核酸ハイブリダイゼーション用のマイクロ流路、マイクロチップ、カラム及び装置と核酸ハイブリダイゼーション方法
【課題】肺がんの早期診断マーカーとして応用が期待される、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを簡便かつ高感度に検出するための方法と装置の提供。
【解決手段】ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡが含まれるサンプル液が通流され、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な特定の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体（アガロースゲルビーズ）２が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタ１１３によって保持された状態で充填された、核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路１１。
【解決手段】ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡが含まれるサンプル液が通流され、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な特定の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体（アガロースゲルビーズ）２が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタ１１３によって保持された状態で充填された、核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路１１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、核酸ハイブリダイゼーション用のマイクロ流路、マイクロチップ、カラム及び装置と核酸ハイブリダイゼーション方法に関する。より詳しくは、がん関連遺伝子であるｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを核酸ハイブリダイゼーションによって検出するためのマイクロ流路等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｈｎＲＮＰ（heterogeneous nuclear ribonucleo- protein）は、pre−messenger RNAに結合し、その代謝や輸送に関与している。ヒトでは約２０種類のｈｎＲＮＰが同定されている。このうち「ｈｎＲＮＰ−Ｂ１」は、肺がん組織において過剰発現することが知られ、他のがん組織でも多く発現することが明らかにされている。ｈｎＲＮＰ−Ｂ１は、これらのがんの初期段階から発現するため、がんの早期診断マーカーとしての応用が検討されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
本技術に関連して、近年、核酸間のハイブリダイゼーション反応を流路やキャピラリー（以下、これらを「マイクロ流路」とも称する）内で進行させる技術が提案されている。例えば、特許文献１には、ポリヌクレオチドの増幅を行う部分と、検出用オリゴヌクレオチドが固定されている多孔質層を有するハイブリダイゼーション部分とが、流路によって連結されているポリヌクレオチドの分析用部材が開示されている。また、特許文献２には、毛細管状の流路の内壁にプローブ化合物を固定して、被検ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションを進行させるポリヌクレオチドの分析方法が開示されている。
【０００４】
本発明者らは、特許文献３において、マイクロ流路内での目詰まりを防止し、内圧上昇を防止することが可能なマイクロ流路系を提供している。このマイクロ流路系は、標的核酸鎖に相補的な塩基配列を有し、捕捉鎖を多孔質担体に固相化した核酸分離用担体が充填されたものである（当該文献、請求項６参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１３０７９５号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１２２６号公報
【特許文献３】特開２００９−２６８３８５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"Establishment of a new method, transcription-reverse transcription concerted reaction, for detection of plasma hnRNP B1 mRNA, a biomarker of lung cancer." J. Cancer Res. Clin. Oncol., 2008, Vol.134, No.11, p.1191-1197
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１はがんの早期診断マーカーとして期待されており、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子の発現検出はがんの診断及び治療のため非常に重要である。
【０００８】
そこで、本技術は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを簡便かつ高感度に検出するための技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題解決のため、本技術は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡが含まれるサンプル液が通流され、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填された、核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路を提供する。
このマイクロ流路では、核酸分離用担体として光透過性を有するアガロースゲル担体を充填しているため、励起光や蛍光の遮断や反射、散乱を抑制できる。また、アガロースゲル担体を保持するためのフィルタを送液方向下流側にのみ配設しているため、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを断片化していない状態で捕捉鎖に接触させることができる。
また、本技術は、上記マイクロ流路が形成され、マイクロ流路へのサンプル液の導入口と、マイクロ流路からのサンプル液の排出口と、が配設された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ及びカラムを提供する。
さらに、本技術は、上記マイクロチップと、前記導入口に導入されるサンプル液を加熱する加熱部、及び／又はマイクロ流路内の温度を制御する温度制御部と、を備える核酸ハイブリダイゼーション装置をも提供する。
【００１０】
併せて、本技術は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填されたマイクロ流路に、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを含むサンプル液を通流させる手順と、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号２記載の塩基配列を有する検出鎖を含む溶液を前記マイクロ流路に通流させる手順と、
を少なくとも含む核酸ハイブリダイゼーション方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本技術により、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを簡便かつ高感度に検出するための技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本技術に係るマイクロ流路が形成された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップの構成を説明する模式図である。（Ａ）は上面図、（Ｂ）は（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する断面図である。
【図２】アガロースゲルビーズ２表面の物質構成を説明する模式図である。
【図３】本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の手順を説明するフローチャートである。
【図４】本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の各手順におけるアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を説明する模式図である。
【図５】本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション装置の構成を説明する模式図である。
【図６】実施例１において核酸ハイブリダイゼーション方法の各手順で測定された蛍光強度値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
１．核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路及びマイクロチップ
（１）核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ
（２）アガロースゲル担体
２．核酸ハイブリダイゼーション方法
（１）コンディショニング
（２）サンプル液の通流と洗浄
（３）検出鎖溶液の通流と洗浄
（４）検出
３．核酸ハイブリダイゼーション装置
【００１４】
１．核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路及びマイクロチップ
（１）核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ
図１は、本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路が形成された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップの構成を説明する模式図である。図１（Ａ）は上面図、（Ｂ）は（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する断面図である。
【００１５】
図中、符号１で示す核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ（以下、「マイクロチップ」と略記する）には、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡが含まれる溶液（以下、「サンプル液」と称する）が通流されるマイクロ流路１１が形成されている。符号１１１は、マイクロ流路１１へのサンプル液の導入口を示す。また、符号１１２は、マイクロ流路１１からのサンプル液の排出口を示す。導入口１１１から送液されたサンプル液は、マイクロ流路１１内を通流して排出口１１２から排液される。
【００１６】
マイクロ流路１１内には、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを分離するための核酸分離用担体としてアガロースゲル担体（以下、「アガロースゲルビーズ」と称する）が充填されている。アガロースゲルビーズ２のサンプル液送液方向下流側には、フィルタ１１３が配設されている。フィルタ１１３には細孔が形成されており、この細孔はサンプル液やサンプル液中のｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡや塩、界面活性剤等の物質を透過させるが、アガロースゲルビーズ２を通過させないような孔径とされている。これにより、フィルタ１１３は、マイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲルビーズ２を保持して、流路内を通流するサンプル液とともにアガロースゲルビーズ２が排出口１１２から排出されるのを防止する。フィルタ１１３の細孔径は、アガロースゲルビーズ２の大きさに応じて適宜設計され得るが、例えば０．５〜２０μｍ程度、より好ましくは１０μｍ程度とされる。
【００１７】
フィルタ１１３は、マイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲルビーズ２の送液方向下流側のみに設けられ、上流側には配されていない。フィルタを上流側に設けた場合、アガロースゲルビーズ２をマイクロ流路１１内により安定的に保持することができる。しかし、サンプル液中に含まれるｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡがフィルタを通過する際に切断、断片化されてしまうおそれが生じる。ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡがアガロースゲルビーズ２と接触する前に断片化してしまうと、アガロースゲルビーズ２に固相化された捕捉鎖との間のハイブリダイゼーション反応の効率が低下する。
【００１８】
マイクロチップ１は、マイクロ流路１１が成形された基板層１ｂと、導入口１１１及び排出口１１２が形成された基板層１ａと、を貼り合せて構成されている。基板層１ａ，１ｂの材質は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの光学検出のため光透過性を有する材質とされ、例えばガラスや各種プラスチック（ＰＰ，ＰＣ，ＣＯＰ、ＰＤＭＳ）とされる。基板層１ａ，１ｂの材質は、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいために、光学誤差の少ない材質を選択することが好ましい。
【００１９】
マイクロ流路１１等の基板層１ａ，１ｂへの成形は、ガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチングによって、またプラスチック製基板層のナノインプリントや射出成型、切削加工によって行うことができる。そして、マイクロ流路１１等を形成した基板層１ａ，１ｂを貼り合せることで、マイクロチップ１を形成できる。基板層の貼り合せは、例えば、熱融着、接着剤、陽極接合、粘着シートを用いた接合、プラズマ活性化結合、超音波接合等の公知の手法により行うことができる。なお、ここでは、マイクロチップ１にマイクロ流路１１を一つ設ける場合を例に説明するが、マイクロ流路１１の配設数は２以上としてもよい。
【００２０】
（２）アガロースゲル担体
図２は、アガロースゲルビーズ２表面の物質構成を説明する模式図である。ここでは、アガロースゲル担体としてアガロースゲルビーズを用いる場合を例に説明する。
【００２１】
アガロースゲルビーズ２の表面には、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡをビーズ上に捕捉するための捕捉鎖２１が固相化されている。捕捉鎖２１は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な配列番号１記載の塩基配列を有し、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと相互作用して二本鎖（ハイブリッド）を形成する。相補鎖２１は、ＤＮＡやＲＮＡに加えて、これらのリボース部分の構造を改変して得られる核酸類似体（例えば、LNA（Locked Nucleic Acid））等からなるオリゴマーとされる。
【００２２】
【表１】
【００２３】
捕捉鎖２１の塩基配列の長さ（塩基数）は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有することにより、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと相互作用して二本鎖を形成し得る限りにおいて、配列番号１よりも長くあるいは短くされてもよい。また、捕捉鎖２１は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列を有している必要はなく、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの二本鎖形成が可能な限りにおいて、配列番号１中に１塩基又は２塩基以上のミスマッチ（非相補塩基）を有していてもよい。捕捉鎖２１の塩基配列は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度（Ｔｍ）が、後述する検出鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度と同程度となるように設計することが好ましい。
【００２４】
アガロースゲルビーズ２表面への捕捉鎖２１の固相化は、従来公知の手法によって行うことができ、例えばアビジン−ビオチン結合やカップリング反応（ジアゾカップリング反応など）によって行うことができる。アビジン−ビオチン結合を利用する場合には、アガロースゲルビーズ２表面にストレプトアビジンを固定化し、末端にビオチンを修飾した捕捉鎖２１をアビジン−ビオチン間の結合によって固相化する。また、捕捉鎖２１の固相化は、本発明者らが上記特許文献３に開示するイオン交換結合による手法を採用してもよい。
【００２５】
以上では、本技術に係るマイクロ流路を核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップとして実施する場合を例に説明した。本技術に係るマイクロ流路は上記特許文献３に開示されるような核酸ハイブリダイゼーション用カラムとしても好適に実施可能である。
【００２６】
２．核酸ハイブリダイゼーション方法
図３は、本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の手順を説明するフローチャートである。また、図４は、本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の各手順におけるアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を説明する模式図である。
【００２７】
（１）コンディショニング
図３、ステップＳ１では、導入口１１１からハイブリダイゼーション反応用の緩衝液を導入しマイクロ流路１１内に通液させて、アガロースゲルビーズ２のコンディショニングを行う。コンディショニングは、マイクロ流路１１内の液体を置換し、脱気するために行われる。ステップＳ１におけるアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を図４（Ａ）に示す。
【００２８】
（２）サンプル液の通流と洗浄
図３、ステップＳ２では、導入口１１１からサンプル液を導入しマイクロ流路１１内に通液させる。サンプル液は、骨髄細胞あるいは末梢血細胞から抽出したｍＲＮＡ溶液等を用いることができる。本ステップでは、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な塩基配列を有する捕捉鎖２１とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとが二本鎖を形成し、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡがアガロースゲルビーズ２表面に捕捉される。
【００２９】
ステップＳ２後のアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を、図４（Ｂ）に示す。図中、符号Ｔはサンプル液に含まれるｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ、符号ＮはｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ以外の核酸鎖（非標的核酸鎖）を示す。
【００３０】
サンプル液の導入は、ステップＳ１で用いたハイブリダイゼーション反応用の緩衝液を液相に用いて行うことが好ましく、より好ましくはアガロースが添加された前記緩衝液を液相に用いて行うことが好ましい。アガロース添加の液相を用いることで、マイクロ流路１１内のアガロースゲルビーズ２同士を緩やかに粘着させて安定させることができる。アガロースの液相への添加量は、０．０２〜０．２％程度、好ましくは０．０５％程度とされる。アガロース添加の液相は、本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の各ステップにおいても用いることができる。
【００３１】
捕捉鎖２１とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション反応用緩衝液の組成（例えば、塩や界面活性剤の濃度）やマイクロ流路１１内の温度を調整し、適当なハイブリッド形成条件下において行われる。ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの自己ハイブリッド形成を抑制するため、サンプル液を予め加温してマイクロ流路１１内に導入することが有効である。また、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの捕捉鎖２１への非特異的な吸着を抑制するため、サンプル液の通流時のマイクロ流路１１内を加温することが有効である。
【００３２】
サンプル液の通液後、導入口１１１から洗浄液を導入しマイクロ流路１１内に通液させ、アガロースゲルビーズ２の洗浄を行う。洗浄は、捕捉鎖２とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリッド形成が維持される条件にて行い、非標的核酸鎖と捕捉鎖２１に非特異的に吸着したｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとをマイクロ流路１１内から除去するために行う。
【００３３】
（３）検出鎖溶液の通流と洗浄
続いて、図３、ステップＳ３では、アガロースゲルビーズ２表面に捕捉されたｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを検出するための検出鎖溶液を導入口１１１からマイクロ流路１１内に導入する。本ステップでは、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な配列番号２記載の塩基配列を有する検出鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとが二本鎖を形成し、捕捉鎖２１−ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ−検出鎖のサンドイッチハイブリッドが形成される。なお、本ステップは、上記のステップＳ２と同時に行ってもよい。
【００３４】
【表２】
【００３５】
検出鎖は、捕捉鎖２１と同様に、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な塩基配列を有し、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと相互作用して二本鎖を形成する。検出鎖も、ＤＮＡやＲＮＡ、核酸類似体等からなるオリゴマーとされる。また、検出鎖の塩基配列の長さ（塩基数）も、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有することにより、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと相互作用し二本鎖を形成し得る限りにおいて、配列番号２よりも長くあるいは短くされてもよい。さらに、検出鎖は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列を有している必要はなく、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの二本鎖形成が可能な限りにおいて、配列番号２中に１塩基又は２塩基以上のミスマッチを有していてもよい。検出鎖の塩基配列は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度（Ｔｍ）が、捕捉鎖２１とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度と同程度となるように設計することが好ましい。
【００３６】
検出鎖には、蛍光物質や化学発光物質、放射性物質などの標識物質Ｌが標識（ラベル）される。次に説明するステップＳ４において、これらの標識物質Ｌから発生する蛍光や発光、放射線を検知することで、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの検出が行われる。
【００３７】
ステップＳ３後のアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を、図４（Ｃ）に示す。図中、符号Ｄは検出鎖を示す。検出鎖Ｄの溶液をマイクロ流路１１内に通液すると、捕捉鎖２１とハイブリッドを形成するｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ（符号Ｔ）に対し、さらに検出鎖Ｄがハイブリダイズする。これにより、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ（符号Ｔ）は捕捉鎖２１及び検出鎖Ｄとハイブリッドを形成し、サンドイッチハイブリッド（ダブルハイブリッド）となる。
【００３８】
検出鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション反応用緩衝液の組成（例えば、塩や界面活性剤の濃度）やマイクロ流路１１内の温度を調整し、適当なハイブリッド形成条件下において行われる。検出鎖のｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡへの非特異的な吸着を抑制するため、検出鎖溶液の通流時のマイクロ流路１１内を加温することが有効である。
【００３９】
検出鎖溶液の通液後、導入口１１１から洗浄液を導入しマイクロ流路１１内に通液させ、アガロースゲルビーズ２の洗浄を行う。洗浄は、検出鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリッド形成が維持される条件にて行い、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに非特異的に吸着した検出鎖をマイクロ流路１１内から除去するために行う。
【００４０】
（４）検出
図３、ステップＳ４では、アガロースゲルビーズ２表面に捕捉されたｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを、検出鎖に標識された標識物質から発生する蛍光や発光、放射線を検知することによって検出する。具体的には、例えば検出鎖に蛍光物質を標識した場合、アガロースゲルビーズ２に励起光を照射し、励起された蛍光物質から発生する蛍光を検知する。蛍光等の強度を測定すれば、蛍光強度等に基づいてｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを定量的に検出することもできる。
【００４１】
本技術においては、核酸分離用担体として光透過性を有するアガロースゲルビーズ２を用いている。アガロースゲルビーズ２では、励起光を照射した際に、励起光がビーズによって遮断されたり、反射あるいは散乱されたりすることがないため、これを充填したマイクロ流路１１では励起光が深部にまで到達でき、発生する蛍光も強い。また、励起光の戻り光を少なくでき、光検出器のダイナミックレンジを広くとることができる。さらに、アガロースゲルビーズ２では、蛍光物質から発せられる蛍光が担体によって遮断されたり、反射あるいは散乱されたりすることがない。従って、励起光や蛍光が担体によって遮断されるために生じる蛍光検出強度の減衰やバックグラウンドの上昇を排除して、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを高感度、高精度に検出できる。
【００４２】
３．核酸ハイブリダイゼーション装置
図５は、本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション装置の構成を説明する模式図である。
【００４３】
核酸ハイブリダイゼーション装置は、マクロチップ１と、マイクロチップ１のマイクロ流路１１内の温度を制御するヒートブロック１０３と、マイクロチップ１の導入口１１１に溶液を送液して排出口１１２から排液させる送液手段と、マイクロチップ１のマイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲルビーズ２に励起光を照射し、発生する蛍光を検出するための光学検出手段と、を備えている。
【００４４】
ヒートブロック１０３は、マイクロチップ１のマイクロ流路１１内を加熱又は冷却する温度制御部として機能する。ヒートブロック１０３は、上述のステップＳ３においてｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの捕捉鎖２１への非特異的な吸着を抑制するため、サンプル液の通流時にマイクロ流路１１内を加温する。また、ヒートブロック１０３は、上述のステップＳ４において検出鎖のｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡへの非特異的な吸着を抑制するため、検出鎖溶液の通流時にもマイクロ流路１１内を加温する。なお、ヒートブロック１０３は、通常使用されるヒーターであってよく、ペルチェ素子やジュール・トムソン素子等に置換してもよい。ヒートブロック１０３の温度は例えば６０℃とされる。
【００４５】
送液手段は、通常使用されるポンプやシリンジポンプ、チューブやバルブ等によって構成できる。送液手段には、導入口１１１に導入されるサンプル液を加熱する加熱部としてインラインヒーター１０２が含まれる。インラインヒーター１０２は、上述のステップＳ２においてｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの自己ハイブリッド形成を抑制するため、サンプル液を予め加温してマイクロ流路１１内に導入する。インラインヒーター１０２における加熱（熱変性）後、マイクロ流路１１のアガロースゲルビーズ２の充填領域まで送液される間に、サンプル液を急冷させることで、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの自己ハイブリッド形成を抑制できる。インラインヒーター１０２の温度は例えば９５℃とされる。
【００４６】
光学検出手段は、励起光光源と、マイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲルビーズ２に対して励起光を集光・照射する集光レンズやダイクロイックミラー、バンドパスフィルター等からなる照射系と、励起光の照射によって検出鎖に標識された蛍光物質から発生する蛍光を検出する検出系と、によって構成される。検出系は、例えば、PMT（photo multiplier tube）や、CCDやCMOS素子等のエリア撮像素子等によって構成される。なお、図では、光学検出手段として集光レンズ１０１のみを示している。また、図では、照射系と検出系を同一の光学経路により構成した場合を示したが、照射系と検出系は別個の光学経路により構成してもよい。
【実施例】
【００４７】
＜実施例１＞
１．ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ、捕捉鎖、検出鎖の合成
ヒトｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子をクローニングし、ｃＤＮＡからポリ（Ａ）を付加したｍＲＮＡを合成した。また、この合成ｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有する捕捉鎖と検出鎖を合成した（「表３」参照）。捕捉鎖と検出鎖は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子の塩基配列において重複しない領域に相補的となるように設計した。捕捉鎖の３´末端はビオチン化した。また、検出鎖の５´末端を蛍光色素（Ｃｙ３）により標識した。捕捉鎖及び検出鎖の解離温度（Tm）は、それぞれ７１℃及び７３℃と計算された。
【００４８】
【表３】
【００４９】
２．アガロースゲルビーズへの捕捉鎖の固相化
表面にストレプトアビジンが固定されたアガロースゲルビーズ懸濁液（Streptavidin Agarose Resin，Thermo Scientific）と捕捉鎖溶液を混合し、ストレプトアビジン−ビオチン結合によってアガロースゲルビーズ表面に捕捉鎖を固相化した。
【００５０】
３．核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップの作製
流路（流路幅0.5 mm，流路深さ0.5 mm，流路長24 mm）を切ったテフロン（登録商標）基板を２枚のアクリル基板で挟んで積層したマイクロチップを用意し、流路下流側に孔径１０μｍのフィルタを装着した。アガロースゲルビーズを流路に注入し、充填した。流路内のアガロースゲルビーズ充填領域の長さは２０ｍｍ程度とした。流路に流路切換バルブとシリンジポンプを配管した。
【００５１】
４．核酸ハイブリダイゼーション装置の構成
マイクロチップの流路と流路切換バルブとの間に、印加電圧制御により温度調節が可能なインラインヒーターを配管した。マイクロチップは、ヒートブロック上に設置した。
【００５２】
緑色ＬＥＤ光源を用意し、Ｃｙ３励起用フィルタと組み合わせて、Ｃｙ３の励起光源とした。分光器を用意し、Ｃｙ３蛍光用フィルタと組み合わせて、Ｃｙ３の蛍光検出器とした。２つの光ファイバを同軸にバンドルした光ファイバケーブルを用意し、励起光用光ファイバを励起光源に、受光用光ファイバを蛍光検出器に結線した。光ファイバケーブルの先端に設けた対物レンズを、流路内のアガロースゲルビーズに対向させた。これにより、流路内に充填されたアガロースゲルビーズに励起光を照射し、発生する蛍光を検出する光学系を構成した。なお、励起光の照射スポット径は５００μｍとした。
【００５３】
５．測定
ｍＲＮＡと検出鎖を0.2% SDS、0.3 M 塩化ナトリウム水溶液に溶解し，サンプル液を調製した。サンプル液３５０μlには、ｍＲＮＡと検出鎖がそれぞれ５μg、３ μg含まれた。
【００５４】
インラインヒーターを９５℃、ヒートブロックを６０℃に設定し，0.2% SDS、0.3 M 塩化ナトリウム水溶液を流路に送液し、アガロースゲルビーズのコンディショニングを行い、蛍光測定を行った。送液速度は５０μｌ／分とした。
【００５５】
サンプル液３００μｌを送液し、捕捉鎖とｍＲＮＡと検出鎖のサンドイッチハイブリダイゼーションを行った。0.2% SDS、0.3 M 塩化ナトリウム水溶液を２．１ｍｌ送液して洗浄し、蛍光測定を行った。
【００５６】
次に、ヒートブロックを８０℃に昇温し、液相を純水に変更して１．８ｍｌ送液することにより、ハイブリッドを解離（変性）させた。変性操作後に蛍光測定を行った。
【００５７】
コンディショニング後（Ａ）、サンプル液及び洗浄液の送液後（Ｂ）、変性操作後（Ｃ）の蛍光測定結果を図６に示す。コンディショニング後（Ａ）に比べて、サンプル液及び洗浄液の送液後（Ｂ）の蛍光強度が増大していることから、捕捉鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと検出鎖のサンドイッチハイブリッドの形成が確認される。また、変性操作後（Ｃ）、蛍光強度が減少したことから、上記の蛍光強度の増大が、捕捉鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと検出鎖の特異的なハイブリダイゼーションによるものであり、非特異的な吸着によるものではないことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション用のマイクロ流路等によれば、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを簡便かつ高感度に検出できる。従って、本技術は、肺がん等のがんの診断及び治療を目的としたｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子の発現検出のため有用である。
【符号の説明】
【００５９】
１：マイクロチップ、１ａ，１ｂ：基板層、１０１：集光レンズ、１０２：インラインヒーター、１０３：ヒートブロック、１１：マイクロ流路、１１１：導入口、１１２：排出口、１１３：フィルタ、２：アガロースゲルビーズ、２１：捕捉鎖、Ｄ：検出鎖、Ｌ：標識物質、Ｎ：非標的核酸鎖、Ｔ：ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本技術は、核酸ハイブリダイゼーション用のマイクロ流路、マイクロチップ、カラム及び装置と核酸ハイブリダイゼーション方法に関する。より詳しくは、がん関連遺伝子であるｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを核酸ハイブリダイゼーションによって検出するためのマイクロ流路等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｈｎＲＮＰ（heterogeneous nuclear ribonucleo- protein）は、pre−messenger RNAに結合し、その代謝や輸送に関与している。ヒトでは約２０種類のｈｎＲＮＰが同定されている。このうち「ｈｎＲＮＰ−Ｂ１」は、肺がん組織において過剰発現することが知られ、他のがん組織でも多く発現することが明らかにされている。ｈｎＲＮＰ−Ｂ１は、これらのがんの初期段階から発現するため、がんの早期診断マーカーとしての応用が検討されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
本技術に関連して、近年、核酸間のハイブリダイゼーション反応を流路やキャピラリー（以下、これらを「マイクロ流路」とも称する）内で進行させる技術が提案されている。例えば、特許文献１には、ポリヌクレオチドの増幅を行う部分と、検出用オリゴヌクレオチドが固定されている多孔質層を有するハイブリダイゼーション部分とが、流路によって連結されているポリヌクレオチドの分析用部材が開示されている。また、特許文献２には、毛細管状の流路の内壁にプローブ化合物を固定して、被検ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションを進行させるポリヌクレオチドの分析方法が開示されている。
【０００４】
本発明者らは、特許文献３において、マイクロ流路内での目詰まりを防止し、内圧上昇を防止することが可能なマイクロ流路系を提供している。このマイクロ流路系は、標的核酸鎖に相補的な塩基配列を有し、捕捉鎖を多孔質担体に固相化した核酸分離用担体が充填されたものである（当該文献、請求項６参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１３０７９５号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１２２６号公報
【特許文献３】特開２００９−２６８３８５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"Establishment of a new method, transcription-reverse transcription concerted reaction, for detection of plasma hnRNP B1 mRNA, a biomarker of lung cancer." J. Cancer Res. Clin. Oncol., 2008, Vol.134, No.11, p.1191-1197
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１はがんの早期診断マーカーとして期待されており、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子の発現検出はがんの診断及び治療のため非常に重要である。
【０００８】
そこで、本技術は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを簡便かつ高感度に検出するための技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題解決のため、本技術は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡが含まれるサンプル液が通流され、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填された、核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路を提供する。
このマイクロ流路では、核酸分離用担体として光透過性を有するアガロースゲル担体を充填しているため、励起光や蛍光の遮断や反射、散乱を抑制できる。また、アガロースゲル担体を保持するためのフィルタを送液方向下流側にのみ配設しているため、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを断片化していない状態で捕捉鎖に接触させることができる。
また、本技術は、上記マイクロ流路が形成され、マイクロ流路へのサンプル液の導入口と、マイクロ流路からのサンプル液の排出口と、が配設された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ及びカラムを提供する。
さらに、本技術は、上記マイクロチップと、前記導入口に導入されるサンプル液を加熱する加熱部、及び／又はマイクロ流路内の温度を制御する温度制御部と、を備える核酸ハイブリダイゼーション装置をも提供する。
【００１０】
併せて、本技術は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填されたマイクロ流路に、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを含むサンプル液を通流させる手順と、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号２記載の塩基配列を有する検出鎖を含む溶液を前記マイクロ流路に通流させる手順と、
を少なくとも含む核酸ハイブリダイゼーション方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本技術により、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを簡便かつ高感度に検出するための技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本技術に係るマイクロ流路が形成された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップの構成を説明する模式図である。（Ａ）は上面図、（Ｂ）は（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する断面図である。
【図２】アガロースゲルビーズ２表面の物質構成を説明する模式図である。
【図３】本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の手順を説明するフローチャートである。
【図４】本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の各手順におけるアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を説明する模式図である。
【図５】本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション装置の構成を説明する模式図である。
【図６】実施例１において核酸ハイブリダイゼーション方法の各手順で測定された蛍光強度値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
１．核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路及びマイクロチップ
（１）核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ
（２）アガロースゲル担体
２．核酸ハイブリダイゼーション方法
（１）コンディショニング
（２）サンプル液の通流と洗浄
（３）検出鎖溶液の通流と洗浄
（４）検出
３．核酸ハイブリダイゼーション装置
【００１４】
１．核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路及びマイクロチップ
（１）核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ
図１は、本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路が形成された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップの構成を説明する模式図である。図１（Ａ）は上面図、（Ｂ）は（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する断面図である。
【００１５】
図中、符号１で示す核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ（以下、「マイクロチップ」と略記する）には、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡが含まれる溶液（以下、「サンプル液」と称する）が通流されるマイクロ流路１１が形成されている。符号１１１は、マイクロ流路１１へのサンプル液の導入口を示す。また、符号１１２は、マイクロ流路１１からのサンプル液の排出口を示す。導入口１１１から送液されたサンプル液は、マイクロ流路１１内を通流して排出口１１２から排液される。
【００１６】
マイクロ流路１１内には、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを分離するための核酸分離用担体としてアガロースゲル担体（以下、「アガロースゲルビーズ」と称する）が充填されている。アガロースゲルビーズ２のサンプル液送液方向下流側には、フィルタ１１３が配設されている。フィルタ１１３には細孔が形成されており、この細孔はサンプル液やサンプル液中のｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡや塩、界面活性剤等の物質を透過させるが、アガロースゲルビーズ２を通過させないような孔径とされている。これにより、フィルタ１１３は、マイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲルビーズ２を保持して、流路内を通流するサンプル液とともにアガロースゲルビーズ２が排出口１１２から排出されるのを防止する。フィルタ１１３の細孔径は、アガロースゲルビーズ２の大きさに応じて適宜設計され得るが、例えば０．５〜２０μｍ程度、より好ましくは１０μｍ程度とされる。
【００１７】
フィルタ１１３は、マイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲルビーズ２の送液方向下流側のみに設けられ、上流側には配されていない。フィルタを上流側に設けた場合、アガロースゲルビーズ２をマイクロ流路１１内により安定的に保持することができる。しかし、サンプル液中に含まれるｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡがフィルタを通過する際に切断、断片化されてしまうおそれが生じる。ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡがアガロースゲルビーズ２と接触する前に断片化してしまうと、アガロースゲルビーズ２に固相化された捕捉鎖との間のハイブリダイゼーション反応の効率が低下する。
【００１８】
マイクロチップ１は、マイクロ流路１１が成形された基板層１ｂと、導入口１１１及び排出口１１２が形成された基板層１ａと、を貼り合せて構成されている。基板層１ａ，１ｂの材質は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの光学検出のため光透過性を有する材質とされ、例えばガラスや各種プラスチック（ＰＰ，ＰＣ，ＣＯＰ、ＰＤＭＳ）とされる。基板層１ａ，１ｂの材質は、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいために、光学誤差の少ない材質を選択することが好ましい。
【００１９】
マイクロ流路１１等の基板層１ａ，１ｂへの成形は、ガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチングによって、またプラスチック製基板層のナノインプリントや射出成型、切削加工によって行うことができる。そして、マイクロ流路１１等を形成した基板層１ａ，１ｂを貼り合せることで、マイクロチップ１を形成できる。基板層の貼り合せは、例えば、熱融着、接着剤、陽極接合、粘着シートを用いた接合、プラズマ活性化結合、超音波接合等の公知の手法により行うことができる。なお、ここでは、マイクロチップ１にマイクロ流路１１を一つ設ける場合を例に説明するが、マイクロ流路１１の配設数は２以上としてもよい。
【００２０】
（２）アガロースゲル担体
図２は、アガロースゲルビーズ２表面の物質構成を説明する模式図である。ここでは、アガロースゲル担体としてアガロースゲルビーズを用いる場合を例に説明する。
【００２１】
アガロースゲルビーズ２の表面には、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡをビーズ上に捕捉するための捕捉鎖２１が固相化されている。捕捉鎖２１は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な配列番号１記載の塩基配列を有し、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと相互作用して二本鎖（ハイブリッド）を形成する。相補鎖２１は、ＤＮＡやＲＮＡに加えて、これらのリボース部分の構造を改変して得られる核酸類似体（例えば、LNA（Locked Nucleic Acid））等からなるオリゴマーとされる。
【００２２】
【表１】
【００２３】
捕捉鎖２１の塩基配列の長さ（塩基数）は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有することにより、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと相互作用して二本鎖を形成し得る限りにおいて、配列番号１よりも長くあるいは短くされてもよい。また、捕捉鎖２１は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列を有している必要はなく、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの二本鎖形成が可能な限りにおいて、配列番号１中に１塩基又は２塩基以上のミスマッチ（非相補塩基）を有していてもよい。捕捉鎖２１の塩基配列は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度（Ｔｍ）が、後述する検出鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度と同程度となるように設計することが好ましい。
【００２４】
アガロースゲルビーズ２表面への捕捉鎖２１の固相化は、従来公知の手法によって行うことができ、例えばアビジン−ビオチン結合やカップリング反応（ジアゾカップリング反応など）によって行うことができる。アビジン−ビオチン結合を利用する場合には、アガロースゲルビーズ２表面にストレプトアビジンを固定化し、末端にビオチンを修飾した捕捉鎖２１をアビジン−ビオチン間の結合によって固相化する。また、捕捉鎖２１の固相化は、本発明者らが上記特許文献３に開示するイオン交換結合による手法を採用してもよい。
【００２５】
以上では、本技術に係るマイクロ流路を核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップとして実施する場合を例に説明した。本技術に係るマイクロ流路は上記特許文献３に開示されるような核酸ハイブリダイゼーション用カラムとしても好適に実施可能である。
【００２６】
２．核酸ハイブリダイゼーション方法
図３は、本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の手順を説明するフローチャートである。また、図４は、本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の各手順におけるアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を説明する模式図である。
【００２７】
（１）コンディショニング
図３、ステップＳ１では、導入口１１１からハイブリダイゼーション反応用の緩衝液を導入しマイクロ流路１１内に通液させて、アガロースゲルビーズ２のコンディショニングを行う。コンディショニングは、マイクロ流路１１内の液体を置換し、脱気するために行われる。ステップＳ１におけるアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を図４（Ａ）に示す。
【００２８】
（２）サンプル液の通流と洗浄
図３、ステップＳ２では、導入口１１１からサンプル液を導入しマイクロ流路１１内に通液させる。サンプル液は、骨髄細胞あるいは末梢血細胞から抽出したｍＲＮＡ溶液等を用いることができる。本ステップでは、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な塩基配列を有する捕捉鎖２１とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとが二本鎖を形成し、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡがアガロースゲルビーズ２表面に捕捉される。
【００２９】
ステップＳ２後のアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を、図４（Ｂ）に示す。図中、符号Ｔはサンプル液に含まれるｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ、符号ＮはｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ以外の核酸鎖（非標的核酸鎖）を示す。
【００３０】
サンプル液の導入は、ステップＳ１で用いたハイブリダイゼーション反応用の緩衝液を液相に用いて行うことが好ましく、より好ましくはアガロースが添加された前記緩衝液を液相に用いて行うことが好ましい。アガロース添加の液相を用いることで、マイクロ流路１１内のアガロースゲルビーズ２同士を緩やかに粘着させて安定させることができる。アガロースの液相への添加量は、０．０２〜０．２％程度、好ましくは０．０５％程度とされる。アガロース添加の液相は、本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション方法の各ステップにおいても用いることができる。
【００３１】
捕捉鎖２１とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション反応用緩衝液の組成（例えば、塩や界面活性剤の濃度）やマイクロ流路１１内の温度を調整し、適当なハイブリッド形成条件下において行われる。ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの自己ハイブリッド形成を抑制するため、サンプル液を予め加温してマイクロ流路１１内に導入することが有効である。また、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの捕捉鎖２１への非特異的な吸着を抑制するため、サンプル液の通流時のマイクロ流路１１内を加温することが有効である。
【００３２】
サンプル液の通液後、導入口１１１から洗浄液を導入しマイクロ流路１１内に通液させ、アガロースゲルビーズ２の洗浄を行う。洗浄は、捕捉鎖２とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリッド形成が維持される条件にて行い、非標的核酸鎖と捕捉鎖２１に非特異的に吸着したｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとをマイクロ流路１１内から除去するために行う。
【００３３】
（３）検出鎖溶液の通流と洗浄
続いて、図３、ステップＳ３では、アガロースゲルビーズ２表面に捕捉されたｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを検出するための検出鎖溶液を導入口１１１からマイクロ流路１１内に導入する。本ステップでは、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な配列番号２記載の塩基配列を有する検出鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとが二本鎖を形成し、捕捉鎖２１−ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ−検出鎖のサンドイッチハイブリッドが形成される。なお、本ステップは、上記のステップＳ２と同時に行ってもよい。
【００３４】
【表２】
【００３５】
検出鎖は、捕捉鎖２１と同様に、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに対し相補的な塩基配列を有し、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと相互作用して二本鎖を形成する。検出鎖も、ＤＮＡやＲＮＡ、核酸類似体等からなるオリゴマーとされる。また、検出鎖の塩基配列の長さ（塩基数）も、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有することにより、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと相互作用し二本鎖を形成し得る限りにおいて、配列番号２よりも長くあるいは短くされてもよい。さらに、検出鎖は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列を有している必要はなく、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの二本鎖形成が可能な限りにおいて、配列番号２中に１塩基又は２塩基以上のミスマッチを有していてもよい。検出鎖の塩基配列は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度（Ｔｍ）が、捕捉鎖２１とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとの解離温度と同程度となるように設計することが好ましい。
【００３６】
検出鎖には、蛍光物質や化学発光物質、放射性物質などの標識物質Ｌが標識（ラベル）される。次に説明するステップＳ４において、これらの標識物質Ｌから発生する蛍光や発光、放射線を検知することで、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの検出が行われる。
【００３７】
ステップＳ３後のアガロースゲルビーズ２表面の物質構成を、図４（Ｃ）に示す。図中、符号Ｄは検出鎖を示す。検出鎖Ｄの溶液をマイクロ流路１１内に通液すると、捕捉鎖２１とハイブリッドを形成するｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ（符号Ｔ）に対し、さらに検出鎖Ｄがハイブリダイズする。これにより、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ（符号Ｔ）は捕捉鎖２１及び検出鎖Ｄとハイブリッドを形成し、サンドイッチハイブリッド（ダブルハイブリッド）となる。
【００３８】
検出鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション反応用緩衝液の組成（例えば、塩や界面活性剤の濃度）やマイクロ流路１１内の温度を調整し、適当なハイブリッド形成条件下において行われる。検出鎖のｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡへの非特異的な吸着を抑制するため、検出鎖溶液の通流時のマイクロ流路１１内を加温することが有効である。
【００３９】
検出鎖溶液の通液後、導入口１１１から洗浄液を導入しマイクロ流路１１内に通液させ、アガロースゲルビーズ２の洗浄を行う。洗浄は、検出鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡとのハイブリッド形成が維持される条件にて行い、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに非特異的に吸着した検出鎖をマイクロ流路１１内から除去するために行う。
【００４０】
（４）検出
図３、ステップＳ４では、アガロースゲルビーズ２表面に捕捉されたｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを、検出鎖に標識された標識物質から発生する蛍光や発光、放射線を検知することによって検出する。具体的には、例えば検出鎖に蛍光物質を標識した場合、アガロースゲルビーズ２に励起光を照射し、励起された蛍光物質から発生する蛍光を検知する。蛍光等の強度を測定すれば、蛍光強度等に基づいてｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを定量的に検出することもできる。
【００４１】
本技術においては、核酸分離用担体として光透過性を有するアガロースゲルビーズ２を用いている。アガロースゲルビーズ２では、励起光を照射した際に、励起光がビーズによって遮断されたり、反射あるいは散乱されたりすることがないため、これを充填したマイクロ流路１１では励起光が深部にまで到達でき、発生する蛍光も強い。また、励起光の戻り光を少なくでき、光検出器のダイナミックレンジを広くとることができる。さらに、アガロースゲルビーズ２では、蛍光物質から発せられる蛍光が担体によって遮断されたり、反射あるいは散乱されたりすることがない。従って、励起光や蛍光が担体によって遮断されるために生じる蛍光検出強度の減衰やバックグラウンドの上昇を排除して、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを高感度、高精度に検出できる。
【００４２】
３．核酸ハイブリダイゼーション装置
図５は、本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション装置の構成を説明する模式図である。
【００４３】
核酸ハイブリダイゼーション装置は、マクロチップ１と、マイクロチップ１のマイクロ流路１１内の温度を制御するヒートブロック１０３と、マイクロチップ１の導入口１１１に溶液を送液して排出口１１２から排液させる送液手段と、マイクロチップ１のマイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲルビーズ２に励起光を照射し、発生する蛍光を検出するための光学検出手段と、を備えている。
【００４４】
ヒートブロック１０３は、マイクロチップ１のマイクロ流路１１内を加熱又は冷却する温度制御部として機能する。ヒートブロック１０３は、上述のステップＳ３においてｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの捕捉鎖２１への非特異的な吸着を抑制するため、サンプル液の通流時にマイクロ流路１１内を加温する。また、ヒートブロック１０３は、上述のステップＳ４において検出鎖のｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡへの非特異的な吸着を抑制するため、検出鎖溶液の通流時にもマイクロ流路１１内を加温する。なお、ヒートブロック１０３は、通常使用されるヒーターであってよく、ペルチェ素子やジュール・トムソン素子等に置換してもよい。ヒートブロック１０３の温度は例えば６０℃とされる。
【００４５】
送液手段は、通常使用されるポンプやシリンジポンプ、チューブやバルブ等によって構成できる。送液手段には、導入口１１１に導入されるサンプル液を加熱する加熱部としてインラインヒーター１０２が含まれる。インラインヒーター１０２は、上述のステップＳ２においてｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの自己ハイブリッド形成を抑制するため、サンプル液を予め加温してマイクロ流路１１内に導入する。インラインヒーター１０２における加熱（熱変性）後、マイクロ流路１１のアガロースゲルビーズ２の充填領域まで送液される間に、サンプル液を急冷させることで、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡの自己ハイブリッド形成を抑制できる。インラインヒーター１０２の温度は例えば９５℃とされる。
【００４６】
光学検出手段は、励起光光源と、マイクロ流路１１内に充填されたアガロースゲルビーズ２に対して励起光を集光・照射する集光レンズやダイクロイックミラー、バンドパスフィルター等からなる照射系と、励起光の照射によって検出鎖に標識された蛍光物質から発生する蛍光を検出する検出系と、によって構成される。検出系は、例えば、PMT（photo multiplier tube）や、CCDやCMOS素子等のエリア撮像素子等によって構成される。なお、図では、光学検出手段として集光レンズ１０１のみを示している。また、図では、照射系と検出系を同一の光学経路により構成した場合を示したが、照射系と検出系は別個の光学経路により構成してもよい。
【実施例】
【００４７】
＜実施例１＞
１．ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ、捕捉鎖、検出鎖の合成
ヒトｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子をクローニングし、ｃＤＮＡからポリ（Ａ）を付加したｍＲＮＡを合成した。また、この合成ｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有する捕捉鎖と検出鎖を合成した（「表３」参照）。捕捉鎖と検出鎖は、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子の塩基配列において重複しない領域に相補的となるように設計した。捕捉鎖の３´末端はビオチン化した。また、検出鎖の５´末端を蛍光色素（Ｃｙ３）により標識した。捕捉鎖及び検出鎖の解離温度（Tm）は、それぞれ７１℃及び７３℃と計算された。
【００４８】
【表３】
【００４９】
２．アガロースゲルビーズへの捕捉鎖の固相化
表面にストレプトアビジンが固定されたアガロースゲルビーズ懸濁液（Streptavidin Agarose Resin，Thermo Scientific）と捕捉鎖溶液を混合し、ストレプトアビジン−ビオチン結合によってアガロースゲルビーズ表面に捕捉鎖を固相化した。
【００５０】
３．核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップの作製
流路（流路幅0.5 mm，流路深さ0.5 mm，流路長24 mm）を切ったテフロン（登録商標）基板を２枚のアクリル基板で挟んで積層したマイクロチップを用意し、流路下流側に孔径１０μｍのフィルタを装着した。アガロースゲルビーズを流路に注入し、充填した。流路内のアガロースゲルビーズ充填領域の長さは２０ｍｍ程度とした。流路に流路切換バルブとシリンジポンプを配管した。
【００５１】
４．核酸ハイブリダイゼーション装置の構成
マイクロチップの流路と流路切換バルブとの間に、印加電圧制御により温度調節が可能なインラインヒーターを配管した。マイクロチップは、ヒートブロック上に設置した。
【００５２】
緑色ＬＥＤ光源を用意し、Ｃｙ３励起用フィルタと組み合わせて、Ｃｙ３の励起光源とした。分光器を用意し、Ｃｙ３蛍光用フィルタと組み合わせて、Ｃｙ３の蛍光検出器とした。２つの光ファイバを同軸にバンドルした光ファイバケーブルを用意し、励起光用光ファイバを励起光源に、受光用光ファイバを蛍光検出器に結線した。光ファイバケーブルの先端に設けた対物レンズを、流路内のアガロースゲルビーズに対向させた。これにより、流路内に充填されたアガロースゲルビーズに励起光を照射し、発生する蛍光を検出する光学系を構成した。なお、励起光の照射スポット径は５００μｍとした。
【００５３】
５．測定
ｍＲＮＡと検出鎖を0.2% SDS、0.3 M 塩化ナトリウム水溶液に溶解し，サンプル液を調製した。サンプル液３５０μlには、ｍＲＮＡと検出鎖がそれぞれ５μg、３ μg含まれた。
【００５４】
インラインヒーターを９５℃、ヒートブロックを６０℃に設定し，0.2% SDS、0.3 M 塩化ナトリウム水溶液を流路に送液し、アガロースゲルビーズのコンディショニングを行い、蛍光測定を行った。送液速度は５０μｌ／分とした。
【００５５】
サンプル液３００μｌを送液し、捕捉鎖とｍＲＮＡと検出鎖のサンドイッチハイブリダイゼーションを行った。0.2% SDS、0.3 M 塩化ナトリウム水溶液を２．１ｍｌ送液して洗浄し、蛍光測定を行った。
【００５６】
次に、ヒートブロックを８０℃に昇温し、液相を純水に変更して１．８ｍｌ送液することにより、ハイブリッドを解離（変性）させた。変性操作後に蛍光測定を行った。
【００５７】
コンディショニング後（Ａ）、サンプル液及び洗浄液の送液後（Ｂ）、変性操作後（Ｃ）の蛍光測定結果を図６に示す。コンディショニング後（Ａ）に比べて、サンプル液及び洗浄液の送液後（Ｂ）の蛍光強度が増大していることから、捕捉鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと検出鎖のサンドイッチハイブリッドの形成が確認される。また、変性操作後（Ｃ）、蛍光強度が減少したことから、上記の蛍光強度の増大が、捕捉鎖とｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡと検出鎖の特異的なハイブリダイゼーションによるものであり、非特異的な吸着によるものではないことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本技術に係る核酸ハイブリダイゼーション用のマイクロ流路等によれば、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを簡便かつ高感度に検出できる。従って、本技術は、肺がん等のがんの診断及び治療を目的としたｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子の発現検出のため有用である。
【符号の説明】
【００５９】
１：マイクロチップ、１ａ，１ｂ：基板層、１０１：集光レンズ、１０２：インラインヒーター、１０３：ヒートブロック、１１：マイクロ流路、１１１：導入口、１１２：排出口、１１３：フィルタ、２：アガロースゲルビーズ、２１：捕捉鎖、Ｄ：検出鎖、Ｌ：標識物質、Ｎ：非標的核酸鎖、Ｔ：ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡが含まれるサンプル液が通流され、
ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填された、核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路。
【請求項２】
請求項１記載のマイクロ流路が形成され、
マイクロ流路へのサンプル液の導入口と、マイクロ流路からのサンプル液の排出口と、が配設された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ。
【請求項３】
請求項２記載のマイクロチップと、
前記導入口に導入されるサンプル液を加熱する加熱部、及び／又はマイクロ流路内の温度を制御する温度制御部と、を備える核酸ハイブリダイゼーション装置。
【請求項４】
ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填されたマイクロ流路に、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを含むサンプル液を通流させる手順と、
ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号２記載の塩基配列を有する検出鎖を含む溶液を前記マイクロ流路に通流させる手順と、
を少なくとも含む核酸ハイブリダイゼーション方法。
【請求項５】
請求項１記載のマイクロ流路が形成され、
マイクロ流路へのサンプル液の導入口と、マイクロ流路からのサンプル液の排出口と、が配設された核酸ハイブリダイゼーション用カラム。
【請求項１】
ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡが含まれるサンプル液が通流され、
ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填された、核酸ハイブリダイゼーション用マイクロ流路。
【請求項２】
請求項１記載のマイクロ流路が形成され、
マイクロ流路へのサンプル液の導入口と、マイクロ流路からのサンプル液の排出口と、が配設された核酸ハイブリダイゼーション用マイクロチップ。
【請求項３】
請求項２記載のマイクロチップと、
前記導入口に導入されるサンプル液を加熱する加熱部、及び／又はマイクロ流路内の温度を制御する温度制御部と、を備える核酸ハイブリダイゼーション装置。
【請求項４】
ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号１記載の塩基配列を有する捕捉鎖が固相化されたアガロースゲル担体が、サンプル液の送液方向下流側に配設されたフィルタによって保持された状態で充填されたマイクロ流路に、ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡを含むサンプル液を通流させる手順と、
ｈｎＲＮＰ−Ｂ１遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列番号２記載の塩基配列を有する検出鎖を含む溶液を前記マイクロ流路に通流させる手順と、
を少なくとも含む核酸ハイブリダイゼーション方法。
【請求項５】
請求項１記載のマイクロ流路が形成され、
マイクロ流路へのサンプル液の導入口と、マイクロ流路からのサンプル液の排出口と、が配設された核酸ハイブリダイゼーション用カラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−２３５７０９（Ｐ２０１２−２３５７０９Ａ）
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０５２１０（Ｐ２０１１−１０５２１０）
【出願日】平成２３年５月１０日（２０１１．５．１０）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１０日（２０１１．５．１０）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]