新規クローディン結合分子およびその利用
【課題】クローディン１指向性を有する新規クローディン結合分子を提供する。また、当該クローディン結合分子を利用する薬物送達システム、粘膜吸収促進剤、ウイルス性疾患治療剤、癌治療剤を提供する。
【解決手段】以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質からなるクローディン結合分子は、クローディン１およびクローディン４に対して結合性を有している。
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列の第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
【解決手段】以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質からなるクローディン結合分子は、クローディン１およびクローディン４に対して結合性を有している。
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列の第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規クローディン結合分子およびその利用に関するものであり、詳細には、新規クローディン結合分子、および当該クローディン結合分子を含む薬物送達システム、粘膜吸収促進剤、ウイルス性疾患治療剤、癌治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞は生体内外および組織内外を隔てる障壁として恒常性維持における中心的な役割を担っている。隣接する上皮細胞間隙は密着結合によりシールされており、上皮細胞層における物質透過および細胞増殖等が厳密に制御されている。クローディンは密着結合の構造的、機能的本体として同定された分子量約２３ｋＤａの４回膜貫通タンパク質であり、２４種類の分子からなるファミリーを形成している。クローディンの発現およびバリア機能には組織特異性が認められており、クローディン１は、皮膚バリアを担っていること（非特許文献１）、大腸粘膜バリアを担っていること（非特許文献２）、大腸癌等で高発現していること（非特許文献３）、Ｃ型肝炎ウイルスの感染受容体であること（非特許文献４）などが報告されている。
【０００３】
本発明者らは、クローディン４への指向性を有するウエルシュ菌エンテロトキシンのＣ末端断片（以下「Ｃ−ＣＰＥ」という。）が、腸管、鼻、肺胞粘膜における薬物吸収促進活性を有することを見出し、粘膜吸収促進剤として利用できることを報告している（非特許文献５、特許文献１）。しかしながら、Ｃ−ＣＰＥにはクローディン１への指向性がないため、クローディン１を標的とした薬物送達システムに利用できず、クローディン１への指向性を有する新たなクローディン結合分子の創製が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００９／００５０００号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】M. Furuse, M. Hata, K. Furuse, Y. Yoshida, A. Haratake, Y. Sugitani, T. Noda, A. Kubo, S. Tsukita, Claudin-based tight junctions are crucial for the mammalian epidermal barrier: a lesson from claudin-1-deficient mice, J Cell Biol, 156 (2002) 1099-1111.
【非特許文献２】R. Mennigen, K. Nolte, E. Rijcken, M. Utech, B. Loeffler, N. Senninger, M. Bruewer, Probiotic mixture VSL#3 protects the epithelial barrier by maintaining tight junction protein expression and preventing apoptosis in a murine model of colitis, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 296 (2009) G1140-G1149.
【非特許文献３】S.L. Kominsky, Claudins: emerging targets for cancer therapy, Expert Rev Mol Med, 8 (2006) 1-11.
【非特許文献４】M.J. Evans, T. von Hahn, D.M. Tscherne, A.J. Syder, M. Panis, B. Wolk, T. Hatziioannou, J.A. McKeating, P.D. Bieniasz, C.M. Rice, Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry, Nature, 446 (2007) 801-805.
【非特許文献５】M. Kondoh, A. Masuyama, A. Takahashi, N. Asano, H. Mizuguchi, N. Koizumi, M. Fujii, T. Hayakawa, Y. Horiguchi, Y. Watanbe, A novel strategy for the enhancement of drug absorption using a claudin modulator, Mol Pharmacol, 67 (2005) 749-756.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、クローディン１指向性を有する新規クローディン結合分子を提供するとともに、当該クローディン結合分子を利用する薬物送達システム等の優れた用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質からなるクローディン結合分子。
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列の第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
［２］クローディンが、少なくともクローディン１およびクローディン４である前記［１］に記載のクローディン結合分子。
［３］毒性を発現しないことを特徴とする前記［１］または［２］に記載のクローディン結合分子。
［４］配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１位〜第５２位を欠失していることを特徴とする前記［３］に記載のクローディン結合分子。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のクローディン結合分子と薬物とを含むことを特徴とする薬物送達システム。
［６］薬物が、抗癌薬、抗ウイルス薬、炎症性腸疾患治療薬、肝疾患治療薬、腎疾患治療薬、脳疾患治療薬、心疾患治療薬、免疫抑制薬、アトピー性皮膚炎治療薬およびワクチンからなる群より選択されることを特徴とする前記［５］に記載の薬物送達システム。
［７］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のクローディン結合分子を含有する粘膜吸収促進剤。
［８］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のクローディン結合分子および抗ウイルス薬を含有するウイルス性疾患治療剤。
［９］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のクローディン結合分子または以下の（Ｃ）もしくは（Ｄ）のタンパク質からなるクローディン結合分子および抗癌薬を含有する癌治療剤。
（Ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｄ）（Ｃ）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、クローディン１および４に指向性を有するクローディン結合分子を提供することができる。本発明のクローディン結合分子を利用すれば、クローディン１またはクローディン４が発現している部位を標的とする薬物送達システムを提供することができる。また、クローディン１またはクローディン４が発現している粘膜を標的とする粘膜吸収促進剤、クローディン１またはクローディン４が発現している細胞に感染するウイルスを標的とするウイルス性疾患治療剤、クローディン１またはクローディン４が発現している癌細胞を標的とする癌治療剤等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｃ−ＣＰＥ変異体ファージライブラリから取得したクローディン１結合性ファージクローンおよびその変異箇所のアミノ酸を示す図である。
【図２】Ｃ−ＣＰＥ変異体１９およびＣ−ＣＰＥ変異体８６のクローディン１結合性を解析した結果を示す図である。
【図３】クローディン１発現Ｌ細胞に対するＣ−ＣＰＥ変異体１９−ＰＳＩＦ、Ｃ−ＣＰＥ変異体８６−ＰＳＩＦおよびＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの細胞毒性を観察した結果を示す図である。
【図４】（Ａ）は、クローディン１発現Ｌ細胞とＣ−ＣＰＥまたはＣ−ＣＰＥ変異体１９をプレインキュベーションした後にＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはＣ−ＣＰＥ変異体１９−ＰＳＩＦを添加して細胞毒性を観察した結果を示す図であり、（Ｂ）は、クローディン１発現Ｌ細胞とＣ−ＣＰＥまたはＣ−ＣＰＥ変異体８６をプレインキュベーションした後にＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはＣ−ＣＰＥ変異体８６−ＰＳＩＦを添加して細胞毒性を観察した結果を示す図である。
【図５】Ｃ−ＣＰＥ、Ｃ−ＣＰＥ変異体１９またはＣ−ＣＰＥ変異体８６の、野生型バキュロウイルス、クローディン１発現バキュロウイルスまたはクローディン４発現バキュロウイルスに対する結合性を解析した結果を示す図である。
【図６】ヒト腸管モデル細胞系であるＣａｃｏ−２細胞の単層膜培養系を用いて、Ｃ−ＣＰＥ変異体１９の粘膜バリア制御活性を解析した結果を示す図である。
【図７】ラット腸管ループ法を用いて、Ｃ−ＣＰＥ変異体１９のデキストラン（分子量４０００）吸収促進活性を解析した結果を示す図である。
【図８】Ｃ−ＣＰＥ三置換体（Ｓ３０５Ｐ、Ｓ３０７Ｒ、Ｓ３０７Ｈ）の、野生型バキュロウイルスまたはクローディン１発現バキュロウイルスに対する結合性を解析した結果を示す図である。
【図９】クローディン１発現Ｌ細胞に対するＣ−ＣＰＥ三置換体（Ｓ３０５Ｐ、Ｓ３０７Ｒ、Ｓ３０７Ｈ）の細胞毒性を観察した結果を示す図である。
【図１０】クローディン４発現Ｂ１６メラノーマ細胞の皮下移植により形成された腫瘍に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性を解析した結果を示す図である。
【図１１】クローディン４発現Ｂ１６メラノーマ細胞の尾静脈投与により肺に転移した癌に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性を解析した結果を示す図である。
【図１２】マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞の皮下移植により形成された腫瘍に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性を解析した結果を示す図である。
【図１３】マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞の皮下移植後、肺に自然転移した細胞に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性を解析した結果を示す図である。
【図１４】マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞の皮下移植により形成された腫瘍に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性をドキソルビシンの抗癌活性と比較した結果を示す図である。
【図１５】マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞の皮下移植後、肺に自然転移した細胞に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性をドキソルビシンの抗癌活性と比較した結果を示す図である。
【図１６】Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを投与したマウスとドキソルビシンを投与したマウスの体重の変化を比較した図である。
【図１７】Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを投与したマウスのＡＳＴおよびＡＬＴを測定した結果を示す図である。
【図１８】Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを投与したマウスのＢＵＮを測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔クローディン結合分子〕
ウエルシュ菌（学名：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）は、クロストリジウム属に属する嫌気性桿菌である。ヒトや動物の腸内細菌叢の構成菌であり、下水、河川、海、耕地などの土壌に広く分布する。ウエルシュ菌エンテロトキシン（以下「ＣＰＥ」という。）はウエルシュ菌が産生する毒素の１つであり、感染性食中毒の原因となる。ＣＰＥは、細胞のタイトジャンクション構成タンパク質であるクローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）ファミリーのクローディン３、４、６、７、８および１４と結合することが知られている（Fujita, K. et al., (2000) FEBS Letters 476, 258-261.）。ＣＰＥは配列番号２で表わされる３１９アミノ酸からなるタンパク質であり、これをコードする遺伝子は配列番号３で表わされる塩基配列を有する。ＣＰＥをコードする遺伝子（配列番号３）は、アクセッション番号：Ｍ９８０３７として公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている。
本発明者らは、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＰＥのＣ末端断片において、第３０５位のセリンがプロリンに、第３０７位のセリンがアルギニンに、第３１３位のセリンがヒスチジンにそれぞれ置換された三置換変異体が、ＣＰＥが本来有しているクローディン４結合性を維持しつつ、クローディン１結合性を獲得していることを見出した。
【００１１】
本発明のクローディン結合分子は、以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質からなるものであればよい。
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列の第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
配列番号１で表わされるアミノ酸配列は、ＣＰＥのアミノ酸配列（配列番号２）において、第３０５位のセリンがプロリンに、第３０７位のセリンがアルギニンに、第３１３位のセリンがヒスチジンにそれぞれ置換されたＣＰＥ三置換変異体のアミノ酸配列である。
【００１２】
本発明のクローディン結合分子は、換言すれば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＣＰＥ三置換変異体のＣ末端断片である。本発明のクローディン結合分子は、少なくともクローディン１およびクローディン４に対する結合性を有していることが好ましい。もちろん、ＣＰＥが本来有している他のクローディン（３、６、７、８および１４）に対する結合性が維持されていてもよいことは言うまでもなく、これら以外のクローディン結合性を獲得しているものでもよい。
ＣＰＥ三置換変異体のＣ末端断片（以下「Ｃ−ＣＰＥ三置換体」という。）は、ＣＰＥをコードする遺伝子（配列番号３）に基づいて、公知の変異導入法および公知の遺伝子組換え技術により、ＣＰＥ三置換変異体のＣ末端断片をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、これを適当な宿主に導入して発現させた組換えタンパク質を回収、精製して取得することができる。取得した組換えタンパク質（Ｃ−ＣＰＥ三置換体）がクローディン結合性を有することは、例えば、クローディンを発現する細胞に結合することを公知の方法で確認すればよい。
【００１３】
本発明のクローディン結合分子は、毒性を発現しないことが好ましい。毒性を発現しないとは、ＣＰＥが有する細胞毒性が消滅していることを意味する。ＣＰＥの毒性は、ＣＰＥのＮ末端側のアミノ酸領域に支配されていることが知られており、ＣＰＥのＮ末端から第４４位までのアミノ酸が欠失したＣ−ＣＰＥ（４５−３１９）は毒性を発現するが、Ｎ末端から第５２位までのアミノ酸が欠失したＣ−ＣＰＥ（５３−３１９）は毒性を発現しないことが報告されている（Kokai-Kun, J.F., et al. (1997) Clin. Infect. Dis. 25, Suppl. 2, 165-167.）。したがって、少なくとも配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第１位〜第５２位までのアミノ酸が欠失したＣ−ＣＰＥ三置換体とすることで、毒性を発現しないＣ−ＣＰＥ三置換体を取得することができる。また、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第５２位より前の領域を有するＣ−ＣＰＥ三置換体であっても、第４５位〜第５２位の領域に置換、欠失、挿入、修飾等の変異を誘導することにより、毒性を発現しないＣ−ＣＰＥ三置換体を取得することも可能である。
【００１４】
本発明のクローディン結合分子は、クローディン結合性を有する限り、第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、変異を有するものでもよい。したがって、本発明のクローディン結合分子には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質の第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質が含まれる。
【００１５】
ここで「１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００１６】
本発明のクローディン結合分子の大きさ（アミノ酸残基数）は特に限定されないが、抗原性の点から小さいことが好ましい。好ましくは１４０アミノ酸以下、より好ましくは１００アミノ酸以下、さらに好ましくは４０アミノ酸以下、特に好ましくは３０アミノ酸以下である。
【００１７】
〔薬物送達システム〕
本発明の薬物送達システムは、上記本発明のクローディン結合分子と薬物とを含むものであればよい。本発明のクローディン結合分子は、クローディン１およびクローディン４への指向性を有しているので、本発明のクローディン結合分子を利用することにより、クローディン１またはクローディン４が発現している臓器や組織へ目的の薬物を送達するための優れた薬物送達システムを提供することができる。
【００１８】
本発明の薬物送達システムは、クローディン結合分子と薬物とが一体化していない混合組成物の形態とすることも可能であるが、クローディン結合分子と薬物とが何らかの相互作用により一体化した形態とすることが好ましい。一体化のための手段は特に限定されないが、例えば、薬物を封入したリポソームとクローディン結合分子の結合体、薬物を担持したナノマテリアルとクローディン結合分子の結合体などの形態が挙げられる。また、薬物がタンパク質である場合は、薬物とクローディン結合分子との融合タンパク質が好適である。
【００１９】
薬物を封入したリポソームとクローディン結合分子の結合体は、ペプチド、タンパク質、核酸、低分子化合物などの薬物を封入したリポソーム膜表面にクローディン結合分子を結合させたものであればよく、薬物の種類、リポソームの脂質組成やサイズ、およびクローディン結合分子との結合方法は特に限定されない。リポソームは、例えば、ホスファチジルコリン、コレステロール、ポリエチレングリコール結合脂質などを原料として公知の方法で作製することができる。また、クローディン結合分子との結合用に脂質末端カルボキシル基もしくはマレイミド基を有する脂質を使用することが好ましい。リポソーム内への薬物の封入は公知の凍結融解法、逆相蒸発法、水和法などにより行うことができる。作製した薬物内封リポソームにクローディン結合分子を加え、ペプチド縮合反応もしくはＳＨ基反応系によりリポソームとクローディン結合分子との結合体を作製することができる。
【００２０】
薬物を担持したナノマテリアルとクローディン結合分子との結合体は、特に限定されず、適当なナノマテリアルに薬物を担持させ、クローディン結合分子とさせればよい。例えば、公知の各種末端修飾ポリマーとクローディン結合分子のリジン、システインとの結合体を用いた自己組織化ナノマテリアルなどが挙げられる。
【００２１】
タンパク性薬物とクローディン結合分子との融合タンパク質は、公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。例えば、クローディン結合分子をコードする遺伝子と薬物をコードする遺伝子とを人工的に連結した融合遺伝子（ハイブリッド遺伝子）を作製し、当該融合遺伝子を、発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより取得することができる。融合タンパク質において、クローディン結合分子と薬物との結合順序は限定されず、Ｎ末端が薬物でＣ末端側がクローディン結合分子としてもよく、逆にＮ末端がクローディン結合分子でＣ末端側が薬物としてもよい。
【００２２】
本発明の薬物送達システムの標的部位は、本発明のクローディン結合分子が結合可能なクローディンが発現している臓器または組織であれば限定されない。好ましくは、クローディン１またはクローディン４が発現している臓器または組織である。具体的には、例えば、腸管粘膜組織（クローディン１および４が発現）、皮膚（クローディン１および４が発現）、肝臓（クローディン１および４が発現）、腎臓（クローディン１および４が発現）、脳（クローディン１が発現）、脾臓（クローディン１が発現）、心臓（クローディン１が発現）、癌細胞（クローディン１または４が発現）、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞（クローディン１がＣ型肝炎ウイルスの感染受容体）などが挙げられる。
【００２３】
本発明の薬物送達システムにおいて用いられる薬物は、上記標的部位に送達することが好ましい薬物であれば特に限定されない。具体的には、例えば、抗癌薬、抗ウイルス薬、炎症性腸疾患治療薬、肝疾患治療薬、腎疾患治療薬、脳疾患治療薬、心疾患治療薬、免疫抑制薬、アトピー性皮膚炎治療薬、ワクチンなどが挙げられる。
【００２４】
〔粘膜吸収促進剤〕
本発明は、上記クローディン結合分子を含有する粘膜吸収促進剤を提供する。本発明者らは、変異を有しないＣ−ＣＰＥが腸管、鼻、肺胞粘膜における薬物吸収促進活性を有することを報告しているが（非特許文献５）、本発明のクローディン結合分子は、変異を有しないＣ−ＣＰＥと比較して２倍以上の粘膜バリア低下作用および粘膜吸収促進活性を有することが実験的に確認されていることから（実施例参照）、顕著に優れた粘膜吸収促進剤を提供することができる。
【００２５】
〔ウイルス性疾患治療剤〕
本発明は、上記クローディン結合分子および抗ウイルス薬を含有するウイルス性疾患治療剤を提供する。治療対象のウイルス性疾患としては、クローディン１またはクローディン４が発現している細胞に感染するウイルスが原因となるウイルス性疾患が好ましい。特に好ましくはＣ型肝炎である。Ｃ型肝炎ウイルスは、クローディン１を感染受容体としていることが報告されている（非特許文献４）こと、本発明のクローディン結合分子はウイルス変異の影響を受けず、副作用が低いと予想されることから、未だ有効な治療法が存在しないＣ型肝炎ウイルスの高ウイルス量患者の治療薬として優れた効果を発揮することが期待される。
本発明のウイルス性疾患治療剤は、上述のように、抗ウイルス薬をリポソームに封入してクローディン結合分子と結合させる形態、抗ウイルス薬を担持したナノマテリアルをクローディン結合分子と結合させる形態、タンパク性抗ウイルス薬とクローディン結合分子との融合タンパク質とする形態が好ましい。
【００２６】
〔癌治療剤〕
本発明は、上記クローディン結合分子および抗癌薬を含有する癌治療剤を提供する。本発明の癌治療剤は、上記本発明のクローディン結合分子の代わりに変異を有しないＣ−ＣＰＥを用いてもよい。変異を有しないＣ−ＣＰＥとしては、以下の（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質を好適に用いることができる。
（Ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｄ）（Ｃ）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
【００２７】
本発明の癌治療剤の対象となる癌種は、クローディン１、３、４、６、７、８、１４が発現している癌であれば特に限定されない。好ましくはクローディン１または４が発現している癌である。具体的には、例えば、胃癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、大腸癌、肝癌等の上皮由来の癌が挙げられる。
【００２８】
本発明の癌治療剤に使用する抗癌薬は特に限定されない。既に臨床応用されている抗癌薬は、いずれも好適に使用することができる。具体的には、例えば、ジフテリアトキシン、緑膿菌エキソトキシン等のタンパク質性分子、タキソール、ドキソルビシン等の抗がん活性低分子などが挙げられる。
本発明の癌治療剤は、上述のように、抗癌薬をリポソームに封入してクローディン結合分子と結合させる形態、抗癌薬を担持したナノマテリアルをクローディン結合分子と結合させる形態、タンパク性抗癌薬とクローディン結合分子との融合タンパク質とする形態が好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実験方法において特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), "Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition)", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) や、F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore,J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Ltd. などの、当該技術分野における標準的なプロトコール集に記載の方法、またはそれらを改変した方法を用いた。また、市販の試薬キットや装置は、それらに添付のプロトコールや取扱説明書に従って使用した。
【００３０】
〔実施例１：Ｃ−ＣＰＥ変異体の活性検討〕
１−１ 実験方法
（１）Ｃ−ＣＰＥ変異体ファージライブラリの作製
Ｃ−ＣＰＥ（配列番号２の第１８４位〜第３１９位）をコードする遺伝子をｐＥＴ−１６ｂに挿入したｐＥＴ−Ｈ１０ＰＥＲ（J Cell Biol, 136, 1239-1247, 1997）を鋳型とし、Ｃ末端側６箇所（Ｓ３０４／Ｓ３０５／Ｓ３０７／Ｎ３０９／Ｓ３１３／Ｋ３１８）をＮＮＳ配列に置換したプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をファージミドに挿入し大腸菌ＴＧ１に導入した。この大腸菌にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加後、３７℃、３０分静置し、さらに３７℃、３０分振とう培養した。その後３０００×ｇで１０分間遠心分離して大腸菌を回収し、抗生物質含有培地中３７℃で振とう培養し、上清にＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液を添加後遠心操作によりファージを沈澱させた。この沈澱の懸濁液をＣ−ＣＰＥ変異体ライブラリとして使用した。
【００３１】
（２）クローディン１結合性ファージのスクリーニング
クローディン発現出芽バキュロウイルス（ＢＶ）は、Ｓａｅｋｉら（R. Saeki, et al., A novel tumor-targeted therapy using a claudin-4-targeting molecule, Mol Pharmacol, 76 (2009) 918-926.）に記載の方法に準じてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen社）を用いて作製した。クローディン１発現出芽バキュロウイルス（クローディン１ＢＶ）をイムノチューブに添加し、４℃で一晩静置することで固相化し、これにＣ−ＣＰＥ変異体ライブラリを添加した。イムノチューブをＰＢＳＴ（0.05% tween20含有PBS）およびＰＢＳでそれぞれ１５回ずつ洗浄し、１００ｍＭ ＨＣｌ １００μＬを添加して、４℃で１０分間作用させることでクローディン１ＢＶに結合しているファージを解離させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０μＬを加えてＨＣｌを中和し、ファージ溶液を回収した。ファージ溶液を大腸菌ＴＧ１に感染させ培養した。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加後、３７℃、３０分静置し、さらに３７℃、３０分振とう培養した。その後３０００×ｇで１０分間遠心分離して大腸菌を回収し、抗生物質含有培地中３７℃で振とう培養し、上清にＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液を添加後遠心操作によりファージを沈澱させた。この操作を繰り返すことにより、クローディン１結合性を有するＣ−ＣＰＥ変異体ファージをスクリーニングした。得られたファージクローンから、ファージミドを回収し、シークエンスを解析した。
【００３２】
（３）Ｃ−ＣＰＥ変異体の発現
目的のＣ−ＣＰＥ変異体がコードされているファージミドを鋳型としてＰＣＲによりＣ−ＣＰＥ変異体をコードするＤＮＡを増幅後、ｐＥＴ−１６ｂに挿入し、Ｃ−ＣＰＥ変異体発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターを大腸菌株ＢＬ２１に導入し、アンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。ＩＰＴＧ添加により融合タンパク質を発現誘導させた後、遠心分離により集菌し、菌体を超音波処理により破砕し、１５０００ｒｐｍの遠心分離後上清を回収した。回収した大腸菌溶解液をあらかじめ６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ／ＥＤＴＡ、ＭｉｌｌｉＱ、０．１Ｍ ＮｉＳＯ４、ｂｕｆｆｅｒＡ（10mM Tris-HCl (pH8.0)、400mM NaCl、5mM MgCl2、0.1mM phenylmethane sulfonyl fluoride、1mM 2-mercaptoethanol、10% glycerol）により平衡化しておいたＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加し、低濃度のイミダゾール溶液でカラムを洗浄後、高濃度のイミダゾール溶液で吸着したＣ−ＣＰＥ変異体を溶出した。溶出液をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加して、溶媒をＰＢＳバッファーに置換し、各種実験に使用した。
【００３３】
（４）Ｃ−ＣＰＥ変異体のクローディン結合性解析
９６ｗｅｌｌＥＬＩＳＡプレート（Greiner Bio-One GmbH、Germany）に０．５μｇ／５０μＬ ＴＢＳ／ｗｅｌｌで、野生型（ＷＴ）ＢＶ、クローディン１ＢＶ、クローディン４ＢＶを４℃で一晩静置することで固相化した。翌日、ＢＶをＰＢＳで３回洗浄し、１．６％ブロックエース（DS PHARMA BIOMEDICAL、Japan）を用いて室温で２時間ブロッキング後、Ｃ−ＣＰＥ変異体を０．２μｇ／ｗｅｌｌ添加した。一次抗体に抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Zymed Laboratories Inc., Co、USA）、二次抗体にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用い、ＴＭＢ試薬（Thermo Scientific, Rockford、IL）添加に伴う発色を波長４５０ｎｍの吸光度として測定し、Ｃ−ＣＰＥ変異体と各種ＢＶとの結合を解析した。
【００３４】
（５）Ｃ−ＣＰＥ変異体−ＰＳＩＦ融合タンパク質の作製
目的のＣ−ＣＰＥ変異体がコードされているファージミドを鋳型としてＰＣＲによりＣ−ＣＰＥ変異体をコードするＤＮＡを増幅後、ｐＥＴ−ＰＳＩＦ（ｐＥＴ１６ｂに緑膿菌エキソトキシン由来のタンパク質合成阻害因子（ＰＳＩＦ）をコードするＤＮＡを挿入したベクター、上記Ｓａｅｋｉら参照）に挿入し、Ｃ−ＣＰＥ変異体−ＰＳＩＦ融合タンパク質発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターを大腸菌株ＢＬ２１に導入し、アンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。ＩＰＴＧ添加により融合タンパク質を発現誘導させた後、遠心分離により集菌し、菌体を超音波処理により破砕し、１５０００ｒｐｍの遠心分離後上清を回収した。回収した大腸菌溶解液をあらかじめ６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ／ＥＤＴＡ、ＭｉｌｌｉＱ、０．１Ｍ ＮｉＳＯ４、ｂｕｆｆｅｒＡにより平衡化しておいたＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加し、低濃度のイミダゾール溶液でカラムを洗浄後、高濃度のイミダゾール溶液で吸着したＣ−ＣＰＥ変異体−ＰＳＩＦ融合タンパク質を溶出した。溶出液をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加して、溶媒をＰＢＳバッファーに置換した。
【００３５】
（６）Ｃ−ＣＰＥ変異体のクローディン１リガンド活性解析
マウス繊維芽細胞（Ｌ細胞）またはクローディン１安定発現Ｌ細胞を９６ｗｅｌｌプレート（FALCON）に播種し、一晩培養後Ｃ−ＣＰＥ変異体−ＰＳＩＦ融合タンパク質等を添加し、４８時間後にＷＳＴ−８試薬（NACALAI TESQUE, Inc., Kyoto）により細胞生存率を測定した。
また、拮抗阻害実験では、クローディン１安定発現Ｌ細胞を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、一晩培養後Ｃ−ＣＰＥまたはＣ−ＣＰＥ変異体を添加し、添加から３時間後にＣ−ＣＰＥ変異体−ＰＳＩＦ融合タンパク質を加え、４８時間後にＷＳＴ−８試薬により生細胞数率を測定した。
【００３６】
（７）Ｃ−ＣＰＥ変異体の粘膜バリア制御活性解析
ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ腸管上皮分化エンバイロメント（BD Biosciences, USA.）を用い、ヒト腸管モデル細胞であるＣａｃｏ−２細胞１×１０５個／５００μＬ／ｗｅｌｌをａｐｉｃａｌ側に、Ｓｅｅｄｉｎｇ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ １ｍＬをｂａｓａｌ側に添加した。２４時間培養後、培地をＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに交換し、７２時間さらに培養した。その後、ａｐｉｃａｌ側を無血清Ｓｅｅｄｉｎｇ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ ５００μＬ、ｂａｓａｌ側をＨＥＰＥＳバッファー（155mM NaCl, 3mM KCl, 2mM CaCl2, 3mM NaH2PO4, 5mM HEPES, 1%BSA, 10mM Glucose(pH7.4)）１ｍＬに置換した。２４時間後、ｂａｓａｌ側から１００μＬずつバッファーを抜き取りＣ−ＣＰＥまたはＣ−ＣＰＥ変異体１９を最終濃度２５または５０μｇ／ｗｅｌｌとなるように添加した。薬液添加後、１２および１８時間後に経上皮電気抵抗（ＴＥＲ：transepithelial electric resistance）を測定した。１８時間後のＴＥＲ測定後、Ｓｅｅｄｉｎｇ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍによって洗浄し、薬液を除去した。薬液洗浄２４時間後ＴＥＲを測定した。なお、ＴＥＲ測定にはＭｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ（Millipore Corp., USA）を用い、０時間のＴＥＲを基準として相対的な値として算出した。
【００３７】
（８）Ｃ−ＣＰＥ変異体の腸管粘膜吸収促進活性解析
モデル薬物として蛍光標識された分子量４０００のデキストラン（ＦＤ−４、Sigma-Aldrich）を使用した。なお、ＦＤ−４は最終濃度４０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。Ｗｉｓｒａｒ系雄性ラットにチアミラールナトリウム（イソゾール注射液（商品名））を腹腔内投与し麻酔下で背位に固定し、頸静脈を確保した。空腸の総胆管開口部の下とそこから約５ｃｍ下部を縫合糸で緩く縛り、作製したループの両端にはさみで切り込みを入れた。切り込みからｐＨ６．５のＰＢＳを５０ｍＬ注入し腸管腔内を洗浄した後、空気を送り余分なＰＢＳを除いた。下端をきつく縛りＦＤ−４とＣ−ＣＰＥとの混合液を２００μＬ投与後、上端を結紮し、腸管を腹腔におさめ、一定時間毎に頸静脈より約３５０μＬずつ採血した。血液は１２０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離を行い、血漿を分取し測定試料とした。分取した血漿５０μＬをｐＨ６．５のＰＢＳ２００μＬにて希釈した後、蛍光強度を測定した（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３８ｎｍ）。得られた血漿中ＦＤ−４濃度−時間曲線より台形則にて、試液投与後０時間から６時間目までの血中濃度下面積（ＡＵＣ）を算出した。
【００３８】
１−２ 実験結果
（１）クローディン１結合性ファージクローンの取得
Ｃ−ＣＰＥのＣ末端側６箇所（Ｓ３０４／Ｓ３０５／Ｓ３０７／Ｎ３０９／Ｓ３１３／Ｋ３１８）をランダムなアミノ酸に変異させたＣ−ＣＰＥ変異体を提示したファージライブラリを作製し、本ライブラリを用いてクローディン１ＢＶに結合性を示すファージクローンを複数取得した。取得したファージクローンおよびその変異箇所のアミノ酸を図１に示した。
【００３９】
（２）クローディン１結合分子の取得
クローディン１結合性ファージクローンのシークエンスデータに基づいて、組換えＣ−ＣＰＥ変異体を作製し、クローディンＢＶを用いてクローディン１結合性を解析した。図２に示したように、Ｃ−ＣＰＥ変異体１９（以下「変異体１９」という。）およびＣ−ＣＰＥ変異体８６（以下「変異体８６」という。）は野生型ＢＶに結合性を示さずクローディン１ＢＶに特異的に結合した。この結果から、変異体１９および変異体８６はクローディン１結合分子であることが明らかとなった。
【００４０】
（３）クローディン１リガンド特性の解析
変異体１９および変異体８６のクローディン１リガンド特性を解析するために、緑膿菌エキソトキシン由来のタンパク質合成阻害因子（ＰＳＩＦ）との融合タンパク質を作製した。変異体１９−ＰＳＩＦ、変異体８６−ＰＳＩＦまたはＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦをクローディン１発現Ｌ細胞に添加して細胞毒性を観察した。結果を図３に示した。図３から明らかなように、変異体１９−ＰＳＩＦ、変異体８６−ＰＳＩＦを添加した場合に添加濃度依存的な細胞毒性が観察された。
拮抗阻害実験の結果を図４（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は変異体１９−ＰＳＩＦの結果であり、（Ｂ）は変異体８６−ＰＳＩＦの結果である。図４（Ａ）および（Ｂ）から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥの前処理では変異体１９−ＰＳＩＦおよび変異体８６−ＰＳＩＦの細胞毒性が抑制されなかったのに対して、変異体１９−ＰＳＩＦまたは変異体８６−ＰＳＩＦの前処理ではいずれも濃度依存的な細胞毒性の抑制が観察された。これらの結果から、変異体１９および変異体８６はクローディン１リガンドとして応用できることが明らかとなった。
【００４１】
（４）クローディン１結合性の解析
野生型ＢＶ、クローディン１ＢＶ、クローディン４ＢＶに対する結合性を解析した結果を図５に示した。図５から明らかなように、変異体１９および変異体８６はいずれもクローディン１結合性のみならずクローディン４結合性を有していた。この結果から、変異体１９および変異体８６はクローディン１およびクローディン４結合性分子であることが示された。
【００４２】
（５）変異体１９の粘膜バリア制御活性解析
ヒト腸管モデル細胞系であるＣａｃｏ−２細胞の単層膜培養系を用いて、変異体１９の粘膜バリア制御活性を解析した結果を図６に示した。図６から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥまたは変異体１９の添加により、添加濃度依存的な粘膜バリア低下作用が観察された。また、変異体１９の粘膜バリア低下作用はＣ−ＣＰＥの約２倍の値を示した。
【００４３】
（６）変異体１９の腸管粘膜吸収促進活性解析
薬物の粘膜吸収測定系であるラット腸管ループ法を用いて、変異体１９のデキストラン（分子量４０００）吸収促進活性を解析した結果を図７に示した。図７から明らかなように、変異体１９はＣ−ＣＰＥと比較して約２倍の粘膜吸収促進活性を有していた。Ｃ−ＣＰＥはペプチド性医薬品の腸管・鼻・肺胞粘膜吸収促進活性を有していることから、変異体１９は経口・経鼻・経肺吸収促進技術への応用が期待される。
【００４４】
（７）クローディン１結合配列の同定
変異体１９、変異体８６の他に変異体３６もクローディン１特異的な結合性を有していた。これら３種類の変異体に共通のアミノ酸変異はＳｅｒ３０５Ｐｒｏ、Ｓｅｒ３０７Ａｒｇ、Ｓｅｒ３１３Ｈｉｓの３か所であることから（図１参照）、これら３か所のみが変異したＣ−ＣＰＥ三置換体を作製し、野生型ＢＶおよびクローディン１ＢＶを用いて結合性を解析した。結果を図８に示した。図８から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ三置換体は変異体１９と同程度のクローディン１結合性を有していた。
さらに、Ｃ−ＣＰＥ三置換体とＰＳＩＦとの融合タンパク質を作製し、クローディン１発現Ｌ細胞に対する細胞毒性を解析した。結果を図９に示した。図９から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ三置換体−ＰＳＩＦは濃度依存的な細胞毒性を示した。
これらの結果から、第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニン、第３１３位のヒスチジンを有するＣ−ＣＰＥの変異体は、クローディン１リガンドとして機能することが明らかとなった。
【００４５】
〔実施例２：Ｃ−ＣＰＥを利用した癌治療剤〕
２−１ 実験方法
（１）Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦおよびＰＳＩＦの作製
ｐＥＴ１６ｂにＣ−ＣＰＥ（配列番号２の第１８４位〜第３１９位）をコードする遺伝子およびその下流に緑膿菌エキソトキシン由来のタンパク質合成阻害因子（ＰＳＩＦ）をコードするＤＮＡを挿入したｐＥＴ−Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦ、ならびに、ｐＥＴ１６ｂにＰＳＩＦをコードするＤＮＡを挿入したｐＥＴ−ＰＳＩＦを使用した。
ｐＥＴ−Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはｐＥＴ−ＰＳＩＦを大腸菌株ＢＬ２１に導入し、アンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。ＩＰＴＧ添加により融合タンパク質を発現誘導させた後、遠心分離により集菌し、菌体を超音波処理により破砕し、１５０００ｒｐｍの遠心分離後上清を回収した。回収した大腸菌溶解液をあらかじめ６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ／ＥＤＴＡ、ＭｉｌｌｉＱ、０．１Ｍ ＮｉＳＯ４、ｂｕｆｆｅｒＡ（10mM Tris-HCl (pH8.0)、400mM NaCl、5mM MgCl2、0.1mM phenylmethane sulfonyl fluoride、1mM 2-mercaptoethanol、10% glycerol）により平衡化しておいたＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加し、１００ｍＭのイミダゾール溶液でカラムを洗浄後、４００ｍＭのイミダゾール溶液で吸着したＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはＰＳＩＦを溶出した。溶出液をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加して、溶媒をＰＢＳバッファーに置換し、各種実験に使用した。
【００４６】
（２）クローディン４発現Ｂ１６細胞に対する抗癌活性解析
実験的肺転移モデルとして汎用されているＢ１６メラノーマ細胞にクローディン４発現プラスミドを導入し、クローディン４発現Ｂ１６細胞を作製した。
７週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下に、クローディン４発現Ｂ１６細胞（１×１０５個）を移植した。移植後週３回Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを静脈内投与し、経日的に腫瘍体積を計測した。腫瘍体積は以下の式により算出した。
腫瘍体積＝最小径×最大径×最大径／２
また、７週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈からクローディン４発現Ｂ１６細胞（１×１０５個）を投与し、投与後週３回Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを静脈内投与した。細胞投与１４日目に肺を回収し、顕微鏡下で肺に転移した細胞数（肺転移結節数）を計測した。
【００４７】
（３）マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞に対する抗癌活性解析
７−８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に、４Ｔ１細胞（１×１０５個）を移植した。移植後週３回Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはドキソルビシン（Ｄｏｘ）を静脈内投与し、経日的に腫瘍体積を計測した。腫瘍体積は上記の式により算出した。また、細胞移植３５日後に肺を回収し、顕微鏡下で肺転移した細胞数（肺転移結節数）を計測した。
【００４８】
（４）Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの安全性
７−８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはＰＳＩＦを週３回、２週間静脈内投与し、投与７２時間後に採血し、血中のＡＳＴ（aspartate aminotransferase）、ＡＬＴ（alanine aminotransferase）およびＢＵＮ（血中尿素窒素）を測定した。ＡＳＴおよびＡＬＴの測定にはトランスアミナーゼＣＩＩテストワコー（和光純薬）、ＢＵＮの測定には、尿素窒素Ｂテストワコー（和光純薬）を用いた。
【００４９】
２−２ 実験結果
（１）クローディン４発現Ｂ１６細胞に対する抗癌活性解析
皮下移植により形成された腫瘍に対する抗癌活性の解析結果を図１０に示した。図１０から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを５μｇ／ｋｇで週３回投与することにより、腫瘍体積の増加が有意に抑制された。
尾静脈投与により肺に転移した癌に対する抗癌活性の解析結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを５μｇ／ｋｇで週３回投与することにより、肺転移が有意に抑制された。
これらの結果から、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦがクローディン４を発現する癌の原発巣における退縮効果および転移抑制効果を有することが示された。
【００５０】
（２）マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞に対する抗癌活性解析
皮下移植により形成された腫瘍に対する抗癌活性の解析結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを５μｇ／ｋｇで週３回投与することにより、腫瘍体積の増加が有意に抑制された。
４Ｔ１細胞の皮下移植３５日目に、肺に自然転移した細胞数（肺転移結節数）を測定した結果を図１３に示した。図１３から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを２または５μｇ／ｋｇで週３回投与することにより、肺転移が有意に抑制された。
これらの結果から、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦは、原発巣における退縮効果および転移抑制効果を有することが示された。
【００５１】
（３）ドキソルビシン（Ｄｏｘ）との比較
Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗腫瘍活性を、代表的な抗癌性抗生物質であるドキソルビシン（Ｄｏｘ）と比較した。
４Ｔ１細胞の皮下移植により形成された腫瘍に対する抗癌活性の解析結果を図１４に示した。図１４から明らかなように、Ｄｏｘの２ｍｇ／ｋｇ投与はＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの５μｇ／ｋｇ投与より強い抗癌活性を有していた。
肺への自然転移に対する抗癌活性の解析結果を図１５に示した。図１５から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの５μｇ／ｋｇ投与はＤｏｘの４ｍｇ／ｋｇ投与と同等の転移抑制効果を有することが示された。
抗癌剤の副作用の指標である体重減少を解析した結果を図１６に示した。図１６から明らかなように、Ｄｏｘの２または４ｍｇ／ｋｇ投与では顕著な体重減少が観察されたが、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの５μｇ／ｋｇ投与では全く体重減少が観察されなかった。
【００５２】
（４）肝臓および腎臓に及ぼす影響
肝障害の指標であるＡＳＴおよびＡＬＴを測定した結果を図１７に示した。また、腎障害の指標であるＢＵＮを測定した結果を図１８に示した。いずれの結果においても、抗癌活性が認められたＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの５μｇ／ｋｇ投与では、測定値の上昇は認められなかった。
【００５３】
以上の結果から、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦは副作用を伴うことなく、原発巣癌および転移癌に対する抗癌活性を発揮することが明らかとなった。
【００５４】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規クローディン結合分子およびその利用に関するものであり、詳細には、新規クローディン結合分子、および当該クローディン結合分子を含む薬物送達システム、粘膜吸収促進剤、ウイルス性疾患治療剤、癌治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞は生体内外および組織内外を隔てる障壁として恒常性維持における中心的な役割を担っている。隣接する上皮細胞間隙は密着結合によりシールされており、上皮細胞層における物質透過および細胞増殖等が厳密に制御されている。クローディンは密着結合の構造的、機能的本体として同定された分子量約２３ｋＤａの４回膜貫通タンパク質であり、２４種類の分子からなるファミリーを形成している。クローディンの発現およびバリア機能には組織特異性が認められており、クローディン１は、皮膚バリアを担っていること（非特許文献１）、大腸粘膜バリアを担っていること（非特許文献２）、大腸癌等で高発現していること（非特許文献３）、Ｃ型肝炎ウイルスの感染受容体であること（非特許文献４）などが報告されている。
【０００３】
本発明者らは、クローディン４への指向性を有するウエルシュ菌エンテロトキシンのＣ末端断片（以下「Ｃ−ＣＰＥ」という。）が、腸管、鼻、肺胞粘膜における薬物吸収促進活性を有することを見出し、粘膜吸収促進剤として利用できることを報告している（非特許文献５、特許文献１）。しかしながら、Ｃ−ＣＰＥにはクローディン１への指向性がないため、クローディン１を標的とした薬物送達システムに利用できず、クローディン１への指向性を有する新たなクローディン結合分子の創製が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００９／００５０００号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】M. Furuse, M. Hata, K. Furuse, Y. Yoshida, A. Haratake, Y. Sugitani, T. Noda, A. Kubo, S. Tsukita, Claudin-based tight junctions are crucial for the mammalian epidermal barrier: a lesson from claudin-1-deficient mice, J Cell Biol, 156 (2002) 1099-1111.
【非特許文献２】R. Mennigen, K. Nolte, E. Rijcken, M. Utech, B. Loeffler, N. Senninger, M. Bruewer, Probiotic mixture VSL#3 protects the epithelial barrier by maintaining tight junction protein expression and preventing apoptosis in a murine model of colitis, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 296 (2009) G1140-G1149.
【非特許文献３】S.L. Kominsky, Claudins: emerging targets for cancer therapy, Expert Rev Mol Med, 8 (2006) 1-11.
【非特許文献４】M.J. Evans, T. von Hahn, D.M. Tscherne, A.J. Syder, M. Panis, B. Wolk, T. Hatziioannou, J.A. McKeating, P.D. Bieniasz, C.M. Rice, Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry, Nature, 446 (2007) 801-805.
【非特許文献５】M. Kondoh, A. Masuyama, A. Takahashi, N. Asano, H. Mizuguchi, N. Koizumi, M. Fujii, T. Hayakawa, Y. Horiguchi, Y. Watanbe, A novel strategy for the enhancement of drug absorption using a claudin modulator, Mol Pharmacol, 67 (2005) 749-756.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、クローディン１指向性を有する新規クローディン結合分子を提供するとともに、当該クローディン結合分子を利用する薬物送達システム等の優れた用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質からなるクローディン結合分子。
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列の第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
［２］クローディンが、少なくともクローディン１およびクローディン４である前記［１］に記載のクローディン結合分子。
［３］毒性を発現しないことを特徴とする前記［１］または［２］に記載のクローディン結合分子。
［４］配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１位〜第５２位を欠失していることを特徴とする前記［３］に記載のクローディン結合分子。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のクローディン結合分子と薬物とを含むことを特徴とする薬物送達システム。
［６］薬物が、抗癌薬、抗ウイルス薬、炎症性腸疾患治療薬、肝疾患治療薬、腎疾患治療薬、脳疾患治療薬、心疾患治療薬、免疫抑制薬、アトピー性皮膚炎治療薬およびワクチンからなる群より選択されることを特徴とする前記［５］に記載の薬物送達システム。
［７］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のクローディン結合分子を含有する粘膜吸収促進剤。
［８］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のクローディン結合分子および抗ウイルス薬を含有するウイルス性疾患治療剤。
［９］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のクローディン結合分子または以下の（Ｃ）もしくは（Ｄ）のタンパク質からなるクローディン結合分子および抗癌薬を含有する癌治療剤。
（Ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｄ）（Ｃ）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、クローディン１および４に指向性を有するクローディン結合分子を提供することができる。本発明のクローディン結合分子を利用すれば、クローディン１またはクローディン４が発現している部位を標的とする薬物送達システムを提供することができる。また、クローディン１またはクローディン４が発現している粘膜を標的とする粘膜吸収促進剤、クローディン１またはクローディン４が発現している細胞に感染するウイルスを標的とするウイルス性疾患治療剤、クローディン１またはクローディン４が発現している癌細胞を標的とする癌治療剤等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｃ−ＣＰＥ変異体ファージライブラリから取得したクローディン１結合性ファージクローンおよびその変異箇所のアミノ酸を示す図である。
【図２】Ｃ−ＣＰＥ変異体１９およびＣ−ＣＰＥ変異体８６のクローディン１結合性を解析した結果を示す図である。
【図３】クローディン１発現Ｌ細胞に対するＣ−ＣＰＥ変異体１９−ＰＳＩＦ、Ｃ−ＣＰＥ変異体８６−ＰＳＩＦおよびＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの細胞毒性を観察した結果を示す図である。
【図４】（Ａ）は、クローディン１発現Ｌ細胞とＣ−ＣＰＥまたはＣ−ＣＰＥ変異体１９をプレインキュベーションした後にＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはＣ−ＣＰＥ変異体１９−ＰＳＩＦを添加して細胞毒性を観察した結果を示す図であり、（Ｂ）は、クローディン１発現Ｌ細胞とＣ−ＣＰＥまたはＣ−ＣＰＥ変異体８６をプレインキュベーションした後にＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはＣ−ＣＰＥ変異体８６−ＰＳＩＦを添加して細胞毒性を観察した結果を示す図である。
【図５】Ｃ−ＣＰＥ、Ｃ−ＣＰＥ変異体１９またはＣ−ＣＰＥ変異体８６の、野生型バキュロウイルス、クローディン１発現バキュロウイルスまたはクローディン４発現バキュロウイルスに対する結合性を解析した結果を示す図である。
【図６】ヒト腸管モデル細胞系であるＣａｃｏ−２細胞の単層膜培養系を用いて、Ｃ−ＣＰＥ変異体１９の粘膜バリア制御活性を解析した結果を示す図である。
【図７】ラット腸管ループ法を用いて、Ｃ−ＣＰＥ変異体１９のデキストラン（分子量４０００）吸収促進活性を解析した結果を示す図である。
【図８】Ｃ−ＣＰＥ三置換体（Ｓ３０５Ｐ、Ｓ３０７Ｒ、Ｓ３０７Ｈ）の、野生型バキュロウイルスまたはクローディン１発現バキュロウイルスに対する結合性を解析した結果を示す図である。
【図９】クローディン１発現Ｌ細胞に対するＣ−ＣＰＥ三置換体（Ｓ３０５Ｐ、Ｓ３０７Ｒ、Ｓ３０７Ｈ）の細胞毒性を観察した結果を示す図である。
【図１０】クローディン４発現Ｂ１６メラノーマ細胞の皮下移植により形成された腫瘍に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性を解析した結果を示す図である。
【図１１】クローディン４発現Ｂ１６メラノーマ細胞の尾静脈投与により肺に転移した癌に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性を解析した結果を示す図である。
【図１２】マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞の皮下移植により形成された腫瘍に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性を解析した結果を示す図である。
【図１３】マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞の皮下移植後、肺に自然転移した細胞に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性を解析した結果を示す図である。
【図１４】マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞の皮下移植により形成された腫瘍に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性をドキソルビシンの抗癌活性と比較した結果を示す図である。
【図１５】マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞の皮下移植後、肺に自然転移した細胞に対するＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗癌活性をドキソルビシンの抗癌活性と比較した結果を示す図である。
【図１６】Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを投与したマウスとドキソルビシンを投与したマウスの体重の変化を比較した図である。
【図１７】Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを投与したマウスのＡＳＴおよびＡＬＴを測定した結果を示す図である。
【図１８】Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを投与したマウスのＢＵＮを測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔クローディン結合分子〕
ウエルシュ菌（学名：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）は、クロストリジウム属に属する嫌気性桿菌である。ヒトや動物の腸内細菌叢の構成菌であり、下水、河川、海、耕地などの土壌に広く分布する。ウエルシュ菌エンテロトキシン（以下「ＣＰＥ」という。）はウエルシュ菌が産生する毒素の１つであり、感染性食中毒の原因となる。ＣＰＥは、細胞のタイトジャンクション構成タンパク質であるクローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）ファミリーのクローディン３、４、６、７、８および１４と結合することが知られている（Fujita, K. et al., (2000) FEBS Letters 476, 258-261.）。ＣＰＥは配列番号２で表わされる３１９アミノ酸からなるタンパク質であり、これをコードする遺伝子は配列番号３で表わされる塩基配列を有する。ＣＰＥをコードする遺伝子（配列番号３）は、アクセッション番号：Ｍ９８０３７として公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている。
本発明者らは、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＰＥのＣ末端断片において、第３０５位のセリンがプロリンに、第３０７位のセリンがアルギニンに、第３１３位のセリンがヒスチジンにそれぞれ置換された三置換変異体が、ＣＰＥが本来有しているクローディン４結合性を維持しつつ、クローディン１結合性を獲得していることを見出した。
【００１１】
本発明のクローディン結合分子は、以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質からなるものであればよい。
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列の第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
配列番号１で表わされるアミノ酸配列は、ＣＰＥのアミノ酸配列（配列番号２）において、第３０５位のセリンがプロリンに、第３０７位のセリンがアルギニンに、第３１３位のセリンがヒスチジンにそれぞれ置換されたＣＰＥ三置換変異体のアミノ酸配列である。
【００１２】
本発明のクローディン結合分子は、換言すれば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＣＰＥ三置換変異体のＣ末端断片である。本発明のクローディン結合分子は、少なくともクローディン１およびクローディン４に対する結合性を有していることが好ましい。もちろん、ＣＰＥが本来有している他のクローディン（３、６、７、８および１４）に対する結合性が維持されていてもよいことは言うまでもなく、これら以外のクローディン結合性を獲得しているものでもよい。
ＣＰＥ三置換変異体のＣ末端断片（以下「Ｃ−ＣＰＥ三置換体」という。）は、ＣＰＥをコードする遺伝子（配列番号３）に基づいて、公知の変異導入法および公知の遺伝子組換え技術により、ＣＰＥ三置換変異体のＣ末端断片をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、これを適当な宿主に導入して発現させた組換えタンパク質を回収、精製して取得することができる。取得した組換えタンパク質（Ｃ−ＣＰＥ三置換体）がクローディン結合性を有することは、例えば、クローディンを発現する細胞に結合することを公知の方法で確認すればよい。
【００１３】
本発明のクローディン結合分子は、毒性を発現しないことが好ましい。毒性を発現しないとは、ＣＰＥが有する細胞毒性が消滅していることを意味する。ＣＰＥの毒性は、ＣＰＥのＮ末端側のアミノ酸領域に支配されていることが知られており、ＣＰＥのＮ末端から第４４位までのアミノ酸が欠失したＣ−ＣＰＥ（４５−３１９）は毒性を発現するが、Ｎ末端から第５２位までのアミノ酸が欠失したＣ−ＣＰＥ（５３−３１９）は毒性を発現しないことが報告されている（Kokai-Kun, J.F., et al. (1997) Clin. Infect. Dis. 25, Suppl. 2, 165-167.）。したがって、少なくとも配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第１位〜第５２位までのアミノ酸が欠失したＣ−ＣＰＥ三置換体とすることで、毒性を発現しないＣ−ＣＰＥ三置換体を取得することができる。また、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第５２位より前の領域を有するＣ−ＣＰＥ三置換体であっても、第４５位〜第５２位の領域に置換、欠失、挿入、修飾等の変異を誘導することにより、毒性を発現しないＣ−ＣＰＥ三置換体を取得することも可能である。
【００１４】
本発明のクローディン結合分子は、クローディン結合性を有する限り、第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、変異を有するものでもよい。したがって、本発明のクローディン結合分子には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質の第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質が含まれる。
【００１５】
ここで「１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００１６】
本発明のクローディン結合分子の大きさ（アミノ酸残基数）は特に限定されないが、抗原性の点から小さいことが好ましい。好ましくは１４０アミノ酸以下、より好ましくは１００アミノ酸以下、さらに好ましくは４０アミノ酸以下、特に好ましくは３０アミノ酸以下である。
【００１７】
〔薬物送達システム〕
本発明の薬物送達システムは、上記本発明のクローディン結合分子と薬物とを含むものであればよい。本発明のクローディン結合分子は、クローディン１およびクローディン４への指向性を有しているので、本発明のクローディン結合分子を利用することにより、クローディン１またはクローディン４が発現している臓器や組織へ目的の薬物を送達するための優れた薬物送達システムを提供することができる。
【００１８】
本発明の薬物送達システムは、クローディン結合分子と薬物とが一体化していない混合組成物の形態とすることも可能であるが、クローディン結合分子と薬物とが何らかの相互作用により一体化した形態とすることが好ましい。一体化のための手段は特に限定されないが、例えば、薬物を封入したリポソームとクローディン結合分子の結合体、薬物を担持したナノマテリアルとクローディン結合分子の結合体などの形態が挙げられる。また、薬物がタンパク質である場合は、薬物とクローディン結合分子との融合タンパク質が好適である。
【００１９】
薬物を封入したリポソームとクローディン結合分子の結合体は、ペプチド、タンパク質、核酸、低分子化合物などの薬物を封入したリポソーム膜表面にクローディン結合分子を結合させたものであればよく、薬物の種類、リポソームの脂質組成やサイズ、およびクローディン結合分子との結合方法は特に限定されない。リポソームは、例えば、ホスファチジルコリン、コレステロール、ポリエチレングリコール結合脂質などを原料として公知の方法で作製することができる。また、クローディン結合分子との結合用に脂質末端カルボキシル基もしくはマレイミド基を有する脂質を使用することが好ましい。リポソーム内への薬物の封入は公知の凍結融解法、逆相蒸発法、水和法などにより行うことができる。作製した薬物内封リポソームにクローディン結合分子を加え、ペプチド縮合反応もしくはＳＨ基反応系によりリポソームとクローディン結合分子との結合体を作製することができる。
【００２０】
薬物を担持したナノマテリアルとクローディン結合分子との結合体は、特に限定されず、適当なナノマテリアルに薬物を担持させ、クローディン結合分子とさせればよい。例えば、公知の各種末端修飾ポリマーとクローディン結合分子のリジン、システインとの結合体を用いた自己組織化ナノマテリアルなどが挙げられる。
【００２１】
タンパク性薬物とクローディン結合分子との融合タンパク質は、公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。例えば、クローディン結合分子をコードする遺伝子と薬物をコードする遺伝子とを人工的に連結した融合遺伝子（ハイブリッド遺伝子）を作製し、当該融合遺伝子を、発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより取得することができる。融合タンパク質において、クローディン結合分子と薬物との結合順序は限定されず、Ｎ末端が薬物でＣ末端側がクローディン結合分子としてもよく、逆にＮ末端がクローディン結合分子でＣ末端側が薬物としてもよい。
【００２２】
本発明の薬物送達システムの標的部位は、本発明のクローディン結合分子が結合可能なクローディンが発現している臓器または組織であれば限定されない。好ましくは、クローディン１またはクローディン４が発現している臓器または組織である。具体的には、例えば、腸管粘膜組織（クローディン１および４が発現）、皮膚（クローディン１および４が発現）、肝臓（クローディン１および４が発現）、腎臓（クローディン１および４が発現）、脳（クローディン１が発現）、脾臓（クローディン１が発現）、心臓（クローディン１が発現）、癌細胞（クローディン１または４が発現）、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞（クローディン１がＣ型肝炎ウイルスの感染受容体）などが挙げられる。
【００２３】
本発明の薬物送達システムにおいて用いられる薬物は、上記標的部位に送達することが好ましい薬物であれば特に限定されない。具体的には、例えば、抗癌薬、抗ウイルス薬、炎症性腸疾患治療薬、肝疾患治療薬、腎疾患治療薬、脳疾患治療薬、心疾患治療薬、免疫抑制薬、アトピー性皮膚炎治療薬、ワクチンなどが挙げられる。
【００２４】
〔粘膜吸収促進剤〕
本発明は、上記クローディン結合分子を含有する粘膜吸収促進剤を提供する。本発明者らは、変異を有しないＣ−ＣＰＥが腸管、鼻、肺胞粘膜における薬物吸収促進活性を有することを報告しているが（非特許文献５）、本発明のクローディン結合分子は、変異を有しないＣ−ＣＰＥと比較して２倍以上の粘膜バリア低下作用および粘膜吸収促進活性を有することが実験的に確認されていることから（実施例参照）、顕著に優れた粘膜吸収促進剤を提供することができる。
【００２５】
〔ウイルス性疾患治療剤〕
本発明は、上記クローディン結合分子および抗ウイルス薬を含有するウイルス性疾患治療剤を提供する。治療対象のウイルス性疾患としては、クローディン１またはクローディン４が発現している細胞に感染するウイルスが原因となるウイルス性疾患が好ましい。特に好ましくはＣ型肝炎である。Ｃ型肝炎ウイルスは、クローディン１を感染受容体としていることが報告されている（非特許文献４）こと、本発明のクローディン結合分子はウイルス変異の影響を受けず、副作用が低いと予想されることから、未だ有効な治療法が存在しないＣ型肝炎ウイルスの高ウイルス量患者の治療薬として優れた効果を発揮することが期待される。
本発明のウイルス性疾患治療剤は、上述のように、抗ウイルス薬をリポソームに封入してクローディン結合分子と結合させる形態、抗ウイルス薬を担持したナノマテリアルをクローディン結合分子と結合させる形態、タンパク性抗ウイルス薬とクローディン結合分子との融合タンパク質とする形態が好ましい。
【００２６】
〔癌治療剤〕
本発明は、上記クローディン結合分子および抗癌薬を含有する癌治療剤を提供する。本発明の癌治療剤は、上記本発明のクローディン結合分子の代わりに変異を有しないＣ−ＣＰＥを用いてもよい。変異を有しないＣ−ＣＰＥとしては、以下の（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質を好適に用いることができる。
（Ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｄ）（Ｃ）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
【００２７】
本発明の癌治療剤の対象となる癌種は、クローディン１、３、４、６、７、８、１４が発現している癌であれば特に限定されない。好ましくはクローディン１または４が発現している癌である。具体的には、例えば、胃癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、大腸癌、肝癌等の上皮由来の癌が挙げられる。
【００２８】
本発明の癌治療剤に使用する抗癌薬は特に限定されない。既に臨床応用されている抗癌薬は、いずれも好適に使用することができる。具体的には、例えば、ジフテリアトキシン、緑膿菌エキソトキシン等のタンパク質性分子、タキソール、ドキソルビシン等の抗がん活性低分子などが挙げられる。
本発明の癌治療剤は、上述のように、抗癌薬をリポソームに封入してクローディン結合分子と結合させる形態、抗癌薬を担持したナノマテリアルをクローディン結合分子と結合させる形態、タンパク性抗癌薬とクローディン結合分子との融合タンパク質とする形態が好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実験方法において特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), "Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition)", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) や、F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore,J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Ltd. などの、当該技術分野における標準的なプロトコール集に記載の方法、またはそれらを改変した方法を用いた。また、市販の試薬キットや装置は、それらに添付のプロトコールや取扱説明書に従って使用した。
【００３０】
〔実施例１：Ｃ−ＣＰＥ変異体の活性検討〕
１−１ 実験方法
（１）Ｃ−ＣＰＥ変異体ファージライブラリの作製
Ｃ−ＣＰＥ（配列番号２の第１８４位〜第３１９位）をコードする遺伝子をｐＥＴ−１６ｂに挿入したｐＥＴ−Ｈ１０ＰＥＲ（J Cell Biol, 136, 1239-1247, 1997）を鋳型とし、Ｃ末端側６箇所（Ｓ３０４／Ｓ３０５／Ｓ３０７／Ｎ３０９／Ｓ３１３／Ｋ３１８）をＮＮＳ配列に置換したプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をファージミドに挿入し大腸菌ＴＧ１に導入した。この大腸菌にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加後、３７℃、３０分静置し、さらに３７℃、３０分振とう培養した。その後３０００×ｇで１０分間遠心分離して大腸菌を回収し、抗生物質含有培地中３７℃で振とう培養し、上清にＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液を添加後遠心操作によりファージを沈澱させた。この沈澱の懸濁液をＣ−ＣＰＥ変異体ライブラリとして使用した。
【００３１】
（２）クローディン１結合性ファージのスクリーニング
クローディン発現出芽バキュロウイルス（ＢＶ）は、Ｓａｅｋｉら（R. Saeki, et al., A novel tumor-targeted therapy using a claudin-4-targeting molecule, Mol Pharmacol, 76 (2009) 918-926.）に記載の方法に準じてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen社）を用いて作製した。クローディン１発現出芽バキュロウイルス（クローディン１ＢＶ）をイムノチューブに添加し、４℃で一晩静置することで固相化し、これにＣ−ＣＰＥ変異体ライブラリを添加した。イムノチューブをＰＢＳＴ（0.05% tween20含有PBS）およびＰＢＳでそれぞれ１５回ずつ洗浄し、１００ｍＭ ＨＣｌ １００μＬを添加して、４℃で１０分間作用させることでクローディン１ＢＶに結合しているファージを解離させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０μＬを加えてＨＣｌを中和し、ファージ溶液を回収した。ファージ溶液を大腸菌ＴＧ１に感染させ培養した。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加後、３７℃、３０分静置し、さらに３７℃、３０分振とう培養した。その後３０００×ｇで１０分間遠心分離して大腸菌を回収し、抗生物質含有培地中３７℃で振とう培養し、上清にＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液を添加後遠心操作によりファージを沈澱させた。この操作を繰り返すことにより、クローディン１結合性を有するＣ−ＣＰＥ変異体ファージをスクリーニングした。得られたファージクローンから、ファージミドを回収し、シークエンスを解析した。
【００３２】
（３）Ｃ−ＣＰＥ変異体の発現
目的のＣ−ＣＰＥ変異体がコードされているファージミドを鋳型としてＰＣＲによりＣ−ＣＰＥ変異体をコードするＤＮＡを増幅後、ｐＥＴ−１６ｂに挿入し、Ｃ−ＣＰＥ変異体発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターを大腸菌株ＢＬ２１に導入し、アンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。ＩＰＴＧ添加により融合タンパク質を発現誘導させた後、遠心分離により集菌し、菌体を超音波処理により破砕し、１５０００ｒｐｍの遠心分離後上清を回収した。回収した大腸菌溶解液をあらかじめ６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ／ＥＤＴＡ、ＭｉｌｌｉＱ、０．１Ｍ ＮｉＳＯ４、ｂｕｆｆｅｒＡ（10mM Tris-HCl (pH8.0)、400mM NaCl、5mM MgCl2、0.1mM phenylmethane sulfonyl fluoride、1mM 2-mercaptoethanol、10% glycerol）により平衡化しておいたＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加し、低濃度のイミダゾール溶液でカラムを洗浄後、高濃度のイミダゾール溶液で吸着したＣ−ＣＰＥ変異体を溶出した。溶出液をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加して、溶媒をＰＢＳバッファーに置換し、各種実験に使用した。
【００３３】
（４）Ｃ−ＣＰＥ変異体のクローディン結合性解析
９６ｗｅｌｌＥＬＩＳＡプレート（Greiner Bio-One GmbH、Germany）に０．５μｇ／５０μＬ ＴＢＳ／ｗｅｌｌで、野生型（ＷＴ）ＢＶ、クローディン１ＢＶ、クローディン４ＢＶを４℃で一晩静置することで固相化した。翌日、ＢＶをＰＢＳで３回洗浄し、１．６％ブロックエース（DS PHARMA BIOMEDICAL、Japan）を用いて室温で２時間ブロッキング後、Ｃ−ＣＰＥ変異体を０．２μｇ／ｗｅｌｌ添加した。一次抗体に抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Zymed Laboratories Inc., Co、USA）、二次抗体にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用い、ＴＭＢ試薬（Thermo Scientific, Rockford、IL）添加に伴う発色を波長４５０ｎｍの吸光度として測定し、Ｃ−ＣＰＥ変異体と各種ＢＶとの結合を解析した。
【００３４】
（５）Ｃ−ＣＰＥ変異体−ＰＳＩＦ融合タンパク質の作製
目的のＣ−ＣＰＥ変異体がコードされているファージミドを鋳型としてＰＣＲによりＣ−ＣＰＥ変異体をコードするＤＮＡを増幅後、ｐＥＴ−ＰＳＩＦ（ｐＥＴ１６ｂに緑膿菌エキソトキシン由来のタンパク質合成阻害因子（ＰＳＩＦ）をコードするＤＮＡを挿入したベクター、上記Ｓａｅｋｉら参照）に挿入し、Ｃ−ＣＰＥ変異体−ＰＳＩＦ融合タンパク質発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターを大腸菌株ＢＬ２１に導入し、アンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。ＩＰＴＧ添加により融合タンパク質を発現誘導させた後、遠心分離により集菌し、菌体を超音波処理により破砕し、１５０００ｒｐｍの遠心分離後上清を回収した。回収した大腸菌溶解液をあらかじめ６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ／ＥＤＴＡ、ＭｉｌｌｉＱ、０．１Ｍ ＮｉＳＯ４、ｂｕｆｆｅｒＡにより平衡化しておいたＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加し、低濃度のイミダゾール溶液でカラムを洗浄後、高濃度のイミダゾール溶液で吸着したＣ−ＣＰＥ変異体−ＰＳＩＦ融合タンパク質を溶出した。溶出液をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加して、溶媒をＰＢＳバッファーに置換した。
【００３５】
（６）Ｃ−ＣＰＥ変異体のクローディン１リガンド活性解析
マウス繊維芽細胞（Ｌ細胞）またはクローディン１安定発現Ｌ細胞を９６ｗｅｌｌプレート（FALCON）に播種し、一晩培養後Ｃ−ＣＰＥ変異体−ＰＳＩＦ融合タンパク質等を添加し、４８時間後にＷＳＴ−８試薬（NACALAI TESQUE, Inc., Kyoto）により細胞生存率を測定した。
また、拮抗阻害実験では、クローディン１安定発現Ｌ細胞を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、一晩培養後Ｃ−ＣＰＥまたはＣ−ＣＰＥ変異体を添加し、添加から３時間後にＣ−ＣＰＥ変異体−ＰＳＩＦ融合タンパク質を加え、４８時間後にＷＳＴ−８試薬により生細胞数率を測定した。
【００３６】
（７）Ｃ−ＣＰＥ変異体の粘膜バリア制御活性解析
ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ腸管上皮分化エンバイロメント（BD Biosciences, USA.）を用い、ヒト腸管モデル細胞であるＣａｃｏ−２細胞１×１０５個／５００μＬ／ｗｅｌｌをａｐｉｃａｌ側に、Ｓｅｅｄｉｎｇ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ １ｍＬをｂａｓａｌ側に添加した。２４時間培養後、培地をＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに交換し、７２時間さらに培養した。その後、ａｐｉｃａｌ側を無血清Ｓｅｅｄｉｎｇ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ ５００μＬ、ｂａｓａｌ側をＨＥＰＥＳバッファー（155mM NaCl, 3mM KCl, 2mM CaCl2, 3mM NaH2PO4, 5mM HEPES, 1%BSA, 10mM Glucose(pH7.4)）１ｍＬに置換した。２４時間後、ｂａｓａｌ側から１００μＬずつバッファーを抜き取りＣ−ＣＰＥまたはＣ−ＣＰＥ変異体１９を最終濃度２５または５０μｇ／ｗｅｌｌとなるように添加した。薬液添加後、１２および１８時間後に経上皮電気抵抗（ＴＥＲ：transepithelial electric resistance）を測定した。１８時間後のＴＥＲ測定後、Ｓｅｅｄｉｎｇ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍによって洗浄し、薬液を除去した。薬液洗浄２４時間後ＴＥＲを測定した。なお、ＴＥＲ測定にはＭｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ（Millipore Corp., USA）を用い、０時間のＴＥＲを基準として相対的な値として算出した。
【００３７】
（８）Ｃ−ＣＰＥ変異体の腸管粘膜吸収促進活性解析
モデル薬物として蛍光標識された分子量４０００のデキストラン（ＦＤ−４、Sigma-Aldrich）を使用した。なお、ＦＤ−４は最終濃度４０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。Ｗｉｓｒａｒ系雄性ラットにチアミラールナトリウム（イソゾール注射液（商品名））を腹腔内投与し麻酔下で背位に固定し、頸静脈を確保した。空腸の総胆管開口部の下とそこから約５ｃｍ下部を縫合糸で緩く縛り、作製したループの両端にはさみで切り込みを入れた。切り込みからｐＨ６．５のＰＢＳを５０ｍＬ注入し腸管腔内を洗浄した後、空気を送り余分なＰＢＳを除いた。下端をきつく縛りＦＤ−４とＣ−ＣＰＥとの混合液を２００μＬ投与後、上端を結紮し、腸管を腹腔におさめ、一定時間毎に頸静脈より約３５０μＬずつ採血した。血液は１２０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離を行い、血漿を分取し測定試料とした。分取した血漿５０μＬをｐＨ６．５のＰＢＳ２００μＬにて希釈した後、蛍光強度を測定した（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３８ｎｍ）。得られた血漿中ＦＤ−４濃度−時間曲線より台形則にて、試液投与後０時間から６時間目までの血中濃度下面積（ＡＵＣ）を算出した。
【００３８】
１−２ 実験結果
（１）クローディン１結合性ファージクローンの取得
Ｃ−ＣＰＥのＣ末端側６箇所（Ｓ３０４／Ｓ３０５／Ｓ３０７／Ｎ３０９／Ｓ３１３／Ｋ３１８）をランダムなアミノ酸に変異させたＣ−ＣＰＥ変異体を提示したファージライブラリを作製し、本ライブラリを用いてクローディン１ＢＶに結合性を示すファージクローンを複数取得した。取得したファージクローンおよびその変異箇所のアミノ酸を図１に示した。
【００３９】
（２）クローディン１結合分子の取得
クローディン１結合性ファージクローンのシークエンスデータに基づいて、組換えＣ−ＣＰＥ変異体を作製し、クローディンＢＶを用いてクローディン１結合性を解析した。図２に示したように、Ｃ−ＣＰＥ変異体１９（以下「変異体１９」という。）およびＣ−ＣＰＥ変異体８６（以下「変異体８６」という。）は野生型ＢＶに結合性を示さずクローディン１ＢＶに特異的に結合した。この結果から、変異体１９および変異体８６はクローディン１結合分子であることが明らかとなった。
【００４０】
（３）クローディン１リガンド特性の解析
変異体１９および変異体８６のクローディン１リガンド特性を解析するために、緑膿菌エキソトキシン由来のタンパク質合成阻害因子（ＰＳＩＦ）との融合タンパク質を作製した。変異体１９−ＰＳＩＦ、変異体８６−ＰＳＩＦまたはＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦをクローディン１発現Ｌ細胞に添加して細胞毒性を観察した。結果を図３に示した。図３から明らかなように、変異体１９−ＰＳＩＦ、変異体８６−ＰＳＩＦを添加した場合に添加濃度依存的な細胞毒性が観察された。
拮抗阻害実験の結果を図４（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は変異体１９−ＰＳＩＦの結果であり、（Ｂ）は変異体８６−ＰＳＩＦの結果である。図４（Ａ）および（Ｂ）から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥの前処理では変異体１９−ＰＳＩＦおよび変異体８６−ＰＳＩＦの細胞毒性が抑制されなかったのに対して、変異体１９−ＰＳＩＦまたは変異体８６−ＰＳＩＦの前処理ではいずれも濃度依存的な細胞毒性の抑制が観察された。これらの結果から、変異体１９および変異体８６はクローディン１リガンドとして応用できることが明らかとなった。
【００４１】
（４）クローディン１結合性の解析
野生型ＢＶ、クローディン１ＢＶ、クローディン４ＢＶに対する結合性を解析した結果を図５に示した。図５から明らかなように、変異体１９および変異体８６はいずれもクローディン１結合性のみならずクローディン４結合性を有していた。この結果から、変異体１９および変異体８６はクローディン１およびクローディン４結合性分子であることが示された。
【００４２】
（５）変異体１９の粘膜バリア制御活性解析
ヒト腸管モデル細胞系であるＣａｃｏ−２細胞の単層膜培養系を用いて、変異体１９の粘膜バリア制御活性を解析した結果を図６に示した。図６から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥまたは変異体１９の添加により、添加濃度依存的な粘膜バリア低下作用が観察された。また、変異体１９の粘膜バリア低下作用はＣ−ＣＰＥの約２倍の値を示した。
【００４３】
（６）変異体１９の腸管粘膜吸収促進活性解析
薬物の粘膜吸収測定系であるラット腸管ループ法を用いて、変異体１９のデキストラン（分子量４０００）吸収促進活性を解析した結果を図７に示した。図７から明らかなように、変異体１９はＣ−ＣＰＥと比較して約２倍の粘膜吸収促進活性を有していた。Ｃ−ＣＰＥはペプチド性医薬品の腸管・鼻・肺胞粘膜吸収促進活性を有していることから、変異体１９は経口・経鼻・経肺吸収促進技術への応用が期待される。
【００４４】
（７）クローディン１結合配列の同定
変異体１９、変異体８６の他に変異体３６もクローディン１特異的な結合性を有していた。これら３種類の変異体に共通のアミノ酸変異はＳｅｒ３０５Ｐｒｏ、Ｓｅｒ３０７Ａｒｇ、Ｓｅｒ３１３Ｈｉｓの３か所であることから（図１参照）、これら３か所のみが変異したＣ−ＣＰＥ三置換体を作製し、野生型ＢＶおよびクローディン１ＢＶを用いて結合性を解析した。結果を図８に示した。図８から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ三置換体は変異体１９と同程度のクローディン１結合性を有していた。
さらに、Ｃ−ＣＰＥ三置換体とＰＳＩＦとの融合タンパク質を作製し、クローディン１発現Ｌ細胞に対する細胞毒性を解析した。結果を図９に示した。図９から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ三置換体−ＰＳＩＦは濃度依存的な細胞毒性を示した。
これらの結果から、第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニン、第３１３位のヒスチジンを有するＣ−ＣＰＥの変異体は、クローディン１リガンドとして機能することが明らかとなった。
【００４５】
〔実施例２：Ｃ−ＣＰＥを利用した癌治療剤〕
２−１ 実験方法
（１）Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦおよびＰＳＩＦの作製
ｐＥＴ１６ｂにＣ−ＣＰＥ（配列番号２の第１８４位〜第３１９位）をコードする遺伝子およびその下流に緑膿菌エキソトキシン由来のタンパク質合成阻害因子（ＰＳＩＦ）をコードするＤＮＡを挿入したｐＥＴ−Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦ、ならびに、ｐＥＴ１６ｂにＰＳＩＦをコードするＤＮＡを挿入したｐＥＴ−ＰＳＩＦを使用した。
ｐＥＴ−Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはｐＥＴ−ＰＳＩＦを大腸菌株ＢＬ２１に導入し、アンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。ＩＰＴＧ添加により融合タンパク質を発現誘導させた後、遠心分離により集菌し、菌体を超音波処理により破砕し、１５０００ｒｐｍの遠心分離後上清を回収した。回収した大腸菌溶解液をあらかじめ６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ／ＥＤＴＡ、ＭｉｌｌｉＱ、０．１Ｍ ＮｉＳＯ４、ｂｕｆｆｅｒＡ（10mM Tris-HCl (pH8.0)、400mM NaCl、5mM MgCl2、0.1mM phenylmethane sulfonyl fluoride、1mM 2-mercaptoethanol、10% glycerol）により平衡化しておいたＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加し、１００ｍＭのイミダゾール溶液でカラムを洗浄後、４００ｍＭのイミダゾール溶液で吸着したＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはＰＳＩＦを溶出した。溶出液をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加して、溶媒をＰＢＳバッファーに置換し、各種実験に使用した。
【００４６】
（２）クローディン４発現Ｂ１６細胞に対する抗癌活性解析
実験的肺転移モデルとして汎用されているＢ１６メラノーマ細胞にクローディン４発現プラスミドを導入し、クローディン４発現Ｂ１６細胞を作製した。
７週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下に、クローディン４発現Ｂ１６細胞（１×１０５個）を移植した。移植後週３回Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを静脈内投与し、経日的に腫瘍体積を計測した。腫瘍体積は以下の式により算出した。
腫瘍体積＝最小径×最大径×最大径／２
また、７週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈からクローディン４発現Ｂ１６細胞（１×１０５個）を投与し、投与後週３回Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを静脈内投与した。細胞投与１４日目に肺を回収し、顕微鏡下で肺に転移した細胞数（肺転移結節数）を計測した。
【００４７】
（３）マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞に対する抗癌活性解析
７−８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に、４Ｔ１細胞（１×１０５個）を移植した。移植後週３回Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはドキソルビシン（Ｄｏｘ）を静脈内投与し、経日的に腫瘍体積を計測した。腫瘍体積は上記の式により算出した。また、細胞移植３５日後に肺を回収し、顕微鏡下で肺転移した細胞数（肺転移結節数）を計測した。
【００４８】
（４）Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの安全性
７−８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦまたはＰＳＩＦを週３回、２週間静脈内投与し、投与７２時間後に採血し、血中のＡＳＴ（aspartate aminotransferase）、ＡＬＴ（alanine aminotransferase）およびＢＵＮ（血中尿素窒素）を測定した。ＡＳＴおよびＡＬＴの測定にはトランスアミナーゼＣＩＩテストワコー（和光純薬）、ＢＵＮの測定には、尿素窒素Ｂテストワコー（和光純薬）を用いた。
【００４９】
２−２ 実験結果
（１）クローディン４発現Ｂ１６細胞に対する抗癌活性解析
皮下移植により形成された腫瘍に対する抗癌活性の解析結果を図１０に示した。図１０から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを５μｇ／ｋｇで週３回投与することにより、腫瘍体積の増加が有意に抑制された。
尾静脈投与により肺に転移した癌に対する抗癌活性の解析結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを５μｇ／ｋｇで週３回投与することにより、肺転移が有意に抑制された。
これらの結果から、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦがクローディン４を発現する癌の原発巣における退縮効果および転移抑制効果を有することが示された。
【００５０】
（２）マウス乳がん細胞株４Ｔ１細胞に対する抗癌活性解析
皮下移植により形成された腫瘍に対する抗癌活性の解析結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを５μｇ／ｋｇで週３回投与することにより、腫瘍体積の増加が有意に抑制された。
４Ｔ１細胞の皮下移植３５日目に、肺に自然転移した細胞数（肺転移結節数）を測定した結果を図１３に示した。図１３から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦを２または５μｇ／ｋｇで週３回投与することにより、肺転移が有意に抑制された。
これらの結果から、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦは、原発巣における退縮効果および転移抑制効果を有することが示された。
【００５１】
（３）ドキソルビシン（Ｄｏｘ）との比較
Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの抗腫瘍活性を、代表的な抗癌性抗生物質であるドキソルビシン（Ｄｏｘ）と比較した。
４Ｔ１細胞の皮下移植により形成された腫瘍に対する抗癌活性の解析結果を図１４に示した。図１４から明らかなように、Ｄｏｘの２ｍｇ／ｋｇ投与はＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの５μｇ／ｋｇ投与より強い抗癌活性を有していた。
肺への自然転移に対する抗癌活性の解析結果を図１５に示した。図１５から明らかなように、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの５μｇ／ｋｇ投与はＤｏｘの４ｍｇ／ｋｇ投与と同等の転移抑制効果を有することが示された。
抗癌剤の副作用の指標である体重減少を解析した結果を図１６に示した。図１６から明らかなように、Ｄｏｘの２または４ｍｇ／ｋｇ投与では顕著な体重減少が観察されたが、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの５μｇ／ｋｇ投与では全く体重減少が観察されなかった。
【００５２】
（４）肝臓および腎臓に及ぼす影響
肝障害の指標であるＡＳＴおよびＡＬＴを測定した結果を図１７に示した。また、腎障害の指標であるＢＵＮを測定した結果を図１８に示した。いずれの結果においても、抗癌活性が認められたＣ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦの５μｇ／ｋｇ投与では、測定値の上昇は認められなかった。
【００５３】
以上の結果から、Ｃ−ＣＰＥ−ＰＳＩＦは副作用を伴うことなく、原発巣癌および転移癌に対する抗癌活性を発揮することが明らかとなった。
【００５４】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質からなるクローディン結合分子。
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列の第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
【請求項２】
クローディンが、少なくともクローディン１およびクローディン４である請求項１に記載のクローディン結合分子。
【請求項３】
毒性を発現しないことを特徴とする請求項１または２に記載のクローディン結合分子。
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１位〜第５２位を欠失していることを特徴とする請求項３に記載のクローディン結合分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のクローディン結合分子と薬物とを含むことを特徴とする薬物送達システム。
【請求項６】
薬物が、抗癌薬、抗ウイルス薬、炎症性腸疾患治療薬、肝疾患治療薬、腎疾患治療薬、脳疾患治療薬、心疾患治療薬、免疫抑制薬、アトピー性皮膚炎治療薬およびワクチンからなる群より選択されることを特徴とする請求項５に記載の薬物送達システム。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のクローディン結合分子を含有する粘膜吸収促進剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載のクローディン結合分子および抗ウイルス薬を含有するウイルス性疾患治療剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のクローディン結合分子または以下の（Ｃ）もしくは（Ｄ）のタンパク質からなるクローディン結合分子および抗癌薬を含有する癌治療剤。
（Ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｄ）（Ｃ）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質からなるクローディン結合分子。
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列の第３０５位のプロリン、第３０７位のアルギニンおよび第３１３位のヒスチジン以外の配列部分において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
【請求項２】
クローディンが、少なくともクローディン１およびクローディン４である請求項１に記載のクローディン結合分子。
【請求項３】
毒性を発現しないことを特徴とする請求項１または２に記載のクローディン結合分子。
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１位〜第５２位を欠失していることを特徴とする請求項３に記載のクローディン結合分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のクローディン結合分子と薬物とを含むことを特徴とする薬物送達システム。
【請求項６】
薬物が、抗癌薬、抗ウイルス薬、炎症性腸疾患治療薬、肝疾患治療薬、腎疾患治療薬、脳疾患治療薬、心疾患治療薬、免疫抑制薬、アトピー性皮膚炎治療薬およびワクチンからなる群より選択されることを特徴とする請求項５に記載の薬物送達システム。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のクローディン結合分子を含有する粘膜吸収促進剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載のクローディン結合分子および抗ウイルス薬を含有するウイルス性疾患治療剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のクローディン結合分子または以下の（Ｃ）もしくは（Ｄ）のタンパク質からなるクローディン結合分子および抗癌薬を含有する癌治療剤。
（Ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の部分配列からなり、少なくとも第３０４位〜第３１９位のアミノ酸を含むタンパク質
（Ｄ）（Ｃ）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクローディンと結合するタンパク質
【図１】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１７】
【図１８】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１１−１６２４６６（Ｐ２０１１−１６２４６６Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５２５９（Ｐ２０１０−２５２５９）
【出願日】平成２２年２月８日（２０１０．２．８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、文部科学省、「関西広域バイオメディカルクラスター構想（大阪北部（彩都）地域）に伴う研究委託業務」に係る再委託契約、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月８日（２０１０．２．８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、文部科学省、「関西広域バイオメディカルクラスター構想（大阪北部（彩都）地域）に伴う研究委託業務」に係る再委託契約、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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