植物の分枝形成促進、矮化、不稔化、および花芽複数形成促進方法
【課題】植物の分枝形成促進、矮化、不稔化方法、および花芽複数形成、さらに、植物の分枝形成を促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成を促進する薬剤を提供すること。
【解決手段】ファイトプラズマは植物の分枝形成促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成を引き起こす病原微生物である。このファイトプラズマのＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体に導入することによって、植物の分枝形成促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成を促進することができる。また、ＰＡＭ７６５ペプチド、または、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子を含有する、植物の分枝形成促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成を促進する薬剤を提供する。
【解決手段】ファイトプラズマは植物の分枝形成促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成を引き起こす病原微生物である。このファイトプラズマのＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体に導入することによって、植物の分枝形成促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成を促進することができる。また、ＰＡＭ７６５ペプチド、または、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子を含有する、植物の分枝形成促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成を促進する薬剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物の分枝形成促進、矮化、不稔化、および花芽複数形成促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の生育調整や形態形成制御が可能となれば、光合成効率の向上や穂数増など農作物の収量増につなげることができる。また、園芸植物についても、形態的特徴を制御することによって付加価値の飛躍的向上が期待できる。従来は、変異原処理等を行うことによって植物の一連の形態形成関連遺伝子群の変異を促し、そのうち有用なものを選択して分子育種に使用することが一般的に行われていた。しかし、この方法では、その形質導入が品質や生育特性等の他の各種形質に及ぼす影響が未知であり、有用かつ実用的な遺伝子となり得るかどうかを予測することが困難であった。
【０００３】
ファイトプラズマ（Phytoplasma asteris）は７００種類以上の植物に感染し、特徴的な形態変化を引き起こす植物病原微生物である（例えば、非特許文献１参照）。その感染によって植物に見られる形態異常として、萎縮、分枝増加（叢生症状）、黄化、縮葉、花器官の葉への変換（葉化）、花器官のシュート構造への転換（突き抜け）等がある（例えば、非特許文献１参照）。これらは農業上重要病害であり、大きな被害をもたらしている。一方で、葉化症状を呈したアジサイ、叢生症状を呈したポインセチア等もファイトプラズマの感染によって引き起こされる病徴として知られているが（例えば、非特許文献２参照）、これらの形態異常植物個体はその形態のユニークさから植物の商品価値を高め、品種登録されて珍重されている。
【０００４】
以上のことから、病原微生物であるファイトプラズマの感染を利用して、植物個体の生育や形態を制御し、分枝形成や矮化等の有用形質を持たせることが可能であると考えられる。しかし、通常、ファイトプラズマの感染は媒介昆虫であるヨコバイ類を介して拡大するため（非特許文献３参照）、ファイトプラズマが感染した植物個体は、たとえ有用形質を持っていたとしても他植物個体における新たな病気の発生源となる恐れがあった。
【０００５】
【非特許文献１】Lee IM et al., Annual Review of Microbiology 54: 221-255 (2000)
【非特許文献２】Lee IM et al., Nature Biotechnology 15:178-182 (1997)
【非特許文献３】Suzuki S et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 103: 4252-4257 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、ファイトプラズマの感染を介さず、植物の分枝形成促進、矮化、不稔化、および花芽複数形成促進する方法、さらに植物の分枝形成を促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成促進する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ファイトプラズマ（Phytoplasma asteris）のＤＮＡ上にコードされると予測される遺伝子全てを一つずつ植物個体に発現させ、個体の形態変化を観察することによって、植物の分枝形成・矮化を促進するペプチド候補のスクリーニングを行った。その結果、分枝の増加および萎縮の形態異常を促進するＰＡＭ７６５ペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
なお、ここで、「分枝」とは、植物個体の主軸を形成する茎の節から生じた側芽が成長して形成された枝のことをいう。この枝は成長に伴い、茎構造に加えて葉や花を持つこともある。また、「花芽複数形成」とは植物の茎の一つの節から、分枝を伴わずに複数の花芽が形成されることであり、「花芽形成」とは花芽の創始、分化、および発達の過程を含む。
【０００９】
すなわち、本発明の植物の分枝形成促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成促進方法は、非組換えファイトプラズマを感染させることなく、ＰＡＭ７６５ペプチドを有するペプチドを植物個体に導入することを特徴とする。ＰＡＭ７６５ペプチドは、DQDDDIENVITLX4ETKENQTEX5IKX6QCQDLLQKGEKDA（配列番号１）、DQDDDIENVITLIETKENQTEQIKIQCQDLLQKGEKDA（配列番号２）またはDQDDDIENVITLTETKENQTEEIKMQCQDLLQKGEKDA（配列番号３）のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましく、配列番号１〜３において、数アミノ酸残基が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有し、植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または不稔化することのできるペプチドであってもよい。（なお、上記配列中、Ｘ４−６はいずれのアミノ酸であってもよい。）
【００１０】
本発明の植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成促進する方法は、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを該植物個体で発現させて行ってもよい。また、前記ＤＮＡの該植物個体における発現は、トランスジェニック植物を作成することにより行ってもよい。
【００１１】
本発明の植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化および／または植物の花芽複数形成促進方法する農薬組成物または薬剤は、ＰＡＭ７６５ペプチドまたはＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、非組換えファイトプラズマの感染を介さず、植物の分枝形成促進および／または矮化および／または不稔化する方法、さらに、植物の分枝形成を促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成促進する薬剤を提供することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されない。
【００１４】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１６】
〈１．植物の分枝形成促進、植物を矮化、不稔化および花芽複数形成促進する方法〉
本発明による植物の分枝形成促進、植物を矮化、不稔化および花芽複数形成促進する方法は、非組換えファイトプラズマを感染させることなく、ＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体に導入することを特徴とする。
ここで、非組換えファイトプラズマとは、遺伝子組み換え技術を用いて作製したファイトプラズマ以外のファイトプラズマであって、例えば、野生型ファイトプラズマや自然突然変異を有するファイトプラズマが例示できる。
また、ＰＡＭ７６５ペプチドとは、長さが最大７０アミノ酸残基のペプチドを意味し、
（１）以下の配列番号４〜６のアミノ酸配列を有するペプチド、
MVKLX1KX2KX3KLLIFAGFWAILLFLNHNYLIFADQDDDIENVITLX4ETKENQTEX5IKX6QCQDLLQKGEKDA（配列番号４）（式中、Ｘ１−６はいずれのアミノ酸でもよいが、Ｘ１はＫかＱ，Ｘ２はＨかＤ，Ｘ３はＡかＶ、Ｘ４はＩまたはＴ、Ｘ５はＱまたはＥ、Ｘ６はＩまたはＭであることが好ましい）
MVKLKKHKAKLLIFAGFWAILLFLNHNYLIFADQDDDIENVITLIETKENQTEQIKIQCQDLLQKGEKDA（配列番号５）
MVKLQKDKVKLLIFAGFWAILLFLNHNYLIFADQDDDIENVITLTETKENQTEEIKMQCQDLLQKGEKDA（配列番号６）
（２）以下の配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するペプチド、
DQDDDIENVITLX4ETKENQTEX5IKX6QCQDLLQKGEKDA（配列番号１）（式中、Ｘ４−６はいずれのアミノ酸でもよいが、Ｘ４はＩまたはＴ、Ｘ５はＱまたはＥ、Ｘ６はＩまたはＭであることが好ましい）
DQDDDIENVITLIETKENQTEQIKIQCQDLLQKGEKDA（配列番号２）
DQDDDIENVITLTETKENQTEEIKMQCQDLLQKGEKDA（配列番号３）
（３）配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする遺伝子のホモログやオーソログがコードするペプチドのうち、配列番号２のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなる部分ペプチドを有するペプチド、
（４）配列番号１〜３のアミノ酸配列または（３）に記載の配列番号２のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、配列番号４〜６の一部のアミノ酸配列からなるペプチド、
（５）（１）から（４）に記載のいずれかのペプチドの配列において、数アミノ酸残基（例えば、１０アミノ酸残基、好ましくは、８アミノ酸残基、より好ましくは、６アミノ酸残基、さらに好ましくは４アミノ酸残基、さらに好ましくは２アミノ酸残基）が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有し、植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化することのできる変異ペプチドを意味するが、好ましくはＮ末端にメチオニンが付加された以下の変異ペプチド（配列番号７〜９）である。
MDQDDDIENVITLX1ETKENQTEX2IKX3QCQDLLQKGEKDA（配列番号７）
MDQDDDIENVITLIETKENQTEQIKIQCQDLLQKGEKDA（配列番号８）
MDQDDDIENVITLTETKENQTEEIKMQCQDLLQKGEKDA（配列番号９）
なお、（５）の変異ペプチドは、（１）〜（４）のペプチドにおいて、分枝形成促進活性、矮化促進活性、または不稔化促進活性に必要なアミノ酸に、変異が生じていないか、変異が生じていても分枝形成促進活性、矮化促進活性、または不稔化促進活性を失わせないような変異を有する変異ペプチドであり、当業者にとって（１）〜（４）のペプチドと均等物であることが明らかなペプチドのことを意味する。なお、これらのペプチドは、糖鎖修飾などの修飾がなされていてもよい。
【００１７】
本発明の方法を用いることのできる対象となる植物は、前記ＰＡＭ７６５ペプチドによって分枝形成、矮化、不稔化、または花芽複数形成を促進することができる植物種であれば特に制限がないが、onion yellows (ＯＹ)ファイトプラズマまたはAster yellows witches’-broom（ＡＹＷＢ）ファイトプラズマによって、疾患の表現系が現れる植物が好ましく、Nicotiana benthamiana、Arabidopsis thaliana、Chrysanthemum coronarium、Petunia hybridaが例示できる。
【００１８】
実施例に示すように、ＯＹファイトプラズマが有する、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドは、植物の分枝形成、矮化、不稔化および花芽複数形成を促進する活性を有する。一方、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドは、ＡＹＷＢファイトプラズマにおけるホモログであり、同じ活性を有すると考えられる。これらのペプチドにおいては、３ヶ所のアミノ酸残基（配列番号１におけるＸ1-3に相当する）が保存されておらず、従って、これらのアミノ酸残基は、植物の分枝形成、矮化、および不稔化を促進する活性には重要でないと考えられる。従って、それらのアミノ酸残基を特定していない配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドも、植物の分枝形成、矮化、不稔化または花芽複数形成を促進する活性を有すると考えられる。
【００１９】
ＰＡＭ７６５ペプチドの植物個体への導入方法は、特に限定されず、ＰＡＭ７６５ペプチド自体の導入、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを植物個体で発現させることによる導入、またはＰＡＭ７６５ペプチドを発現する細胞を移植することによる導入など、いずれの方法によって行ってもよい。なお、ＰＡＭ７６５ペプチドは分子量が顕著に小さいため、植物個体の一部に導入すれば、機能すべき場所に拡散する。従って、ＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体の一部に導入しても全体に導入してもかまわない。
【００２０】
〈２．ＰＡＭ７６５ペプチドの製造と植物個体への導入〉
上記のように、ＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体に導入するには、ＰＡＭ７６５ペプチド自体を植物個体に導入してもよい。
【００２１】
植物個体に導入するためのＰＡＭ７６５ペプチドは、その取得・調製法によって特に限定されず、天然由来のペプチドであっても、遺伝子組換え技術を用いて製造された組換えペプチドであっても、または周知の方法で化学合成したペプチドであってもよい。天然由来のペプチドは、タンパク質の単離・精製法を適宜組み合わせることにより、ＰＡＭ７６５ペプチドを発現しているファイトプラズマから取得することができる。あるいは、ファイトプラズマに感染した媒介昆虫や植物器官等から精製してもよい。ここで、ファイトプラズマの系統は、分枝形成を促進するか、矮化を引き起こすか、不稔化を引き起こすか、または花芽複数形成を促進するものであれば、特に制限はない。化学合成により本発明に係るペプチドを調製する場合には、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やｔＢｏｃ法（ｔ-ブチルオキシカルボニル法）等の当業者に周知の化学合成法に従って製造することができる。また、各種市販のペプチド合成機を利用してＰＡＭ７６５ペプチドを製造することもできる。遺伝子組換え技術によりペプチドを調製する場合には、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を好適な発現ベクターに導入した後、培養細胞等の宿主を形質転換し、ペプチドを発現させればよい。
【００２２】
このようにして得られるＰＡＭ７６５ペプチドを植物体に導入する方法は特に限定されず、注射器等で、葉等の植物個体の一部に注入してもよく、維管束内に注入してもよい。
【００２３】
〈３．ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを植物個体で発現させることによる、ＰＡＭ７６５ペプチドの植物個体への導入〉
上記のように、ＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体に導入するには、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを植物個体で発現させてもよい。
【００２４】
ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを植物個体で発現させるため、まず、ＰＡＭ７６５をコードするＤＮＡを植物細胞で発現させるための適切なプロモーターの下流に挿入した発現ベクターを作製する。この発現ベクターを生体植物に導入するか、あるいは、生体植物から単離した組織、器官、または、植物由来の株化細胞、カルスに導入した後、植物個体に再生することによって、植物個体へＰＡＭ７６５ペプチドを導入することができる。
【００２５】
ＤＮＡを植物個体で発現させる方法においては、まず、当業者に周知の方法を用い、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを発現ウイルスベクターに組込み、組換えウイルスベクターを作成する。ここで、使用するウイルスベクターは、例えばｐＣＡＭＶ(ポテトウイルスＸベクター)等を用いることができるが、特に制限されない。
【００２６】
このようにして作製した組換えウイルスベクターを植物個体に導入する。この工程は、生体植物を用いる方法、あるいは、植物から単離した組織、器官、もしくは、植物由来株化細胞、カルスを用いる方法、から選択できる。以下、各々について詳細に説明する。
【００２７】
まず、生体植物を用いて組換えウイルスベクターを植物に導入する方法としては、例えば、アグロバクテリウムを介するアグロバクテリウム法が挙げられる。アグロバクテリウム法では、例えばエレクトロポーテーション法（Nagel et al., Microbiology Letters, 67:325, 1990）等の当業者に周知の方法を用いて、組換えウイルスベクターをアグロバクテリウムに導入する。
【００２８】
次いで、組換えウイルスベクター導入アグロバクテリウムを浸漬バッファーに懸濁したアグロバクテリウム菌液を作製し、生体植物の一部または全体を浸漬する（Gelvin et al., Molecular Biology Manual, Academic Press Publishers; Cough & Bent, The Plant Journal, 16:735-743, 1996）。これによって、浸漬した生体植物の部分の細胞にＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを導入することができ、その場所で、ＰＡＭ７６５ペプチドを発現・分泌させることができる。
【００２９】
あるいは、前記組換えウイルスベクターを、エレクトロポーテーション法やパーティクルガン法等の当業者に周知の方法を用いて生体植物個体の細胞に直接導入することができる。これによって、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを導入されたこの細胞においてＰＡＭ７６５ペプチドを発現させることができる。
【００３０】
一方、植物由来の組織、器官、株化細胞、カルスなどの培養下にある細胞を用いて、組換えベクターを植物個体に導入する場合、アグロバクテリウムを介して、あるいは、直接、前記植物由来細胞に組換えウイルスベクターを導入することにより、まず、ＰＡＭ７６５ペプチド発現する形質転換細胞を作製する。
【００３１】
アグロバクテリウムを介する場合、上記のような培養下にある細胞を組換えウイルスベクター導入アグロバクテリウムと共培養し、アグロバクテリウムをそれらの細胞に導入することにより、形質転換細胞を作製する。一方、組換えウイルスベクターを直接細胞に導入する場合、培養下にある細胞に対し、エレクトロポーテーション法、パーティクルガン法等の当業者に周知の方法を用いればよい。
【００３２】
得られた形質転換細胞はＰＡＭ７６５ペプチドを発現する。この形質転換細胞を、常法に従って植物体再生用の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン等）を添加した培地で培養することによって植物体に再生することができる。このようにして、個体全体の細胞が、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを有するトランスジェニック植物を得ることができる。このＤＮＡは、ＰＡＭ７６５ペプチドの上流に付加されているプロモーターの制御下で、このペプチドを発現する。あるいはＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えウイルスを植物体の一部に導入すると、組換えウイルスが植物体全体に移行し、全身でこのペプチドを発現するようになる。
【００３３】
〈４．植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成を促進する薬剤〉
本発明に係る植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成するための農薬組成物は、ＰＡＭ７６５ペプチド、またはＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子のいずれか、もしくはこれらのうち2つ以上の組み合わせを含有する。この農薬組成物は、当業者に周知の製剤用添加物を用いて、剤形化することができるが、その形態は特に限定されず、例えば、乳剤、液剤、油剤、水溶剤、水和剤、フロアブル剤、粉剤、微粒剤、粒剤、エアロゾール、くん蒸剤、ペースト剤等の形態にすることができる。この薬剤には、殺虫剤、殺菌剤、殺虫殺菌剤、除草剤などの他の農薬の有効成分を配合してもよい。なお、この、植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または不稔化する薬剤の適用方法および適用量は、適用目的、剤型、適用場所などの条件に応じて当業者が適宜選択可能である。
【実施例】
【００３４】
〈実施例１〉
本実施例では、ファイトプラズマのＰＡＭ７６５ペプチドが植物の分枝形成および矮化を促進することを示す。
【００３５】
＝＝ＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子の植物個体への導入＝＝
植物の分枝形成および矮化を促進するＯＹファイトプラズマ由来のＰＡＭ７６５ｏｙペプチド（配列番号８）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１０）をＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ここでは、鋳型として、ファイトプラズマ感染植物よりcetyltrimethylammonium bromide法（Namba et al., Phytopathology, 83:786-791, 1993）によって抽出した全ＤＮＡを用いた。ＰＣＲプライマーは、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
プライマーＳ1：acgcgtcgacATGGACCAAGATGATGATATTGAAAACGTGATAACTC（配列番号１１）
プライマーＡＳ１：tgacccgggTTAGGCATCTTTCTCGCCCTTTTGCAATAAATCTTGACA（配列番号１２）
【００３６】
ＰＣＲ産物を制限酵素（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ）で切断し、ｂｉｎａｒｙポテトウイルスＸ（ＰＶＸ）ベクター（ｐＣＡＭＶ、ｐＣＡＭＶはアグロバクテリウムのｂｉｎａｒｙベクターｐＣＡＭＢＩＡにＰＶＸのｃＤＮＡ ｐＰ２Ｃ２Ｓ (Baulcombe DC, Chapman S, Santa Cruz S, The Plant Journal 7:1045-1053 1995)を挿入したもの）のマルチクローニングサイトに挿入することにより、ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ組換えウイルスベクターを作製した。このｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ組換えウイルスベクターを、アグロバクテリウム（A. tumefaciens）ＥＨＡ１０５系統にエレクトロポレーション法によって導入した。対照群として、挿入ＤＮＡを持たないｐＣＡＭＶベクター、および、異なるペプチドＰＡＭ４８６をコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターであるｐＣＡＭＶ−ＰＡＭ４８６を、上記と同様にアグロバクテリウムに導入した。
【００３７】
アグロバクテリウムは、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加した選択培地を用いて選択し、その後、菌濃度が０．８（ＯＤ６００）になるまで２８℃で培養した。このアグロバクテリウムを、浸漬バッファー（１０ ｍＭ morpholineprapanesulfonic acid、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０μＭ acetosyrigone、 ｐＨ５．６）に菌濃度０．８（ＯＤ６００）で懸濁し、このアグロバクテリウム懸濁液に双葉を有した３週齢のタバコ（N. benthamiana）の植物個体を浸漬することにより、タバコにアグロバクテリウムを感染させた。こうして得られた感染タバコ個体を２５℃に保たれたチャンバーで生育させ、成長後の感染タバコ個体を観察した（図１）。なお、感染個体で、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドをコードする遺伝子が実際に発現していることは、ＲＴ−ＰＣＲで確認した。
【００３８】
図1に示すように、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドが導入された個体（Ｂ：ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ）は、対照個体（Ａ： ｐＣＡＭＶベクターのみ、Ｃ： ｐＣＡＭＶ−ＰＡＭ４８６）と比較して分枝が著しく促進され、矮小化した。この分枝形成はファイトプラズマの感染により特徴的に引き起こされる分枝形成と同様であった。
【００３９】
また、図２に示すように、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドが導入された個体（ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ）では、対照個体（ｐＣＡＭＶ）と比較して、優位に葉数が多かった。
【００４０】
このように、ＰＡＭ７６５ペプチドは、植物の分枝形成および矮化を促進する活性を有する。しかも、生体植物の一部でＰＡＭ７６５ペプチドを発現させるだけで、個体全体にその効果が生じる。
【００４１】
〈実施例２〉
本実施例では、ＰＡＭ７６５トランスジェニック植物個体が、ファイトプラズマ感染野生個体と同様に分枝促進、矮化、不稔、および花芽複数形成の症状を呈することを示す。
【００４２】
＝＝トランスジェニック植物の作製＝＝
ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドを発現するＴｅｎｇｕトランスジェニックシロイヌナズナ（A. thaliana）の作製方法を以下に述べる。
まず、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１０）をＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応の鋳型として、前記実施例１と同様に作製した全ＤＮＡを用い、プライマーは、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
プライマーＳ２：cgggatcctggtcagtcccttATGGACCAAGATGATGATATTGAAAACG（配列番号１３）
プライマーＡＳ２：cgagctcTTAGGCATCTTTCTCGCCCTTTTGCAATAAATCTTGACA（配列番号１４）
【００４３】
ＰＣＲ産物を制限酵素（ＢａｍＨＩ、 ＳａｃＩ）で切断し、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを有するｂｉｎａｒｙベクターｐＢＩ１２１（Clontech社）のマルチクローニングサイトに挿入することにより、ｐＢＩ１２１−ＴＥＮＧＵ組換えウイルスベクターを作製した。次いで、得られた組換えプラスミドベクター(ｐＢＩ１２１−ＴＥＮＧＵ)をエレクトロポレーション法を用いてアグロバクテリウムＥＨＡ１０５系統に導入した。対照群として、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）タンパク質をコードする遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）を挿入した組換えベクター（ｐＢＩ１２１−ＧＵＳ）（Clontech社)を、同様にしてアグロバクテリウムＥＨＡ１０５系統に導入した。
【００４４】
これらのアグロバクテリウムを用い、ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ法（Cough & Bent, The Plant Journal, 16:735-743, 1996）によりシロイヌナズナ（A. thaliana、ecotype Col-0）を形質転換した。形質転換体は、Ｔ１植物の種子をカナマイシン選択培地（ムラシゲ・スクーグ培地用塩類(和光社)、ＭＳビタミン（Ｓｉｇｍａ社）、１％ショ糖、０．７ ％寒天、５０μｇ／ｍｌカナマイシン）に播種することにより選択した。なお、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドをコードする遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ法によって確認した。
【００４５】
Ｔｅｎｇｕトランスジェニック群（Ｎ＝８７）、およびＧＵＳトランスジェニック対照群（Ｎ＝２５）において、発芽後１ヶ月後に各個体を観察し、症状を発現する個体及び正常個体を計数した。表１に、その計測結果を示す。
【表１】
表１より明らかなように、ＧＵＳトランスジェニック対照群では症状を呈する個体が全く観察されなかったが、Ｔｅｎｇｕトランスジェニック群では２７．６％の個体が症状を呈し、分枝促進および／または矮化率が有意に高かった（Ｆｉｓｈｅｒの直接確率法）。
【００４６】
＝＝ヨコバイを介したファイトプラズマの野生型個体への感染＝＝
シロイヌナズナ(A. thaliana、ecotype Col-0)は２５℃に保たれたチャンバーで生育させた。4〜5枚のロゼット葉を有する成長段階の個体を透明な管で覆った。5匹のＯＹファイトプラズマ感染ヨコバイ（M. striifrons）を、植物を覆ったこの管の中に５日間放虫することによって野生型シロイヌナズナをファイトプラズマに感染させた。
【００４７】
上記表1に示した症状を発現するＴｅｎｇｕトランスジェニック個体の一例を、ヨコバイを介してファイトプラズマを感染させた個体、非感染個体、及びＧＵＳトランスジェニック個体の各一例と比較した結果を図３に示す。
【００４８】
ヨコバイを介してファイトプラズマを感染させた個体（ＢおよびＣ）では、非感染野生型個体（Ａ）と比較して著しい矮化と分枝が見られた。一方、Ｔｅｎｇｕトランスジェニック個体(ｐＢＩ１２１−ＴＥＮＧＵ)もファイトプラズマを感染させた個体と同様の形態を示し、茎の節間が短くなって矮化し、不稔の花を呈する個体（Ｅ）や著しい分枝形成を示す個体（Ｆ）が観察された。なお、対照群であるＧＵＳトランスジェニック個体（Ｄ）では、非感染個体（Ａ）と同様、症状を示さなかった。
【００４９】
さらに、図４に示すように、ヨコバイを介してファイトプラズマが感染した個体（Ｇ〜Ｉ）およびＴｅｎｇｕトランスジェニック個体（Ｂ〜Ｅ）では一つの節から花芽を有する複数の枝を生じる症状（Ｂ〜Ｄ）、および、一つの節から複数の花芽を生じる症状（Ｄ）を呈し、不稔の花（生殖器を持たない）（Ｅ）も観察された。一方、対照群であるＧＵＳトランスジェニック個体（Ａ）および非感染野生個体（Ｆ）ではこれらの症状は観察できなかった。
【００５０】
このように、ＰＡＭ７６５ペプチドはファイトプラズマの引き起こす分枝形成、矮化、生殖器官形成不全(不稔)、および花芽複数形成を促進した。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の一実施例において、ｐＣＡＭＶベクターのみ（対照群、Ａ）、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドをコードするＤＮＡを導入したｐＣＡＭＶベクター（ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ、Ｂ）、または、ＰＡＭ４８６を導入したｐＣＡＭＶベクター（対照群、Ｃ）のいずれかをアグロバクテリウムを介して遺伝子導入したタバコを示した図である。
【図２】本発明の一実施例において、ｐＣＡＭＶベクターのみ（対照群、Ａ）またはＰＡＭ７６５ｏｙペプチドをコードするＤＮＡを導入したｐＣＡＭＶベクター（ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ、Ｂ）のいずれかアグロバクテリウムを介して遺伝子導入したタバコの葉の数を示した図である。なお、データは平均値+標準偏差で示す（＊ｐ＜０．０５）。Ｎ＝４ （ｐＣＡＭＶ）、Ｎ＝８ （ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ）。
【図３】本発明の一実施例において、ファイトプラズマ非感染野生型（Ａ）、ヨコバイ媒介感染（Ｂ、Ｃ）、ＧＵＳトランスジェニック（Ｄ）、Ｔｅｎｇｕトランスジェニック（Ｅ）のシロイヌナズナを示す。
【図４】本発明の一実施例において、ＧＵＳトランスジェニック（Ａ）、ヨコバイ媒介感染（Ｂ〜Ｅ）、ファイトプラズマ非感染野生型（Ｆ）、Ｔｅｎｇｕトランスジェニック（Ｇ〜Ｈ）のシロイヌナズナを示す。スケールバー、５０ｍｍ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物の分枝形成促進、矮化、不稔化、および花芽複数形成促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の生育調整や形態形成制御が可能となれば、光合成効率の向上や穂数増など農作物の収量増につなげることができる。また、園芸植物についても、形態的特徴を制御することによって付加価値の飛躍的向上が期待できる。従来は、変異原処理等を行うことによって植物の一連の形態形成関連遺伝子群の変異を促し、そのうち有用なものを選択して分子育種に使用することが一般的に行われていた。しかし、この方法では、その形質導入が品質や生育特性等の他の各種形質に及ぼす影響が未知であり、有用かつ実用的な遺伝子となり得るかどうかを予測することが困難であった。
【０００３】
ファイトプラズマ（Phytoplasma asteris）は７００種類以上の植物に感染し、特徴的な形態変化を引き起こす植物病原微生物である（例えば、非特許文献１参照）。その感染によって植物に見られる形態異常として、萎縮、分枝増加（叢生症状）、黄化、縮葉、花器官の葉への変換（葉化）、花器官のシュート構造への転換（突き抜け）等がある（例えば、非特許文献１参照）。これらは農業上重要病害であり、大きな被害をもたらしている。一方で、葉化症状を呈したアジサイ、叢生症状を呈したポインセチア等もファイトプラズマの感染によって引き起こされる病徴として知られているが（例えば、非特許文献２参照）、これらの形態異常植物個体はその形態のユニークさから植物の商品価値を高め、品種登録されて珍重されている。
【０００４】
以上のことから、病原微生物であるファイトプラズマの感染を利用して、植物個体の生育や形態を制御し、分枝形成や矮化等の有用形質を持たせることが可能であると考えられる。しかし、通常、ファイトプラズマの感染は媒介昆虫であるヨコバイ類を介して拡大するため（非特許文献３参照）、ファイトプラズマが感染した植物個体は、たとえ有用形質を持っていたとしても他植物個体における新たな病気の発生源となる恐れがあった。
【０００５】
【非特許文献１】Lee IM et al., Annual Review of Microbiology 54: 221-255 (2000)
【非特許文献２】Lee IM et al., Nature Biotechnology 15:178-182 (1997)
【非特許文献３】Suzuki S et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 103: 4252-4257 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、ファイトプラズマの感染を介さず、植物の分枝形成促進、矮化、不稔化、および花芽複数形成促進する方法、さらに植物の分枝形成を促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成促進する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ファイトプラズマ（Phytoplasma asteris）のＤＮＡ上にコードされると予測される遺伝子全てを一つずつ植物個体に発現させ、個体の形態変化を観察することによって、植物の分枝形成・矮化を促進するペプチド候補のスクリーニングを行った。その結果、分枝の増加および萎縮の形態異常を促進するＰＡＭ７６５ペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
なお、ここで、「分枝」とは、植物個体の主軸を形成する茎の節から生じた側芽が成長して形成された枝のことをいう。この枝は成長に伴い、茎構造に加えて葉や花を持つこともある。また、「花芽複数形成」とは植物の茎の一つの節から、分枝を伴わずに複数の花芽が形成されることであり、「花芽形成」とは花芽の創始、分化、および発達の過程を含む。
【０００９】
すなわち、本発明の植物の分枝形成促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成促進方法は、非組換えファイトプラズマを感染させることなく、ＰＡＭ７６５ペプチドを有するペプチドを植物個体に導入することを特徴とする。ＰＡＭ７６５ペプチドは、DQDDDIENVITLX4ETKENQTEX5IKX6QCQDLLQKGEKDA（配列番号１）、DQDDDIENVITLIETKENQTEQIKIQCQDLLQKGEKDA（配列番号２）またはDQDDDIENVITLTETKENQTEEIKMQCQDLLQKGEKDA（配列番号３）のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましく、配列番号１〜３において、数アミノ酸残基が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有し、植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または不稔化することのできるペプチドであってもよい。（なお、上記配列中、Ｘ４−６はいずれのアミノ酸であってもよい。）
【００１０】
本発明の植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成促進する方法は、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを該植物個体で発現させて行ってもよい。また、前記ＤＮＡの該植物個体における発現は、トランスジェニック植物を作成することにより行ってもよい。
【００１１】
本発明の植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化および／または植物の花芽複数形成促進方法する農薬組成物または薬剤は、ＰＡＭ７６５ペプチドまたはＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、非組換えファイトプラズマの感染を介さず、植物の分枝形成促進および／または矮化および／または不稔化する方法、さらに、植物の分枝形成を促進および／または矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成促進する薬剤を提供することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されない。
【００１４】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１６】
〈１．植物の分枝形成促進、植物を矮化、不稔化および花芽複数形成促進する方法〉
本発明による植物の分枝形成促進、植物を矮化、不稔化および花芽複数形成促進する方法は、非組換えファイトプラズマを感染させることなく、ＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体に導入することを特徴とする。
ここで、非組換えファイトプラズマとは、遺伝子組み換え技術を用いて作製したファイトプラズマ以外のファイトプラズマであって、例えば、野生型ファイトプラズマや自然突然変異を有するファイトプラズマが例示できる。
また、ＰＡＭ７６５ペプチドとは、長さが最大７０アミノ酸残基のペプチドを意味し、
（１）以下の配列番号４〜６のアミノ酸配列を有するペプチド、
MVKLX1KX2KX3KLLIFAGFWAILLFLNHNYLIFADQDDDIENVITLX4ETKENQTEX5IKX6QCQDLLQKGEKDA（配列番号４）（式中、Ｘ１−６はいずれのアミノ酸でもよいが、Ｘ１はＫかＱ，Ｘ２はＨかＤ，Ｘ３はＡかＶ、Ｘ４はＩまたはＴ、Ｘ５はＱまたはＥ、Ｘ６はＩまたはＭであることが好ましい）
MVKLKKHKAKLLIFAGFWAILLFLNHNYLIFADQDDDIENVITLIETKENQTEQIKIQCQDLLQKGEKDA（配列番号５）
MVKLQKDKVKLLIFAGFWAILLFLNHNYLIFADQDDDIENVITLTETKENQTEEIKMQCQDLLQKGEKDA（配列番号６）
（２）以下の配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するペプチド、
DQDDDIENVITLX4ETKENQTEX5IKX6QCQDLLQKGEKDA（配列番号１）（式中、Ｘ４−６はいずれのアミノ酸でもよいが、Ｘ４はＩまたはＴ、Ｘ５はＱまたはＥ、Ｘ６はＩまたはＭであることが好ましい）
DQDDDIENVITLIETKENQTEQIKIQCQDLLQKGEKDA（配列番号２）
DQDDDIENVITLTETKENQTEEIKMQCQDLLQKGEKDA（配列番号３）
（３）配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする遺伝子のホモログやオーソログがコードするペプチドのうち、配列番号２のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなる部分ペプチドを有するペプチド、
（４）配列番号１〜３のアミノ酸配列または（３）に記載の配列番号２のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、配列番号４〜６の一部のアミノ酸配列からなるペプチド、
（５）（１）から（４）に記載のいずれかのペプチドの配列において、数アミノ酸残基（例えば、１０アミノ酸残基、好ましくは、８アミノ酸残基、より好ましくは、６アミノ酸残基、さらに好ましくは４アミノ酸残基、さらに好ましくは２アミノ酸残基）が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有し、植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化することのできる変異ペプチドを意味するが、好ましくはＮ末端にメチオニンが付加された以下の変異ペプチド（配列番号７〜９）である。
MDQDDDIENVITLX1ETKENQTEX2IKX3QCQDLLQKGEKDA（配列番号７）
MDQDDDIENVITLIETKENQTEQIKIQCQDLLQKGEKDA（配列番号８）
MDQDDDIENVITLTETKENQTEEIKMQCQDLLQKGEKDA（配列番号９）
なお、（５）の変異ペプチドは、（１）〜（４）のペプチドにおいて、分枝形成促進活性、矮化促進活性、または不稔化促進活性に必要なアミノ酸に、変異が生じていないか、変異が生じていても分枝形成促進活性、矮化促進活性、または不稔化促進活性を失わせないような変異を有する変異ペプチドであり、当業者にとって（１）〜（４）のペプチドと均等物であることが明らかなペプチドのことを意味する。なお、これらのペプチドは、糖鎖修飾などの修飾がなされていてもよい。
【００１７】
本発明の方法を用いることのできる対象となる植物は、前記ＰＡＭ７６５ペプチドによって分枝形成、矮化、不稔化、または花芽複数形成を促進することができる植物種であれば特に制限がないが、onion yellows (ＯＹ)ファイトプラズマまたはAster yellows witches’-broom（ＡＹＷＢ）ファイトプラズマによって、疾患の表現系が現れる植物が好ましく、Nicotiana benthamiana、Arabidopsis thaliana、Chrysanthemum coronarium、Petunia hybridaが例示できる。
【００１８】
実施例に示すように、ＯＹファイトプラズマが有する、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドは、植物の分枝形成、矮化、不稔化および花芽複数形成を促進する活性を有する。一方、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドは、ＡＹＷＢファイトプラズマにおけるホモログであり、同じ活性を有すると考えられる。これらのペプチドにおいては、３ヶ所のアミノ酸残基（配列番号１におけるＸ1-3に相当する）が保存されておらず、従って、これらのアミノ酸残基は、植物の分枝形成、矮化、および不稔化を促進する活性には重要でないと考えられる。従って、それらのアミノ酸残基を特定していない配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドも、植物の分枝形成、矮化、不稔化または花芽複数形成を促進する活性を有すると考えられる。
【００１９】
ＰＡＭ７６５ペプチドの植物個体への導入方法は、特に限定されず、ＰＡＭ７６５ペプチド自体の導入、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを植物個体で発現させることによる導入、またはＰＡＭ７６５ペプチドを発現する細胞を移植することによる導入など、いずれの方法によって行ってもよい。なお、ＰＡＭ７６５ペプチドは分子量が顕著に小さいため、植物個体の一部に導入すれば、機能すべき場所に拡散する。従って、ＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体の一部に導入しても全体に導入してもかまわない。
【００２０】
〈２．ＰＡＭ７６５ペプチドの製造と植物個体への導入〉
上記のように、ＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体に導入するには、ＰＡＭ７６５ペプチド自体を植物個体に導入してもよい。
【００２１】
植物個体に導入するためのＰＡＭ７６５ペプチドは、その取得・調製法によって特に限定されず、天然由来のペプチドであっても、遺伝子組換え技術を用いて製造された組換えペプチドであっても、または周知の方法で化学合成したペプチドであってもよい。天然由来のペプチドは、タンパク質の単離・精製法を適宜組み合わせることにより、ＰＡＭ７６５ペプチドを発現しているファイトプラズマから取得することができる。あるいは、ファイトプラズマに感染した媒介昆虫や植物器官等から精製してもよい。ここで、ファイトプラズマの系統は、分枝形成を促進するか、矮化を引き起こすか、不稔化を引き起こすか、または花芽複数形成を促進するものであれば、特に制限はない。化学合成により本発明に係るペプチドを調製する場合には、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やｔＢｏｃ法（ｔ-ブチルオキシカルボニル法）等の当業者に周知の化学合成法に従って製造することができる。また、各種市販のペプチド合成機を利用してＰＡＭ７６５ペプチドを製造することもできる。遺伝子組換え技術によりペプチドを調製する場合には、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を好適な発現ベクターに導入した後、培養細胞等の宿主を形質転換し、ペプチドを発現させればよい。
【００２２】
このようにして得られるＰＡＭ７６５ペプチドを植物体に導入する方法は特に限定されず、注射器等で、葉等の植物個体の一部に注入してもよく、維管束内に注入してもよい。
【００２３】
〈３．ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを植物個体で発現させることによる、ＰＡＭ７６５ペプチドの植物個体への導入〉
上記のように、ＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体に導入するには、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを植物個体で発現させてもよい。
【００２４】
ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを植物個体で発現させるため、まず、ＰＡＭ７６５をコードするＤＮＡを植物細胞で発現させるための適切なプロモーターの下流に挿入した発現ベクターを作製する。この発現ベクターを生体植物に導入するか、あるいは、生体植物から単離した組織、器官、または、植物由来の株化細胞、カルスに導入した後、植物個体に再生することによって、植物個体へＰＡＭ７６５ペプチドを導入することができる。
【００２５】
ＤＮＡを植物個体で発現させる方法においては、まず、当業者に周知の方法を用い、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを発現ウイルスベクターに組込み、組換えウイルスベクターを作成する。ここで、使用するウイルスベクターは、例えばｐＣＡＭＶ(ポテトウイルスＸベクター)等を用いることができるが、特に制限されない。
【００２６】
このようにして作製した組換えウイルスベクターを植物個体に導入する。この工程は、生体植物を用いる方法、あるいは、植物から単離した組織、器官、もしくは、植物由来株化細胞、カルスを用いる方法、から選択できる。以下、各々について詳細に説明する。
【００２７】
まず、生体植物を用いて組換えウイルスベクターを植物に導入する方法としては、例えば、アグロバクテリウムを介するアグロバクテリウム法が挙げられる。アグロバクテリウム法では、例えばエレクトロポーテーション法（Nagel et al., Microbiology Letters, 67:325, 1990）等の当業者に周知の方法を用いて、組換えウイルスベクターをアグロバクテリウムに導入する。
【００２８】
次いで、組換えウイルスベクター導入アグロバクテリウムを浸漬バッファーに懸濁したアグロバクテリウム菌液を作製し、生体植物の一部または全体を浸漬する（Gelvin et al., Molecular Biology Manual, Academic Press Publishers; Cough & Bent, The Plant Journal, 16:735-743, 1996）。これによって、浸漬した生体植物の部分の細胞にＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを導入することができ、その場所で、ＰＡＭ７６５ペプチドを発現・分泌させることができる。
【００２９】
あるいは、前記組換えウイルスベクターを、エレクトロポーテーション法やパーティクルガン法等の当業者に周知の方法を用いて生体植物個体の細胞に直接導入することができる。これによって、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを導入されたこの細胞においてＰＡＭ７６５ペプチドを発現させることができる。
【００３０】
一方、植物由来の組織、器官、株化細胞、カルスなどの培養下にある細胞を用いて、組換えベクターを植物個体に導入する場合、アグロバクテリウムを介して、あるいは、直接、前記植物由来細胞に組換えウイルスベクターを導入することにより、まず、ＰＡＭ７６５ペプチド発現する形質転換細胞を作製する。
【００３１】
アグロバクテリウムを介する場合、上記のような培養下にある細胞を組換えウイルスベクター導入アグロバクテリウムと共培養し、アグロバクテリウムをそれらの細胞に導入することにより、形質転換細胞を作製する。一方、組換えウイルスベクターを直接細胞に導入する場合、培養下にある細胞に対し、エレクトロポーテーション法、パーティクルガン法等の当業者に周知の方法を用いればよい。
【００３２】
得られた形質転換細胞はＰＡＭ７６５ペプチドを発現する。この形質転換細胞を、常法に従って植物体再生用の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン等）を添加した培地で培養することによって植物体に再生することができる。このようにして、個体全体の細胞が、ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを有するトランスジェニック植物を得ることができる。このＤＮＡは、ＰＡＭ７６５ペプチドの上流に付加されているプロモーターの制御下で、このペプチドを発現する。あるいはＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えウイルスを植物体の一部に導入すると、組換えウイルスが植物体全体に移行し、全身でこのペプチドを発現するようになる。
【００３３】
〈４．植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成を促進する薬剤〉
本発明に係る植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または不稔化および／または花芽複数形成するための農薬組成物は、ＰＡＭ７６５ペプチド、またはＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子のいずれか、もしくはこれらのうち2つ以上の組み合わせを含有する。この農薬組成物は、当業者に周知の製剤用添加物を用いて、剤形化することができるが、その形態は特に限定されず、例えば、乳剤、液剤、油剤、水溶剤、水和剤、フロアブル剤、粉剤、微粒剤、粒剤、エアロゾール、くん蒸剤、ペースト剤等の形態にすることができる。この薬剤には、殺虫剤、殺菌剤、殺虫殺菌剤、除草剤などの他の農薬の有効成分を配合してもよい。なお、この、植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または不稔化する薬剤の適用方法および適用量は、適用目的、剤型、適用場所などの条件に応じて当業者が適宜選択可能である。
【実施例】
【００３４】
〈実施例１〉
本実施例では、ファイトプラズマのＰＡＭ７６５ペプチドが植物の分枝形成および矮化を促進することを示す。
【００３５】
＝＝ＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子の植物個体への導入＝＝
植物の分枝形成および矮化を促進するＯＹファイトプラズマ由来のＰＡＭ７６５ｏｙペプチド（配列番号８）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１０）をＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ここでは、鋳型として、ファイトプラズマ感染植物よりcetyltrimethylammonium bromide法（Namba et al., Phytopathology, 83:786-791, 1993）によって抽出した全ＤＮＡを用いた。ＰＣＲプライマーは、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
プライマーＳ1：acgcgtcgacATGGACCAAGATGATGATATTGAAAACGTGATAACTC（配列番号１１）
プライマーＡＳ１：tgacccgggTTAGGCATCTTTCTCGCCCTTTTGCAATAAATCTTGACA（配列番号１２）
【００３６】
ＰＣＲ産物を制限酵素（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ）で切断し、ｂｉｎａｒｙポテトウイルスＸ（ＰＶＸ）ベクター（ｐＣＡＭＶ、ｐＣＡＭＶはアグロバクテリウムのｂｉｎａｒｙベクターｐＣＡＭＢＩＡにＰＶＸのｃＤＮＡ ｐＰ２Ｃ２Ｓ (Baulcombe DC, Chapman S, Santa Cruz S, The Plant Journal 7:1045-1053 1995)を挿入したもの）のマルチクローニングサイトに挿入することにより、ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ組換えウイルスベクターを作製した。このｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ組換えウイルスベクターを、アグロバクテリウム（A. tumefaciens）ＥＨＡ１０５系統にエレクトロポレーション法によって導入した。対照群として、挿入ＤＮＡを持たないｐＣＡＭＶベクター、および、異なるペプチドＰＡＭ４８６をコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターであるｐＣＡＭＶ−ＰＡＭ４８６を、上記と同様にアグロバクテリウムに導入した。
【００３７】
アグロバクテリウムは、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加した選択培地を用いて選択し、その後、菌濃度が０．８（ＯＤ６００）になるまで２８℃で培養した。このアグロバクテリウムを、浸漬バッファー（１０ ｍＭ morpholineprapanesulfonic acid、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０μＭ acetosyrigone、 ｐＨ５．６）に菌濃度０．８（ＯＤ６００）で懸濁し、このアグロバクテリウム懸濁液に双葉を有した３週齢のタバコ（N. benthamiana）の植物個体を浸漬することにより、タバコにアグロバクテリウムを感染させた。こうして得られた感染タバコ個体を２５℃に保たれたチャンバーで生育させ、成長後の感染タバコ個体を観察した（図１）。なお、感染個体で、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドをコードする遺伝子が実際に発現していることは、ＲＴ−ＰＣＲで確認した。
【００３８】
図1に示すように、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドが導入された個体（Ｂ：ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ）は、対照個体（Ａ： ｐＣＡＭＶベクターのみ、Ｃ： ｐＣＡＭＶ−ＰＡＭ４８６）と比較して分枝が著しく促進され、矮小化した。この分枝形成はファイトプラズマの感染により特徴的に引き起こされる分枝形成と同様であった。
【００３９】
また、図２に示すように、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドが導入された個体（ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ）では、対照個体（ｐＣＡＭＶ）と比較して、優位に葉数が多かった。
【００４０】
このように、ＰＡＭ７６５ペプチドは、植物の分枝形成および矮化を促進する活性を有する。しかも、生体植物の一部でＰＡＭ７６５ペプチドを発現させるだけで、個体全体にその効果が生じる。
【００４１】
〈実施例２〉
本実施例では、ＰＡＭ７６５トランスジェニック植物個体が、ファイトプラズマ感染野生個体と同様に分枝促進、矮化、不稔、および花芽複数形成の症状を呈することを示す。
【００４２】
＝＝トランスジェニック植物の作製＝＝
ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドを発現するＴｅｎｇｕトランスジェニックシロイヌナズナ（A. thaliana）の作製方法を以下に述べる。
まず、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１０）をＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応の鋳型として、前記実施例１と同様に作製した全ＤＮＡを用い、プライマーは、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
プライマーＳ２：cgggatcctggtcagtcccttATGGACCAAGATGATGATATTGAAAACG（配列番号１３）
プライマーＡＳ２：cgagctcTTAGGCATCTTTCTCGCCCTTTTGCAATAAATCTTGACA（配列番号１４）
【００４３】
ＰＣＲ産物を制限酵素（ＢａｍＨＩ、 ＳａｃＩ）で切断し、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを有するｂｉｎａｒｙベクターｐＢＩ１２１（Clontech社）のマルチクローニングサイトに挿入することにより、ｐＢＩ１２１−ＴＥＮＧＵ組換えウイルスベクターを作製した。次いで、得られた組換えプラスミドベクター(ｐＢＩ１２１−ＴＥＮＧＵ)をエレクトロポレーション法を用いてアグロバクテリウムＥＨＡ１０５系統に導入した。対照群として、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）タンパク質をコードする遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）を挿入した組換えベクター（ｐＢＩ１２１−ＧＵＳ）（Clontech社)を、同様にしてアグロバクテリウムＥＨＡ１０５系統に導入した。
【００４４】
これらのアグロバクテリウムを用い、ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ法（Cough & Bent, The Plant Journal, 16:735-743, 1996）によりシロイヌナズナ（A. thaliana、ecotype Col-0）を形質転換した。形質転換体は、Ｔ１植物の種子をカナマイシン選択培地（ムラシゲ・スクーグ培地用塩類(和光社)、ＭＳビタミン（Ｓｉｇｍａ社）、１％ショ糖、０．７ ％寒天、５０μｇ／ｍｌカナマイシン）に播種することにより選択した。なお、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドをコードする遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ法によって確認した。
【００４５】
Ｔｅｎｇｕトランスジェニック群（Ｎ＝８７）、およびＧＵＳトランスジェニック対照群（Ｎ＝２５）において、発芽後１ヶ月後に各個体を観察し、症状を発現する個体及び正常個体を計数した。表１に、その計測結果を示す。
【表１】
表１より明らかなように、ＧＵＳトランスジェニック対照群では症状を呈する個体が全く観察されなかったが、Ｔｅｎｇｕトランスジェニック群では２７．６％の個体が症状を呈し、分枝促進および／または矮化率が有意に高かった（Ｆｉｓｈｅｒの直接確率法）。
【００４６】
＝＝ヨコバイを介したファイトプラズマの野生型個体への感染＝＝
シロイヌナズナ(A. thaliana、ecotype Col-0)は２５℃に保たれたチャンバーで生育させた。4〜5枚のロゼット葉を有する成長段階の個体を透明な管で覆った。5匹のＯＹファイトプラズマ感染ヨコバイ（M. striifrons）を、植物を覆ったこの管の中に５日間放虫することによって野生型シロイヌナズナをファイトプラズマに感染させた。
【００４７】
上記表1に示した症状を発現するＴｅｎｇｕトランスジェニック個体の一例を、ヨコバイを介してファイトプラズマを感染させた個体、非感染個体、及びＧＵＳトランスジェニック個体の各一例と比較した結果を図３に示す。
【００４８】
ヨコバイを介してファイトプラズマを感染させた個体（ＢおよびＣ）では、非感染野生型個体（Ａ）と比較して著しい矮化と分枝が見られた。一方、Ｔｅｎｇｕトランスジェニック個体(ｐＢＩ１２１−ＴＥＮＧＵ)もファイトプラズマを感染させた個体と同様の形態を示し、茎の節間が短くなって矮化し、不稔の花を呈する個体（Ｅ）や著しい分枝形成を示す個体（Ｆ）が観察された。なお、対照群であるＧＵＳトランスジェニック個体（Ｄ）では、非感染個体（Ａ）と同様、症状を示さなかった。
【００４９】
さらに、図４に示すように、ヨコバイを介してファイトプラズマが感染した個体（Ｇ〜Ｉ）およびＴｅｎｇｕトランスジェニック個体（Ｂ〜Ｅ）では一つの節から花芽を有する複数の枝を生じる症状（Ｂ〜Ｄ）、および、一つの節から複数の花芽を生じる症状（Ｄ）を呈し、不稔の花（生殖器を持たない）（Ｅ）も観察された。一方、対照群であるＧＵＳトランスジェニック個体（Ａ）および非感染野生個体（Ｆ）ではこれらの症状は観察できなかった。
【００５０】
このように、ＰＡＭ７６５ペプチドはファイトプラズマの引き起こす分枝形成、矮化、生殖器官形成不全(不稔)、および花芽複数形成を促進した。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の一実施例において、ｐＣＡＭＶベクターのみ（対照群、Ａ）、ＰＡＭ７６５ｏｙペプチドをコードするＤＮＡを導入したｐＣＡＭＶベクター（ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ、Ｂ）、または、ＰＡＭ４８６を導入したｐＣＡＭＶベクター（対照群、Ｃ）のいずれかをアグロバクテリウムを介して遺伝子導入したタバコを示した図である。
【図２】本発明の一実施例において、ｐＣＡＭＶベクターのみ（対照群、Ａ）またはＰＡＭ７６５ｏｙペプチドをコードするＤＮＡを導入したｐＣＡＭＶベクター（ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ、Ｂ）のいずれかアグロバクテリウムを介して遺伝子導入したタバコの葉の数を示した図である。なお、データは平均値+標準偏差で示す（＊ｐ＜０．０５）。Ｎ＝４ （ｐＣＡＭＶ）、Ｎ＝８ （ｐＣＡＭＶ−ＴＥＮＧＵ）。
【図３】本発明の一実施例において、ファイトプラズマ非感染野生型（Ａ）、ヨコバイ媒介感染（Ｂ、Ｃ）、ＧＵＳトランスジェニック（Ｄ）、Ｔｅｎｇｕトランスジェニック（Ｅ）のシロイヌナズナを示す。
【図４】本発明の一実施例において、ＧＵＳトランスジェニック（Ａ）、ヨコバイ媒介感染（Ｂ〜Ｅ）、ファイトプラズマ非感染野生型（Ｆ）、Ｔｅｎｇｕトランスジェニック（Ｇ〜Ｈ）のシロイヌナズナを示す。スケールバー、５０ｍｍ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化および／または植物の花芽複数形成促進方法であって、
非組換えファイトプラズマを感染させることなく、ＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体に導入することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＰＡＭ７６５ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＡＭ７６５ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、数アミノ酸残基が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有し、
植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化および／または植物の花芽複数形成促進することのできるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、
前記ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを該植物個体で発現させることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを用いてトランスジェニック植物を作製することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化および／または植物の花芽複数形成促進するための農薬組成物であって、
ＰＡＭ７６５ペプチド、またはＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子を含有することを特徴とする農薬組成物。
【請求項７】
植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化および／または植物の花芽複数形成促進するための薬剤であって、
ＰＡＭ７６５ペプチド、またはＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子を含有することを特徴とする薬剤。
【請求項１】
植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化および／または植物の花芽複数形成促進方法であって、
非組換えファイトプラズマを感染させることなく、ＰＡＭ７６５ペプチドを植物個体に導入することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＰＡＭ７６５ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＡＭ７６５ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において、数アミノ酸残基が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有し、
植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化および／または植物の花芽複数形成促進することのできるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、
前記ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを該植物個体で発現させることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記ＰＡＭ７６５ペプチドをコードするＤＮＡを用いてトランスジェニック植物を作製することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化および／または植物の花芽複数形成促進するための農薬組成物であって、
ＰＡＭ７６５ペプチド、またはＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子を含有することを特徴とする農薬組成物。
【請求項７】
植物の分枝形成を促進および／または植物を矮化および／または植物を不稔化および／または植物の花芽複数形成促進するための薬剤であって、
ＰＡＭ７６５ペプチド、またはＰＡＭ７６５ペプチドをコードする遺伝子を含有することを特徴とする薬剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−４３０２４（Ｐ２０１０−４３０２４Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０８１５２（Ｐ２００８−２０８１５２）
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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