植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキット及びその利用
【課題】植物を用いて、Ｏ型糖鎖修飾された有用タンパク質を製造するためのキットを提供する。
【解決手段】本発明の植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキットは、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを備えている。
【解決手段】本発明の植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキットは、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを備えている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキット及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞内で発現するタンパク質のほとんどは、何らかの翻訳後修飾を受けている。
【０００３】
中でもＮ型糖鎖による修飾については、生理学的・生物学的に重要な役割を果たすことが明らかにされている。例えば、植物では、Ｎ型糖鎖による修飾が環境ストレス耐性に関与することが報告されている。また、例えば特許文献１には、植物細胞を用いてヒト型のＮ型糖鎖結合タンパク質を製造する方法が開示されている。
【０００４】
一方、Ｏ型糖鎖による修飾については、哺乳類、酵母等において、その関連酵素遺伝子等が明らかにされている。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ／２０００／０３４４９０号パンフレット（２０００年６月１５日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、医薬品等に利用可能な有用タンパク質を植物で製造することには様々な利点がある。例えば、植物に対する遺伝子操作は比較的容易であること、培養の際、動物病原の汚染を回避できること等の利点が挙げられる。
【０００６】
しかしながら、植物はＯ型糖鎖の修飾機構を有していない。そのため、Ｏ型糖鎖による修飾が機能等に大きな役割を与えるタンパク質の製造には、植物を利用することができなかった。
【０００７】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物を用いて、Ｏ型糖鎖修飾された有用タンパク質を製造するための、キット及びこれを利用した技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を行なった。
【０００９】
タンパク質のＯ型糖鎖修飾が、哺乳類動物等のみならず、仮に植物にとっても重要なものであれば、植物がＯ型糖鎖修飾機構を有してしかるべきである。ところが、植物はこれを有していない。このことから、植物においては、タンパク質にＯ型糖鎖は結合しないということが当然のように推測できた。また、Ｏ型糖鎖修飾機構を有さない植物にＯ型糖鎖修飾に関連する遺伝子を導入しても、当然に、当該遺伝子が正常に機能しないであろうと予想された。
【００１０】
しかし、本発明者らは、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするポリヌクレオチドを植物に導入して発現させると、Ｏ型糖鎖により修飾されたタンパク質を得ることができることを見出し、本発明に想到するに至った。
【００１１】
このように、本発明は、従来の予想に反した全く新たな知見に基づいてなされたものであり、以下の発明を包含する。
【００１２】
即ち、本発明に係る植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキットは、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを備えていることを特徴としている。
【００１３】
さらに、本発明に係るキットは、ガラクトース転移酵素及びその酵素をコードするポリヌクレオチドのうちの、少なくとも一つをさらに備えていることがより好ましい。
【００１４】
また、本発明に係る植物は、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするポリヌクレオチド、及びＮ‐アセチルガラクトサミンを結合させる対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００１５】
また、本発明に係る植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するための組成物は、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを含むことを特徴としている。
【００１６】
また、本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法は、植物内又は植物の抽出物内で、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を合成する合成工程を含んでいてもよい。
【００１７】
また、本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法は、植物の抽出物に、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を混合する混合工程を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキットは、以上のように、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを備えているので、植物を用いて、Ｏ型糖鎖修飾された有用タンパク質を製造できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
＜１．本発明に係る植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキット＞
本発明に係る植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキット（以下、「本発明に係るキット」という。）は、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一方を備えていればよい。本発明に係るキットによれば、植物を用いてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造することができる。
【００２０】
本発明に係るキットは、Ｎ‐アセチルガラクトサミンを結合させる対象のタンパク質（Ｏ型糖鎖を結合させる対象のタンパク質ということもできる。以下、「標的タンパク質」という。）として、植物が有していないタンパク質を採用する場合、特に有利な効果を発揮する。例えば、Ｏ型糖鎖の結合がその機能に重大な影響を与えるタンパク質を製造する場合、従来、動物細胞を利用する必要があったが、本発明に係るキットを用いれば、植物にＯ型糖鎖結合タンパク質を製造させることができるので、培養の際、動物病原の汚染を回避できる等の点において有利である。
【００２１】
本明細書において「Ｏ型糖鎖」とは、タンパク質のセリン残基及び／又はスレオニン残基に結合している糖鎖を意味する。また、「Ｏ型糖鎖結合タンパク質」とは、Ｏ型糖鎖が結合したタンパク質を意味する。なお、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」と記載したとき、「Ａ」、「Ｂ」、又は「Ａ及びＢ」を意味する。
【００２２】
本明細書における「植物」には様々な形態の植物が包含される。例えば、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）、種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞等の培養細胞）、プロトプラスト、カルス等が挙げられる。
【００２３】
また、本明細書において「植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造する」とは、植物を用いてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造すること意味する。ここで用いる植物の種類、形態としては、特に限定されず、植物から得た抽出物であってもよい。つまり、植物の抽出物を用いてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造することも「植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造する」の範疇である。
【００２４】
また、本明細書において「ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素」とは、タンパク質中のセリン残基及び／又はスレオニン残基に、Ｎ‐アセチルガラクトサミンを結合させる活性を有する酵素を意味する。以下、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を「ｐｐＧａｌＮＡｃＴ」と表記し、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするポリヌクレオチドを「ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子」と表記し、タンパク質中のセリン残基及び／又はスレオニン残基に、Ｎ‐アセチルガラクトサミンを結合させる活性を「ｐｐＧａｌＮＡｃＴ活性」と表記する。
【００２５】
本発明に係るキットにおいて利用できる植物の種類としては、特に限定されない。例えば、種々の単子葉植物、双子葉植物、樹木等の植物全般に適用することができる。例えば、単子葉植物としては、例えばウキクサ属植物（ウキクサ）及びアオウキクサ属植物（アオウキクサ，ヒンジモ）が含まれるうきくさ科植物；カトレア属植物、シンビジウム属植物、デンドロビューム属植物、ファレノプシス属植物、バンダ属植物、パフィオペディラム属植物、オンシジウム属植物等が含まれる、らん科植物；がま科植物、みくり科植物、ひるむしろ科植物、いばらも科植物、ほろむいそう科植物、おもだか科植物、とちかがみ科植物、ほんごうそう科植物、いね科植物、かやつりぐさ科植物、やし科植物、さといも科植物、ほしぐさ科植物、つゆくさ科植物、みずあおい科植物、いぐさ科植物、びゃくぶ科植物、ゆり科植物、ひがんばな科植物、やまのいも科植物、あやめ科植物、ばしょう科植物、しょうが科植物、かんな科植物、ひなのしゃくじょう科植物等を例示することができる。
【００２６】
また、双子葉植物としては、例えばアサガオ属植物（アサガオ）、ヒルガオ属植物（ヒルガオ，コヒルガオ，ハマヒルガオ）、サツマイモ属植物（グンバイヒルガオ、サツマイモ）、ネナシカズラ属植物（ネナシカズラ、マメダオシ）が含まれるひるがお科植物；ナデシコ属植物（カーネーション等）、ハコベ属植物、タカネツメクサ属植物、ミミナグサ属植物、ツメクサ属植物、ノミノツヅリ属植物、オオヤマフスマ属植物、ワチガイソウ属植物、ハマハコベ属植物、オオツメクサ属植物、シオツメクサ属植物、マンテマ属植物、センノウ属植物、フシグロ属植物、ナンバンハコベ属植物が含まれるなでしこ科植物；もくまもう科植物、どくだみ科植物、こしょう科植物、せんりょう科植物、やなぎ科植物、やまもも科植物、くるみ科植物、かばのき科植物、ぶな科植物、にれ科植物、くわ科植物、いらくさ科植物、かわごけそう科植物、やまもがし科植物、ぼろぼろのき科植物、びゃくだん科植物、やどりぎ科植物、うまのすずくさ科植物、やっこそう科植物、つちとりもち科植物、たで科植物、あかざ科植物、ひゆ科植物、おしろいばな科植物、やまとぐさ科植物、やまごぼう科植物、つるな科植物、すべりひゆ科植物、もくれん科植物、やまぐるま科植物、かつら科植物、すいれん科植物、まつも科植物、きんぽうげ科植物、あけび科植物、めぎ科植物、つづらふじ科植物、ろうばい科植物、くすのき科植物、けし科植物、ふうちょうそう科植物、あぶらな科植物、もうせんごけ科植物、うつぼかずら科植物、べんけいそう科植物、ゆきのした科植物、とべら科植物、まんさく科植物、すずかけのき科植物、ばら科植物、まめ科植物、かたばみ科植物、ふうろそう科植物、あま科植物、はまびし科植物、みかん科植物、にがき科植物、せんだん科植物、ひめはぎ科植物、とうだいぐさ科植物、あわごけ科植物、つげ科植物、がんこうらん科植物、どくうつぎ科植物、うるし科植物、もちのき科植物、にしきぎ科植物、みつばうつぎ科植物、くろたきかずら科植物、かえで科植物、とちのき科植物、むくろじ科植物、あわぶき科植物、つりふねそう科植物、くろうめもどき科植物、ぶどう科植物、ほるとのき科植物、しなのき科植物、あおい科植物、あおぎり科植物、さるなし科植物、つばき科植物、おとぎりそう科植物、みぞはこべ科植物、ぎょりゅう科植物、すみれ科植物、いいぎり科植物、きぶし科植物、とけいそう科植物、しゅうかいどう科植物、さぼてん科植物、じんちょうげ科植物、ぐみ科植物、みそはぎ科植物、ざくろ科植物、ひるぎ科植物、うりのき科植物、のぼたん科植物、ひし科植物、あかばな科植物、ありのとうぐさ科植物、すぎなも科植物、うこぎ科植物、せり科植物、みずき科植物、いわうめ科植物、りょうぶ科植物、いちやくそう科植物、つつじ科植物、やぶこうじ科植物、さくらそう科植物、いそまつ科植物、かきのき科植物、はいのき科植物、えごのき科植物、もくせい科植物、ふじうつぎ科植物、りんどう科植物、きょうちくとう科植物、ががいも科植物、はなしのぶ科植物、むらさき科植物、くまつづら科植物、しそ科植物、なす科植物（トマト等）、ごまのはぐさ科植物、のうぜんかずら科植物、ごま科植物、はまうつぼ科植物、いわたばこ科植物、たぬきも科植物、きつねのまご科植物、はまじんちょう科植物、はえどくそう科植物、おおばこ科植物、あかね科植物、すいかずら科植物、れんぷくそう科植物、おみなえし科植物、まつむしそう科植物、うり科植物、ききょう科植物、きく科植物等を例示できる。
【００２７】
〔本発明に係るキットの構成：ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を備える形態〕
本発明に係るキットが備えるｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子としては、上述のｐｐＧａｌＮＡｃＴとしての活性を有するポリペプチドをコードするものである限り、特に限定されない。例えば、ヒト等の哺乳類動物、鳥類、爬虫類等の様々な生物に由来するｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子が、本発明に係るキットに包含され得る。より具体的には、ＧａｌＮＡｃ‐Ｔ２（例えばGenBankアクセッション番号ＮＭ＿００４４８１）、ＧａｌＮＡｃ‐Ｔ１（例えばGenBankアクセッション番号ＮＭ＿０２０４７４）が例示される。
【００２８】
また、本発明に係るキットが包含し得るポリヌクレオチドとしては、上述した具体例のポリヌクレオチドの相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行なうことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしにくくなる）。
【００２９】
ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、上述した哺乳類動物等から単離することができる。例えば、既知のｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いて、上述の哺乳類動物等のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうこと等によりｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を得ることができる。また、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００３０】
本発明に係るキットは、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を発現させるための発現ベクターを備えるものであってもよい。ｐｐＧａｌＮＡｃＴの発現ベクターとしては、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子とプロモーターとを含めば特に限定されるものではない。
【００３１】
発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、本発明に係るキットを用いて、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を備えるベクターを、アグロバクテリウム法により植物体に導入する場合、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００３２】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター又はアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【００３３】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【００３４】
上記発現ベクターは、上記プロモーター及びｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選択マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記発現ベクターは、さらにＴ‐ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ‐ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００３５】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることができる。上記発現ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【００３６】
上記選択マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００３７】
上記翻訳効率を高めるためのポリヌクレオチドとしては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記転写因子をコードする遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【００３８】
発現ベクターを構築する具体的な方法としては、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター及びｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入する方法が例示される。また、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【００３９】
発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【００４０】
また、上記発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【００４１】
なお、本発明に係るキットは、上述した発現ベクターの母体となるベクター、プロモーター、選択マーカー、翻訳効率を高めるためのポリヌクレオチド、ターミネーターを、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子とは別の容器に包含させた上で、備えていてもよい。
【００４２】
〔本発明に係るキットの構成：ｐｐＧａｌＮＡｃＴを備える形態〕
本発明に係るキットが備えるｐｐＧａｌＮＡｃＴとしては、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ活性を有するポリペプチドであれば限定されない。なお、本明細書において、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」又は「タンパク質」と交換可能に使用される。
【００４３】
例えば、本発明に係るキットが備えるｐｐＧａｌＮＡｃＴとしては、上述のｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子によりコードされるものであってもよい。
【００４４】
また、天然の精製産物、化学合成手順の産物、及び原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。また、組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、ミリスチル化され得るか、又は非ミリスチル化され得る。さらに、本発明にかかるポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００４５】
また、本発明に係るキットが備えるｐｐＧａｌＮＡｃＴは、従来公知のタンパク質保存用試薬に予め溶解されていてもよい。
【００４６】
〔その他の構成〕
本発明に係るキットは、本発明の効果を損なわない範囲で様々な他の試薬等を備えていてもよい。Ｏ型糖鎖はＮ‐アセチルガラクトサミンを基本骨格として、ガラクトース、Ｎ‐アセチルグルコサミン、シアル酸等の他の糖及び／又は酸により構成される。そこで、本発明に係るキットは、Ｏ型糖鎖を構成する糖及び／又は酸の転移酵素を含んでいてもよい。このような転移酵素としては、ガラクトース転移酵素、ST6GALNAC1（alpha-N-acetyl-neuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3）-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1（GenBankアクセッション番号 ＮＣ＿００００１７）、core 1 synthase, glycoprotein-N-acetylgalactosamine 3-beta-galactosyltransferase, 1（GenBankアクセッション番号 ＮＣ＿０００００７）、UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 6 （core3 synthase）（GenBankアクセッション番号 ＮＣ＿００００１１）、ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 1（GenBankアクセッション番号 ＮＭ＿００３０３３）等が好ましく例示できる。また、例えば、Varki, Ajit; Cummings, Richard; Esko, Jeffrey; Freeze, Hudson; Hart, Gerald; Marth, Jamey., Essentials of Glycobiology., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, のChapter 8、Fig. 8-3, 8-4, 8-5, 8-6に記載されているＯ型糖鎖結合タンパク質の合成工程における各工程を触媒する酵素を備えていてもよい。
【００４７】
なお、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ以外の酵素であって、Ｏ型糖鎖を構成する糖又は酸の転移酵素を、説明の便宜のため「更なる転移酵素」と表記する。本発明に係るキットが更なる転移酵素を備えることで、任意のＯ型糖鎖を、標的タンパク質に結合させることができる。
【００４８】
本発明に係るキットは、上記更なる転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。また、これらのポリヌクレオチドの相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、それぞれの酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド等を包含してもよい。
【００４９】
上記更なる転移酵素をコードするポリヌクレオチドを取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの哺乳類動物、鳥類、爬虫類等から単離することができる。例えば、既知のガラクトース転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、上述の哺乳類動物等のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうこと等によりポリヌクレオチドを得ることができる。また、更なる転移酵素をコードするポリヌクレオチドは、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００５０】
これらのポリヌクレオチドについては、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子とは容器を分けて、別の容器に入れて提供してもよい。
【００５１】
また、本発明に係るキットが上記更なる転移酵素のポリヌクレオチドを備える場合、当該ポリヌクレオチドを備える発現ベクターの形態であってもよい。この発現ベクターについては、上述したｐｐＧａｌＮＡｃＴの発現ベクターの説明に準じる。
【００５２】
なお、本発明に係るキットにおいて、更なる転移酵素をコードするポリヌクレオチドは、上述のｐｐＧａｌＮＡｃＴの発現ベクターに導入されていてもよく、ｐｐＧａｌＮＡｃＴの発現ベクター及び更なる転移酵素の発現ベクターを別々の発現ベクターとしてもよい。
【００５３】
また、本発明に係るキットは標的タンパク質及び／又は標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、「標的タンパク質遺伝子」という。）を備えている形態であってもよい。標的タンパク質遺伝子は、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子とは別々の発現ベクターに導入されていてもよく、一つの発現ベクターに両方の遺伝子が導入されていてもよい。この形態は、標的タンパク質として植物が有していないものを採用する場合において有効である。当該形態に係るキットによれば、当該キットの利用者は標的タンパク質及び／又は標的タンパク質遺伝子を別途調整する必要がなく、より簡便にＯ型糖鎖結合タンパク質を製造することができるからである。
【００５４】
また、本発明に係るキットが包含し得る他の試薬等としては、ここまで説明したものに限定されるものではない。例えば、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ、上記更なる転移酵素、標的タンパク質、これらをコードするポリヌクレオチドを安定的に保持するための試薬、バッファー等を含んでもよいし、当該ポリヌクレオチドをベクターに導入するための制限酵素、リガーゼ等の試薬を含んでもよい。また、植物細胞、植物からの抽出物を含んでもよいし、当該ポリヌクレオチドを植物細胞に導入するための試薬を含んでもよい。また、本発明に係るキットは、複数の異なる試薬を、適切な容量及び／又は形態で混合していてもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。
【００５５】
なお、本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュ等）を備えた包装が意図される。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備える」は、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ及び／又はｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子が、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。このときｐｐＧａｌＮＡｃＴ及び／又はｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子は、特に限定されないが、従来公知の緩衝液等の保存液に溶解された状態であってもよいし、精製された状態であってもよい。また、本発明に係るキットは、上述のｐｐＧａｌＮＡｃＴ、上記更なる転移酵素、標的タンパク質、これらをコードするポリヌクレド、その他の試薬等を同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。
【００５６】
また、本発明に係るキットには、植物においてＯ型結合タンパク質を製造するための手順等を記載した指示書を含んでもよい。紙又はその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能なディスク又はＣＤ−ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよい。
【００５７】
〔本発明に係るキットの使用方法〕
本発明に係るキットの使用方法の例を以下に説明するが、これに限定されるものではなく、植物においてＯ型糖鎖結合タンパクを製造可能なように使用すればよい。
【００５８】
本発明に係るキットがｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を備えている場合、当該ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を、植物又は植物からの抽出物等の中で発現させてもよい。ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を発現させる方法としては、特に限定されず、上述の発現ベクターを用いる等、従来公知の植物内での遺伝子発現方法を用いてもよい。
【００５９】
また、標的タンパク質については、セリン残基及び／又はスレオニン残基が含まれていればよい。例えば、標的タンパク質としては、植物が有しているポリペプチド（以下、「内在タンパク質」という。）でもよく、植物以外の生物が有しているポリペプチド（以下、「外来タンパク質」という。）でもよい。
【００６０】
内在タンパク質としては、例えば、グルテリン（Glutelin、例えばコメ由来のものなど）（Kishimoto T, Watanabe M, Mitsui T, Hori H.Glutelin basic subunits have a mammalian mucin-type O-linked disaccharide side chain.Arch Biochem Biophys. 1999 Oct 15;370（2）:271-277）等を挙げることができる。
【００６１】
外来タンパク質としては、例えば、エリスロポエチン、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ（例えばOtvos,L. Jr., Krivuika. et al., Biochim. Biophys. Acta., 1995, 1267, 55-64を参照）、ムチン（例えばShogren, R., et al., Biochemistry, 1989, 28, 5525-5536を参照）、ＨＳＰ−１、ＨＳＰ−２（熱ショックタンパク質、例えばCalvete, J. J., et al., Biochem. J., 1995, 310, 615-622を参照）、Ｔ１ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ ＡＮ（例えばPieper, J., et al., Nat. Struct. Biol., 1996, 3, 228-232を参照）、ＤＡＦ（崩壊促進因子、例えば、Coyne, K. E., et al., J. Immunol., 1992, 149, 2906-2913を参照）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子、例えばOh-eda, M., et al., J. Biol. Chem., 1990, 265, 11432-11435を参照）、ＰＳＧＬ−１（Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄ−１、例えばMaly, P., et al., Cell, 1996, 86, 643-653を参照）、ＺＰ−３（卵膜蛋白（ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）、例えば、Yurewicz, E. C., et al., Mol. Reprod. Dev., 1992, 33, 182を参照）、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）−ｇｒｏｏｖｅ（例えば、Haurum, J.S., et al., J. Exp. Med., 1994, 180, 739-744、Haurum, J.S., et al., Eur. J. Immunol., 1995, 25, 3270-3276を参照）、ＩｎｔｅｒＬｅｕｋｉｎ−５（例えば、Kodama, S., et al., Eur. J. Biochem., 1993, 211, 903-908を参照）、Ｌａｃｔａｓｅ−ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（例えば、Naim, H. Y., and Lentze, M. J., J. Biol. Chem., 1992, 267, 25494-25504）、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ Ａ（例えば、Remaley, A. T., J. Biol. Chem., 1991, 266, 24176-24183を参照）、ＧＦ−ＩＩ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＩＩ、例えば、Daughaday, W.H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1993, 90, 5823-5827を参照）。
【００６２】
内在タンパク質にＮ‐アセチルガラクトサミンを結合させる場合、植物細胞又は抽出物内にｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を導入して、内在タンパク質をコードするポリヌクレオチドと共に発現させてもよく、植物の抽出物にｐｐＧａｌＮＡｃＴを混合してもよい。
【００６３】
外来ポリペプチドにＮ‐アセチルガラクトサミンを結合させる場合、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を発現させる植物細胞又は抽出物内に、当該外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを併せて導入してこれを発現させてもよく、抽出物内にｐｐＧａｌＮＡｃＴ及び当該外来タンパク質を混合してもよい。
【００６４】
植物に対するｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子及び標的タンパク質遺伝子の導入方法としては特に限定されるものではなく、従来公知の植物の形質転換方法を用いてもよい。例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法等が用いられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、上述の発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著，植物遺伝子操作マニュアル，１９９０，２７‐３１ｐｐ，講談社サイエンティフィック，東京）などにしたがって無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。
【００６５】
ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子及び標的タンパク質遺伝子は、別々の発現ベクターに導入されていてもよく、一つの発現ベクターに両方の遺伝子が導入されていてもよい。
【００６６】
ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子及び標的タンパク質遺伝子を、別々の発現ベクターに導入した場合、それぞれの発現ベクターを用いた形質転換は、一度に行なってもよく、二段階で行なってもよい。「二段階で形質転換を行なう」とは、いずれか一方の発現ベクターを導入して、当該発現ベクターの導入が確認された形質転換植物に対して、他方の発現ベクターを導入することをいう。このように二段階で形質転換を行なうことで、最初に導入した方の発現ベクターを最も安定して高発現する植物を予め選抜することができる。ここで選抜された植物に他方の発現ベクターを導入すれば、両者の発現ベクターがそれぞれ安定して高発現する植物を高確率に取得することが可能となる。それゆえ、Ｏ型結合タンパク質を高生産することができる植物を少ない労力と時間で取得することができ、その結果、効率よく、かつ、安価、安全に有用タンパク質を大量生産することが可能になる。
【００６７】
また、本発明に係るキットがｐｐＧａｌＮＡｃＴを備える形態である場合、その使用方法としては、特に限定されるものではないが、例えば植物の抽出物にｐｐＧａｌＮＡｃＴを混合してもよい。
【００６８】
植物の抽出物としては、植物から抽出したものである限り、特に限定されるものではなく、例えば従来公知の溶媒を用いて抽出したものであってもよいし、植物をすり潰して濾過したり、搾り取ったりして得たものでもよい。
【００６９】
＜２．本発明に係る植物＞
本発明に係る植物は、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子、及びＮ‐アセチルガラクトサミンを結合させる対象のポリペプチド（標的タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（標的タンパク質遺伝子）を備えていればよい。
【００７０】
例えば、植物の染色体、ミトコンドリア等に存在するゲノム中に、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子及び標的タンパク質遺伝子が導入されていてもよい。
【００７１】
植物に対する遺伝子の導入方法、遺伝子を導入する植物の形態、種類等については、本発明に係るキットについて説明した事項に準じればよい。なお、標的タンパク質として植物が有しているものを採用する場合、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子のみを植物に導入してもよいし、標的タンパク質をさらに高発現させるため、両方の遺伝子を植物に導入してもよい。
【００７２】
＜３．組成物＞
本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するための組成物（以下、「本発明に係る組成物」という。）は、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素（ｐｐＧａｌＮＡｃＴ）、及びそれをコードするポリヌクレオチド（ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子）のうちの少なくとも一つを含めばよい。
【００７３】
本発明に係る組成物において、ｐｐＧａｌＮＡｃＴを包含する場合、その濃度としては特に限定されない。この場合、従来公知のタンパク質用緩衝液にｐｐＧａｌＮＡｃＴを溶解したものであってもよい。このような緩衝液としては、ｐｐＧａｌＮＡｃＴを保存可能であれば限定されないが、例えば、次の文献にて、酵素活性を測定する際に用いられている緩衝液を使用することができる。Wandall HH, et al., J Biol Chem., 1997 Sep 19;272(38):23503-23514、Zhang Y, et al., J Biol Chem., 2003, Jan 3;278(1):573-584、Bennett EP, et al, J Biol Chem., 1998, Nov 13;273(46):30472-30481。また、例えば、Iwasaki H, et al., J Biol Chem., 2003, Feb 21;278(8):5613-5621には、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）， ５ｍＭ ＭｎＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の混合液を、保存用の緩衝液として使用できる。また、これらの緩衝液にはグリセロール等の酵素安定化剤を包含させてもよい。
【００７４】
また、本発明に係る組成物において、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を包含する場合、その濃度としては特に限定されない。また、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子は、従来公知の核酸保存用の緩衝液に溶解されていればよい。
【００７５】
本発明に係る組成物は、上述した更なる転移酵素及び／又はこれをコードするポリヌクレオチド、標的タンパク質及び／又は標的タンパク質遺伝子を含んでいてもよい。
【００７６】
＜４．本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法１＞
本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法としては、植物内又は植物の抽出物内で、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を合成する合成工程を含んでいてもよい。
【００７７】
上記合成工程の具体的な方法としては、植物内又は植物の抽出物内でｐｐＧａｌＮＡｃＴを合成させることが可能であれば、特に限定されない。
【００７８】
例えば植物内でｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を発現させてもよい。この場合、上記合成工程は、植物細胞内にｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を導入する導入工程を行ない、次に、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子が導入された植物細胞を培養する培養工程を行なう工程であってもよい。
【００７９】
上記導入工程としては、植物細胞内にｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を導入する工程である限り限定されない。例えば、上述した従来公知の植物の形質転換方法を用いてもよい。
【００８０】
上記培養工程では、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子が導入された植物細胞を、培養細胞の状態で維持してもよいし、葉、根、茎等の組織に分化させてもよいし、完全な植物体に再生してもよい。また、植物の抽出物内でｐｐＧａｌＮＡｃＴを合成させてもよい。例えば、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を植物抽出物内に混合した上で、無細胞発現系によりｐｐＧａｌＮＡｃＴを発現させてもよい。
【００８１】
上記合成工程の後は、植物内又は植物の抽出物からＯ型糖鎖結合タンパク質を精製してもよい。Ｏ型糖鎖結合タンパク質の精製については、従来公知のＮ型糖鎖タンパク質の精製方法を適用してもよい。例えば、Ｏ型糖鎖結合タンパク質を特異的に認識するレクチンを用いてもよい。
【００８２】
＜５．本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法２＞
本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法としては、植物の抽出物に、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を混合する混合工程を含んでいてもよい。
【００８３】
上記混合工程の具体的な方法としては、植物の抽出物にｐｐＧａｌＮＡｃＴを混合する限り、特に限定されない。例えば、単に植物の抽出物にｐｐＧａｌＮＡｃＴを滴下するだけでもよく、攪拌してもよい。植物の抽出物中に含まれるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを基質としてＯ型糖鎖が生成される。また、植物の抽出物中にＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが含まれない場合は別途添加すればよいし、含まれる場合であっても、さらに添加してもよい。
【００８４】
上記混合工程の後は、植物の抽出物からＯ型糖鎖結合タンパク質を精製すればよい。Ｏ型糖鎖結合タンパク質の精製については、従来公知の型糖鎖結合タンパク質の精製方法を用いて行なえばよい。
【００８５】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００８６】
＜実施例１．形質転換植物細胞の作出＞
ヒト組織から、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子及びガラクトース転移酵素遺伝子をクローニングした。
【００８７】
ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子については、次の方法で得た。肝臓由来ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型（ORIGENE TECHNOLOGIES INC. Multiple Choice(TM) Human cDNA）とし、プライマーＵ１−Ｆ（5'-GGCGGATCCAAGGAGATATAACAATGAGAAAATTTGCATACTGCAAGGTGGTC-3'）（配列番号１）およびＵ１−Ｒ（5'-GGCGAGCTCTCAGAATATTTCTGGCAGGGTGACGTTTCG-3'）（配列番号２）を用いたＰＣＲで増幅することで、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。これをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断後、ＴｉプラスミドｐＢＩ１２１のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに導入し、プラスミドｐＢＩ‐ＧａｌＮＡｃ‐Ｔ１を構築した。
【００８８】
ガラクトース転移酵素遺伝子について、次の方法で得た。肝臓由来ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型（ORIGENE TECHNOLOGIES INC. Multiple Choice(TM) Human cDNA）を鋳型とし、プライマーＧＴ−Ｆ（5'-GGCGGATCCAAGGAGATATAACAATGGCCTCTAAATCCTGGCTGAATTTTTTA-3'）（配列番号３）およびＧＴ−Ｒ（5'-GGCGAGCTCTCAAGGATTTCCTAACTTCACTTTTGTATC-3'）（配列番号４）を用いたＰＣＲで増幅することにより、ガラクトース転移酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。これをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断後、ｐＢＩ１２１のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに導入し、プラスミドｐＢＩ―Ｃ１ＧＡＬＴ１を構築した。
【００８９】
次に、それぞれのベクターを共にタバコＢＹ２培養細胞にアグロバクテリウム法によりｃｏ‐ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ形質転換した。得られた形質転換細胞から、ｍＲＮＡを調製して、Ｎ‐アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子及びガラクトース転移酵素遺伝子の発現をノーザン分析により確認した。そして、両方の転移酵素遺伝子を共に発現する形質転換細胞を選抜した。なお、この実験に供した植物細胞３００個のうち、両方の転移酵素遺伝子を共に発現する形質転換細胞は２個であった。このうち、ｍＲＮＡ量の高かった形質転換細胞（以下、「ＴＸ１３株」という。）をさらに選抜して、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ‐Ｓｋｏｏｇ培地を用いて懸濁培養した。
【００９０】
＜実施例２．Ｏ型糖鎖結合タンパク質の確認＞
実施例１にて懸濁培養したＴＸ１３株を、１．５ｍｌの１７５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させた。得られた懸濁液中の細胞を乳鉢及び乳棒を用いてホモジナイズした後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）に供した。次に上澄み（細胞抽出液）を回収した。同様にして、非形質転換ＢＹ２細胞（以下、「ＢＹ２野生株」という。）から細胞抽出液を調製した。
【００９１】
次に、ＴＸ１３株及びＢＹ２野生株から得た細胞抽出液を、それぞれレクチンカラムに通じさせ、糖タンパク質をレクチンに吸着させた。非吸着画分については廃棄した。なお、レクチンカラムとしては、ジャッカリン（Ｊａｃａｌｉｎ）レクチン０．５ｍｌを、Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社製カラム（品番７３７−１００６ 内径１ｃｍ 長さ５ｃｍ）に充填したものを用いた。ジャッカリンは、Ｇａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ構造を認識する。
【００９２】
次に、２０ｍｌの１７５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）でレクチンカラムを洗浄して、溶出液を回収した。さらに、１０ｍＭのメチルガラクトピラノシドを含む１７５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）により、吸着したタンパク質を溶出して、１ｍｌ（フラクション１）、１ｍｌ（フラクション２）、１ｍｌ（フラクション３）、１ｍｌ（フラクション４）、６ｍｌ（フラクション５）として回収した。
【００９３】
次に、各細胞抽出液に由来するフラクション１〜３を、１２．５％ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。結果を図１に示す。図１は、本実施例における電気泳動の結果を示す図であり、図１の（ａ）はＴＸ１３株の細胞抽出液を用いた結果を示し、（ｂ）はＢＹ２野生株の細胞抽出を用いた結果を示す。また、図１の（ａ）及び（ｂ）において各レーンの上に示す番号はフラクションの番号を示しており、「２＆３」はフラクション２及び３の混合物を電気泳動に供したことを示している。
【００９４】
図１の（ａ）の三角印にて示すように、ＴＸ１３株の細胞抽出液では、ＢＹ２野生株の細胞抽出からは確認されなかったレクチン結合性タンパク質が確認された。
【００９５】
次に、各細胞抽出液に由来するフラクション１及び２を超純水に対して透析した後、凍結乾燥した。得られた生成物を０．２Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した後、α‐Ｎ‐アセチルガラクトサミニダーゼ（生化学工業社製）を加えて、３日間３７℃に保温した。なお、本明細書の実施例において「超純水」とは、Ｍｉｌｌｉ‐Ｑシステム（ミリポア社製）を用いて精製した水である。
【００９６】
次に、保温後の溶液をＣａｒｂｏｇｒａｐｈ（ＧＬ‐Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて精製した。まず、当該溶液をＣａｒｂｏｇｒａｐｈに通し、次に５ｍｌの５０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）で洗浄し、６０％アセトニトリルを含有する５０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）で糖鎖を溶出した。次に、得られた溶液を凍結乾燥した。
【００９７】
凍結乾燥後の試料にＰＡ化試薬（２‐アミノピリジン（Ｗａｋｏ社製）５５２ｍｇに対して２００μｌの酢酸（Ｗａｋｏ社製）を混合したもの）を適量加えて、９０℃で１時間インキュベートした。次に、試料を室温で冷却した後、等量の還元試薬（ジメチルアミノボラン（Ｗａｋｏ社製）３９ｍｇに対して２００μｌの酢酸を混合したもの）を加えて、８０℃で４０分間インキュベートした。次に、反応停止のために等量の蒸留水を加えた。
【００９８】
得られた溶液に、超純水飽和のフェノール溶液：クロロホルム溶液（１：１）を等量加えて、未反応のＰＡ化試薬を抽出した。この抽出の操作を再度繰り返した。次に、クロロホルム溶液を混合して、得られた水層部分を抽出した。
【００９９】
次に、抽出液を、常温で真空下に静置することで１０分の１の液量まで濃縮して、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による解析に供した。
【０１００】
また、コントロールとして、市販のＧａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ（Ｔｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）に対しても同様の操作を行ない、ＨＰＬＣに供した。即ち、Ｇａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ １ｍｇに対して上記ＰＡ化試薬を適量加えて、９０℃で１時間インキュベートした。
【０１０１】
次に、試料を室温で冷却した後、等量の上記還元試薬を加えて、８０℃で４０分間インキュベートした。次に、反応停止のために等量の蒸留水を加えた。その後、超純水飽和のフェノール溶液：クロロホルム溶液（１：１）を等量加えて、未反応のＰＡ化試薬を抽出した。この抽出の操作を再度繰り返した後、クロロホルム溶液を混合して、得られた水層部分を抽出した。この抽出液を常温で真空下に静置することで１０分の１の液量まで濃縮して、ＨＰＬＣに供した。
【０１０２】
ＨＰＬＣによる解析については、次のようにして行なった。試料に対して、アセトニトリルが全量の８０％となるように加えて、ＨＰＬＣ（ＳＦ‐ＨＰＬＣ）に供した。ＨＰＬＣのカラムとしては、アミドカラム（Ｓｈｏｗａ ｄｅｎｋｏ社製、型名：Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ‐５０；４．６×２５０ｎｍ）を用いた。ＨＰＬＣの装置としてはＨＩＴＡＣＨＩ ＦＬ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｌ‐７４８０を備えるＨＩＴＡＣＨＩ ＨＰＬＣシステムを用いた。展開溶媒及びグラジェント等の詳細な条件は次の通りである。
展開溶媒：８０％アセトニトリル
グラジェント：アイソクラチック
流速：０．７ｍｌ／分
検出：蛍光（Ｅｘ；３１０ｎｍ、Ｅｍ；３８０ｎｍ）
カラム温度：３０℃
結果を図２に示す。図２は、本実施例におけるＨＰＬＣの結果を示す図である。
【０１０３】
図２に示すように、ＴＸ１３株の細胞抽出液を用いた結果、コントロールに由来するＧａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ‐ＰＡと同じ位置にピークを検出した。このピークの溶出画分を分離精製した。このことから、ＴＸ１３株の細胞抽出液にＮ‐アセチルガラクトサミンで修飾されたタンパク質が含まれていることが確認できた。
【０１０４】
次に、精製して得られたタンパク質（ＰＡ化糖鎖、上記フラクション２）の分子量をＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ‐ＭＳにより測定した。装置としてａｕｔｏｆｌｅｘ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）を用いた。レーザー強度を１８００〜２０００ｍｂａｒとし、３．０×ｅ−７以下の真空下でデータを得た。マトリックス試薬としては、蒸留水：アセトニトリルを１：１で混合した溶液に、１０ｍｇの２，５‐ジヒドロキシ安息香酸（Ｓｉｇｍａ社製）を混合した溶液を用いた。また、ＰＡ化糖鎖を溶解した蒸留水に、等量のマトリックス試薬を混合して、この内２μｌをターゲットに置き、室温で乾燥させることで結晶化させた後、Ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ ｍｏｄｅ分析を行なった。
【０１０５】
結果を図３に示す。図３は本実施例のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ‐ＭＳの結果を示す図であり、図３の（ａ）はＴＸ１３細胞由来のＰＡ化糖鎖の分子量を測定した結果を示し、図３の（ｂ）はコントロールに由来するＧａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ‐ＰＡの分子量を測定した結果を示す。
【０１０６】
図３の（ａ）及び（ｂ）に示すように、ＴＸ１３細胞由来のＰＡ化糖鎖の分子量（ｍ／ｚ ｆｏｒ ［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４８２）は、コントロール由来のＧａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ‐ＰＡの分子量と同じであり、また構造から推測される分子量（４８３．５）とほぼ一致した。
【０１０７】
以上の結果から、植物細胞に導入したＮ‐アセチルガラクトサミン転移遺伝子及びガラクトース転移遺伝子が機能し、植物タンパク質にＯ型糖鎖を結合できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明に係るキットを用いれば、植物においてＯ型糖鎖をタンパク質に結合させることが可能となるので、有用タンパク質を植物で生産することができる。よって、本発明は、植物の工業的利用用途の拡大に寄与すると共に、医薬品産業、食品産業等の幅広い産業において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】実施例２における電気泳動の結果を示す図であり、（ａ）はＴＸ１３株の細胞抽出液を用いた結果を示し、（ｂ）はＢＹ２野生株の細胞抽出を用いた結果を示す。
【図２】実施例２におけるＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図３】実施例２におけるＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ‐ＭＳの結果を示す図であり、（ａ）はＴＸ１３細胞由来のＰＡ化糖鎖の分子量を測定した結果を示し、（ｂ）はコントロールに由来するＧａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ‐ＰＡの分子量を測定した結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキット及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞内で発現するタンパク質のほとんどは、何らかの翻訳後修飾を受けている。
【０００３】
中でもＮ型糖鎖による修飾については、生理学的・生物学的に重要な役割を果たすことが明らかにされている。例えば、植物では、Ｎ型糖鎖による修飾が環境ストレス耐性に関与することが報告されている。また、例えば特許文献１には、植物細胞を用いてヒト型のＮ型糖鎖結合タンパク質を製造する方法が開示されている。
【０００４】
一方、Ｏ型糖鎖による修飾については、哺乳類、酵母等において、その関連酵素遺伝子等が明らかにされている。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ／２０００／０３４４９０号パンフレット（２０００年６月１５日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、医薬品等に利用可能な有用タンパク質を植物で製造することには様々な利点がある。例えば、植物に対する遺伝子操作は比較的容易であること、培養の際、動物病原の汚染を回避できること等の利点が挙げられる。
【０００６】
しかしながら、植物はＯ型糖鎖の修飾機構を有していない。そのため、Ｏ型糖鎖による修飾が機能等に大きな役割を与えるタンパク質の製造には、植物を利用することができなかった。
【０００７】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物を用いて、Ｏ型糖鎖修飾された有用タンパク質を製造するための、キット及びこれを利用した技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を行なった。
【０００９】
タンパク質のＯ型糖鎖修飾が、哺乳類動物等のみならず、仮に植物にとっても重要なものであれば、植物がＯ型糖鎖修飾機構を有してしかるべきである。ところが、植物はこれを有していない。このことから、植物においては、タンパク質にＯ型糖鎖は結合しないということが当然のように推測できた。また、Ｏ型糖鎖修飾機構を有さない植物にＯ型糖鎖修飾に関連する遺伝子を導入しても、当然に、当該遺伝子が正常に機能しないであろうと予想された。
【００１０】
しかし、本発明者らは、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするポリヌクレオチドを植物に導入して発現させると、Ｏ型糖鎖により修飾されたタンパク質を得ることができることを見出し、本発明に想到するに至った。
【００１１】
このように、本発明は、従来の予想に反した全く新たな知見に基づいてなされたものであり、以下の発明を包含する。
【００１２】
即ち、本発明に係る植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキットは、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを備えていることを特徴としている。
【００１３】
さらに、本発明に係るキットは、ガラクトース転移酵素及びその酵素をコードするポリヌクレオチドのうちの、少なくとも一つをさらに備えていることがより好ましい。
【００１４】
また、本発明に係る植物は、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするポリヌクレオチド、及びＮ‐アセチルガラクトサミンを結合させる対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００１５】
また、本発明に係る植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するための組成物は、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを含むことを特徴としている。
【００１６】
また、本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法は、植物内又は植物の抽出物内で、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を合成する合成工程を含んでいてもよい。
【００１７】
また、本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法は、植物の抽出物に、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を混合する混合工程を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキットは、以上のように、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを備えているので、植物を用いて、Ｏ型糖鎖修飾された有用タンパク質を製造できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
＜１．本発明に係る植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキット＞
本発明に係る植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキット（以下、「本発明に係るキット」という。）は、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一方を備えていればよい。本発明に係るキットによれば、植物を用いてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造することができる。
【００２０】
本発明に係るキットは、Ｎ‐アセチルガラクトサミンを結合させる対象のタンパク質（Ｏ型糖鎖を結合させる対象のタンパク質ということもできる。以下、「標的タンパク質」という。）として、植物が有していないタンパク質を採用する場合、特に有利な効果を発揮する。例えば、Ｏ型糖鎖の結合がその機能に重大な影響を与えるタンパク質を製造する場合、従来、動物細胞を利用する必要があったが、本発明に係るキットを用いれば、植物にＯ型糖鎖結合タンパク質を製造させることができるので、培養の際、動物病原の汚染を回避できる等の点において有利である。
【００２１】
本明細書において「Ｏ型糖鎖」とは、タンパク質のセリン残基及び／又はスレオニン残基に結合している糖鎖を意味する。また、「Ｏ型糖鎖結合タンパク質」とは、Ｏ型糖鎖が結合したタンパク質を意味する。なお、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」と記載したとき、「Ａ」、「Ｂ」、又は「Ａ及びＢ」を意味する。
【００２２】
本明細書における「植物」には様々な形態の植物が包含される。例えば、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）、種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞等の培養細胞）、プロトプラスト、カルス等が挙げられる。
【００２３】
また、本明細書において「植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造する」とは、植物を用いてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造すること意味する。ここで用いる植物の種類、形態としては、特に限定されず、植物から得た抽出物であってもよい。つまり、植物の抽出物を用いてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造することも「植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造する」の範疇である。
【００２４】
また、本明細書において「ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素」とは、タンパク質中のセリン残基及び／又はスレオニン残基に、Ｎ‐アセチルガラクトサミンを結合させる活性を有する酵素を意味する。以下、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を「ｐｐＧａｌＮＡｃＴ」と表記し、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするポリヌクレオチドを「ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子」と表記し、タンパク質中のセリン残基及び／又はスレオニン残基に、Ｎ‐アセチルガラクトサミンを結合させる活性を「ｐｐＧａｌＮＡｃＴ活性」と表記する。
【００２５】
本発明に係るキットにおいて利用できる植物の種類としては、特に限定されない。例えば、種々の単子葉植物、双子葉植物、樹木等の植物全般に適用することができる。例えば、単子葉植物としては、例えばウキクサ属植物（ウキクサ）及びアオウキクサ属植物（アオウキクサ，ヒンジモ）が含まれるうきくさ科植物；カトレア属植物、シンビジウム属植物、デンドロビューム属植物、ファレノプシス属植物、バンダ属植物、パフィオペディラム属植物、オンシジウム属植物等が含まれる、らん科植物；がま科植物、みくり科植物、ひるむしろ科植物、いばらも科植物、ほろむいそう科植物、おもだか科植物、とちかがみ科植物、ほんごうそう科植物、いね科植物、かやつりぐさ科植物、やし科植物、さといも科植物、ほしぐさ科植物、つゆくさ科植物、みずあおい科植物、いぐさ科植物、びゃくぶ科植物、ゆり科植物、ひがんばな科植物、やまのいも科植物、あやめ科植物、ばしょう科植物、しょうが科植物、かんな科植物、ひなのしゃくじょう科植物等を例示することができる。
【００２６】
また、双子葉植物としては、例えばアサガオ属植物（アサガオ）、ヒルガオ属植物（ヒルガオ，コヒルガオ，ハマヒルガオ）、サツマイモ属植物（グンバイヒルガオ、サツマイモ）、ネナシカズラ属植物（ネナシカズラ、マメダオシ）が含まれるひるがお科植物；ナデシコ属植物（カーネーション等）、ハコベ属植物、タカネツメクサ属植物、ミミナグサ属植物、ツメクサ属植物、ノミノツヅリ属植物、オオヤマフスマ属植物、ワチガイソウ属植物、ハマハコベ属植物、オオツメクサ属植物、シオツメクサ属植物、マンテマ属植物、センノウ属植物、フシグロ属植物、ナンバンハコベ属植物が含まれるなでしこ科植物；もくまもう科植物、どくだみ科植物、こしょう科植物、せんりょう科植物、やなぎ科植物、やまもも科植物、くるみ科植物、かばのき科植物、ぶな科植物、にれ科植物、くわ科植物、いらくさ科植物、かわごけそう科植物、やまもがし科植物、ぼろぼろのき科植物、びゃくだん科植物、やどりぎ科植物、うまのすずくさ科植物、やっこそう科植物、つちとりもち科植物、たで科植物、あかざ科植物、ひゆ科植物、おしろいばな科植物、やまとぐさ科植物、やまごぼう科植物、つるな科植物、すべりひゆ科植物、もくれん科植物、やまぐるま科植物、かつら科植物、すいれん科植物、まつも科植物、きんぽうげ科植物、あけび科植物、めぎ科植物、つづらふじ科植物、ろうばい科植物、くすのき科植物、けし科植物、ふうちょうそう科植物、あぶらな科植物、もうせんごけ科植物、うつぼかずら科植物、べんけいそう科植物、ゆきのした科植物、とべら科植物、まんさく科植物、すずかけのき科植物、ばら科植物、まめ科植物、かたばみ科植物、ふうろそう科植物、あま科植物、はまびし科植物、みかん科植物、にがき科植物、せんだん科植物、ひめはぎ科植物、とうだいぐさ科植物、あわごけ科植物、つげ科植物、がんこうらん科植物、どくうつぎ科植物、うるし科植物、もちのき科植物、にしきぎ科植物、みつばうつぎ科植物、くろたきかずら科植物、かえで科植物、とちのき科植物、むくろじ科植物、あわぶき科植物、つりふねそう科植物、くろうめもどき科植物、ぶどう科植物、ほるとのき科植物、しなのき科植物、あおい科植物、あおぎり科植物、さるなし科植物、つばき科植物、おとぎりそう科植物、みぞはこべ科植物、ぎょりゅう科植物、すみれ科植物、いいぎり科植物、きぶし科植物、とけいそう科植物、しゅうかいどう科植物、さぼてん科植物、じんちょうげ科植物、ぐみ科植物、みそはぎ科植物、ざくろ科植物、ひるぎ科植物、うりのき科植物、のぼたん科植物、ひし科植物、あかばな科植物、ありのとうぐさ科植物、すぎなも科植物、うこぎ科植物、せり科植物、みずき科植物、いわうめ科植物、りょうぶ科植物、いちやくそう科植物、つつじ科植物、やぶこうじ科植物、さくらそう科植物、いそまつ科植物、かきのき科植物、はいのき科植物、えごのき科植物、もくせい科植物、ふじうつぎ科植物、りんどう科植物、きょうちくとう科植物、ががいも科植物、はなしのぶ科植物、むらさき科植物、くまつづら科植物、しそ科植物、なす科植物（トマト等）、ごまのはぐさ科植物、のうぜんかずら科植物、ごま科植物、はまうつぼ科植物、いわたばこ科植物、たぬきも科植物、きつねのまご科植物、はまじんちょう科植物、はえどくそう科植物、おおばこ科植物、あかね科植物、すいかずら科植物、れんぷくそう科植物、おみなえし科植物、まつむしそう科植物、うり科植物、ききょう科植物、きく科植物等を例示できる。
【００２７】
〔本発明に係るキットの構成：ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を備える形態〕
本発明に係るキットが備えるｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子としては、上述のｐｐＧａｌＮＡｃＴとしての活性を有するポリペプチドをコードするものである限り、特に限定されない。例えば、ヒト等の哺乳類動物、鳥類、爬虫類等の様々な生物に由来するｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子が、本発明に係るキットに包含され得る。より具体的には、ＧａｌＮＡｃ‐Ｔ２（例えばGenBankアクセッション番号ＮＭ＿００４４８１）、ＧａｌＮＡｃ‐Ｔ１（例えばGenBankアクセッション番号ＮＭ＿０２０４７４）が例示される。
【００２８】
また、本発明に係るキットが包含し得るポリヌクレオチドとしては、上述した具体例のポリヌクレオチドの相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行なうことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしにくくなる）。
【００２９】
ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、上述した哺乳類動物等から単離することができる。例えば、既知のｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いて、上述の哺乳類動物等のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうこと等によりｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を得ることができる。また、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００３０】
本発明に係るキットは、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を発現させるための発現ベクターを備えるものであってもよい。ｐｐＧａｌＮＡｃＴの発現ベクターとしては、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子とプロモーターとを含めば特に限定されるものではない。
【００３１】
発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、本発明に係るキットを用いて、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を備えるベクターを、アグロバクテリウム法により植物体に導入する場合、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００３２】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター又はアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【００３３】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【００３４】
上記発現ベクターは、上記プロモーター及びｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選択マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記発現ベクターは、さらにＴ‐ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ‐ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００３５】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることができる。上記発現ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【００３６】
上記選択マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００３７】
上記翻訳効率を高めるためのポリヌクレオチドとしては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記転写因子をコードする遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【００３８】
発現ベクターを構築する具体的な方法としては、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター及びｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入する方法が例示される。また、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【００３９】
発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【００４０】
また、上記発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【００４１】
なお、本発明に係るキットは、上述した発現ベクターの母体となるベクター、プロモーター、選択マーカー、翻訳効率を高めるためのポリヌクレオチド、ターミネーターを、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子とは別の容器に包含させた上で、備えていてもよい。
【００４２】
〔本発明に係るキットの構成：ｐｐＧａｌＮＡｃＴを備える形態〕
本発明に係るキットが備えるｐｐＧａｌＮＡｃＴとしては、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ活性を有するポリペプチドであれば限定されない。なお、本明細書において、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」又は「タンパク質」と交換可能に使用される。
【００４３】
例えば、本発明に係るキットが備えるｐｐＧａｌＮＡｃＴとしては、上述のｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子によりコードされるものであってもよい。
【００４４】
また、天然の精製産物、化学合成手順の産物、及び原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。また、組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、ミリスチル化され得るか、又は非ミリスチル化され得る。さらに、本発明にかかるポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００４５】
また、本発明に係るキットが備えるｐｐＧａｌＮＡｃＴは、従来公知のタンパク質保存用試薬に予め溶解されていてもよい。
【００４６】
〔その他の構成〕
本発明に係るキットは、本発明の効果を損なわない範囲で様々な他の試薬等を備えていてもよい。Ｏ型糖鎖はＮ‐アセチルガラクトサミンを基本骨格として、ガラクトース、Ｎ‐アセチルグルコサミン、シアル酸等の他の糖及び／又は酸により構成される。そこで、本発明に係るキットは、Ｏ型糖鎖を構成する糖及び／又は酸の転移酵素を含んでいてもよい。このような転移酵素としては、ガラクトース転移酵素、ST6GALNAC1（alpha-N-acetyl-neuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3）-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1（GenBankアクセッション番号 ＮＣ＿００００１７）、core 1 synthase, glycoprotein-N-acetylgalactosamine 3-beta-galactosyltransferase, 1（GenBankアクセッション番号 ＮＣ＿０００００７）、UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 6 （core3 synthase）（GenBankアクセッション番号 ＮＣ＿００００１１）、ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 1（GenBankアクセッション番号 ＮＭ＿００３０３３）等が好ましく例示できる。また、例えば、Varki, Ajit; Cummings, Richard; Esko, Jeffrey; Freeze, Hudson; Hart, Gerald; Marth, Jamey., Essentials of Glycobiology., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, のChapter 8、Fig. 8-3, 8-4, 8-5, 8-6に記載されているＯ型糖鎖結合タンパク質の合成工程における各工程を触媒する酵素を備えていてもよい。
【００４７】
なお、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ以外の酵素であって、Ｏ型糖鎖を構成する糖又は酸の転移酵素を、説明の便宜のため「更なる転移酵素」と表記する。本発明に係るキットが更なる転移酵素を備えることで、任意のＯ型糖鎖を、標的タンパク質に結合させることができる。
【００４８】
本発明に係るキットは、上記更なる転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。また、これらのポリヌクレオチドの相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、それぞれの酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド等を包含してもよい。
【００４９】
上記更なる転移酵素をコードするポリヌクレオチドを取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの哺乳類動物、鳥類、爬虫類等から単離することができる。例えば、既知のガラクトース転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、上述の哺乳類動物等のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうこと等によりポリヌクレオチドを得ることができる。また、更なる転移酵素をコードするポリヌクレオチドは、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００５０】
これらのポリヌクレオチドについては、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子とは容器を分けて、別の容器に入れて提供してもよい。
【００５１】
また、本発明に係るキットが上記更なる転移酵素のポリヌクレオチドを備える場合、当該ポリヌクレオチドを備える発現ベクターの形態であってもよい。この発現ベクターについては、上述したｐｐＧａｌＮＡｃＴの発現ベクターの説明に準じる。
【００５２】
なお、本発明に係るキットにおいて、更なる転移酵素をコードするポリヌクレオチドは、上述のｐｐＧａｌＮＡｃＴの発現ベクターに導入されていてもよく、ｐｐＧａｌＮＡｃＴの発現ベクター及び更なる転移酵素の発現ベクターを別々の発現ベクターとしてもよい。
【００５３】
また、本発明に係るキットは標的タンパク質及び／又は標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、「標的タンパク質遺伝子」という。）を備えている形態であってもよい。標的タンパク質遺伝子は、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子とは別々の発現ベクターに導入されていてもよく、一つの発現ベクターに両方の遺伝子が導入されていてもよい。この形態は、標的タンパク質として植物が有していないものを採用する場合において有効である。当該形態に係るキットによれば、当該キットの利用者は標的タンパク質及び／又は標的タンパク質遺伝子を別途調整する必要がなく、より簡便にＯ型糖鎖結合タンパク質を製造することができるからである。
【００５４】
また、本発明に係るキットが包含し得る他の試薬等としては、ここまで説明したものに限定されるものではない。例えば、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ、上記更なる転移酵素、標的タンパク質、これらをコードするポリヌクレオチドを安定的に保持するための試薬、バッファー等を含んでもよいし、当該ポリヌクレオチドをベクターに導入するための制限酵素、リガーゼ等の試薬を含んでもよい。また、植物細胞、植物からの抽出物を含んでもよいし、当該ポリヌクレオチドを植物細胞に導入するための試薬を含んでもよい。また、本発明に係るキットは、複数の異なる試薬を、適切な容量及び／又は形態で混合していてもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。
【００５５】
なお、本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュ等）を備えた包装が意図される。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備える」は、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ及び／又はｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子が、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。このときｐｐＧａｌＮＡｃＴ及び／又はｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子は、特に限定されないが、従来公知の緩衝液等の保存液に溶解された状態であってもよいし、精製された状態であってもよい。また、本発明に係るキットは、上述のｐｐＧａｌＮＡｃＴ、上記更なる転移酵素、標的タンパク質、これらをコードするポリヌクレド、その他の試薬等を同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。
【００５６】
また、本発明に係るキットには、植物においてＯ型結合タンパク質を製造するための手順等を記載した指示書を含んでもよい。紙又はその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能なディスク又はＣＤ−ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよい。
【００５７】
〔本発明に係るキットの使用方法〕
本発明に係るキットの使用方法の例を以下に説明するが、これに限定されるものではなく、植物においてＯ型糖鎖結合タンパクを製造可能なように使用すればよい。
【００５８】
本発明に係るキットがｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を備えている場合、当該ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を、植物又は植物からの抽出物等の中で発現させてもよい。ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を発現させる方法としては、特に限定されず、上述の発現ベクターを用いる等、従来公知の植物内での遺伝子発現方法を用いてもよい。
【００５９】
また、標的タンパク質については、セリン残基及び／又はスレオニン残基が含まれていればよい。例えば、標的タンパク質としては、植物が有しているポリペプチド（以下、「内在タンパク質」という。）でもよく、植物以外の生物が有しているポリペプチド（以下、「外来タンパク質」という。）でもよい。
【００６０】
内在タンパク質としては、例えば、グルテリン（Glutelin、例えばコメ由来のものなど）（Kishimoto T, Watanabe M, Mitsui T, Hori H.Glutelin basic subunits have a mammalian mucin-type O-linked disaccharide side chain.Arch Biochem Biophys. 1999 Oct 15;370（2）:271-277）等を挙げることができる。
【００６１】
外来タンパク質としては、例えば、エリスロポエチン、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ（例えばOtvos,L. Jr., Krivuika. et al., Biochim. Biophys. Acta., 1995, 1267, 55-64を参照）、ムチン（例えばShogren, R., et al., Biochemistry, 1989, 28, 5525-5536を参照）、ＨＳＰ−１、ＨＳＰ−２（熱ショックタンパク質、例えばCalvete, J. J., et al., Biochem. J., 1995, 310, 615-622を参照）、Ｔ１ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ ＡＮ（例えばPieper, J., et al., Nat. Struct. Biol., 1996, 3, 228-232を参照）、ＤＡＦ（崩壊促進因子、例えば、Coyne, K. E., et al., J. Immunol., 1992, 149, 2906-2913を参照）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子、例えばOh-eda, M., et al., J. Biol. Chem., 1990, 265, 11432-11435を参照）、ＰＳＧＬ−１（Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄ−１、例えばMaly, P., et al., Cell, 1996, 86, 643-653を参照）、ＺＰ−３（卵膜蛋白（ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）、例えば、Yurewicz, E. C., et al., Mol. Reprod. Dev., 1992, 33, 182を参照）、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）−ｇｒｏｏｖｅ（例えば、Haurum, J.S., et al., J. Exp. Med., 1994, 180, 739-744、Haurum, J.S., et al., Eur. J. Immunol., 1995, 25, 3270-3276を参照）、ＩｎｔｅｒＬｅｕｋｉｎ−５（例えば、Kodama, S., et al., Eur. J. Biochem., 1993, 211, 903-908を参照）、Ｌａｃｔａｓｅ−ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（例えば、Naim, H. Y., and Lentze, M. J., J. Biol. Chem., 1992, 267, 25494-25504）、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ Ａ（例えば、Remaley, A. T., J. Biol. Chem., 1991, 266, 24176-24183を参照）、ＧＦ−ＩＩ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＩＩ、例えば、Daughaday, W.H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1993, 90, 5823-5827を参照）。
【００６２】
内在タンパク質にＮ‐アセチルガラクトサミンを結合させる場合、植物細胞又は抽出物内にｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を導入して、内在タンパク質をコードするポリヌクレオチドと共に発現させてもよく、植物の抽出物にｐｐＧａｌＮＡｃＴを混合してもよい。
【００６３】
外来ポリペプチドにＮ‐アセチルガラクトサミンを結合させる場合、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を発現させる植物細胞又は抽出物内に、当該外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを併せて導入してこれを発現させてもよく、抽出物内にｐｐＧａｌＮＡｃＴ及び当該外来タンパク質を混合してもよい。
【００６４】
植物に対するｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子及び標的タンパク質遺伝子の導入方法としては特に限定されるものではなく、従来公知の植物の形質転換方法を用いてもよい。例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法等が用いられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、上述の発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著，植物遺伝子操作マニュアル，１９９０，２７‐３１ｐｐ，講談社サイエンティフィック，東京）などにしたがって無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。
【００６５】
ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子及び標的タンパク質遺伝子は、別々の発現ベクターに導入されていてもよく、一つの発現ベクターに両方の遺伝子が導入されていてもよい。
【００６６】
ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子及び標的タンパク質遺伝子を、別々の発現ベクターに導入した場合、それぞれの発現ベクターを用いた形質転換は、一度に行なってもよく、二段階で行なってもよい。「二段階で形質転換を行なう」とは、いずれか一方の発現ベクターを導入して、当該発現ベクターの導入が確認された形質転換植物に対して、他方の発現ベクターを導入することをいう。このように二段階で形質転換を行なうことで、最初に導入した方の発現ベクターを最も安定して高発現する植物を予め選抜することができる。ここで選抜された植物に他方の発現ベクターを導入すれば、両者の発現ベクターがそれぞれ安定して高発現する植物を高確率に取得することが可能となる。それゆえ、Ｏ型結合タンパク質を高生産することができる植物を少ない労力と時間で取得することができ、その結果、効率よく、かつ、安価、安全に有用タンパク質を大量生産することが可能になる。
【００６７】
また、本発明に係るキットがｐｐＧａｌＮＡｃＴを備える形態である場合、その使用方法としては、特に限定されるものではないが、例えば植物の抽出物にｐｐＧａｌＮＡｃＴを混合してもよい。
【００６８】
植物の抽出物としては、植物から抽出したものである限り、特に限定されるものではなく、例えば従来公知の溶媒を用いて抽出したものであってもよいし、植物をすり潰して濾過したり、搾り取ったりして得たものでもよい。
【００６９】
＜２．本発明に係る植物＞
本発明に係る植物は、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子、及びＮ‐アセチルガラクトサミンを結合させる対象のポリペプチド（標的タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（標的タンパク質遺伝子）を備えていればよい。
【００７０】
例えば、植物の染色体、ミトコンドリア等に存在するゲノム中に、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子及び標的タンパク質遺伝子が導入されていてもよい。
【００７１】
植物に対する遺伝子の導入方法、遺伝子を導入する植物の形態、種類等については、本発明に係るキットについて説明した事項に準じればよい。なお、標的タンパク質として植物が有しているものを採用する場合、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子のみを植物に導入してもよいし、標的タンパク質をさらに高発現させるため、両方の遺伝子を植物に導入してもよい。
【００７２】
＜３．組成物＞
本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するための組成物（以下、「本発明に係る組成物」という。）は、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素（ｐｐＧａｌＮＡｃＴ）、及びそれをコードするポリヌクレオチド（ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子）のうちの少なくとも一つを含めばよい。
【００７３】
本発明に係る組成物において、ｐｐＧａｌＮＡｃＴを包含する場合、その濃度としては特に限定されない。この場合、従来公知のタンパク質用緩衝液にｐｐＧａｌＮＡｃＴを溶解したものであってもよい。このような緩衝液としては、ｐｐＧａｌＮＡｃＴを保存可能であれば限定されないが、例えば、次の文献にて、酵素活性を測定する際に用いられている緩衝液を使用することができる。Wandall HH, et al., J Biol Chem., 1997 Sep 19;272(38):23503-23514、Zhang Y, et al., J Biol Chem., 2003, Jan 3;278(1):573-584、Bennett EP, et al, J Biol Chem., 1998, Nov 13;273(46):30472-30481。また、例えば、Iwasaki H, et al., J Biol Chem., 2003, Feb 21;278(8):5613-5621には、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）， ５ｍＭ ＭｎＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の混合液を、保存用の緩衝液として使用できる。また、これらの緩衝液にはグリセロール等の酵素安定化剤を包含させてもよい。
【００７４】
また、本発明に係る組成物において、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を包含する場合、その濃度としては特に限定されない。また、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子は、従来公知の核酸保存用の緩衝液に溶解されていればよい。
【００７５】
本発明に係る組成物は、上述した更なる転移酵素及び／又はこれをコードするポリヌクレオチド、標的タンパク質及び／又は標的タンパク質遺伝子を含んでいてもよい。
【００７６】
＜４．本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法１＞
本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法としては、植物内又は植物の抽出物内で、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を合成する合成工程を含んでいてもよい。
【００７７】
上記合成工程の具体的な方法としては、植物内又は植物の抽出物内でｐｐＧａｌＮＡｃＴを合成させることが可能であれば、特に限定されない。
【００７８】
例えば植物内でｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を発現させてもよい。この場合、上記合成工程は、植物細胞内にｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を導入する導入工程を行ない、次に、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子が導入された植物細胞を培養する培養工程を行なう工程であってもよい。
【００７９】
上記導入工程としては、植物細胞内にｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を導入する工程である限り限定されない。例えば、上述した従来公知の植物の形質転換方法を用いてもよい。
【００８０】
上記培養工程では、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子が導入された植物細胞を、培養細胞の状態で維持してもよいし、葉、根、茎等の組織に分化させてもよいし、完全な植物体に再生してもよい。また、植物の抽出物内でｐｐＧａｌＮＡｃＴを合成させてもよい。例えば、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を植物抽出物内に混合した上で、無細胞発現系によりｐｐＧａｌＮＡｃＴを発現させてもよい。
【００８１】
上記合成工程の後は、植物内又は植物の抽出物からＯ型糖鎖結合タンパク質を精製してもよい。Ｏ型糖鎖結合タンパク質の精製については、従来公知のＮ型糖鎖タンパク質の精製方法を適用してもよい。例えば、Ｏ型糖鎖結合タンパク質を特異的に認識するレクチンを用いてもよい。
【００８２】
＜５．本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法２＞
本発明に係るＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法としては、植物の抽出物に、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を混合する混合工程を含んでいてもよい。
【００８３】
上記混合工程の具体的な方法としては、植物の抽出物にｐｐＧａｌＮＡｃＴを混合する限り、特に限定されない。例えば、単に植物の抽出物にｐｐＧａｌＮＡｃＴを滴下するだけでもよく、攪拌してもよい。植物の抽出物中に含まれるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを基質としてＯ型糖鎖が生成される。また、植物の抽出物中にＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが含まれない場合は別途添加すればよいし、含まれる場合であっても、さらに添加してもよい。
【００８４】
上記混合工程の後は、植物の抽出物からＯ型糖鎖結合タンパク質を精製すればよい。Ｏ型糖鎖結合タンパク質の精製については、従来公知の型糖鎖結合タンパク質の精製方法を用いて行なえばよい。
【００８５】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００８６】
＜実施例１．形質転換植物細胞の作出＞
ヒト組織から、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子及びガラクトース転移酵素遺伝子をクローニングした。
【００８７】
ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子については、次の方法で得た。肝臓由来ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型（ORIGENE TECHNOLOGIES INC. Multiple Choice(TM) Human cDNA）とし、プライマーＵ１−Ｆ（5'-GGCGGATCCAAGGAGATATAACAATGAGAAAATTTGCATACTGCAAGGTGGTC-3'）（配列番号１）およびＵ１−Ｒ（5'-GGCGAGCTCTCAGAATATTTCTGGCAGGGTGACGTTTCG-3'）（配列番号２）を用いたＰＣＲで増幅することで、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。これをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断後、ＴｉプラスミドｐＢＩ１２１のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに導入し、プラスミドｐＢＩ‐ＧａｌＮＡｃ‐Ｔ１を構築した。
【００８８】
ガラクトース転移酵素遺伝子について、次の方法で得た。肝臓由来ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型（ORIGENE TECHNOLOGIES INC. Multiple Choice(TM) Human cDNA）を鋳型とし、プライマーＧＴ−Ｆ（5'-GGCGGATCCAAGGAGATATAACAATGGCCTCTAAATCCTGGCTGAATTTTTTA-3'）（配列番号３）およびＧＴ−Ｒ（5'-GGCGAGCTCTCAAGGATTTCCTAACTTCACTTTTGTATC-3'）（配列番号４）を用いたＰＣＲで増幅することにより、ガラクトース転移酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。これをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断後、ｐＢＩ１２１のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに導入し、プラスミドｐＢＩ―Ｃ１ＧＡＬＴ１を構築した。
【００８９】
次に、それぞれのベクターを共にタバコＢＹ２培養細胞にアグロバクテリウム法によりｃｏ‐ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ形質転換した。得られた形質転換細胞から、ｍＲＮＡを調製して、Ｎ‐アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子及びガラクトース転移酵素遺伝子の発現をノーザン分析により確認した。そして、両方の転移酵素遺伝子を共に発現する形質転換細胞を選抜した。なお、この実験に供した植物細胞３００個のうち、両方の転移酵素遺伝子を共に発現する形質転換細胞は２個であった。このうち、ｍＲＮＡ量の高かった形質転換細胞（以下、「ＴＸ１３株」という。）をさらに選抜して、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ‐Ｓｋｏｏｇ培地を用いて懸濁培養した。
【００９０】
＜実施例２．Ｏ型糖鎖結合タンパク質の確認＞
実施例１にて懸濁培養したＴＸ１３株を、１．５ｍｌの１７５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させた。得られた懸濁液中の細胞を乳鉢及び乳棒を用いてホモジナイズした後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）に供した。次に上澄み（細胞抽出液）を回収した。同様にして、非形質転換ＢＹ２細胞（以下、「ＢＹ２野生株」という。）から細胞抽出液を調製した。
【００９１】
次に、ＴＸ１３株及びＢＹ２野生株から得た細胞抽出液を、それぞれレクチンカラムに通じさせ、糖タンパク質をレクチンに吸着させた。非吸着画分については廃棄した。なお、レクチンカラムとしては、ジャッカリン（Ｊａｃａｌｉｎ）レクチン０．５ｍｌを、Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社製カラム（品番７３７−１００６ 内径１ｃｍ 長さ５ｃｍ）に充填したものを用いた。ジャッカリンは、Ｇａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ構造を認識する。
【００９２】
次に、２０ｍｌの１７５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）でレクチンカラムを洗浄して、溶出液を回収した。さらに、１０ｍＭのメチルガラクトピラノシドを含む１７５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）により、吸着したタンパク質を溶出して、１ｍｌ（フラクション１）、１ｍｌ（フラクション２）、１ｍｌ（フラクション３）、１ｍｌ（フラクション４）、６ｍｌ（フラクション５）として回収した。
【００９３】
次に、各細胞抽出液に由来するフラクション１〜３を、１２．５％ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。結果を図１に示す。図１は、本実施例における電気泳動の結果を示す図であり、図１の（ａ）はＴＸ１３株の細胞抽出液を用いた結果を示し、（ｂ）はＢＹ２野生株の細胞抽出を用いた結果を示す。また、図１の（ａ）及び（ｂ）において各レーンの上に示す番号はフラクションの番号を示しており、「２＆３」はフラクション２及び３の混合物を電気泳動に供したことを示している。
【００９４】
図１の（ａ）の三角印にて示すように、ＴＸ１３株の細胞抽出液では、ＢＹ２野生株の細胞抽出からは確認されなかったレクチン結合性タンパク質が確認された。
【００９５】
次に、各細胞抽出液に由来するフラクション１及び２を超純水に対して透析した後、凍結乾燥した。得られた生成物を０．２Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した後、α‐Ｎ‐アセチルガラクトサミニダーゼ（生化学工業社製）を加えて、３日間３７℃に保温した。なお、本明細書の実施例において「超純水」とは、Ｍｉｌｌｉ‐Ｑシステム（ミリポア社製）を用いて精製した水である。
【００９６】
次に、保温後の溶液をＣａｒｂｏｇｒａｐｈ（ＧＬ‐Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて精製した。まず、当該溶液をＣａｒｂｏｇｒａｐｈに通し、次に５ｍｌの５０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）で洗浄し、６０％アセトニトリルを含有する５０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）で糖鎖を溶出した。次に、得られた溶液を凍結乾燥した。
【００９７】
凍結乾燥後の試料にＰＡ化試薬（２‐アミノピリジン（Ｗａｋｏ社製）５５２ｍｇに対して２００μｌの酢酸（Ｗａｋｏ社製）を混合したもの）を適量加えて、９０℃で１時間インキュベートした。次に、試料を室温で冷却した後、等量の還元試薬（ジメチルアミノボラン（Ｗａｋｏ社製）３９ｍｇに対して２００μｌの酢酸を混合したもの）を加えて、８０℃で４０分間インキュベートした。次に、反応停止のために等量の蒸留水を加えた。
【００９８】
得られた溶液に、超純水飽和のフェノール溶液：クロロホルム溶液（１：１）を等量加えて、未反応のＰＡ化試薬を抽出した。この抽出の操作を再度繰り返した。次に、クロロホルム溶液を混合して、得られた水層部分を抽出した。
【００９９】
次に、抽出液を、常温で真空下に静置することで１０分の１の液量まで濃縮して、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による解析に供した。
【０１００】
また、コントロールとして、市販のＧａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ（Ｔｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）に対しても同様の操作を行ない、ＨＰＬＣに供した。即ち、Ｇａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ １ｍｇに対して上記ＰＡ化試薬を適量加えて、９０℃で１時間インキュベートした。
【０１０１】
次に、試料を室温で冷却した後、等量の上記還元試薬を加えて、８０℃で４０分間インキュベートした。次に、反応停止のために等量の蒸留水を加えた。その後、超純水飽和のフェノール溶液：クロロホルム溶液（１：１）を等量加えて、未反応のＰＡ化試薬を抽出した。この抽出の操作を再度繰り返した後、クロロホルム溶液を混合して、得られた水層部分を抽出した。この抽出液を常温で真空下に静置することで１０分の１の液量まで濃縮して、ＨＰＬＣに供した。
【０１０２】
ＨＰＬＣによる解析については、次のようにして行なった。試料に対して、アセトニトリルが全量の８０％となるように加えて、ＨＰＬＣ（ＳＦ‐ＨＰＬＣ）に供した。ＨＰＬＣのカラムとしては、アミドカラム（Ｓｈｏｗａ ｄｅｎｋｏ社製、型名：Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ‐５０；４．６×２５０ｎｍ）を用いた。ＨＰＬＣの装置としてはＨＩＴＡＣＨＩ ＦＬ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｌ‐７４８０を備えるＨＩＴＡＣＨＩ ＨＰＬＣシステムを用いた。展開溶媒及びグラジェント等の詳細な条件は次の通りである。
展開溶媒：８０％アセトニトリル
グラジェント：アイソクラチック
流速：０．７ｍｌ／分
検出：蛍光（Ｅｘ；３１０ｎｍ、Ｅｍ；３８０ｎｍ）
カラム温度：３０℃
結果を図２に示す。図２は、本実施例におけるＨＰＬＣの結果を示す図である。
【０１０３】
図２に示すように、ＴＸ１３株の細胞抽出液を用いた結果、コントロールに由来するＧａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ‐ＰＡと同じ位置にピークを検出した。このピークの溶出画分を分離精製した。このことから、ＴＸ１３株の細胞抽出液にＮ‐アセチルガラクトサミンで修飾されたタンパク質が含まれていることが確認できた。
【０１０４】
次に、精製して得られたタンパク質（ＰＡ化糖鎖、上記フラクション２）の分子量をＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ‐ＭＳにより測定した。装置としてａｕｔｏｆｌｅｘ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）を用いた。レーザー強度を１８００〜２０００ｍｂａｒとし、３．０×ｅ−７以下の真空下でデータを得た。マトリックス試薬としては、蒸留水：アセトニトリルを１：１で混合した溶液に、１０ｍｇの２，５‐ジヒドロキシ安息香酸（Ｓｉｇｍａ社製）を混合した溶液を用いた。また、ＰＡ化糖鎖を溶解した蒸留水に、等量のマトリックス試薬を混合して、この内２μｌをターゲットに置き、室温で乾燥させることで結晶化させた後、Ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ ｍｏｄｅ分析を行なった。
【０１０５】
結果を図３に示す。図３は本実施例のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ‐ＭＳの結果を示す図であり、図３の（ａ）はＴＸ１３細胞由来のＰＡ化糖鎖の分子量を測定した結果を示し、図３の（ｂ）はコントロールに由来するＧａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ‐ＰＡの分子量を測定した結果を示す。
【０１０６】
図３の（ａ）及び（ｂ）に示すように、ＴＸ１３細胞由来のＰＡ化糖鎖の分子量（ｍ／ｚ ｆｏｒ ［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４８２）は、コントロール由来のＧａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ‐ＰＡの分子量と同じであり、また構造から推測される分子量（４８３．５）とほぼ一致した。
【０１０７】
以上の結果から、植物細胞に導入したＮ‐アセチルガラクトサミン転移遺伝子及びガラクトース転移遺伝子が機能し、植物タンパク質にＯ型糖鎖を結合できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明に係るキットを用いれば、植物においてＯ型糖鎖をタンパク質に結合させることが可能となるので、有用タンパク質を植物で生産することができる。よって、本発明は、植物の工業的利用用途の拡大に寄与すると共に、医薬品産業、食品産業等の幅広い産業において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】実施例２における電気泳動の結果を示す図であり、（ａ）はＴＸ１３株の細胞抽出液を用いた結果を示し、（ｂ）はＢＹ２野生株の細胞抽出を用いた結果を示す。
【図２】実施例２におけるＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図３】実施例２におけるＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ‐ＭＳの結果を示す図であり、（ａ）はＴＸ１３細胞由来のＰＡ化糖鎖の分子量を測定した結果を示し、（ｂ）はコントロールに由来するＧａｌβ（１‐３）ＧａｌＮＡｃ‐ＰＡの分子量を測定した結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを備えていることを特徴とする植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキット。
【請求項２】
ガラクトース転移酵素、及びその酵素をコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つをさらに備えていることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするポリヌクレオチド、及びＮ‐アセチルガラクトサミンを結合させる対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを備えていることを特徴とする形質転換植物。
【請求項４】
ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するための組成物。
【請求項５】
植物内又は植物の抽出物内で、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を合成する合成工程を含むことを特徴とするＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法。
【請求項６】
植物の抽出物に、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を混合する混合工程を含むことを特徴とするＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法。
【請求項１】
ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを備えていることを特徴とする植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するためのキット。
【請求項２】
ガラクトース転移酵素、及びその酵素をコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つをさらに備えていることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするポリヌクレオチド、及びＮ‐アセチルガラクトサミンを結合させる対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを備えていることを特徴とする形質転換植物。
【請求項４】
ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする植物においてＯ型糖鎖結合タンパク質を製造するための組成物。
【請求項５】
植物内又は植物の抽出物内で、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を合成する合成工程を含むことを特徴とするＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法。
【請求項６】
植物の抽出物に、ポリペプチドＮ‐アセチルガラクトサミン転移酵素を混合する混合工程を含むことを特徴とするＯ型糖鎖結合タンパク質の製造方法。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１１５０４３（Ｐ２０１１−１１５０４３Ａ）
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８４６４９（Ｐ２００８−８４６４９）
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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