核酸増幅方法および核酸増幅装置、ならびに核酸増幅用チップ
【課題】核酸増幅に要する反応液量を低減することができ、省電力化および低コスト化を達成でき、かつ増幅に要する時間を短縮できる核酸増幅装置および核酸増幅方法、ならびに核酸増幅用チップを提供する。
【解決手段】核酸増幅用チップは、反応液が導入され、第1のチャンバーと、第2のチャンバーと、第1のチャンバーと第2のチャンバーとを接続し、第2のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、第2のチャンバーに充填された液体と、を含み、液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和しない。
【解決手段】核酸増幅用チップは、反応液が導入され、第1のチャンバーと、第2のチャンバーと、第1のチャンバーと第2のチャンバーとを接続し、第2のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、第2のチャンバーに充填された液体と、を含み、液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和しない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸増幅方法および核酸増幅装置、ならびに核酸増幅用チップに関する。
【背景技術】
【0002】
DNAやRNA等の遺伝子を検査するための方法として、PCR(Polymerase Chain Reaction)が例えば研究用および臨床検査用に広く用いられている(特許文献1)。このPCRでは通常、標的核酸を含みうる検体および試薬を含む反応液を容器に入れ、サーマルサイクラーと呼ばれる温度制御装置を用いて、例えば95℃、74℃、55℃という複数段階の温度変化を繰り返すことにより標的核酸を増幅させる。しかしながら、PCRでは通常、反応液を一定の温度に調節するのに時間がかかることが、作業効率の向上を妨げる一要因となっている。また、作業時間短縮のために反応液を急速に加熱または冷却すると、消費電力が大きくなるうえ、サーマルサイクラーの温度制御を司る温度制御素子の耐久性を下げるおそれがある。
【0003】
そこで、PCR反応をより効率良く行うために、所定の温度に制御されたサーマルサイクラーの温度制御素子に対して反応液を移動させ、反応液の温度変化を生じさせる技術も提案されている(特許文献2)。しかし、この温度制御方法では、反応容器内に残る気泡により温度勾配が乱され、標的核酸増幅における温度制御の効率が低下してしまうことがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特公平4−67957号
【特許文献2】特願2007−318627号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、反応液導入時に気泡が内部に残り難い核酸増幅用チップを提供し、かつ、前記核酸増幅用チップを用いることで、省電力化および低コスト化を達成でき、かつ増幅に要する時間を短縮できる核酸増幅方法および核酸増幅装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の一態様に係る核酸増幅方法は、
反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
前記反応液より比重が軽く、かつ、前記反応液と混和しない液体が充填された第2のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第1のチャンバーに前記反応液を導入する工程と、
遠心によって前記第1のチャンバーの前記反応液を前記第2のチャンバーに導入させる工程と、
前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させる工程と、を含む。
【0007】
上記核酸増幅方法によれば、反応液より比重が軽く反応液と混和しない液体が充填された第2のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第1のチャンバーに反応液を供給し、遠心して前記第1のチャンバーから前記第2のチャンバーに前記反応液を移動させ、前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節し、回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させるので、重力を利用して前記一方の端部から他方の端部へと前記反応液を移動させることができ、前記一方の端部での温度領域から前記他方の端部での温度領域へと、前記反応液の温度を制御することができる。
【0008】
また、予め前記反応液より比重が軽く前記反応液と混和しない前記液体が前記第2のチャンバーに充填されているので、遠心することにより気泡を残さずに前記反応液を前記第1のチャンバーから前記第2のチャンバーへ移動させることができる。これにより、気泡によって前記第2チャンバーに充填された前記液体の温度勾配が乱されることがなくなるので、前記反応液の温度をより効率良く制御できる。
【0009】
本発明の別の一態様に係る反応液が導入される核酸増幅用チップは、
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、
前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続し、前記第2のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、
前記第2のチャンバーに充填された液体と、を有し、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液とは混和しない。
【0010】
上記核酸増幅用チップにおいて、前記連結部の最大幅は、前記第1のチャンバーの最小幅よりも小さいとより好適である。本発明において、連結部の最大幅とは、連結部のうち最も広い部分の幅をいい、第1のチャンバー(第2のチャンバー)の最小幅とは、第1のチャンバー(第2のチャンバー)のうち最も狭い部分の幅をいう。
【0011】
上記核酸増幅用チップによれば、第1のチャンバーと、第2のチャンバーと、前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続し、かつ、前記第2のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を持つ連結部と、第2のチャンバーに充填された所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く反応液とは混和しない液体と、を有するので、前記反応液が第1のチャンバーから第2のチャンバーへ導入された場合に、前記反応液と前記液体とが分離された状態にすることができる。これにより、前記第2のチャンバー内における前記反応液の位置を容易に確認することができる。なお、前記反応液と前記液体とが分離された状態においては前記反応液が球状になることから、本発明で前記第2のチャンバーに導入された前記反応液を液滴と表現することもある。
【0012】
さらに、上記核酸増幅用チップの前記第2のチャンバーに充填する液体の量を、前記第2のチャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量以上、かつ、前記第1チャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量と、前記第2のチャンバーの容積と、前記連結部の容積と、を足した量以内にすることで、前記第2のチャンバー内に気泡が残り難くすることができる。
【0013】
本発明の別の一態様に係る核酸増幅装置は、
反応液が導入される核酸増幅用チップを用いた核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、
前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続し、前記第2チャンバーの最小幅より小さい最大幅を有する連結部と、
前記第2のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が前記反応液よりも軽く、かつ、前記反応液とは混和せず、
前記核酸増幅装置は、
前記核酸増幅用チップを設置可能なチップ保持部と、
回転軸を中心に前記チップ保持部を所定の回転速度で回転させる回転部と、
前記回転軸に沿って設けられた温度制御部と、を含み、
前記回転部は、回転時に重力方向における前記第2のチャンバー内の最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記チップ保持部を回転させる。
【0014】
上記核酸増幅装置において、前記核酸増幅用チップは、前記第2のチャンバーと、前記第1のチャンバーと前記第2チャンバーとを接続する前記連結部と、を含む反応部と、を有し、複数の前記反応部は、それぞれ前記第1チャンバーに接続されていることができる。
【0015】
上記核酸増幅装置において、前記温度制御部は、第1温度制御部と第2温度制御部とからなり、前記第2温度制御部は、前記第1温度制御部よりも前記回転軸から遠い位置に設けられていることができる。
【0016】
上記核酸増幅装置において、前記第2のチャンバー内に、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されていることができる。なお、本発明において「標的核酸」とは、本発明の核酸増幅装置による増幅対象となる核酸のことをいう。
【0017】
上記核酸増幅装置によれば、前記回転部によって、前記チップ保持部により保持された前記核酸増幅用チップの前記第2のチャンバー内の重力方向における最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記核酸増幅用チップを回転させることができるので、前記回転軸に沿って設けられた温度制御部によって、前記核酸増幅用チップ内の所定の位置を所定の温度に調節することができる。これにより、前記核酸増幅用チップ内に導入される反応液の温度をより効率良く調節することができるので、省電力化および低コスト化を達成でき、かつ増幅に要する時間を短縮できる。
【0018】
本発明の他の一態様に係る核酸増幅用チップは、
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
前記核酸増幅用チップの中央部に配置された第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、前記第1のチャンバーと前記第2チャンバーとを接続する連結部と、を含む反応部と、
を有し、
前記反応部を複数含み、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第1のチャンバーに接続されており、かつ、前記中央部から放射線状方向に配置されている。
【0019】
上記核酸増幅用チップを用いて核酸増幅を行うことにより、複数の前記反応部毎に異なる試薬を使用することが可能となるので、異なる標的核酸を同時に増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】本発明の第1実施形態に係る核酸増幅装置を説明する斜視図(図1(a)は核酸増幅装置の全体図、図1(b)は図1(a)の核酸増幅装置から保持部材を取り外した図、図1(c)は図1(b)の核酸増幅装置から断熱部材を取り外した図。)。
【図2】図1(b)の第1温度制御部、第2温度制御部および核酸増幅用チップ収容部を抜き出して、回転軸Aの延びる方向と垂直な方向(図1(a)〜図1(c)の左側)から記載した拡大図。
【図3】本発明の第1実施形態に係る核酸増幅装置に設けられる核酸増幅用チップの断面図(図3(a))および前記核酸増幅用チップの第1基板の平面図(図3(b))。
【図4】図3(b)の核酸増幅用チップに液体が充填された状態を説明する図。
【図5】図3(b)の核酸増幅用チップに液滴が充填された状態を説明する図(図5(a))および図3(b)の核酸増幅用チップ内の液体中を液滴が移動する状態を説明する図(図5(b))。
【図6】図3(b)の核酸増幅用チップを第1の温度で保持する状態を説明する図(図6(a))および図3(b)の核酸増幅用チップを第2の温度で保持する状態を説明する図(図6(b))。
【図7】本発明の第2実施形態に係る核酸増幅装置を説明する斜視図(図7(a)は核酸増幅装置の全体図、図7(b)は図7(a)の装置から保持部材および第2温度制御部を取り外した図、図7(c)は図7(b)の装置から測定用ポート、断熱部材および核酸増幅用チップを取り外した図。)。
【図8】本発明の第2実施形態に係る核酸増幅装置に設けられる核酸増幅用チップの平面図。
【図9】図8の核酸増幅用チップに液体および液滴を充填する方法を説明する断面図(図9(a)〜図9(c))。
【図10】図8の核酸増幅用チップを用いて核酸増幅を行う工程を説明する平面図(図10(a)〜図10(d))。
【図11】図8の核酸増幅用チップの一変形例を示す平面図。
【発明を実施するための形態】
【0021】
以下に、本発明の一実施形態に係る核酸増幅方法および核酸増幅装置、ならびに核酸増幅用チップ(チップ)について具体的に説明する。
【0022】
1.第1実施形態
図1(a)〜図1(c)は、本発明の第1実施形態に係る核酸増幅装置40を説明する斜視図である(図1(a)は核酸増幅装置40の全体図、図1(b)は図1(a)の核酸増幅装置40から保持部材47bを取り外した図、図1(c)は図1(b)の核酸増幅装置40から断熱部材44を取り外した図。)。
【0023】
1.1.核酸増幅装置の構成
図1(a)〜図1(c)に示されるように、本実施形態に係る核酸増幅装置40は、温度制御部(第1温度制御部49および第2温度制御部45)と、チップ100を設置可能なチップ保持部47と、回転軸Aを中心にチップ100を回転させる回転部41とを含む。
【0024】
チップ100は、図3(a)および図3(b)に示されるように、第1のチャンバー12と、第2のチャンバー14と、第1のチャンバー12と第2のチャンバー14とを接続する連結部16とを基板10の第1の面10aに有する。
【0025】
チップ保持部47は、回転時にチップ100の長手方向に重力が作用するようにチップ100を保持する。
【0026】
温度制御部は、チップ100の所定の位置を所定の温度に調節する。第1温度制御部49は回転軸Aに沿って設けられている。
【0027】
チップ回転部49は、回転時に重力方向における第2のチャンバー14内の最下点と回転軸Aとの距離が変化するようにチップ100を回転させる。
【0028】
核酸増幅装置40には、複数のチップ収容部43が、回転軸Aに対称にかつ回転軸Aの中心から放射線状方向に配置されており、1つのチップ収容部43内に、1つのチップ100(図1(a)〜図1(c)ではチップ100は図示せず)が収容されている。図1(b)および図1(c)に示されるように、隣り合うチップ収容部43の間には断熱部材44が配置されており、隣り合うチップ収容部43の間での熱の移動を遮断している。チップ収容部43には例えば、チップ100(図6(a)および図6(b)参照)の第1のチャンバー12が第2のチャンバー14よりも回転軸Aに近くなるようにチップ100を収容することができる。なお、チップ100の第2のチャンバー14が第1のチャンバー12よりも回転軸Aに近くなるようにチップ100を収容してもよい。
【0029】
図2は、図1(b)の第1温度制御部49および第2温度制御部45ならびにチップ収容部43を抜き出して、回転軸Aの延びる方向と垂直な方向(図1(a)〜図1(c)の左側)から記載した拡大図である。
【0030】
本実施形態に係る核酸増幅装置40では、温度制御部は、第1温度制御部49と第2温度制御部45とからなり、第2温度制御部45は図1(b)に示されるように、第1温度制御部49よりも回転軸Aから遠い位置に設けられている。また、第1温度制御部49は図1(b)に示されるように、回転軸Aに沿って設けることができる。
【0031】
第2温度制御部45は、図2に示されるように、円盤状の形状を有する。すなわち、第2温度制御部45は、外周部に設けられた第2ヒーター45aを有する。
【0032】
回転部41は、回転軸Aを中心にチップ保持部47を所定の回転速度で回転させることによってチップ100を回転させる。回転部41は例えばアルミ等の金属からなる。また、図2に示されるように、回転部41の外周には、断熱部材44が設けられ、この断熱部材44を挟むように2枚の熱伝導性部材41b,41cが配置されている。熱伝導性部材41b、断熱部材42a、および熱伝導性部材43aが同心円盤を構成し、また、熱伝導性部材41c、断熱部材42b、および熱伝導性部材43cが同心円盤を構成し、これらの2枚の同心円盤がチップ収容部43および断熱部材44を挟むように配置されている。また、回転部41の少なくとも一部が、熱伝導性部材41b、断熱部材44および熱伝導性部材41cを貫通する穴44a内に設けられている。熱伝導性部材41b,41cは例えばアルミ等の金属からなる。
【0033】
また、チップ100を収容するチップ収容部43は、チップ100からの情報を光学的に読み取る光学的検出部(測定用ポート)43bを有する。すなわち、光学的検出部43bは第2のチャンバー14内で増幅された核酸の濃度を測定する。光学的検出部43bの近傍には、LEDおよびCCDセンサ(図示せず)等を配置することができる。これにより、本実施形態による核酸増幅装置40を用いてリアルタイムPCRを行う場合、チップ100が回転中にCCDセンサに対向したときに、第2のチャンバー14内で増幅された核酸の濃度を光学的に測定することができるため、サイクル毎の増幅産物量を測定することができる。
【0034】
熱伝導性部材43a,43cは第2ヒーター45aに接している。熱伝導性部材43a,43cは例えばアルミなどの金属からなる。第2ヒーター45aの熱が熱伝導性部材43a,43cに伝搬することで、チップ収容部43内のチップ100の所定の位置が所定の温度に調節される。第2ヒーター45aは例えば、外周部に取り付けられたフィルム状のヒーターであることができる。さらに、熱伝導性部材41a、断熱部材44および熱伝導性部材41cを貫通する穴44aが設けられている。
【0035】
第1温度制御部49は、図1(b)および図2に示されるように、第1ヒーター49aと、第1ヒーター49aを収容する第1ヒーター収容部(回転部41の穴)41aとを含む。第1ヒーター49は例えば棒状のヒーターであり、回転軸Aに沿って、穴44aを貫通するように配置される。
【0036】
第1ヒーター収容部41に設けられた穴41aは、回転軸Aに沿って設けられ、この穴41aに第1ヒーター49aが収容される。これにより、第1温度制御部49は、チップ収容部43に収容されるチップ100のうち回転軸A近傍の領域を所定の温度に調節することができる。より具体的には、第1温度制御部49が、回転軸Aに沿って設けられた第1ヒーター49aを含むことにより、回転軸Aからの距離が大きくなるにつれて温度が小さくなるような温度勾配をチップ100に生じさせることができる。第1ヒーター収容部41aは、円筒状の被覆部材48a,48b内に配置されている。
【0037】
例えば、チップ100のうち第1のチャンバー12が第2のチャンバー14よりも回転軸Aに近くなるように配置する場合、第1温度制御部49によって、回転軸A近傍の領域をPCRの熱変性温度(例えば95℃)に調節し、第2温度制御部45によって、回転軸A近傍から離れた領域をアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度(例えば60℃)に調節することができる。これにより、チップ100の第2のチャンバー14のうち第1のチャンバー12に近い側をPCRの熱変性温度(例えば95℃)に調節し、チップ100の第2のチャンバー14のうち第1のチャンバー12から離れている側をアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度(例えば60℃)に調節することができる。
【0038】
図1(a)に示されるように、チップ100が収容されるチップ収容部43の外周部には第2温度制御部45が配置されており、さらにその外側が保持部材47a,47bで挟まれている。保持部材47a,47bはそれぞれ被覆部材48a,48bを介して支持部材46a,46bに固定されている。回転部41は被覆部材48a,48bに覆われており、被覆部材48a,48bの両端が支持部材46a,46bに固定されていることから、被覆部材48a,48bが図1(a)に示される矢印IまたはIIの方向に回転すると、保持部材47a,47bもともに、図1(a)に示される矢印Iまたは矢印IIの方向に回転する。なお、本実施形態に係る核酸増幅装置40は、回転部41が取り付けられた支持部材46bの外側に、回転部41の回転を制御するモータを備えている。
【0039】
また、回転部41が回転軸Aを中心に回転することにより、回転軸Aを中心にチップ100が回転する。すなわち、回転部41にチップ保持部47が固定されているため、回転部41が回転軸Aを中心に回転すると、チップ保持部47も回転軸Aを中心に回転する。なお、チップ100の第1のチャンバー12に供給された反応液32(図5(a)参照)は、遠心分離装置(図示せず)を用いてチップ100に対して遠心分離処理を施すことより、遠心力によって、連結部16を介して第2のチャンバー14に導入することができる(図5(b)参照)。遠心処理は例えば1,000〜15,000rpmで0.5〜5分間行うことができる。
【0040】
1.2.チップの構成
次に、本実施形態に係る核酸増幅装置40に設けられるチップ100の構成について説明する。図3(a)は、本実施形態に係る核酸増幅装置に設けられるチップ100の断面図であり、図3(b)は、チップ100の第1基板10の平面図である。なお、後述する図4、図5(a)、図5(b)、図6(a)、および図6(b)でも図3(b)と同様に、チップ100の第1基板10の平面図を示している。
【0041】
チップ100は、反応液32が導入される核酸増幅用チップであり、図3(a)および図3(b)に示されるように、第1のチャンバー12と、第2のチャンバー14と、第1のチャンバー12と第2のチャンバー14とを接続し、第2のチャンバー14の最小幅d2よりも小さい最大幅d3を有する連結部16とを含む。図3(a)に示されるように、チップ100は2枚の透明基板(第1基板10および第2基板20)から構成されており、第1のチャンバー12、第2のチャンバー14および連結部16を表面(第1の面)10aに有する第1基板10と、穴22を有する第2基板20とが、穴22が第1ウェル12の供給口23上に配置された状態で接着されている。
【0042】
第1基板10および第2基板20の材質は限定されないが、耐熱性で自家蛍光が低いものが好ましく、例えば、ポリカーボネート等の樹脂が挙げられる。第1基板10および第2基板20の材質は、撥水性を有するため、後述する液滴32がチップ100中を容易に移動できる点で、樹脂が好ましい。また、後述するように、第2のチャンバー14には、例えばマイクロピペットによる充填や真空充填などの方法により、所定の温度範囲内(例えば45℃〜100℃)で液滴(反応液)32より比重が低くかつ液滴32と混和しない液体30を充填させることができる。
【0043】
第1のチャンバー12は、反応液を導入しうる供給口23を有する。後述するように、第1のチャンバー12の供給口23から、核酸増幅を行うための反応液からなる液滴32(図5(a)および図5(b)参照)が導入される。
【0044】
第2のチャンバー14では、液滴32の核酸増幅が行われる。第2のチャンバー14には、後述するように、液体30(図5(a)および図5(b)参照)が充填される。また、第2のチャンバー14内(例えば第2チャンバー14の表面)には、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されていてもよい。この試薬には、例えばプライマーや蛍光プローブが含まれる。この試薬は第2のチャンバー14の表面に塗布された後、乾燥させた状態で該表面に配置されていてもよい。あるいは、試薬が液体30内に液滴の状態で存在していてもよい。第2のチャンバー14の表面に試薬が塗布されている場合、液滴(反応液)32と接触することにより、液滴32中に試薬が溶解することができる。なお、試薬は、標的核酸の種類に応じて適切なものを選択できる。したがって、本実施形態に係る核酸増幅装置40が複数のチップ100を使用する場合、チップ100毎に異なる標的核酸を同時に増幅することができ、この場合、各標的核酸に応じた試薬を選択することが好ましい。
【0045】
なお、増幅対象となる標的核酸としては、例えば、血液、尿、唾液、髄液等の検体中のDNA、または該検体から抽出したRNAから逆転写したcDNA等が挙げられる。
【0046】
図3(b)に示されるように、連結部16の最大幅d3は、第2のチャンバー14の最小幅d2よりも小さい。これにより、後述する液滴(反応液)32(図5参照)が第2のチャンバー14から第1のチャンバー12へと侵入するのを効果的に防止することができ、かつ、第1のチャンバー12から第2のチャンバー14への気泡の混入を防止するとともに、遠心分離処理による反応液の導入時に第2チャンバーに気泡が残留してしまうことを効果的に防止することができる。
【0047】
より具体的には、液滴32が球形である場合、液滴32の直径をd(mm)とすると、液滴32の体積(V=πd3/6)は0.2〜20μlであることが好ましい。ここで、液滴32の体積が20μlを超える場合、液滴32が不安定となり壊れやすくなることがあり、一方、0.2μl未満である場合、粘性によって液滴32の移動が遅くなることがある。
【0048】
また、液滴32の移動が円滑に行われる点で、第2のチャンバー14の最小幅d2>d+0.2(mm)であることが好ましく、さらに、対流を低減できる点で、第2のチャンバー14の最小幅d2≦2.5(mm)であるのがより好ましい。
【0049】
さらに、液滴32が重力の影響を受けにくい点で、連結部16の最大幅d3<d×0.2(mm)であることが好ましく、また、液滴32が遠心力により連結部16をより円滑に通過できる点で、連結部16の最大幅d3≧0.1mmであるのがより好ましい。
【0050】
1.3.核酸増幅方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅装置40を用いた核酸増幅方法について説明する。本実施形態に係る核酸増幅方法は、反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
反応液32より比重が軽く、かつ、反応液32と混和しない液体30が充填された第2のチャンバー14を有する核酸増幅用チップ100の第1のチャンバー12に反応液32を導入する工程と、
遠心によって第1のチャンバー12の反応液32を第2のチャンバー14に導入させる工程と、
核酸増幅用チップ(チップ)100の一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸Aを中心として核酸増幅用チップ100を所定の速度で回転させる工程と、
を含む。
【0051】
本実施形態に係る核酸増幅方法によれば、反応液32が第2のチャンバー14に導入された状態で回転軸Aを中心として核酸増幅用チップ100を所定の速度で回転させることにより、重力によって前記一方の端部から他方の端部へと反応液32を移動させることによって反応液32の温度を調節することができ、前記一方の端部での温度領域から前記他方の端部での温度領域へと、反応液32の温度を制御することができる。 まず、チップ100への液体30の充填方法について説明する。図4は、図3(b)のチップに液体30が充填された状態を説明する図である。まず、チップ100の第2のチャンバー14に、例えばマイクロピペットや真空充填などの方法により、液体30を充填する。液体30は例えば、第2のチャンバー14に設けられた図示しない注入口から導入することができる。
【0052】
液体30としては、例えばオイルが挙げられる。オイルは、水より比重が軽く、水と混和せず、核酸増幅に使用する試薬および検体に影響を与えないものであれば特に限定されないが、例えばミネラルオイル、シリコンオイルが挙げられる、なお、液体30の粘度を調節することにより、液滴(反応液)32の移動速度を調節する(すなわち、液滴32の温度変化を調節する)ことができる。
【0053】
ここで、第2のチャンバー14に気泡が残り難くなる観点から、液体30は、第2のチャンバー14の容積から反応液(液滴)32の容積を引いた量以上、かつ、第1チャンバー12の容積から反応液(液滴)32の容積を引いた量と、第2のチャンバー12の容積と、連結部16の容積と、を足した量以内を充填させることができる。
【0054】
次いで、図5(a)に示されるように、ウェル100の蓋部24を開き、穴23から第1のチャンバー12に液滴(反応液)32を導入する。図5(a)は、図3(b)のチップ100に液滴32が充填された状態を説明する図である。
【0055】
液滴32は例えば、マイクロピペットを用いて第1のチャンバー12に導入することができる。また、液滴32は例えば、標的核酸を含みうる検体、PCRマスターミックス、プライマー、蛍光プローブを適切な濃度に調整して混合されたものである。なお、第2のチャンバー14の表面にプライマーや蛍光プローブ等の試薬が塗布されている場合、液滴32は該試薬を含まないものであってもよい。また、導入する液滴32の好ましい量は上述したとおりである。
【0056】
続いて、第1のチャンバー12の穴22を例えばシール等の蓋部24で封止した状態で、遠心分離装置(図示せず)の回転中心から第2のチャンバー14までの距離が、遠心分離装置の回転中心から第1のチャンバー12までの距離よりも大きくなるような配置にて、遠心分離機にチップ100を取り付ける。遠心分離装置としては、市販されている公知のものを使用することができる。これにより、遠心分離装置によって、遠心力を利用して、第1のチャンバー12から第2のチャンバー14の方向に液滴32を移動させる。その結果、液滴32は第1のチャンバー12から連結部16を介して第2のチャンバー14に導入され、図5(b)に示されるように、第2のチャンバー14の先端(第1のチャンバー12から離れた側の先端)まで移動する。図5(b)は、図3(b)のチップ100内を液滴32が移動した状態を説明する図である。
【0057】
次に、得られたチップ100の第1のチャンバー12が回転軸Aの近傍に配置され、第2のチャンバー14が測定用ポート43b近傍に配置されるように、本実施形態に係る核酸増幅装置40にチップ100を取り付ける。
【0058】
この場合、第1温度制御部49によって、回転軸Aに近い領域が第1の温度に保持され、第2温度制御部45によって、回転軸Aから離れた領域が、第1の温度より低い(高い)第2の温度で保持される場合、チップ100を回転させる際に重力を利用して、液滴32の位置を回転軸Aから離れた領域に移動させることにより、液滴32を第2の温度に調節することができ、また、チップ100を回転させる際に重力を利用して、液滴32の位置を回転軸A近傍の領域に移動させることにより、液滴32を第1の温度に調節することができる。
【0059】
例えば、第1の温度がPCRの熱変性温度(例えば95℃)であり、第2の温度がアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度(例えば60℃)である場合、重力を利用して、液滴32を適切な位置に移動させることにより、液滴32を所定の温度に調節して、核酸増幅を行うことができる。なお、この工程では、重力を利用するため、地面とチップ100とのなす角(鋭角)θ1が0<θ1<90°になるように本実施形態に係る核酸増幅装置40を配置する。
【0060】
より具体的には、チップ100を回転させる際に重力を利用して、図6(a)に示されるように、チップ100の第1のチャンバー12を第2のチャンバー14よりも地面に近い位置に配置することにより、液体30と液滴32との比重の差によって、液滴32は第2のチャンバー14中において第1のチャンバー12近傍に移動する。これにより、図3(b)のチップ100を回転軸Aに近い領域における温度(第1の温度)に調節することができる(工程1)。
【0061】
また、チップ100を回転させる際に重力を利用して、図6(b)に示されるように、チップ100の第2のチャンバー14を第1のチャンバー12よりも重力方向側に配置することにより、液体30と液滴32との比重の差によって、液滴32は第2のチャンバー14中で第1のチャンバー12から離れた位置に移動する。これにより、液滴32を回転軸Aから離れた領域における温度(第1の温度より低い(高い)第2の温度)に調節することができる(工程2)。
【0062】
上記の工程1および工程2を繰り返すことにより、液滴32に含まれうる標的核酸の増幅を行うことができる。なお、工程1および工程2の繰り返しは例えば、1〜20回/分行なうことができる。
【0063】
なお、第1基板10aが例えば樹脂からなる場合、チップ100を構成する第1基板10aの表面が撥水性を有するため、液滴32がチップ100の表面10aに付着するのを防止することができる。これにより、液滴32をチップ100中で容易に移動させることができる。
【0064】
1.4.特徴
本実施形態に係る核酸増幅装置40によれば、チップ収容部43にチップ100に装着させた状態で回転部41によって回転軸Aを中心にチップ100を回転させる。ここで、チップ100の第2のチャンバー14内の液滴32は液体30より比重が重いため、回転によりチップ100の向きを変えることにより、液滴32は第2のチャンバー14の中を沈降しながら周期的に移動する。この動作を繰り返すことにより、液滴32を所定の位置に配置することで、所定の温度(すなわちPCRの温度サイクルの温度)に調節することができる。
【0065】
したがって、本実施形態に係る核酸増幅装置40によれば、公知のPCR用の温度調節方法(例えば、チューブを差し込んだヒートブロックについて過熱冷却を繰り返す方法や、反応チューブを複数のヒートブロック間で移動させる方式)に比べて、核酸増幅に要する反応液量を低減することができ、温度制御が簡単であり、かつ消費電力を低減することができるうえ、短時間で核酸増幅を行うことができる。
【0066】
2.第2実施形態
図7(a)〜図7(c)は、本発明の第2実施形態に係る核酸増幅装置140を説明する斜視図である(図7(a)は核酸増幅装置140の全体図、図7(b)は図7(a)の核酸増幅装置140から保持部材47bおよび第2温度制御部45を取り外した図、図7(c)は図7(b)の核酸増幅装置40から測定用ポート43b、断熱部材144およびチップ200を取り外した図。)。
【0067】
2.1.核酸増幅装置の構成
本実施形態に係る核酸増幅装置140は、第1のチャンバー12と、第2のチャンバー14と、第1のチャンバー12と第2のチャンバー14とを接続する連結部16を含む核酸増幅用チップ(チップ)200(図8参照)を用いて核酸増幅を行う点で、第1実施形態に係る核酸増幅装置40とは異なる。なお、本実施形態に係る核酸増幅装置140において、第1実施形態に係る核酸増幅装置40と共通の構成については共通の符号を付して詳しい説明を省略する。
【0068】
図8は、本実施形態に係る核酸増幅装置140に設けられるチップ200の平面図である。
【0069】
チップ200は図8に示されるように、反応液32が導入される核酸増幅用チップであり、チップ200の中央部に配置された第1のチャンバー212と、反応部211とを有する。反応部211は、第2のチャンバー214と、第1のチャンバー212と第2のチャンバー214とを接続する連結部216とを含む。
【0070】
また、チップ200は反応部211を複数含み、複数の反応部211は、それぞれ第1のチャンバー212に接続されており、かつ、チップ200の中央部から放射線状方向に配置されている。また、第1のチャンバー212、第2のチャンバー214、および連結部216は、基板(第1基板210)の第1の面210aに設けられている。また、連結部216の最大幅d3は、各第2のチャンバー214の最小幅d2よりも小さい。
【0071】
また、反応部211において、第2のチャンバー214は、連結部216を介して第1のチャンバー212に接続されている。さらに、第1のチャンバー212は、反応液(液滴)32を供給しうる導入口222aと、第1のチャンバー212内の空気を排出しうる排出口222bとを含む。導入口222aおよび排出口222bはそれぞれ、溝218および溝219を介して第1のチャンバー212と接続されている。チップ200が1個の第1のチャンバー212と、この第1のチャンバー212に連結部216を介して接続される複数の第2のチャンバー214と、反応液(液滴)32を供給しうる導入口222aと、第1のチャンバー212内の空気を排出しうる排出口222bとを有することにより、1回の反応液供給動作ですべての第2のチャンバー214に反応液32を供給することができる。
【0072】
また、チップ200を構成する第1基板210および第2基板220は例えば図8に示されるように円形状であり、第1のチャンバー212が第1基板210の中央部に配置され、複数の第2のチャンバー214が第1のチャンバー212より外側に、チップ200の中央部から放射線状方向に配置されている。
【0073】
第1のチャンバー212は図8に示されるように、第2のチャンバー214に対向する部分の幅が大きく、隣り合う第2のチャンバー214の間に位置する部分の幅が小さくなるような形状を有する。第1のチャンバー212がこのような形状を有することにより、遠心処理を施した時に、第1のチャンバー212間で反応液32の移動および残留が生じるのを防止することができ、また、複数の第2のチャンバー214それぞれに導入される反応液の量をほぼ均一にすることができる。
【0074】
図9(a)〜図9(c)は、図8のチップ200に液体30および液滴32を充填する方法を説明する断面図である。なお、図9(a)〜図9(c)は、図8のX−X’における断面を示している。
【0075】
図9(a)に示されるように、第1のチャンバー212および第2のチャンバー214は第1基板210に設けられている。第2基板220には、穴222aおよび穴224が設けられている。この穴222aは第1のチャンバー212の上に設けられ、穴224は第2のチャンバー214の上に設けられている。第1基板210および第2基板220としては、第1実施形態における第1基板10および第2基板20と同様のものを使用することができる。
【0076】
まず、図9(b)に示されるように、例えばピペット34を用いて、穴224から第2のチャンバー214に液体30を導入する。液体30の材質および導入方法は第1実施形態で説明した通りである。次いで、図9(c)に示されるように、例えばピペット34を用いて、第1のチャンバー212に液滴32を導入する。液滴32の材質および導入方法は第1実施形態で説明した通りである。
【0077】
次に、図8のチップ200を用いて核酸増幅を行う工程について説明する。図10(a)〜図10(d)は、図8のチップ200を用いて核酸増幅を行う工程を説明する平面図である。
【0078】
まず、図10(a)に示されるように、図7(b)に示される手順によって、第2のチャンバー214に液体30を導入する。次に、図10(b)に示されるように、図7(c)に示される手順によって、第1のチャンバー212に反応液32を導入する。次いで、図10(c)に示されるように、チップ200を遠心分離装置(図示せず)に取り付けて遠心処理を施すことにより、遠心力を利用して、第1のチャンバー212内の反応液32を、連結部216を介して第2のチャンバー214内に導入する。これにより、反応液は液滴32として、第2のチャンバー214内において回転軸Aから離れた位置(チップ200の外周部近傍)に移動する。遠心処理は例えば1,000〜15,000rpmで0.5〜5分間行うことができる。遠心分離装置としては、第1実施形態で使用する遠心分離装置と同様に、市販されている公知のものを使用することができる。
【0079】
続いて、図10(d)に示されるように、チップ200を本実施形態に係る核酸増幅装置140に取り付け、回転部41によりチップ200を回転させる際に、重力を利用することにより、液滴32を第2のチャンバー214内において回転軸A近傍に移動させる。この状態で、回転軸A近傍に液滴32を保持することにより、液滴32を回転軸A近傍の第1の温度に調節することができる(図10(d)の左上の第2のチャンバー214参照、工程3)。
【0080】
さらに、所定時間経過後に、再び回転部41によりチップ200を回転させる際に、重力を利用することにより、液滴32を第2のチャンバー214内において回転軸Aから離れた位置(例えば図10(c)で示される位置)に移動させる。これにより、この状態で、第2のチャンバー214内において回転軸Aから離れた位置に液滴32を保持することにより、液滴32を回転軸Aから離れた第2の温度に調節することができる(図10(d)の右下の第2のチャンバー214参照、工程4)。
【0081】
上記の工程3および工程4を繰り返すことにより、液滴32に含まれうる標的核酸の増幅を行うことができる。なお、工程3および工程4における重力を利用したチップ200の回転速度は1〜20回/分であり、工程3および工程4の繰り返しは例えば、20〜60回行なうことができる。なお、工程3および工程4では、重力を利用するため、地面とチップ200とのなす角(鋭角)θ2が0<θ2<90°になるように本実施形態に係る核酸増幅装置140を配置する。
【0082】
2.2.変形例
図11は、図8のチップ200の一変形例であるチップ300を示す平面図である。図11に示されるチップ300は、第1のチャンバー212の形状が図8に示されるチップ200と異なる点以外は、チップ200と同様の構成を有する。このため、チップ200と同様の機能を有する構成要素については同じ符号を付して、詳しい説明は省略する。
【0083】
図11に示されるチップ300は、ほぼ同一幅の波型形状の第1のチャンバー312を有する。この第1のチャンバー312は、波型の頂上部分において、連結部216を介して各第2のチャンバー214に接続されている。この形状の第1のチャンバー312によって、第1のチャンバー312から各第2のチャンバー214へとより容易に液滴32を導入することができる。
【0084】
2.3.特徴
本実施形態に係る核酸増幅装置140によれば、上述した第1実施形態に係る核酸増幅装置40と同様の作用効果を有する。さらに、本実施形態に係る核酸増幅装置140によれば、チップ200(300)の第1のチャンバー212(312)が複数の第2のチャンバー214に接続されているため、一回の操作ですべての第2のチャンバー214に反応液32を供給することができる。
【0085】
本発明に係る実施の形態の説明は以上である。本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成(例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び結果が同一の構成)を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【0086】
10,210…基板(第1基板),20,220…基板(第2基板)、10a,210a…第1の面、12,212,312…第1のチャンバー、14,214…第2のチャンバー、16,216…連結部、22,224…穴、23…供給口、24…蓋部、30…液体、32…液滴(反応液)、34…ピペット、40,140…核酸増幅装置、41…回転部、41a…穴(第1ヒーター49aの収容部)、41b,41c…熱伝導性部材、42a,42b…断熱部材、43…チップ収容部、43a,43c…熱伝導性部材、43b…測定用ポート、44,144…断熱部材、44a…穴、45…第2温度制御部、45a…第2ヒーター、45c…支持部材、46a,46b…支持部材、47…チップ保持部、47a,47b…保持部材、48a,48b…被覆部材、49…第1温度制御部、49a…第1ヒーター、100,200,300…チップ、211…反応部、218,219…溝、222a…穴(導入口)、222b…穴(排出口)、d1…第1のチャンバーの最大幅、d2…第2のチャンバーの最大幅、d3…連結部の最大幅
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸増幅方法および核酸増幅装置、ならびに核酸増幅用チップに関する。
【背景技術】
【0002】
DNAやRNA等の遺伝子を検査するための方法として、PCR(Polymerase Chain Reaction)が例えば研究用および臨床検査用に広く用いられている(特許文献1)。このPCRでは通常、標的核酸を含みうる検体および試薬を含む反応液を容器に入れ、サーマルサイクラーと呼ばれる温度制御装置を用いて、例えば95℃、74℃、55℃という複数段階の温度変化を繰り返すことにより標的核酸を増幅させる。しかしながら、PCRでは通常、反応液を一定の温度に調節するのに時間がかかることが、作業効率の向上を妨げる一要因となっている。また、作業時間短縮のために反応液を急速に加熱または冷却すると、消費電力が大きくなるうえ、サーマルサイクラーの温度制御を司る温度制御素子の耐久性を下げるおそれがある。
【0003】
そこで、PCR反応をより効率良く行うために、所定の温度に制御されたサーマルサイクラーの温度制御素子に対して反応液を移動させ、反応液の温度変化を生じさせる技術も提案されている(特許文献2)。しかし、この温度制御方法では、反応容器内に残る気泡により温度勾配が乱され、標的核酸増幅における温度制御の効率が低下してしまうことがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特公平4−67957号
【特許文献2】特願2007−318627号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、反応液導入時に気泡が内部に残り難い核酸増幅用チップを提供し、かつ、前記核酸増幅用チップを用いることで、省電力化および低コスト化を達成でき、かつ増幅に要する時間を短縮できる核酸増幅方法および核酸増幅装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の一態様に係る核酸増幅方法は、
反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
前記反応液より比重が軽く、かつ、前記反応液と混和しない液体が充填された第2のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第1のチャンバーに前記反応液を導入する工程と、
遠心によって前記第1のチャンバーの前記反応液を前記第2のチャンバーに導入させる工程と、
前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させる工程と、を含む。
【0007】
上記核酸増幅方法によれば、反応液より比重が軽く反応液と混和しない液体が充填された第2のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第1のチャンバーに反応液を供給し、遠心して前記第1のチャンバーから前記第2のチャンバーに前記反応液を移動させ、前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節し、回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させるので、重力を利用して前記一方の端部から他方の端部へと前記反応液を移動させることができ、前記一方の端部での温度領域から前記他方の端部での温度領域へと、前記反応液の温度を制御することができる。
【0008】
また、予め前記反応液より比重が軽く前記反応液と混和しない前記液体が前記第2のチャンバーに充填されているので、遠心することにより気泡を残さずに前記反応液を前記第1のチャンバーから前記第2のチャンバーへ移動させることができる。これにより、気泡によって前記第2チャンバーに充填された前記液体の温度勾配が乱されることがなくなるので、前記反応液の温度をより効率良く制御できる。
【0009】
本発明の別の一態様に係る反応液が導入される核酸増幅用チップは、
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、
前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続し、前記第2のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、
前記第2のチャンバーに充填された液体と、を有し、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液とは混和しない。
【0010】
上記核酸増幅用チップにおいて、前記連結部の最大幅は、前記第1のチャンバーの最小幅よりも小さいとより好適である。本発明において、連結部の最大幅とは、連結部のうち最も広い部分の幅をいい、第1のチャンバー(第2のチャンバー)の最小幅とは、第1のチャンバー(第2のチャンバー)のうち最も狭い部分の幅をいう。
【0011】
上記核酸増幅用チップによれば、第1のチャンバーと、第2のチャンバーと、前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続し、かつ、前記第2のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を持つ連結部と、第2のチャンバーに充填された所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く反応液とは混和しない液体と、を有するので、前記反応液が第1のチャンバーから第2のチャンバーへ導入された場合に、前記反応液と前記液体とが分離された状態にすることができる。これにより、前記第2のチャンバー内における前記反応液の位置を容易に確認することができる。なお、前記反応液と前記液体とが分離された状態においては前記反応液が球状になることから、本発明で前記第2のチャンバーに導入された前記反応液を液滴と表現することもある。
【0012】
さらに、上記核酸増幅用チップの前記第2のチャンバーに充填する液体の量を、前記第2のチャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量以上、かつ、前記第1チャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量と、前記第2のチャンバーの容積と、前記連結部の容積と、を足した量以内にすることで、前記第2のチャンバー内に気泡が残り難くすることができる。
【0013】
本発明の別の一態様に係る核酸増幅装置は、
反応液が導入される核酸増幅用チップを用いた核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、
前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続し、前記第2チャンバーの最小幅より小さい最大幅を有する連結部と、
前記第2のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が前記反応液よりも軽く、かつ、前記反応液とは混和せず、
前記核酸増幅装置は、
前記核酸増幅用チップを設置可能なチップ保持部と、
回転軸を中心に前記チップ保持部を所定の回転速度で回転させる回転部と、
前記回転軸に沿って設けられた温度制御部と、を含み、
前記回転部は、回転時に重力方向における前記第2のチャンバー内の最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記チップ保持部を回転させる。
【0014】
上記核酸増幅装置において、前記核酸増幅用チップは、前記第2のチャンバーと、前記第1のチャンバーと前記第2チャンバーとを接続する前記連結部と、を含む反応部と、を有し、複数の前記反応部は、それぞれ前記第1チャンバーに接続されていることができる。
【0015】
上記核酸増幅装置において、前記温度制御部は、第1温度制御部と第2温度制御部とからなり、前記第2温度制御部は、前記第1温度制御部よりも前記回転軸から遠い位置に設けられていることができる。
【0016】
上記核酸増幅装置において、前記第2のチャンバー内に、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されていることができる。なお、本発明において「標的核酸」とは、本発明の核酸増幅装置による増幅対象となる核酸のことをいう。
【0017】
上記核酸増幅装置によれば、前記回転部によって、前記チップ保持部により保持された前記核酸増幅用チップの前記第2のチャンバー内の重力方向における最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記核酸増幅用チップを回転させることができるので、前記回転軸に沿って設けられた温度制御部によって、前記核酸増幅用チップ内の所定の位置を所定の温度に調節することができる。これにより、前記核酸増幅用チップ内に導入される反応液の温度をより効率良く調節することができるので、省電力化および低コスト化を達成でき、かつ増幅に要する時間を短縮できる。
【0018】
本発明の他の一態様に係る核酸増幅用チップは、
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
前記核酸増幅用チップの中央部に配置された第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、前記第1のチャンバーと前記第2チャンバーとを接続する連結部と、を含む反応部と、
を有し、
前記反応部を複数含み、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第1のチャンバーに接続されており、かつ、前記中央部から放射線状方向に配置されている。
【0019】
上記核酸増幅用チップを用いて核酸増幅を行うことにより、複数の前記反応部毎に異なる試薬を使用することが可能となるので、異なる標的核酸を同時に増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】本発明の第1実施形態に係る核酸増幅装置を説明する斜視図(図1(a)は核酸増幅装置の全体図、図1(b)は図1(a)の核酸増幅装置から保持部材を取り外した図、図1(c)は図1(b)の核酸増幅装置から断熱部材を取り外した図。)。
【図2】図1(b)の第1温度制御部、第2温度制御部および核酸増幅用チップ収容部を抜き出して、回転軸Aの延びる方向と垂直な方向(図1(a)〜図1(c)の左側)から記載した拡大図。
【図3】本発明の第1実施形態に係る核酸増幅装置に設けられる核酸増幅用チップの断面図(図3(a))および前記核酸増幅用チップの第1基板の平面図(図3(b))。
【図4】図3(b)の核酸増幅用チップに液体が充填された状態を説明する図。
【図5】図3(b)の核酸増幅用チップに液滴が充填された状態を説明する図(図5(a))および図3(b)の核酸増幅用チップ内の液体中を液滴が移動する状態を説明する図(図5(b))。
【図6】図3(b)の核酸増幅用チップを第1の温度で保持する状態を説明する図(図6(a))および図3(b)の核酸増幅用チップを第2の温度で保持する状態を説明する図(図6(b))。
【図7】本発明の第2実施形態に係る核酸増幅装置を説明する斜視図(図7(a)は核酸増幅装置の全体図、図7(b)は図7(a)の装置から保持部材および第2温度制御部を取り外した図、図7(c)は図7(b)の装置から測定用ポート、断熱部材および核酸増幅用チップを取り外した図。)。
【図8】本発明の第2実施形態に係る核酸増幅装置に設けられる核酸増幅用チップの平面図。
【図9】図8の核酸増幅用チップに液体および液滴を充填する方法を説明する断面図(図9(a)〜図9(c))。
【図10】図8の核酸増幅用チップを用いて核酸増幅を行う工程を説明する平面図(図10(a)〜図10(d))。
【図11】図8の核酸増幅用チップの一変形例を示す平面図。
【発明を実施するための形態】
【0021】
以下に、本発明の一実施形態に係る核酸増幅方法および核酸増幅装置、ならびに核酸増幅用チップ(チップ)について具体的に説明する。
【0022】
1.第1実施形態
図1(a)〜図1(c)は、本発明の第1実施形態に係る核酸増幅装置40を説明する斜視図である(図1(a)は核酸増幅装置40の全体図、図1(b)は図1(a)の核酸増幅装置40から保持部材47bを取り外した図、図1(c)は図1(b)の核酸増幅装置40から断熱部材44を取り外した図。)。
【0023】
1.1.核酸増幅装置の構成
図1(a)〜図1(c)に示されるように、本実施形態に係る核酸増幅装置40は、温度制御部(第1温度制御部49および第2温度制御部45)と、チップ100を設置可能なチップ保持部47と、回転軸Aを中心にチップ100を回転させる回転部41とを含む。
【0024】
チップ100は、図3(a)および図3(b)に示されるように、第1のチャンバー12と、第2のチャンバー14と、第1のチャンバー12と第2のチャンバー14とを接続する連結部16とを基板10の第1の面10aに有する。
【0025】
チップ保持部47は、回転時にチップ100の長手方向に重力が作用するようにチップ100を保持する。
【0026】
温度制御部は、チップ100の所定の位置を所定の温度に調節する。第1温度制御部49は回転軸Aに沿って設けられている。
【0027】
チップ回転部49は、回転時に重力方向における第2のチャンバー14内の最下点と回転軸Aとの距離が変化するようにチップ100を回転させる。
【0028】
核酸増幅装置40には、複数のチップ収容部43が、回転軸Aに対称にかつ回転軸Aの中心から放射線状方向に配置されており、1つのチップ収容部43内に、1つのチップ100(図1(a)〜図1(c)ではチップ100は図示せず)が収容されている。図1(b)および図1(c)に示されるように、隣り合うチップ収容部43の間には断熱部材44が配置されており、隣り合うチップ収容部43の間での熱の移動を遮断している。チップ収容部43には例えば、チップ100(図6(a)および図6(b)参照)の第1のチャンバー12が第2のチャンバー14よりも回転軸Aに近くなるようにチップ100を収容することができる。なお、チップ100の第2のチャンバー14が第1のチャンバー12よりも回転軸Aに近くなるようにチップ100を収容してもよい。
【0029】
図2は、図1(b)の第1温度制御部49および第2温度制御部45ならびにチップ収容部43を抜き出して、回転軸Aの延びる方向と垂直な方向(図1(a)〜図1(c)の左側)から記載した拡大図である。
【0030】
本実施形態に係る核酸増幅装置40では、温度制御部は、第1温度制御部49と第2温度制御部45とからなり、第2温度制御部45は図1(b)に示されるように、第1温度制御部49よりも回転軸Aから遠い位置に設けられている。また、第1温度制御部49は図1(b)に示されるように、回転軸Aに沿って設けることができる。
【0031】
第2温度制御部45は、図2に示されるように、円盤状の形状を有する。すなわち、第2温度制御部45は、外周部に設けられた第2ヒーター45aを有する。
【0032】
回転部41は、回転軸Aを中心にチップ保持部47を所定の回転速度で回転させることによってチップ100を回転させる。回転部41は例えばアルミ等の金属からなる。また、図2に示されるように、回転部41の外周には、断熱部材44が設けられ、この断熱部材44を挟むように2枚の熱伝導性部材41b,41cが配置されている。熱伝導性部材41b、断熱部材42a、および熱伝導性部材43aが同心円盤を構成し、また、熱伝導性部材41c、断熱部材42b、および熱伝導性部材43cが同心円盤を構成し、これらの2枚の同心円盤がチップ収容部43および断熱部材44を挟むように配置されている。また、回転部41の少なくとも一部が、熱伝導性部材41b、断熱部材44および熱伝導性部材41cを貫通する穴44a内に設けられている。熱伝導性部材41b,41cは例えばアルミ等の金属からなる。
【0033】
また、チップ100を収容するチップ収容部43は、チップ100からの情報を光学的に読み取る光学的検出部(測定用ポート)43bを有する。すなわち、光学的検出部43bは第2のチャンバー14内で増幅された核酸の濃度を測定する。光学的検出部43bの近傍には、LEDおよびCCDセンサ(図示せず)等を配置することができる。これにより、本実施形態による核酸増幅装置40を用いてリアルタイムPCRを行う場合、チップ100が回転中にCCDセンサに対向したときに、第2のチャンバー14内で増幅された核酸の濃度を光学的に測定することができるため、サイクル毎の増幅産物量を測定することができる。
【0034】
熱伝導性部材43a,43cは第2ヒーター45aに接している。熱伝導性部材43a,43cは例えばアルミなどの金属からなる。第2ヒーター45aの熱が熱伝導性部材43a,43cに伝搬することで、チップ収容部43内のチップ100の所定の位置が所定の温度に調節される。第2ヒーター45aは例えば、外周部に取り付けられたフィルム状のヒーターであることができる。さらに、熱伝導性部材41a、断熱部材44および熱伝導性部材41cを貫通する穴44aが設けられている。
【0035】
第1温度制御部49は、図1(b)および図2に示されるように、第1ヒーター49aと、第1ヒーター49aを収容する第1ヒーター収容部(回転部41の穴)41aとを含む。第1ヒーター49は例えば棒状のヒーターであり、回転軸Aに沿って、穴44aを貫通するように配置される。
【0036】
第1ヒーター収容部41に設けられた穴41aは、回転軸Aに沿って設けられ、この穴41aに第1ヒーター49aが収容される。これにより、第1温度制御部49は、チップ収容部43に収容されるチップ100のうち回転軸A近傍の領域を所定の温度に調節することができる。より具体的には、第1温度制御部49が、回転軸Aに沿って設けられた第1ヒーター49aを含むことにより、回転軸Aからの距離が大きくなるにつれて温度が小さくなるような温度勾配をチップ100に生じさせることができる。第1ヒーター収容部41aは、円筒状の被覆部材48a,48b内に配置されている。
【0037】
例えば、チップ100のうち第1のチャンバー12が第2のチャンバー14よりも回転軸Aに近くなるように配置する場合、第1温度制御部49によって、回転軸A近傍の領域をPCRの熱変性温度(例えば95℃)に調節し、第2温度制御部45によって、回転軸A近傍から離れた領域をアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度(例えば60℃)に調節することができる。これにより、チップ100の第2のチャンバー14のうち第1のチャンバー12に近い側をPCRの熱変性温度(例えば95℃)に調節し、チップ100の第2のチャンバー14のうち第1のチャンバー12から離れている側をアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度(例えば60℃)に調節することができる。
【0038】
図1(a)に示されるように、チップ100が収容されるチップ収容部43の外周部には第2温度制御部45が配置されており、さらにその外側が保持部材47a,47bで挟まれている。保持部材47a,47bはそれぞれ被覆部材48a,48bを介して支持部材46a,46bに固定されている。回転部41は被覆部材48a,48bに覆われており、被覆部材48a,48bの両端が支持部材46a,46bに固定されていることから、被覆部材48a,48bが図1(a)に示される矢印IまたはIIの方向に回転すると、保持部材47a,47bもともに、図1(a)に示される矢印Iまたは矢印IIの方向に回転する。なお、本実施形態に係る核酸増幅装置40は、回転部41が取り付けられた支持部材46bの外側に、回転部41の回転を制御するモータを備えている。
【0039】
また、回転部41が回転軸Aを中心に回転することにより、回転軸Aを中心にチップ100が回転する。すなわち、回転部41にチップ保持部47が固定されているため、回転部41が回転軸Aを中心に回転すると、チップ保持部47も回転軸Aを中心に回転する。なお、チップ100の第1のチャンバー12に供給された反応液32(図5(a)参照)は、遠心分離装置(図示せず)を用いてチップ100に対して遠心分離処理を施すことより、遠心力によって、連結部16を介して第2のチャンバー14に導入することができる(図5(b)参照)。遠心処理は例えば1,000〜15,000rpmで0.5〜5分間行うことができる。
【0040】
1.2.チップの構成
次に、本実施形態に係る核酸増幅装置40に設けられるチップ100の構成について説明する。図3(a)は、本実施形態に係る核酸増幅装置に設けられるチップ100の断面図であり、図3(b)は、チップ100の第1基板10の平面図である。なお、後述する図4、図5(a)、図5(b)、図6(a)、および図6(b)でも図3(b)と同様に、チップ100の第1基板10の平面図を示している。
【0041】
チップ100は、反応液32が導入される核酸増幅用チップであり、図3(a)および図3(b)に示されるように、第1のチャンバー12と、第2のチャンバー14と、第1のチャンバー12と第2のチャンバー14とを接続し、第2のチャンバー14の最小幅d2よりも小さい最大幅d3を有する連結部16とを含む。図3(a)に示されるように、チップ100は2枚の透明基板(第1基板10および第2基板20)から構成されており、第1のチャンバー12、第2のチャンバー14および連結部16を表面(第1の面)10aに有する第1基板10と、穴22を有する第2基板20とが、穴22が第1ウェル12の供給口23上に配置された状態で接着されている。
【0042】
第1基板10および第2基板20の材質は限定されないが、耐熱性で自家蛍光が低いものが好ましく、例えば、ポリカーボネート等の樹脂が挙げられる。第1基板10および第2基板20の材質は、撥水性を有するため、後述する液滴32がチップ100中を容易に移動できる点で、樹脂が好ましい。また、後述するように、第2のチャンバー14には、例えばマイクロピペットによる充填や真空充填などの方法により、所定の温度範囲内(例えば45℃〜100℃)で液滴(反応液)32より比重が低くかつ液滴32と混和しない液体30を充填させることができる。
【0043】
第1のチャンバー12は、反応液を導入しうる供給口23を有する。後述するように、第1のチャンバー12の供給口23から、核酸増幅を行うための反応液からなる液滴32(図5(a)および図5(b)参照)が導入される。
【0044】
第2のチャンバー14では、液滴32の核酸増幅が行われる。第2のチャンバー14には、後述するように、液体30(図5(a)および図5(b)参照)が充填される。また、第2のチャンバー14内(例えば第2チャンバー14の表面)には、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されていてもよい。この試薬には、例えばプライマーや蛍光プローブが含まれる。この試薬は第2のチャンバー14の表面に塗布された後、乾燥させた状態で該表面に配置されていてもよい。あるいは、試薬が液体30内に液滴の状態で存在していてもよい。第2のチャンバー14の表面に試薬が塗布されている場合、液滴(反応液)32と接触することにより、液滴32中に試薬が溶解することができる。なお、試薬は、標的核酸の種類に応じて適切なものを選択できる。したがって、本実施形態に係る核酸増幅装置40が複数のチップ100を使用する場合、チップ100毎に異なる標的核酸を同時に増幅することができ、この場合、各標的核酸に応じた試薬を選択することが好ましい。
【0045】
なお、増幅対象となる標的核酸としては、例えば、血液、尿、唾液、髄液等の検体中のDNA、または該検体から抽出したRNAから逆転写したcDNA等が挙げられる。
【0046】
図3(b)に示されるように、連結部16の最大幅d3は、第2のチャンバー14の最小幅d2よりも小さい。これにより、後述する液滴(反応液)32(図5参照)が第2のチャンバー14から第1のチャンバー12へと侵入するのを効果的に防止することができ、かつ、第1のチャンバー12から第2のチャンバー14への気泡の混入を防止するとともに、遠心分離処理による反応液の導入時に第2チャンバーに気泡が残留してしまうことを効果的に防止することができる。
【0047】
より具体的には、液滴32が球形である場合、液滴32の直径をd(mm)とすると、液滴32の体積(V=πd3/6)は0.2〜20μlであることが好ましい。ここで、液滴32の体積が20μlを超える場合、液滴32が不安定となり壊れやすくなることがあり、一方、0.2μl未満である場合、粘性によって液滴32の移動が遅くなることがある。
【0048】
また、液滴32の移動が円滑に行われる点で、第2のチャンバー14の最小幅d2>d+0.2(mm)であることが好ましく、さらに、対流を低減できる点で、第2のチャンバー14の最小幅d2≦2.5(mm)であるのがより好ましい。
【0049】
さらに、液滴32が重力の影響を受けにくい点で、連結部16の最大幅d3<d×0.2(mm)であることが好ましく、また、液滴32が遠心力により連結部16をより円滑に通過できる点で、連結部16の最大幅d3≧0.1mmであるのがより好ましい。
【0050】
1.3.核酸増幅方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅装置40を用いた核酸増幅方法について説明する。本実施形態に係る核酸増幅方法は、反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
反応液32より比重が軽く、かつ、反応液32と混和しない液体30が充填された第2のチャンバー14を有する核酸増幅用チップ100の第1のチャンバー12に反応液32を導入する工程と、
遠心によって第1のチャンバー12の反応液32を第2のチャンバー14に導入させる工程と、
核酸増幅用チップ(チップ)100の一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸Aを中心として核酸増幅用チップ100を所定の速度で回転させる工程と、
を含む。
【0051】
本実施形態に係る核酸増幅方法によれば、反応液32が第2のチャンバー14に導入された状態で回転軸Aを中心として核酸増幅用チップ100を所定の速度で回転させることにより、重力によって前記一方の端部から他方の端部へと反応液32を移動させることによって反応液32の温度を調節することができ、前記一方の端部での温度領域から前記他方の端部での温度領域へと、反応液32の温度を制御することができる。 まず、チップ100への液体30の充填方法について説明する。図4は、図3(b)のチップに液体30が充填された状態を説明する図である。まず、チップ100の第2のチャンバー14に、例えばマイクロピペットや真空充填などの方法により、液体30を充填する。液体30は例えば、第2のチャンバー14に設けられた図示しない注入口から導入することができる。
【0052】
液体30としては、例えばオイルが挙げられる。オイルは、水より比重が軽く、水と混和せず、核酸増幅に使用する試薬および検体に影響を与えないものであれば特に限定されないが、例えばミネラルオイル、シリコンオイルが挙げられる、なお、液体30の粘度を調節することにより、液滴(反応液)32の移動速度を調節する(すなわち、液滴32の温度変化を調節する)ことができる。
【0053】
ここで、第2のチャンバー14に気泡が残り難くなる観点から、液体30は、第2のチャンバー14の容積から反応液(液滴)32の容積を引いた量以上、かつ、第1チャンバー12の容積から反応液(液滴)32の容積を引いた量と、第2のチャンバー12の容積と、連結部16の容積と、を足した量以内を充填させることができる。
【0054】
次いで、図5(a)に示されるように、ウェル100の蓋部24を開き、穴23から第1のチャンバー12に液滴(反応液)32を導入する。図5(a)は、図3(b)のチップ100に液滴32が充填された状態を説明する図である。
【0055】
液滴32は例えば、マイクロピペットを用いて第1のチャンバー12に導入することができる。また、液滴32は例えば、標的核酸を含みうる検体、PCRマスターミックス、プライマー、蛍光プローブを適切な濃度に調整して混合されたものである。なお、第2のチャンバー14の表面にプライマーや蛍光プローブ等の試薬が塗布されている場合、液滴32は該試薬を含まないものであってもよい。また、導入する液滴32の好ましい量は上述したとおりである。
【0056】
続いて、第1のチャンバー12の穴22を例えばシール等の蓋部24で封止した状態で、遠心分離装置(図示せず)の回転中心から第2のチャンバー14までの距離が、遠心分離装置の回転中心から第1のチャンバー12までの距離よりも大きくなるような配置にて、遠心分離機にチップ100を取り付ける。遠心分離装置としては、市販されている公知のものを使用することができる。これにより、遠心分離装置によって、遠心力を利用して、第1のチャンバー12から第2のチャンバー14の方向に液滴32を移動させる。その結果、液滴32は第1のチャンバー12から連結部16を介して第2のチャンバー14に導入され、図5(b)に示されるように、第2のチャンバー14の先端(第1のチャンバー12から離れた側の先端)まで移動する。図5(b)は、図3(b)のチップ100内を液滴32が移動した状態を説明する図である。
【0057】
次に、得られたチップ100の第1のチャンバー12が回転軸Aの近傍に配置され、第2のチャンバー14が測定用ポート43b近傍に配置されるように、本実施形態に係る核酸増幅装置40にチップ100を取り付ける。
【0058】
この場合、第1温度制御部49によって、回転軸Aに近い領域が第1の温度に保持され、第2温度制御部45によって、回転軸Aから離れた領域が、第1の温度より低い(高い)第2の温度で保持される場合、チップ100を回転させる際に重力を利用して、液滴32の位置を回転軸Aから離れた領域に移動させることにより、液滴32を第2の温度に調節することができ、また、チップ100を回転させる際に重力を利用して、液滴32の位置を回転軸A近傍の領域に移動させることにより、液滴32を第1の温度に調節することができる。
【0059】
例えば、第1の温度がPCRの熱変性温度(例えば95℃)であり、第2の温度がアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度(例えば60℃)である場合、重力を利用して、液滴32を適切な位置に移動させることにより、液滴32を所定の温度に調節して、核酸増幅を行うことができる。なお、この工程では、重力を利用するため、地面とチップ100とのなす角(鋭角)θ1が0<θ1<90°になるように本実施形態に係る核酸増幅装置40を配置する。
【0060】
より具体的には、チップ100を回転させる際に重力を利用して、図6(a)に示されるように、チップ100の第1のチャンバー12を第2のチャンバー14よりも地面に近い位置に配置することにより、液体30と液滴32との比重の差によって、液滴32は第2のチャンバー14中において第1のチャンバー12近傍に移動する。これにより、図3(b)のチップ100を回転軸Aに近い領域における温度(第1の温度)に調節することができる(工程1)。
【0061】
また、チップ100を回転させる際に重力を利用して、図6(b)に示されるように、チップ100の第2のチャンバー14を第1のチャンバー12よりも重力方向側に配置することにより、液体30と液滴32との比重の差によって、液滴32は第2のチャンバー14中で第1のチャンバー12から離れた位置に移動する。これにより、液滴32を回転軸Aから離れた領域における温度(第1の温度より低い(高い)第2の温度)に調節することができる(工程2)。
【0062】
上記の工程1および工程2を繰り返すことにより、液滴32に含まれうる標的核酸の増幅を行うことができる。なお、工程1および工程2の繰り返しは例えば、1〜20回/分行なうことができる。
【0063】
なお、第1基板10aが例えば樹脂からなる場合、チップ100を構成する第1基板10aの表面が撥水性を有するため、液滴32がチップ100の表面10aに付着するのを防止することができる。これにより、液滴32をチップ100中で容易に移動させることができる。
【0064】
1.4.特徴
本実施形態に係る核酸増幅装置40によれば、チップ収容部43にチップ100に装着させた状態で回転部41によって回転軸Aを中心にチップ100を回転させる。ここで、チップ100の第2のチャンバー14内の液滴32は液体30より比重が重いため、回転によりチップ100の向きを変えることにより、液滴32は第2のチャンバー14の中を沈降しながら周期的に移動する。この動作を繰り返すことにより、液滴32を所定の位置に配置することで、所定の温度(すなわちPCRの温度サイクルの温度)に調節することができる。
【0065】
したがって、本実施形態に係る核酸増幅装置40によれば、公知のPCR用の温度調節方法(例えば、チューブを差し込んだヒートブロックについて過熱冷却を繰り返す方法や、反応チューブを複数のヒートブロック間で移動させる方式)に比べて、核酸増幅に要する反応液量を低減することができ、温度制御が簡単であり、かつ消費電力を低減することができるうえ、短時間で核酸増幅を行うことができる。
【0066】
2.第2実施形態
図7(a)〜図7(c)は、本発明の第2実施形態に係る核酸増幅装置140を説明する斜視図である(図7(a)は核酸増幅装置140の全体図、図7(b)は図7(a)の核酸増幅装置140から保持部材47bおよび第2温度制御部45を取り外した図、図7(c)は図7(b)の核酸増幅装置40から測定用ポート43b、断熱部材144およびチップ200を取り外した図。)。
【0067】
2.1.核酸増幅装置の構成
本実施形態に係る核酸増幅装置140は、第1のチャンバー12と、第2のチャンバー14と、第1のチャンバー12と第2のチャンバー14とを接続する連結部16を含む核酸増幅用チップ(チップ)200(図8参照)を用いて核酸増幅を行う点で、第1実施形態に係る核酸増幅装置40とは異なる。なお、本実施形態に係る核酸増幅装置140において、第1実施形態に係る核酸増幅装置40と共通の構成については共通の符号を付して詳しい説明を省略する。
【0068】
図8は、本実施形態に係る核酸増幅装置140に設けられるチップ200の平面図である。
【0069】
チップ200は図8に示されるように、反応液32が導入される核酸増幅用チップであり、チップ200の中央部に配置された第1のチャンバー212と、反応部211とを有する。反応部211は、第2のチャンバー214と、第1のチャンバー212と第2のチャンバー214とを接続する連結部216とを含む。
【0070】
また、チップ200は反応部211を複数含み、複数の反応部211は、それぞれ第1のチャンバー212に接続されており、かつ、チップ200の中央部から放射線状方向に配置されている。また、第1のチャンバー212、第2のチャンバー214、および連結部216は、基板(第1基板210)の第1の面210aに設けられている。また、連結部216の最大幅d3は、各第2のチャンバー214の最小幅d2よりも小さい。
【0071】
また、反応部211において、第2のチャンバー214は、連結部216を介して第1のチャンバー212に接続されている。さらに、第1のチャンバー212は、反応液(液滴)32を供給しうる導入口222aと、第1のチャンバー212内の空気を排出しうる排出口222bとを含む。導入口222aおよび排出口222bはそれぞれ、溝218および溝219を介して第1のチャンバー212と接続されている。チップ200が1個の第1のチャンバー212と、この第1のチャンバー212に連結部216を介して接続される複数の第2のチャンバー214と、反応液(液滴)32を供給しうる導入口222aと、第1のチャンバー212内の空気を排出しうる排出口222bとを有することにより、1回の反応液供給動作ですべての第2のチャンバー214に反応液32を供給することができる。
【0072】
また、チップ200を構成する第1基板210および第2基板220は例えば図8に示されるように円形状であり、第1のチャンバー212が第1基板210の中央部に配置され、複数の第2のチャンバー214が第1のチャンバー212より外側に、チップ200の中央部から放射線状方向に配置されている。
【0073】
第1のチャンバー212は図8に示されるように、第2のチャンバー214に対向する部分の幅が大きく、隣り合う第2のチャンバー214の間に位置する部分の幅が小さくなるような形状を有する。第1のチャンバー212がこのような形状を有することにより、遠心処理を施した時に、第1のチャンバー212間で反応液32の移動および残留が生じるのを防止することができ、また、複数の第2のチャンバー214それぞれに導入される反応液の量をほぼ均一にすることができる。
【0074】
図9(a)〜図9(c)は、図8のチップ200に液体30および液滴32を充填する方法を説明する断面図である。なお、図9(a)〜図9(c)は、図8のX−X’における断面を示している。
【0075】
図9(a)に示されるように、第1のチャンバー212および第2のチャンバー214は第1基板210に設けられている。第2基板220には、穴222aおよび穴224が設けられている。この穴222aは第1のチャンバー212の上に設けられ、穴224は第2のチャンバー214の上に設けられている。第1基板210および第2基板220としては、第1実施形態における第1基板10および第2基板20と同様のものを使用することができる。
【0076】
まず、図9(b)に示されるように、例えばピペット34を用いて、穴224から第2のチャンバー214に液体30を導入する。液体30の材質および導入方法は第1実施形態で説明した通りである。次いで、図9(c)に示されるように、例えばピペット34を用いて、第1のチャンバー212に液滴32を導入する。液滴32の材質および導入方法は第1実施形態で説明した通りである。
【0077】
次に、図8のチップ200を用いて核酸増幅を行う工程について説明する。図10(a)〜図10(d)は、図8のチップ200を用いて核酸増幅を行う工程を説明する平面図である。
【0078】
まず、図10(a)に示されるように、図7(b)に示される手順によって、第2のチャンバー214に液体30を導入する。次に、図10(b)に示されるように、図7(c)に示される手順によって、第1のチャンバー212に反応液32を導入する。次いで、図10(c)に示されるように、チップ200を遠心分離装置(図示せず)に取り付けて遠心処理を施すことにより、遠心力を利用して、第1のチャンバー212内の反応液32を、連結部216を介して第2のチャンバー214内に導入する。これにより、反応液は液滴32として、第2のチャンバー214内において回転軸Aから離れた位置(チップ200の外周部近傍)に移動する。遠心処理は例えば1,000〜15,000rpmで0.5〜5分間行うことができる。遠心分離装置としては、第1実施形態で使用する遠心分離装置と同様に、市販されている公知のものを使用することができる。
【0079】
続いて、図10(d)に示されるように、チップ200を本実施形態に係る核酸増幅装置140に取り付け、回転部41によりチップ200を回転させる際に、重力を利用することにより、液滴32を第2のチャンバー214内において回転軸A近傍に移動させる。この状態で、回転軸A近傍に液滴32を保持することにより、液滴32を回転軸A近傍の第1の温度に調節することができる(図10(d)の左上の第2のチャンバー214参照、工程3)。
【0080】
さらに、所定時間経過後に、再び回転部41によりチップ200を回転させる際に、重力を利用することにより、液滴32を第2のチャンバー214内において回転軸Aから離れた位置(例えば図10(c)で示される位置)に移動させる。これにより、この状態で、第2のチャンバー214内において回転軸Aから離れた位置に液滴32を保持することにより、液滴32を回転軸Aから離れた第2の温度に調節することができる(図10(d)の右下の第2のチャンバー214参照、工程4)。
【0081】
上記の工程3および工程4を繰り返すことにより、液滴32に含まれうる標的核酸の増幅を行うことができる。なお、工程3および工程4における重力を利用したチップ200の回転速度は1〜20回/分であり、工程3および工程4の繰り返しは例えば、20〜60回行なうことができる。なお、工程3および工程4では、重力を利用するため、地面とチップ200とのなす角(鋭角)θ2が0<θ2<90°になるように本実施形態に係る核酸増幅装置140を配置する。
【0082】
2.2.変形例
図11は、図8のチップ200の一変形例であるチップ300を示す平面図である。図11に示されるチップ300は、第1のチャンバー212の形状が図8に示されるチップ200と異なる点以外は、チップ200と同様の構成を有する。このため、チップ200と同様の機能を有する構成要素については同じ符号を付して、詳しい説明は省略する。
【0083】
図11に示されるチップ300は、ほぼ同一幅の波型形状の第1のチャンバー312を有する。この第1のチャンバー312は、波型の頂上部分において、連結部216を介して各第2のチャンバー214に接続されている。この形状の第1のチャンバー312によって、第1のチャンバー312から各第2のチャンバー214へとより容易に液滴32を導入することができる。
【0084】
2.3.特徴
本実施形態に係る核酸増幅装置140によれば、上述した第1実施形態に係る核酸増幅装置40と同様の作用効果を有する。さらに、本実施形態に係る核酸増幅装置140によれば、チップ200(300)の第1のチャンバー212(312)が複数の第2のチャンバー214に接続されているため、一回の操作ですべての第2のチャンバー214に反応液32を供給することができる。
【0085】
本発明に係る実施の形態の説明は以上である。本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成(例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び結果が同一の構成)を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【0086】
10,210…基板(第1基板),20,220…基板(第2基板)、10a,210a…第1の面、12,212,312…第1のチャンバー、14,214…第2のチャンバー、16,216…連結部、22,224…穴、23…供給口、24…蓋部、30…液体、32…液滴(反応液)、34…ピペット、40,140…核酸増幅装置、41…回転部、41a…穴(第1ヒーター49aの収容部)、41b,41c…熱伝導性部材、42a,42b…断熱部材、43…チップ収容部、43a,43c…熱伝導性部材、43b…測定用ポート、44,144…断熱部材、44a…穴、45…第2温度制御部、45a…第2ヒーター、45c…支持部材、46a,46b…支持部材、47…チップ保持部、47a,47b…保持部材、48a,48b…被覆部材、49…第1温度制御部、49a…第1ヒーター、100,200,300…チップ、211…反応部、218,219…溝、222a…穴(導入口)、222b…穴(排出口)、d1…第1のチャンバーの最大幅、d2…第2のチャンバーの最大幅、d3…連結部の最大幅
【特許請求の範囲】
【請求項1】
反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
前記反応液より比重が軽く、かつ、前記反応液と混和しない液体が充填された第2のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第1のチャンバーに前記反応液を導入する工程と、
遠心によって前記第1のチャンバーの前記反応液を前記第2のチャンバーに導入させる工程と、
前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させる工程と、を含む、核酸増幅方法。
【請求項2】
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、
前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続し、前記第2のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、
前記第2のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和しない、核酸増幅用チップ。
【請求項3】
請求項2に記載の核酸増幅用チップであって、
前記液体は、前記第2のチャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量以上、かつ、
前記第1チャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量と、前記第2のチャンバーの容積と、前記連結部の容積と、を足した量以内が充填されている、前記核酸増幅用チップ。
【請求項4】
反応液が導入される核酸増幅用チップを用いた核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、
前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続し、前記第2チャンバーの最小幅より小さい最大幅を有する連結部と、
前記第2のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が前記反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和せず、
前記核酸増幅装置は、
前記核酸増幅用チップを設置可能なチップ保持部と、
回転軸を中心に前記チップ保持部を所定の回転速度で回転させることによって前記核酸増幅用チップを回転させる回転部と、
前記回転軸に沿って設けられた温度制御部と、を含み、
前記回転部は、回転時に重力方向における前記第2のチャンバー内の最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記核酸増幅用チップを回転させる、前記核酸増幅装置。
【請求項5】
請求項4に記載の核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
前記第2のチャンバーと、前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続する前記連結部と、を含む反応部を有し、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第1のチャンバーに接続されている、核酸増幅装置。
【請求項6】
請求項4または5記載の核酸増幅装置であって、
前記温度制御部は、
第1温度制御部と第2温度制御部とからなり、
前記第2温度制御部は、
前記第1温度制御部よりも前記回転軸から遠い位置に設けられている、核酸増幅装置。
【請求項7】
請求項4ないし6のいずれか1項に記載の核酸増幅装置であって、
前記第2のチャンバー内に、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されている、核酸増幅装置。
【請求項8】
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
前記核酸増幅用チップの中央部に配置された第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、前記第1のチャンバーと前記第2チャンバーとを接続する連結部と、を含む反応部と、
を有し、
前記反応部を複数含み、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第1のチャンバーに接続されており、かつ、前記中央部から放射線状方向に配置されている、前記核酸増幅用チップ。
【請求項1】
反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
前記反応液より比重が軽く、かつ、前記反応液と混和しない液体が充填された第2のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第1のチャンバーに前記反応液を導入する工程と、
遠心によって前記第1のチャンバーの前記反応液を前記第2のチャンバーに導入させる工程と、
前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させる工程と、を含む、核酸増幅方法。
【請求項2】
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、
前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続し、前記第2のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、
前記第2のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和しない、核酸増幅用チップ。
【請求項3】
請求項2に記載の核酸増幅用チップであって、
前記液体は、前記第2のチャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量以上、かつ、
前記第1チャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量と、前記第2のチャンバーの容積と、前記連結部の容積と、を足した量以内が充填されている、前記核酸増幅用チップ。
【請求項4】
反応液が導入される核酸増幅用チップを用いた核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、
前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続し、前記第2チャンバーの最小幅より小さい最大幅を有する連結部と、
前記第2のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が前記反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和せず、
前記核酸増幅装置は、
前記核酸増幅用チップを設置可能なチップ保持部と、
回転軸を中心に前記チップ保持部を所定の回転速度で回転させることによって前記核酸増幅用チップを回転させる回転部と、
前記回転軸に沿って設けられた温度制御部と、を含み、
前記回転部は、回転時に重力方向における前記第2のチャンバー内の最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記核酸増幅用チップを回転させる、前記核酸増幅装置。
【請求項5】
請求項4に記載の核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
前記第2のチャンバーと、前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとを接続する前記連結部と、を含む反応部を有し、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第1のチャンバーに接続されている、核酸増幅装置。
【請求項6】
請求項4または5記載の核酸増幅装置であって、
前記温度制御部は、
第1温度制御部と第2温度制御部とからなり、
前記第2温度制御部は、
前記第1温度制御部よりも前記回転軸から遠い位置に設けられている、核酸増幅装置。
【請求項7】
請求項4ないし6のいずれか1項に記載の核酸増幅装置であって、
前記第2のチャンバー内に、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されている、核酸増幅装置。
【請求項8】
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
前記核酸増幅用チップの中央部に配置された第1のチャンバーと、
第2のチャンバーと、前記第1のチャンバーと前記第2チャンバーとを接続する連結部と、を含む反応部と、
を有し、
前記反応部を複数含み、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第1のチャンバーに接続されており、かつ、前記中央部から放射線状方向に配置されている、前記核酸増幅用チップ。
【図2】
【図3】
【図4】
【図8】
【図9】
【図11】
【図1】
【図5】
【図6】
【図7】
【図10】
【図3】
【図4】
【図8】
【図9】
【図11】
【図1】
【図5】
【図6】
【図7】
【図10】
【公開番号】特開2011−147411(P2011−147411A)
【公開日】平成23年8月4日(2011.8.4)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−12880(P2010−12880)
【出願日】平成22年1月25日(2010.1.25)
【出願人】(000002369)セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成23年8月4日(2011.8.4)
【国際特許分類】
【出願日】平成22年1月25日(2010.1.25)
【出願人】(000002369)セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Fターム(参考)】
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