方、ＬＳＵ遺伝子は、色素体ゲノム中で見受けられる。異なる植物中のＲｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵ遺伝子の数は、４コピーから１５コピーまたはいくつかの倍数体ゲノムにおいてはそれ以上へと変動する。Ｒｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵ遺伝子の少なくとも４コピーは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｂｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）中に存在することが分かっており、１２またはさらにそれ以上のコピー／倍数体ゲノムは、小麦中に存在することが分かっている(Sasanuma, T., Mol. Genet. Genomics. 265 (1),161-171, 2001; Sasanuma, T. and Miyashita, N.T., Genes Genet. Syst.,73(5), 297-309, 1998)。
【０００３】
Ｒｕｂｉｓｃｏ酵素は、植物中に存在する最も普遍的な酵素のうちの１つである。Ｒｕｂｉｓｃｏ酵素をコードする遺伝子のプロモーターは、それらの特定の特徴のいずれも特定することなしに、植物を形質転換するためのＤＮＡ構築体の調製に有用な強力なプロモーターとして提案されている(米国５，９９４，６２８、米国２００２／０１７００９６、米国２００３／００９７６７８)。
【０００４】
高等植物中のＲｂｃＳ遺伝子の構造、進化および制御は、Dean, C. et al (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 415-439, 1989)によって記載されており、ＲｂｃＳ遺伝子の構造および機能に基づく。Dean et al.は、核遺伝子が、マルチジェニックファミリーにグループ分けできると提案している。これらのファミリーの遺伝子構造は、アブラナ科（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、トマト、キク科（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓおよび大豆のような他の植物において、広く研究されている。トマトには、３つの染色体座に位置する５つのＲｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵ（ｒｂｃＳ）遺伝子が存在し、１つは染色体３、他の４つは染色体２にある(Sugita, M., et al., Mol. Gen. Genetic., 209 (2), 247-256,1987)。さらに、遺伝子のうちの３つは、１０ｋｂ領域内のタンデムアレイに組織されることが分かっている。状況は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｒｂｃＳ遺伝子ファミリーにおいて非常に似ている(Krebbers, E., et al., Plant Mol. Biol. 11, 745-759, 988; Niwa, Y., et al., NA Res., 4(5), 341-343, 1997; Dedonder, A., et al., Plant Physiol., 101, 3, 801-808, 1993)。Galili, S., et al., Mol. Gen. Genet., 263 (4), 674-680, 2000.
【０００５】
Outchkourov, N.S. et al. (Planta, 216 (6), 1003-1012, 2002)は、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ種（Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ Ｒａｍａｔ．)のＲｕｂｉｓｃｏ小−サブユニット遺伝子ファミリーの豊富に転写されたｒｂｃＳ１のクローンを作り、ｒｂｃＳ１−プロモーターの制御下で、ＧＵＳを発現するＵｉｄＡ遺伝子を含有する遺伝子カセットで形質転換されたタバコ植物が、葉における総可溶性蛋白の最大１０％ＧＵＳを提供したことを示した。たとえ、キク科（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）からの該Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターが、タバコ葉において、高蛋白質発現レベルを与えたとしても、他の発達段階での高発現は示されていない。
【０００６】
米国特許出願２００２／０１７００９６は、Ｒｉ−またはＴｉ−プラスミドによる形質転換システムにおける大豆ＳＳＵ遺伝子のプロモーター領域の使用を開示する。
【０００７】
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓコード配列、３つのｒｂｃＳ遺伝子の５’−および３’−制御領域（受託番号Ｘ７５３３４、Ｘ５５９３７、Ｘ６１０９７）は、クローン化され、配列決定されている(Beck, I., et al., Bot. Acta, 108, 327-333, 1995; Fiebig, C. and Link, G., Curr. Genet., 21(2), 161-8, 1995; Fiebig, C., et al., Bot. Acta, 103, 258-265, 1990)。サザーン分析によって得られたデータによると、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓは、３以下のｒｂｃＳ遺伝子を含有すると考えられる(Nantel, A. M., et al., Plant Mol. Biol., 16(6), 955-966, 1991)。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳ遺伝子のｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡ配列は、Baszczynski, et al.によって記載されている(Nucleic Acids Res. 16(10) 4732, 1988)。公開されたｃＤＮＡのうちの１つは、受託番号Ｘ０７３６７が与えられている。Beck, et al., Bot. Acta, 108, 327-333, 1995は、タバコからの葉肉細胞プロトプラスト中のＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓからのＲｂｃＳ領域の一過性発現活性を記載している。
【０００８】
他のＢｒａｓｓｉｃａ種のｒｂｃＳ遺伝子ファミリーは、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳ遺伝子ファミリーよりずっと研究されていない。事実、遺伝子構造および活性に対して入手可能なデータは、異なる植物組織においてまたは異なる時空間段階の間または種々の環境条件下で、異なって発現するＢｒａｓｓｉｃａ ｒｂｃＳ遺伝子ファミリーのメンバーの同定を可能としない。
【０００９】
葉は豊富に生成され、葉のサイズは大きいため、植物における遺伝子産物の発現および生成は、しばしば、葉において行われ、遺伝子産物はそれらから収穫される。芽を成長させる際に、トランスジェニック発現産物の生産を可能にするために、例えば、子葉成長の選択された段階の間、強力に発現するプロモーターを有することが非常に重要である。初期子葉発達、アミノ酸および油を含む種子からの栄養源は、デノボ合成のための生材料として豊富に入手可能であり、基質溶液からの発現された遺伝子産物の回収は、収穫された葉からより簡単かつより効率的であるため、植物種子および子葉は、特に、生産に有利である。
【００１０】
トランスジェニック植物を設計する時に重要な態様は、所望の植物組織においてまたは所望の植物成長位相の間、有意なレベルのトランスジーン発現を得る方法である。プロモーターの役割は、この態様において本質的に重要であり、従って、異なる特性および発現プロファイルを有する新たなプロモーターが必要である。
【００１１】
高レベルのトランスジーン発現の提供は、トランスジェニック植物において遺伝子産物を生成する時に、考慮すべき唯一の態様ではない。特に、含有された条件において、外来または異種遺伝子産物を生成する時、選択された、好ましくはかなり短時間の間の選択された植物組織における遺伝子産物の生成を可能にする、選択された、特異的な、時空様式での強力な発現の提供が、特に重要である。種子発芽または子葉の成長の間活性であるプロモーターは、適当な施設における含有された条件で、トランスジーン産物の生成に必要である。従って、異なる新たな適用のための新たなプロモーターが必要である。
【００１２】
本発明の目的は、所望の遺伝子産物または蛋白質の時空的に標的された高発現レベルを得ることである。従って、異なる成長段階にて発現するだけでなく、特に、植物の特定の成長段階および／または特定の組織において高蛋白質レベルを提供する新たなプロモーターが提供される。
【００１３】
発明の概要
本発明は、光成長されたＢｒａｓｓｉｃａ実生から入手可能である配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３を含む新規な時空的に活性なＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーに関し、特異的な植物組織におけるまたは植物成長の特定の段階でのトランスジーン発現に関する。プロモーターは、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子とフレーム内で機能的に融合された該プロモーター配列のうちの少なくとも１つを含むＤＮＡ構築体またはカセットを設計するのに有用である。形質転換された同種または異種ゼロ世代植物および、形質転換された植物の引き続いての世代からの種子が収集され、特に、含有された条件で、遺伝子産物の効率的な生産に使用される。
【００１４】
プロモーターを使用して、プロモーター配列が、所望の蛋白質または遺伝子産物をコードする異種または同種核酸配列に操作可能に連結されたヌクレオチド配列の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３を含むＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーから選択された少なくとも１つのＲｕｂｉｓｃｏプロモーターを含む発現カセットを設計する。
【００１５】
核酸配列は、天然に生じる単離された遺伝子または合成または単離された天然に生じる遺伝子から部分的に設計された半合成核酸配列を含むレポーター遺伝子によって例示される。レポーター遺伝子は、例えば、ＧＵＳ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、抗体および医学的に活性な蛋白質をコードする。
【００１６】
ＤＮＡ構築体またはカセットは、ＢｒａｓｓｉｃａおよびＣａｍｅｌｉｎａ種によって例示される宿主植物を形質転換するのに使用される。この形質転換されたいわゆるゼロ世代植物は、ＤＮＡカセットを含有する１以上のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターを含む。該ゼロ世代の形質転換された植物の種子は、植物のさらなる世代を提供するために使用されてもよいが、天然には、種子は、種子発芽および子葉成長の間、該種子の実生からの所望の遺伝子産物の生産に直接的に使用することができる。
【００１７】
従って、本発明は、形質転換された植物、該形質転換された植物の引き続いての世代ならびにＲｕｂｉｓｃｏプロモーターの該ファミリーのうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのＤＮＡ構築体またはカセットを運ぶ種子または実生に関する。
【００１８】
また、本発明は、上記で論議したＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーのものと実質的に同様である特性を有するさらなるプロモーターを生成するための方法を開示する。方法は、光成長された実生における発現を評価し、最も高度に発現された遺伝子を同定し、子葉の成長に、遺伝子発現を向ける能力を有する該遺伝子プロモーターから選択する工程を含む。
【００１９】
本図面に開示されたレポーター遺伝子は、本発明の一部ではないことは記されるべきである。それらは、単に、本発明のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターの実現可能性を例示するためだけに使用される。
【００２０】
発明の詳細な記載
本発明において使用される用語は、それらが、通常、組換えＤＮＡ技術および植物におけるトランスジーン発現の分野で有する意味を有する。しかしながら、本発明におけるいくつかの用語は、より広範にまたはいくらか異なる様式で使用される。従って、用語のうちのいくつかは、下記により詳細に定義される。
【００２１】
定義
用語「レポーター遺伝子」は、ＧＵＳ酵素としてまたは分光法、免疫学的アッセイ等のような決定の適用可能な既知の方法によってのいずれかで容易に示すことができる同種または異種蛋白質あるいは他の代謝遺伝子産物をコードする遺伝子を意味する。レポーター遺伝子は、「構造遺伝子」であり、これは、いずれかの選択されたまたは所望の蛋白質または遺伝子産物をコードし得る。レポーター遺伝子は、ＧＵＳ蛋白質をコードするｕｉｄＡ遺伝子およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）配列番号：１５をコードする遺伝子によって例示される。該遺伝子は、容易に検出可能なマーカー蛋白質をコードするため、特に、リサーチにおけるモデル遺伝子として、および産業的に有用なＤＮＡ構築体またはカセットの発達に有用である。
【００２２】
用語「同種プロモーター」は、宿主植物種に対して内因性であるプロモーターを意味する。言い換えれば、それは、宿主植物が由来するのと同じ植物種を原産とするまたはそれに存在する。
【００２３】
用語「異種プロモーター」は、プロモーターが、宿主植物種に対して外因性であることを意味する。プロモーターは、形質転換されていない植物種中に存在しない。言い換えれば、それは、宿主植物を原産とせず、宿主植物は、該プロモーターを運ぶ構築体によって形質転換されなければならない。
【００２４】
用語「同種システム」は、宿主植物と同一の種から由来したプロモーターを含むＤＮＡ構築体またはカセットを意味する。言い換えれば、該システムは、宿主植物を原産とする内因性プロモーターを含むＤＮＡ構築体またはカセットである。同種システムにおいて、同種プロモーターは、好ましくは、異種であってもよいレポーター遺伝子と、機能的にフレーム内で融合される。
【００２５】
用語「異種システム」は、宿主植物種に対して外因性であるプロモーターを含むＤＮＡ構築体またはカセットを意味する。その天然の状態での宿主植物は、該プロモーターを含まない。言い換えれば、プロモーターは、宿主植物を原産とせず、宿主植物は、もう１つの生物体から由来する外来プロモーターによって形質転換されなければならない。異種システムにおいて、異種プロモーターは、好ましくは、異種または同種であってもよいレポーター遺伝子と、フレーム内で機能的に融合される。
【００２６】
用語「同種遺伝子、蛋白質または遺伝子産物」は、遺伝子が、宿主植物種に対して内因性であることを意味する。言い換えれば、遺伝子は、宿主植物種を原産とし、また、形質転換されていない宿主植物種は、該蛋白質または遺伝子産物を生成する。
【００２７】
用語「異種遺伝子、蛋白質または遺伝子産物」は、遺伝子が宿主植物種に対して外因性であることを意味する。形質転換されていない植物は、該蛋白質を生成しない。言い換えれば、それは宿主植物種を原産とせず、宿主植物は、それが異種蛋白質または遺伝子産物を生成することができる前に、他の生物体から由来する外来遺伝子によって形質転換されなければならない。
【００２８】
用語「ゼロ世代」は、形質転換された植物を意味する。該「ゼロ世代植物」からの種子は、子葉成長の間、種子または実生の発芽から、所望の遺伝子産物の生成に直接的に使用されてもよいが、それらは、また、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３またはその組合せを含むＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーのうちの少なくとも１つのメンバーを運ぶＤＮＡ構築体またはカセットのうちの少なくとも１つを含む植物のさらなるまたは引き続いての世代を提供するのに使用することもできる。それらが少なくとも１つのＤＮＡ構築体を運ぶようにチェックされ選択された該植物の種子は、好ましくは、生成目的のために使用される。
【００２９】
発明の一般的な記載
本発明は、実生および芽を発芽する際のトランスジーン発現に関する。本発明によると、強力な蛋白質発現は、Ｂｒａｓｓｉｃａ、特にＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａからクローン化された新規なＲｕｂｉｓｃｏプロモーターと、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を融合することによって達成される。新規なプロモーターは、Ｂｒａｓｓｉｃａの光成長された子葉において豊富に発現されるｒｂｃＳ遺伝子から選択されたｒｂｃＳ遺伝子から由来するＲｕｂｉｓｃｏプロモーターの一群から選択される。
【００３０】
新規なプロモーターは、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３を含むＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーを含む。プロモーター配列は、単離された天然のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターから由来するが、同様の配列は、合成および半合成方法を含む他の手段によって調製することができる。
【００３１】
Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターは、所望の遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子と、フレーム内で機能的に融合された配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３を含む組換えＤＮＡ構築体または発現カセットを設計するのに有用である。
【００３２】
本発明のプロモーターは、Ｂｒａｓｓｉｃａ種の光成長された実生の子葉を成長させる際に高度に発現された遺伝子を選択し同定することによって入手された。該高度に発現された遺伝子の3'-ＵＴＲは、単離され、特徴付けられた。該方法を用いて、３つの強力なＲｕｂｉｓｃｏプロモーターは、配列の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３、および子葉を成長させることに、時空的様式で遺伝子発現を向ける能力を有することによって特徴付けられた。
【００３３】
本発明のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリーの該３つのプロモーターは、異種蛋白質または遺伝子産物をコードする遺伝子または核酸配列に機能的に連結された該Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターのうちの少なくとも１つ、所望により２以上を含むＤＮＡ構築体または発現カセットを設計するのに使用された。通常、異種遺伝子産物は生成されるが、プロモーターは、同種蛋白質または遺伝子産物をコードする遺伝子または核酸配列に機能的に組み合わされてもよい。それにより、宿主植物は、天然の遺伝子のいくつかのコピーによって形質転換されてもよく、それにより、産業的に重要な、望ましい、天然の蛋白質の収量が増加され得る。いくつかのケースにおいて、遺伝子発現をさらに改良するために、いずれかの組合せでの該プロモーターのうちの１以上を、ＤＮＡ構築体または発現カセットに、タンデム様式で挿入してもよい。
【００３４】
本発明の好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出可能なマーカー蛋白質であるＧＵＳをコードするｕｉｄＡ遺伝子である。もう１つの例示的な「レポーター遺伝子」は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をコードする遺伝子である。有用なレポーター遺伝子は、医学的に活性な蛋白質の選択された部分と組み合わされた免疫グロブリンＩｇ（Ｇ）重鎖の選択された部分から合成的に設計されてもよい。ＥＲ−保持シグナルＫＤＥＬあるなしで、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）の免疫グロブリンＩｇ（Ｇ）重鎖および細胞外ドメインの一部よりなるそのような合成遺伝子、およびｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２抗体に対して向けられたヒト抗体の重鎖および／または軽鎖を含む抗体レポーター遺伝子を使用して、発明の実現可能性を例示する。上記の「レポーター遺伝子」は、単なる例であって、本発明のプロモーターを含むＤＮＡ構築体またはカセットが、所望の産物をコードするいずれかの他のレポーター遺伝子とフレーム内で機能的に融合され得ることは、当業者には明白である。
【００３５】
本発明による同種システムを表す１以上の内因性プロモーターあるいは本発明による異種システムを表す１以上の外因性プロモーターを含む本発明の組換え構築体または発現カセットは、それぞれ、同種および異種植物を形質転換するのに使用された。植物種は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍおよびＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａによって、本発明において例示される。植物形質転換手順は、当業者にはよく知られており、従って、いずれの他の植物種も本開示に従って、構築体によっても形質転換することができる。適用可能な形質転換システムは、例えば、慣用的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換システムを含むが、これに限定されるものではない。特に、ＷＯ０２／３８７７９および米国１０／４１６，０９１記載の新規な形質転換システムによるＣａｍｅｌｉｎａ植物の形質転換を使用してもよい。
【００３６】
宿主植物は、１以上の上記のＤＮＡ構築体または発現カセットによって形質転換された。ゼロ世代を表す形質転換された宿主植物からの種子は、収集され、含有された条件で、例えば、適切な発酵装置のような、緩衝された寒天プレート上または通気容器内で、外種子を発芽させることによって、所望の蛋白質または遺伝子産物の生産に使用されるトランスジェニック種子を提供する引き続いての植物世代の生産に使用される。形質転換種子は、優れた栄養源を供し、形質転換された種子は、適切に緩衝され、成長ホルモンおよび他の有利な成長および発芽促進剤を含有していてもよい、主に水を含む溶液中で実生へと発芽してもよい。そのような栽培は、無菌条件下での生産および、遺伝子産物の容易な回収を可能にする。
【００３７】
本発明において、Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：３を生産するための方法も提供される。該方法を使用して、本発明のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターと同様の有用な特性を有するさらなるプロモーターを提供してもよい。従って、該方法は、含有された条件で、形質転換された種子からの所望の遺伝子産物の生成のための新たな有用なプロモーターの生成を可能にする。該方法において、光成長した実生の発現は評価され、子葉の成長の間、高度に発現される遺伝子は同定され、それらのプロモーターは特徴付けられる。成長の間、子葉に、発現を向けることが可能なプロモーターは、ＤＮＡ構築体および発現カセットを設計するのに選択される。
【００３８】
以下の実施例は、説明的であるように意図され、決して、本発明の種々の具体例を制限するものではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）種子の発芽の子葉において発現されるＲｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡ型
ｃＤＮＡライブラリーを、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）種子発芽の子葉中に発現されるＲｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡの最も豊富なタイプを同定するために構築した。
【００４０】
総ＲＮＡを、４日目のＢｒａｓｓｉｃａ実生から単離し、ｍＲＮＡ画分を、オリゴ（ｄ）Ｔセルロースを用いて、総ＲＮＡ調製物から単離した。第１の鎖ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄ）Ｔを用いて、Ｍ−ＭＬＶ（点突然変異体）逆転写酵素によって合成した。次のＰＣＲ工程を、Ｒｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵコード領域の第３のエクソンに特異的な順方向プライマーe3a 5'-CAUCAUCAUCAUCAACCGTCAAGTCCAGTGCATCAGTTTCAT-3'(配列番号：４）およびCloneAmp手順（Life Technologies)によって特別に設計されたオリゴ（ｄ）Ｔ誘導体である逆方向プライマーatu 5'-CUACUACUACUATTTTTTTTTTTTTTT-3'(配列番号:５）で実施した。両方のプライマーは、５’末端上で、酵素ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）によって破壊されたいくつかのｄＵＭＰ残基を含んだ。ＰＣＲ工程を、２周期実施し、引き続いて、ＰＣＲ産物をＵＤＧによって消化し、ＲＴ−ＰＣＲ産物の３’末端からの突出と適合性のある３’末端からの特別な突出を含有する線状ｐＡＭＰ１ベクター（Life Technologies)に直接挿入した。ベクターを含有するインサートを、適切なＥ．Ｃｏｌｉ株ＸＬ−１に形質転換した。１００のプラークを選択し分析した。各タイプのインサートを含有する別々のコロニーの相対的な数を、配列分析の助けによって計算した。
【００４１】
図１を参照すると、クローン化された３’ＵＴＲの配列分析は、異なるＲｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡ種の間の顕著な定量的な差を示した。「５６」と名付けられた配列は、クローン化された全Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡの５６％を占めた。「２９」と名付けられた他の配列は、全Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡの２９％を占めた。クローンの残り１５％は、Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡの他のタイプに対応した。
【００４２】
ｃＤＮＡライブラリーから受け取られた２９タイプおよび５６タイプを、公開された配列と比較した。配列の整列は、これらのＲｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡが、新規なＲｕｂｉｓｃｏプロモーターから発現することを示した。それぞれ、２９タイプ配列はｒｂｃＳ−２と呼ばれ、５６タイプ配列はｒｂｃＳ−４と呼ばれる。
【００４３】
実施例２ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａから得られたＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのクローニング
配列の「５６」および「２９」タイプに基づき、逆方向プライマーを、プロモータークローニングの引き続いての工程において使用するために設計した。
【００４４】
ｒｂｃｓ−２プロモーターのクローニング
まず、ＥＳＴライブラリーを構築した。見受けられる最も一般的なタイプのＵＴＲはＵＴＲ２であった。このＵＴＲ−２を使用して、ゲノムウォーキング工程のために、逆方向プライマーを設計した。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＶ、ＤｒａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｍａＩおよびＳｓｐＩによって消化し、アダプター(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT (配列番号:６）および5'-p-ACCAGCCC-NH2-3'(配列番号:７）に連結して、６つのＤＮＡライブラリーを得た。
【００４５】
次のＰＣＲ増幅（第１およびネステッド）を、アダプタープライマーAP1 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(配列番号:８）およびＵＴＲ２−特異的ＬＩプライマー5'-GGCCACACTTGACAATCCGATATAACATGCCTCA-3'(配列番号:９）で実行した。
【００４６】
ネステッドＰＣＲを、ＡＰ２プライマー5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’（配列番号:１０）およびネステッドＵＴＲ２-特異的Ｌ２プライマー5'-CAAATGGAAATGAAATGAGGTAG-3’（配列番号:１１）で実施した。
【００４７】
最長の９００ｂｐ産物を、ＤｒａＩ ＤＮＡライブラリーを用いることによって入手した。この断片を、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ベクターへクローン化し、配列決定した。配列を、GenBankデータベースの配列と比較した。見つかった最も同種な配列は、Ｂ． ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳ（受託番号Ｘ６１０９７）であった。
【００４８】
受け取られたクローンのうちの１つ（Ｒｕｄ３）の５’末端近くには、Ｂ．ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳから欠けている２２ｎｔ長のストレッチがあった（Ｂ．ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳの１０３７ｎｔから始まる）。（Ｘ６１０９７との相同性に基いた）推定上の転写開始部位から下流の２つの逆方向プライマー、ＲｂＮｃｏおよびＲｂＳｉＢおよびＸ６１０９７の相同性に基づいた２つの順方向プライマーＢＮＲｂ１およびＢＮＲｂ３を設計した。全長ｒｂｃＳ−２−遺伝子を、順方向プライマーとしてＢＮＲｂ１を、逆方向プライマーとしてＵＴＲ２−Ｌ２を用いて増幅した。引き続いて、異なる長さの２つのプロモーターを、順方向プライマーとしてＢＮＲｂ３および逆方向プライマーとして（シグナルペプチドとの）ＲｂＳｉＢ、あるいは順方向プライマーとしてＢＮＲｂ３および逆方向プライマーとして（シグナルペプチドなしの）ＲｂＮｃｏの組合せを用いて、ネステッドＰＣＴにおいて増幅した。
【００４９】
ｒｂｃＳ−４プロモーターのクローニング
プロモータークローニングを、いくつかの工程で実施した。３つの公開されたＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の第１のエクソンの開始上の同じ配列と適合する（第１およびネステッドＰＣＲに対する）２つの逆方向プライマーを、ゲノムウォーキングの最初の工程に使用した。
【００５０】
ゲノムＤＮＡを、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ葉から単離し、６つの画分に分けた。各画分を、６つの制限酵素（ＥｃｏＲＶ、ＤｒａＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｔｕＩ、ＳｓｐＩ、ＸｍｎＩ）のうちの１つによって消化し、上記のゲノムウォーキングアダプター（Clontech)で連結した。各制限連結混合物は、ゲノムＤＮＡライブラリーを表す。
【００５１】
次の工程は、アダプター特異的ＡＰ１およびＡＰ２（順方向）および遺伝子特異的（逆方向）プライマーを用いる、２つの連続ＰＣＲ(第１およびネステッド）を含んだ。ＰＣＲを、３つの異なる逆方向プライマーを用いることによって開始し、下記にリストする重複ＰＣＲ産物を得るために、Ｒｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵ遺伝子の最初のエクソンの異なる部分にアニールした。
(ＲｂｃＳ−ＲＮ: 5'-ACCCGGGCCCAGGAGAGCATAGAGGAAGCC-3' (配列番号:１２）,
ＲｂｃＳ−Ｒ１: 5'-CGGTGAATGGAGCGACCATCGTGGCTTGAG-3' (配列番号:１３）,
ＲｂｃＳ−Ｒ２: 5'-CTGTGAATGGAGCAACCATGGCCGCTTGAG-3' (配列番号:１４）.
【００５２】
上記の６つのゲノムＤＮＡライブラリーは、ネステッドＰＣＲの後、増幅産物を生産した。これらの産物を、ＴＡクローニングを用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Promega)へ直接クローン化した。コロニーを、Ｍ１３ユニバーサルおよび逆方向プライマーによるＰＣＲを用いてスクリーンした。インサートを持つプラスミドＤＮＡを運ぶコロニーを、液体培養液中で成長させ、単離されたプラスミドＤＮＡを、配列決定分析に使用した。
【００５３】
クローンを含有する約９０プラスミドＤＮＡインサートの総数を分析した。配列決定分析から得られたデータに基づき、配列を、配列類似性に従って、５つの群に分けた。３つのプロモーターを、GenBankで公開されたものと似ていると同定した。さらに、クローン化されたプロモーター領域に特異的な、特別に設計された順方向プライマー、および３’ＵＴＲの「５６」型（３’ＵＴＲのｒｂｃＳ−４型）に特異的な逆方向プライマーを用いるＰＣＲによって、ゲノムにおける３’ＵＴＲの５６型（３’ＵＴＲのｒｂｃＳ−４型）を有する推定プロモーターの同定が可能になった。このプロモーターを、「５６Ａ」と呼ぶ。
【００５４】
得られた配列に基づき、新たな逆方向プライマーを設計して、同一の順方向プライマー（ＡＰ１、ＡＰ２）および新たな逆方向プライマーを有し、同一のゲノムＤＮＡライブラリーを用いる次のＰＣＲ組を作成した。この手順を４回繰り返した。４回目のＰＣＲ周期の後、得られた配列によって、プロモーター特異的順方向プライマーを設計することができた。逆方向プライマーを、ＢｐｉＩに対して特別な部位を含むように設計して、ＮｃｏＩ適合性制限部位を作った。これらのプライマーおよびＨｉＦｉ ＫＯＤポリメラーゼを用いるＰＣＲによって、他の配列の中でも、プロモーターｒｂｃＳ−４Ａ（配列番号：１）の「５６」型の同定が可能になった。ゲノムウォーキング技術の手段によって、「５６」型３’ＵＴＲを有するもう１つのプロモーターが、ゲノム中に連結していることが分かった。このｒｂｃＳ−４Ｂプロモーター（配列番号：２）は、（１９５３−２１７５ｎｔ 配列番号：１および配列番号：２において７９４−１０１６ｎｔ）における約２３０ｎｔ領域の長さに対して、ｒｂｃＳ−４Ａと９８％類似していたが、ｒｂｃＳ−４ＡおよびｒｂｃＳ−４Ｂの末端部は、４０％以下の類似性を示した。図２Ｂは、これらの２つのプロモーターの−２６７ないし＋３３ｎｔの整列を与える。また、ｒｂｃＳ−４Ｂプロモーターを、校正ＫＯＳポリメラーゼでクローン化し、その機能的活性をさらに研究した。
【００５５】
同じアプローチを用いて、ゲノムウォーキングの全４工程を、ｒｂｃＳ−４Ａプロモーター（配列番号：１）をクローン化するのに適用し、２工程を、ｒｂｃＳ−１、ｒｂｃＳ−３およびｒｂｃＳ−５プロモーター（それぞれ、配列番号：２１、配列番号：２２、および配列番号：２３）をクローン化するのに適用した。ゲノムウォーキングの最終工程の後、全長プロモーターを、校正Ｐｆｕ酵素を用いてクローン化した。クローン化されたプロモーター配列の３’末端を、それらがレポーター遺伝子と連結することができるように設計した。得られたプロモーター配列を、GenBank BLASTシステムを用いて分析した。それぞれ、受託番号Ｘ５５９３７およびＸ７５３３４を有するｒｂｃＳ−３およびｒｂｃＳ−５プロモーターと（最大９８ないし９９％）類似した、同定されたＢｒａｓｓｉｃａプロモーターが存在した。クローン化され、知られた全プロモーターを、コンピューター整列プログラムによって、相互と比較した。この分析は、全プロモーターが、ほとんど約３００ｎｔ領域に位置する大体類似した部分を有することを示した。これらの（ｒｂｃＳ−４Ｂ以外（下記参照））ｒｂｃＳプロモーターの３００ｂｐ長の近接部分の整列を、図２Aに示す（ｒｂｃＳ−２は配列番号：３であり；ｒｂｃＳ−４は配列番号：１である）。ゲノムウォーキングデータは、同一の３’ＵＴＲに接続された２つの部分的に異なるｒｂｃＳ−４（ｒｂｃＳ−４ＡおよびｒｂｃＳ−４Ｂと呼ばれる）プロモーターがあり、それらの３’末端上の最後の２３０ｂｐ上で非常に類似していることを示した（図２Ｂ）（ｒｂｃＳ−４Ａは配列番号：１であり；ｒｂｃＳ−４Ｂは配列番号：２である）。他方、プロモーターの終止（末端）部分は、他のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターと整列して示すのと同じ低レベルの相同性（４０％）を示す。
【００５６】
ｒｂｃＳ−２（配列番号：１）との公開されたＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター（受託番号Ｘ６１０９７）のうちの１つの整列は、それらの間のいくつかの差（９１％類似性）を示す（図２Ｃ)。また、３’ＵＴＲ領域において差が存在する。従って、これらの２つのプロモーターは同じものではなく、恐らく、Ｂｒａｓｓｉｃａ種のｒｂｃＳ遺伝子ファミリーの進化または選択プロセスの間に発散した。
【００５７】
図３を参照すると、ｒｂｃＳ−４Ａ（配列番号：１）プロモーター配列および公開されたＢｒａｓｓｉｃａ ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター（Ｘ６１０９７）の整列は、５２％の相違を明らかにした。
【００５８】
同様に、図４を参照すると、ｒｂｃＳ−４Ａプロモーター配列と公開されたＣｈｒｙｓａｎｔｈｍｕｍ ｒｂｃＳ−１プロモーター（ＡＹ１６３９０４）の整列は、５７％の相違を明らかにした。
【００５９】
明らかに、Ｂｒａｓｓｉｃａゲノムプロジェクトデータベースと非常に高い相同性（約９３％の類似性）を有するｒｂｓＣ−４Ａプロモーター（配列番号：１の１００７ないし１４４０ｎｔ、１７７６ないし１９５０ｎｔおよび１９５９ないし２１７５ｎｔ）において、３つのストレッチのみが存在する（図１７）。受託番号ＢＨ４８４６５１は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａのゲノムクローンを表し、ＣＤ８１１７６１はＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのｃＤＮＡクローンを表す。ｒｂｃＳ−４Ａプロモーター配列の他の部分は、Ｂｒａｓｓｉｃａゲノムプロジェクトを含むいずれのデータベースでも見受けられない。
【００６０】
明らかに、ｒｂｃＳ−２（配列番号：３）およびｒｂｃＳ−４ＡおよびＢ（それぞれ、配列番号：１および２）のヌクレオチド配列は、この開示において記載のように新規かつ有用である。
【００６１】
実施例３ 融合構築体 ｒｂｃＳ−４Ａ−ＧＵＳ、ｒｂｃＳ−４Ａ−ＨＳＡ、ｒｂｃＳ−４Ｂ−ＧＵＳ、ｒｂｃＳ−２−ＧＵＳ、ｒｂｃＳ−２−ＨＳＡ、Ｒｂｃｓ−２−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２、ｒｂｃＳ−４Ａ−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２、ｒｂｃＳ−２−ＴＮＦＲ−ＦｃおよびｒｂｃＳ−４Ａ−ＴＮＦＲ−Ｆｃ
プロモーターを、逆方向プライマーによって増幅して、それらの３’末端上に、ＮｃｏＩ適合性制限部位を得た。ＧＵＳ遺伝子とその５’末端上にＮｃｏＩ部位を含有するベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（ＣＡＭＢＩＡ）を使用した。ＨＳＡ融合構築体を、ＨＳＡ遺伝子が挿入されたｐＢＩＮ１９系プラスミドｐＧＰＴＶにおいて設計した。コドン最適化されたＨＳＡ遺伝子と人工ポリAシグナルの配列を、図１９に示されるように添加した。ＲｂｃＳ−４ＡおよびｒｂｃＳ４Ｂを、ＢｐｉＩ、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断した。ＲｂｃＳ−２を、ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断した。プロモーターＲｂｃＳ ４Ａ、ｒｂｃＳ−４Ｂ、およびｒｂｃＳ−２を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１またはＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって開環されたｐＧＰＴＶベクターへクローン化した。これらの構築体に使用されたターミネーターは以下のとおりであった：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ベクターを含有するＧＵＳにおけるｎｏｓターミネーター、ならびに３’ＵＴＲのｒｂｃＳ−４型およびGenBankからの既知のＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒｂｃＳターミネーターの一部を、ｐＧＰＴＶプラスミドを含有するＨＳＡにおいて使用した。
【００６２】
構築体Ｒｂｃｓ−２−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２およびＲｂｃＳ−４−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２は、同じ抗体領域および（ゲノムから直接の）天然のＢｒａｓｓｉｃａ ｒｕｂｉｓｃｏ ＲｂｃＳ−４遺伝子からの同じターミネーター（ポリA)シグナルを含有する。抗体蛋白質分子は、元来、ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２抗原に対して開発された。Ｒｂｃｓ−２−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２は、Ｒｂｃｓプロモーター、図２０に示される軽鎖（抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２)コード領域、図２１に示されるＲｂｃＳ−４ターミネーター（配列番号：１７）、もう１つのＲｂｃＳ−２プロモーター、図２２に示されるような重鎖（抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２)（配列番号：１８）コード領域およびもう１つのＲｂｃｓ−４ターミネーター（配列番号：２０）よりなる。ＲｂｃＳ−４−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２は、ＲｂｃＳ−４プロモーター、軽鎖（抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２（配列番号：１６）コード領域、ＲｂｃＳ-4ターミネーター、もう１つのＲｂｃｓ−４プロモーター（配列番号：２）、重鎖（抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２）（配列番号：１８）コード領域、およびもう１つのＲｂｃＳ−４ターミネーター（配列番号：２０）よりなる。
【００６３】
構築体Ｒｂｃｓ−２−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２およびＲｂｃＳ−４−Ａｂ（Ｌ＋Ｈ）−１Ｃ２について、ｒｂｃＳ−２およびｒｂｃＳ−４プロモーターを、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって切断し、ｐＶＫ１−ＣＨＣ（不変重鎖）-ｒｂｃＳ−４−ターミネーターと連結し、ＳａｌＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＶＫ１-ＲｂｃＳ−２（Ｒｂｃｓ−４Ａ）プロモーター−ＣＨＣ−ＲｂｃＳ−４−ターミネーターを得た。元々、ＲｂｃＳ−４ターミネーターは、ＢｓｉＷＩ、ＥｃｏＲＩによって、ＣＨＣでクローン化した。１Ｃ２抗体（ＶＨ−１Ｃ２）の可変重鎖領域を、ＢｐｉＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉによって切断し、同一部位によって、ｐＶＫ１-Ｒｂｃｓ−２（Ｒｂｃｓ−４）−プロモーター−ＣＨＣ−ＲｂｃＳ−４−ターミネーターベクターへクローン化した。得られたプラスミドは、全Ｈ（重）鎖ユニットを含有するプラスミドであった。同じ戦略を使用して、全Ｌ（軽）鎖ユニットを得た。次いで、軽鎖ユニットを３５Ｓ−ｇｕｓＡまたは３５ＳＵｉｄＡ遺伝子を除去したｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ベクターへクローン化した。これによって、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１-Ｌ−鎖を得た。最終工程において、Ｈ鎖ユニットを、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１−Ｌ−鎖ベクターへ導入して、最終ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１−Ｈ−Ｌを得た。プラスミドを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介戦略を用いる植物形質転換に使用した。
【００６４】
Ｉｇ−ＴＮＦＲ（ＥＮＢＲＥＬ）構築体は、ｒｂｃＳ−２またはｒｂｃＳ−４プロモーター、Ｉｇ ＣＨＣ部分（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）およびターミネーターを含む図２３に示されるＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子レセプター）部分（４８９ｎｔ）（配列番号：１９）を含有する。ＴＮＦＲ部分を、逆転写によって、引き続いてＰＣＲによって、ヒトｍＲＮＡから直接クローン化し、ＴＡクローニング手順によって、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙプラスミドに連結し、Ｍ１３ユニバーサルおよび逆方向プライマーによって、両方の方向から配列決定した。Ｉｇ ＣＨＣ部分を、ＰＣＲによって入手し、その後配列決定した。クローニング戦略は、ＢｓｉＷＩ部位によるＩｇ ＣＨＣ部分を連結し、ｒｂｃＳ−ターミネーターを含有するｐＶＫ１プラスミド（ｐＵＣ１９誘導体）にプロモーターを導入することを含んだ。次いで、ＢｓｍＢ１によって消化されたＴＮＦＲ部分をこのプラスミドに導入し、全インサートを、大きなｐＣＡＭＢＩＡ１３００またはｐＣＡＭＢＩＡ２３００プラスミドへ再クローン化した。
【００６５】
Ｉｇ ＣＨＣ部分を、２つの変異体において入手した。１番目は、その３’末端においていずれの変化もなく、２番目のものはその３’末端にＫＤＥＬを含有した。このシグナルは、１２ｎｔ長の配列AAAGACGAGCTG(配列番号:２４）であり、ＳＴＯＰコドンの直前に導入する。いくつかのターミネーターを、Ｉｇ−ＴＮＦＲ構築体において使用した。１つは、抗体構築体において使用されるのと同じであるｒｂｃＳ−４ターミネーター（約５００ｎｔ）であった。もう１つのターミネーターは、ｒｂｃＳ ４−ターミネーターのより長いバージョン（約２ｋｂ）であった。使用されたさらにもう１つのターミネーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＶＳＰ１（発育保存蛋白質−１遺伝子）からのものであり、ＳＴＯＰコドンのすぐ後ろおよび開裂部位のすぐ前に位置する部分を使用し、図２４に示されるｒｂｃＳ 4ターミネーター（配列番号：１７）の一部と接続した。構造体のうちのいくつかにおいて、１または２つのＭＡＲ（マトリックス付着領域）配列（約２ｋｂ）も導入した。構築体が２つのＭＡＲ配列を含有した場合、それらを、プロモーターの前およびターミネーターの後に導入した。
【００６６】
実施例４ 植物形質転換
この開示に従って、新規なプロモーターの機能性を例示するために、我々は、Ｂｒａｓｓｉｃａ種の植物、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物およびＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ植物を形質転換した。当業者は、他の種の植物を形質転換することができる。
【００６７】
Ｂｒａｓｓｉｃａ植物を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１またはｐＧＰＴＶ−ＨＰＴバイナリーベクターを運ぶＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４で、葉植菌によって形質転換した。タバコ植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． Ｓａｍｓｕｎｇを、ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴバイナリーベクターを運ぶＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４で、葉植菌によって形質転換した。推定形質転換体を３０ｍｇ／ｌヒグロマイシン上で選択した。陽性系統を、さらなる研究のために、温室に移した。
【００６８】
Ｃａｍｅｌｉｎａ植物を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００バイナリーベクターを運ぶＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株Ｃ５８（ヘルパープラスミドｐＧＶ３８５０）で、葉植菌によって形質転換した。推定形質転換体を、２０ｍｇ／ｌヒグロマイシン上で選択した。陽性系統を、さらなる研究のために、温室に移した。
【００６９】
実施例５ 発現分析のための定量ＧＵＳアッセイ
アッセイを、タバコ葉またはＣａｍｅｌｉｎａ実生で実施した。新鮮な植物材料を、２−ＭＥを含有するＴｒｉｓ緩衝液中で、機械的に分離した。抽出物中に濃縮する蛋白質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイを用いて決定した。ＧＵＳ活性を、メチルウンベリフェリル（umbelliferyl）を、酵素反応のための基質として用いて、分光光度計において決定した。インキュベーションは、＋３７℃にて、３０分間であり、生じた色は、４５０ｎｍ波長にて、分光光度計において測定した。非トランスジェニック植物を、陰性対照として使用した。
【００７０】
実施例６ リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびノーザン分析によるｍＲＮＡの発現分析
ＢｒａｓｓｉｃａまたはＣａｍｅｌｉｎａ種子またはタバコ葉の発芽の子葉から単離された総ＲＮＡを、遺伝子特異的逆方向プライマーによって、逆転写した。逆方向プライマーを、知られている全３’ＵＴＲの相違した部分ならびにＨＳＡ、ＧＵＳ、抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２抗体の重鎖および軽鎖およびＲｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵコード領域の第３のエクソンに対して設計した。得られたｃＤＮＡを、順方向および同一の逆方向プライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲ工程に使用した。
【００７１】
リアルタイム手順を、主に、方法のＳＹＢＲｇｒｅｅｎ定量変異体を用いるマニュアルに従って、ＡＰＩ７０００機械で実施した。受動的な参照色素はＲＯＸであった。較正曲線を、ゲノムから増幅され、リアルタイムプロセスにおいてと同じプライマーで精製されたＰＣＲ産物を用いて、構築した。結果を、分子の数／元々採取されたＲＮＡ試料の１ｎｇで表現した。
【００７２】
ノーザン分析につき、総ＲＮＡを植物材料から単離し、寒天ゲル上でランし、膜に移した。次いで、ＲＮＡを、ＵＶ光への短い露出によって膜に交差結合した。次の工程は、細菌Ｔ７またはＳＰ６プロモーターからインビトロ合成された特異的ＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションは、各プローブに対して特別に最適化された、最適温度にて、一晩続いた。洗浄後、膜を、プローブ上のＤＩＧ標識を認識する抗体によるインキュベーションに付す。ＲＮＡプローブ（つまり、特異的なｍＲＮＡ）の量を、陰性および陽性対照（可変濃度）を用いて、増強された発光によって検出して、実験試料中の特異的なｍＲＮＡの量の決定を可能にした。
【００７３】
実施例７ 種子を発芽する際のＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の発現レベルおよび総Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡが、子葉成長の終結に向けて増加する。
恒明条件下の総ＲＢＣＳ ｍＲＮＡ含有量は、最初の３ないし４日の間増加し、次の５ないし７日間、高レベルのままであった（図１６）。
【００７４】
異なるＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の発現レベルおよびＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ種子を発芽する際の総Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡ生産も決定するために、リアルタイムＰＣＲによる恒明条件下で、発芽の０、１、２、３および４日目の種子中の総Ｒｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡの量を測定した。
【００７５】
図９（第１列）に示される定量データは、総ｍＲＮＡのうちの１ｎｇ／平均試料中のＲｕｂｉｓｃｏ ｍＲＮＡ分子の量または数を示す。明らかに、ｍＲＮＡ分子の量は、０日目から４日目へと増加し、４日目で最高量を示した。発芽の４日目、ほとんどの試料において決定されたＲＢＣＳ ｍＲＮＡの量は、約４ないし７ｘ１０７分子／総ｍＲＮＡのうちの４ｎｇであった。
【００７６】
実施例８ ＲＢＣＳ ｍＲＮＡのｒｂｃＳ−４型は、植物成長の種子を発芽する段階にて、ｍＲＮＡの最も普遍的かつ活性なタイプである
ＲＢＣＳ ｍＲＮＡの異なるタイプの量を、上記のリアルタイムプロセスによって分析した。ｒｂｃＳ−２、ｒｂｃＳ−３、ｒｂｃＳ−４およびｒｂｃＳ−５の発現レベルを、ｍＲＮＡ種の３’ＵＴＲの相違部分に特異的なプライマーを用いることによって、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ種子発芽の０ないし４日目に決定した（図５）。順方向プライマーを、それらが、特異的な３’ＵＴＲタイプに対応するより長い右部分を有するように設計した。各プライマーのより短い左部分は、ＲＢＣＳコード領域の末端に対応する。この左部分によって、長さ、つまりプライマーのＴｍが増加するが、その特異性を妨げない（図５）。
【００７７】
図９（３ないし６段）に要約されるデータは、発現レベルにおける著しい差を示す。種子発芽の４日目の最も豊富なタイプは、ｒｂｃＳ−４ ＲＢＣＳ ｍＲＮＡであったが、部分的に類似したプロモーター（ｒｂｃＳ−４Ａおよび-B；それぞれ、配列番号：２および配列番号：３）によって駆動され、同一の３’ＵＴＲ（３’ＵＴＲのｒｂｃＳ−４型）に接続された少なくとも２つのｒｂｃＳ遺伝子が存在することが上記で既に記している。これは、各ｒｂｃＳ−４遺伝子が、遺伝子の合計活性に寄与し得ることを意味するかもしれない。しかし、ｒｂｃＳ−４Ｂ-ＧＵＳトランスジェニックタバコ植物から得られた定量ＧＵＳ発現データ（図１０）によると、プロモーターの活性は非常に低く、３’ＵＴＲのｒｂｃＳ−４型を含有するｍＲＮＡの総量に顕著な影響を及ぼさないようである。
【００７８】
本明細書に提示されるデータは、明らかに、植物成長の種子発芽のより遅い段階での、ＲＢＣＳ ｍＲＮＡのｒｂｃＳ−４型の普遍性を示す。
【００７９】
さて、図９に示される結果を参照すると、リアルタイムＰＣＲは、ｒｂｃＳ−４プロモーターが、検査されたいずれの他のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターよりも、発芽の４日目にて、より活性であることを示した。異なるＲＢＣＳ遺伝子の発現レベルは、異なる動力学に従い、例えば、３日目には、ｒｂｃＳ−２（配列番号：３）およびｒｂｃＳ−３（配列番号：２１）は、ｒｂｃＳ−４（配列番号：２２）およびｒｂｃＳ−５（配列番号：２３）より活性であった。これらの特徴は、種子または芽を発芽する際に、生産される外来蛋白質または他の所望の遺伝子産物の生産方法に対するプロモーターを選択する時に、非常に重要である。
【００８０】
不安定なトランスジェニック蛋白質は、種子発芽の組織中の植物細胞の促進された蛋白質可動化能力のため、かなり早く劣化し得る。活性の遅延した動力学を有するｒｂｃＳ−４のようなプロモーターを用いる時、溶解液胞（lytic vacuoles)の活性からのトランスジェニック蛋白質産物の蓄積を保護する機会がより多く存在する。さらに、トランスジェニック構築体において、ｒｂｃＳ−４Ａを用いるさらなる利点は、これが、種子発芽のより遅い段階で分析された４つのプロモーターの中で最も強力なプロモーターであるという事実から生じる。
【００８１】
図１３は、ｒｂｃＳ−４-ＨＳＡに対してまたは（ｒｂｃＳ−２-ＨＳＡ）ｘ２に対してトランスジェニックなＢ． ｎａｐｕｓ種子を発芽する際のＨＳＡ ｍＲＮＡの蓄積を比較する。（ｒｂｃＳ−２-ＨＳＡ）ｘ２は、ｒｂｃＳ−２の２ユニットが直列で並べられたｒｂｃＳ−２-ＨＳＡの変異体である。ＨＳＡ ｍＲＮＡが、（ｒｂｃＳ−２-ＨＳＡ）ｘ２に対してトランスジェニックな種子においてより早く蓄積し始めることは明白である。他方、ｒｂｃＳ−４-ＨＳＡトランスジェニック植物中のＨＳＡ ｍＲＮＡは、より遅く蓄積し始めるが、蓄積する量は、いくらかより大きい。図９から分かるように、ｒｂｃＳ−４プロモーター活性の動力学は、ｒｂｃＳ−２のものよりより遅延しており、従って、両方のプロモーターが、天然でない状況にある時でさえ機能的であることが明白である。この関連において、天然の状況は、ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターおよびゲノムの適切な部位に置かれたｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子を含有する正常な非トランスジェニック植物を意味する。天然でない条件は、人工の条件、我々の場合においてのように、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子およびゲノムの不定位置に挿入された外来レポーター遺伝子を意味する。
【００８２】
実施例９ 所望の遺伝子産物の生産のために、ｒｂｃＳ−２およびｒｂｃＳ−４プロモーターを有する異種および同種トランスジェニック植物
ｒｂｃＳ−２（配列番号：１）およびｒｂｃＳ−４（配列番号：２および配列番号：３）プロモーターを、Ｂｒａｓｓｉｃａ、タバコおよびＣａｍｅｌｉｎａ植物による植物形質転換実験に使用して、「プロモーター強度」を決定し、また、同種および異種システム（つまり、同一または異なる種からのプロモーターを含有する構築体で形質転換された植物）における発現レベルを比較した。
【００８３】
プロモーターを逆方向プライマーによって増幅して、それらの３’末端上のＮｃｏＩ適合性制限部位を得た。実施例２記載のとおり設計された５’末端上にＮｃｏＩ部位を有するＧＵＳ遺伝子を含有するｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ベクター（ＣＡＭＢＩＡ）を使用した。
【００８４】
Ｂｒａｓｓｉｃａのゲノム中に挿入された構築体を含有するプロモーターｒｂｃＳ−２（配列番号：３）またはｒｂｃＳ−４ＡおよびＢ（配列番号：１および２）は、同種システムを表し、タバコおよびＣａｍｅｌｉｎａ植物のゲノム中の同一の構築体の挿入は異種システムを表す。フレーム内でレポーター遺伝子と融合されたｒｂｃＳ−２またはｒｂｃＳ−４プロモーターを含有する組換え構築体を、実施例３記載のとおり設計し、実施例４記載のとおり、植物に形質転換した。
【００８５】
ｒｂｃＳ−４Ａ−ＧＵＳまたはｒｂｃＳ−２−ＧＵＡを含有するトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ植物のｍＲＮＡ発現データを、図７に示す。レポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、４日間発芽させたトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ植物の種子の子葉から測定した。
【００８６】
図７に示される表において、
１）両方の植物形質転換体におけるトランスジーン（ＧＵＳ)ｍＲＮＡの発現は、対応する天然のｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子（ｒｂｃＳ−２またはｒｂｃＳ−４Ａ）の発現より、約５ないし６倍低く；
２）トランスジェニック植物における天然のｒｂｃＳ−４Ａ遺伝子の発現レベルは、非トランスジェニック植物におけるものに対応する（図９）が、ｒｂｃＳ−２トランスジェニック植物における天然のｒｂｃＳ−２遺伝子の発現レベルは、非トランスジェニック植物におけるものより低いようであることを示す。
この結果は、２つのプロモーターのいくつかの特性、つまり、同種植物におけるｒｂｃＳ−２プロモーターのさらなるサイレンシング依存性を指摘する。
【００８７】
タバコ形質転換実験につき、ｒｂｃＳ−２-ＨＳＡおよびｒｂｃＳ−４Ａ-ＨＳＡ構築体を使用し、それらの各々に対する７つのＨＳＡ生産植物系統を受け取った。トランスジェニックタバコ種子発芽の５日目に決定されたＨＳＡ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、これらの植物系統の両方のタイプにおいて、発現の大体同じレベルを示す（図８）。タバコ形質転換実験は、明らかに、ｒｂｃＳ−２およびｒｂｃＳ−４プロモーター強度の間に有意な差は全くないが、それらの両方は異種システムで発現していることを示す。
【００８８】
ＲｂｃＳ−２−ＧＵＳ、ＲｂｃＳ−４−ＧＵＳ、Ｒｂｃｓ−２−ＴＮＦＲ−Ｆｃ−５６ＵＴＲｓｈｏｒｔ、Ｒｂｃｓ−２−ＴＮＦＲ−ＦｃＫＤＥＬ−５６ＵＴＲｓｈｏｒｔ、Ｒｂｃｓ−４−ＴＮＦＲ−Ｆｃ−５６ＵＴＲｌｏｎｇ、Ｒｂｃｓ−４−ＴＮＦＲ−ＦｃＫＤＥＬ−５６ＵＴＲｌｏｎｇを有するトランスジェニックＣａｍｅｌｉｎａおよびタバコ植物を入手し分析した。結果を、表として、図１８ＡおよびＢに示す。ＧＵＳ活性の決定は、ｒｂｃＳ−２（ｒｂｃＳ−４）−ＧＵＳトランスジェニック植物における酵素活性レベルが、陽性対照として使用された慣用的な３５Ｓｐ−ＧＵＳ構築体を運ぶ植物においてよりも大きいことを示す。ノーザンデータは、いくつかのＴＮＦＲ−Ｆｃ含有Ｃａｍｅｌｉｎａおよびタバコ植物に対して入手可能である。（ｒｂｃＳ−４-TNFR-Fcに対する）発現レベルは、天然のｒｂｃＳ遺伝子のもの（Ｂｒａｓｓｉｃａにおいて、全ＲＢＣＳ遺伝子ファミリーに対する総ＲＮＡのうちの約５０ないし１００ｐｇ／μｇ）に相当する。
【００８９】
実施例１０ トランスジェニック植物における蛋白質発現
ＧＵＳ遺伝子コード領域を含む構築体を、ＲｕｂｉｓｃｏプロモーターｒｂｃＳ−４Ａに連結し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を用いて、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ)植物に形質転換した。トランスジェニック植物を、種子を生産するまで、温室で成長させた。トランスジェニック植物の種子を、２０℃の炭酸水、２４℃の通気した２０ｍＭのＫＮＯ３水あるいは３０℃の炭酸水中で発芽させた。培養の可変時間後、発現されたＧＵＳ蛋白質を、適切な緩衝液中のホモゲナイゼーションおよび遠心によって芽から単離した。特異的なＧＵＳ活性を、分光光度計によって決定した（図１１）。明らかに、ＧＵＳ活性／芽は、成長媒体中のＫＮＯ３を用いる培養液の７２時間後、最も高かった。
【００９０】
また、ｒｂｃＳ−２またはｒｂｃＳ−４の制御下のＨＳＡを運ぶトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａおよびタバコ植物の蛋白質発現を分析した。同様に、ＲｂｃＳ−２−ＨＳＡのタンデム構築体を運ぶ植物を分析した。蛋白質発現を、４日間の恒明および２４℃温度にて発芽した芽から分析した。図１５は、データを、総可溶性蛋白の％として示す。タンデム構築体を運ぶ植物が、単一構築体を運ぶ植物よりも、蛋白質の発現レベルが高いことが明白である。さらに、蛋白質発現が、ｒｂｃＳ−２プロモーター下よりも、ｒｂｃＳ−４プロモーター下でより高いことが明白である。２つのｒｂｃＳ−２−ＨＳＡ構築体を有するタンデム構築体は、本発明による複数の構築体の一例であり、当業者は、直列の２以上の構築体によって、植物を形質転換することも可能であろう。同様に、当業者は、ｒｂｃＳ−４Ａを駆動プロモーターとして有するタンデム構築体を使用して、より高い蛋白質含有量を得ることが可能であろう。
【００９１】
ＴＮＦＲ構築体を運ぶトランスジェニックＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａおよびタバコ植物の蛋白質発現を分析した。結果を図１８に示す。
【００９２】
実施例１１ 最大活性を提供するためには、ＲｂｃＳプロモーターは完全な長さでなければならない。
切断されたバージョンのｒｂｃＳ−２プロモーターを、レポーターｕｉｄ Ａ遺伝子で、融合構築体内でクローン化した（長さ０．３および０．６ｋｂ）。タバコ植物を、これらの構築体を運ぶＡｂｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって形質転換し、ＧＵＳ活性を、成熟したタバコ植物の葉から測定した。得られたデータを、ＧＵＳ遺伝子に接続されたｒｂｃＳ−２（１，６ｋｂ）または３５Ｓプロモーターを運ぶ高発現する成熟したタバコ植物の分析から得られたデータと比較した。図１５に示される結果は、明らかに、プロモーターの長さの減少による、現れたＧＵＳ活性の減少を示す。従って、ｒｂｃＳ−２プロモーターの末端領域が、基本的な（誘導できない）プロモーター活性を支える本質的な制御要素を含有することが明白である。既知のトマトｒｂｃＳ１プロモーターおよび我々のクローン化されたＢｒａｓｓｉｃａ ｒｂｃＳ−２およびｒｂｃＳ−４Ａプロモーターのシリコ比較分析によって、それらの全てにおける同様のコンセンサス制御要素を発見することが可能になる（図６）。既知のボックスのうちのほとんどが、−５００−６００ｎｔ領域に位置することが明らかである。プロモーターのそれらの末端部分が、いくつかの不可解な制御要素を有し得るかあるいはそれらが、例えば、ｒｂｃＳ−４Ａの５’領域において、ＭＡＲ（マトリックス付着領域）部位の潜在的な発生のために、プロモーター活性に参加し得ることを提案することができる（コンピューターＭＡＲ予測分析）。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａの種子を発芽させる際の異なる３’ＵＴＲ型ｒｂｃＳ遺伝子の相対量を示す。
【図２Ａ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３、および４は、Ｇｌｏｂａｌ ＤＮＡ整列プログラムによるＤＮＡ配列整列を示す。参照分子：ｒｂｃＳ−３００ｎｔ。領域１ないし３００。配列５。スコアリングマトリックス：線状［ミスマッチ２、OpenGAp 4m ExtGap 1］。配列一覧：類似性フォーマット、同じベース位置での高マッチの色領域。図２Ａは、クローン化されたＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒｂｃＳプロモーター（３００ｂｐ)の整列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、水平のボックスが同種領域であるクローン化されたＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒｂｃＳ−４Ａ（配列番号：１）およびｒｂｃＳ−４Ｂ（配列番号：２）プロモーター（３００ｂｐ）の整列を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、プロモーター（上部）および３’ＵＴＲ（下部）Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒｂｃＳ−２（配列番号：３）およびＢ ｎａｐｕｓ ｒｂｃＳ（Ｘ６１０９７)の整列を示す。
【図３】図３は、ＲｂｃＳ−４Ａプロモーター（配列番号：１）（上部系統）および受託番号Ｘ６１０９７で公開されたＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター（下部系統）の１ｋｂ配列の整列を示す。配列は、５２％の相違を示す。
【図４】図４は、ｒｂｃＳ−４Ａプロモーター（配列番号：１）（上部系統）および受託番号ＡＹ１６３９０４で公開されたＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｒｂｃＳ１プロモーターの１ｋｂ配列の整列を示す。配列は、５７％の相違を示す。
【図５】図５は、異なるｒｕｂｉｓｃｏ ３’ＵＴＲタイプの独特の部分に対して特異的な順方向および逆方向プライマーの配列を示す。プライマーは、異なる３’ＵＴＲ種が、リアルタイムＰＣＲと識別され得ることを示す。順方向プライマーは、２つの部分に分けられる（下線かつイタリック体）：各プライマーの左部分は、関連するｒｕｂｉｓｃｏコード領域の最後のほとんどないヌクレオチドに対応し、右部分は特異的な３’ＵＴＲ配列に対応する。全ての逆方向プライマーは、特異的な３’ＵＴＲ領域にアニールする。全アンプリコンサイズは、８０ないし１００ｎｔ範囲を変動する。
【図６】図６は、ｒｂｃＳ−２（配列番号：１）およびｒｂｃＳ−４Ａ（配列番号：３）プロモーターで見受けられるコンセンサス制御要素の図である。
【図７】図７は、ｒｂｃＳ−２-ＧＵＳおよびｒｂｃＳ４Ａ−ＧＵＳ（それぞれ、Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター配列の配列番号：１および配列番号：３）によって形質転換されたトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ植物において、リアルタイムＰＣＲを用いるｒｂｃＳ−２、ｒｂｃＳ−４およびＵｉｄＡ(ＧＵＳ)からのｍＲＮＡの量を示す表である。
【図８】図８は、トランスジェニックタバコ植物のＲＮＡ試料中のＨＳＡ ｍＲＮＡ分子の量を示す（リアルタイムＰＣＲデータ）。
【図９】図９は、種々の時間に発芽したＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ種子中の異なるＲｕｂｉｓｃｏプロモーターの発現レベルを示す。データは、分子の数／試料（総ＲＮＡの１００ｎｇ）を示す。
【図１０】図１０は、構築体を含むｒｂｃＳ−４Ｂ ＵｉｄＡ遺伝子を運ぶトランスジェニックタバコ植物におけるＧＵＳ発現を示す。
【図１１】図１１は、２４℃または３０℃での恒明下でのＢｒａｓｓｉｃａ種子の発芽の間の、ＲｕｂｉｓｃｏプロモーターｒｂｃＳ−４Ａ下でのＧＵＳ発現を示す。
【図１２】図１２は、トランスジェニックＣａｍｅｌｉｎａ植物中のＨＳＡ ｍＲＮＡ含有量を示す（ノーザン分析）。
【図１３】図１３は、種々の時間でのトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ植物の種子を発芽する際のＨＳＡ ｍＲＮＡ含有量を示す。
【図１４】図１４は、％ＴＳＰ（総可溶性蛋白）として計算されたトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｍｅｌｉｎａおよびタバコ植物中のＨＳＡ蛋白質の量を示す。最小値および最大値と共に、平均値を示す。
【図１５】図１５は、レポーター遺伝子としてＧＵＳおよび全長ｒｂｃＳ−２（配列番号：２）プロモーター（１．６ｋｂ）またはプロモーターの切断されたバージョンのいずれかを含む構築体によって形質転換されたトランスジェニックタバコ植物におけるＧＵＳ活性を示す。３５Ｓプロモーターを、陽性対照として使用する。
【図１６】図１６は、ノーザンブロット分析によって明らかにされるように、Ｂｒａｓｓｉｃａ実生を発芽する際のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターの発現を示す。図１６Ａは、１２ないし１６８時間、空輸タンク中で発芽した後のＢｒａｓｓｉｃａ実生におけるＲｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵ ｍＲＮＡの合成を示すノーザンブロットである。図１６Ｂは、対照として同一のフィルター上に負荷された時に、インビトロ転写によって生産された標識されていないＲｕｂｉｓｃｏ ＲＮＡを示す。対照ＲＮＡの量は、ｐｇで示す。
【図１７】図１７は、ＲｂｃＳ−４Ａ（配列番号：１）プロモーター（上部系統）の配列および受託番号ＢＨ４８４６５１で、Ｂｒａｓｓｉｃａゲノムプロジェクトにおいて公開されたＢｒａｓｓｉｃａ配列の整列を示す。
【図１８】図１８は、ＴＮＦＲ構築体を運ぶトランスジェニックＣａｍｅｌｉｎａおよびタバコ植物に対する定量的ノーザンデータを示す。図において、Ｒｂｃｓ−２−ＴＮＦＲ−Ｆｃ−５６ＵＴＲ ｓｈｏｒｔは、ｒｂｃｓ−２プロモーター、ＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ２＋ＣＨ３ドメイン）の一部に連結されたＴＮＦＲ部分（４８９ｎｔ）、天然のｒｂｃｓ−４遺伝子（０，５ｋｂ長）からのターミネーターを含有し、先の構築体中と同一であるが、そこにはＦｃ領域の後（ＳＴＯＰコドンの直前）に、ＫＤＥＬシグナル（１２ｎｔ）も存在する。Ｒｂｃｓ−２−ＴＮＦＲ−Ｆｃ−５６ＵＴＲｌｏｎｇは、ｒｂｃｓ−４Ａプロモーター、ＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ２＋ＣＨ３ドメイン）の一部に連結されたＴＮＦＲ部分（４８９ｎｔ）、および天然のｒｂｃｓ−４遺伝子（２ｋｂ長）からのターミネーターを含有する。Ｒｂｃｓ−４−ＴＮＦＲ−ＦｃＫＤＥＬ−５６ＵＴＲｌｏｎｇは、先の構築体と同一であるが、そこにはＦｃ領域の後（ＳＴＯＰコドンの直前）にＫＤＥＬシグナル（１２ｎｔ)も存在する。
【図１９】図１９は、人工ＨＳＡ遺伝子（配列番号：１５）を示す。単離された天然のヒトゲノム（ｃＤＮＡ、つまりエクソンのみでイントロンなし）の配列は、コドン最適化されている。
【図２０】図２０は、人工または半合成軽鎖（抗−ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２）コード領域（配列番号：１６）を示す。配列は、３つの部分よりなる：マウスシグナルペプチドをコードする６６ｎｔ長配列（２２アミノ酸）。配列は、受託番号ＡＦ０７８５４８を有する部分配列と１００％類似性を有し；３２４ｎｔ長軽鎖抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２抗体可変領域は、（ＶＴＴから得られた）ファージ提示ライブラリーから単離する。受託番号ＡＢ０９５２９１（Genbank)は、図２０における可変領域の１６ないし３０５ｎｔ領域（配列番号：１６）と１００％類似性を有し；カッパ軽鎖定常領域の３２４ｎｔ長は、受託番号ＢＣ０６３５９９を有する配列と１００％類似性を有する。
【図２１】図２１は、人工のｒｂｃＳ−４ターミネーター配列（配列番号：１７）を示す。元来、この配列は、ゲノムウォーキング技術によって、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａのゲノムからクローン化された。同様の配列が、Ｂｒａｓｓｉｃａゲノムプロジェクトにおいて公開される。受託番号ＢＨ６９１８３８は、８８％の部分的類似性を有する。
【図２２】図２２は、人工の重鎖（抗-ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２）コード領域（配列番号：１８）を示す。配列は、３つの部分よりなる：マウスシグナルペプチド（１７アミノ酸）をコードする５７ｎｔ長の配列。受託番号Ｘ６７２１０を有する配列の一部は、１００%類似性を有する;（ＶＴＴから得られた）ファージ提示技術によって作成された３８７ｎｔ長の重鎖抗ｈｅｖｅｉｎ １Ｃ２抗原可変領域。受託番号ＡＢ０６７２２２(Genbank)は、図２２に示された可変領域の1ないし２９５ｎｔ領域と９５%類似性を有する; ９９０ｎｔ長のＩｇＧ１重鎖定常領域。受託番号ＢＣ０２４２８９を有する配列は、９９%類似性を有する。対立遺伝子の差のため、僅かな差が存在し得る。
【図２３】図２３は、人工シグナル配列（６９ｎｔ)およびＴＮＦＲ部分（４８９ｎｔ)を示す。受託番号ＮＭ＿００１０６６を有する配列は、米国５，６０５，６９０に開示される配列と１００％類似性を有する。同様の配列は、他のＴＮＦＲ配列から入手可能である。
【図２４】図２４は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓis ＶＳＰ１（発育保存蛋白質-1遺伝子）-３’ＵＴＲおよびｒｂｃＳ−４-ターミネーター）（Genbank受託番号ＮＭ＿１２２３８７）の人工部分を示す。本明細書中のＲｂｓＳ−４−ターミネーター部は、開裂部の後ろからｎｔ３５０までの、図２１に示される全長ｒｂｃＳ−４−ターミネーターである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
子葉を成長させることに、遺伝子発現を向けることが可能な光成長されたＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ実生から由来するプロモーターであって、ヌクレオチド配列の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３を含むＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリー。
【請求項２】
蛋白質または遺伝子産物をコードする異種または同種の核酸配列に操作可能に連結された配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３よりなるヌクレオチド配列の群から選択された少なくとも１つのＲｕｂｉｓｃｏプロモーターを含む発現カセット。
【請求項３】
Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターが配列番号：１である請求項２記載の発現カセット。
【請求項４】
Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターが配列番号：２である請求項２記載の発現カセット。
【請求項５】
Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターが配列番号：３である請求項２記載の発現カセット。
【請求項６】
核酸配列が、ヒト血清アルブミンをコードする請求項２記載の発現カセット。
【請求項７】
核酸配列が合成されたものである請求項２記載の発現カセット。
【請求項８】
核酸配列が医学的に活性な蛋白質の一部をコードする請求項２記載の発現カセット。
【請求項９】
レポーター遺伝子が抗体をコードする請求項２記載の発現カセット。
【請求項１０】
植物またはその引き続いての世代が、少なくとも１つの請求項２記載の発現カセットを含む形質転換された植物。
【請求項１１】
該植物がＢｒａｓｓｉｃａまたはＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａである請求項１０記載の形質転換された植物。
【請求項１２】
該植物がＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ種子である請求項１０記載の形質転換された植物。
【請求項１３】
該種子が少なくとも１つの請求項２記載の発現カセットを含む請求項１０記載の形質転換された植物の種子。
【請求項１４】
該種子がＢｒａｓｓｉｃａまたはＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ種子である請求項１３記載の種子。
【請求項１５】
トランスジェニック実生が少なくとも１つの請求項２記載の発現カセットを含む請求項１３記載の発芽した種子の形質転換された実生。
【請求項１６】
該実生がＢｒａｓｓｉｃａまたはＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ実生である請求項１６記載のトランスジェニック実生。
【請求項１７】
該実生がＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ実生である請求項１６記載のトランスジェニック実生。
【請求項１８】
請求項１記載のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターファミリーのＲｕｂｉｓｃｏプロモーターを生成するための方法であって、光成長した実生における発現を評価し、最も高度に発現された遺伝子を同定し、子葉を成長させることに遺伝子発現を向ける能力を有するプロモーターを該遺伝子から選択する工程を含む該方法。
【請求項１】
子葉を成長させることに、遺伝子発現を向けることが可能な光成長されたＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ実生から由来するプロモーターであって、ヌクレオチド配列の配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３を含むＲｕｂｉｓｃｏプロモーターのファミリー。
【請求項２】
蛋白質または遺伝子産物をコードする異種または同種の核酸配列に操作可能に連結された配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３よりなるヌクレオチド配列の群から選択された少なくとも１つのＲｕｂｉｓｃｏプロモーターを含む発現カセット。
【請求項３】
Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターが配列番号：１である請求項２記載の発現カセット。
【請求項４】
Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターが配列番号：２である請求項２記載の発現カセット。
【請求項５】
Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーターが配列番号：３である請求項２記載の発現カセット。
【請求項６】
核酸配列が、ヒト血清アルブミンをコードする請求項２記載の発現カセット。
【請求項７】
核酸配列が合成されたものである請求項２記載の発現カセット。
【請求項８】
核酸配列が医学的に活性な蛋白質の一部をコードする請求項２記載の発現カセット。
【請求項９】
レポーター遺伝子が抗体をコードする請求項２記載の発現カセット。
【請求項１０】
植物またはその引き続いての世代が、少なくとも１つの請求項２記載の発現カセットを含む形質転換された植物。
【請求項１１】
該植物がＢｒａｓｓｉｃａまたはＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａである請求項１０記載の形質転換された植物。
【請求項１２】
該植物がＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ種子である請求項１０記載の形質転換された植物。
【請求項１３】
該種子が少なくとも１つの請求項２記載の発現カセットを含む請求項１０記載の形質転換された植物の種子。
【請求項１４】
該種子がＢｒａｓｓｉｃａまたはＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ種子である請求項１３記載の種子。
【請求項１５】
トランスジェニック実生が少なくとも１つの請求項２記載の発現カセットを含む請求項１３記載の発芽した種子の形質転換された実生。
【請求項１６】
該実生がＢｒａｓｓｉｃａまたはＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ実生である請求項１６記載のトランスジェニック実生。
【請求項１７】
該実生がＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ実生である請求項１６記載のトランスジェニック実生。
【請求項１８】
請求項１記載のＲｕｂｉｓｃｏプロモーターファミリーのＲｕｂｉｓｃｏプロモーターを生成するための方法であって、光成長した実生における発現を評価し、最も高度に発現された遺伝子を同定し、子葉を成長させることに遺伝子発現を向ける能力を有するプロモーターを該遺伝子から選択する工程を含む該方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公表番号】特表２００７−５２０１９６（Ｐ２００７−５２０１９６Ａ）
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１６２３９（Ｐ２００６−５１６２３９）
【出願日】平成１６年７月５日（２００４．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００４／０００４２６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３６０
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０２２００９３３）ユニクロップ・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＣＲＯＰ ＬＴＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月５日（２００４．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００４／０００４２６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３６０
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０２２００９３３）ユニクロップ・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＣＲＯＰ ＬＴＤ
【Ｆターム（参考）】
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