新規枯草菌変異株及びタンパク質の製造方法
【課題】タンパク質の生産性を向上させる。
【解決手段】所定の領域を欠失した枯草菌株において分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を１又は複数欠失させる。分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子としては、ywaA遺伝子を挙げることができる。さらに、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子としてybgE遺伝子及びbcd遺伝子をともに欠失していることがより好ましい。
【解決手段】所定の領域を欠失した枯草菌株において分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を１又は複数欠失させる。分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子としては、ywaA遺伝子を挙げることができる。さらに、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子としてybgE遺伝子及びbcd遺伝子をともに欠失していることがより好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な枯草菌変異株及びタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
枯草菌は、グラム陽性菌のモデルとして広く分子生物学の研究に供されているのみならず、アミラーゼやプロテアーゼといった各種酵素の生産菌として発酵工業及び医薬品工業等に広く利用されている。日欧共同ゲノムプロジェクトにより、枯草菌ゲノムの全塩基配列が既に決定されているが、枯草菌ゲノムに存在する約4100種類の遺伝子に関する機能同定は完了していない。
【０００３】
現在まで、枯草菌ゲノムに存在する約4100種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研究され、271個の遺伝子が成育に必須であることが指摘されている（非特許文献１）。また、枯草菌において、L-バリン、L-イソロイシン及びL-ロイシンといった分岐アミノ酸は、代謝パスウェイによって分岐脂肪酸合成系の基質となるイソブチリル-CoA、2-メチルブチリル-CoA及びイソブチリル-CoAとなる。また、これらイソブチリル-CoA、2-メチルブチリル-CoA及びイソブチリル-CoAは、イソ酪酸、2-メチル酪酸及び吉草酸といった臭気の原因物質へと変換される。このような分岐鎖アミノ酸の代謝パスウェイに関与する酵素としては、例えば非特許文献２に開示されるように、ロイシン脱水素酵素及び分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼが同定されている。これらロイシン脱水素酵素及び分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼを欠損した枯草菌株においては、イソ酪酸、2-メチル酪酸及び吉草酸の生産量が顕著に低下し、臭気を低減できることが知られていた。
【０００４】
【非特許文献１】K. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 4678-4683, 2003
【非特許文献２】竹村ら、日本食品科学工学会誌、第47巻、第10号、2000年10月、第773〜779頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところが、微生物を用いてタンパク質を製造する際に、これらロイシン脱水素酵素及び分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼといった分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素が関与するといった知見はなかった。
【０００６】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、タンパク質の生産性に優れた枯草菌変異株を提供し、これを利用することによって生産性に優れたタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明者らは、所定の領域を欠失した枯草菌株において分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする１又は複数の遺伝子を欠失又は不活性化させることによってタンパク質の生産性が向上するといった知見を見いだし、発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明に係る枯草菌変異株は、枯草菌におけるprophage6 (yoaV-yobO)領域、prophage1 (ybbU-ybdE)領域、prophage4 (yjcM-yjdJ)領域、PBSX (ykdA-xlyA)領域、prophage5 (ynxB-dut)領域、prophage3 (ydiM-ydjC)領域、spb (yodU-ypqP)領域、pks (pksA-ymaC)領域、skin (spoIVCB-spoIIIC)領域、pps (ppsE-ppsA)領域、prophage2 (ydcL-ydeJ)領域、ydcL-ydeK-ydhU領域、yisB-yitD領域、yunA-yurT領域、cgeE-ypmQ領域及びyeeK-yesX領域からなる群から選ばれる１以上の遺伝子領域を欠失させたゲノム構造を有する枯草菌株から、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させたものである。
【０００９】
ここで、上記分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌由来のywaA遺伝子又はywaA遺伝子に対応する相同遺伝子を挙げることができる。
【００１０】
また、本発明に係る枯草菌変異株は、上記分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌由来のywaA遺伝子又はywaA遺伝子に対応する相同遺伝子の他に、枯草菌由来のbcd遺伝子、ybgE遺伝子及びこれら遺伝子に対応する相同遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子がさらに欠失又は不活性化されていることが好ましい。
【００１１】
さらに、本発明に係る枯草菌変異株は、上記枯草菌株と比較してタンパク質生産性が向上したものとなっている。
【００１２】
一方、本発明に係るタンパク質の製造方法は、上述した枯草菌変異株を培養し、菌体内及び/又は菌体外に目的とするタンパク質を産生するものである。特に、本発明に係るタンパク質の製造方法においては、上記枯草菌変異株を、分岐鎖アミノ酸を含有する培地において培養することが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、野生株や公知の変異株と比較して、タンパク質の生産性が優れた枯草菌変異株を提供することができる。本発明に係る枯草菌変異株を種々の物質生産に使用することによって、目的とするタンパク質の生産性を向上させることができる。
【００１４】
さらに、本発明により、野生株や公知の変異株を使用した場合と比較して生産性に優れたタンパク質の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において提供される新規な枯草菌変異株は、枯草菌の野生株から特定の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株（以下、親株と称する場合もある）に対して、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させたものである。特定の領域とは、prophage6 (yoaV-yobO)領域、prophage1 (ybbU-ybdE)領域、prophage4 (yjcM-yjdJ)領域、PBSX (ykdA-xlyA)領域、prophage5 (ynxB-dut)領域、prophage3 (ydiM-ydjC)領域、spb (yodU-ypqP)領域、pks (pksA-ymaC)領域、skin (spoIVCB-spoIIIC)領域、pps (ppsE-ppsA)領域、prophage2 (ydcL-ydeJ)領域、ydcL-ydeK-ydhU領域、yisB-yitD領域、yunA-yurT領域、cgeE-ypmQ領域及びyeeK-yesX領域を挙げることができる。すなわち、親株は、これら領域のうち少なくとも１領域、好ましくは２２以上の領域が欠失したゲノム構造を有していることが好ましい。また、親株は、これら全ての領域が欠失したゲノム構造を有することが最も好ましい。なお、これら全ての領域が欠失したゲノム構造を有する枯草菌は、特開２００７−１３００１３号公報においてMGB874株として開示されている。
【００１６】
各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。また、これら特定の領域は、表１のオリゴヌクレオチド・セットにより挟み込まれる領域として定義することもできる。
【００１７】
【表１】
【００１８】
表１に示した欠失領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えば図１に示す以下の方法を適用することができる。
【００１９】
すなわち、いわゆるSOE-PCR法（Gene,77,61 (1989)）によって調製される欠失用DNA断片を挿入した欠失用プラスミドを用いた２段階の１重交差法を用いる方法によって、表１に示した欠失領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる。本方法で用いる欠失用DNA断片は、欠失対象領域の上流に隣接する約0.1〜3kb断片（上流断片と称する）と、同じく下流に隣接する約0.1〜3kb断片が結合したDNA断片（下流断片と称する）とを連結したDNA断片である。また当該DNA断片の下流或いは上流にクロラムフェニコール耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカー遺伝子断片を結合させたDNA断片を用いることもできる。
【００２０】
まず、１回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに必要に応じて薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製する。この際、結合対象となるDNA断片の末端10〜30塩基対の配列を付加したプライマーを設計する。例えば、上流断片及び下流断片をこの順で結合させる場合、上流断片の下流末端に位置する（アニールする）プライマーにおける５’末端に、下流断片の上流側10〜30塩基に相当する配列を付加し、また下流断片の上流末端に位置する（アニールする）プライマーにおける５’末端に、上流断片の下流側10〜30塩基に相当する配列を付加する。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片及び下流断片を増幅した場合、増幅された上流断片の下流側には下流断片の上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片の上流側には上流断片の下流側に相当する領域が付加されることとなる。
【００２１】
次に１回目に調製した上流断片及び下流断片を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に位置する（アニールする）プライマー及び下流断片の下流側に位置する（アニールする）プライマーからなる1対のプライマーを用いて２回目のPCRを行う。この２回目のPCRにより、上流断片及び下流断片をこの順で結合した欠失用DNA断片を増幅することができる。
【００２２】
なお、欠失用DNA断片に薬剤耐性マーカー遺伝子断片を連結する場合には、１回目のPCRにおいて、下流断片の下流側に相当する領域を付加するように、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を増幅する。さらに2回目のPCRにおいて、上流断片の上流側に位置する（アニールする）プライマーと薬剤耐性マーカー遺伝子断片の下流側に位置する（アニールする）プライマーからなる一対のプライマーを使用する。これにより、上流断片、下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片の順で結合した欠失用DNA断片を増幅することができる。
【００２３】
また、上流断片及び下流断片をこの順で結合した欠失用DNA断片を2回目のPCRによって増幅した後、薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに欠失用DNA断片を挿入することで、上流断片、下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片をこの順で有する欠失用DNA断片を調製しても良い。
【００２４】
更に、上述の方法などによって得られる欠失用DNA断片を、通常の制限酵素とDNAリガーゼを用いて宿主菌内で増幅されないプラスミドDNA、又は温度感受性プラスミド等、容易に除去できるプラスミドDNAに挿入することによって、欠失導入用プラスミドを構築する。宿主菌内で増幅されないプラスミドDNAの例としては、例えば枯草菌を宿主とする場合、pUC18、pUC118、pBR322などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
次いで、欠失用プラスミドによる宿主菌の形質転換をコンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）などによって行い、プラスミドに挿入された上流断片或いは下流断片とゲノム上の相同領域間での１重交差の相同組換えによって欠失用プラスミドが宿主菌ゲノムDNA内に融合した形質転換体を得る。形質転換体の選択には欠失導入用プラスミドのクロラムフェニコール耐性遺伝子などのマーカー遺伝子による薬剤耐性を指標に行えば良い。
【００２６】
かくして得られる形質転換体のゲノム上には欠失すべきゲノム上の薬剤耐性遺伝子の上流領域及び下流領域の配列について、宿主菌ゲノム由来と欠失用プラスミドに由来するものが重複して存在している。この上流領域又は下流領域のうち、形質転換体を獲得する際に相同組換えした領域と異なる領域でゲノム内相同組換えを起こさせることにより、欠失用プラスミド由来の領域と共にゲノム上の薬剤耐性遺伝子など欠失すべき標的遺伝子の欠失が生じる。ゲノム内の相同組換えを起こさせる方法としては、例えばコンピテンスを誘導する方法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）が挙げられるが、単に通常の培地での培養中においても自然誘発的に相同組換えが生じる。目的通りにゲノム内相同組換えを起こした菌株は同時に薬剤耐性遺伝子を欠失して薬剤に対する耐性能を失うため、薬剤感受性となった菌株より選択することができる。こうした菌株からゲノムDNAを抽出し、PCR法などによって目的遺伝子の欠失を確認すれば良い。
【００２７】
目的の欠失株を選択する際、薬剤耐性から感受性に変化した菌株を直接選択することは難しく、またゲノム内での相同組換えは約10-4以下の低い頻度で生じるものと考えられる。そこで、目的欠失株を効率的に取得するためには薬剤感受性株の存在比率を高めるなどの工夫を施すことが望ましい。薬剤感受性株の濃縮方法としては、例えばアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質が、増殖細胞に対して殺菌的に作用し、一方、非増殖細胞には作用しないことを利用した濃縮法（Methods in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, (1970)）などが挙げられる。アンピシリンなどによる濃縮を行う場合、例えばテトラサイクリンやクロラムフェニコールなどの様に宿主細胞に対して静菌的に作用する薬剤に対する耐性遺伝子の欠失に関して有効である。こうした静菌的作用の薬剤を適量含む適当な培地において、当該薬剤耐性遺伝子を保持する耐性株は増殖可能であり、当該薬剤耐性遺伝子を欠失した感受性株は増殖も死滅もしない。この様な条件下において適当な濃度のアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質を添加して培養を行うと、増殖しようとする耐性株が死滅する一方、感受性株はアンピシリンなどの作用を受けず、結果として感受性株の存在比率が高まることになる。この様な濃縮操作を行った培養液を適当な寒天培地に塗抹、培養し、出現したコロニーのマーカー薬剤に対する耐性の有無をレプリカ法などによって確認することにより、効率的に感受性株を選択することが可能となる。
【００２８】
以上のようにして、本発明に係る枯草菌変異株の親株となる、ゲノム上の所定の領域を単独で欠失したゲノム構造を有する枯草菌株を製造することができる。さらに、複数の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株は、いわゆる、LP(lysis of protoplasts)形質転換方法によって製造することができる。LP形質転換法は、『T. Akamatsu及びJ. Sekiguchi, 「Archives of Microbiology」, 1987年, 第146巻, p.353-357』及び『T. Akamatsu及びH. Taguchi, 「Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry」, 2001年, 第65巻，第4号, p.823-829』を参照することで利用することができる。すなわち、LP形質転換法では、細胞壁を溶解させたプロトプラストを供与体DNAとして、レシピエント菌株のコンピテントセルに供与する。添加されたプロトプラストは浸透圧ショックにより破壊され、培養液中に放出された供与体DNAがレシピエント菌株のコンピテントセルに取り込まれるものと考えられている。また、LP形質転換方法によれば、一般的な形質転換方法に比べて、導入すべきDNAの損傷は大幅に軽減する。
【００２９】
このLP形質転換法を適用することによって、単独で欠失したゲノム構造を有する枯草菌株から複数の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株をあらたに製造することができる。具体的には、先ず、第１の欠失領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株をプロトプラスト化し、異なる領域を（第２の欠失領域）を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株のコンピテントセルと共存させる。これにより、第１の欠失領域を有するゲノムDNA（供与体DNA）と、第２の欠失領域を有するゲノムDNA（宿主DNA）との間で一組の鎖間交換構造を形成することとなる。この一組の鎖間交換構造が供与体DNAにおける第１の欠失領域を挟み込んだ位置で生じることによって、供与体DNAにおける第１の欠失領域が宿主DNAに導入されることとなる。このようにして、LP形質転換法を適用することによって、第１の欠失領域及び第２の欠失領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株を製造することができる。この方法を応用すれば、成育に必須な遺伝子を欠失しない限り、複数の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株を製造することができる。以上のようにして、表１に示した領域を枯草菌ゲノム上から欠失させることができ、所望のゲノム構造を有する枯草菌株を作製することができ、本発明に係る枯草菌変異株の親株として使用することができる。
【００３０】
本発明に係る枯草菌変異株は、上述した親株から分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させたものである。ここで、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素とは、ロイシン、イソロイシン及びバリンといった分岐アミノ酸が脱アミノ化されて2-ケトイソ吉草酸、2-ケト-3-メチル吉草酸及び2-ケトイソカプロン酸に代謝される反応における、上記脱アミノ化を触媒する酵素を意味する。より具体的には、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素としては、枯草菌におけるywaA遺伝子によりコードされるYwaAタンパク質を挙げることができる。YwaAタンパク質は、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることがJ. Bacteriol., 185, 2418-2431 (2003)により明らかとなっている。
【００３１】
枯草菌由来のywaA遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、ywaA遺伝子によりコードされるYwaAタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、ywaA遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるYwaAタンパク質をコードするか、配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するYwaAタンパク質をコードするものであれば、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。ここで、上記複数個のアミノ酸とは、具体的には2〜30個、好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個、さらに好ましくは2〜5個を意味する。
【００３２】
また、ywaA遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して70％以上、80％以上または、90％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、特に好ましくは97％以上、より特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するYwaAタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、相同性の値は、複数のアミノ酸配列間の相同性を演算するソフトウェア（例えば、DANASYSやBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を意味する。
【００３３】
さらに、ywaA遺伝子としては、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドも含まれる。当該ポリヌクレオチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることとなる。
【００３４】
ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件下としては、例えば、相同性が高いDNA同士(例えば50％以上の相同性を有するDNA同士)がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。具体的に、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1％SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３５】
以上のように、本発明においては、配列番号２に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有していても、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするものであればywaA相同遺伝子として欠失又は不活性化の対象とすることができる。ywaA相同遺伝子が、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするか否かは従来公知の手法を適用して検証することができる。すなわち、検証対象のywaA相同遺伝子を発現する組み換え体を、分岐アミノ酸を基質として含有する培地にて培養する。培地に合成される2-ケトイソ吉草酸、2-ケト-3-メチル吉草酸或いは2-ケトイソカプロン酸の量が対照（野生株）と比較して有意に増加している場合には、検証対象のywaA相同遺伝子が分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードしていることが判る。
【００３６】
ywaA遺伝子（ywaA相同遺伝子も含む）を欠失又は不活性化させる方法としては、特に限定されず、如何なる方法を適用しても良い。一例としては、上述したSOE-PCR法（図１参照）を適用して親株のゲノムからywaA遺伝子を欠失させることができる。また、上述したSOE-PCR法により、ywaA遺伝子における特定の領域のみを欠失させてもよい。さらに、上述したSOE-PCR法により、ywaA遺伝子のプロモーター領域を欠失させることによって、ywaA遺伝子を不活性化させても良い。さらに、所謂、アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用した遺伝子発現抑制法を適用しても良いし、RNA干渉を利用した遺伝子発現抑制法を適用しても良いし、ハンマーヘッド型リボザイムを利用した遺伝子発現抑制法を適用しても良い。さらに、部位特異的突然変異導入法を適用して、ywaA遺伝子の所定の部位に突然変異を導入することで、不活性型のタンパク質を発現するように改変してもよい。
【００３７】
以上のように構成された本発明に係る枯草菌変異株は、上述した親株から分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を欠失又は不活性化している。本発明に係る枯草菌変異株は、枯草菌野生株や親株と比較してタンパク質生産性が向上しているといった特徴を示す。すなわち、本発明に係る枯草菌変異株に対して、所望の遺伝子を発現可能に導入することによって、当該遺伝子によりコードされるタンパク質の優れた生産性で菌体内外に産生することができる。生産される目的タンパク質としては、特に限定されず、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業に使用される産業用酵素や生理活性ペプチドなどが挙げられるが、特に産業用酵素であることが好ましい。産業用酵素には、機能別に分類すると、酸化還元酵素(Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)及び合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれる。この中でも、本発明の枯草菌変異株を用いて生産される目的タンパク質としては、好適には、セルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
【００３８】
目的タンパク質を導入した枯草菌変異株は、通常の培養方法を用いることができる。すなわち、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含む通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷん及びセルロースの加水分解物、糖蜜等の糖類、グリセロール、エタノール、ソルビトール等のアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸を用いることができる。窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物等の有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水、尿素等を用いることができる。有機微量栄養源として、ビタミン類、アミノ酸等の要求物質、又は、必要に応じて酵母エキス、コーンスティープリカー等を含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、銅イオン、鉄イオン、マンガンイオン等を添加することが望ましい。場合によっては、消泡剤等も添加される。
【００３９】
特に本発明に係る枯草菌変異株は、ywaA遺伝子によりコードされる分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼが欠失又は不活性化しているため、分岐アミノ酸の合成量が低下している虞がある。従って、本発明に係る枯草菌変異株を培養する培地としては、アミノ酸のうち少なくとも分岐アミノ酸を含有する培地を使用することが好ましい。
【００４０】
また、培地のpHは6.0〜8.0に調節することが適当であり、pHの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行えばよい。培養は、15〜45℃、好ましくは25〜45℃で、6〜96時間、更に好ましくは24〜72時間行い、必要により通気や攪拌を加えてもよい。なお、組換え枯草菌の場合は、培地のｐＨは用いる枯草菌が生育し得る範囲、例えば、pH6.0〜8.0に調整するのが好適である。また、培養条件は、15〜42℃、好ましくは28〜37℃で２〜４日間振盪、又は通気撹拌培養すればよい。
【００４１】
なお、セルラーゼの生産性は、一例として以下のようにして測定することができる。先ず、セルラーゼ遺伝子を有するベクターを用いて供試枯草菌変異株を形質転換する。次に、得られた形質転換体を培養した後、遠心分離等によって菌体を除いた培養液上清を得る。そして、得られた上清に基質として例えば、p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を添加し、所定時間反応させ、反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量する。これにより、供試枯草菌変異株に導入したセルラーゼ遺伝子にコードされるセルラーゼの生産性を測定することができる。なお、枯草菌168株等の標準野生株や親株におけるセルラーゼの生産性を同様に測定することで、供試枯草菌変異株におけるセルラーゼ生産性を相対値として評価することができる。
【００４２】
プロテアーゼの生産性は、一例として以下のようにして測定することができる。先ず、プロテアーゼ遺伝子を有するベクターを用いて供試枯草菌変異株を形質転換する。次に、得られた形質転換体を培養した後、遠心分離等によって菌体を除いた培養液上清を得る。そして、得られた上清に基質として例えば、Succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide (STANA ペプチド研究所)を添加し、所定時間反応させ、反応を行った際に遊離するp-ニトロアニリン量を420nmにおける吸光度変化(OD420nm)により定量する。これにより、供試枯草菌変異株に導入したプロテアーゼ遺伝子にコードされるプロテアーゼの生産性を測定することができる。なお、枯草菌168株等の標準野生株や親株におけるプロテアーゼの生産性を同様に測定することで、供試枯草菌変異株におけるプロテアーゼ生産性を相対値として評価することができる。
【００４３】
アルカリアミラーゼの生産性は、一例として以下のようにして測定することができる。先ず、アルカリアミラーゼ遺伝子を有するベクターを用いて供試枯草菌変異株を形質転換する。次に、得られた形質転換体を培養した後、遠心分離等によって菌体を除いた培養液上清を得る。そして、例えば、アミラーゼ活性測定キットであるリキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティック社)を使用して、上清に含まれるアルカリアミラーゼの活性を測定することができる。これにより、供試枯草菌変異株に導入したアルカリアミラーゼ遺伝子にコードされるアルカリアミラーゼの生産性を測定することができる。なお、枯草菌168株等の標準野生株や親株におけるアルカリアミラーゼの生産性を同様に測定することで、供試枯草菌変異株におけるアルカリアミラーゼ生産性を相対値として評価することができる。
【００４４】
本発明に係る枯草菌変異株に導入される目的タンパク質の遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域であるものが、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス（Bacillus）属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
【００４５】
より具体的には配列番号５１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号５２で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して70％以上、80％以上または、90％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、特に好ましくは97％以上、より特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質の構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
【００４６】
また、本発明に係る枯草菌変異株は、上述したywaA遺伝子とともに、枯草菌におけるbcd遺伝子及び/又はybgE遺伝子が欠失又は不活性化していることが好ましい。なお、bcd遺伝子及び/又はybgE遺伝子を欠失又は不活性化する手法は、上述したywaA遺伝子の欠失又は不活性化の手法を適用することができる。
【００４７】
bcd遺伝子は、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素であるロイシン脱水素酵素をコードすることが知られている（J. Bacteriol., 181, 2059-2066 (1999)）。bcd遺伝子の塩基配列を配列番号３に示し、bcd遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。なお、bcd遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるbcdタンパク質をコードするか、配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、ロイシン脱水素酵素活性を有するBcdタンパク質をコードするものであれば、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。ここで、上記複数個のアミノ酸とは、具体的には2〜30個、好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個、さらに好ましくは2〜5個を意味する。
【００４８】
また、bcd遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して70％以上、80％以上または、90％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、特に好ましくは97％以上、より特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、ロイシン脱水素酵素活性を有するBcdタンパク質をコードものであってもよい。ここで、相同性の値は、複数のアミノ酸配列間の相同性を演算するソフトウェア（例えば、DANASYSやBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を意味する。
【００４９】
さらに、bcd遺伝子としては、配列番号３に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ロイシン脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドも含まれる。当該ポリヌクレオチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ロイシン脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードすることとなる。
【００５０】
ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件であって例えば、上述した条件を含む意味である。
【００５１】
一方、ybgE遺伝子は、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素である分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードすることが知られている（J. Bacteriol., 185, 2418-2431 (2003)）。ybgE遺伝子の塩基配列を配列番号５に示し、ybgE遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。なお、ybgE遺伝子は、配列番号５に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるYbgEタンパク質をコードするか、配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するybgEタンパク質をコードするものであれば、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。ここで、上記複数個のアミノ酸とは、具体的には2〜30個、好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個、さらに好ましくは2〜5個を意味する。
【００５２】
また、ybgE遺伝子は、配列番号５に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して70％以上、80％以上または、90％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、特に好ましくは97％以上、より特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有するを有するアミノ酸配列からなり、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するYbgEタンパク質をコードものであってもよい。ここで、相同性の値は、複数のアミノ酸配列間の相同性を演算するソフトウェア（例えば、DANASYSやBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を意味する。
【００５３】
さらに、ybgE遺伝子としては、配列番号５に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドも含まれる。当該ポリヌクレオチドは、配列番号６に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることとなる。ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件であって例えば、上述した条件を含む意味である。
【００５４】
上述したywaA遺伝子とともに、枯草菌におけるbcd遺伝子及び/又はybgE遺伝子が欠失又は不活性化した枯草菌変異株においては、タンパク質の生産性が更に向上することとなる。ここで、上述したbcd遺伝子及びybgE遺伝子のそれぞれを単独で欠失又は不活性化した枯草菌変異株は、枯草菌標準株や親株と比較してもタンパク質の生産性は同等である。しかしながら、ywaA遺伝子とともにbcd遺伝子及び/又はybgE遺伝子が欠失又は不活性化した枯草菌変異株においては、ywaA遺伝子が単独で欠失した枯草菌変異株と比較してタンパク質生産性が更に向上したものとなる。
【００５５】
特に、ywaA遺伝子及びbcd遺伝子の２つの遺伝子が欠失又は不活性化した枯草菌変異株並びにywaA遺伝子及びybgE遺伝子の２つの遺伝子が欠失又は不活性化した枯草菌変異株と比較すると、ywaA遺伝子、bcd遺伝子及びybgE遺伝子の３つの遺伝子が欠失又は不活性化した枯草菌変異体は、タンパク質の生産性が最も優れたものとなる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５７】
本実施例における“PCR法”、“枯草菌の形質転換法”及び“目的タンパク質生産用の培養法”は以下のように行った。
【００５８】
また、本実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
【００５９】
＜PCR法＞
PCRにはGeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いて行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μLとし、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmolとし、Pyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。
【００６０】
＜枯草菌の形質転換法＞
枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20％ 硫酸アンモニウム、1.40％ リン酸水素二カリウム、0.60％ リン酸二水素カリウム、0.10％ クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50％ グルコース、0.02％ カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20％ 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60％ リン酸二水素カリウム、0.10％ クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50％ グルコース、0.01％ カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
【００６１】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μLに各種DNA断片を含む溶液（SOE-PCRの反応液等）5μLを添加し、37℃で1時間振盪培養後、適切な薬剤を含むLB寒天培地（1％トリプトン、0.5％ 酵母エキス、1％ NaCl、1.5％ 寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするPCRによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
【００６２】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の宿主微生物への導入は、コンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）、エレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）、プロトプラスト形質転換法（Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)）のいずれかによって行った。
【００６３】
＜目的タンパク質生産用の培養法＞
組換え微生物によるタンパク質生産用の培養には、LB培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl）、2xYT培地（1.6％トリプトン、1％酵母エキス、0.5％NaCl）、2xL-マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物）、或いはCSL発酵培地（2％酵母エキス、0.5％コーンスティープリカー（CSL）、0.05％塩化マグネシウム七水和物、0.6％尿素、0.2％L-トリプトファン、10％グルコース、0.15％リン酸二水素ナトリウム、0.35％リン酸水素二ナトリウム、pH7.2）を用いた。
【００６４】
また、本実施例で使用したプライマーの名称及び塩基配列を表２に示す。
【００６５】
【表２】
【００６６】
〔実施例１〕
本実施例１では、枯草菌MGB874株のゲノム中からbcd、ywaA及びybgE遺伝子を単独で欠失した枯草菌変異株を構築した。なお、枯草菌MGB874株については、特開２００７−１３００１３号公報の実施例等を参照して、枯草菌標準株168株から当業者が容易に構築することができる。
【００６７】
本実施例では、図1に模式的に示したSOE-PCR法を適用して、MGB874株を用いてゲノム中ywaA遺伝子、bcd遺伝子及びybgE遺伝子を単独で欠失した枯草菌変異株を構築した。なお、ywaA遺伝子、bcd遺伝子及びybgE遺伝子は、枯草菌の分岐アミノ酸（L-バリン、L-ロイシン及びL-イソロイシン）の分解経路の最初ステップ及び生合成経路の最終ステップの酵素をコードする遺伝子である。
【００６８】
まず、ywaA欠失株の構築方法を説明する。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表２に示したywaAFW及びywaA/CmRのプライマーセットを用いて、ゲノム中のywaA遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、ywaA/CmF及びywaARVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のywaA遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片（B）をPCRにより増幅した。
【００６９】
さらに、プラスミドpC194(J. Bacteriol. 150(2), 815 (1982))DNAを鋳型とし、表２に示したcatf及びcatrのプライマーセットを用いて、0.9kbのクロラムフェ二コール（Cm）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
【００７０】
次に、図１に示すように、得られた1.0kb断片（A）、1.0kb断片（B）及びCm耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表２に示したywaAFW2及びywaARV2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.0kb断片（A）、Cm耐性遺伝子領域（C）、1.0kb断片（B）の順に含まれる2.9kbのDNA断片（D）を得た。
【００７１】
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片（D）を用いて、MGB874株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェ二コール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってywaA遺伝子がCm耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、ywaA遺伝子欠失株（ΔywaA株）を構築した。
【００７２】
また上述した手順と同様に、Cm耐性遺伝子に置換することによりybgE遺伝子欠失株(ΔybgE株)及びbcd遺伝子欠失株(Δbcd株)を構築した。各菌株の構築には表２に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔywaA株の構築に用いたプライマーとの対応を表３に示した。
【００７３】
【表３】
【００７４】
〔実施例２〕
本実施例２では、二重欠失株ΔywaAΔybgE株、ΔywaAΔbcd株及びΔybgEΔbcd株を構築した。先ず、実施例１に示したywaA遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換方法と同様にして、ΔywaA株及びΔybgE株ゲノム中のbcd遺伝子のスペクチノマイシン耐性遺伝子による置換を行い、二重欠失株ΔywaAΔbcd株及びΔybgEΔbcd株を構築した。すなわち、枯草菌168株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したbcdFWとbcd/SpR、及びbcd/SpFとbcdRVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のbcd遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片(E)、及び下流に隣接する1.0kb断片(F)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpDG1727（Gene. 167:335-336(1995)）のスペクチノマイシン耐性遺伝子を鋳型とし、表２に示したspfとsprプライマーセットを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含む1.2kb断片(G)を調製した。次に、得られた(E)(F)(G)３断片を混合して鋳型とし、表２のプライマーbcdFW2とbcdRV2を用いたSOE-PCRを行うことによって、３断片を(E)(G)(F)の順になる様に結合させ、3.2kbのDNA断片(H)を得た。このDNA断片を用いてコンピテント法により実施例１にて得られたΔywaA株及びΔybgE株の形質転換を行い、スペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体としてそれぞれ分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってbcd遺伝子が欠失され、スペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、二重欠失株であるΔywaAΔbcd株及びΔybgEΔbcd株を構築した。
【００７５】
上述したΔywaA株の形質転換による二重欠失株のΔywaAΔbcd株の作成と同様に、ybgE遺伝子のネオマイシン耐性(Nm) 遺伝子による置換からΔywaAΔybgE株を作成した。この菌株の構築には表１に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔywaAΔbcd株の構築に用いたプライマーとの対応を表４に示した。また、Nmマーカーは、表２に示したrneofとrepUr-Nmとのプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpUB110（Plasmid 15, 93 (1986)）を用いて調製したrepU遺伝子プロモーター領域を含む0.4kb断片と、表２に示したNmUf-repとneorとのプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpUB110を用いて調製したネオマイシン耐性遺伝子の構造遺伝子領域を含む0.8kb断片とを混合して鋳型とし、表１に示したプライマーrneof及びneorを用いたSOE-PCRを行うことによって調製した。
【００７６】
【表４】
【００７７】
〔実施例３〕
本実施例３では、三重欠失株ΔywaAΔybgEΔbcd株を構築した。先ず、実施例２に調整したDNA断片(H)を用いて、コンピテント法により実施例２にて構築した二重欠失株ΔywaAΔybgE株の形質転換を行い、スペクチノマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってbcd遺伝子が欠失され、スペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、三重欠失株であるΔywaAΔybgEΔbcd株を構築した。
【００７８】
〔実施例４〕
本実施例４では、実施例１〜３で構築した枯草菌変変異株におけるアルカリセルラーゼ分泌生産性を評価した。
【００７９】
まず実施例１〜３にて得られた単独欠失株（ΔywaA株、Δbcd株及びΔybgE株）、二重欠失株（ΔywaAΔybgE株、ΔywaAΔbcd株及びΔybgEΔbcd株）、三重欠失株（ΔywaAΔybgEΔbcd株）及び対照としてMGB874株の異種タンパク質生産性評価として、バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。すなわち、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）断片（3.1 kb）をシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入した組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた菌株を10mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2×L-マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、細胞の密度として培養液のOD600を測定し、次に、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
【００８０】
セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。結果を表５に示す。
【００８１】
【表５】
【００８２】
表５に示したように、単独欠失株を宿主とした場合には、ywaA遺伝子が欠失した枯草菌変異株においてはアルカリセルラーゼの分泌生産性が向上していることが明らかとなった。これに対して、bcd遺伝子又はybgE遺伝子をそれぞれ単独で欠失した枯草菌変異株においては、アルカリセルラーゼの分泌生産性は親株であるMGB874株とほぼ同等であった。
【００８３】
また、二重欠失株を宿主とした場合にはΔywaAΔybgE株及びΔywaAΔbcd株においては、ΔywaA株と比較してアルカリセルラーゼの分泌生産性が更に向上していることが明らかとなった。これに対して、ΔybgEΔbcd株を宿主としても、アルカリセルラーゼの分泌生産性はMGB874株とほぼ同等であった。以上の結果から、bcd遺伝子及びybgE遺伝子については、単独で欠失させたとしてもタンパク質の生産性の点で影響はないが、ywaA遺伝子とともに欠失させることによって、ywaA遺伝子を単独で欠失させた変異株よりもタンパク質の生産性をより向上できるといった効果が判明した。
【００８４】
さらに、三重欠失株を宿主とした場合には、単独欠失株及び二重欠失株と比較してタンパク質の生産性が最も優れたものとなることが明らかとなった。すなわち、枯草菌MGB874株からywaA遺伝子、ybgE遺伝子及びbcd遺伝子の３つの遺伝子を欠失させた枯草菌変異株は、タンパク質を優れた生産性で製造することができることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を説明するための模式図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な枯草菌変異株及びタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
枯草菌は、グラム陽性菌のモデルとして広く分子生物学の研究に供されているのみならず、アミラーゼやプロテアーゼといった各種酵素の生産菌として発酵工業及び医薬品工業等に広く利用されている。日欧共同ゲノムプロジェクトにより、枯草菌ゲノムの全塩基配列が既に決定されているが、枯草菌ゲノムに存在する約4100種類の遺伝子に関する機能同定は完了していない。
【０００３】
現在まで、枯草菌ゲノムに存在する約4100種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研究され、271個の遺伝子が成育に必須であることが指摘されている（非特許文献１）。また、枯草菌において、L-バリン、L-イソロイシン及びL-ロイシンといった分岐アミノ酸は、代謝パスウェイによって分岐脂肪酸合成系の基質となるイソブチリル-CoA、2-メチルブチリル-CoA及びイソブチリル-CoAとなる。また、これらイソブチリル-CoA、2-メチルブチリル-CoA及びイソブチリル-CoAは、イソ酪酸、2-メチル酪酸及び吉草酸といった臭気の原因物質へと変換される。このような分岐鎖アミノ酸の代謝パスウェイに関与する酵素としては、例えば非特許文献２に開示されるように、ロイシン脱水素酵素及び分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼが同定されている。これらロイシン脱水素酵素及び分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼを欠損した枯草菌株においては、イソ酪酸、2-メチル酪酸及び吉草酸の生産量が顕著に低下し、臭気を低減できることが知られていた。
【０００４】
【非特許文献１】K. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 4678-4683, 2003
【非特許文献２】竹村ら、日本食品科学工学会誌、第47巻、第10号、2000年10月、第773〜779頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところが、微生物を用いてタンパク質を製造する際に、これらロイシン脱水素酵素及び分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼといった分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素が関与するといった知見はなかった。
【０００６】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、タンパク質の生産性に優れた枯草菌変異株を提供し、これを利用することによって生産性に優れたタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明者らは、所定の領域を欠失した枯草菌株において分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする１又は複数の遺伝子を欠失又は不活性化させることによってタンパク質の生産性が向上するといった知見を見いだし、発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明に係る枯草菌変異株は、枯草菌におけるprophage6 (yoaV-yobO)領域、prophage1 (ybbU-ybdE)領域、prophage4 (yjcM-yjdJ)領域、PBSX (ykdA-xlyA)領域、prophage5 (ynxB-dut)領域、prophage3 (ydiM-ydjC)領域、spb (yodU-ypqP)領域、pks (pksA-ymaC)領域、skin (spoIVCB-spoIIIC)領域、pps (ppsE-ppsA)領域、prophage2 (ydcL-ydeJ)領域、ydcL-ydeK-ydhU領域、yisB-yitD領域、yunA-yurT領域、cgeE-ypmQ領域及びyeeK-yesX領域からなる群から選ばれる１以上の遺伝子領域を欠失させたゲノム構造を有する枯草菌株から、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させたものである。
【０００９】
ここで、上記分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌由来のywaA遺伝子又はywaA遺伝子に対応する相同遺伝子を挙げることができる。
【００１０】
また、本発明に係る枯草菌変異株は、上記分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌由来のywaA遺伝子又はywaA遺伝子に対応する相同遺伝子の他に、枯草菌由来のbcd遺伝子、ybgE遺伝子及びこれら遺伝子に対応する相同遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子がさらに欠失又は不活性化されていることが好ましい。
【００１１】
さらに、本発明に係る枯草菌変異株は、上記枯草菌株と比較してタンパク質生産性が向上したものとなっている。
【００１２】
一方、本発明に係るタンパク質の製造方法は、上述した枯草菌変異株を培養し、菌体内及び/又は菌体外に目的とするタンパク質を産生するものである。特に、本発明に係るタンパク質の製造方法においては、上記枯草菌変異株を、分岐鎖アミノ酸を含有する培地において培養することが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、野生株や公知の変異株と比較して、タンパク質の生産性が優れた枯草菌変異株を提供することができる。本発明に係る枯草菌変異株を種々の物質生産に使用することによって、目的とするタンパク質の生産性を向上させることができる。
【００１４】
さらに、本発明により、野生株や公知の変異株を使用した場合と比較して生産性に優れたタンパク質の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において提供される新規な枯草菌変異株は、枯草菌の野生株から特定の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株（以下、親株と称する場合もある）に対して、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させたものである。特定の領域とは、prophage6 (yoaV-yobO)領域、prophage1 (ybbU-ybdE)領域、prophage4 (yjcM-yjdJ)領域、PBSX (ykdA-xlyA)領域、prophage5 (ynxB-dut)領域、prophage3 (ydiM-ydjC)領域、spb (yodU-ypqP)領域、pks (pksA-ymaC)領域、skin (spoIVCB-spoIIIC)領域、pps (ppsE-ppsA)領域、prophage2 (ydcL-ydeJ)領域、ydcL-ydeK-ydhU領域、yisB-yitD領域、yunA-yurT領域、cgeE-ypmQ領域及びyeeK-yesX領域を挙げることができる。すなわち、親株は、これら領域のうち少なくとも１領域、好ましくは２２以上の領域が欠失したゲノム構造を有していることが好ましい。また、親株は、これら全ての領域が欠失したゲノム構造を有することが最も好ましい。なお、これら全ての領域が欠失したゲノム構造を有する枯草菌は、特開２００７−１３００１３号公報においてMGB874株として開示されている。
【００１６】
各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。また、これら特定の領域は、表１のオリゴヌクレオチド・セットにより挟み込まれる領域として定義することもできる。
【００１７】
【表１】
【００１８】
表１に示した欠失領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えば図１に示す以下の方法を適用することができる。
【００１９】
すなわち、いわゆるSOE-PCR法（Gene,77,61 (1989)）によって調製される欠失用DNA断片を挿入した欠失用プラスミドを用いた２段階の１重交差法を用いる方法によって、表１に示した欠失領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる。本方法で用いる欠失用DNA断片は、欠失対象領域の上流に隣接する約0.1〜3kb断片（上流断片と称する）と、同じく下流に隣接する約0.1〜3kb断片が結合したDNA断片（下流断片と称する）とを連結したDNA断片である。また当該DNA断片の下流或いは上流にクロラムフェニコール耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカー遺伝子断片を結合させたDNA断片を用いることもできる。
【００２０】
まず、１回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに必要に応じて薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製する。この際、結合対象となるDNA断片の末端10〜30塩基対の配列を付加したプライマーを設計する。例えば、上流断片及び下流断片をこの順で結合させる場合、上流断片の下流末端に位置する（アニールする）プライマーにおける５’末端に、下流断片の上流側10〜30塩基に相当する配列を付加し、また下流断片の上流末端に位置する（アニールする）プライマーにおける５’末端に、上流断片の下流側10〜30塩基に相当する配列を付加する。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片及び下流断片を増幅した場合、増幅された上流断片の下流側には下流断片の上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片の上流側には上流断片の下流側に相当する領域が付加されることとなる。
【００２１】
次に１回目に調製した上流断片及び下流断片を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に位置する（アニールする）プライマー及び下流断片の下流側に位置する（アニールする）プライマーからなる1対のプライマーを用いて２回目のPCRを行う。この２回目のPCRにより、上流断片及び下流断片をこの順で結合した欠失用DNA断片を増幅することができる。
【００２２】
なお、欠失用DNA断片に薬剤耐性マーカー遺伝子断片を連結する場合には、１回目のPCRにおいて、下流断片の下流側に相当する領域を付加するように、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を増幅する。さらに2回目のPCRにおいて、上流断片の上流側に位置する（アニールする）プライマーと薬剤耐性マーカー遺伝子断片の下流側に位置する（アニールする）プライマーからなる一対のプライマーを使用する。これにより、上流断片、下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片の順で結合した欠失用DNA断片を増幅することができる。
【００２３】
また、上流断片及び下流断片をこの順で結合した欠失用DNA断片を2回目のPCRによって増幅した後、薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに欠失用DNA断片を挿入することで、上流断片、下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片をこの順で有する欠失用DNA断片を調製しても良い。
【００２４】
更に、上述の方法などによって得られる欠失用DNA断片を、通常の制限酵素とDNAリガーゼを用いて宿主菌内で増幅されないプラスミドDNA、又は温度感受性プラスミド等、容易に除去できるプラスミドDNAに挿入することによって、欠失導入用プラスミドを構築する。宿主菌内で増幅されないプラスミドDNAの例としては、例えば枯草菌を宿主とする場合、pUC18、pUC118、pBR322などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
次いで、欠失用プラスミドによる宿主菌の形質転換をコンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）などによって行い、プラスミドに挿入された上流断片或いは下流断片とゲノム上の相同領域間での１重交差の相同組換えによって欠失用プラスミドが宿主菌ゲノムDNA内に融合した形質転換体を得る。形質転換体の選択には欠失導入用プラスミドのクロラムフェニコール耐性遺伝子などのマーカー遺伝子による薬剤耐性を指標に行えば良い。
【００２６】
かくして得られる形質転換体のゲノム上には欠失すべきゲノム上の薬剤耐性遺伝子の上流領域及び下流領域の配列について、宿主菌ゲノム由来と欠失用プラスミドに由来するものが重複して存在している。この上流領域又は下流領域のうち、形質転換体を獲得する際に相同組換えした領域と異なる領域でゲノム内相同組換えを起こさせることにより、欠失用プラスミド由来の領域と共にゲノム上の薬剤耐性遺伝子など欠失すべき標的遺伝子の欠失が生じる。ゲノム内の相同組換えを起こさせる方法としては、例えばコンピテンスを誘導する方法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）が挙げられるが、単に通常の培地での培養中においても自然誘発的に相同組換えが生じる。目的通りにゲノム内相同組換えを起こした菌株は同時に薬剤耐性遺伝子を欠失して薬剤に対する耐性能を失うため、薬剤感受性となった菌株より選択することができる。こうした菌株からゲノムDNAを抽出し、PCR法などによって目的遺伝子の欠失を確認すれば良い。
【００２７】
目的の欠失株を選択する際、薬剤耐性から感受性に変化した菌株を直接選択することは難しく、またゲノム内での相同組換えは約10-4以下の低い頻度で生じるものと考えられる。そこで、目的欠失株を効率的に取得するためには薬剤感受性株の存在比率を高めるなどの工夫を施すことが望ましい。薬剤感受性株の濃縮方法としては、例えばアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質が、増殖細胞に対して殺菌的に作用し、一方、非増殖細胞には作用しないことを利用した濃縮法（Methods in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, (1970)）などが挙げられる。アンピシリンなどによる濃縮を行う場合、例えばテトラサイクリンやクロラムフェニコールなどの様に宿主細胞に対して静菌的に作用する薬剤に対する耐性遺伝子の欠失に関して有効である。こうした静菌的作用の薬剤を適量含む適当な培地において、当該薬剤耐性遺伝子を保持する耐性株は増殖可能であり、当該薬剤耐性遺伝子を欠失した感受性株は増殖も死滅もしない。この様な条件下において適当な濃度のアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質を添加して培養を行うと、増殖しようとする耐性株が死滅する一方、感受性株はアンピシリンなどの作用を受けず、結果として感受性株の存在比率が高まることになる。この様な濃縮操作を行った培養液を適当な寒天培地に塗抹、培養し、出現したコロニーのマーカー薬剤に対する耐性の有無をレプリカ法などによって確認することにより、効率的に感受性株を選択することが可能となる。
【００２８】
以上のようにして、本発明に係る枯草菌変異株の親株となる、ゲノム上の所定の領域を単独で欠失したゲノム構造を有する枯草菌株を製造することができる。さらに、複数の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株は、いわゆる、LP(lysis of protoplasts)形質転換方法によって製造することができる。LP形質転換法は、『T. Akamatsu及びJ. Sekiguchi, 「Archives of Microbiology」, 1987年, 第146巻, p.353-357』及び『T. Akamatsu及びH. Taguchi, 「Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry」, 2001年, 第65巻，第4号, p.823-829』を参照することで利用することができる。すなわち、LP形質転換法では、細胞壁を溶解させたプロトプラストを供与体DNAとして、レシピエント菌株のコンピテントセルに供与する。添加されたプロトプラストは浸透圧ショックにより破壊され、培養液中に放出された供与体DNAがレシピエント菌株のコンピテントセルに取り込まれるものと考えられている。また、LP形質転換方法によれば、一般的な形質転換方法に比べて、導入すべきDNAの損傷は大幅に軽減する。
【００２９】
このLP形質転換法を適用することによって、単独で欠失したゲノム構造を有する枯草菌株から複数の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株をあらたに製造することができる。具体的には、先ず、第１の欠失領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株をプロトプラスト化し、異なる領域を（第２の欠失領域）を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株のコンピテントセルと共存させる。これにより、第１の欠失領域を有するゲノムDNA（供与体DNA）と、第２の欠失領域を有するゲノムDNA（宿主DNA）との間で一組の鎖間交換構造を形成することとなる。この一組の鎖間交換構造が供与体DNAにおける第１の欠失領域を挟み込んだ位置で生じることによって、供与体DNAにおける第１の欠失領域が宿主DNAに導入されることとなる。このようにして、LP形質転換法を適用することによって、第１の欠失領域及び第２の欠失領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株を製造することができる。この方法を応用すれば、成育に必須な遺伝子を欠失しない限り、複数の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌株を製造することができる。以上のようにして、表１に示した領域を枯草菌ゲノム上から欠失させることができ、所望のゲノム構造を有する枯草菌株を作製することができ、本発明に係る枯草菌変異株の親株として使用することができる。
【００３０】
本発明に係る枯草菌変異株は、上述した親株から分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させたものである。ここで、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素とは、ロイシン、イソロイシン及びバリンといった分岐アミノ酸が脱アミノ化されて2-ケトイソ吉草酸、2-ケト-3-メチル吉草酸及び2-ケトイソカプロン酸に代謝される反応における、上記脱アミノ化を触媒する酵素を意味する。より具体的には、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素としては、枯草菌におけるywaA遺伝子によりコードされるYwaAタンパク質を挙げることができる。YwaAタンパク質は、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることがJ. Bacteriol., 185, 2418-2431 (2003)により明らかとなっている。
【００３１】
枯草菌由来のywaA遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、ywaA遺伝子によりコードされるYwaAタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、ywaA遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるYwaAタンパク質をコードするか、配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するYwaAタンパク質をコードするものであれば、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。ここで、上記複数個のアミノ酸とは、具体的には2〜30個、好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個、さらに好ましくは2〜5個を意味する。
【００３２】
また、ywaA遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して70％以上、80％以上または、90％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、特に好ましくは97％以上、より特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するYwaAタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、相同性の値は、複数のアミノ酸配列間の相同性を演算するソフトウェア（例えば、DANASYSやBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を意味する。
【００３３】
さらに、ywaA遺伝子としては、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドも含まれる。当該ポリヌクレオチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることとなる。
【００３４】
ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件下としては、例えば、相同性が高いDNA同士(例えば50％以上の相同性を有するDNA同士)がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。具体的に、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1％SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３５】
以上のように、本発明においては、配列番号２に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有していても、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするものであればywaA相同遺伝子として欠失又は不活性化の対象とすることができる。ywaA相同遺伝子が、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするか否かは従来公知の手法を適用して検証することができる。すなわち、検証対象のywaA相同遺伝子を発現する組み換え体を、分岐アミノ酸を基質として含有する培地にて培養する。培地に合成される2-ケトイソ吉草酸、2-ケト-3-メチル吉草酸或いは2-ケトイソカプロン酸の量が対照（野生株）と比較して有意に増加している場合には、検証対象のywaA相同遺伝子が分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードしていることが判る。
【００３６】
ywaA遺伝子（ywaA相同遺伝子も含む）を欠失又は不活性化させる方法としては、特に限定されず、如何なる方法を適用しても良い。一例としては、上述したSOE-PCR法（図１参照）を適用して親株のゲノムからywaA遺伝子を欠失させることができる。また、上述したSOE-PCR法により、ywaA遺伝子における特定の領域のみを欠失させてもよい。さらに、上述したSOE-PCR法により、ywaA遺伝子のプロモーター領域を欠失させることによって、ywaA遺伝子を不活性化させても良い。さらに、所謂、アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用した遺伝子発現抑制法を適用しても良いし、RNA干渉を利用した遺伝子発現抑制法を適用しても良いし、ハンマーヘッド型リボザイムを利用した遺伝子発現抑制法を適用しても良い。さらに、部位特異的突然変異導入法を適用して、ywaA遺伝子の所定の部位に突然変異を導入することで、不活性型のタンパク質を発現するように改変してもよい。
【００３７】
以上のように構成された本発明に係る枯草菌変異株は、上述した親株から分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を欠失又は不活性化している。本発明に係る枯草菌変異株は、枯草菌野生株や親株と比較してタンパク質生産性が向上しているといった特徴を示す。すなわち、本発明に係る枯草菌変異株に対して、所望の遺伝子を発現可能に導入することによって、当該遺伝子によりコードされるタンパク質の優れた生産性で菌体内外に産生することができる。生産される目的タンパク質としては、特に限定されず、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業に使用される産業用酵素や生理活性ペプチドなどが挙げられるが、特に産業用酵素であることが好ましい。産業用酵素には、機能別に分類すると、酸化還元酵素(Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)及び合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれる。この中でも、本発明の枯草菌変異株を用いて生産される目的タンパク質としては、好適には、セルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
【００３８】
目的タンパク質を導入した枯草菌変異株は、通常の培養方法を用いることができる。すなわち、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含む通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷん及びセルロースの加水分解物、糖蜜等の糖類、グリセロール、エタノール、ソルビトール等のアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸を用いることができる。窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物等の有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水、尿素等を用いることができる。有機微量栄養源として、ビタミン類、アミノ酸等の要求物質、又は、必要に応じて酵母エキス、コーンスティープリカー等を含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、銅イオン、鉄イオン、マンガンイオン等を添加することが望ましい。場合によっては、消泡剤等も添加される。
【００３９】
特に本発明に係る枯草菌変異株は、ywaA遺伝子によりコードされる分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼが欠失又は不活性化しているため、分岐アミノ酸の合成量が低下している虞がある。従って、本発明に係る枯草菌変異株を培養する培地としては、アミノ酸のうち少なくとも分岐アミノ酸を含有する培地を使用することが好ましい。
【００４０】
また、培地のpHは6.0〜8.0に調節することが適当であり、pHの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行えばよい。培養は、15〜45℃、好ましくは25〜45℃で、6〜96時間、更に好ましくは24〜72時間行い、必要により通気や攪拌を加えてもよい。なお、組換え枯草菌の場合は、培地のｐＨは用いる枯草菌が生育し得る範囲、例えば、pH6.0〜8.0に調整するのが好適である。また、培養条件は、15〜42℃、好ましくは28〜37℃で２〜４日間振盪、又は通気撹拌培養すればよい。
【００４１】
なお、セルラーゼの生産性は、一例として以下のようにして測定することができる。先ず、セルラーゼ遺伝子を有するベクターを用いて供試枯草菌変異株を形質転換する。次に、得られた形質転換体を培養した後、遠心分離等によって菌体を除いた培養液上清を得る。そして、得られた上清に基質として例えば、p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を添加し、所定時間反応させ、反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量する。これにより、供試枯草菌変異株に導入したセルラーゼ遺伝子にコードされるセルラーゼの生産性を測定することができる。なお、枯草菌168株等の標準野生株や親株におけるセルラーゼの生産性を同様に測定することで、供試枯草菌変異株におけるセルラーゼ生産性を相対値として評価することができる。
【００４２】
プロテアーゼの生産性は、一例として以下のようにして測定することができる。先ず、プロテアーゼ遺伝子を有するベクターを用いて供試枯草菌変異株を形質転換する。次に、得られた形質転換体を培養した後、遠心分離等によって菌体を除いた培養液上清を得る。そして、得られた上清に基質として例えば、Succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide (STANA ペプチド研究所)を添加し、所定時間反応させ、反応を行った際に遊離するp-ニトロアニリン量を420nmにおける吸光度変化(OD420nm)により定量する。これにより、供試枯草菌変異株に導入したプロテアーゼ遺伝子にコードされるプロテアーゼの生産性を測定することができる。なお、枯草菌168株等の標準野生株や親株におけるプロテアーゼの生産性を同様に測定することで、供試枯草菌変異株におけるプロテアーゼ生産性を相対値として評価することができる。
【００４３】
アルカリアミラーゼの生産性は、一例として以下のようにして測定することができる。先ず、アルカリアミラーゼ遺伝子を有するベクターを用いて供試枯草菌変異株を形質転換する。次に、得られた形質転換体を培養した後、遠心分離等によって菌体を除いた培養液上清を得る。そして、例えば、アミラーゼ活性測定キットであるリキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティック社)を使用して、上清に含まれるアルカリアミラーゼの活性を測定することができる。これにより、供試枯草菌変異株に導入したアルカリアミラーゼ遺伝子にコードされるアルカリアミラーゼの生産性を測定することができる。なお、枯草菌168株等の標準野生株や親株におけるアルカリアミラーゼの生産性を同様に測定することで、供試枯草菌変異株におけるアルカリアミラーゼ生産性を相対値として評価することができる。
【００４４】
本発明に係る枯草菌変異株に導入される目的タンパク質の遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域であるものが、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス（Bacillus）属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
【００４５】
より具体的には配列番号５１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号５２で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して70％以上、80％以上または、90％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、特に好ましくは97％以上、より特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質の構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
【００４６】
また、本発明に係る枯草菌変異株は、上述したywaA遺伝子とともに、枯草菌におけるbcd遺伝子及び/又はybgE遺伝子が欠失又は不活性化していることが好ましい。なお、bcd遺伝子及び/又はybgE遺伝子を欠失又は不活性化する手法は、上述したywaA遺伝子の欠失又は不活性化の手法を適用することができる。
【００４７】
bcd遺伝子は、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素であるロイシン脱水素酵素をコードすることが知られている（J. Bacteriol., 181, 2059-2066 (1999)）。bcd遺伝子の塩基配列を配列番号３に示し、bcd遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。なお、bcd遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるbcdタンパク質をコードするか、配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、ロイシン脱水素酵素活性を有するBcdタンパク質をコードするものであれば、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。ここで、上記複数個のアミノ酸とは、具体的には2〜30個、好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個、さらに好ましくは2〜5個を意味する。
【００４８】
また、bcd遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して70％以上、80％以上または、90％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、特に好ましくは97％以上、より特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、ロイシン脱水素酵素活性を有するBcdタンパク質をコードものであってもよい。ここで、相同性の値は、複数のアミノ酸配列間の相同性を演算するソフトウェア（例えば、DANASYSやBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を意味する。
【００４９】
さらに、bcd遺伝子としては、配列番号３に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ロイシン脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドも含まれる。当該ポリヌクレオチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ロイシン脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードすることとなる。
【００５０】
ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件であって例えば、上述した条件を含む意味である。
【００５１】
一方、ybgE遺伝子は、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素である分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードすることが知られている（J. Bacteriol., 185, 2418-2431 (2003)）。ybgE遺伝子の塩基配列を配列番号５に示し、ybgE遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。なお、ybgE遺伝子は、配列番号５に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるYbgEタンパク質をコードするか、配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するybgEタンパク質をコードするものであれば、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。ここで、上記複数個のアミノ酸とは、具体的には2〜30個、好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個、さらに好ましくは2〜5個を意味する。
【００５２】
また、ybgE遺伝子は、配列番号５に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して70％以上、80％以上または、90％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは96％以上、特に好ましくは97％以上、より特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有するを有するアミノ酸配列からなり、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するYbgEタンパク質をコードものであってもよい。ここで、相同性の値は、複数のアミノ酸配列間の相同性を演算するソフトウェア（例えば、DANASYSやBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を意味する。
【００５３】
さらに、ybgE遺伝子としては、配列番号５に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドも含まれる。当該ポリヌクレオチドは、配列番号６に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、分岐アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることとなる。ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件であって例えば、上述した条件を含む意味である。
【００５４】
上述したywaA遺伝子とともに、枯草菌におけるbcd遺伝子及び/又はybgE遺伝子が欠失又は不活性化した枯草菌変異株においては、タンパク質の生産性が更に向上することとなる。ここで、上述したbcd遺伝子及びybgE遺伝子のそれぞれを単独で欠失又は不活性化した枯草菌変異株は、枯草菌標準株や親株と比較してもタンパク質の生産性は同等である。しかしながら、ywaA遺伝子とともにbcd遺伝子及び/又はybgE遺伝子が欠失又は不活性化した枯草菌変異株においては、ywaA遺伝子が単独で欠失した枯草菌変異株と比較してタンパク質生産性が更に向上したものとなる。
【００５５】
特に、ywaA遺伝子及びbcd遺伝子の２つの遺伝子が欠失又は不活性化した枯草菌変異株並びにywaA遺伝子及びybgE遺伝子の２つの遺伝子が欠失又は不活性化した枯草菌変異株と比較すると、ywaA遺伝子、bcd遺伝子及びybgE遺伝子の３つの遺伝子が欠失又は不活性化した枯草菌変異体は、タンパク質の生産性が最も優れたものとなる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５７】
本実施例における“PCR法”、“枯草菌の形質転換法”及び“目的タンパク質生産用の培養法”は以下のように行った。
【００５８】
また、本実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
【００５９】
＜PCR法＞
PCRにはGeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いて行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μLとし、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmolとし、Pyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。
【００６０】
＜枯草菌の形質転換法＞
枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20％ 硫酸アンモニウム、1.40％ リン酸水素二カリウム、0.60％ リン酸二水素カリウム、0.10％ クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50％ グルコース、0.02％ カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20％ 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60％ リン酸二水素カリウム、0.10％ クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50％ グルコース、0.01％ カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
【００６１】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μLに各種DNA断片を含む溶液（SOE-PCRの反応液等）5μLを添加し、37℃で1時間振盪培養後、適切な薬剤を含むLB寒天培地（1％トリプトン、0.5％ 酵母エキス、1％ NaCl、1.5％ 寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするPCRによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
【００６２】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の宿主微生物への導入は、コンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）、エレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）、プロトプラスト形質転換法（Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)）のいずれかによって行った。
【００６３】
＜目的タンパク質生産用の培養法＞
組換え微生物によるタンパク質生産用の培養には、LB培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl）、2xYT培地（1.6％トリプトン、1％酵母エキス、0.5％NaCl）、2xL-マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物）、或いはCSL発酵培地（2％酵母エキス、0.5％コーンスティープリカー（CSL）、0.05％塩化マグネシウム七水和物、0.6％尿素、0.2％L-トリプトファン、10％グルコース、0.15％リン酸二水素ナトリウム、0.35％リン酸水素二ナトリウム、pH7.2）を用いた。
【００６４】
また、本実施例で使用したプライマーの名称及び塩基配列を表２に示す。
【００６５】
【表２】
【００６６】
〔実施例１〕
本実施例１では、枯草菌MGB874株のゲノム中からbcd、ywaA及びybgE遺伝子を単独で欠失した枯草菌変異株を構築した。なお、枯草菌MGB874株については、特開２００７−１３００１３号公報の実施例等を参照して、枯草菌標準株168株から当業者が容易に構築することができる。
【００６７】
本実施例では、図1に模式的に示したSOE-PCR法を適用して、MGB874株を用いてゲノム中ywaA遺伝子、bcd遺伝子及びybgE遺伝子を単独で欠失した枯草菌変異株を構築した。なお、ywaA遺伝子、bcd遺伝子及びybgE遺伝子は、枯草菌の分岐アミノ酸（L-バリン、L-ロイシン及びL-イソロイシン）の分解経路の最初ステップ及び生合成経路の最終ステップの酵素をコードする遺伝子である。
【００６８】
まず、ywaA欠失株の構築方法を説明する。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表２に示したywaAFW及びywaA/CmRのプライマーセットを用いて、ゲノム中のywaA遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、ywaA/CmF及びywaARVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のywaA遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片（B）をPCRにより増幅した。
【００６９】
さらに、プラスミドpC194(J. Bacteriol. 150(2), 815 (1982))DNAを鋳型とし、表２に示したcatf及びcatrのプライマーセットを用いて、0.9kbのクロラムフェ二コール（Cm）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
【００７０】
次に、図１に示すように、得られた1.0kb断片（A）、1.0kb断片（B）及びCm耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表２に示したywaAFW2及びywaARV2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.0kb断片（A）、Cm耐性遺伝子領域（C）、1.0kb断片（B）の順に含まれる2.9kbのDNA断片（D）を得た。
【００７１】
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片（D）を用いて、MGB874株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェ二コール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってywaA遺伝子がCm耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、ywaA遺伝子欠失株（ΔywaA株）を構築した。
【００７２】
また上述した手順と同様に、Cm耐性遺伝子に置換することによりybgE遺伝子欠失株(ΔybgE株)及びbcd遺伝子欠失株(Δbcd株)を構築した。各菌株の構築には表２に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔywaA株の構築に用いたプライマーとの対応を表３に示した。
【００７３】
【表３】
【００７４】
〔実施例２〕
本実施例２では、二重欠失株ΔywaAΔybgE株、ΔywaAΔbcd株及びΔybgEΔbcd株を構築した。先ず、実施例１に示したywaA遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換方法と同様にして、ΔywaA株及びΔybgE株ゲノム中のbcd遺伝子のスペクチノマイシン耐性遺伝子による置換を行い、二重欠失株ΔywaAΔbcd株及びΔybgEΔbcd株を構築した。すなわち、枯草菌168株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したbcdFWとbcd/SpR、及びbcd/SpFとbcdRVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のbcd遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片(E)、及び下流に隣接する1.0kb断片(F)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpDG1727（Gene. 167:335-336(1995)）のスペクチノマイシン耐性遺伝子を鋳型とし、表２に示したspfとsprプライマーセットを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含む1.2kb断片(G)を調製した。次に、得られた(E)(F)(G)３断片を混合して鋳型とし、表２のプライマーbcdFW2とbcdRV2を用いたSOE-PCRを行うことによって、３断片を(E)(G)(F)の順になる様に結合させ、3.2kbのDNA断片(H)を得た。このDNA断片を用いてコンピテント法により実施例１にて得られたΔywaA株及びΔybgE株の形質転換を行い、スペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体としてそれぞれ分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってbcd遺伝子が欠失され、スペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、二重欠失株であるΔywaAΔbcd株及びΔybgEΔbcd株を構築した。
【００７５】
上述したΔywaA株の形質転換による二重欠失株のΔywaAΔbcd株の作成と同様に、ybgE遺伝子のネオマイシン耐性(Nm) 遺伝子による置換からΔywaAΔybgE株を作成した。この菌株の構築には表１に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔywaAΔbcd株の構築に用いたプライマーとの対応を表４に示した。また、Nmマーカーは、表２に示したrneofとrepUr-Nmとのプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpUB110（Plasmid 15, 93 (1986)）を用いて調製したrepU遺伝子プロモーター領域を含む0.4kb断片と、表２に示したNmUf-repとneorとのプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpUB110を用いて調製したネオマイシン耐性遺伝子の構造遺伝子領域を含む0.8kb断片とを混合して鋳型とし、表１に示したプライマーrneof及びneorを用いたSOE-PCRを行うことによって調製した。
【００７６】
【表４】
【００７７】
〔実施例３〕
本実施例３では、三重欠失株ΔywaAΔybgEΔbcd株を構築した。先ず、実施例２に調整したDNA断片(H)を用いて、コンピテント法により実施例２にて構築した二重欠失株ΔywaAΔybgE株の形質転換を行い、スペクチノマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってbcd遺伝子が欠失され、スペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、三重欠失株であるΔywaAΔybgEΔbcd株を構築した。
【００７８】
〔実施例４〕
本実施例４では、実施例１〜３で構築した枯草菌変変異株におけるアルカリセルラーゼ分泌生産性を評価した。
【００７９】
まず実施例１〜３にて得られた単独欠失株（ΔywaA株、Δbcd株及びΔybgE株）、二重欠失株（ΔywaAΔybgE株、ΔywaAΔbcd株及びΔybgEΔbcd株）、三重欠失株（ΔywaAΔybgEΔbcd株）及び対照としてMGB874株の異種タンパク質生産性評価として、バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。すなわち、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）断片（3.1 kb）をシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入した組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた菌株を10mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2×L-マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、細胞の密度として培養液のOD600を測定し、次に、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
【００８０】
セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。結果を表５に示す。
【００８１】
【表５】
【００８２】
表５に示したように、単独欠失株を宿主とした場合には、ywaA遺伝子が欠失した枯草菌変異株においてはアルカリセルラーゼの分泌生産性が向上していることが明らかとなった。これに対して、bcd遺伝子又はybgE遺伝子をそれぞれ単独で欠失した枯草菌変異株においては、アルカリセルラーゼの分泌生産性は親株であるMGB874株とほぼ同等であった。
【００８３】
また、二重欠失株を宿主とした場合にはΔywaAΔybgE株及びΔywaAΔbcd株においては、ΔywaA株と比較してアルカリセルラーゼの分泌生産性が更に向上していることが明らかとなった。これに対して、ΔybgEΔbcd株を宿主としても、アルカリセルラーゼの分泌生産性はMGB874株とほぼ同等であった。以上の結果から、bcd遺伝子及びybgE遺伝子については、単独で欠失させたとしてもタンパク質の生産性の点で影響はないが、ywaA遺伝子とともに欠失させることによって、ywaA遺伝子を単独で欠失させた変異株よりもタンパク質の生産性をより向上できるといった効果が判明した。
【００８４】
さらに、三重欠失株を宿主とした場合には、単独欠失株及び二重欠失株と比較してタンパク質の生産性が最も優れたものとなることが明らかとなった。すなわち、枯草菌MGB874株からywaA遺伝子、ybgE遺伝子及びbcd遺伝子の３つの遺伝子を欠失させた枯草菌変異株は、タンパク質を優れた生産性で製造することができることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を説明するための模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌におけるprophage6 (yoaV-yobO)領域、prophage1 (ybbU-ybdE)領域、prophage4 (yjcM-yjdJ)領域、PBSX (ykdA-xlyA)領域、prophage5 (ynxB-dut)領域、prophage3 (ydiM-ydjC)領域、spb (yodU-ypqP)領域、pks (pksA-ymaC)領域、skin (spoIVCB-spoIIIC)領域、pps (ppsE-ppsA)領域、prophage2 (ydcL-ydeJ)領域、ydcL-ydeK-ydhU領域、yisB-yitD領域、yunA-yurT領域、cgeE-ypmQ領域及びyeeK-yesX領域からなる群から選ばれる１以上の遺伝子領域を欠失させたゲノム構造を有する枯草菌株から、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌変異株。
【請求項２】
上記分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子は、枯草菌由来のywaA遺伝子又はywaA遺伝子に対応する相同遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の枯草菌変異株。
【請求項３】
上記ywaA遺伝子は以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項２記載の枯草菌変異株。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
上記分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌由来のbcd遺伝子、ybgE遺伝子及びこれら遺伝子に対応する相同遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子がさらに欠失又は不活性化されていることを特徴とする請求項２又は３記載の枯草菌変異株。
【請求項５】
上記bcd遺伝子は以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項４記載の枯草菌変異株。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、ロイシン脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、ロイシン脱水素酵素活性を有するタンパク質
【請求項６】
上記ybgE遺伝子は以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項４記載の枯草菌変異株。
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項７】
上記遺伝子領域は、表１のオリゴヌクレオチド・セットにより挟み込まれる領域であることを特徴とする請求項１乃至６いずれか一項記載の枯草菌変異株。
【表１】
【請求項８】
上記枯草菌株と比較して、タンパク質生産性が向上していることを特徴とする請求項１乃至７いずれか一項記載の枯草菌変異株。
【請求項９】
目的のタンパク質をコードする遺伝子を有する、請求項１乃至８いずれか一項記載の枯草菌変異株を培養し、菌体内及び/又は菌体外に産生された上記タンパク質を回収することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
上記枯草菌変異株を、分岐鎖アミノ酸を含有する培地において培養することを特徴とする請求項９記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１】
枯草菌におけるprophage6 (yoaV-yobO)領域、prophage1 (ybbU-ybdE)領域、prophage4 (yjcM-yjdJ)領域、PBSX (ykdA-xlyA)領域、prophage5 (ynxB-dut)領域、prophage3 (ydiM-ydjC)領域、spb (yodU-ypqP)領域、pks (pksA-ymaC)領域、skin (spoIVCB-spoIIIC)領域、pps (ppsE-ppsA)領域、prophage2 (ydcL-ydeJ)領域、ydcL-ydeK-ydhU領域、yisB-yitD領域、yunA-yurT領域、cgeE-ypmQ領域及びyeeK-yesX領域からなる群から選ばれる１以上の遺伝子領域を欠失させたゲノム構造を有する枯草菌株から、分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌変異株。
【請求項２】
上記分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子は、枯草菌由来のywaA遺伝子又はywaA遺伝子に対応する相同遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の枯草菌変異株。
【請求項３】
上記ywaA遺伝子は以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項２記載の枯草菌変異株。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
上記分岐アミノ酸の脱アミノ酸反応に関与する酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌由来のbcd遺伝子、ybgE遺伝子及びこれら遺伝子に対応する相同遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子がさらに欠失又は不活性化されていることを特徴とする請求項２又は３記載の枯草菌変異株。
【請求項５】
上記bcd遺伝子は以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項４記載の枯草菌変異株。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、ロイシン脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、ロイシン脱水素酵素活性を有するタンパク質
【請求項６】
上記ybgE遺伝子は以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項４記載の枯草菌変異株。
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項７】
上記遺伝子領域は、表１のオリゴヌクレオチド・セットにより挟み込まれる領域であることを特徴とする請求項１乃至６いずれか一項記載の枯草菌変異株。
【表１】
【請求項８】
上記枯草菌株と比較して、タンパク質生産性が向上していることを特徴とする請求項１乃至７いずれか一項記載の枯草菌変異株。
【請求項９】
目的のタンパク質をコードする遺伝子を有する、請求項１乃至８いずれか一項記載の枯草菌変異株を培養し、菌体内及び/又は菌体外に産生された上記タンパク質を回収することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
上記枯草菌変異株を、分岐鎖アミノ酸を含有する培地において培養することを特徴とする請求項９記載のタンパク質の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１７１８８６（Ｐ２００９−１７１８８６Ａ）
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３０４３（Ｐ２００８−１３０４３）
【出願日】平成２０年１月２３日（２００８．１．２３）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２３日（２００８．１．２３）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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