早産の危険性を評価するためのバイオマーカーの同定および定量化
本明細書にて説明するのは、懐妊被験者での早産の危険性を評価するための方法である。この方法は、被験者由来の生物学的試料において早産関連の１種類以上のバイオマーカーを検出および定量化することを含む。また、本明細書にて説明するのは、早産の危険性を予測する際に有用な単離されたバイオマーカーおよびキットである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年７月２０日出願の米国仮特許出願第６０／９６１，４６６号ならびに、２００８年５月１日出願の米国仮特許出願第６１／０４９，６７６号の優先権の利益を主張するものである。これらの出願に記載の教示内容全体について、その全文を本明細書に援用する。
【０００２】
謝辞
本発明につながった研究では、一部にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｇｒａｎｔ Ｎｏｓ．Ｒ２１ＨＤ０４７３１９およびＵ０１ＨＤ０５００８０による資金援助を受けた。本発明は米国政府が一定の権利を有し得るものである。
【背景技術】
【０００３】
全体の１０％を超える妊婦に、早期分娩が影響をおよぼしている。また、早期分娩は新生児関連の疾患や死亡の主な原因のひとつでもある。満期産の赤ん坊と比べると、未熟児で生まれた乳児では新生児死亡率が４０倍高く、脳性麻痺、慢性呼吸器疾患、盲目、難聴などの主要な医学的合併症の危険性が大幅に増すこともある。さらに、出生児体重が１．５ポンド（約６８０グラム）未満の場合は７０％もの子どもに、長期にわたる神経障害や発達障害が確認されている。これらの合併症は、米国内だけでも年間数十億ドルの直接経費ならびに、いまだ実現されていない潜在性に関連していると推定されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
問題が深刻であるにもかかわらず、早期陣痛や分娩を生じる体内で何が起こっているのかについては、いまだはっきりしない要素がある。早産（ＰＴＢ）の原因に関する不確定要素があるがゆえに、こうした問題の効果的な治療のためにできることも限られているが、事前に適切な危険信号が得られれば、医療の専門家らが医療処置をほどこせることもある。どの妊婦が早産になりそうかを予測可能であれば、未熟分娩を遅らせる、あるいは防止できる薬剤を投与すればよいことがある。さらに、早産の危険性が早い段階で検出された場合に、母親を経由して胎児に投与すると、胎児肺成熟度を高めて早産に関連した主な合併症のひとつを減らせるホルモン誘導体が知られている。しかしながら、現時点では、どの妊婦にこうした妊娠合併症の発症の危険性があるかを知る方法はないように見受けられる。したがって、いまだ満たされていない重要な需要のひとつに、早産の危険性がある母親を早期に検出するための試験手順を策定することがある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書にて説明するのは、懐妊被験者において早産の危険性を評価するための方法である。この方法は、被験者から得た生物学的試料で早産関連の１種類以上のバイオマーカーを検出および定量化することを含む。早産を予測するのに有用なバイオマーカーについても詳細に説明する。本発明の利点の一部を以下の文中にて説明し、一部は文中から自明であろうし、あるいは後述する態様を実施することで習得できるものもある。後述する利点は、特に添付の特許請求の範囲に記載の要素と組み合わせによって実現および到達される。上記の概要および下記の詳細な説明はいずれも例示や説明目的のものにすぎず、限定的なものではない旨を理解されたい。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本化合物、組成物および／または方法について開示と説明をする前に、後述の態様は特定の化合物に限定されるものではなく、もちろん合成方法や使用法そのものも変わることがある旨を理解されたい。また、本明細書で用いる専門用語は特定の態様のみを説明する目的のものであり、限定を意図したものではない旨も理解されたい。
【０００７】
本明細書と、これに続く特許請求の範囲では、以下の意味を持つものとして定義するものとする多数の用語に言及する。
【０００８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その指示対象の複数形を含む（文脈から、そうでないことが明白な場合を除く）ことに注意されたい。よって、たとえば、「バイオマーカー」といえば、２種類以上のこのようなバイオマーカーの混合物を含むといった具合である。
【０００９】
「任意」または「任意に」とは、それに続けて説明する事象または状況が起こり得るまたは起こり得ないことを意味し、なおかつ、該当する事象または状況が発生する場合と、それが発生しない場合とを説明に含むことを意味する。
【００１０】
本明細書で使用する場合、「被験者」とは、早産の危険性があり、本明細書に記載の方法から恩恵を受ける妊婦を示す。
【００１１】
本明細書で使用する場合、「早産」とは、妊娠期間満期前に赤ん坊を分娩することを含む。たとえば、妊娠期間３７週未満での赤ん坊の分娩は、早産であるとみなされる。早産という用語は、早期分娩および未熟分娩と同義語である。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「バイオマーカー」という用語は、早産の危険性を予測する際に有用なさまざまな濃度で妊婦に存在する、天然に生じる生体分子を示すのに使用されることがある。たとえば、バイオマーカーは、早産の危険性のある被験者に、早産ではなかった被験者の同じバイオマーカーの量よりも多いまたは少ない量で存在するペプチドであってもよい。バイオマーカーは、生物学的アミンおよびステロイドなどであるがこれに限定されるものではない、小分子をはじめとするペプチド以外の他の分子を含み得る。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」という用語は、あるアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のαアミノ基とが結合された状態で２つ以上のアミノ酸を含む天然分子または合成分子を示すのに使用されることがある。このペプチドは長さで限定されるものではないため、「ペプチド」にはポリペプチドおよびタンパク質を含み得る。
【００１４】
本明細書で使用する場合、ペプチドに関しての「単離された」という表現は、ある物質が天然に生じるものである場合に、それを本来の環境から取り出したものを示す。たとえば、生きた動物での天然に生じるペプチドは単離されていないが、同じペプチドであっても、自然な系で共存するいくつかの物質またはすべての物質から分離した場合は、単離されたものである。このような単離されたペプチドは、組成物の一部であってもよく、その組成物が当該ペプチドの天然環境の一部ではないという意味で、依然として単離された状態にある。また、「単離された」ペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって合成または作製された物質も含む。
【００１５】
本明細書で使用する場合（Ａｓ ｕｓｅｄ ｈｅｒｅｉｎ）、「特異的免疫反応性」という用語は、生物学的試料またはペプチドと他の生物製剤の異種起源の個体群におけるペプチドの存在を決定するような、ペプチドと抗体との結合などの測定可能および再現可能な特異的免疫反応を示す。「特異的免疫反応性」という用語は、構造的な形態や表面の特徴の特異的認識を含むこともある。よって、表記の条件下において、特定のペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体は、試料中に存在する他のペプチドとは有意な量では結合しない。多岐にわたるイムノアッセイフォーマットを使用して、特定のペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体を判断することが可能である。たとえば、ペプチドとの間で特異的免疫反応性のモノクローナル抗体の選択に、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが日常的に用いられている。特異的免疫反応性を判断するのに使用可能なイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明については、たとえば、本明細書に援用するＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、特定の抗原に対して特異的免疫反応性の免疫グロブリンを示す。「抗体」という用語は、あらゆるアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の全抗体ならびにそのフラグメントを含むことを意図したものである。本明細書で使用する（ｓｕｅｄ）場合、「抗体」には抗体調製物も含む。従来技術において周知の多岐にわたる技法を用いて、検出可能な標識で抗体を標識してもよい。標識には、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素または酵素補因子あるいは従来技術において周知の他の標識が可能である。いくつかの態様では、目的のペプチドと結合する抗体を標識しなくてもよく、その代わり、一次抗体と特異的に結合する標識された二次抗体の結合によって検出してもよい。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「検出する」という表現は、１種類以上のバイオマーカー（たとえば、ペプチドおよび他の生体分子など）の検出不能な血清濃度、低血清濃度、正常な血清濃度または高血清濃度の定量的測定値を示す。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「定量化する」および「定量化」という表現は、同義に使用されることがあり、試料（バイオマーカーなど）中における物質の相対的または絶対的な量または存在量を判断するプロセスを示す。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「約」という表現は、所望の結果に影響することなく、特定の値が数値範囲の端点よりも「若干大きい」または「若干小さい」旨を示すことで端点に柔軟性を持たせるのに用いられる。
【００２０】
本明細書で使用する場合、複数の項目、構造的要素、構成要素および／または物質を便宜上共通の一覧で示すことがある。しかしながら、これらの一覧は、その一覧の各成員を別個かつ独特の成員として個々に特定したかのごとく解釈されるべきものである。よって、このような一覧の個々の成員はいずれも、単に共通の群に含まれているからというだけの理由で、同じ一覧の他の成員に対する事実上の等価物として解釈されることがない（逆のことが明記されている場合を除く）。
【００２１】
濃度、量および他の数値データは、本明細書では範囲形式で表現または提示されることがある。このような範囲形式は、単に便宜上かつ簡略化目的で用いられるものにすぎず、よって、範囲の上下限として明示された数値を含むだけでなく、その範囲内に包含される個々のすべての数値または部分範囲も、これらの数値および部分範囲を各々明示したのと同じように含むものと柔軟に解釈される点を理解されたい。実例として、「約１から約５」という数値の範囲は、明示された値である約１から約５を含むだけでなく、表記の範囲内の個々の値および部分範囲も含むものと解釈されるべきものである。よって、この数値の範囲に含まれるのは、２、３および４などの個々の値と、１〜３、２〜４、３〜５などの部分範囲ならびに、１、２、３、４、５各々である。これと同じ原理が、最小値または最大値として１つの数値だけを示している範囲にも適用される。さらに、このような解釈は、範囲の幅または説明されている特徴とは関係なく適用されるものとする。
【００２２】
本明細書で説明するのは、早産の危険性のある懐妊被験者を識別するための方法である。早産の危険性があり得る妊娠初期から中期の懐妊被験者を識別するのに利用できる特定のバイオマーカーが同定されている。このようなマーカーを用いると、早産と類似の症候を呈する他の症状とを診断で区別できることがある。早産の危険性の高い被験者を早期に識別できれば、このような被験者を一層詳しく観察できるため、そうすることにはかなりの価値があろう。
【００２３】
本明細書に記載の方法を用いての懐妊被験者の検査は、早産を示すバイオマーカーを被験者で定量可能であれば、妊娠中のどの時点でも起こり得る。たとえば、一態様において、妊娠期間の約２０週目から約３４週目にバイオマーカーを検査してもよい。もうひとつの態様では、妊娠期間の約２４週目から約３２週目にバイオマーカーを試験してもよい。ただし、このような検査は妊娠中のどの時点でも実施できるため、上記の範囲が限定的なものとみなされるべきではない点に注意されたい。むしろ、これらの範囲は、大半の被験者でこのような検査がなされる可能性の最も高い妊娠周期の期間を示すためのものである。
【００２４】
早産の危険性のある被験者を識別する上で有用なバイオマーカーとして、さまざまなペプチドおよび他の生体分子がある。本明細書に記載の技法および方法を用いて、早産の出現率と相関する特定のペプチドおよび他の生体分子が同定されている。これらのペプチドおよび他の生体分子のうちの１種類以上を定量化することで、被験者にとっての早産の危険性を示す指標になるため、予防治療の機会を与えることができる。早産合併症を予測可能なバイオマーカーであれば、どのようなものであっても本発明の特許請求の範囲の範囲に包含されるものとみなされる点に注意されたい。しかしながら、一態様において、早産合併症に関連するバイオマーカーの非限定的な例としては、対照被験者（すなわち、早産合併症を経験しなかった妊婦）と比較して、ｐ（確率）値＜０．０２をカットオフとした場合に統計的に異なる（ｐ≦０．０１）ことが分かっている生体分子およびペプチドがあげられる。しかしながら、もうひとつの態様では、早産関連のペプチドの非限定的な例として、アミノ酸配列ＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号１）、ＮＶＨＳＡＧＡＡＧＳＲＭＮＦＲＰＧＶＬＳＳＲＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号２）、ＮＶＨＳＡＧＡＡＧＳＲＭ(O)ＮＦＲＰＧＶＬＳＳＲＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号３）（Ｍ(O)は酸化メチオニンを示す）、ＮＶＨＳＧＳＴＦＦＫＹＹＬＱＧＡＫＩＰＫＰＥＡＳＦＳＰＲ（配列番号４）を有するペプチドがあげられる。
【００２５】
国際公開第２００８／０７９４０７号パンフレット（本出願内にて、あらゆる目的でその内容全体を本明細書に援用する）に開示されているような、バイオマーカーを同定するのに用いられるプロテオミクス技術を使用して、懐妊被験者における早産の危険性を評価するためのバイオマーカーを同定および定量化することが可能である。一態様では、潜在的な早産について懐妊被験者を検査するための方法が、対照（すなわち、早産を経験しない妊婦におけるバイオマーカーの相対濃度または量）と比較して、生物学的試料中に存在する、早産関連の１種類以上のバイオマーカーの濃度または量の差を検出することを含むものであってもよい。一態様では、プロテオミクスシステムおよび方法を使用して、バイオマーカーを同定および定量化することが可能である。たとえば、異なる生物学的試料由来の複数の質量スペクトルを比較し、非生物学的変動を補償するためのアプローチを使用した後に定量的に異なる質量イオンの位置を特定し、目的のバイオマーカーを単離し、キャラクタライズすることを、本明細書では使用できる。このような方法は、複数の生物学的試料を各々分画して複数の溶出画分を生成し、複数の溶出時間に複数の溶出画分各々から複数の質量スペクトルを取得し、生物学的試料間で定量的に異なるように見える目的の分子イオンピークを見つけることを含むものであってもよい。この方法はさらに、生物学的試料間で実質的に一貫している内因性参照分子であって、溶出時間と質量対電荷比が目的のピークと実質的に類似する内因性参照分子に対応する質量スペクトルの参照ピークを同定し、目的のピークを内因性参照分子の質量スペクトルピークに正規化することで複数の溶出画分での各生物学的試料の非生物学的変化を補償することを含むものであってもよい。この方法はさらに、複数の衝突エネルギの各々を一度に一回ずつ使用する衝突誘起フラグメンテーション研究を実施し、得られた複数のフラグメントイオン質量スペクトルを平均せずに合計し、単一の娘フラグメント累積質量スペクトルを形成するとともに、娘フラグメントの質量スペクトルを用いてアミノ酸配列データを構築し、その後これをアライメントされた単一の質量スペクトルにおける目的のピークに対応するペプチドの同定に使用することを含むものであってもよい。
【００２６】
もうひとつの態様では、複数の溶出時間に複数の溶出画分各々から複数の質量スペクトルを取得し、複数の溶出画分各々で溶出される内因性アライメント分子に対応する質量スペクトルのアライメントピークを同定しつつ、目的のバイオマーカーを含有する生物学的試料を分画して、複数の溶出画分を生成することが可能である。この方法はさらに、複数の溶出画分各々からの質量スペクトルのアライメントピークをアライメントすることで、各溶出画分からの複数の質量スペクトルをアライメントし、アライメントされた複数の質量スペクトルを合計してアライメントされた単一の質量スペクトルを生成し、アライメントされた単一の質量スペクトルにおける目的のピークに対応するペプチドを同定することを含むものであってもよい。さまざまな技法が企図されるが、一態様では、複数の質量スペクトルをアライメントすることが、複数の質量スペクトルを可視的にアライメントすることをさらに含むものであってもよい。また、複数の生物学的試料に存在する複数の生体分子各々を分画することは、たとえば、キャピラリー液体クロマトグラフィ（ｃＬＣ）などの多数の方法で実現できるものである。具体的な方法と、本明細書に記載するバイオマーカーを検出および定量化するためのパラメータについては、実施例にあげておく。
【００２７】
バイオマーカーを検出および定量化するのに用いられるプロテオミクス技術では、標本のローディング、イオン化効率および質量分析計の感度の差を補正するのに使用可能な内部対照として機能する、あらゆる血清に含まれる分子を利用する。上述の説明に加えて、あるピークが比較群間で定量的に同様である旨を示すことができ、候補バイオマーカーと同じ溶出ウィンドウのカラムから溶出し、その質量対電荷比が候補バイオマーカーのものと同様であり、すべての標本がノイズレベルの３倍を超える量になるほど十分に豊富である場合は、そのピークが参照として選択される。本明細書に記載の参照ピークは、標本の処理、クロマトグラフィでのローディング、イオン化効率または機器の感度の変動に関連しているが、ピーク量の生物学的な差によるものではない、ピークの高さまたは面積の定量補正用である。この参照を内部定量対照と呼ぶ。他の態様では、外部対照を用いてバイオマーカーの定量化を容易にすることが可能である。この態様では、バイオマーカーと対照との比を計算できるように、周知の量の化合物を生物学的試料に加えることが可能である。この比を求めたら、早産の危険性を評価するために対照試料での比と比較すればよい。
【００２８】
上述したように、早産の予測因子として４つのバイオマーカー（配列番号１〜４）が同定されている。内部定量対照については、バイオマーカーの定量化に使用したバイオマーカー配列番号１（ｍ／ｚ６７７）に使用した。参照（すなわち内部対照）は、モノアイソトピックピークの＋３荷電状態でのｍ／ｚが６７３．３６であった。中性の親質量は２０１７．０７質量単位であり、クロマトグラフィの溶出時間は１５．５分であった。しかしながら、日によって、あるいは置換カラムごとに溶出時間が若干変化することを考えれば、溶出時間は、その内部時間対照に対する溶出時間の割合（０．９９６８、すなわち内部時間対照よりも保持時間の０．００３２倍早く溶出する）ならびに、実際のバイオマーカー配列番号１（ｍ／ｚ６７７）と比較した溶出時間の割合（１．０５５８、すなわちバイオマーカーよりも自らの溶出時間の０．０５２８６早く溶出する）として得られる。
【００２９】
第２の内部定量対照は、２つのバイオマーカーすなわち配列番号２（ｍ／ｚ８５７）と配列番号３（ｍ／ｚ８６０）の参照として機能した。参照分子のｍ／ｚは、＋５荷電状態で８４２．３９であり、中性の親質量は４２０６．０７質量単位であった。クロマトグラフィの溶出時間は１５．８分前後であった。しかしながら、溶出時間のばらつきを考えれば、その溶出時間は内部時間対照およびバイオマーカー配列番号２（ｍ／ｚ８５７）の溶出時間との関連で一層適切に説明される。内部時間対照との関連で、内部定量対照は、内部時間対照の溶出画分の後で自らの溶出時間の０．０１５９倍の溶出時間（または時間対照マーカーの比１．０１６１）で溶出された。配列番号２（ｍ／ｚ８５７）のバイオマーカーとの関連で、内部定量マーカーは、バイオマーカー後に自らの溶出時間の０．０５３９倍（またはバイオマーカーの溶出時間の１．０７００）となった。
【００３０】
バイオマーカー配列番号４（ｍ／ｚ７９５）に用いられる参照は、モノアイソトピックピークの＋１荷電状態でのｍ／ｚが５９５．３であった。中性の親質量は５９４．３２質量単位であり、クロマトグラフィの溶出時間は１８．８分であった。しかしながら、日によって、あるいは置換カラムごとに溶出時間が若干変化することを考えれば、溶出時間は、先行（１４３５．２）および後続（２００９．９５）する２つの内部時間対照に対する溶出時間の割合として得られる。すなわち、２つの境界にある時間アライメントマーカーによって指定される期間中ずっと０．６０７で溶出する。
【００３１】
個々の質量は溶出時間（保持時間）で定義できるものであるが、この溶出時間（保持時間）を内部時間対照の関数として表すことも可能である。これは、バイオマーカーに先行するタイムメーカー（ｔｉｍｅ ｍａｋｅｒ）と目的のピークに続く時間マーカーとの間の目的のピークの相対位置によって求められる。こうして求めたものをＲf値と見なす。Ｒf値は、以下のようにして算出される。
Ｒf＝（バイオマーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）／（後続の時間マーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）。
【００３２】
上述した技法を使用して、早産のインジケーターとして４つのバイオマーカーを同定している。バイオマーカーの同定と定量化に関する具体的な詳細については、実施例にあげておく。各バイオマーカーの別の構造特性を以下に示す。第１のバイオマーカー（「配列番号１」）は、ペプチドであり、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）が６７７、平均質量２０２６．９８ダルトン、平均溶出時間１４．３０±０．４７分、Ｒf値０．５３５±０．０５２である。配列番号１を本明細書では「バイオマーカー１」とも呼ぶ。
【００３３】
第２のバイオマーカー（配列番号２）は、ペプチドであり、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）８５７、平均質量４２７９．２５ダルトン、平均溶出時間１７．２０±２．０４分、Ｒf値０．７８１±０．０８６である。配列番号２を本明細書では「バイオマーカー２」とも呼ぶ。
【００３４】
第３のバイオマーカー（配列番号３）は、ペプチドであり、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）８６０、平均質量４２９５．２５ダルトン、平均溶出時間１６．１３±１．９７分、Ｒf値０．６９５±０．１３４である。配列番号３を本明細書では「バイオマーカー３」とも呼ぶ。
【００３５】
第４のバイオマーカー（配列番号４）は、ペプチドであり、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）７９５、平均質量３９６８．９６ダルトン、平均溶出時間１５．５２±０．１５分、Ｒf値０．０２５２±０．０２１である。配列番号４を本明細書では「バイオマーカー４」と呼ぶ。
【００３６】
したがって、潜在的な早産について懐妊被験者を評価するための方法が得られる。一態様では、この方法は、被験者由来の生物学的試料における早産関連の本明細書に記載の少なくとも１つのバイオマーカーであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４で表される配列と同一または相同的なアミノ酸配列を有する少なくとも１つのバイオマーカーを検出し、生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの存在量を定量化することを含む。バイオマーカーの存在量は、内部対照として機能する、同じく生物学的試料に存在する参照分子の関数として、処理および分離後に測定される。「存在量」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の質量スペクトルで質量分析計にて測定した特定の質量のイオン数あるいは、全溶出間隔を表している複数の質量スペクトルで観察される特定の質量のイオン数の合計を表す。この内部対照に対してバイオマーカー存在量を正規化することで、非生物学的なばらつきが減り、危険性予測においてバイオマーカーを利用する機能が改善される。言い方を変えれば、ある被験者から別の被験者に比較的一定の存在量で生物学的試料に存在する参照に対して分子を選択することで、長期間のうちには広がる場合もある異なる日に実施した結果を比較する場合は特に、生物学的試料のプロセシングの変動性を補正できる。それ自体、バイオマーカーの相対存在量は、関与する特定のバイオマーカーに応じて変わることがある。したがって、バイオマーカーのピーク存在量と特定の値分だけ大きいまたは小さい参照ピーク存在量との比で実質的に早産の危険性が高いことを予測できるように、バイオマーカー／参照比ごとに特定のカットオフ値を確立してもよい。
【００３７】
被験者由来の生物学的試料における１種類以上のバイオマーカーの存在量と、正常分娩を示すこれらの同じバイオマーカーの既知の存在量とを比較することで、潜在的な早産の検査を実現してもよい。一態様では、被験者で配列番号１の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約５０％未満であると、早産が起こり得る。もうひとつの態様では、被験者で配列番号１の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約３０％未満であると、早産が起こり得る。さらに別の態様では、被験者で配列番号１の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約１０％未満であると、早産が起こり得る。
【００３８】
もうひとつの態様では、被験者で配列番号２の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約５０％未満であると、早産が起こり得る。もうひとつの態様では、被験者で配列番号２の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約３０％未満であると、早産が起こり得る。さらに別の態様では、被験者で配列番号２の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約１０％未満であると、早産が起こり得る。
【００３９】
別の態様では、被験者で配列番号３の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約５５％未満であると、早産が起こり得る。もうひとつの態様では、被験者で配列番号３の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約３５％未満であると、早産が示唆され得る。さらに別の態様では、被験者で配列番号３の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約１５％未満であると、早産が起こり得る。
【００４０】
さらに別の態様では、被験者で配列番号４の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約５０％未満であると、早産が起こり得る。もうひとつの態様では、被験者で配列番号４の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約３０％未満であると、早産が示唆され得る。さらに別の態様では、被験者で配列番号４の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約１０％未満であると、早産が起こり得る。
【００４１】
目的のバイオマーカーを含み得るものであれば、どのようなタイプの生物学的試料をスクリーニングしてもよく、非限定的な例として、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、頸膣液、洗浄液、組織、これらの組み合わせがあげられる。
【００４２】
バイオマーカー１〜４は大半の妊婦に存在するが、早産に至る妊婦の多くは、正常分娩の女性と比較して妊娠中に上記の生体分子のうちの１種類以上の血中血清濃度が低い。たとえば、ＰＴＢの症例では、バイオマーカー１〜４単独または全体が対照より少なかった。よって、早産を経験しなかった被験者から得た既知の対照濃度あるいは、検査対象被験者から得た既知のバイオマーカー濃度に対して、被験者由来の生物学的試料におけるこれらのバイオマーカーのうちの１種類以上の存在量を比較することで、早産を予測できることがある。これらのバイオマーカーのうちの１種類以上の存在量が高めまたは低めの被験者のほうが、早産の危険性が高いことがあり、よって、適切な処置ができるだけの十分に早い段階で識別可能である。早産の予測にあたっての特定のバイオマーカーの存在量については、下記にて詳細に説明する。
【００４３】
一態様では、早産被験者と対照被験者のバイオマーカーの存在量を算出するために、ｌｏｇ比を取った。たとえば、ｌｏｇ比ｌｏｇ６７６．７／６７３．３６（バイオマーカー１／参照ピーク）では、対照平均０．５７９±０．１０１、ＰＴＢ平均−０．０１５±０．０９０となった。ｌｏｇ比ｌｏｇ８５６．８／８４２．８（バイオマーカー２／参照ピーク）では、対照平均（早産を経験しなかった被験者）０．２３１±０．１０２、ＰＴＢ平均（早産の危険性のある被験者）−０．１４９±０．０９５（実施例の表４）となった。実施例の表４を参照して、他のバイオマーカーのｌｏｇ比を算出した。ｌｏｇ比ｌｏｇ８６０．０／８４２．８（バイオマーカー３／参照ピーク）では、対照平均０．２０１±０．０９６、ＰＴＢ平均−０．２０４±０．０８８となった。ｌｏｇ比ｌｏｇ７９４．８／５９５．３（バイオマーカー４／参照ピーク）では、対照平均０．５８２±０．６３７、ＰＴＢ平均０．２７４±０．６５６となった。言い方を変えれば、早産の危険性のある被験者では、バイオマーカー１の減少、バイオマーカー２の減少、バイオマーカー３の減少、バイオマーカー４の減少が、個々にまたは全体で認められる可能性が最も高い。
【００４４】
この説明を念頭において、一態様では、配列番号１（ｍ／ｚ６７７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ６７３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約１．０未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。もうひとつの態様では、配列番号１（ｍ／ｚ６７７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ６７３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．８未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。さらに別の態様では、配列番号１（ｍ／ｚ６７７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ６７３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．６未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。
【００４５】
さらに、一態様では、配列番号２（ｍ／ｚ８５７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．６未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。もうひとつの態様では、配列番号２（ｍ／ｚ８５７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．５未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。さらに別の態様では、配列番号２（ｍ／ｚ８５７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．４４未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。
【００４６】
また、一態様では、配列番号３（ｍ／ｚ８６０）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．６未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。もうひとつの態様では、配列番号３（ｍ／ｚ８６０）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．４未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。さらに別の態様では、配列番号３（ｍ／ｚ８６０）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．２未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。
【００４７】
別の態様では、配列番号４（ｍ／ｚ７９５）のと参照分子のｍ／ｚ５９５での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．６未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。もうひとつの態様では、配列番号４（ｍ／ｚ７９５）の存在量と参照分子のｍ／ｚ５９５での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．４未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。さらに別の態様では、配列番号４（ｍ／ｚ７９５）の存在量とｍ／ｚ５９５での参照分子の存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．２未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。
【００４８】
特定の態様では、上記にて算出したｌｏｇ比を使用して、早産する危険性のある妊婦における危険性を統計的に予測するようにしてもよい。バイオマーカーの予測力についての一般的な尺度の一つが、その敏感度と特異度である。「敏感度」とは、本明細書で使用する場合、真陽性率（たとえば、バイオマーカーで正しく識別された、後に早産した妊婦の比率）として定義される統計用語である。「特異度」という用語は、本明細書で使用する場合、真陰性率（たとえば、正しく識別された、妊娠に合併症を併発しない妊婦の比率）として定義される。本明細書に記載したようにして早産の予測にバイオマーカーを使用するには、数字での閾値を設定する。数字での閾値を設定するには、特定のバイオマーカーに対する値の範囲を、最小から最大まで考慮し、それぞれの点で正しく陽性と識別された被験者の割合と、その同じ点で誤って陽性と識別された対照の割合を考慮する。特定のバイオマーカーの値の範囲については、具体的なデータセットに対する最小から最大までの実際の定量値を取ることで算出すればよい。これを受診者動作特性曲線（ＲＯＣ）と呼ぶ。一態様では、偽陽性率を、一般に臨床試験で許容できる最大値とされる２０％までに制限することが可能である。真陰性率を１００％から差し引けば、偽陽性率（すなわち、バイオマーカーでは早産の危険性があると識別されたが、妊娠に合併症を併発しない女性の比率）が算出される。偽陽性率２０％以下での閾値（特異度８０％以上と等価である）によって、ある人に危険性があるか危険性がないかを判断するのに用いられる閾値が決まることになる。
【００４９】
実施例の表５を参照すると、早産の危険性のある被験者を識別するために、４つのｌｏｇ比それぞれの閾値を求めた。それぞれの閾値については、特異度（真陰性率）が８０％以上（偽陽性率２０％以下と同じことである）になるようにして算出した。数学的に求めた閾値を使用して、４つの比で独立して敏感度（真陽性）と特異度（真陰性）の率（表５）を得た。表５を参照すると、早産の予測に関してはバイオマーカー１／参照ピークの比で敏感度（６５％）と特異度（８５％）が最大であった。よって、この態様では、妊婦に存在するバイオマーカー１の同定および定量化が、早産に至る尤度を示す正確な予測因子のひとつである。バイオマーカー１／参照ピークの比は有用であるが、ｌｏｇ比の組み合わせを使用して早産の危険性を予測することも可能である旨が企図される。よって、本明細書にて同定するバイオマーカーは、早産の危険性を予測する際の強力な道具である。
【００５０】
本明細書に記載のバイオマーカーは、早産を予測できるものである。しかしながら、場合によっては、複数のバイオマーカーに対するスクリーニングと定量化で、早産検査の予測値を改善できることがある。一態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４で表される配列と同一または相同のアミノ酸配列を有する少なくとも２つのバイオマーカーについて、被験者由来の生物学的試料をスクリーニングしてもよい。もうひとつの態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４で表される配列と同一または相同のアミノ酸配列を有する少なくとも３つのバイオマーカーについて、被験者由来の生物学的試料をスクリーニングしてもよい。検査のタイプまたは利用するアッセイによって予測値が変わることもあり、このうちのいくつかをさらに詳細に後述する。評価することで、複数（すなわち２つ以上）のバイオマーカーの存在と量を評価することで、早産を予測するにあたって有用な明確な特徴を生成することが可能である。たとえば、少なくとも２つのバイオマーカーを判断して定量化することで、本明細書に記載の方法の予測値を高めることが可能である。ＰＴＢを発症する女性がわずかしか含まれないこともあるが、これは早産に至る危険性を一層よく示している。目的のペプチドを含み得るものであれば、どのようなタイプの生物学的試料をスクリーニングしてもよく、非限定的な例として、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、頸膣液、洗浄液、組織、これらの組み合わせがあげられる。しかしながら、一態様では、被験者から得た血清試料中のペプチドをスクリーニングすると都合がよいことがある。もうひとつの態様では、被験者から得た血液試料中のペプチドをスクリーニングすると都合がよいことがある。
【００５１】
また、本明細書には、懐妊被験者が早産に至る確率を予測するのに利用できる、単離されたペプチド（すなわちバイオマーカー）ならびに、単離されたペプチドの混合物も記載されている。このようなペプチドは、多くの検査アッセイでの陽性対照として有用なことがあり、抗体の生成に有用なこともある。一態様では、たとえば、単離されたペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４で表される配列と同一または相同なアミノ酸配列を有するものであればよい。ペプチド合成は従来技術において周知であり、当業者であれば、ペプチド配列が分かれば本明細書に開示のペプチドを合成するための多岐にわたる技術を利用できるであろうことを理解されたい。このような技術として数例をあげると、液相合成法および固相合成法ならびに、前チオール捕捉（ｐｒｉｏｒ ｔｈｉｏｌ ｃａｐｔｕｒｅ、ネイティブ化学ライゲーション、発現タンパク質ライゲーション、アシル開始捕捉（ａｃｙｌ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｃａｐｔｕｒｅ）、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションなどのさまざまな化学ライゲーション法などのさまざまな方法があるが、これに限定されるものではない。また、組換えＤＮＡ技術を用いてペプチドを合成してもよい。
【００５２】
特定の態様では、上述したプロテオミクス技術を使用して、バイオマーカーを同定および定量化することが可能である。しかしながら、本明細書では、生物学的試料のバイオマーカーを検出および／または定量化できる他の方法を用いることが可能である。潜在性のある一タイプのペプチドアッセイとして、イムノアッセイがある。同種および非同種ならびに、競合および非競合的な方法をはじめとして、特定のペプチドに対する生物学的試料のスクリーニングに抗体を用いる多数のイムノアッセイプロトコールが周知である。たとえば、このような技術は、固相支持体、免疫沈降などの使用を含むことがある。しかしながら、通常、ペプチド検出用のイムノアッセイでは標識抗体の使用が必要になることが多い。このような標識は、周知のどのようなタイプの物質を含むものであってもよく、一例として、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識などがあげられる。このようなイムノアッセイ検査自体は従来技術において周知であり、生物学的試料におけるペプチドの検出に利用する特定の方法は、本発明の特許請求の範囲に記載の範囲を限定するものとはみなされないものとする旨を理解されたい。イムノアッセイについては、下記にてさらに説明する。
【００５３】
他の態様では、本明細書に記載のバイオマーカーに対して特異的免疫反応性の抗体を利用できる。一態様では、たとえば、配列番号１からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な抗体が得られる。もうひとつの態様では、配列番号２からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な抗体が得られる。さらに別の態様では、配列番号３からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な抗体が得られる。さらに別の態様では、配列番号４からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な抗体が得られる。
【００５４】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体であってもよく、従来技術において周知のどのような方法で作製してもよいものである。抗体フラグメントも本発明の範囲に包含されるものとする。本発明の態様による抗体は、鳥類および哺乳動物を含むどのような動物起源のものであっても構わない。一態様では、たとえば抗体が、ヒト、ネズミ科動物（マウスおよびラットなど）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、ニワトリなどに由来するものであってもよい。
【００５５】
一態様では、ポリクローナル抗体を利用して、生物学的試料における本明細書に記載の１種類以上のバイオマーカーを検出および定量化し、早産の危険性を評価してもよい。ポリクローナル抗体は、当業者間で周知のさまざまな手法で作製可能なものである。たとえば、ウサギ、ラット、マウス、ヒツジ、ヤギなどのｉｎ ｖｉｖｏ宿主動物でポリクローナル抗体を作製してもよい。宿主動物については、遊離ペプチドまたはキャリア結合ペプチドを用いて、たとえば腹腔内注射および／または皮内注射によって免疫化する。注射物質は一般に、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質を含有するエマルジョンである。宿主の種に応じて、さまざまなアジュバントを使用して免疫学的応答を増すことができる。アジュバントの例としては、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ウシ型弱毒結核菌ワクチン（ＢＣＧ）およびコリネバクテリウム・パルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントがあげられるが、これに限定されるものではない。これらのアジュバントおよび他のアジュバントは、従来技術において周知である。場合によっては、検出可能な抗体の有用な力価を得るために、約２週間の間隔でいくつかの追加注射が必要な場合もある。従来技術において周知の方法での選択した抗体の溶出や固相支持体へのペプチドの吸着などによって、抗体の選択で免疫化された動物由来の血清中の抗体力価を高めることが可能である。
【００５６】
もうひとつの態様では、モノクローナル抗体を利用して、生物学的試料における１種類以上のバイオマーカーを検出および定量化し、早産の危険性を評価してもよい。モノクローナル抗体とは、１つの種の抗原しか認識しない抗体を示す。これらの抗体は、単一の抗体産生ハイブリドーマの娘細胞によって生成される。モノクローナル抗体は一般に、自己が免疫反応するどのエピトープに対しても単一の結合親和性を示す。モノクローナル抗体は、二特異性モノクローナル抗体など、各々が異なるエピトープに対して免疫特異的である複数の抗体結合部位を有する抗体分子を含有するものであってもよい。モノクローナル抗体は、当業者間で周知のさまざまな方法で得られる。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５ ４９７（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９８７，１９９２）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、（各々を本明細書に援用する）を参照のこと。
【００５７】
また、本明細書で有用な抗体は、単一特異性または多特異性（二特異性、三特異性またはそれより上の多特異性など）でもよい点にも注意されたい。多特異性抗体は、ペプチドの異なるエピトープに特異的なものであってもよいし、目的のペプチドと、異種ペプチドまたは固相支持体物質などの異種エピトープの両方に特異的なものであってもよい。さらに、抗体は、本明細書に記載のバイオマーカーのどの領域から調製したものであってもよい。
【００５８】
一例として、モノクローナル抗体を十分に確立された方法で調製することが可能である。一態様では、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製される。このような方法では、マウス、ハムスターまたは他の適当な宿主動物を免疫剤（本発明の態様によるペプチドなど）で免疫化し、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するか、産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏにて免疫化してもよい。その後、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する。不死化細胞系は、哺乳類細胞、特に、齧歯類、ウサギ、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞に形質転換されることが多い。多くは、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞系が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、未融合の不死化細胞の成長または生存を阻害する１種類以上の物質を含み得る好適な培養液中で培養できるものである。たとえば、親細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠けている場合、ハイブリドーマ用の培養液は一般に、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の成長を阻害するためのヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含むことになる。
【００５９】
ハイブリドーマ細胞を培養する培養液を、モノクローナル抗体の有無についてアッセイすることが可能である。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によって、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって判断する。このような技術およびアッセイは、従来技術において周知である。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、この細胞を限界希釈法によってサブクローニングし、周知の方法で成長させる。モノクローナル抗体については、たとえば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、培養液から単離または精製してもよい。また、モノクローナル抗体は、本明細書に援用する米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されているものなどの組換えＤＮＡ法によっても作製可能である。当業者間で周知の抗体を生成するための他の方法も、本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００６０】
したがって、一態様では、懐妊被験者の潜在的な早産を検査するための方法が得られる。このような方法は、被験者から生物学的試料を取得し、抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で、本明細書に記載のバイオマーカーのうちの１つと同一または相同なアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドに対して免疫学的に特異な少なくとも１つの抗体に生物学的試料を接触させ、抗体抗原複合体の形成をアッセイして、生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーを検出および定量化することを含むものであってもよい。生物学的試料における目的のバイオマーカーの存在と量が、早産の危険性を示す指標となる。
【００６１】
以上説明したように、生物学的試料におけるペプチドを検出および／または定量化できるさまざまなイムノアッセイが周知である。一態様では、イムノアッセイが競合アッセイであってもよい。たとえば、検査対象ペプチドの配列を有する標識ペプチドを、ペプチド配列の少なくとも一部に特異な抗体と接触させ、抗体抗原（またはペプチド）複合体の形成を可能にする。このペプチド／抗体混合物に生物学的試料を加えて、生物学的試料に含まれる目的のペプチドが標識ペプチドと競合して、標識の強度を低下させられるようにする。競合アッセイは、従来技術において周知の一段階または二段階のプロトコールを含むものであってもよい。
【００６２】
もうひとつの態様では、イムノアッセイが非競合アッセイであってもよいし、サンドイッチアッセイであってもよい。このようなアッセイでは通常、アッセイの敏感度と特異度のレベルが高い。この非競合アッセイフォーマットでも、一段階または二段階のプロトコールを利用できる。通常、このようなアッセイは、物理的な支持体に固定化された抗体を含み、そこで固定化された抗体が目的のペプチド（すなわちバイオマーカー）に対して免疫学的に特異である。同じく目的のペプチドに対して免疫学的に特異な標識抗体と一緒に、支持体に生物学的試料を加える。生物学的試料に存在するペプチドは、支持体に沿って固定化された抗体と結合する。標識抗体はまた、目的のペプチドにも結合するため、ペプチドおよび固定化抗体によって物理的な基質にも固定化される。標識抗体の標識を検出し、生物学的試料におけるバイオマーカーの量を定量化するとともに、対照（すなわち、早産に至らない懐妊被験者）と比較することが可能である。プロトコールによっては、標識の検出前に非固定化標識抗体を洗い流すことが可能である。この場合、標識の強度が、生物学的試料に存在するバイオマーカーの量に対する量に比例する。
【００６３】
従来技術において周知の固相支持体基質の多数の構成が企図される。このような基質は、抗体または抗体アンカーなどの検出物質の固定化に好適な基質を含むものであってもよい。たとえば、好適な基質は、抗体の機能性に大きく影響することなく検出物質との間で結合を形成できる、固体有機物、バイオポリマーまたは無機支持体物質などの固相支持体を含むものであってもよい。有機固体支持体物質の例としては、ポリスチレン、ナイロン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂などのポリマー、ポリアクリルアミドなどのアクリルコポリマーといったものがあげられるが、これに限定されるものではない。バイオポリマー支持体物質としては、セルロース、ポリデキストラン、アガロース、コラーゲン、キチンなどがあげられるが、これに限定されるものではない。無機支持体物質の例としては、ガラスビーズ（多項性および非多孔性）、ステンレス鋼、ＺｒＯ2、ＴｉＯ2、Ａｌ2Ｏ3およびＮｉＯなどの多孔性セラミックを含む金属酸化物、砂などがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
従来技術において周知の多数の特異的アッセイ方法を、本明細書で使用する（ｓｕｅｄ）ことが可能である。このような特異的アッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、免疫比濁阻害法（ＮＩＡ）、微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）、化学発光磁気イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）などのプロトコールがあげられる。
【００６５】
検出可能なさまざまな標識を、本発明の態様に従って抗体に結合させることができる。適切な標識としては、放射性核種（125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ、32Ｐなど）、酵素（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）など）、蛍光部分またはタンパク質（フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、ＢＦＰなど）または発光部分（ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ ＣＯＲＰ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．から提供されるＱｄｏｔ（登録商標）ナノ粒子など）があげられるが、これに限定されるものではない。上述のさまざまなイムノアッセイを実施するにあたって用いられる一般的な方法は、当業者間で周知である。
【００６６】
イムノアッセイに加えて、生物学的試料におけるペプチドを検出するための別の方法も企図され、いずれも本発明の範囲内に包含されるものとする。一態様では、たとえば質量分析（ＭＳ）技術を利用できる。ひとつの具体例として、マトリックス支援レーザー脱離イオン化などの高スループットＭＳ分析技術があげられる。このような技術では、１時間あたり数百の生物学的試料を迅速に処理できる特別な施設に試料を送ってもよい。
【００６７】
また、本明細書で説明するのは、懐妊被験者由来の生物学的試料を検査して、早産の危険性を評価するためのキットである。このようなキットを、病院、クリニック、参照試験所、診察所などで採用して、医療上の判断をくだす、あるいは必要があれば、利用可能な治療法または介入を提供する助けとすることができる。また、このようなキットは、早産に関連する他の医学的症状の診断、予後または危険性の評価を可能にするものでもある。
【００６８】
したがって、一態様では、懐妊被験者の潜在的な早産を検査するためのキットが得られる。このようなキットは、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４を有する少なくとも１つのバイオマーカーと選択的に結合できる少なくとも１つのモノクローナル抗体と、少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を定量化するのに使用可能な、少なくとも１つのバイオマーカーと少なくとも１つのモノクローナル抗体との間の抗体抗原複合体の形成をアッセイするために抗体と機能的に関連したインジケーターと、を含むものであってもよい。このキットは、使用される特定の検査アッセイに必要または有益な試薬をさらに含むものであってもよい。
【００６９】
このキットは、生物学的試料におけるバイオマーカーを検出および定量化する手段を含むものであってもよく、キットの内容物は、使用する検出アッセイのタイプに応じて必然的に変化するものであってもよい。必要な試薬に加えて、キットは、目的の結合ペプチドのための抗体またはそのフラグメント、固体基質、抗体抗原複合体を検出するための別の抗体などを含み得る。上記にて提案したとおり、抗体または抗体フラグメントは、遊離形態で存在するものであってもよいし、プラスチック皿、試験管、試験棒、ビーズなどの基質に固定化されていてもよい。キットはまた、陽性対照または陰性対照、洗浄液、希釈緩衝液などの検出および／または標識用の好適な試薬ならびに、指示書を含むものであってもよい。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、本明細書に記載して権利請求している化合物、組成物および方法を、どのようにして作製および評価するのかについての完全な開示および説明を当業者に与えるために出すものであり、純粋に例示としてのものを意図しており、本発明者らが自らの発明であるとみなしている範囲を限定することを意図したものではない。数量（たとえば、量、温度など）に関しては正確さを期するために努力をしているが、若干の誤差や偏差も考慮に入れなければならない。特に明記しないかぎり、部は重量部、温度は℃または周囲温度、圧力は大気圧またはその前後である。ここに記載のプロセスで得られる生成物の純度と収率を最適化するのに使用可能な成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力および他の反応範囲および条件などの反応条件には、多数のバリエーションまたは組み合わせがある。このようなプロセス条件の最適化には、合理的かつ常法による実験だけが必要であろう。
【００７１】
血清採取
妊娠２４週目または２８週目に採血した１６０名の妊婦で研究を実施し、妊娠が終わるまで追跡した。これらの女性のうち８０名が合併症のない妊娠で、早産（ＰＴＢ）の兆候は何ら認められなかった。この女性たちで対照群を構成した。残りの８０名の女性にはＰＴＢ（妊娠期間３７週未満）があった。この女性たちをＰＴＢの症例とした。本明細書に記載のプロテオミクス技術を用いて、これら１６０名の女性の血清を研究した。
【００７２】
アセトニトリル沈殿
２容量のＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（４００μＬ）を血清２００μＬに加え、５秒間強くボルテックスして室温にて３０分間放置した。次に、（血清採取）由来の試料を、ＩＥＣ Ｍｉｃｒｏｍａｘ ＲＦ遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）にて室温で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心処理した。続いて、上清のアリコートを３００μＬのＨＰＬＣグレードの水が入った微小遠心管に移した。試料を軽くボルテックスして溶液を混合し、これをＬａｂｃｏｎｃｏ ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）にて約２００μＬまで凍結乾燥させた。凍結乾燥前に加える水の容量によって、溶液からアセトニトリルを完全に除去しやすくなる。これが必要なのは、アセトニトリルはタンパク質濃度を判断するのに用いるアッセイと不適合であることが理由である。製造業者の指示に従って実施するＢｉｏ−Ｒａｄマイクロタイタープレートタンパク質アッセイを用いて、上清タンパク質濃度を求めた。タンパク質４μｇを含有するアリコートを新しい微小遠心管に移し、ほぼ乾固するまで凍結乾燥させた。ＨＰＬＣ水を用いて試料を最大２０μＬまでにした後、２０μＬの８８％ギ酸を用いて酸性化した。
【００７３】
アセトニトリル処理（後沈殿）した血清試料（４０μＬ）を２５０μＬ容のポリプロピレン製コニカルバイアルにロードし、隔壁を有するポリプロピレン製のスナップキャップ（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で蓋を閉じ、４℃に保ったＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーの４８ウェルのプレートに入れた。０．１％ギ酸で酸性化したＨＰＬＣ水を用いて、ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーによって４０μＬ／分の流量で各血清試料を５μＬずつ液体クロマトグラフィガードカラムに注入した。酸性水を用いて、塩や他の不純物をガードカラムから洗い流した。ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーでは、カラムにロードした容量の３倍が引き出されるため、試料の容量が限られる場合は試料を手で注射する必要があった。これについては、ガードカラムの上流のブランクループに１０μＬ容量の試料を注入し、試料の代わりにＨＰＬＣ水の１０μＬ試料を注入するようＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーをプログラムすることで実現した。血清試料をガードカラムにロードし、コニカルバイアルからロードしたかのように脱塩した。
【００７４】
質量スペクトル分析用の液体クロマトグラフィ分離
キャピラリー液体クロマトグラフィ（ｃＣＬ）を実施して、試料を分画した。キャピラリーＬＣでは、１ｍｍ（１６．２μＬ）のマイクロボアガードカラム（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）と、インハウスで組み立てた内径１５ｃｍ×２５０μｍのキャピラリーカラムとを用いる。ＰＯＲＯＳ Ｒ１逆相培地（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を用いて、ガードカラムには乾燥充填、キャピラリーカラムにはスラリー充填した。水性相（９８％ＨＰＬＣグレードのＨ2Ｏ、２％アセトニトリル、０１．％ギ酸）と有機相（２％ＨＰＬＣ Ｈ2Ｏ、９８％アセトニトリル、０．１％ギ酸）を用いて、カラム平衡およびクロマトグラフ分離を実施した。分離については、９５％水溶液でカラム平衡３分、続いて６０％有機相まで２．７５％／分勾配増、これを７％／分で増加して９５％有機相の濃度にすることで達成した。勾配を９５％有機相で７分間保持し、試料の一層疎水性の成分を溶出させた後、５分かけて勾配を９５％水性相に戻してこの濃度で２分間保持して、カラムを再平衡させた。分離はいずれも、流量５μＬ／分で実施した。クロマトグラフィでは、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＣａｐｉｌｌａｒｙＨＰＬＣポンプシステムを、ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラー（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）と一緒に、Ａｎａｌｙｓｔ ＱＳ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の制御下で用いた。
【００７５】
ＭＳ解析
試料を流す前に毎日、外部対照を用いてＭＳ較正を実施した。必要があれば、設定を調節して信号対雑音比を最適化するとともに、敏感度を最大限にした。
【００７６】
このｃＬＣシステムを質量分析計に直接接続した。キャピラリーカラムからの排水をＩｏｎＳｐｒａｙソース（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってＱＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ Ｉ四重極直交飛行時間型質量分析計に送った。５分から開始して５５分まで、ｍ／ｚ５００から２５００のデータを回収した。流量が５μＬ／分の場合、試料をガードカラムから質量分析計に得るのに５分より長くかかり、５分より前には有用なデータが得られないため、開始時間の遅延をプログラムした。データ収集、処理、予備フォーマットは、Ａｎａｌｙｓｔ ＱＳ（登録商標）ソフトウェアパッケージにＢｉｏＡｎａｌｙｓｔのアドオンを加えた（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ものを用いて実現された。
【００７７】
各標本について５分から５５分のｃＬＣ溶出時間全体にわたって１秒ごとに質量スペクトルを得た。各被験者のｃＬＣ分画タンパク質枯渇血清の溶出特性を、全イオンクロマトグラムとして報告し、点検して前に流したヒト血清と一貫することを確認した。全存在量が通常の５０％未満または通常の２００％超え、あるいは不適切な標本がある場合は特徴的な一連の３つの広イオン強度領域を欠いている標本を再度流すか省いて、解析をやり直した。
【００７８】
ピークアライメント
異なる日とカラムでの試料の流が溶出時間を変える可能性があるため、有用なクロマトグラム（有用なクロマトグラム１５分から３５分前後）で２分前後の間隔で溶出される平均存在量の１０の内因性分子種を求めた。また、目的の溶出領域に対して２分のウィンドウを確立し、ファイルサイズを取り扱い可能なままにしておけるようにする。ＭＳコンピュータの抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）機能を利用して、各溶出時間マーカーについて所望のｍ／ｚ範囲の溶出画分を可視化する。それぞれの標本についてアライメントピークそれぞれの溶出時間を求め、これをＳｅｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ機能の平均によって２分のウィンドウの中心として使用する。これによって、すべての実施がそのウィンドウの同じ中点に対して整列される。次に、Ｓｈｏｗ Ｓｐｅｃｔｒａ機能を使って、全質量スペクトルから単一の平均質量スペクトルを作製する。
【００７９】
データ解析
Ｑ−Ｓｔａｒ（ｑ−ＴＯＦ）質量分析計をサポートしているＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェアプログラムによって、１６の個々の液体クロマトグラフの実施をまとめ、その中での同様の溶出時間での質量スペクトルを比較することができる。上述したようにして有用な溶出の２分のウィンドウ１０個を２０分間かけて確立し、データファイルの大きさを取り扱いできる程度に維持した。同じく上述したようにして２分のウィンドウを整列させた。２分の溶出間隔１０のうち、第１に分析するのは、一般にペプチド種の存在量が多いことから選択した第２の２分のウィンドウであった。ペプチドの多荷電状態の特徴的な見た目によってペプチドを同定したが、これは十分に画定されたピークのクラスターのように見える（単一のピークまたは複数のピークが１質量／電荷単位で分離されるのではなく、個々のピークのガウス形状が１質量／電荷単位未満で分割される。ＰＴＢに至っている８名の被験者からなる群と対照（ＰＴＢなし）の８名の被験者からなる群とを色で区別し、重ねた。次に、データを目視検査し、ひとつの色で優勢に見える分子種を記録した。使用したソフトウェアは、１６の試料しか可視化できない状態に限られていた。１６を超えるサンプリングサイズの場合、複数のデータセット比較を実施する。さらに考慮される化合物では、データセットの少なくとも三分の二において２つの群間で同じ明確な差が観察される必要があった。
【００８０】
次に、２つの研究群間で異なるように見える分子を個々に調べた。これらの候補種はいずれも、ペプチドであった。定量的データを抽出する前に、質量スペクトルを検討してペプチドピークが同じｍ／ｚを有し、なおかつ同じ荷電状態を表すことを保証し、さらに同じペプチドが検討対象となっていることを保証する。また、第２の付近のピークは、２つの群間で存在量に差は認められなかったが、これを参照として選択した。このピークを使用して、目的の候補ピークを正規化し、標本プロセシング、標本ローディング、イオン化効率の変動性を補正した。
【００８１】
次に、Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェアで分子種を「抽出」し、毎回実行するごとに個々の分子種の最大ピークを求める。この特徴は、特定のｍ／ｚの調査を２分の溶出画分ウィンドウに制限しなかったため、結果としてｃＬＣ溶出時間をアライメントするのに用いられるピークをさらに利用して、溶出画分特性における場所が同じことを保証し、毎回同じ分子種が選択されたことを保証する。
【００８２】
それぞれの分子種のピーク高さを、その存在量を示す合理的な推定因子とみなした。各候補化合物の存在量を表にまとめ、それぞれの候補種の算出値を近くの参照種と比較した。単一の種を考慮しているため、２つの群間で、このペプチドの存在量で考えられる差の評価には一変量統計解析を利用した。
【００８３】
内因性時間アライメント分子
時間アライメントに用いた参照ピークの質量および代表的な溶出時間を表１にまとめておく。
【００８４】
【表１】
【００８５】
妊婦のあらゆる血清に存在するこれらの内因性分子種の場所に関する知識も、これをキャピラリー液体クロマトグラフィ溶出画分特性内のＰＴＢバイオマーカーのアライメントおよび局在化用の時間マーカーに使用するのを可能にする。
【００８６】
バイオマーカーの特徴
時間アライメント後に、各々色を付けたＰＴＢ症例と対照で複数の質量スペクトルが重なった初期プロセスでバイオマーカー候補を可視的に同定した。優位に一方の色に見えるピークをさらに研究した。個々のスペクトルについて、ＱｑＴＯＦ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）用のオペレーティングシステムであるＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたコンピュータでピーク高を求めた。次に、バイオマーカーの量を表にした。また、同じ時間ウィンドウで発生した第２のピークは、症例と対照とで定量的に異なるものではなく、同じく選択した。これは、非生物学的な変動性を減らすための内因性対照を表していた。これについては、候補ピークの量を内因性対照の量で割って達成した。それぞれの標本での比の大きさを記録し、ＰＴＢ症例と対照とを比較するスチューデント検定を用いて統計的な差を求めた。
【００８７】
４つの種は十分に異なっていた（ｐ＜０．０００１）ことから、２つの群の優れた分離を可能にできるのではないかと思われる。４つのＰＴＢバイオマーカーの個々の質量および溶出時間を表２にまとめておく。
【００８８】
【表２】
【００８９】
溶出時間（保持時間）を内部時間対照の関数として表した。これは、バイオマーカーに先行する時間マーカーと目的のピークに続く時間マーカーとの間の目的のピークの相対位置によって求めた。これは以下の式によって算出した。
Ｒf＝（バイオマーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）／（後続の時間マーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）
【００９０】
Ｒf値のほうが実際の溶出時間よりも信頼性が高かった。溶出時間は新たなカラムまたは付着物のある既存のカラムの性能の変化に応じて変化することがあるが、Ｒfはこれらの変化によって変わることがなかった。５つのバイオマーカーのＲf値を表３にあげておく。
【００９１】
【表３】
【００９２】
内因性同時溶出対照に対する参照による変動性の減少
現段階の血清プロテオミクス手法の特徴のひとつに、あらゆる種で見いだされ、症例と対照とで違わなかった内因性分子を使用することがある。バイオマーカー存在量を、この内部対照に対して正規化すると、非生物学的な変化が減り、危険性の予測にバイオマーカーを利用する機能が改善される。正規化には、目的のピークの存在量を参照ピークで数学的に割ることを含む。存在量は、機械で導き出した値であった。特定の分子の存在量は、特定の質量スペクトルで質量分析計によって測定される特定質量のイオン数あるいは、全溶出期間を表すいくつかの質量スペクトルで観察される特定質量の合計を示す。分子は一般に、クロマトグラフィのカラムを移動して外に出るのに１．０〜１．５分間必要とするのに対し、質量スペクトルはその溶出期間で１秒ごとに得られる。
【００９３】
現時点の４つのピークには、内部参照を用いた。バイオマーカーピークｍ／ｚ６７６．７には、ｍ／ｚ６７３．３での同時溶出参照ピークを用いた。バイオマーカーｍ／ｚ８５６．８および８６０．０には、ｍ／ｚ８４３．８での同時溶出参照ピークを選択した。バイオマーカーｍ／ｚ７９４．８では、ｍ／ｚ５９５．３での同時溶出参照を選択した。これらの比を使用して、ｌｏｇ比の平均値を求めた（表４）。
【００９４】
【表４】
【００９５】
早産に至る危険性のある女性の予測にバイオマーカーを使用
上述したように、バイオマーカーの予測力についての一般的な尺度の一つが、その敏感度と特異度である。ＰＴＢを発症する危険性のある被験者を識別するために、表４に示す４つのｌｏｇ比それぞれの閾値を求めた。それぞれの閾値については、特異度（真陰性率）が８０％以上になるようにして算出した。上述のように、これは偽陽性率が２０％以下であるのと同じである。これらの数学的に求めた閾値を使用して、４つの比で独立して、表５に示すような以下の敏感度（真陽性）と特異度（真陰性）の比を得た。
【００９６】
【表５】
【００９７】
敏感度は、真陽性率として定義される統計用語であり、この場合は具体的に、バイオマーカーで正しく識別された、後にＰＴＢを発症した妊婦の比率である。特異度は真陰性率として定義され、この場合は、正しく識別された、妊娠に合併症を併発しない妊婦の比率である。このようにして予測にバイオマーカーを使用するには、数字での閾値を設定しなければならない。その数字での値を設定するには、一般に、バイオマーカーに対する値の範囲を、最小から最大まで考慮し、それぞれの点で正しく陽性と識別された被験者の割合と、その同じ点で誤って陽性と識別された対照の割合を考慮する。これを受診者動作特性曲線（ＲＯＣ）と呼ぶ。偽陽性率は２０％に限定する。これは、一般に臨床試験で許容できる最大値とされる。真陰性率を１００％から差し引いて、偽陽性率（バイオマーカーでは後にＰＴＢの危険性があると識別されたが、妊娠に合併症を併発しない女性すなわち対照群の比率）を算出する。閾値が偽陽性率２０％以下（特異度８０％以上と等価）であれば何でも、ある人に危険性があるか危険性がないかを判断するのに用いられる閾値が決まることになる。後のＰＴＢの危険性のある被験者を識別できるようにする４つの比それぞれの閾値を求めた。それぞれの閾値については、特異度（真陰性率）が８０％以上になるようにして算出した。上述のように、これは偽陽性率が２０％以下であるのと同じである。これらの数学的に求めた閾値を使用して、４つの比で独立して表５に示すような敏感度（真陽性）と特異度（真陰性）の率を得た。ピークの組み合わせは、６７７でのピークが後のＰＴＢを予測する機能を有意には改善しなかった。
【００９８】
現段階のＰＴＢバイオマーカーの同一性
親ペプチドのフラグメンテーションを引き起こす２つの質量分析計の間に衝突セルを挟んだタンデムＭＳを用いて、検索可能なデータベース（ＭＡＳＣＯＴ）と比較して第２のＭＳステップで観察されたフラグメンテーションパターンからアミノ配列を求めた。このペプチドのうちの３つは、同じ親タンパク質すなわちインターαトリプシン阻害剤重鎖４（ＩＴＩＨ４）由来であったのに対し、最終ペプチドは第２のタンパク質すなわちインターαトリプシン阻害剤重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）から得られた。表６にバイオマーカー（配列番号１〜４）をあげておく。
【００９９】
【表６】
【０１００】
これらのペプチドは、インターαトリプシン阻害剤と呼ばれるタンパク質スーパーファミリから生じるように見える。具体的には、このペプチドは、インターαトリプシン阻害剤重鎖４のアイソフォーム１（ＩＴＩＨ４−１）およびアイソフォーム２（ＩＴＩＨ４−２）のアイソフォームであると現時点でみなされている異なるタンパク質に由来しているように見える。２つのアイソフォームは若干の配列相同性を有するが、他方には見られないアミノ酸の部分も有する。２つのアイソフォームは、単に他方から切断したものを表すものではない。
【０１０１】
ＥＬＩＳＡアッセイＩ
以下のＥＬＩＳＡアッセイを利用して、生物学的試料における目的のバイオマーカーを検出および定量化することが可能である。目的のペプチド（抗原）に対して免疫学的に特異な第１の抗体を、９６ウェルのマイクロタイタープレートの表面に吸着させる。２５マイクロリットルの血清または目的のペプチドの周知のグレード濃度の標準を個々のウェルに加える。血清を第１の抗体と一緒に３０分間インキュベートする。ウェル表面にコーティングされた第１の抗体が抗原を結合し、これを固定化する。抗原に対して免疫学的に特異な第２の抗体を含有する第２の溶液２００マイクロリットルを、それぞれのウェルに加える。第２の抗体については、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのマーカーまたは化学発光前駆体で標識しておく。ウェルを３０分間インキュベートし、第２の抗体が抗原−第１の抗体複合体と結合して、それ自体がウェルの表面に結合した抗体−抗原−抗体「サンドイッチ」を形成できるようにする。次にウェルを慎重かつ十分に洗浄し、未結合の第２の抗体を除去する。さらに、第２の抗体標識に対する特異的基質を含有する溶液を加える。西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、結合した第２の抗体の量に対応する色の変化がウェルに起こる。化学発光マーカーの場合、基質は非化学発光分子種から、化学発光製品に変換される。製品によって放出される光は、ウェルに存在する抗原の量に比例し、「プレートリーダー」で測定される。このプレートリーダーは、特定の波長で放出された光を測定し、その強度を記録する特別なスペクトロメータである。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡアッセイＩＩ
以下のＥＬＩＳＡアッセイを利用して、目的のバイオマーカーを生物学的試料で検出および定量化することが可能である。このアッセイは、第２の抗体をビオチン分子で標識すること以外はＥＬＩＳＡアッセイＩと同様である。抗体−抗原−抗体形成後のウェルの洗浄に続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンを含む溶液をウェルに加え、ビオチン分子と反応させる。この特定のアッセイでは、未着色の基質が着色製品に変換される。特定波長の光の吸光度として測定した色の強度は、ウェルに存在する抗原の量に比例する。その吸光度と、既知でグレード濃度の抗原の一連の較正標準の吸光度ｖｓ．濃度のプロットとを比較をすれば、未知の濃度を推測することが可能である。
【０１０３】
上述した組成物および応用モードは、本発明の好ましい実施形態を示す例示的なものにすぎない旨を理解されたい。当業者であれば、本発明および添付の特許請求の範囲の主旨および範囲から逸脱することなく、多数の改変例および別の配置を考案でき、このような改変例やアレンジメントも包含することを意図している。よって、本発明については、現時点で本発明の最も実用的かつ好ましい実施形態であると思われるものに関連して詳細かつ入念に説明したが、本明細書に記載の原理および概念を逸脱することなく、大きさ、物質、形状、形態、機能および動作方式、組立および用途の違いを含むが、これに限定されるものではない多数の改変をほどこし得ることは、当業者には自明であろう。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年７月２０日出願の米国仮特許出願第６０／９６１，４６６号ならびに、２００８年５月１日出願の米国仮特許出願第６１／０４９，６７６号の優先権の利益を主張するものである。これらの出願に記載の教示内容全体について、その全文を本明細書に援用する。
【０００２】
謝辞
本発明につながった研究では、一部にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｇｒａｎｔ Ｎｏｓ．Ｒ２１ＨＤ０４７３１９およびＵ０１ＨＤ０５００８０による資金援助を受けた。本発明は米国政府が一定の権利を有し得るものである。
【背景技術】
【０００３】
全体の１０％を超える妊婦に、早期分娩が影響をおよぼしている。また、早期分娩は新生児関連の疾患や死亡の主な原因のひとつでもある。満期産の赤ん坊と比べると、未熟児で生まれた乳児では新生児死亡率が４０倍高く、脳性麻痺、慢性呼吸器疾患、盲目、難聴などの主要な医学的合併症の危険性が大幅に増すこともある。さらに、出生児体重が１．５ポンド（約６８０グラム）未満の場合は７０％もの子どもに、長期にわたる神経障害や発達障害が確認されている。これらの合併症は、米国内だけでも年間数十億ドルの直接経費ならびに、いまだ実現されていない潜在性に関連していると推定されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
問題が深刻であるにもかかわらず、早期陣痛や分娩を生じる体内で何が起こっているのかについては、いまだはっきりしない要素がある。早産（ＰＴＢ）の原因に関する不確定要素があるがゆえに、こうした問題の効果的な治療のためにできることも限られているが、事前に適切な危険信号が得られれば、医療の専門家らが医療処置をほどこせることもある。どの妊婦が早産になりそうかを予測可能であれば、未熟分娩を遅らせる、あるいは防止できる薬剤を投与すればよいことがある。さらに、早産の危険性が早い段階で検出された場合に、母親を経由して胎児に投与すると、胎児肺成熟度を高めて早産に関連した主な合併症のひとつを減らせるホルモン誘導体が知られている。しかしながら、現時点では、どの妊婦にこうした妊娠合併症の発症の危険性があるかを知る方法はないように見受けられる。したがって、いまだ満たされていない重要な需要のひとつに、早産の危険性がある母親を早期に検出するための試験手順を策定することがある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書にて説明するのは、懐妊被験者において早産の危険性を評価するための方法である。この方法は、被験者から得た生物学的試料で早産関連の１種類以上のバイオマーカーを検出および定量化することを含む。早産を予測するのに有用なバイオマーカーについても詳細に説明する。本発明の利点の一部を以下の文中にて説明し、一部は文中から自明であろうし、あるいは後述する態様を実施することで習得できるものもある。後述する利点は、特に添付の特許請求の範囲に記載の要素と組み合わせによって実現および到達される。上記の概要および下記の詳細な説明はいずれも例示や説明目的のものにすぎず、限定的なものではない旨を理解されたい。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本化合物、組成物および／または方法について開示と説明をする前に、後述の態様は特定の化合物に限定されるものではなく、もちろん合成方法や使用法そのものも変わることがある旨を理解されたい。また、本明細書で用いる専門用語は特定の態様のみを説明する目的のものであり、限定を意図したものではない旨も理解されたい。
【０００７】
本明細書と、これに続く特許請求の範囲では、以下の意味を持つものとして定義するものとする多数の用語に言及する。
【０００８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その指示対象の複数形を含む（文脈から、そうでないことが明白な場合を除く）ことに注意されたい。よって、たとえば、「バイオマーカー」といえば、２種類以上のこのようなバイオマーカーの混合物を含むといった具合である。
【０００９】
「任意」または「任意に」とは、それに続けて説明する事象または状況が起こり得るまたは起こり得ないことを意味し、なおかつ、該当する事象または状況が発生する場合と、それが発生しない場合とを説明に含むことを意味する。
【００１０】
本明細書で使用する場合、「被験者」とは、早産の危険性があり、本明細書に記載の方法から恩恵を受ける妊婦を示す。
【００１１】
本明細書で使用する場合、「早産」とは、妊娠期間満期前に赤ん坊を分娩することを含む。たとえば、妊娠期間３７週未満での赤ん坊の分娩は、早産であるとみなされる。早産という用語は、早期分娩および未熟分娩と同義語である。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「バイオマーカー」という用語は、早産の危険性を予測する際に有用なさまざまな濃度で妊婦に存在する、天然に生じる生体分子を示すのに使用されることがある。たとえば、バイオマーカーは、早産の危険性のある被験者に、早産ではなかった被験者の同じバイオマーカーの量よりも多いまたは少ない量で存在するペプチドであってもよい。バイオマーカーは、生物学的アミンおよびステロイドなどであるがこれに限定されるものではない、小分子をはじめとするペプチド以外の他の分子を含み得る。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」という用語は、あるアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のαアミノ基とが結合された状態で２つ以上のアミノ酸を含む天然分子または合成分子を示すのに使用されることがある。このペプチドは長さで限定されるものではないため、「ペプチド」にはポリペプチドおよびタンパク質を含み得る。
【００１４】
本明細書で使用する場合、ペプチドに関しての「単離された」という表現は、ある物質が天然に生じるものである場合に、それを本来の環境から取り出したものを示す。たとえば、生きた動物での天然に生じるペプチドは単離されていないが、同じペプチドであっても、自然な系で共存するいくつかの物質またはすべての物質から分離した場合は、単離されたものである。このような単離されたペプチドは、組成物の一部であってもよく、その組成物が当該ペプチドの天然環境の一部ではないという意味で、依然として単離された状態にある。また、「単離された」ペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって合成または作製された物質も含む。
【００１５】
本明細書で使用する場合（Ａｓ ｕｓｅｄ ｈｅｒｅｉｎ）、「特異的免疫反応性」という用語は、生物学的試料またはペプチドと他の生物製剤の異種起源の個体群におけるペプチドの存在を決定するような、ペプチドと抗体との結合などの測定可能および再現可能な特異的免疫反応を示す。「特異的免疫反応性」という用語は、構造的な形態や表面の特徴の特異的認識を含むこともある。よって、表記の条件下において、特定のペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体は、試料中に存在する他のペプチドとは有意な量では結合しない。多岐にわたるイムノアッセイフォーマットを使用して、特定のペプチドに対して特異的免疫反応性の抗体を判断することが可能である。たとえば、ペプチドとの間で特異的免疫反応性のモノクローナル抗体の選択に、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが日常的に用いられている。特異的免疫反応性を判断するのに使用可能なイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明については、たとえば、本明細書に援用するＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、特定の抗原に対して特異的免疫反応性の免疫グロブリンを示す。「抗体」という用語は、あらゆるアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の全抗体ならびにそのフラグメントを含むことを意図したものである。本明細書で使用する（ｓｕｅｄ）場合、「抗体」には抗体調製物も含む。従来技術において周知の多岐にわたる技法を用いて、検出可能な標識で抗体を標識してもよい。標識には、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素または酵素補因子あるいは従来技術において周知の他の標識が可能である。いくつかの態様では、目的のペプチドと結合する抗体を標識しなくてもよく、その代わり、一次抗体と特異的に結合する標識された二次抗体の結合によって検出してもよい。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「検出する」という表現は、１種類以上のバイオマーカー（たとえば、ペプチドおよび他の生体分子など）の検出不能な血清濃度、低血清濃度、正常な血清濃度または高血清濃度の定量的測定値を示す。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「定量化する」および「定量化」という表現は、同義に使用されることがあり、試料（バイオマーカーなど）中における物質の相対的または絶対的な量または存在量を判断するプロセスを示す。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「約」という表現は、所望の結果に影響することなく、特定の値が数値範囲の端点よりも「若干大きい」または「若干小さい」旨を示すことで端点に柔軟性を持たせるのに用いられる。
【００２０】
本明細書で使用する場合、複数の項目、構造的要素、構成要素および／または物質を便宜上共通の一覧で示すことがある。しかしながら、これらの一覧は、その一覧の各成員を別個かつ独特の成員として個々に特定したかのごとく解釈されるべきものである。よって、このような一覧の個々の成員はいずれも、単に共通の群に含まれているからというだけの理由で、同じ一覧の他の成員に対する事実上の等価物として解釈されることがない（逆のことが明記されている場合を除く）。
【００２１】
濃度、量および他の数値データは、本明細書では範囲形式で表現または提示されることがある。このような範囲形式は、単に便宜上かつ簡略化目的で用いられるものにすぎず、よって、範囲の上下限として明示された数値を含むだけでなく、その範囲内に包含される個々のすべての数値または部分範囲も、これらの数値および部分範囲を各々明示したのと同じように含むものと柔軟に解釈される点を理解されたい。実例として、「約１から約５」という数値の範囲は、明示された値である約１から約５を含むだけでなく、表記の範囲内の個々の値および部分範囲も含むものと解釈されるべきものである。よって、この数値の範囲に含まれるのは、２、３および４などの個々の値と、１〜３、２〜４、３〜５などの部分範囲ならびに、１、２、３、４、５各々である。これと同じ原理が、最小値または最大値として１つの数値だけを示している範囲にも適用される。さらに、このような解釈は、範囲の幅または説明されている特徴とは関係なく適用されるものとする。
【００２２】
本明細書で説明するのは、早産の危険性のある懐妊被験者を識別するための方法である。早産の危険性があり得る妊娠初期から中期の懐妊被験者を識別するのに利用できる特定のバイオマーカーが同定されている。このようなマーカーを用いると、早産と類似の症候を呈する他の症状とを診断で区別できることがある。早産の危険性の高い被験者を早期に識別できれば、このような被験者を一層詳しく観察できるため、そうすることにはかなりの価値があろう。
【００２３】
本明細書に記載の方法を用いての懐妊被験者の検査は、早産を示すバイオマーカーを被験者で定量可能であれば、妊娠中のどの時点でも起こり得る。たとえば、一態様において、妊娠期間の約２０週目から約３４週目にバイオマーカーを検査してもよい。もうひとつの態様では、妊娠期間の約２４週目から約３２週目にバイオマーカーを試験してもよい。ただし、このような検査は妊娠中のどの時点でも実施できるため、上記の範囲が限定的なものとみなされるべきではない点に注意されたい。むしろ、これらの範囲は、大半の被験者でこのような検査がなされる可能性の最も高い妊娠周期の期間を示すためのものである。
【００２４】
早産の危険性のある被験者を識別する上で有用なバイオマーカーとして、さまざまなペプチドおよび他の生体分子がある。本明細書に記載の技法および方法を用いて、早産の出現率と相関する特定のペプチドおよび他の生体分子が同定されている。これらのペプチドおよび他の生体分子のうちの１種類以上を定量化することで、被験者にとっての早産の危険性を示す指標になるため、予防治療の機会を与えることができる。早産合併症を予測可能なバイオマーカーであれば、どのようなものであっても本発明の特許請求の範囲の範囲に包含されるものとみなされる点に注意されたい。しかしながら、一態様において、早産合併症に関連するバイオマーカーの非限定的な例としては、対照被験者（すなわち、早産合併症を経験しなかった妊婦）と比較して、ｐ（確率）値＜０．０２をカットオフとした場合に統計的に異なる（ｐ≦０．０１）ことが分かっている生体分子およびペプチドがあげられる。しかしながら、もうひとつの態様では、早産関連のペプチドの非限定的な例として、アミノ酸配列ＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号１）、ＮＶＨＳＡＧＡＡＧＳＲＭＮＦＲＰＧＶＬＳＳＲＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号２）、ＮＶＨＳＡＧＡＡＧＳＲＭ(O)ＮＦＲＰＧＶＬＳＳＲＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号３）（Ｍ(O)は酸化メチオニンを示す）、ＮＶＨＳＧＳＴＦＦＫＹＹＬＱＧＡＫＩＰＫＰＥＡＳＦＳＰＲ（配列番号４）を有するペプチドがあげられる。
【００２５】
国際公開第２００８／０７９４０７号パンフレット（本出願内にて、あらゆる目的でその内容全体を本明細書に援用する）に開示されているような、バイオマーカーを同定するのに用いられるプロテオミクス技術を使用して、懐妊被験者における早産の危険性を評価するためのバイオマーカーを同定および定量化することが可能である。一態様では、潜在的な早産について懐妊被験者を検査するための方法が、対照（すなわち、早産を経験しない妊婦におけるバイオマーカーの相対濃度または量）と比較して、生物学的試料中に存在する、早産関連の１種類以上のバイオマーカーの濃度または量の差を検出することを含むものであってもよい。一態様では、プロテオミクスシステムおよび方法を使用して、バイオマーカーを同定および定量化することが可能である。たとえば、異なる生物学的試料由来の複数の質量スペクトルを比較し、非生物学的変動を補償するためのアプローチを使用した後に定量的に異なる質量イオンの位置を特定し、目的のバイオマーカーを単離し、キャラクタライズすることを、本明細書では使用できる。このような方法は、複数の生物学的試料を各々分画して複数の溶出画分を生成し、複数の溶出時間に複数の溶出画分各々から複数の質量スペクトルを取得し、生物学的試料間で定量的に異なるように見える目的の分子イオンピークを見つけることを含むものであってもよい。この方法はさらに、生物学的試料間で実質的に一貫している内因性参照分子であって、溶出時間と質量対電荷比が目的のピークと実質的に類似する内因性参照分子に対応する質量スペクトルの参照ピークを同定し、目的のピークを内因性参照分子の質量スペクトルピークに正規化することで複数の溶出画分での各生物学的試料の非生物学的変化を補償することを含むものであってもよい。この方法はさらに、複数の衝突エネルギの各々を一度に一回ずつ使用する衝突誘起フラグメンテーション研究を実施し、得られた複数のフラグメントイオン質量スペクトルを平均せずに合計し、単一の娘フラグメント累積質量スペクトルを形成するとともに、娘フラグメントの質量スペクトルを用いてアミノ酸配列データを構築し、その後これをアライメントされた単一の質量スペクトルにおける目的のピークに対応するペプチドの同定に使用することを含むものであってもよい。
【００２６】
もうひとつの態様では、複数の溶出時間に複数の溶出画分各々から複数の質量スペクトルを取得し、複数の溶出画分各々で溶出される内因性アライメント分子に対応する質量スペクトルのアライメントピークを同定しつつ、目的のバイオマーカーを含有する生物学的試料を分画して、複数の溶出画分を生成することが可能である。この方法はさらに、複数の溶出画分各々からの質量スペクトルのアライメントピークをアライメントすることで、各溶出画分からの複数の質量スペクトルをアライメントし、アライメントされた複数の質量スペクトルを合計してアライメントされた単一の質量スペクトルを生成し、アライメントされた単一の質量スペクトルにおける目的のピークに対応するペプチドを同定することを含むものであってもよい。さまざまな技法が企図されるが、一態様では、複数の質量スペクトルをアライメントすることが、複数の質量スペクトルを可視的にアライメントすることをさらに含むものであってもよい。また、複数の生物学的試料に存在する複数の生体分子各々を分画することは、たとえば、キャピラリー液体クロマトグラフィ（ｃＬＣ）などの多数の方法で実現できるものである。具体的な方法と、本明細書に記載するバイオマーカーを検出および定量化するためのパラメータについては、実施例にあげておく。
【００２７】
バイオマーカーを検出および定量化するのに用いられるプロテオミクス技術では、標本のローディング、イオン化効率および質量分析計の感度の差を補正するのに使用可能な内部対照として機能する、あらゆる血清に含まれる分子を利用する。上述の説明に加えて、あるピークが比較群間で定量的に同様である旨を示すことができ、候補バイオマーカーと同じ溶出ウィンドウのカラムから溶出し、その質量対電荷比が候補バイオマーカーのものと同様であり、すべての標本がノイズレベルの３倍を超える量になるほど十分に豊富である場合は、そのピークが参照として選択される。本明細書に記載の参照ピークは、標本の処理、クロマトグラフィでのローディング、イオン化効率または機器の感度の変動に関連しているが、ピーク量の生物学的な差によるものではない、ピークの高さまたは面積の定量補正用である。この参照を内部定量対照と呼ぶ。他の態様では、外部対照を用いてバイオマーカーの定量化を容易にすることが可能である。この態様では、バイオマーカーと対照との比を計算できるように、周知の量の化合物を生物学的試料に加えることが可能である。この比を求めたら、早産の危険性を評価するために対照試料での比と比較すればよい。
【００２８】
上述したように、早産の予測因子として４つのバイオマーカー（配列番号１〜４）が同定されている。内部定量対照については、バイオマーカーの定量化に使用したバイオマーカー配列番号１（ｍ／ｚ６７７）に使用した。参照（すなわち内部対照）は、モノアイソトピックピークの＋３荷電状態でのｍ／ｚが６７３．３６であった。中性の親質量は２０１７．０７質量単位であり、クロマトグラフィの溶出時間は１５．５分であった。しかしながら、日によって、あるいは置換カラムごとに溶出時間が若干変化することを考えれば、溶出時間は、その内部時間対照に対する溶出時間の割合（０．９９６８、すなわち内部時間対照よりも保持時間の０．００３２倍早く溶出する）ならびに、実際のバイオマーカー配列番号１（ｍ／ｚ６７７）と比較した溶出時間の割合（１．０５５８、すなわちバイオマーカーよりも自らの溶出時間の０．０５２８６早く溶出する）として得られる。
【００２９】
第２の内部定量対照は、２つのバイオマーカーすなわち配列番号２（ｍ／ｚ８５７）と配列番号３（ｍ／ｚ８６０）の参照として機能した。参照分子のｍ／ｚは、＋５荷電状態で８４２．３９であり、中性の親質量は４２０６．０７質量単位であった。クロマトグラフィの溶出時間は１５．８分前後であった。しかしながら、溶出時間のばらつきを考えれば、その溶出時間は内部時間対照およびバイオマーカー配列番号２（ｍ／ｚ８５７）の溶出時間との関連で一層適切に説明される。内部時間対照との関連で、内部定量対照は、内部時間対照の溶出画分の後で自らの溶出時間の０．０１５９倍の溶出時間（または時間対照マーカーの比１．０１６１）で溶出された。配列番号２（ｍ／ｚ８５７）のバイオマーカーとの関連で、内部定量マーカーは、バイオマーカー後に自らの溶出時間の０．０５３９倍（またはバイオマーカーの溶出時間の１．０７００）となった。
【００３０】
バイオマーカー配列番号４（ｍ／ｚ７９５）に用いられる参照は、モノアイソトピックピークの＋１荷電状態でのｍ／ｚが５９５．３であった。中性の親質量は５９４．３２質量単位であり、クロマトグラフィの溶出時間は１８．８分であった。しかしながら、日によって、あるいは置換カラムごとに溶出時間が若干変化することを考えれば、溶出時間は、先行（１４３５．２）および後続（２００９．９５）する２つの内部時間対照に対する溶出時間の割合として得られる。すなわち、２つの境界にある時間アライメントマーカーによって指定される期間中ずっと０．６０７で溶出する。
【００３１】
個々の質量は溶出時間（保持時間）で定義できるものであるが、この溶出時間（保持時間）を内部時間対照の関数として表すことも可能である。これは、バイオマーカーに先行するタイムメーカー（ｔｉｍｅ ｍａｋｅｒ）と目的のピークに続く時間マーカーとの間の目的のピークの相対位置によって求められる。こうして求めたものをＲf値と見なす。Ｒf値は、以下のようにして算出される。
Ｒf＝（バイオマーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）／（後続の時間マーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）。
【００３２】
上述した技法を使用して、早産のインジケーターとして４つのバイオマーカーを同定している。バイオマーカーの同定と定量化に関する具体的な詳細については、実施例にあげておく。各バイオマーカーの別の構造特性を以下に示す。第１のバイオマーカー（「配列番号１」）は、ペプチドであり、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）が６７７、平均質量２０２６．９８ダルトン、平均溶出時間１４．３０±０．４７分、Ｒf値０．５３５±０．０５２である。配列番号１を本明細書では「バイオマーカー１」とも呼ぶ。
【００３３】
第２のバイオマーカー（配列番号２）は、ペプチドであり、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）８５７、平均質量４２７９．２５ダルトン、平均溶出時間１７．２０±２．０４分、Ｒf値０．７８１±０．０８６である。配列番号２を本明細書では「バイオマーカー２」とも呼ぶ。
【００３４】
第３のバイオマーカー（配列番号３）は、ペプチドであり、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）８６０、平均質量４２９５．２５ダルトン、平均溶出時間１６．１３±１．９７分、Ｒf値０．６９５±０．１３４である。配列番号３を本明細書では「バイオマーカー３」とも呼ぶ。
【００３５】
第４のバイオマーカー（配列番号４）は、ペプチドであり、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）７９５、平均質量３９６８．９６ダルトン、平均溶出時間１５．５２±０．１５分、Ｒf値０．０２５２±０．０２１である。配列番号４を本明細書では「バイオマーカー４」と呼ぶ。
【００３６】
したがって、潜在的な早産について懐妊被験者を評価するための方法が得られる。一態様では、この方法は、被験者由来の生物学的試料における早産関連の本明細書に記載の少なくとも１つのバイオマーカーであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４で表される配列と同一または相同的なアミノ酸配列を有する少なくとも１つのバイオマーカーを検出し、生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの存在量を定量化することを含む。バイオマーカーの存在量は、内部対照として機能する、同じく生物学的試料に存在する参照分子の関数として、処理および分離後に測定される。「存在量」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の質量スペクトルで質量分析計にて測定した特定の質量のイオン数あるいは、全溶出間隔を表している複数の質量スペクトルで観察される特定の質量のイオン数の合計を表す。この内部対照に対してバイオマーカー存在量を正規化することで、非生物学的なばらつきが減り、危険性予測においてバイオマーカーを利用する機能が改善される。言い方を変えれば、ある被験者から別の被験者に比較的一定の存在量で生物学的試料に存在する参照に対して分子を選択することで、長期間のうちには広がる場合もある異なる日に実施した結果を比較する場合は特に、生物学的試料のプロセシングの変動性を補正できる。それ自体、バイオマーカーの相対存在量は、関与する特定のバイオマーカーに応じて変わることがある。したがって、バイオマーカーのピーク存在量と特定の値分だけ大きいまたは小さい参照ピーク存在量との比で実質的に早産の危険性が高いことを予測できるように、バイオマーカー／参照比ごとに特定のカットオフ値を確立してもよい。
【００３７】
被験者由来の生物学的試料における１種類以上のバイオマーカーの存在量と、正常分娩を示すこれらの同じバイオマーカーの既知の存在量とを比較することで、潜在的な早産の検査を実現してもよい。一態様では、被験者で配列番号１の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約５０％未満であると、早産が起こり得る。もうひとつの態様では、被験者で配列番号１の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約３０％未満であると、早産が起こり得る。さらに別の態様では、被験者で配列番号１の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約１０％未満であると、早産が起こり得る。
【００３８】
もうひとつの態様では、被験者で配列番号２の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約５０％未満であると、早産が起こり得る。もうひとつの態様では、被験者で配列番号２の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約３０％未満であると、早産が起こり得る。さらに別の態様では、被験者で配列番号２の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約１０％未満であると、早産が起こり得る。
【００３９】
別の態様では、被験者で配列番号３の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約５５％未満であると、早産が起こり得る。もうひとつの態様では、被験者で配列番号３の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約３５％未満であると、早産が示唆され得る。さらに別の態様では、被験者で配列番号３の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約１５％未満であると、早産が起こり得る。
【００４０】
さらに別の態様では、被験者で配列番号４の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約５０％未満であると、早産が起こり得る。もうひとつの態様では、被験者で配列番号４の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約３０％未満であると、早産が示唆され得る。さらに別の態様では、被験者で配列番号４の実測存在量が、妊娠期間の少なくとも２２週目で対照存在量の約１０％未満であると、早産が起こり得る。
【００４１】
目的のバイオマーカーを含み得るものであれば、どのようなタイプの生物学的試料をスクリーニングしてもよく、非限定的な例として、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、頸膣液、洗浄液、組織、これらの組み合わせがあげられる。
【００４２】
バイオマーカー１〜４は大半の妊婦に存在するが、早産に至る妊婦の多くは、正常分娩の女性と比較して妊娠中に上記の生体分子のうちの１種類以上の血中血清濃度が低い。たとえば、ＰＴＢの症例では、バイオマーカー１〜４単独または全体が対照より少なかった。よって、早産を経験しなかった被験者から得た既知の対照濃度あるいは、検査対象被験者から得た既知のバイオマーカー濃度に対して、被験者由来の生物学的試料におけるこれらのバイオマーカーのうちの１種類以上の存在量を比較することで、早産を予測できることがある。これらのバイオマーカーのうちの１種類以上の存在量が高めまたは低めの被験者のほうが、早産の危険性が高いことがあり、よって、適切な処置ができるだけの十分に早い段階で識別可能である。早産の予測にあたっての特定のバイオマーカーの存在量については、下記にて詳細に説明する。
【００４３】
一態様では、早産被験者と対照被験者のバイオマーカーの存在量を算出するために、ｌｏｇ比を取った。たとえば、ｌｏｇ比ｌｏｇ６７６．７／６７３．３６（バイオマーカー１／参照ピーク）では、対照平均０．５７９±０．１０１、ＰＴＢ平均−０．０１５±０．０９０となった。ｌｏｇ比ｌｏｇ８５６．８／８４２．８（バイオマーカー２／参照ピーク）では、対照平均（早産を経験しなかった被験者）０．２３１±０．１０２、ＰＴＢ平均（早産の危険性のある被験者）−０．１４９±０．０９５（実施例の表４）となった。実施例の表４を参照して、他のバイオマーカーのｌｏｇ比を算出した。ｌｏｇ比ｌｏｇ８６０．０／８４２．８（バイオマーカー３／参照ピーク）では、対照平均０．２０１±０．０９６、ＰＴＢ平均−０．２０４±０．０８８となった。ｌｏｇ比ｌｏｇ７９４．８／５９５．３（バイオマーカー４／参照ピーク）では、対照平均０．５８２±０．６３７、ＰＴＢ平均０．２７４±０．６５６となった。言い方を変えれば、早産の危険性のある被験者では、バイオマーカー１の減少、バイオマーカー２の減少、バイオマーカー３の減少、バイオマーカー４の減少が、個々にまたは全体で認められる可能性が最も高い。
【００４４】
この説明を念頭において、一態様では、配列番号１（ｍ／ｚ６７７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ６７３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約１．０未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。もうひとつの態様では、配列番号１（ｍ／ｚ６７７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ６７３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．８未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。さらに別の態様では、配列番号１（ｍ／ｚ６７７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ６７３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．６未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。
【００４５】
さらに、一態様では、配列番号２（ｍ／ｚ８５７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．６未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。もうひとつの態様では、配列番号２（ｍ／ｚ８５７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．５未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。さらに別の態様では、配列番号２（ｍ／ｚ８５７）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．４４未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。
【００４６】
また、一態様では、配列番号３（ｍ／ｚ８６０）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．６未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。もうひとつの態様では、配列番号３（ｍ／ｚ８６０）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．４未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。さらに別の態様では、配列番号３（ｍ／ｚ８６０）の存在量と参照分子のｍ／ｚ８４３での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．２未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。
【００４７】
別の態様では、配列番号４（ｍ／ｚ７９５）のと参照分子のｍ／ｚ５９５での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．６未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。もうひとつの態様では、配列番号４（ｍ／ｚ７９５）の存在量と参照分子のｍ／ｚ５９５での存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．４未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。さらに別の態様では、配列番号４（ｍ／ｚ７９５）の存在量とｍ／ｚ５９５での参照分子の存在量との比が、妊娠期間の少なくとも２２週目に実測で約０．２未満である場合に、早産の危険性の実質的な増大を予測できることがある。
【００４８】
特定の態様では、上記にて算出したｌｏｇ比を使用して、早産する危険性のある妊婦における危険性を統計的に予測するようにしてもよい。バイオマーカーの予測力についての一般的な尺度の一つが、その敏感度と特異度である。「敏感度」とは、本明細書で使用する場合、真陽性率（たとえば、バイオマーカーで正しく識別された、後に早産した妊婦の比率）として定義される統計用語である。「特異度」という用語は、本明細書で使用する場合、真陰性率（たとえば、正しく識別された、妊娠に合併症を併発しない妊婦の比率）として定義される。本明細書に記載したようにして早産の予測にバイオマーカーを使用するには、数字での閾値を設定する。数字での閾値を設定するには、特定のバイオマーカーに対する値の範囲を、最小から最大まで考慮し、それぞれの点で正しく陽性と識別された被験者の割合と、その同じ点で誤って陽性と識別された対照の割合を考慮する。特定のバイオマーカーの値の範囲については、具体的なデータセットに対する最小から最大までの実際の定量値を取ることで算出すればよい。これを受診者動作特性曲線（ＲＯＣ）と呼ぶ。一態様では、偽陽性率を、一般に臨床試験で許容できる最大値とされる２０％までに制限することが可能である。真陰性率を１００％から差し引けば、偽陽性率（すなわち、バイオマーカーでは早産の危険性があると識別されたが、妊娠に合併症を併発しない女性の比率）が算出される。偽陽性率２０％以下での閾値（特異度８０％以上と等価である）によって、ある人に危険性があるか危険性がないかを判断するのに用いられる閾値が決まることになる。
【００４９】
実施例の表５を参照すると、早産の危険性のある被験者を識別するために、４つのｌｏｇ比それぞれの閾値を求めた。それぞれの閾値については、特異度（真陰性率）が８０％以上（偽陽性率２０％以下と同じことである）になるようにして算出した。数学的に求めた閾値を使用して、４つの比で独立して敏感度（真陽性）と特異度（真陰性）の率（表５）を得た。表５を参照すると、早産の予測に関してはバイオマーカー１／参照ピークの比で敏感度（６５％）と特異度（８５％）が最大であった。よって、この態様では、妊婦に存在するバイオマーカー１の同定および定量化が、早産に至る尤度を示す正確な予測因子のひとつである。バイオマーカー１／参照ピークの比は有用であるが、ｌｏｇ比の組み合わせを使用して早産の危険性を予測することも可能である旨が企図される。よって、本明細書にて同定するバイオマーカーは、早産の危険性を予測する際の強力な道具である。
【００５０】
本明細書に記載のバイオマーカーは、早産を予測できるものである。しかしながら、場合によっては、複数のバイオマーカーに対するスクリーニングと定量化で、早産検査の予測値を改善できることがある。一態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４で表される配列と同一または相同のアミノ酸配列を有する少なくとも２つのバイオマーカーについて、被験者由来の生物学的試料をスクリーニングしてもよい。もうひとつの態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４で表される配列と同一または相同のアミノ酸配列を有する少なくとも３つのバイオマーカーについて、被験者由来の生物学的試料をスクリーニングしてもよい。検査のタイプまたは利用するアッセイによって予測値が変わることもあり、このうちのいくつかをさらに詳細に後述する。評価することで、複数（すなわち２つ以上）のバイオマーカーの存在と量を評価することで、早産を予測するにあたって有用な明確な特徴を生成することが可能である。たとえば、少なくとも２つのバイオマーカーを判断して定量化することで、本明細書に記載の方法の予測値を高めることが可能である。ＰＴＢを発症する女性がわずかしか含まれないこともあるが、これは早産に至る危険性を一層よく示している。目的のペプチドを含み得るものであれば、どのようなタイプの生物学的試料をスクリーニングしてもよく、非限定的な例として、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、頸膣液、洗浄液、組織、これらの組み合わせがあげられる。しかしながら、一態様では、被験者から得た血清試料中のペプチドをスクリーニングすると都合がよいことがある。もうひとつの態様では、被験者から得た血液試料中のペプチドをスクリーニングすると都合がよいことがある。
【００５１】
また、本明細書には、懐妊被験者が早産に至る確率を予測するのに利用できる、単離されたペプチド（すなわちバイオマーカー）ならびに、単離されたペプチドの混合物も記載されている。このようなペプチドは、多くの検査アッセイでの陽性対照として有用なことがあり、抗体の生成に有用なこともある。一態様では、たとえば、単離されたペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４で表される配列と同一または相同なアミノ酸配列を有するものであればよい。ペプチド合成は従来技術において周知であり、当業者であれば、ペプチド配列が分かれば本明細書に開示のペプチドを合成するための多岐にわたる技術を利用できるであろうことを理解されたい。このような技術として数例をあげると、液相合成法および固相合成法ならびに、前チオール捕捉（ｐｒｉｏｒ ｔｈｉｏｌ ｃａｐｔｕｒｅ、ネイティブ化学ライゲーション、発現タンパク質ライゲーション、アシル開始捕捉（ａｃｙｌ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｃａｐｔｕｒｅ）、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションなどのさまざまな化学ライゲーション法などのさまざまな方法があるが、これに限定されるものではない。また、組換えＤＮＡ技術を用いてペプチドを合成してもよい。
【００５２】
特定の態様では、上述したプロテオミクス技術を使用して、バイオマーカーを同定および定量化することが可能である。しかしながら、本明細書では、生物学的試料のバイオマーカーを検出および／または定量化できる他の方法を用いることが可能である。潜在性のある一タイプのペプチドアッセイとして、イムノアッセイがある。同種および非同種ならびに、競合および非競合的な方法をはじめとして、特定のペプチドに対する生物学的試料のスクリーニングに抗体を用いる多数のイムノアッセイプロトコールが周知である。たとえば、このような技術は、固相支持体、免疫沈降などの使用を含むことがある。しかしながら、通常、ペプチド検出用のイムノアッセイでは標識抗体の使用が必要になることが多い。このような標識は、周知のどのようなタイプの物質を含むものであってもよく、一例として、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識などがあげられる。このようなイムノアッセイ検査自体は従来技術において周知であり、生物学的試料におけるペプチドの検出に利用する特定の方法は、本発明の特許請求の範囲に記載の範囲を限定するものとはみなされないものとする旨を理解されたい。イムノアッセイについては、下記にてさらに説明する。
【００５３】
他の態様では、本明細書に記載のバイオマーカーに対して特異的免疫反応性の抗体を利用できる。一態様では、たとえば、配列番号１からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な抗体が得られる。もうひとつの態様では、配列番号２からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な抗体が得られる。さらに別の態様では、配列番号３からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な抗体が得られる。さらに別の態様では、配列番号４からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な抗体が得られる。
【００５４】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体であってもよく、従来技術において周知のどのような方法で作製してもよいものである。抗体フラグメントも本発明の範囲に包含されるものとする。本発明の態様による抗体は、鳥類および哺乳動物を含むどのような動物起源のものであっても構わない。一態様では、たとえば抗体が、ヒト、ネズミ科動物（マウスおよびラットなど）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、ニワトリなどに由来するものであってもよい。
【００５５】
一態様では、ポリクローナル抗体を利用して、生物学的試料における本明細書に記載の１種類以上のバイオマーカーを検出および定量化し、早産の危険性を評価してもよい。ポリクローナル抗体は、当業者間で周知のさまざまな手法で作製可能なものである。たとえば、ウサギ、ラット、マウス、ヒツジ、ヤギなどのｉｎ ｖｉｖｏ宿主動物でポリクローナル抗体を作製してもよい。宿主動物については、遊離ペプチドまたはキャリア結合ペプチドを用いて、たとえば腹腔内注射および／または皮内注射によって免疫化する。注射物質は一般に、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質を含有するエマルジョンである。宿主の種に応じて、さまざまなアジュバントを使用して免疫学的応答を増すことができる。アジュバントの例としては、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ウシ型弱毒結核菌ワクチン（ＢＣＧ）およびコリネバクテリウム・パルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントがあげられるが、これに限定されるものではない。これらのアジュバントおよび他のアジュバントは、従来技術において周知である。場合によっては、検出可能な抗体の有用な力価を得るために、約２週間の間隔でいくつかの追加注射が必要な場合もある。従来技術において周知の方法での選択した抗体の溶出や固相支持体へのペプチドの吸着などによって、抗体の選択で免疫化された動物由来の血清中の抗体力価を高めることが可能である。
【００５６】
もうひとつの態様では、モノクローナル抗体を利用して、生物学的試料における１種類以上のバイオマーカーを検出および定量化し、早産の危険性を評価してもよい。モノクローナル抗体とは、１つの種の抗原しか認識しない抗体を示す。これらの抗体は、単一の抗体産生ハイブリドーマの娘細胞によって生成される。モノクローナル抗体は一般に、自己が免疫反応するどのエピトープに対しても単一の結合親和性を示す。モノクローナル抗体は、二特異性モノクローナル抗体など、各々が異なるエピトープに対して免疫特異的である複数の抗体結合部位を有する抗体分子を含有するものであってもよい。モノクローナル抗体は、当業者間で周知のさまざまな方法で得られる。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５ ４９７（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９８７，１９９２）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、（各々を本明細書に援用する）を参照のこと。
【００５７】
また、本明細書で有用な抗体は、単一特異性または多特異性（二特異性、三特異性またはそれより上の多特異性など）でもよい点にも注意されたい。多特異性抗体は、ペプチドの異なるエピトープに特異的なものであってもよいし、目的のペプチドと、異種ペプチドまたは固相支持体物質などの異種エピトープの両方に特異的なものであってもよい。さらに、抗体は、本明細書に記載のバイオマーカーのどの領域から調製したものであってもよい。
【００５８】
一例として、モノクローナル抗体を十分に確立された方法で調製することが可能である。一態様では、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製される。このような方法では、マウス、ハムスターまたは他の適当な宿主動物を免疫剤（本発明の態様によるペプチドなど）で免疫化し、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するか、産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏにて免疫化してもよい。その後、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する。不死化細胞系は、哺乳類細胞、特に、齧歯類、ウサギ、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞に形質転換されることが多い。多くは、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞系が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、未融合の不死化細胞の成長または生存を阻害する１種類以上の物質を含み得る好適な培養液中で培養できるものである。たとえば、親細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠けている場合、ハイブリドーマ用の培養液は一般に、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の成長を阻害するためのヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含むことになる。
【００５９】
ハイブリドーマ細胞を培養する培養液を、モノクローナル抗体の有無についてアッセイすることが可能である。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によって、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって判断する。このような技術およびアッセイは、従来技術において周知である。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、この細胞を限界希釈法によってサブクローニングし、周知の方法で成長させる。モノクローナル抗体については、たとえば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、培養液から単離または精製してもよい。また、モノクローナル抗体は、本明細書に援用する米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されているものなどの組換えＤＮＡ法によっても作製可能である。当業者間で周知の抗体を生成するための他の方法も、本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００６０】
したがって、一態様では、懐妊被験者の潜在的な早産を検査するための方法が得られる。このような方法は、被験者から生物学的試料を取得し、抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で、本明細書に記載のバイオマーカーのうちの１つと同一または相同なアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドに対して免疫学的に特異な少なくとも１つの抗体に生物学的試料を接触させ、抗体抗原複合体の形成をアッセイして、生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーを検出および定量化することを含むものであってもよい。生物学的試料における目的のバイオマーカーの存在と量が、早産の危険性を示す指標となる。
【００６１】
以上説明したように、生物学的試料におけるペプチドを検出および／または定量化できるさまざまなイムノアッセイが周知である。一態様では、イムノアッセイが競合アッセイであってもよい。たとえば、検査対象ペプチドの配列を有する標識ペプチドを、ペプチド配列の少なくとも一部に特異な抗体と接触させ、抗体抗原（またはペプチド）複合体の形成を可能にする。このペプチド／抗体混合物に生物学的試料を加えて、生物学的試料に含まれる目的のペプチドが標識ペプチドと競合して、標識の強度を低下させられるようにする。競合アッセイは、従来技術において周知の一段階または二段階のプロトコールを含むものであってもよい。
【００６２】
もうひとつの態様では、イムノアッセイが非競合アッセイであってもよいし、サンドイッチアッセイであってもよい。このようなアッセイでは通常、アッセイの敏感度と特異度のレベルが高い。この非競合アッセイフォーマットでも、一段階または二段階のプロトコールを利用できる。通常、このようなアッセイは、物理的な支持体に固定化された抗体を含み、そこで固定化された抗体が目的のペプチド（すなわちバイオマーカー）に対して免疫学的に特異である。同じく目的のペプチドに対して免疫学的に特異な標識抗体と一緒に、支持体に生物学的試料を加える。生物学的試料に存在するペプチドは、支持体に沿って固定化された抗体と結合する。標識抗体はまた、目的のペプチドにも結合するため、ペプチドおよび固定化抗体によって物理的な基質にも固定化される。標識抗体の標識を検出し、生物学的試料におけるバイオマーカーの量を定量化するとともに、対照（すなわち、早産に至らない懐妊被験者）と比較することが可能である。プロトコールによっては、標識の検出前に非固定化標識抗体を洗い流すことが可能である。この場合、標識の強度が、生物学的試料に存在するバイオマーカーの量に対する量に比例する。
【００６３】
従来技術において周知の固相支持体基質の多数の構成が企図される。このような基質は、抗体または抗体アンカーなどの検出物質の固定化に好適な基質を含むものであってもよい。たとえば、好適な基質は、抗体の機能性に大きく影響することなく検出物質との間で結合を形成できる、固体有機物、バイオポリマーまたは無機支持体物質などの固相支持体を含むものであってもよい。有機固体支持体物質の例としては、ポリスチレン、ナイロン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂などのポリマー、ポリアクリルアミドなどのアクリルコポリマーといったものがあげられるが、これに限定されるものではない。バイオポリマー支持体物質としては、セルロース、ポリデキストラン、アガロース、コラーゲン、キチンなどがあげられるが、これに限定されるものではない。無機支持体物質の例としては、ガラスビーズ（多項性および非多孔性）、ステンレス鋼、ＺｒＯ2、ＴｉＯ2、Ａｌ2Ｏ3およびＮｉＯなどの多孔性セラミックを含む金属酸化物、砂などがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
従来技術において周知の多数の特異的アッセイ方法を、本明細書で使用する（ｓｕｅｄ）ことが可能である。このような特異的アッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、免疫比濁阻害法（ＮＩＡ）、微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）、化学発光磁気イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）などのプロトコールがあげられる。
【００６５】
検出可能なさまざまな標識を、本発明の態様に従って抗体に結合させることができる。適切な標識としては、放射性核種（125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ、32Ｐなど）、酵素（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）など）、蛍光部分またはタンパク質（フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、ＢＦＰなど）または発光部分（ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ ＣＯＲＰ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．から提供されるＱｄｏｔ（登録商標）ナノ粒子など）があげられるが、これに限定されるものではない。上述のさまざまなイムノアッセイを実施するにあたって用いられる一般的な方法は、当業者間で周知である。
【００６６】
イムノアッセイに加えて、生物学的試料におけるペプチドを検出するための別の方法も企図され、いずれも本発明の範囲内に包含されるものとする。一態様では、たとえば質量分析（ＭＳ）技術を利用できる。ひとつの具体例として、マトリックス支援レーザー脱離イオン化などの高スループットＭＳ分析技術があげられる。このような技術では、１時間あたり数百の生物学的試料を迅速に処理できる特別な施設に試料を送ってもよい。
【００６７】
また、本明細書で説明するのは、懐妊被験者由来の生物学的試料を検査して、早産の危険性を評価するためのキットである。このようなキットを、病院、クリニック、参照試験所、診察所などで採用して、医療上の判断をくだす、あるいは必要があれば、利用可能な治療法または介入を提供する助けとすることができる。また、このようなキットは、早産に関連する他の医学的症状の診断、予後または危険性の評価を可能にするものでもある。
【００６８】
したがって、一態様では、懐妊被験者の潜在的な早産を検査するためのキットが得られる。このようなキットは、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４を有する少なくとも１つのバイオマーカーと選択的に結合できる少なくとも１つのモノクローナル抗体と、少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を定量化するのに使用可能な、少なくとも１つのバイオマーカーと少なくとも１つのモノクローナル抗体との間の抗体抗原複合体の形成をアッセイするために抗体と機能的に関連したインジケーターと、を含むものであってもよい。このキットは、使用される特定の検査アッセイに必要または有益な試薬をさらに含むものであってもよい。
【００６９】
このキットは、生物学的試料におけるバイオマーカーを検出および定量化する手段を含むものであってもよく、キットの内容物は、使用する検出アッセイのタイプに応じて必然的に変化するものであってもよい。必要な試薬に加えて、キットは、目的の結合ペプチドのための抗体またはそのフラグメント、固体基質、抗体抗原複合体を検出するための別の抗体などを含み得る。上記にて提案したとおり、抗体または抗体フラグメントは、遊離形態で存在するものであってもよいし、プラスチック皿、試験管、試験棒、ビーズなどの基質に固定化されていてもよい。キットはまた、陽性対照または陰性対照、洗浄液、希釈緩衝液などの検出および／または標識用の好適な試薬ならびに、指示書を含むものであってもよい。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、本明細書に記載して権利請求している化合物、組成物および方法を、どのようにして作製および評価するのかについての完全な開示および説明を当業者に与えるために出すものであり、純粋に例示としてのものを意図しており、本発明者らが自らの発明であるとみなしている範囲を限定することを意図したものではない。数量（たとえば、量、温度など）に関しては正確さを期するために努力をしているが、若干の誤差や偏差も考慮に入れなければならない。特に明記しないかぎり、部は重量部、温度は℃または周囲温度、圧力は大気圧またはその前後である。ここに記載のプロセスで得られる生成物の純度と収率を最適化するのに使用可能な成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力および他の反応範囲および条件などの反応条件には、多数のバリエーションまたは組み合わせがある。このようなプロセス条件の最適化には、合理的かつ常法による実験だけが必要であろう。
【００７１】
血清採取
妊娠２４週目または２８週目に採血した１６０名の妊婦で研究を実施し、妊娠が終わるまで追跡した。これらの女性のうち８０名が合併症のない妊娠で、早産（ＰＴＢ）の兆候は何ら認められなかった。この女性たちで対照群を構成した。残りの８０名の女性にはＰＴＢ（妊娠期間３７週未満）があった。この女性たちをＰＴＢの症例とした。本明細書に記載のプロテオミクス技術を用いて、これら１６０名の女性の血清を研究した。
【００７２】
アセトニトリル沈殿
２容量のＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（４００μＬ）を血清２００μＬに加え、５秒間強くボルテックスして室温にて３０分間放置した。次に、（血清採取）由来の試料を、ＩＥＣ Ｍｉｃｒｏｍａｘ ＲＦ遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）にて室温で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心処理した。続いて、上清のアリコートを３００μＬのＨＰＬＣグレードの水が入った微小遠心管に移した。試料を軽くボルテックスして溶液を混合し、これをＬａｂｃｏｎｃｏ ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）にて約２００μＬまで凍結乾燥させた。凍結乾燥前に加える水の容量によって、溶液からアセトニトリルを完全に除去しやすくなる。これが必要なのは、アセトニトリルはタンパク質濃度を判断するのに用いるアッセイと不適合であることが理由である。製造業者の指示に従って実施するＢｉｏ−Ｒａｄマイクロタイタープレートタンパク質アッセイを用いて、上清タンパク質濃度を求めた。タンパク質４μｇを含有するアリコートを新しい微小遠心管に移し、ほぼ乾固するまで凍結乾燥させた。ＨＰＬＣ水を用いて試料を最大２０μＬまでにした後、２０μＬの８８％ギ酸を用いて酸性化した。
【００７３】
アセトニトリル処理（後沈殿）した血清試料（４０μＬ）を２５０μＬ容のポリプロピレン製コニカルバイアルにロードし、隔壁を有するポリプロピレン製のスナップキャップ（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で蓋を閉じ、４℃に保ったＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーの４８ウェルのプレートに入れた。０．１％ギ酸で酸性化したＨＰＬＣ水を用いて、ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーによって４０μＬ／分の流量で各血清試料を５μＬずつ液体クロマトグラフィガードカラムに注入した。酸性水を用いて、塩や他の不純物をガードカラムから洗い流した。ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーでは、カラムにロードした容量の３倍が引き出されるため、試料の容量が限られる場合は試料を手で注射する必要があった。これについては、ガードカラムの上流のブランクループに１０μＬ容量の試料を注入し、試料の代わりにＨＰＬＣ水の１０μＬ試料を注入するようＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーをプログラムすることで実現した。血清試料をガードカラムにロードし、コニカルバイアルからロードしたかのように脱塩した。
【００７４】
質量スペクトル分析用の液体クロマトグラフィ分離
キャピラリー液体クロマトグラフィ（ｃＣＬ）を実施して、試料を分画した。キャピラリーＬＣでは、１ｍｍ（１６．２μＬ）のマイクロボアガードカラム（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）と、インハウスで組み立てた内径１５ｃｍ×２５０μｍのキャピラリーカラムとを用いる。ＰＯＲＯＳ Ｒ１逆相培地（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を用いて、ガードカラムには乾燥充填、キャピラリーカラムにはスラリー充填した。水性相（９８％ＨＰＬＣグレードのＨ2Ｏ、２％アセトニトリル、０１．％ギ酸）と有機相（２％ＨＰＬＣ Ｈ2Ｏ、９８％アセトニトリル、０．１％ギ酸）を用いて、カラム平衡およびクロマトグラフ分離を実施した。分離については、９５％水溶液でカラム平衡３分、続いて６０％有機相まで２．７５％／分勾配増、これを７％／分で増加して９５％有機相の濃度にすることで達成した。勾配を９５％有機相で７分間保持し、試料の一層疎水性の成分を溶出させた後、５分かけて勾配を９５％水性相に戻してこの濃度で２分間保持して、カラムを再平衡させた。分離はいずれも、流量５μＬ／分で実施した。クロマトグラフィでは、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＣａｐｉｌｌａｒｙＨＰＬＣポンプシステムを、ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラー（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）と一緒に、Ａｎａｌｙｓｔ ＱＳ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の制御下で用いた。
【００７５】
ＭＳ解析
試料を流す前に毎日、外部対照を用いてＭＳ較正を実施した。必要があれば、設定を調節して信号対雑音比を最適化するとともに、敏感度を最大限にした。
【００７６】
このｃＬＣシステムを質量分析計に直接接続した。キャピラリーカラムからの排水をＩｏｎＳｐｒａｙソース（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってＱＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ Ｉ四重極直交飛行時間型質量分析計に送った。５分から開始して５５分まで、ｍ／ｚ５００から２５００のデータを回収した。流量が５μＬ／分の場合、試料をガードカラムから質量分析計に得るのに５分より長くかかり、５分より前には有用なデータが得られないため、開始時間の遅延をプログラムした。データ収集、処理、予備フォーマットは、Ａｎａｌｙｓｔ ＱＳ（登録商標）ソフトウェアパッケージにＢｉｏＡｎａｌｙｓｔのアドオンを加えた（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ものを用いて実現された。
【００７７】
各標本について５分から５５分のｃＬＣ溶出時間全体にわたって１秒ごとに質量スペクトルを得た。各被験者のｃＬＣ分画タンパク質枯渇血清の溶出特性を、全イオンクロマトグラムとして報告し、点検して前に流したヒト血清と一貫することを確認した。全存在量が通常の５０％未満または通常の２００％超え、あるいは不適切な標本がある場合は特徴的な一連の３つの広イオン強度領域を欠いている標本を再度流すか省いて、解析をやり直した。
【００７８】
ピークアライメント
異なる日とカラムでの試料の流が溶出時間を変える可能性があるため、有用なクロマトグラム（有用なクロマトグラム１５分から３５分前後）で２分前後の間隔で溶出される平均存在量の１０の内因性分子種を求めた。また、目的の溶出領域に対して２分のウィンドウを確立し、ファイルサイズを取り扱い可能なままにしておけるようにする。ＭＳコンピュータの抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）機能を利用して、各溶出時間マーカーについて所望のｍ／ｚ範囲の溶出画分を可視化する。それぞれの標本についてアライメントピークそれぞれの溶出時間を求め、これをＳｅｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ機能の平均によって２分のウィンドウの中心として使用する。これによって、すべての実施がそのウィンドウの同じ中点に対して整列される。次に、Ｓｈｏｗ Ｓｐｅｃｔｒａ機能を使って、全質量スペクトルから単一の平均質量スペクトルを作製する。
【００７９】
データ解析
Ｑ−Ｓｔａｒ（ｑ−ＴＯＦ）質量分析計をサポートしているＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェアプログラムによって、１６の個々の液体クロマトグラフの実施をまとめ、その中での同様の溶出時間での質量スペクトルを比較することができる。上述したようにして有用な溶出の２分のウィンドウ１０個を２０分間かけて確立し、データファイルの大きさを取り扱いできる程度に維持した。同じく上述したようにして２分のウィンドウを整列させた。２分の溶出間隔１０のうち、第１に分析するのは、一般にペプチド種の存在量が多いことから選択した第２の２分のウィンドウであった。ペプチドの多荷電状態の特徴的な見た目によってペプチドを同定したが、これは十分に画定されたピークのクラスターのように見える（単一のピークまたは複数のピークが１質量／電荷単位で分離されるのではなく、個々のピークのガウス形状が１質量／電荷単位未満で分割される。ＰＴＢに至っている８名の被験者からなる群と対照（ＰＴＢなし）の８名の被験者からなる群とを色で区別し、重ねた。次に、データを目視検査し、ひとつの色で優勢に見える分子種を記録した。使用したソフトウェアは、１６の試料しか可視化できない状態に限られていた。１６を超えるサンプリングサイズの場合、複数のデータセット比較を実施する。さらに考慮される化合物では、データセットの少なくとも三分の二において２つの群間で同じ明確な差が観察される必要があった。
【００８０】
次に、２つの研究群間で異なるように見える分子を個々に調べた。これらの候補種はいずれも、ペプチドであった。定量的データを抽出する前に、質量スペクトルを検討してペプチドピークが同じｍ／ｚを有し、なおかつ同じ荷電状態を表すことを保証し、さらに同じペプチドが検討対象となっていることを保証する。また、第２の付近のピークは、２つの群間で存在量に差は認められなかったが、これを参照として選択した。このピークを使用して、目的の候補ピークを正規化し、標本プロセシング、標本ローディング、イオン化効率の変動性を補正した。
【００８１】
次に、Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェアで分子種を「抽出」し、毎回実行するごとに個々の分子種の最大ピークを求める。この特徴は、特定のｍ／ｚの調査を２分の溶出画分ウィンドウに制限しなかったため、結果としてｃＬＣ溶出時間をアライメントするのに用いられるピークをさらに利用して、溶出画分特性における場所が同じことを保証し、毎回同じ分子種が選択されたことを保証する。
【００８２】
それぞれの分子種のピーク高さを、その存在量を示す合理的な推定因子とみなした。各候補化合物の存在量を表にまとめ、それぞれの候補種の算出値を近くの参照種と比較した。単一の種を考慮しているため、２つの群間で、このペプチドの存在量で考えられる差の評価には一変量統計解析を利用した。
【００８３】
内因性時間アライメント分子
時間アライメントに用いた参照ピークの質量および代表的な溶出時間を表１にまとめておく。
【００８４】
【表１】
【００８５】
妊婦のあらゆる血清に存在するこれらの内因性分子種の場所に関する知識も、これをキャピラリー液体クロマトグラフィ溶出画分特性内のＰＴＢバイオマーカーのアライメントおよび局在化用の時間マーカーに使用するのを可能にする。
【００８６】
バイオマーカーの特徴
時間アライメント後に、各々色を付けたＰＴＢ症例と対照で複数の質量スペクトルが重なった初期プロセスでバイオマーカー候補を可視的に同定した。優位に一方の色に見えるピークをさらに研究した。個々のスペクトルについて、ＱｑＴＯＦ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）用のオペレーティングシステムであるＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたコンピュータでピーク高を求めた。次に、バイオマーカーの量を表にした。また、同じ時間ウィンドウで発生した第２のピークは、症例と対照とで定量的に異なるものではなく、同じく選択した。これは、非生物学的な変動性を減らすための内因性対照を表していた。これについては、候補ピークの量を内因性対照の量で割って達成した。それぞれの標本での比の大きさを記録し、ＰＴＢ症例と対照とを比較するスチューデント検定を用いて統計的な差を求めた。
【００８７】
４つの種は十分に異なっていた（ｐ＜０．０００１）ことから、２つの群の優れた分離を可能にできるのではないかと思われる。４つのＰＴＢバイオマーカーの個々の質量および溶出時間を表２にまとめておく。
【００８８】
【表２】
【００８９】
溶出時間（保持時間）を内部時間対照の関数として表した。これは、バイオマーカーに先行する時間マーカーと目的のピークに続く時間マーカーとの間の目的のピークの相対位置によって求めた。これは以下の式によって算出した。
Ｒf＝（バイオマーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）／（後続の時間マーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）
【００９０】
Ｒf値のほうが実際の溶出時間よりも信頼性が高かった。溶出時間は新たなカラムまたは付着物のある既存のカラムの性能の変化に応じて変化することがあるが、Ｒfはこれらの変化によって変わることがなかった。５つのバイオマーカーのＲf値を表３にあげておく。
【００９１】
【表３】
【００９２】
内因性同時溶出対照に対する参照による変動性の減少
現段階の血清プロテオミクス手法の特徴のひとつに、あらゆる種で見いだされ、症例と対照とで違わなかった内因性分子を使用することがある。バイオマーカー存在量を、この内部対照に対して正規化すると、非生物学的な変化が減り、危険性の予測にバイオマーカーを利用する機能が改善される。正規化には、目的のピークの存在量を参照ピークで数学的に割ることを含む。存在量は、機械で導き出した値であった。特定の分子の存在量は、特定の質量スペクトルで質量分析計によって測定される特定質量のイオン数あるいは、全溶出期間を表すいくつかの質量スペクトルで観察される特定質量の合計を示す。分子は一般に、クロマトグラフィのカラムを移動して外に出るのに１．０〜１．５分間必要とするのに対し、質量スペクトルはその溶出期間で１秒ごとに得られる。
【００９３】
現時点の４つのピークには、内部参照を用いた。バイオマーカーピークｍ／ｚ６７６．７には、ｍ／ｚ６７３．３での同時溶出参照ピークを用いた。バイオマーカーｍ／ｚ８５６．８および８６０．０には、ｍ／ｚ８４３．８での同時溶出参照ピークを選択した。バイオマーカーｍ／ｚ７９４．８では、ｍ／ｚ５９５．３での同時溶出参照を選択した。これらの比を使用して、ｌｏｇ比の平均値を求めた（表４）。
【００９４】
【表４】
【００９５】
早産に至る危険性のある女性の予測にバイオマーカーを使用
上述したように、バイオマーカーの予測力についての一般的な尺度の一つが、その敏感度と特異度である。ＰＴＢを発症する危険性のある被験者を識別するために、表４に示す４つのｌｏｇ比それぞれの閾値を求めた。それぞれの閾値については、特異度（真陰性率）が８０％以上になるようにして算出した。上述のように、これは偽陽性率が２０％以下であるのと同じである。これらの数学的に求めた閾値を使用して、４つの比で独立して、表５に示すような以下の敏感度（真陽性）と特異度（真陰性）の比を得た。
【００９６】
【表５】
【００９７】
敏感度は、真陽性率として定義される統計用語であり、この場合は具体的に、バイオマーカーで正しく識別された、後にＰＴＢを発症した妊婦の比率である。特異度は真陰性率として定義され、この場合は、正しく識別された、妊娠に合併症を併発しない妊婦の比率である。このようにして予測にバイオマーカーを使用するには、数字での閾値を設定しなければならない。その数字での値を設定するには、一般に、バイオマーカーに対する値の範囲を、最小から最大まで考慮し、それぞれの点で正しく陽性と識別された被験者の割合と、その同じ点で誤って陽性と識別された対照の割合を考慮する。これを受診者動作特性曲線（ＲＯＣ）と呼ぶ。偽陽性率は２０％に限定する。これは、一般に臨床試験で許容できる最大値とされる。真陰性率を１００％から差し引いて、偽陽性率（バイオマーカーでは後にＰＴＢの危険性があると識別されたが、妊娠に合併症を併発しない女性すなわち対照群の比率）を算出する。閾値が偽陽性率２０％以下（特異度８０％以上と等価）であれば何でも、ある人に危険性があるか危険性がないかを判断するのに用いられる閾値が決まることになる。後のＰＴＢの危険性のある被験者を識別できるようにする４つの比それぞれの閾値を求めた。それぞれの閾値については、特異度（真陰性率）が８０％以上になるようにして算出した。上述のように、これは偽陽性率が２０％以下であるのと同じである。これらの数学的に求めた閾値を使用して、４つの比で独立して表５に示すような敏感度（真陽性）と特異度（真陰性）の率を得た。ピークの組み合わせは、６７７でのピークが後のＰＴＢを予測する機能を有意には改善しなかった。
【００９８】
現段階のＰＴＢバイオマーカーの同一性
親ペプチドのフラグメンテーションを引き起こす２つの質量分析計の間に衝突セルを挟んだタンデムＭＳを用いて、検索可能なデータベース（ＭＡＳＣＯＴ）と比較して第２のＭＳステップで観察されたフラグメンテーションパターンからアミノ配列を求めた。このペプチドのうちの３つは、同じ親タンパク質すなわちインターαトリプシン阻害剤重鎖４（ＩＴＩＨ４）由来であったのに対し、最終ペプチドは第２のタンパク質すなわちインターαトリプシン阻害剤重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）から得られた。表６にバイオマーカー（配列番号１〜４）をあげておく。
【００９９】
【表６】
【０１００】
これらのペプチドは、インターαトリプシン阻害剤と呼ばれるタンパク質スーパーファミリから生じるように見える。具体的には、このペプチドは、インターαトリプシン阻害剤重鎖４のアイソフォーム１（ＩＴＩＨ４−１）およびアイソフォーム２（ＩＴＩＨ４−２）のアイソフォームであると現時点でみなされている異なるタンパク質に由来しているように見える。２つのアイソフォームは若干の配列相同性を有するが、他方には見られないアミノ酸の部分も有する。２つのアイソフォームは、単に他方から切断したものを表すものではない。
【０１０１】
ＥＬＩＳＡアッセイＩ
以下のＥＬＩＳＡアッセイを利用して、生物学的試料における目的のバイオマーカーを検出および定量化することが可能である。目的のペプチド（抗原）に対して免疫学的に特異な第１の抗体を、９６ウェルのマイクロタイタープレートの表面に吸着させる。２５マイクロリットルの血清または目的のペプチドの周知のグレード濃度の標準を個々のウェルに加える。血清を第１の抗体と一緒に３０分間インキュベートする。ウェル表面にコーティングされた第１の抗体が抗原を結合し、これを固定化する。抗原に対して免疫学的に特異な第２の抗体を含有する第２の溶液２００マイクロリットルを、それぞれのウェルに加える。第２の抗体については、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのマーカーまたは化学発光前駆体で標識しておく。ウェルを３０分間インキュベートし、第２の抗体が抗原−第１の抗体複合体と結合して、それ自体がウェルの表面に結合した抗体−抗原−抗体「サンドイッチ」を形成できるようにする。次にウェルを慎重かつ十分に洗浄し、未結合の第２の抗体を除去する。さらに、第２の抗体標識に対する特異的基質を含有する溶液を加える。西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、結合した第２の抗体の量に対応する色の変化がウェルに起こる。化学発光マーカーの場合、基質は非化学発光分子種から、化学発光製品に変換される。製品によって放出される光は、ウェルに存在する抗原の量に比例し、「プレートリーダー」で測定される。このプレートリーダーは、特定の波長で放出された光を測定し、その強度を記録する特別なスペクトロメータである。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡアッセイＩＩ
以下のＥＬＩＳＡアッセイを利用して、目的のバイオマーカーを生物学的試料で検出および定量化することが可能である。このアッセイは、第２の抗体をビオチン分子で標識すること以外はＥＬＩＳＡアッセイＩと同様である。抗体−抗原−抗体形成後のウェルの洗浄に続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンを含む溶液をウェルに加え、ビオチン分子と反応させる。この特定のアッセイでは、未着色の基質が着色製品に変換される。特定波長の光の吸光度として測定した色の強度は、ウェルに存在する抗原の量に比例する。その吸光度と、既知でグレード濃度の抗原の一連の較正標準の吸光度ｖｓ．濃度のプロットとを比較をすれば、未知の濃度を推測することが可能である。
【０１０３】
上述した組成物および応用モードは、本発明の好ましい実施形態を示す例示的なものにすぎない旨を理解されたい。当業者であれば、本発明および添付の特許請求の範囲の主旨および範囲から逸脱することなく、多数の改変例および別の配置を考案でき、このような改変例やアレンジメントも包含することを意図している。よって、本発明については、現時点で本発明の最も実用的かつ好ましい実施形態であると思われるものに関連して詳細かつ入念に説明したが、本明細書に記載の原理および概念を逸脱することなく、大きさ、物質、形状、形態、機能および動作方式、組立および用途の違いを含むが、これに限定されるものではない多数の改変をほどこし得ることは、当業者には自明であろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被験者由来の生物学的試料中に存在する、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４またはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つのバイオマーカーを検出し、
（ｂ）前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの量を定量化することを含む、懐妊被験者における早産の危険性を評価するための方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）が、少なくとも１つのバイオマーカーの存在量を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの存在量と、早産に至らなかった被験体に由来する対照生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの対照濃度とを比較して、早産の危険性が高いことを識別することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
早産の危険性が高いことを識別することが、前記生物学的試料における少なくとも１つのペプチドの存在量が、前記対照生物学的試料における少なくとも１つのペプチドの対照濃度よりも有意に低いと判断することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの存在量と、前記被験者から得た前記生物学的試料における参照分子の対照濃度とを比較し、早産の危険性が高いことを識別することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのバイオマーカーが、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を有する少なくとも２つのペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのバイオマーカーが、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を有する少なくとも３つのペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検出ステップ（ａ）がプロテオミクス技術を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
検出ステップ（ａ）が、（１）抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で、少なくとも１つのバイオマーカーに対して免疫学的に特異な抗体に前記生物学的試料を接触させ、（２）抗体抗原複合体の形成をアッセイして、前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、キャリア分子に結合またはコンジュゲートされている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、固相支持体に結合またはコンジュゲートされている、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体抗原複合体の形成後、前記固相支持体上の抗体に結合しない前記生物学的試料の成分を除去する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的試料が、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、頸膣液、洗浄液またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的試料が血清である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的試料が血液である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
アミノ酸配列が配列番号１からなる、単離されたペプチド。
【請求項１８】
アミノ酸配列が配列番号２からなる、単離されたペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列が配列番号３からなる、単離されたペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸配列が配列番号４からなる、単離ペプチド。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸配列を有する単離されたペプチドの混合物。
【請求項２２】
配列番号１からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な、単離された抗体。
【請求項２３】
配列番号２からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な、単離された抗体。
【請求項２４】
配列番号３からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な、単離された抗体。
【請求項２５】
配列番号４からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な、単離された抗体。
【請求項２６】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
（ａ）被験者から生物学的試料を取得し、
（ｂ）抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４を含むアミノ酸またはそれらの組み合わせを有する少なくとも１つのバイオマーカーに対して免疫学的に特異な少なくとも１つの抗体に前記生物学的試料を接触させ、
（ｃ）抗体抗原複合体の形成をアッセイして、前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーを定量化し、
（ｄ）前記生物学的試料におけるバイオマーカーの量を、早産に至らなかった被験者における同じバイオマーカーの量と比較して、早産の危険性を評価することを含む、懐妊被験者における早産の危険性を評価するための方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの抗体が少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つのバイオマーカーに選択的に結合可能な少なくとも１つの抗体と、
（ｂ）少なくとも１つのモノクローナル抗体と少なくとも１つのバイオマーカーとの間の抗体抗原複合体の形成をアッセイするために前記抗体と機能的に関連するインジケーターと、を含む、懐妊被験者における早産の危険性を評価するためのキット。
【請求項３０】
前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの量を定量化するよう構成されたインジケーターをさらに含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項１】
（ａ）被験者由来の生物学的試料中に存在する、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４またはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つのバイオマーカーを検出し、
（ｂ）前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの量を定量化することを含む、懐妊被験者における早産の危険性を評価するための方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）が、少なくとも１つのバイオマーカーの存在量を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの存在量と、早産に至らなかった被験体に由来する対照生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの対照濃度とを比較して、早産の危険性が高いことを識別することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
早産の危険性が高いことを識別することが、前記生物学的試料における少なくとも１つのペプチドの存在量が、前記対照生物学的試料における少なくとも１つのペプチドの対照濃度よりも有意に低いと判断することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの存在量と、前記被験者から得た前記生物学的試料における参照分子の対照濃度とを比較し、早産の危険性が高いことを識別することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのバイオマーカーが、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を有する少なくとも２つのペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのバイオマーカーが、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を有する少なくとも３つのペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検出ステップ（ａ）がプロテオミクス技術を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
検出ステップ（ａ）が、（１）抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で、少なくとも１つのバイオマーカーに対して免疫学的に特異な抗体に前記生物学的試料を接触させ、（２）抗体抗原複合体の形成をアッセイして、前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、キャリア分子に結合またはコンジュゲートされている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、固相支持体に結合またはコンジュゲートされている、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体抗原複合体の形成後、前記固相支持体上の抗体に結合しない前記生物学的試料の成分を除去する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的試料が、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、頸膣液、洗浄液またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的試料が血清である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的試料が血液である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
アミノ酸配列が配列番号１からなる、単離されたペプチド。
【請求項１８】
アミノ酸配列が配列番号２からなる、単離されたペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列が配列番号３からなる、単離されたペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸配列が配列番号４からなる、単離ペプチド。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸配列を有する単離されたペプチドの混合物。
【請求項２２】
配列番号１からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な、単離された抗体。
【請求項２３】
配列番号２からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な、単離された抗体。
【請求項２４】
配列番号３からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な、単離された抗体。
【請求項２５】
配列番号４からなるアミノ酸配列を有するペプチドに対して免疫学的に特異な、単離された抗体。
【請求項２６】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
（ａ）被験者から生物学的試料を取得し、
（ｂ）抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４を含むアミノ酸またはそれらの組み合わせを有する少なくとも１つのバイオマーカーに対して免疫学的に特異な少なくとも１つの抗体に前記生物学的試料を接触させ、
（ｃ）抗体抗原複合体の形成をアッセイして、前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーを定量化し、
（ｄ）前記生物学的試料におけるバイオマーカーの量を、早産に至らなかった被験者における同じバイオマーカーの量と比較して、早産の危険性を評価することを含む、懐妊被験者における早産の危険性を評価するための方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの抗体が少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つのバイオマーカーに選択的に結合可能な少なくとも１つの抗体と、
（ｂ）少なくとも１つのモノクローナル抗体と少なくとも１つのバイオマーカーとの間の抗体抗原複合体の形成をアッセイするために前記抗体と機能的に関連するインジケーターと、を含む、懐妊被験者における早産の危険性を評価するためのキット。
【請求項３０】
前記生物学的試料における少なくとも１つのバイオマーカーの量を定量化するよう構成されたインジケーターをさらに含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項２９に記載のキット。
【公表番号】特表２０１０−５３４３４１（Ｐ２０１０−５３４３４１Ａ）
【公表日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１８３０２（Ｐ２０１０−５１８３０２）
【出願日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７０３２０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１４９８７
【国際公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【出願人】（５１００１９６２４）ザ ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション (1)
【出願人】（５１００１９６３５）ブリガム ヤング ユニバーシティ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７０３２０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１４９８７
【国際公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【出願人】（５１００１９６２４）ザ ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション (1)
【出願人】（５１００１９６３５）ブリガム ヤング ユニバーシティ (1)
【Ｆターム（参考）】
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