標的認識分子および標的認識分子を固定化する方法
【課題】特定物質に特異的に反応する標的認識分子であって、分析チップの所定箇所に自己集合的に高密度に集合させることができ、またそこに可逆的または不可逆的安定的に固定化することのできる新規な帯電性標的認識分子を提供する。
【解決手段】標的物質を特異的に識別する認識部位としての標的認識ペプチドセグメント（１）と、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電し得る３個以上の帯電性官能基を備え且つ異なる極性に帯電する官能基を有しない帯電性セグメント（３）と、前記標的認識ペプチドセグメント（１）と前記帯電性セグメント（３）のそれぞれに化学結合して両者を連結する連結セグメント（２）と、を有する標的認識分子。
【解決手段】標的物質を特異的に識別する認識部位としての標的認識ペプチドセグメント（１）と、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電し得る３個以上の帯電性官能基を備え且つ異なる極性に帯電する官能基を有しない帯電性セグメント（３）と、前記標的認識ペプチドセグメント（１）と前記帯電性セグメント（３）のそれぞれに化学結合して両者を連結する連結セグメント（２）と、を有する標的認識分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定物質に特異的に反応する感応部位を有する標的認識分子に関し、特に分析チップの特定部位に自己集合的に高密度に集合させ固定化させることのできる帯電性が付与された標的認識分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、チップ内に標的認識分子が固定化されてなる分析チップが、タンパク質などの生体成分の分析に用いられるようになっている。
【０００３】
分析チップの標的認識分子としては、特定物質に対し特異的選択的に反応する物質が使用されており、従来、天然由来の抗体が使用されていたが、最近では長期保存性、生産性などの観点から、合成ペプチドなどからなる人工抗体が用いられるようになっている。
【０００４】
特定物質に対し特異的選択的に反応する物質を備えたこの種の分析チップは、操作が簡単で分析に高度な錬度を必要としない。また、標的物質を少ない検体量でもって短時間に測定できるという利点を有する。その一方、チップ内の所定箇所に必要量の標的認識分子を適正に固定化し保持させるのが容易でないなどのため、必ずしも十分な測定精度や信頼性、再現性が得られていない。
【０００５】
標的認識分子の固定化方法については、従前より種々な方法が提案されている。例えば、基材表面に標的認識分子を物理吸着させる方法や共有結合させる方法が知られている。また、標的認識分子を微小ビーズの表面に固定化し、これをマイクロ流路内に配置する方法が知られている。更にまた、下記先行技術文献に記載の方法などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７-５０４４７１号公報
【特許文献２】特開２００３-３４４３９６号公報
【特許文献３】特開２００６-２６６８３１号公報
【特許文献４】特表平４-５０１６０５号公報
【特許文献５】特開２０００-２６６７１６号公報
【特許文献６】特開２００６−７１３２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特定物質に対し特異的選択的に反応する物質を具備させてなる分析チップにおいては、標的認識分子の固定化密度や固定化状態の良否により分析性能が大きく左右され、また固定化効率により分析チップの生産性が大きく左右される。本発明の目的は、標的認識分子自体に高密度に固定化する機能を付与した新規な標的認識分子を提供することにある。また、標的認識分子を効率よく基材に固定化する技術を提供することにある。
【０００８】
分析チップの製造において、標的認識分子の固定化効率が低いと、原材料としての標的認識分子を多く使用する必要がある。標的認識分子の無駄はコスト上昇を招くとともに、低い固定化率は生産性を低下させる原因となる。また、固定化密度が低いと、十分な分析感度が得られない。また、個々の分析チップ間で固定化密度に差があると、分析チップに対する信頼性が大きく低下する。それゆえ、チップ内の所定部位に標的認識分子を迅速かつ高密度に、しかも再現性よく固定化できる手段が求められている。
【０００９】
更にまた、標的認識分子が化学的物理的安定性に乏しいものである場合、この物質を固定化してなる分析チップは、短時に使用不能になるという問題がある。この問題を解決する方法の一つは、分析時にその場で標的認識分子を固定化する方法であるが、このためには、分析現場で簡便に固定化し得る手段が必要である。
【００１０】
本発明者は、これらの課題を解決すべく鋭意検討を行い、標的認識分子自身を高密度固定化が可能な分子とする本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、分子中に帯電性セグメントが組み込まれた新規な標的認識分子に関し、一群の発明は次のように構成されている。
【００１２】
（１）第１発明にかかる標的認識分子は、標的物質を特異的に識別する認識部位としての標的認識ペプチドセグメントと、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する帯電性官能基を備えた帯電性セグメントと、前記標的認識ペプチドセグメントと前記帯電性セグメントのそれぞれに化学結合して両者を連結する連結セグメントと、を有することを特徴とする。
【００１３】
（２）第２発明は、上記第1発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメン
トが、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する３個以上の帯電性官能基を備えることを特徴とする。
【００１４】
（３）第３発明は、上記第1または第２の発明にかかる標的認識分子において、前記標
的認識ペプチドセグメントの等電点が、６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、ｐＨ７以上の水溶液中でマイナスに帯電する官能基であることを特徴とする。
【００１５】
（４）第４発明は、上記第１または第２の発明にかかる標的認識分子において、前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が、８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、ｐＨ７以下の水溶液中でプラスに帯電する官能基であることを特徴とする。
【００１６】
ここで、上記「同一極性の電荷に帯電する３個以上の帯電性官能基を備えた」とは、同一の官能基を３個以上備えたものでもよく、３種類以上の異なる官能基を３個以上備えたものであってもよい。また、「標的認識ペプチドセグメントの等電点」とは、標的認識ペプチドセグメントを組成する個々のアミノ酸残基に対応するアミノ酸の等電点を合算した総和値をアミノ残基数で割った値（平均値）で定義される等電点（平均等電点）をいう。個々のアミノ酸の等電点は表１に示す通りとする。
【００１７】
【表１】
【００１８】
（５）第５の発明は、上記第1ないし第４の何れかの発明にかかる標的認識分子におい
て、前記帯電性セグメントが、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する３個以上の帯電性官能基を備え、かつ異なる極性に帯電する官能基を有しないものであることを特徴とする。
【００１９】
ここで、本発明にかかる標的認識分子の使用態様を説明し、この説明を通して、一群の本発明構成の技術的意義を明らかにする。
【００２０】
本発明標的認識分子は、電場に集まる性質が増強されているので、この性質を利用して所望の固定化部位に標的認識分子を集合させ保持させることができる。例えば、マイクロ流路を形成してなる分析チップにおいて、標的認識分子を集合保持させたい箇所に電極を形成しておき、この電極に電圧を印加し、プラス又はマイナスの電荷を与え、この状態で、流路内に標的認識分子を溶解した標的認識分子含有溶液を流すことにより、固定化部位である電極表面に標的認識分子を効率よく集合させ且つそこに可逆的にまたは不可逆的に固定化することができる。以下、この点について説明する。
【００２１】
第５発明にかかる標的認識分子は、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する３個以上の帯電性官能基を備え、かつ異なる極性に帯電する官能基を有しない。よって、この標的認識分子を溶液に溶かすと、帯電性セグメントが同一の電荷を帯びる。それゆえ、電荷が付与された固定化部位（電極）上に本発明標的認識分子含有溶液を流すと、標的認識分子が電極表面に静電相互作用により引っぱられ、そこに高密度に捕集される。この高密度な集合状態は電極に電荷が印加されている限り保持される。すなわち、固定化部位に標的認識分子が可逆的に固定化される。
【００２２】
上記を更に詳しく説明する。標的認識ペプチドセグメントの等電点が６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基を備えた標的認識分子を、例えばｐＨ８のキャリア溶液に溶かすと、標的認識ペプチドセグメントおよび帯電性セグメントともにマイナスに帯電する。ここで第３発明と第５発明の双方の要件を満たす帯電性セグメントは、等電点が６以下であり、その帯電性官能基がｐＨ７以上の水溶液中でマイナスに帯電する官能基であり、かつ同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する３個以上の帯電性官能基を備え、しかも異なる極性に帯電する官能基を有しないので、帯電性セグメントのマイナス電荷密度が十分に高い。よって、電極にプラス電荷を印加すると、帯電性セグメント部分が電極に引き付けられ、電極表面に捕集される。
【００２３】
他方、第４発明と第５発明の双方の要件を満たす帯電性セグメントは、標的認識ペプチドセグメントの等電点が８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基を備え、しかも異なる極性に帯電する官能基を有しないので、この標的認識分子を、例えばｐＨ６のキャリア溶液に溶かすと、標的認識ペプチドセグメントおよび帯電性セグメントともにプラスに帯電し、その電荷密度が十分に高い。よって、電極にマイナス電荷を印加すると、帯電性セグメント部分が電極に引き付けられ、電極表面に捕集されることになる。
【００２４】
上記構成の標的認識分子においては、連結セグメント および／または 帯電性セグメントは、固定部位（電極面）と標的認識ペプチドセグメントの距離を保つスペーサとして機能すると共に、標的認識ペプチドセグメントの自由度を確保するアームとして機能する。それゆえ、分子の一端が電極に固定化された状態においても、標的物質に対する特異的認識能を十分に発揮する。
【００２５】
（６）第６発明は、上記第５の発明にかかる標的認識分子において、前記標的認識ペプチドセグメントがシステイン残基を含み、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されていることを特徴とする。
【００２６】
（７）また、第７発明は、上記第１ないし第５の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記標的認識ペプチドセグメントの一方端がシステイン残基であり、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されていることを特徴とする。
【００２７】
（８）また、第８発明は、上記第１ないし第６の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記連結セグメントが前記標的認識ペプチドセグメントの末端のアミノ酸残基に化学結合され、当該化学結合部位と異なる連結セグメント部位に前記帯電性セグメントが化学結合されていることを特徴とする。
【００２８】
この構成であると、連結セグメントや帯電性セグメントによって、標的認識ペプチドセグメントの標的物質に対する特異性が阻害され難い。すなわち、標的認識ペプチドセグメントに、標的物質を選別する機能を発揮させ易い。
【００２９】
（９）また、第９発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントが、３個以上のアミノ酸残基を有するペプチドからなることを特徴とする。
【００３０】
（１０）また、第１０発明は、上記第９の発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントとしてのペプチドは、アルギニン、リシンからなる群から１つ以上選択された塩基性アミノ酸残基を３個以上含み、かつ、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基を含まないことを特徴とする。
【００３１】
この構成にかかる帯電性セグメントは、等電点が高い特定の塩基性アミノ酸残基を３個以上含んでなり、等電点が低い酸性アミノ酸残基を含まないので、弱アルカリ性から酸性側の溶液中において強くプラス電荷を帯びる。よって、この構成の標的認識分子は、弱アルカリ性から酸性の溶液を用いる標的物質分析に都合がよい。
【００３２】
（１１）また、第１１発明は、上記第９発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントとしてのペプチドは、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から１つ以上選択された酸性アミノ酸残基を３個以上含み、かつ、アルギニン残基及びリシン残基を含まないことを特徴とする。
【００３３】
この構成にかかる帯電性セグメントは、等電点が低い特定された酸性アミノ酸残基を３個以上含んでなり、等電点が高い塩基性アミノ酸を含まないので、弱酸性からアルカリ性の溶液中で強くマイナス電荷を帯びる。よって、この構成の標的認識分子は、弱アルカリ性から酸性の溶液を用いる標的物質分析に都合がよい。
【００３４】
（１２）また、第１２発明は、上記第９ないし第１１の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントを構成するアミノ酸残基の数が、前記標的認識ペプチドセグメントを構成するアミノ酸残基の数よりも多いことを特徴とする。
【００３５】
標的認識ペプチドセグメントは、通常、酸性アミノ酸やアルカリ性アミノ酸、中性アミノ酸が混合されたペプチドからなる。よって、アミノ酸残基数が、標的認識ペプチドセグメントよりも帯電性セグメントの方が多ければ、偏在させたアミノ酸配列からなる帯電性セグメントの方がより強く帯電するので、その役割を果すことができる。
【００３６】
（１３）また、第１３の発明は、上記第1ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識
分子において、前記帯電性セグメントが、ｎが３以上１５０の化１で表されるポリアクリル酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００３７】
【化１】
【００３８】
（１４）また、第１４発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントが、ｎが３以上１５０の化２で表されるポリスチレンスルホン酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００３９】
【化２】
【００４０】
（１５）また、第１５発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントが、ｎが３以上１５０の化３で表されるポリエチレンイミン構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００４１】
【化３】
【００４２】
（１６）また、第１６発明は、上記第1ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分
子において、前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０の化４で表されるポリアリルアミン塩酸塩構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００４３】
【化４】
【００４４】
（１７）また、第１７発明は、上記第１ないし第７の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０の化５で表されるポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００４５】
【化５】
【００４６】
（１８）また、第１８発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０の化６で表されるポリビニルピリジン構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００４７】
【化６】
【００４８】
（１９）また、第１９発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０の化７で表されるポリビニル硫酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００４９】
【化７】
【００５０】
（２０）また、第２０発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントが、ｎが１以上１５０以下の化８で表されるデキストラン硫酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００５１】
【化８】
【００５２】
（２１）また、第２１発明は、上記第1ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分
子において、前記帯電性セグメントが、ｎが１以上１５０以下の化９で表されるコンドロイチン硫酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００５３】
【化９】
【００５４】
（２２）また、第２２発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントが、ｎが３以上１５０以下の化１０で表されるヌクレオチド構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００５５】
【化１０】
【００５６】
リン酸、糖（リボース（ＲがＯＨ）又はデオキシリボース（ＲがＨ））、塩基（アデニン、シトシン、グアニン、チミン（デオキシリボースの場合のみ）、ウラシル（リボースの場合のみ））から構成されるヌクレオチドは、リン酸を有しているため、塩基性の溶液中でマイナス電荷を帯びる。よって、この構成の標的認識分子は、アルカリ性から弱酸性の溶液を用いる標的物質分析に都合がよい。なお、帯電性セグメントとして、一本鎖のポリヌクレオチド（ｓｓＤＮＡやＲＮＡ）を用いてもよく、二本鎖のポリヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）を用いてもよい。
【００５７】
上記化１〜化１０の構成単位を有する帯電性セグメントは「ｎ」を適当に選定することにより、標的認識ペプチドセグメントの特異的感応性を十分に発揮させることが可能になる。
【００５８】
（２３）また、第２３発明は、上記第１ないし２２の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記連結セグメントは、溶液中で帯電する官能基を有しないことを特徴とする。
【００５９】
この構成であると、帯電性セグメントの帯電性に影響を与えないので分子設計がし易い。
【００６０】
（２４）また、第２４発明は、上記第１ないし２３の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記標的認識ペプチドセグメントが、３個以上１９個以下のアミノ酸残基を有するペプチドからなることを特徴とする。
【００６１】
アミノ酸数が２以下のペプチドでは特異的な標的認識能力が得られにくいが、３個以上１９個以下のアミノ酸数であれば標的認識能を発揮するペプチドを構成することができる。また、３個以上１９個以下であれば、ペプチド合成が容易であり、この範囲の結合数のペプチドであると、標的認識分子としての取り扱い性がよい。
【００６２】
（２５）また、第２５発明は、上記第１ないし２４の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントに、更に、基材と結合させるための官能基を備えた基材結合用セグメントが化学結合されていることを特徴とする。
【００６３】
この構成の標的認識分子は次のように使用することができる。帯電性セグメントに更に基材結合用セグメントが結合された標的認識分子は、印加された電極表面などの電場で捕集される性質を備えるので、この標的認識分子溶液を固定部位に電極を配したマイクロ流路内に注入すると、標的認識分子が電極表面に高密度に集合する。この状態においては、基材と結合させるための官能基（基材結合基と称する）は電極表面に接触しているか、または電極表面の近傍に位置し、基材結合用セグメントの揺らぎよって電極表面に接触する。それゆえ、容易に固定化部位（電極表面）に結合させることができる。
【００６４】
つまり、上記構成の標的認識分子を用いると、確実かつ高密度に高密度な固定化を行うことができ、結合後は印加を止めても標的認識分子は固定化部位に保持されたままとなる。これにより、分析精度や信頼性に優れた分析チップが実現できることになる。
【００６５】
（２６）また、第２６発明は、上記第２５の発明にかかる標的認識分子において、前記連結セグメントが、一方端の結合可能部位で標的認識ペプチドセグメントと化学結合し、前記一方端の結合可能部位から最も離れた他方端結合可能部位で前記帯電性セグメントと化学結合し、前記帯電性セグメントが、前記連結セグメントと化学結合した部位から最も離れた結合可能部位で前記基材結合用セグメントと化学結合していることを特徴とする。
【００６６】
この構成であると、固定化部位と標的認識ペプチドセグメントとの距離が大きくなり、標的認識ペプチドセグメントの自由度が高まるので、標的認識機能が阻害され難い。
【００６７】
〔方法発明〕
第２７発明〜第２８発明は、上記した第１〜第２４発明にかかる標的認識分子を利用するための固定化方法に関し、第２９発明〜第３０発明は、上記した第２５〜第２６発明にかかる標的認識分子を利用するための固定化方法に関する。
【００６８】
（２７）第２７発明は、マイクロ流路内に電極が形成された分析チップに、上記３、５〜１５、１９〜２２の何れか１項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、を備える標的認識分子を固定化する方法である。
【００６９】
（２８）また、第２８発明は、マイクロ流路内に電極が形成された分析チップに、上記請求項４〜１２、１６〜１８の何れか１項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、を備える標的認識分子を固定化する方法である。
【００７０】
（２９）また、第２９発明は、マイクロ流路内に電極が形成された分析チップに、上記請求項２５または２６に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用セグメントと電極とを化学結合させる工程と、を備える標的認識分子を固定化する方法である。
【００７１】
（３０）また、第３０発明は、マイクロ流路内に電極が形成された分析チップに、上記請求項２５または２６に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用セグメントと電極とを化学結合させる工程と、を備える標的認識分子を固定化する方法である。
【００７２】
ここで、帯電性セグメントの帯電性官能基を十分に解離させるためには、上記第２５の発明及び第２６の発明においては前記溶液ｐＨを好ましくはｐＨ７．３以上とし、上記第２４の発明及び第２６の発明においては前記溶液ｐＨを好ましくはｐＨ６．５以下とするのがよい。
【発明の効果】
【００７３】
本発明標的認識分子は、標的物質に特異的に反応する標的認識ペプチドセグメントを一方端側に備え、マイナス又はプラスの何れかに帯電する帯電性セグメントを他方端側に備え、両セグメントが連結セグメントで連結された構造を有する化合物である。この構造の本発明標的認識分子は、標的認識ペプチドセグメントが分析対象となる標的物質を特異的に認識する性質を発揮し、帯電性セグメントが印加された電極（固定化部位）に高密度に集合する性質を発揮する。さらに連結セグメントと帯電性セグメントが、標的認識ペプチドセグメントの自由度の低下を防止し、標的認識ペプチドセグメントが特異的認識機能を十分に発揮できるように機能する。
【００７４】
このような本発明標的認識分子を用いると、簡単かつ確実に電極の形成された固定化部位に高密度に保持させることができ、この電気的保持による固定化は可逆的であるので、分析チップの使い勝手が大幅に向上する。また、標的認識分子の高密度な固定化が、分析チップの分析感度および精度を顕著に向上させる。
【００７５】
更に、帯電性セグメントに基材結合用セグメントが結合された本発明標的認識分子は、基材結合用セグメントが基材と結合する官能基を有するので、先ず固定化を望む部位に電圧を印加して標的認識分子を高密度に集め、この状態で基材結合用セグメントを介して標的認識分子と基材とを結合させることができる。基材結合用セグメントを介した結合は、電圧印加を解除しても解除されないので、一層確実な高密度固定化を簡便に行えるという顕著な効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、本発明標的認識分子の構成要素の繋がりを示す概念図である。
【図２】図２は、図１に示す標的分子が電極（固定化部位）に電荷間相互作用により保持された状態を示す概念図である。
【図３】図３は、基材結合セグメントを有する本発明標的認識分子の構成要素の繋がりを示す概念図である。
【図４】図４は、基材結合セグメントを有する本発明標的認識分子が電極（固定化部位）に電荷間相互作用により保持された状態を示す概念図である。
【図５】図５は、基材結合セグメントを有する本発明標的認識分子が基材である電極に化学結合された様子を示す概念図である。
【図６】図６は、本発明標的認識分子の適用対象である分析チップ装置の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本発明の実施するための実施の形態を、順次説明する。
【００７８】
〔第1実施例群〕
（実施例１-１）
［ペプチドセグメント］
標的認識ペプチドセグメント（標的認識用ＰＳと略記）として、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉ
ｎａｓｅ Ａ（ＰＫＡ）基質ペプチドを用意した。このもののアミノ酸配列は〈ＬＲＲＡ
ＳＬＧ〉であり、このものはセリン残基がリン酸化されている。また、下記表１および式１に基づいて算出した等電点（平均値）は７.３である。
【００７９】
【数１】
【００８０】
【表１】
【００８１】
［帯電性セグメント］
帯電性セグメントは、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）を８個連結したペプチド〈アミノ酸配列；ＤＤＤＤＤＤＤＤ〉とした。この帯電性セグメントの等電点（平均値）は、２.７７であり、親水性である。
【００８２】
［連結セグメント］
連結セグメントとしては、一般式化１１に示すポリエチレングリコール構成単位を５個（ｎ＝５）含むBis(NHS)PEG5 〔Bis-Ｎ−Succinimidyl−(pentaethyene-glycol) ester〕（化１２）を用いた。この一方端のスクシンイミド基（NHS）を上記標的認識ペプチドセグメントのN末端のアミノ酸残基のアミノ基に反応させ、他方端のスクシンイミド基を上記帯電性セグメントのＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基に結合させた。
【００８３】
【化１１】
【００８４】
【化１２】
【００８５】
この実施例１-１の標的認識分子を、化１３に示す。また、実施例１-１の標的認識分子（分子）の概念構成を図１に示す。
【００８６】
【化１３】
【００８７】
図１において、符号１が標的認識ペプチドセグメント、符号２が連結セグメント、符号３が帯電性セグメント、３’が帯電性セグメントの構成単位（この例ではアミノ酸残基）を表している。
【００８８】
なお、「・・・・」は構成単位の省略を意味している。この標的認識分子を溶かし、その溶液ｐＨを弱酸性ないしアルカリ性とすると、帯電性セグメント部分がマイナスに帯電するので、この溶液をプラスに帯電した電極面に接触させると、帯電性セグメント部分が電極表面に電気的に保持固定されることになる。図２は、電極面に標的認識分子が保持された様子を示している。
【００８９】
図６を用いて、この標的認識分子の使用態様の一例を説明する。図６は分析用マイクロ流路デバイスを用いた分析装置１０であり、符号１１は溶液注入口、１２は流路、１３は排出口、１４・１５は一対の電極、１６は検出器である。この装置を用いた分析法の基本的手順は次のようになる。
【００９０】
実施例１-１の標的認識分子を、例えばｐＨ７.３のリン酸緩衝生理食塩水からなるキャリア液に溶解させる。濃度は例えば１００uｇ／ｍＬとする。
【００９１】
次に、一対の電極（何れか一方の電極表面が固定化部となる）に直流電圧を印加した状態（例えば１〜１０Ｖとする）で、標的認識分子含有キャリア液を溶液注入口１１から注入し流路１２内を流す。上記したように実施例１-１の標的認識分子はｐＨ７.３の溶液中では、帯電性セグメントがマイナスに帯電するので、電極１４に吸引固定される。この状態で、上記キャリア液（標的認識分子を含まないもの）で流路内を洗浄する。これにより標的認識分子の固定化操作が終了する。
【００９２】
実施例１−１の標的認識分子は、電気的に電極面に固定化できる特性を有するので、電極への電圧印加の有無により、固定化と固定化解除を制御できる。よって、測定の場で固定化を行うことができる。また、無印加状態で流路内を洗浄することにより、容易に分析チップの再生利用を図ることができる。
【００９３】
また、実施例１−１の標的認識分子では、連結セグメントや帯電性セグメントが標的認識用ペプチドセグメンの自由度を担保する。よって、電極面に固定化することにより標的物質に対する認識性が損なわれないので、検液中に含まれる標的物質を高精度に捕捉することができる。
【００９４】
なお、固定化以降の操作は、非標識免疫測定法や標識免疫測定法（例えばサンドイッチアッセイ法など）の公知の分析法に準じればよい。また、検出器としては、例えば熱レンズ、表面プラズモン共鳴、水晶発振子などが使用でき、また、固定化部位である電極自体を電気化学的な検出器として利用することもできる。
【００９５】
また、上記電極１４の構成材料としては、例えば金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、チタン（Ｔｉ）などの金属、導電性プラスチックなどが使用でき、電極は、分析チップの作製時にこれらの材料を固定化予定部位に塗布する等して予め形成しておけばよい。
【００９６】
（実施例１−２）
実施例１の標的認識分子の帯電性セグメント〈アミノ酸配列；ＤＤＤＤＤＤＤＤ〉のＣ末端に常法にしたがって基材結合用セグメントとしてシステイン〈Ｃ〉を結合させた。この実施例１−２の標的認識分子を化１４に示す。
【００９７】
【化１４】
【００９８】
実施例１−２の標的認識分子は、システイン残基のチオール基（硫黄元素）を介して金電極表面と化学結合させることができる性質を有する。よって、金電極に電荷を印加した状態で標的認識分子含有溶液を流すことにより、金電極表面に高密度に標的認識分子を集めることができ、これが金（Ａｕ）電極面に化学結合する。一旦、電極表面に化学結合した後は、電極への印加を止めても、固定化状態が保持されることになる。
【００９９】
（実施例１−３）
実施例１-２においては、更にシステイン残基のチオール基に、（Ｎ−［4−（ｐ−Ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌａｍｉｄｏ） ｂｕｔｙｌ］−3´−（2´−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔ
ｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ）（ＡＰＤＰ；Ｔｈｅｒｍｏ社）を反応させ、末端に光架橋基であるアジド基を導入した。
【０１００】
［合成方法］
上記ＡＰＤＰのジスルフィド結合と、システインのＳＨ基とが反応（ジスルフィド交換）して、結合する。実施例１−３の標的認識分子の構造を化１５に示す。
【０１０１】
【化１５】
【０１０２】
上記化１５においては、システイン残基を含めたこれ以降の部分を基材結合用セグメントとすることとする。なお、この例では、帯電性セグメントが酸性アミノ酸からなり、システインも酸性アミノ酸であるので、システイン残基を含めた〈ＤＤＤＤＤＤＤＤ−Ｃ〉を帯電性セグメントとし、光架橋基（アジド基）と結合した、システイン残基のＳ以降を基材結合用セグメントとすることもできる。
【０１０３】
この実施例１−３の標的認識分子は、基材結合用セグメントが光架橋基（アジド基）を有するので、基材面にＵＶ長波長の光を照射することにより標的認識分子と基材とを化学結合（固定化）させることができる。
【０１０４】
（実施例１−４）
上記実施例１−３の（Ｎ−［4−（ｐ−Ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌａｍｉｄｏ） ｂｕｔｙｌ］−3´−（2´−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ）に代えて、Ｎ−（6−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（同
仁化学社）を用いて、システイン残基のチオール基にスクシンイミド基を導入した。
【０１０５】
この実施例にかかる標的認識分子は、分子末端にスクシンイミド基を有するので、アミノ基を持った基材面に化学結合（固定化）させることができる。
【０１０６】
例えばアミノ基を持った基材面を作製する方法としては、基板上に金薄膜を形成し、11-Amino-1-undecanethiol, hydrochloride（同仁化学社）を用いて金薄膜上にアミノ基末
端を持つＳＡＭ膜を形成する。
【０１０７】
実施例１−２〜実施例１−４の標的認識分子の概念構成を図３に示す。また、これらの分子が電荷の印加された電極面（基材面）に静電気的に吸着固定された様子を図４に示し、基材結合セグメントで基材面に化学結合され、かつ電極面への印加が解かれ標的分子が立ち上がった様子を図５に示す。
【０１０８】
図３〜５に示すように、実施例１−２〜実施例１−４の標的認識分子では、静電気的引力により分子を電極に集め、この状態で基材結合セグメントの官能基を電極面に結合させることができる。よって、高い固定化効率を実現することができる。また、電極面に化学結合させた後は、電極への通電を絶っても固定化状態が保持させるので、使い勝手が一段と向上する。
【０１０９】
〔第２実施例群〕
（実施例２−１）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉の末端にシステインを結合したもの〈配列；ＬＲＲＡＳＬＧＣ〉を用いた。
【０１１０】
他方、帯電性セグメントとしては、アルギニンを１０個結合したペプチド〈配列；ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ〉のＮ末端に、連結セグメントとしてシステイン〈Ｃ〉を結合したものを用いた。この帯電性セグメントの等電点（平均値）は、１０.１６である。
【０１１１】
連結セグメント材料として、下記化１６に示す、ポリエチレングリコール構成単位ｎが２のＭａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌを用いた。
【０１１２】
【化１６】
【０１１３】
［合成方法］
０．１ｍMの標的認識ペプチドセグメントにモル比１００倍の１０mM Ｍａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌ溶液（１０％ＤＭＳＯ含む）を反応させた。その後、未架橋のＭａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌを取り除き、０．１ｍMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端の
マレイミド基と標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のＳＨ基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのシステイン残基のＳＨ基とを、それぞれ結合反応させた。
このようにして化１７で表される実施例２-１の標的認識分子を作製した。
【０１１４】
【化１７】
【０１１５】
なお、下記化１８に示すように、上記化合物はｐＨ８を超える水溶液中では加水分解されることがあるが（加水分解位置により、以下に示す２つの形態をとり得る）、この場合であっても本願所定の機能を発揮する。
【０１１６】
【化１８】
【０１１７】
実施例２−１の標的認識分子は、帯電性セグメントをプラスに帯電させて使用するものであるので、キャリア溶液はアルカリから酸性の溶液を用いるのが好ましい。
【０１１８】
なお、システインの導入は、ペプチドセグメントと連結セグメント、及び連結セグメントと帯電性セグメントとの結合位置を末端とするためであり、システインを導入せずに、反応性のある官能基（例えば、アミノ基）の修飾によって、結合位置を末端としてもよい。
【０１１９】
また、上記帯電性セグメントの構成アミノ酸として、アルギニンに代え、塩基性アミノ酸であるリシン、又はリシンとアルギニンの双方を使用するのもよい。
【０１２０】
（実施例２−２）
上記実施例１−２と同様、標的認識分子の帯電性セグメント〈アミノ酸配列；ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ〉のＣ末端に、実施例１−２と同様に基材結合用セグメントとしてシステイン〈Ｃ〉を結合させた。この実施例２−２の標的認識分子の構造を化１９に示す。
【０１２１】
【化１９】
【０１２２】
（実施例２−３）
上記実施例１−３と同様にして、分子末端に光架橋基（アジド基）を導入した実施例２−３にかかる標的認識分子を作製した。実施例２−３の標的認識分子を化２０に示す。
【０１２３】
【化２０】
【０１２４】
（実施例２−４）
上記実施例１−４と同様にして、システイン残基のチオール基にスクシンイミド基を導入した実施例２−４にかかる標的認識分子を作製した。実施例２−４の標的認識分子の構造を化２１に示す。なお、Ｘは連結セグメント、Ｐはペプチドを示している。
【０１２５】
【化２１】
【０１２６】
〔第３実施例群〕
（実施例３）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１２７】
帯電性セグメントは、下記化１に示すポリアクリル酸構成単位（ｎ＝１４、Ｒ＝Ｎａ）
を有するものとした。
【０１２８】
【化１】
【０１２９】
連結セグメントとしては、ポリエチレングリコール構成単位を２個（ｎ＝２）含むNHS-PEG2-OHを用いた。この化合物のＯＨ基と、帯電性セグメントのカルボキシル基とをエス
テル結合させ、スクシンイミド基と標的認識ペプチドセグメントのアミノ基とを結合させた。
【０１３０】
実施例３の標的認識分子の構造を化２２に示す。
【０１３１】
【化２２】
【０１３２】
〔第４実施例群〕
（実施例４）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１３３】
帯電性セグメントは、下記化３に示すポリエチレンイミン構成単位（ｎ＝１４）を有するものとした。
【０１３４】
【化３】
【０１３５】
連結セグメントとしては、上記ポリエチレングリコール構成単位を５個（ｎ＝５）含むBis(ＮHS)PEG5 〔Bis-Ｎ−Succinimidyl−(diethyene-glycol) ester〕を用いた。
【０１３６】
実施例４の標的認識分子の構造を化２３に示す。
【０１３７】
【化２３】
【０１３８】
〔第５実施例群〕
（実施例５）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１３９】
帯電性セグメントとしては、化５で表されるポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド構成単位ｎ＝１４）を有するものとした。なお、帯電性セグメントに、連結セグメントと結合させるためのポリアクリル酸構成単位を導入した。
【０１４０】
【化５】
【０１４１】
連結セグメントとしては、ポリエチレングリコール構成単位を２個（ｎ＝２）含むＮＨＳ−ＰＥＧ２−ＯＨを用いた。この化合物のＯＨ基と、帯電性セグメントに導入したカルボキシル基とをエステル結合させ、スクシンイミド基と標的認識ペプチドセグメントのアミノ基とを結合させた。
【０１４２】
実施例５の標的認識分子の構造を化２４に示す。
【０１４３】
【化２４】
【０１４４】
〔第６実施例群〕
（実施例６）
実施例５において、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリドに代え、帯電性セグメントを化４で表されるポリアリルアミン構成単位（ｎ＝１４）を有するものとした。なお、帯電性セグメントに、連結セグメントと結合させるためのポリアクリル酸構成単位を導入した。これ以外は実施例５と同様にして、実施例６にかかる標的認識分子を作製した。この分子の構造を化２５に示す。
【０１４５】
【化２５】
【０１４６】
〔第７実施例群〕
（実施例７）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１４７】
帯電性セグメントは、化６で表されるポリビニルピリジン構成単位（ｎ＝１４）を有するものとした。なお、帯電性セグメントに、連結セグメントと結合させるためのポリアクリル酸構成単位を導入した。
【０１４８】
【化６】
【０１４９】
連結セグメントとしては、ポリエチレングリコール構成単位を２個（ｎ＝２）含むＮＨＳ−ＰＥＧ２−ＯＨを用いた。この化合物のＯＨ基と、帯電性セグメントに導入したカルボキシル基とをエステル結合させ、スクシンイミド基と標的認識ペプチドセグメントのアミノ基とを結合させた。
【０１５０】
実施例７の標的認識分子の構造を化２６に示す。
【０１５１】
【化２６】
【０１５２】
〔第８実施例群〕
（実施例８）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１５３】
帯電性セグメントは、化８で表されるデキストラン硫酸構成単位（ｎ＝１４、スルホン化率（Ｒに占めるＳＯ3Ｎａの割合）３０％）を有するものとした。なお、スルホン化率
は１０％以上であればよい。
【０１５４】
【化８】
【０１５５】
連結セグメントとしては、ポリエチレングリコール構成単位を２個（ｎ＝２）含むＮＨＳ−ＰＥＧ２−ＯＨを用いた。この化合物のＯＨ基と、帯電性セグメントのヒドロキシスルホニル基（ＳＯ3Ｈ基）とをエステル結合させ、スクシンイミド基と標的認識ペプチド
セグメントのアミノ基とを結合させた。
【０１５６】
実施例８の標的認識分子の構造を化２７に示す。
【０１５７】
【化２７】
【０１５８】
〔第９実施例群〕
（実施例９）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１５９】
帯電性セグメントは、化９で表されるコンドロイチン硫酸構成単位（ｎ＝１４、Ｒ＝Ｈ）を有するものとした。
【０１６０】
【化９】
【０１６１】
連結セグメントとしては、ポリエチレングリコール構成単位を２個（ｎ＝２）含むＮＨＳ−ＰＥＧ２−ＯＨを用いた。この化合物のＯＨ基と、帯電性セグメントのヒドロキシスルホニル基（ＳＯ3Ｈ基）とをエステル結合させ、スクシンイミド基と標的認識ペプチド
セグメントのアミノ基とを結合させた。
【０１６２】
実施例９の標的認識分子の構造を化２８に示す。
【０１６３】
【化２８】
【０１６４】
〔第１０実施例群〕
（実施例１０−１）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉の末端にシステインＣが導入されたものとした。
【０１６５】
帯電性セグメントは、オクトヌクレオチド（一方鎖はポリデオキシアデノシンモノホスフェート、他方（相補）鎖はポリデオキシチミジンモノホスフェート）を有し、一方鎖の５’末端のリン酸に（ＣＨ2）6ＳＨが導入されたもの（化２９参照）とした。
【０１６６】
【化２９】
【０１６７】
［連結セグメント］
連結セグメントとしては、一般式化３０に示すBis Maleimidoethane 〔Thermo社〕を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のＳＨ基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのＳＨ基に結合させた。
【０１６８】
【化３０】
【０１６９】
［合成方法］
０．１ｍMの標的認識ペプチドセグメントにモル比１００倍の１０mM Bis Maleimidoethane（１０％DMSO含む）を反応させた。その後、未架橋のBis Maleimidoethaneを取り除き、０．１ｍMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端のマレイミド基と
標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのSH基とを、それぞれ結合反応させた。
【０１７０】
（実施例１０−２）
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例１０−１と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；ＬＲＲＡＳＬＧ〉の末端にシステインＣが導入されたものとした。
【０１７１】
帯電性セグメントは、上記実施例１０−１と同じＤＮＡとした。
【０１７２】
［連結セグメント］
連結セグメントとしては、一般式化３１に示す1,4-Di-[3´-(2-pyridyldithio) -propionamido]butane（Thermo社）を用いた。このジスルフィドの一方を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のＳＨ基に反応させ、他方のジスルフィドを上記帯電性セグメントのＳＨ基に結合させた。
【０１７３】
【化３１】
【０１７４】
（実施例１０−３）
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例１０−１と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；ＬＲＲＡＳＬＧ〉の末端にシステインＣが導入されたものとした。
【０１７５】
帯電性セグメントは、上記実施例１０−１と同じＤＮＡとした。
【０１７６】
［連結セグメント］
連結セグメントとしては、一般式化３２に示す1,11-Bis-maleimido-triethyleneglycol（Thermo社）を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のＳＨ基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのＳＨ基に結合させた。
【０１７７】
【化３２】
【０１７８】
（実施例１０−４）
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例１０−１と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；ＬＲＲＡＳＬＧ〉の末端にシステインＣが導入されたものとした。
【０１７９】
帯電性セグメントは、上記実施例１０−１のＤＮＡにおいて、さらに他方（相補）鎖の５’末端のリン酸に（ＣＨ2）6ＳＨが導入されたものとした。
【０１８０】
［連結セグメント］
連結セグメントとしては、上記実施例１０−３と同じ1,11-Bis-maleimido -triethyleneglycol（Thermo社）を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグ
メントのシステイン残基のＳＨ基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのＳＨ基に結合させた。
【０１８１】
［合成方法］
０．１ｍMの標的認識ペプチドセグメントにモル比１００倍の１０mM Bis Maleimido ethane（１０％DMSO含む）を反応させた。その後、未架橋のBis Maleimidoethaneを取り除
き、０．１ｍMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端のマレイミド基
と標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのSH基とを、それぞれ結合反応させた。下記化３３に示す10mM N-[g-Maleimidobutyryloxy]succinimide ester溶液を混合し、帯電性セグメント
のＳＨ基と反応させ、末端にスクシンイミド基を有する基材結合セグメントを導入した。
【０１８２】
【化３３】
【０１８３】
（補充事項）
上記各実施例では、標的認識ペプチドセグメントとしてｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ基質ペプチドを用いたが、本発明の主要要素である標的認識ペプチドセグメントは、上記物質に限られない。本発明にかかる標的認識ペプチドセグメントは、標的物質を特異的に認識するペプチドであればよい。標的物質を特異的に認識するペプチドであるか否かは、検出目的とする標的物質との関係において判定する。具体的には、ファージディスプレイ法（Pharge Display - Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 Barbas. C. et al.）や、スポット合成法（The SPOT-synthesis technique. Synthesis peptide arrays on membrane supports-principles and applications. J. Immunol. Methods 267 2002 13-26 R. Frank）などの公知の方法を用いて、検出目的とする標的物
質を認識できるペプチド配列を決定し、この配列のペプチドを標的認識ペプチドセグメントとして選定する。
【０１８４】
また、標的認識ペプチドセグメントの原料ペプチドは、天然由来のもの、人工的に合成したものの何れでもよく、ペプチドの合成法についても何ら限定されない。ペプチドの合成法としては、固相合成法、液相合成法、遺伝子発現を用いた合成法などが例示できる。
【０１８５】
また、上記実施例３においては、上記ポリアクリル酸構成単位を有する帯電性セグメントに代え、化２に示すポリスチレンスルホン酸構成単位、または化７に示すポリビニル硫酸構成単位を有する帯電性セグメントを用いることができる。
【０１８６】
【化２】
【０１８７】
【化７】
【０１８８】
ここで、帯電性セグメントの長さ（アーム長）が長過ぎると、分子相互が絡み合うなどの不都合がある一方、帯電性セグメントの長さが短過ぎると、標的認識セグメントの自由度が少なくなる。よって、帯電性セグメントの長さはそれ自身の性質や標的認識セグメントとの関係において適当に選定する必要がある。よって、好ましくは帯電性セグメントの長さが標的認識ペプチドセグメントの長さ以上となるようにし、より好ましくは１〜２倍となるように繰り返し単位（ｎ）を選定する。また、一般に、繰り返し単位（ｎ）が３未満のものは静電的相互作用による吸引力が不足するため好ましくない一方、繰り返し単位（ｎ）が１５０を超えるもものは、合成コストが増すと共に、分子の絡み合いが生じる等するため好ましくない。
【０１８９】
また、標的認識分子を用いた分析チップのキャリア溶液としては、一般に中性付近（ｐＨ７±１程度）の水溶液が使用されるが、上記各実施例で使用した標的認識ペプチドセグメントの平均等電点は７.３であるので、各実施例にかかる標的認識分子をｐＨが７±１
程度の中性のキャリア液に溶解した場合、標的認識ペプチドセグメント部分の電荷は無視しうる程度の大きさとなる。すなわち、上記各実施例にかかる標的認識分子においては、帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスまたはマイナスの何れに帯電するものであっても、標的認識ペプチドセグメント部分の電荷に殆ど影響されないことから、標的認識ペプチドセグメントの平均等電点との関連性において帯電性セグメントの電荷の種類を規定する必要がない。
【０１９０】
これに対して、標的認識ペプチドセグメントの平均等電点が、「６以下」または「８以上」である場合には、標的認識分子全体に占める標的認識ペプチドセグメントの電荷の影響力が大きくなる。それゆえ、標的認識ペプチドセグメントの平均等電点が「６以下」である場合には、帯電性セグメントの帯電性官能基をｐＨ７以上の水溶液中でマイナスに帯電する官能基とするのが好ましい。この要件を満たす標的認識分子は、ｐＨが７以上（例えばｐＨ７.８）のキャリア水溶液に溶解すると、帯電性セグメントのマイナス電荷密度
が十分に高まるので、プラス電荷を与えた固定化部位（電極）に効率よく集合させ可逆的に固定化させることができる。
【０１９１】
他方、標的認識ペプチドセグメントの平均等電点が「８以上」である場合には、帯電性セグメントの帯電性官能基をｐＨ７以下の水溶液中でプラスに帯電する官能基とするのが好ましい。この要件を満たす標的認識分子は、ｐＨが７以下（例えばｐＨ６.２）のキャ
リア水溶液に溶解すると、帯電性セグメントのプラス電荷密度が十分に高まる。よって、この要件を充足させることにより、マイナス電荷を与えた固定化部位（電極）に効率よく集合させ可逆的に固定化させることができることになる。
【０１９２】
上記実施例３〜９の標的認識分子においては、基材結合セグメントを有しない標的認識分子を示したが、これらの分子に対しても第1実施例群に示したように、基材に共有結合させることのできる基材結合セグメントを化学結合させることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１９３】
本発明の標的認識分子は、特定物質に特異的に反応する感応部位である標的認識セグメントと、帯電性が付与された帯電性セグメントとを備える新規な化学分子であり、本発明の標的認識分子を含む溶液を用いると、電荷を印加した固定化部位に、標的認識分子を自己集合的かつ高密度に集合させ可逆的固定を行うことができる。また、基材結合セグメントを備える本発明の標的認識分子を用いると、電荷を印加した固定化部位に、標的認識分子を自己集合的に高密度に固定化することができる。このような本発明標的認識分子は、分析チップなど分析用デバイスの使い勝手性、分析精度、信頼性を格段に高めることに寄与する。よってその産業上の利用可能性は大きい。
【符号の説明】
【０１９４】
１ 標的認識セグメント
２ 連結セグメント
３ 帯電性セグメント
３’ 帯電性セグメントの繰り返し単位
４ 基材
５ 基材結合セグメント
１０ 分析チップ
１１ 注液口
１２ マイクロ流路
１３ 排出口
１４・１５ 電極（何れか一方が固定化部位）
１６ 検出器
１７ 電源
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定物質に特異的に反応する感応部位を有する標的認識分子に関し、特に分析チップの特定部位に自己集合的に高密度に集合させ固定化させることのできる帯電性が付与された標的認識分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、チップ内に標的認識分子が固定化されてなる分析チップが、タンパク質などの生体成分の分析に用いられるようになっている。
【０００３】
分析チップの標的認識分子としては、特定物質に対し特異的選択的に反応する物質が使用されており、従来、天然由来の抗体が使用されていたが、最近では長期保存性、生産性などの観点から、合成ペプチドなどからなる人工抗体が用いられるようになっている。
【０００４】
特定物質に対し特異的選択的に反応する物質を備えたこの種の分析チップは、操作が簡単で分析に高度な錬度を必要としない。また、標的物質を少ない検体量でもって短時間に測定できるという利点を有する。その一方、チップ内の所定箇所に必要量の標的認識分子を適正に固定化し保持させるのが容易でないなどのため、必ずしも十分な測定精度や信頼性、再現性が得られていない。
【０００５】
標的認識分子の固定化方法については、従前より種々な方法が提案されている。例えば、基材表面に標的認識分子を物理吸着させる方法や共有結合させる方法が知られている。また、標的認識分子を微小ビーズの表面に固定化し、これをマイクロ流路内に配置する方法が知られている。更にまた、下記先行技術文献に記載の方法などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７-５０４４７１号公報
【特許文献２】特開２００３-３４４３９６号公報
【特許文献３】特開２００６-２６６８３１号公報
【特許文献４】特表平４-５０１６０５号公報
【特許文献５】特開２０００-２６６７１６号公報
【特許文献６】特開２００６−７１３２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特定物質に対し特異的選択的に反応する物質を具備させてなる分析チップにおいては、標的認識分子の固定化密度や固定化状態の良否により分析性能が大きく左右され、また固定化効率により分析チップの生産性が大きく左右される。本発明の目的は、標的認識分子自体に高密度に固定化する機能を付与した新規な標的認識分子を提供することにある。また、標的認識分子を効率よく基材に固定化する技術を提供することにある。
【０００８】
分析チップの製造において、標的認識分子の固定化効率が低いと、原材料としての標的認識分子を多く使用する必要がある。標的認識分子の無駄はコスト上昇を招くとともに、低い固定化率は生産性を低下させる原因となる。また、固定化密度が低いと、十分な分析感度が得られない。また、個々の分析チップ間で固定化密度に差があると、分析チップに対する信頼性が大きく低下する。それゆえ、チップ内の所定部位に標的認識分子を迅速かつ高密度に、しかも再現性よく固定化できる手段が求められている。
【０００９】
更にまた、標的認識分子が化学的物理的安定性に乏しいものである場合、この物質を固定化してなる分析チップは、短時に使用不能になるという問題がある。この問題を解決する方法の一つは、分析時にその場で標的認識分子を固定化する方法であるが、このためには、分析現場で簡便に固定化し得る手段が必要である。
【００１０】
本発明者は、これらの課題を解決すべく鋭意検討を行い、標的認識分子自身を高密度固定化が可能な分子とする本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、分子中に帯電性セグメントが組み込まれた新規な標的認識分子に関し、一群の発明は次のように構成されている。
【００１２】
（１）第１発明にかかる標的認識分子は、標的物質を特異的に識別する認識部位としての標的認識ペプチドセグメントと、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する帯電性官能基を備えた帯電性セグメントと、前記標的認識ペプチドセグメントと前記帯電性セグメントのそれぞれに化学結合して両者を連結する連結セグメントと、を有することを特徴とする。
【００１３】
（２）第２発明は、上記第1発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメン
トが、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する３個以上の帯電性官能基を備えることを特徴とする。
【００１４】
（３）第３発明は、上記第1または第２の発明にかかる標的認識分子において、前記標
的認識ペプチドセグメントの等電点が、６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、ｐＨ７以上の水溶液中でマイナスに帯電する官能基であることを特徴とする。
【００１５】
（４）第４発明は、上記第１または第２の発明にかかる標的認識分子において、前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が、８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、ｐＨ７以下の水溶液中でプラスに帯電する官能基であることを特徴とする。
【００１６】
ここで、上記「同一極性の電荷に帯電する３個以上の帯電性官能基を備えた」とは、同一の官能基を３個以上備えたものでもよく、３種類以上の異なる官能基を３個以上備えたものであってもよい。また、「標的認識ペプチドセグメントの等電点」とは、標的認識ペプチドセグメントを組成する個々のアミノ酸残基に対応するアミノ酸の等電点を合算した総和値をアミノ残基数で割った値（平均値）で定義される等電点（平均等電点）をいう。個々のアミノ酸の等電点は表１に示す通りとする。
【００１７】
【表１】
【００１８】
（５）第５の発明は、上記第1ないし第４の何れかの発明にかかる標的認識分子におい
て、前記帯電性セグメントが、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する３個以上の帯電性官能基を備え、かつ異なる極性に帯電する官能基を有しないものであることを特徴とする。
【００１９】
ここで、本発明にかかる標的認識分子の使用態様を説明し、この説明を通して、一群の本発明構成の技術的意義を明らかにする。
【００２０】
本発明標的認識分子は、電場に集まる性質が増強されているので、この性質を利用して所望の固定化部位に標的認識分子を集合させ保持させることができる。例えば、マイクロ流路を形成してなる分析チップにおいて、標的認識分子を集合保持させたい箇所に電極を形成しておき、この電極に電圧を印加し、プラス又はマイナスの電荷を与え、この状態で、流路内に標的認識分子を溶解した標的認識分子含有溶液を流すことにより、固定化部位である電極表面に標的認識分子を効率よく集合させ且つそこに可逆的にまたは不可逆的に固定化することができる。以下、この点について説明する。
【００２１】
第５発明にかかる標的認識分子は、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する３個以上の帯電性官能基を備え、かつ異なる極性に帯電する官能基を有しない。よって、この標的認識分子を溶液に溶かすと、帯電性セグメントが同一の電荷を帯びる。それゆえ、電荷が付与された固定化部位（電極）上に本発明標的認識分子含有溶液を流すと、標的認識分子が電極表面に静電相互作用により引っぱられ、そこに高密度に捕集される。この高密度な集合状態は電極に電荷が印加されている限り保持される。すなわち、固定化部位に標的認識分子が可逆的に固定化される。
【００２２】
上記を更に詳しく説明する。標的認識ペプチドセグメントの等電点が６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基を備えた標的認識分子を、例えばｐＨ８のキャリア溶液に溶かすと、標的認識ペプチドセグメントおよび帯電性セグメントともにマイナスに帯電する。ここで第３発明と第５発明の双方の要件を満たす帯電性セグメントは、等電点が６以下であり、その帯電性官能基がｐＨ７以上の水溶液中でマイナスに帯電する官能基であり、かつ同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する３個以上の帯電性官能基を備え、しかも異なる極性に帯電する官能基を有しないので、帯電性セグメントのマイナス電荷密度が十分に高い。よって、電極にプラス電荷を印加すると、帯電性セグメント部分が電極に引き付けられ、電極表面に捕集される。
【００２３】
他方、第４発明と第５発明の双方の要件を満たす帯電性セグメントは、標的認識ペプチドセグメントの等電点が８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基を備え、しかも異なる極性に帯電する官能基を有しないので、この標的認識分子を、例えばｐＨ６のキャリア溶液に溶かすと、標的認識ペプチドセグメントおよび帯電性セグメントともにプラスに帯電し、その電荷密度が十分に高い。よって、電極にマイナス電荷を印加すると、帯電性セグメント部分が電極に引き付けられ、電極表面に捕集されることになる。
【００２４】
上記構成の標的認識分子においては、連結セグメント および／または 帯電性セグメントは、固定部位（電極面）と標的認識ペプチドセグメントの距離を保つスペーサとして機能すると共に、標的認識ペプチドセグメントの自由度を確保するアームとして機能する。それゆえ、分子の一端が電極に固定化された状態においても、標的物質に対する特異的認識能を十分に発揮する。
【００２５】
（６）第６発明は、上記第５の発明にかかる標的認識分子において、前記標的認識ペプチドセグメントがシステイン残基を含み、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されていることを特徴とする。
【００２６】
（７）また、第７発明は、上記第１ないし第５の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記標的認識ペプチドセグメントの一方端がシステイン残基であり、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されていることを特徴とする。
【００２７】
（８）また、第８発明は、上記第１ないし第６の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記連結セグメントが前記標的認識ペプチドセグメントの末端のアミノ酸残基に化学結合され、当該化学結合部位と異なる連結セグメント部位に前記帯電性セグメントが化学結合されていることを特徴とする。
【００２８】
この構成であると、連結セグメントや帯電性セグメントによって、標的認識ペプチドセグメントの標的物質に対する特異性が阻害され難い。すなわち、標的認識ペプチドセグメントに、標的物質を選別する機能を発揮させ易い。
【００２９】
（９）また、第９発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントが、３個以上のアミノ酸残基を有するペプチドからなることを特徴とする。
【００３０】
（１０）また、第１０発明は、上記第９の発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントとしてのペプチドは、アルギニン、リシンからなる群から１つ以上選択された塩基性アミノ酸残基を３個以上含み、かつ、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基を含まないことを特徴とする。
【００３１】
この構成にかかる帯電性セグメントは、等電点が高い特定の塩基性アミノ酸残基を３個以上含んでなり、等電点が低い酸性アミノ酸残基を含まないので、弱アルカリ性から酸性側の溶液中において強くプラス電荷を帯びる。よって、この構成の標的認識分子は、弱アルカリ性から酸性の溶液を用いる標的物質分析に都合がよい。
【００３２】
（１１）また、第１１発明は、上記第９発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントとしてのペプチドは、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から１つ以上選択された酸性アミノ酸残基を３個以上含み、かつ、アルギニン残基及びリシン残基を含まないことを特徴とする。
【００３３】
この構成にかかる帯電性セグメントは、等電点が低い特定された酸性アミノ酸残基を３個以上含んでなり、等電点が高い塩基性アミノ酸を含まないので、弱酸性からアルカリ性の溶液中で強くマイナス電荷を帯びる。よって、この構成の標的認識分子は、弱アルカリ性から酸性の溶液を用いる標的物質分析に都合がよい。
【００３４】
（１２）また、第１２発明は、上記第９ないし第１１の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントを構成するアミノ酸残基の数が、前記標的認識ペプチドセグメントを構成するアミノ酸残基の数よりも多いことを特徴とする。
【００３５】
標的認識ペプチドセグメントは、通常、酸性アミノ酸やアルカリ性アミノ酸、中性アミノ酸が混合されたペプチドからなる。よって、アミノ酸残基数が、標的認識ペプチドセグメントよりも帯電性セグメントの方が多ければ、偏在させたアミノ酸配列からなる帯電性セグメントの方がより強く帯電するので、その役割を果すことができる。
【００３６】
（１３）また、第１３の発明は、上記第1ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識
分子において、前記帯電性セグメントが、ｎが３以上１５０の化１で表されるポリアクリル酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００３７】
【化１】
【００３８】
（１４）また、第１４発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントが、ｎが３以上１５０の化２で表されるポリスチレンスルホン酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００３９】
【化２】
【００４０】
（１５）また、第１５発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントが、ｎが３以上１５０の化３で表されるポリエチレンイミン構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００４１】
【化３】
【００４２】
（１６）また、第１６発明は、上記第1ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分
子において、前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０の化４で表されるポリアリルアミン塩酸塩構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００４３】
【化４】
【００４４】
（１７）また、第１７発明は、上記第１ないし第７の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０の化５で表されるポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００４５】
【化５】
【００４６】
（１８）また、第１８発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０の化６で表されるポリビニルピリジン構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００４７】
【化６】
【００４８】
（１９）また、第１９発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０の化７で表されるポリビニル硫酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００４９】
【化７】
【００５０】
（２０）また、第２０発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントが、ｎが１以上１５０以下の化８で表されるデキストラン硫酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００５１】
【化８】
【００５２】
（２１）また、第２１発明は、上記第1ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分
子において、前記帯電性セグメントが、ｎが１以上１５０以下の化９で表されるコンドロイチン硫酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００５３】
【化９】
【００５４】
（２２）また、第２２発明は、上記第１ないし第８の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントが、ｎが３以上１５０以下の化１０で表されるヌクレオチド構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
【００５５】
【化１０】
【００５６】
リン酸、糖（リボース（ＲがＯＨ）又はデオキシリボース（ＲがＨ））、塩基（アデニン、シトシン、グアニン、チミン（デオキシリボースの場合のみ）、ウラシル（リボースの場合のみ））から構成されるヌクレオチドは、リン酸を有しているため、塩基性の溶液中でマイナス電荷を帯びる。よって、この構成の標的認識分子は、アルカリ性から弱酸性の溶液を用いる標的物質分析に都合がよい。なお、帯電性セグメントとして、一本鎖のポリヌクレオチド（ｓｓＤＮＡやＲＮＡ）を用いてもよく、二本鎖のポリヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）を用いてもよい。
【００５７】
上記化１〜化１０の構成単位を有する帯電性セグメントは「ｎ」を適当に選定することにより、標的認識ペプチドセグメントの特異的感応性を十分に発揮させることが可能になる。
【００５８】
（２３）また、第２３発明は、上記第１ないし２２の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記連結セグメントは、溶液中で帯電する官能基を有しないことを特徴とする。
【００５９】
この構成であると、帯電性セグメントの帯電性に影響を与えないので分子設計がし易い。
【００６０】
（２４）また、第２４発明は、上記第１ないし２３の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記標的認識ペプチドセグメントが、３個以上１９個以下のアミノ酸残基を有するペプチドからなることを特徴とする。
【００６１】
アミノ酸数が２以下のペプチドでは特異的な標的認識能力が得られにくいが、３個以上１９個以下のアミノ酸数であれば標的認識能を発揮するペプチドを構成することができる。また、３個以上１９個以下であれば、ペプチド合成が容易であり、この範囲の結合数のペプチドであると、標的認識分子としての取り扱い性がよい。
【００６２】
（２５）また、第２５発明は、上記第１ないし２４の何れかの発明にかかる標的認識分子において、前記帯電性セグメントに、更に、基材と結合させるための官能基を備えた基材結合用セグメントが化学結合されていることを特徴とする。
【００６３】
この構成の標的認識分子は次のように使用することができる。帯電性セグメントに更に基材結合用セグメントが結合された標的認識分子は、印加された電極表面などの電場で捕集される性質を備えるので、この標的認識分子溶液を固定部位に電極を配したマイクロ流路内に注入すると、標的認識分子が電極表面に高密度に集合する。この状態においては、基材と結合させるための官能基（基材結合基と称する）は電極表面に接触しているか、または電極表面の近傍に位置し、基材結合用セグメントの揺らぎよって電極表面に接触する。それゆえ、容易に固定化部位（電極表面）に結合させることができる。
【００６４】
つまり、上記構成の標的認識分子を用いると、確実かつ高密度に高密度な固定化を行うことができ、結合後は印加を止めても標的認識分子は固定化部位に保持されたままとなる。これにより、分析精度や信頼性に優れた分析チップが実現できることになる。
【００６５】
（２６）また、第２６発明は、上記第２５の発明にかかる標的認識分子において、前記連結セグメントが、一方端の結合可能部位で標的認識ペプチドセグメントと化学結合し、前記一方端の結合可能部位から最も離れた他方端結合可能部位で前記帯電性セグメントと化学結合し、前記帯電性セグメントが、前記連結セグメントと化学結合した部位から最も離れた結合可能部位で前記基材結合用セグメントと化学結合していることを特徴とする。
【００６６】
この構成であると、固定化部位と標的認識ペプチドセグメントとの距離が大きくなり、標的認識ペプチドセグメントの自由度が高まるので、標的認識機能が阻害され難い。
【００６７】
〔方法発明〕
第２７発明〜第２８発明は、上記した第１〜第２４発明にかかる標的認識分子を利用するための固定化方法に関し、第２９発明〜第３０発明は、上記した第２５〜第２６発明にかかる標的認識分子を利用するための固定化方法に関する。
【００６８】
（２７）第２７発明は、マイクロ流路内に電極が形成された分析チップに、上記３、５〜１５、１９〜２２の何れか１項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、を備える標的認識分子を固定化する方法である。
【００６９】
（２８）また、第２８発明は、マイクロ流路内に電極が形成された分析チップに、上記請求項４〜１２、１６〜１８の何れか１項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、を備える標的認識分子を固定化する方法である。
【００７０】
（２９）また、第２９発明は、マイクロ流路内に電極が形成された分析チップに、上記請求項２５または２６に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用セグメントと電極とを化学結合させる工程と、を備える標的認識分子を固定化する方法である。
【００７１】
（３０）また、第３０発明は、マイクロ流路内に電極が形成された分析チップに、上記請求項２５または２６に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用セグメントと電極とを化学結合させる工程と、を備える標的認識分子を固定化する方法である。
【００７２】
ここで、帯電性セグメントの帯電性官能基を十分に解離させるためには、上記第２５の発明及び第２６の発明においては前記溶液ｐＨを好ましくはｐＨ７．３以上とし、上記第２４の発明及び第２６の発明においては前記溶液ｐＨを好ましくはｐＨ６．５以下とするのがよい。
【発明の効果】
【００７３】
本発明標的認識分子は、標的物質に特異的に反応する標的認識ペプチドセグメントを一方端側に備え、マイナス又はプラスの何れかに帯電する帯電性セグメントを他方端側に備え、両セグメントが連結セグメントで連結された構造を有する化合物である。この構造の本発明標的認識分子は、標的認識ペプチドセグメントが分析対象となる標的物質を特異的に認識する性質を発揮し、帯電性セグメントが印加された電極（固定化部位）に高密度に集合する性質を発揮する。さらに連結セグメントと帯電性セグメントが、標的認識ペプチドセグメントの自由度の低下を防止し、標的認識ペプチドセグメントが特異的認識機能を十分に発揮できるように機能する。
【００７４】
このような本発明標的認識分子を用いると、簡単かつ確実に電極の形成された固定化部位に高密度に保持させることができ、この電気的保持による固定化は可逆的であるので、分析チップの使い勝手が大幅に向上する。また、標的認識分子の高密度な固定化が、分析チップの分析感度および精度を顕著に向上させる。
【００７５】
更に、帯電性セグメントに基材結合用セグメントが結合された本発明標的認識分子は、基材結合用セグメントが基材と結合する官能基を有するので、先ず固定化を望む部位に電圧を印加して標的認識分子を高密度に集め、この状態で基材結合用セグメントを介して標的認識分子と基材とを結合させることができる。基材結合用セグメントを介した結合は、電圧印加を解除しても解除されないので、一層確実な高密度固定化を簡便に行えるという顕著な効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、本発明標的認識分子の構成要素の繋がりを示す概念図である。
【図２】図２は、図１に示す標的分子が電極（固定化部位）に電荷間相互作用により保持された状態を示す概念図である。
【図３】図３は、基材結合セグメントを有する本発明標的認識分子の構成要素の繋がりを示す概念図である。
【図４】図４は、基材結合セグメントを有する本発明標的認識分子が電極（固定化部位）に電荷間相互作用により保持された状態を示す概念図である。
【図５】図５は、基材結合セグメントを有する本発明標的認識分子が基材である電極に化学結合された様子を示す概念図である。
【図６】図６は、本発明標的認識分子の適用対象である分析チップ装置の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本発明の実施するための実施の形態を、順次説明する。
【００７８】
〔第1実施例群〕
（実施例１-１）
［ペプチドセグメント］
標的認識ペプチドセグメント（標的認識用ＰＳと略記）として、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉ
ｎａｓｅ Ａ（ＰＫＡ）基質ペプチドを用意した。このもののアミノ酸配列は〈ＬＲＲＡ
ＳＬＧ〉であり、このものはセリン残基がリン酸化されている。また、下記表１および式１に基づいて算出した等電点（平均値）は７.３である。
【００７９】
【数１】
【００８０】
【表１】
【００８１】
［帯電性セグメント］
帯電性セグメントは、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）を８個連結したペプチド〈アミノ酸配列；ＤＤＤＤＤＤＤＤ〉とした。この帯電性セグメントの等電点（平均値）は、２.７７であり、親水性である。
【００８２】
［連結セグメント］
連結セグメントとしては、一般式化１１に示すポリエチレングリコール構成単位を５個（ｎ＝５）含むBis(NHS)PEG5 〔Bis-Ｎ−Succinimidyl−(pentaethyene-glycol) ester〕（化１２）を用いた。この一方端のスクシンイミド基（NHS）を上記標的認識ペプチドセグメントのN末端のアミノ酸残基のアミノ基に反応させ、他方端のスクシンイミド基を上記帯電性セグメントのＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基に結合させた。
【００８３】
【化１１】
【００８４】
【化１２】
【００８５】
この実施例１-１の標的認識分子を、化１３に示す。また、実施例１-１の標的認識分子（分子）の概念構成を図１に示す。
【００８６】
【化１３】
【００８７】
図１において、符号１が標的認識ペプチドセグメント、符号２が連結セグメント、符号３が帯電性セグメント、３’が帯電性セグメントの構成単位（この例ではアミノ酸残基）を表している。
【００８８】
なお、「・・・・」は構成単位の省略を意味している。この標的認識分子を溶かし、その溶液ｐＨを弱酸性ないしアルカリ性とすると、帯電性セグメント部分がマイナスに帯電するので、この溶液をプラスに帯電した電極面に接触させると、帯電性セグメント部分が電極表面に電気的に保持固定されることになる。図２は、電極面に標的認識分子が保持された様子を示している。
【００８９】
図６を用いて、この標的認識分子の使用態様の一例を説明する。図６は分析用マイクロ流路デバイスを用いた分析装置１０であり、符号１１は溶液注入口、１２は流路、１３は排出口、１４・１５は一対の電極、１６は検出器である。この装置を用いた分析法の基本的手順は次のようになる。
【００９０】
実施例１-１の標的認識分子を、例えばｐＨ７.３のリン酸緩衝生理食塩水からなるキャリア液に溶解させる。濃度は例えば１００uｇ／ｍＬとする。
【００９１】
次に、一対の電極（何れか一方の電極表面が固定化部となる）に直流電圧を印加した状態（例えば１〜１０Ｖとする）で、標的認識分子含有キャリア液を溶液注入口１１から注入し流路１２内を流す。上記したように実施例１-１の標的認識分子はｐＨ７.３の溶液中では、帯電性セグメントがマイナスに帯電するので、電極１４に吸引固定される。この状態で、上記キャリア液（標的認識分子を含まないもの）で流路内を洗浄する。これにより標的認識分子の固定化操作が終了する。
【００９２】
実施例１−１の標的認識分子は、電気的に電極面に固定化できる特性を有するので、電極への電圧印加の有無により、固定化と固定化解除を制御できる。よって、測定の場で固定化を行うことができる。また、無印加状態で流路内を洗浄することにより、容易に分析チップの再生利用を図ることができる。
【００９３】
また、実施例１−１の標的認識分子では、連結セグメントや帯電性セグメントが標的認識用ペプチドセグメンの自由度を担保する。よって、電極面に固定化することにより標的物質に対する認識性が損なわれないので、検液中に含まれる標的物質を高精度に捕捉することができる。
【００９４】
なお、固定化以降の操作は、非標識免疫測定法や標識免疫測定法（例えばサンドイッチアッセイ法など）の公知の分析法に準じればよい。また、検出器としては、例えば熱レンズ、表面プラズモン共鳴、水晶発振子などが使用でき、また、固定化部位である電極自体を電気化学的な検出器として利用することもできる。
【００９５】
また、上記電極１４の構成材料としては、例えば金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、チタン（Ｔｉ）などの金属、導電性プラスチックなどが使用でき、電極は、分析チップの作製時にこれらの材料を固定化予定部位に塗布する等して予め形成しておけばよい。
【００９６】
（実施例１−２）
実施例１の標的認識分子の帯電性セグメント〈アミノ酸配列；ＤＤＤＤＤＤＤＤ〉のＣ末端に常法にしたがって基材結合用セグメントとしてシステイン〈Ｃ〉を結合させた。この実施例１−２の標的認識分子を化１４に示す。
【００９７】
【化１４】
【００９８】
実施例１−２の標的認識分子は、システイン残基のチオール基（硫黄元素）を介して金電極表面と化学結合させることができる性質を有する。よって、金電極に電荷を印加した状態で標的認識分子含有溶液を流すことにより、金電極表面に高密度に標的認識分子を集めることができ、これが金（Ａｕ）電極面に化学結合する。一旦、電極表面に化学結合した後は、電極への印加を止めても、固定化状態が保持されることになる。
【００９９】
（実施例１−３）
実施例１-２においては、更にシステイン残基のチオール基に、（Ｎ−［4−（ｐ−Ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌａｍｉｄｏ） ｂｕｔｙｌ］−3´−（2´−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔ
ｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ）（ＡＰＤＰ；Ｔｈｅｒｍｏ社）を反応させ、末端に光架橋基であるアジド基を導入した。
【０１００】
［合成方法］
上記ＡＰＤＰのジスルフィド結合と、システインのＳＨ基とが反応（ジスルフィド交換）して、結合する。実施例１−３の標的認識分子の構造を化１５に示す。
【０１０１】
【化１５】
【０１０２】
上記化１５においては、システイン残基を含めたこれ以降の部分を基材結合用セグメントとすることとする。なお、この例では、帯電性セグメントが酸性アミノ酸からなり、システインも酸性アミノ酸であるので、システイン残基を含めた〈ＤＤＤＤＤＤＤＤ−Ｃ〉を帯電性セグメントとし、光架橋基（アジド基）と結合した、システイン残基のＳ以降を基材結合用セグメントとすることもできる。
【０１０３】
この実施例１−３の標的認識分子は、基材結合用セグメントが光架橋基（アジド基）を有するので、基材面にＵＶ長波長の光を照射することにより標的認識分子と基材とを化学結合（固定化）させることができる。
【０１０４】
（実施例１−４）
上記実施例１−３の（Ｎ−［4−（ｐ−Ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌａｍｉｄｏ） ｂｕｔｙｌ］−3´−（2´−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ）に代えて、Ｎ−（6−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（同
仁化学社）を用いて、システイン残基のチオール基にスクシンイミド基を導入した。
【０１０５】
この実施例にかかる標的認識分子は、分子末端にスクシンイミド基を有するので、アミノ基を持った基材面に化学結合（固定化）させることができる。
【０１０６】
例えばアミノ基を持った基材面を作製する方法としては、基板上に金薄膜を形成し、11-Amino-1-undecanethiol, hydrochloride（同仁化学社）を用いて金薄膜上にアミノ基末
端を持つＳＡＭ膜を形成する。
【０１０７】
実施例１−２〜実施例１−４の標的認識分子の概念構成を図３に示す。また、これらの分子が電荷の印加された電極面（基材面）に静電気的に吸着固定された様子を図４に示し、基材結合セグメントで基材面に化学結合され、かつ電極面への印加が解かれ標的分子が立ち上がった様子を図５に示す。
【０１０８】
図３〜５に示すように、実施例１−２〜実施例１−４の標的認識分子では、静電気的引力により分子を電極に集め、この状態で基材結合セグメントの官能基を電極面に結合させることができる。よって、高い固定化効率を実現することができる。また、電極面に化学結合させた後は、電極への通電を絶っても固定化状態が保持させるので、使い勝手が一段と向上する。
【０１０９】
〔第２実施例群〕
（実施例２−１）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉の末端にシステインを結合したもの〈配列；ＬＲＲＡＳＬＧＣ〉を用いた。
【０１１０】
他方、帯電性セグメントとしては、アルギニンを１０個結合したペプチド〈配列；ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ〉のＮ末端に、連結セグメントとしてシステイン〈Ｃ〉を結合したものを用いた。この帯電性セグメントの等電点（平均値）は、１０.１６である。
【０１１１】
連結セグメント材料として、下記化１６に示す、ポリエチレングリコール構成単位ｎが２のＭａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌを用いた。
【０１１２】
【化１６】
【０１１３】
［合成方法］
０．１ｍMの標的認識ペプチドセグメントにモル比１００倍の１０mM Ｍａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌ溶液（１０％ＤＭＳＯ含む）を反応させた。その後、未架橋のＭａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌを取り除き、０．１ｍMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端の
マレイミド基と標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のＳＨ基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのシステイン残基のＳＨ基とを、それぞれ結合反応させた。
このようにして化１７で表される実施例２-１の標的認識分子を作製した。
【０１１４】
【化１７】
【０１１５】
なお、下記化１８に示すように、上記化合物はｐＨ８を超える水溶液中では加水分解されることがあるが（加水分解位置により、以下に示す２つの形態をとり得る）、この場合であっても本願所定の機能を発揮する。
【０１１６】
【化１８】
【０１１７】
実施例２−１の標的認識分子は、帯電性セグメントをプラスに帯電させて使用するものであるので、キャリア溶液はアルカリから酸性の溶液を用いるのが好ましい。
【０１１８】
なお、システインの導入は、ペプチドセグメントと連結セグメント、及び連結セグメントと帯電性セグメントとの結合位置を末端とするためであり、システインを導入せずに、反応性のある官能基（例えば、アミノ基）の修飾によって、結合位置を末端としてもよい。
【０１１９】
また、上記帯電性セグメントの構成アミノ酸として、アルギニンに代え、塩基性アミノ酸であるリシン、又はリシンとアルギニンの双方を使用するのもよい。
【０１２０】
（実施例２−２）
上記実施例１−２と同様、標的認識分子の帯電性セグメント〈アミノ酸配列；ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ〉のＣ末端に、実施例１−２と同様に基材結合用セグメントとしてシステイン〈Ｃ〉を結合させた。この実施例２−２の標的認識分子の構造を化１９に示す。
【０１２１】
【化１９】
【０１２２】
（実施例２−３）
上記実施例１−３と同様にして、分子末端に光架橋基（アジド基）を導入した実施例２−３にかかる標的認識分子を作製した。実施例２−３の標的認識分子を化２０に示す。
【０１２３】
【化２０】
【０１２４】
（実施例２−４）
上記実施例１−４と同様にして、システイン残基のチオール基にスクシンイミド基を導入した実施例２−４にかかる標的認識分子を作製した。実施例２−４の標的認識分子の構造を化２１に示す。なお、Ｘは連結セグメント、Ｐはペプチドを示している。
【０１２５】
【化２１】
【０１２６】
〔第３実施例群〕
（実施例３）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１２７】
帯電性セグメントは、下記化１に示すポリアクリル酸構成単位（ｎ＝１４、Ｒ＝Ｎａ）
を有するものとした。
【０１２８】
【化１】
【０１２９】
連結セグメントとしては、ポリエチレングリコール構成単位を２個（ｎ＝２）含むNHS-PEG2-OHを用いた。この化合物のＯＨ基と、帯電性セグメントのカルボキシル基とをエス
テル結合させ、スクシンイミド基と標的認識ペプチドセグメントのアミノ基とを結合させた。
【０１３０】
実施例３の標的認識分子の構造を化２２に示す。
【０１３１】
【化２２】
【０１３２】
〔第４実施例群〕
（実施例４）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１３３】
帯電性セグメントは、下記化３に示すポリエチレンイミン構成単位（ｎ＝１４）を有するものとした。
【０１３４】
【化３】
【０１３５】
連結セグメントとしては、上記ポリエチレングリコール構成単位を５個（ｎ＝５）含むBis(ＮHS)PEG5 〔Bis-Ｎ−Succinimidyl−(diethyene-glycol) ester〕を用いた。
【０１３６】
実施例４の標的認識分子の構造を化２３に示す。
【０１３７】
【化２３】
【０１３８】
〔第５実施例群〕
（実施例５）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１３９】
帯電性セグメントとしては、化５で表されるポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド構成単位ｎ＝１４）を有するものとした。なお、帯電性セグメントに、連結セグメントと結合させるためのポリアクリル酸構成単位を導入した。
【０１４０】
【化５】
【０１４１】
連結セグメントとしては、ポリエチレングリコール構成単位を２個（ｎ＝２）含むＮＨＳ−ＰＥＧ２−ＯＨを用いた。この化合物のＯＨ基と、帯電性セグメントに導入したカルボキシル基とをエステル結合させ、スクシンイミド基と標的認識ペプチドセグメントのアミノ基とを結合させた。
【０１４２】
実施例５の標的認識分子の構造を化２４に示す。
【０１４３】
【化２４】
【０１４４】
〔第６実施例群〕
（実施例６）
実施例５において、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリドに代え、帯電性セグメントを化４で表されるポリアリルアミン構成単位（ｎ＝１４）を有するものとした。なお、帯電性セグメントに、連結セグメントと結合させるためのポリアクリル酸構成単位を導入した。これ以外は実施例５と同様にして、実施例６にかかる標的認識分子を作製した。この分子の構造を化２５に示す。
【０１４５】
【化２５】
【０１４６】
〔第７実施例群〕
（実施例７）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１４７】
帯電性セグメントは、化６で表されるポリビニルピリジン構成単位（ｎ＝１４）を有するものとした。なお、帯電性セグメントに、連結セグメントと結合させるためのポリアクリル酸構成単位を導入した。
【０１４８】
【化６】
【０１４９】
連結セグメントとしては、ポリエチレングリコール構成単位を２個（ｎ＝２）含むＮＨＳ−ＰＥＧ２−ＯＨを用いた。この化合物のＯＨ基と、帯電性セグメントに導入したカルボキシル基とをエステル結合させ、スクシンイミド基と標的認識ペプチドセグメントのアミノ基とを結合させた。
【０１５０】
実施例７の標的認識分子の構造を化２６に示す。
【０１５１】
【化２６】
【０１５２】
〔第８実施例群〕
（実施例８）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１５３】
帯電性セグメントは、化８で表されるデキストラン硫酸構成単位（ｎ＝１４、スルホン化率（Ｒに占めるＳＯ3Ｎａの割合）３０％）を有するものとした。なお、スルホン化率
は１０％以上であればよい。
【０１５４】
【化８】
【０１５５】
連結セグメントとしては、ポリエチレングリコール構成単位を２個（ｎ＝２）含むＮＨＳ−ＰＥＧ２−ＯＨを用いた。この化合物のＯＨ基と、帯電性セグメントのヒドロキシスルホニル基（ＳＯ3Ｈ基）とをエステル結合させ、スクシンイミド基と標的認識ペプチド
セグメントのアミノ基とを結合させた。
【０１５６】
実施例８の標的認識分子の構造を化２７に示す。
【０１５７】
【化２７】
【０１５８】
〔第９実施例群〕
（実施例９）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉とした。
【０１５９】
帯電性セグメントは、化９で表されるコンドロイチン硫酸構成単位（ｎ＝１４、Ｒ＝Ｈ）を有するものとした。
【０１６０】
【化９】
【０１６１】
連結セグメントとしては、ポリエチレングリコール構成単位を２個（ｎ＝２）含むＮＨＳ−ＰＥＧ２−ＯＨを用いた。この化合物のＯＨ基と、帯電性セグメントのヒドロキシスルホニル基（ＳＯ3Ｈ基）とをエステル結合させ、スクシンイミド基と標的認識ペプチド
セグメントのアミノ基とを結合させた。
【０１６２】
実施例９の標的認識分子の構造を化２８に示す。
【０１６３】
【化２８】
【０１６４】
〔第１０実施例群〕
（実施例１０−１）
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；
ＬＲＲＡＳＬＧ〉の末端にシステインＣが導入されたものとした。
【０１６５】
帯電性セグメントは、オクトヌクレオチド（一方鎖はポリデオキシアデノシンモノホスフェート、他方（相補）鎖はポリデオキシチミジンモノホスフェート）を有し、一方鎖の５’末端のリン酸に（ＣＨ2）6ＳＨが導入されたもの（化２９参照）とした。
【０１６６】
【化２９】
【０１６７】
［連結セグメント］
連結セグメントとしては、一般式化３０に示すBis Maleimidoethane 〔Thermo社〕を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のＳＨ基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのＳＨ基に結合させた。
【０１６８】
【化３０】
【０１６９】
［合成方法］
０．１ｍMの標的認識ペプチドセグメントにモル比１００倍の１０mM Bis Maleimidoethane（１０％DMSO含む）を反応させた。その後、未架橋のBis Maleimidoethaneを取り除き、０．１ｍMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端のマレイミド基と
標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのSH基とを、それぞれ結合反応させた。
【０１７０】
（実施例１０−２）
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例１０−１と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；ＬＲＲＡＳＬＧ〉の末端にシステインＣが導入されたものとした。
【０１７１】
帯電性セグメントは、上記実施例１０−１と同じＤＮＡとした。
【０１７２】
［連結セグメント］
連結セグメントとしては、一般式化３１に示す1,4-Di-[3´-(2-pyridyldithio) -propionamido]butane（Thermo社）を用いた。このジスルフィドの一方を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のＳＨ基に反応させ、他方のジスルフィドを上記帯電性セグメントのＳＨ基に結合させた。
【０１７３】
【化３１】
【０１７４】
（実施例１０−３）
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例１０−１と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；ＬＲＲＡＳＬＧ〉の末端にシステインＣが導入されたものとした。
【０１７５】
帯電性セグメントは、上記実施例１０−１と同じＤＮＡとした。
【０１７６】
［連結セグメント］
連結セグメントとしては、一般式化３２に示す1,11-Bis-maleimido-triethyleneglycol（Thermo社）を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のＳＨ基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのＳＨ基に結合させた。
【０１７７】
【化３２】
【０１７８】
（実施例１０−４）
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例１０−１と同じＰＫＡ基質ペプチド〈配列；ＬＲＲＡＳＬＧ〉の末端にシステインＣが導入されたものとした。
【０１７９】
帯電性セグメントは、上記実施例１０−１のＤＮＡにおいて、さらに他方（相補）鎖の５’末端のリン酸に（ＣＨ2）6ＳＨが導入されたものとした。
【０１８０】
［連結セグメント］
連結セグメントとしては、上記実施例１０−３と同じ1,11-Bis-maleimido -triethyleneglycol（Thermo社）を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグ
メントのシステイン残基のＳＨ基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのＳＨ基に結合させた。
【０１８１】
［合成方法］
０．１ｍMの標的認識ペプチドセグメントにモル比１００倍の１０mM Bis Maleimido ethane（１０％DMSO含む）を反応させた。その後、未架橋のBis Maleimidoethaneを取り除
き、０．１ｍMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端のマレイミド基
と標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのSH基とを、それぞれ結合反応させた。下記化３３に示す10mM N-[g-Maleimidobutyryloxy]succinimide ester溶液を混合し、帯電性セグメント
のＳＨ基と反応させ、末端にスクシンイミド基を有する基材結合セグメントを導入した。
【０１８２】
【化３３】
【０１８３】
（補充事項）
上記各実施例では、標的認識ペプチドセグメントとしてｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ基質ペプチドを用いたが、本発明の主要要素である標的認識ペプチドセグメントは、上記物質に限られない。本発明にかかる標的認識ペプチドセグメントは、標的物質を特異的に認識するペプチドであればよい。標的物質を特異的に認識するペプチドであるか否かは、検出目的とする標的物質との関係において判定する。具体的には、ファージディスプレイ法（Pharge Display - Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 Barbas. C. et al.）や、スポット合成法（The SPOT-synthesis technique. Synthesis peptide arrays on membrane supports-principles and applications. J. Immunol. Methods 267 2002 13-26 R. Frank）などの公知の方法を用いて、検出目的とする標的物
質を認識できるペプチド配列を決定し、この配列のペプチドを標的認識ペプチドセグメントとして選定する。
【０１８４】
また、標的認識ペプチドセグメントの原料ペプチドは、天然由来のもの、人工的に合成したものの何れでもよく、ペプチドの合成法についても何ら限定されない。ペプチドの合成法としては、固相合成法、液相合成法、遺伝子発現を用いた合成法などが例示できる。
【０１８５】
また、上記実施例３においては、上記ポリアクリル酸構成単位を有する帯電性セグメントに代え、化２に示すポリスチレンスルホン酸構成単位、または化７に示すポリビニル硫酸構成単位を有する帯電性セグメントを用いることができる。
【０１８６】
【化２】
【０１８７】
【化７】
【０１８８】
ここで、帯電性セグメントの長さ（アーム長）が長過ぎると、分子相互が絡み合うなどの不都合がある一方、帯電性セグメントの長さが短過ぎると、標的認識セグメントの自由度が少なくなる。よって、帯電性セグメントの長さはそれ自身の性質や標的認識セグメントとの関係において適当に選定する必要がある。よって、好ましくは帯電性セグメントの長さが標的認識ペプチドセグメントの長さ以上となるようにし、より好ましくは１〜２倍となるように繰り返し単位（ｎ）を選定する。また、一般に、繰り返し単位（ｎ）が３未満のものは静電的相互作用による吸引力が不足するため好ましくない一方、繰り返し単位（ｎ）が１５０を超えるもものは、合成コストが増すと共に、分子の絡み合いが生じる等するため好ましくない。
【０１８９】
また、標的認識分子を用いた分析チップのキャリア溶液としては、一般に中性付近（ｐＨ７±１程度）の水溶液が使用されるが、上記各実施例で使用した標的認識ペプチドセグメントの平均等電点は７.３であるので、各実施例にかかる標的認識分子をｐＨが７±１
程度の中性のキャリア液に溶解した場合、標的認識ペプチドセグメント部分の電荷は無視しうる程度の大きさとなる。すなわち、上記各実施例にかかる標的認識分子においては、帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスまたはマイナスの何れに帯電するものであっても、標的認識ペプチドセグメント部分の電荷に殆ど影響されないことから、標的認識ペプチドセグメントの平均等電点との関連性において帯電性セグメントの電荷の種類を規定する必要がない。
【０１９０】
これに対して、標的認識ペプチドセグメントの平均等電点が、「６以下」または「８以上」である場合には、標的認識分子全体に占める標的認識ペプチドセグメントの電荷の影響力が大きくなる。それゆえ、標的認識ペプチドセグメントの平均等電点が「６以下」である場合には、帯電性セグメントの帯電性官能基をｐＨ７以上の水溶液中でマイナスに帯電する官能基とするのが好ましい。この要件を満たす標的認識分子は、ｐＨが７以上（例えばｐＨ７.８）のキャリア水溶液に溶解すると、帯電性セグメントのマイナス電荷密度
が十分に高まるので、プラス電荷を与えた固定化部位（電極）に効率よく集合させ可逆的に固定化させることができる。
【０１９１】
他方、標的認識ペプチドセグメントの平均等電点が「８以上」である場合には、帯電性セグメントの帯電性官能基をｐＨ７以下の水溶液中でプラスに帯電する官能基とするのが好ましい。この要件を満たす標的認識分子は、ｐＨが７以下（例えばｐＨ６.２）のキャ
リア水溶液に溶解すると、帯電性セグメントのプラス電荷密度が十分に高まる。よって、この要件を充足させることにより、マイナス電荷を与えた固定化部位（電極）に効率よく集合させ可逆的に固定化させることができることになる。
【０１９２】
上記実施例３〜９の標的認識分子においては、基材結合セグメントを有しない標的認識分子を示したが、これらの分子に対しても第1実施例群に示したように、基材に共有結合させることのできる基材結合セグメントを化学結合させることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１９３】
本発明の標的認識分子は、特定物質に特異的に反応する感応部位である標的認識セグメントと、帯電性が付与された帯電性セグメントとを備える新規な化学分子であり、本発明の標的認識分子を含む溶液を用いると、電荷を印加した固定化部位に、標的認識分子を自己集合的かつ高密度に集合させ可逆的固定を行うことができる。また、基材結合セグメントを備える本発明の標的認識分子を用いると、電荷を印加した固定化部位に、標的認識分子を自己集合的に高密度に固定化することができる。このような本発明標的認識分子は、分析チップなど分析用デバイスの使い勝手性、分析精度、信頼性を格段に高めることに寄与する。よってその産業上の利用可能性は大きい。
【符号の説明】
【０１９４】
１ 標的認識セグメント
２ 連結セグメント
３ 帯電性セグメント
３’ 帯電性セグメントの繰り返し単位
４ 基材
５ 基材結合セグメント
１０ 分析チップ
１１ 注液口
１２ マイクロ流路
１３ 排出口
１４・１５ 電極（何れか一方が固定化部位）
１６ 検出器
１７ 電源
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質を特異的に識別する認識部位としての標的認識ペプチドセグメントと、
静電気的作用を利用して基材に可逆的に固定させるセグメントであって同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電し得る３個以上の帯電性官能基を備えた帯電性セグメントと、
アミノ酸残基を含むセグメントであって前記標的認識ペプチドセグメントと前記帯電性セグメントのそれぞれに化学結合して両者を連結する連結セグメントと、
を有する標的認識分子。
【請求項２】
請求項１に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、アミノ酸残基を有さないセグメントであり、
前記連結セグメントは、アミノ酸残基からなるセグメントであり、
前記標的認識ペプチドセグメントは、システイン残基を含み、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項３】
請求項１に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントおよび前記帯電性セグメントは、それぞれシステイン残基を含んでなり、
前記標的認識ペプチドセグメントの前記システイン残基の硫黄元素に、前記連結セグメントの一端が化学結合され、
前記帯電性セグメントの前記システイン残基の硫黄元素に、前記連結セグメントの他端が化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項４】
請求項１に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が、６以下であり、
前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、ｐＨ７以上の水溶液中でマイナスに帯電する官能基である、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項５】
請求項１に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が、８以上であり、
前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、ｐＨ７以下の水溶液中でプラスに帯電する官能基である、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項６】
請求項１、３、４、５の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントが、３個以上のアミノ酸残基を有するペプチドからなる、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項７】
請求項６に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントとしてのペプチドは、アルギニン、リシンからなる群から１つ以上選択された塩基性アミノ酸残基を３個以上含み、かつ、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基を含まない、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項８】
請求項６に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントとしてのペプチドは、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から１つ以上選択された酸性アミノ酸残基を３個以上含み、かつ、アルギニン残基及びリシン残基を含まない、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項９】
請求項６ないし８の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントを構成するアミノ酸残基の数が、前記標的認識ペプチドセグメントを構成するアミノ酸残基の数よりも多い、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項１０】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化１で表されるポリアクリル酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化１】
【請求項１１】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化２で表されるポリスチレンスルホン酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化２】
【請求項１２】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、化３で表されるポリエチレンイミン構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化３】
【請求項１３】
請求項１〜３、５の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化４で表されるポリアリルアミン塩酸塩構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化４】
【請求項１４】
請求項１〜３、５の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化５で表されるポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化５】
【請求項１５】
請求項１〜３、５の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化６で表されるポリビニルピリジン構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化６】
【請求項１６】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化７で表されるポリビニル硫酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化７】
【請求項１７】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが１以上１５０以下の化８で表されるデキストラン硫酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化８】
【請求項１８】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが１以上１５０以下の化９で表されるコンドロイチン硫酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化９】
【請求項１９】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化１０で表されるヌクレオチド構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化１０】
【請求項２０】
請求項１ないし１９の何れかに記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、同一の溶液中で異なる極性に帯電する官能基を有しない、
を有する標的認識分子。
【請求項２１】
請求項１ないし２０の何れかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントは、３個以上１９個以下のアミノ酸残基を有するペプチドからなる、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２２】
請求項１〜２、４〜２１の何れかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントはシステイン残基を含み、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２３】
請求項１〜２、４〜２１の何れかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントの一方端がシステイン残基であり、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２４】
請求項１〜２、４〜２１の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントのＮ末端またはＣ末端の何れか一方に前記連結セグメントが化学結合され、当該結合部位と異なる連結セグメント部位に前記帯電性セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２５】
実施例１−１、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４
請求項１ないし２３の何れかに記載の標的分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントと前記帯電性セグメントがシステイン残基をそれぞれ有し、
前記連結セグメントが、ジスルフィド基およびマレイミド基のうちから選択されるチオール基と反応可能な２つの官能基を有し、
前記標的認識ペプチドセグメントと前記連結セグメントとが、前記システイン残基と前記ジスルフィドとの反応により生じるジスルフィド結合により、または前記システイン残基の硫黄元素が前記マレイミド基に付加することにより、化学結合しており、
前記帯電性セグメントと前記連結セグメントとが、前記システイン残基と前記ジスルフィドとの反応により生じるジスルフィド結合により、または前記システイン残基の硫黄元素が前記マレイミド基に付加することにより、化学結合している、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２６】
請求項１ないし２５の何れかに記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントに、更に、基材と化学結合させるための官能基を備えた基材結合用セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載の標的認識分子において、
前記連結セグメントは、一方端の結合可能部位で標的認識ペプチドセグメントと化学結合し、前記一方端の結合可能部位から最も離れた他方端結合可能部位で前記帯電性セグメントと化学結合し、
前記帯電性セグメントは、前記連結セグメントと化学結合した部位から最も離れた結合可能部位で前記基材結合用セグメントと化学結合している、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２８】
実施例１−２、１−３、１−４
請求項２６または２７に記載の標的認識分子において、
前記基材結合用セグメントが、チオール基、アジド基、またはスクシンイミド基を含む、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２９】
マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項４、６〜１２、１６〜２５の何れか１項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。
【請求項３０】
マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項５〜９、１２〜１５、２０〜２５の何れか１項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。
【請求項３１】
マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項２６ないし２８の何れかに記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用セグメントと電極とを化学結合させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。
【請求項３２】
マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項２６ないし２８の何れかに記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用セグメントと電極とを化学結合させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。
【請求項３３】
電極を備えた基板と、前記電極に固定化された標的認識分子と、を有する標的認識分子固定化電極基板であって、
前記標的認識分子が、上記請求項１ないし２８の何れか１項に記載された標的認識分子である、
ことを特徴とする標的認識分子固定化電極基板。
【請求項３４】
電極と、前記電極に固定化された標的認識分子と、標的認識分子が捕捉した標的分子を検出する検出器と、を有する特定分子検出装置であって、
前記標的認識分子が、上記請求項１ないし２８の何れか１項に記載された標的認識分子である、
ことを特徴とする特定分子検出装置。
【請求項１】
標的物質を特異的に識別する認識部位としての標的認識ペプチドセグメントと、
静電気的作用を利用して基材に可逆的に固定させるセグメントであって同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電し得る３個以上の帯電性官能基を備えた帯電性セグメントと、
アミノ酸残基を含むセグメントであって前記標的認識ペプチドセグメントと前記帯電性セグメントのそれぞれに化学結合して両者を連結する連結セグメントと、
を有する標的認識分子。
【請求項２】
請求項１に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、アミノ酸残基を有さないセグメントであり、
前記連結セグメントは、アミノ酸残基からなるセグメントであり、
前記標的認識ペプチドセグメントは、システイン残基を含み、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項３】
請求項１に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントおよび前記帯電性セグメントは、それぞれシステイン残基を含んでなり、
前記標的認識ペプチドセグメントの前記システイン残基の硫黄元素に、前記連結セグメントの一端が化学結合され、
前記帯電性セグメントの前記システイン残基の硫黄元素に、前記連結セグメントの他端が化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項４】
請求項１に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が、６以下であり、
前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、ｐＨ７以上の水溶液中でマイナスに帯電する官能基である、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項５】
請求項１に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が、８以上であり、
前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、ｐＨ７以下の水溶液中でプラスに帯電する官能基である、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項６】
請求項１、３、４、５の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントが、３個以上のアミノ酸残基を有するペプチドからなる、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項７】
請求項６に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントとしてのペプチドは、アルギニン、リシンからなる群から１つ以上選択された塩基性アミノ酸残基を３個以上含み、かつ、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基を含まない、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項８】
請求項６に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントとしてのペプチドは、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から１つ以上選択された酸性アミノ酸残基を３個以上含み、かつ、アルギニン残基及びリシン残基を含まない、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項９】
請求項６ないし８の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントを構成するアミノ酸残基の数が、前記標的認識ペプチドセグメントを構成するアミノ酸残基の数よりも多い、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項１０】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化１で表されるポリアクリル酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化１】
【請求項１１】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化２で表されるポリスチレンスルホン酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化２】
【請求項１２】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、化３で表されるポリエチレンイミン構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化３】
【請求項１３】
請求項１〜３、５の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化４で表されるポリアリルアミン塩酸塩構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化４】
【請求項１４】
請求項１〜３、５の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化５で表されるポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化５】
【請求項１５】
請求項１〜３、５の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化６で表されるポリビニルピリジン構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化６】
【請求項１６】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化７で表されるポリビニル硫酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化７】
【請求項１７】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが１以上１５０以下の化８で表されるデキストラン硫酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化８】
【請求項１８】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが１以上１５０以下の化９で表されるコンドロイチン硫酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化９】
【請求項１９】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、ｎが３以上１５０以下の化１０で表されるヌクレオチド構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
【化１０】
【請求項２０】
請求項１ないし１９の何れかに記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、同一の溶液中で異なる極性に帯電する官能基を有しない、
を有する標的認識分子。
【請求項２１】
請求項１ないし２０の何れかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントは、３個以上１９個以下のアミノ酸残基を有するペプチドからなる、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２２】
請求項１〜２、４〜２１の何れかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントはシステイン残基を含み、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２３】
請求項１〜２、４〜２１の何れかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントの一方端がシステイン残基であり、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２４】
請求項１〜２、４〜２１の何れか１項に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントのＮ末端またはＣ末端の何れか一方に前記連結セグメントが化学結合され、当該結合部位と異なる連結セグメント部位に前記帯電性セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２５】
実施例１−１、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４
請求項１ないし２３の何れかに記載の標的分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントと前記帯電性セグメントがシステイン残基をそれぞれ有し、
前記連結セグメントが、ジスルフィド基およびマレイミド基のうちから選択されるチオール基と反応可能な２つの官能基を有し、
前記標的認識ペプチドセグメントと前記連結セグメントとが、前記システイン残基と前記ジスルフィドとの反応により生じるジスルフィド結合により、または前記システイン残基の硫黄元素が前記マレイミド基に付加することにより、化学結合しており、
前記帯電性セグメントと前記連結セグメントとが、前記システイン残基と前記ジスルフィドとの反応により生じるジスルフィド結合により、または前記システイン残基の硫黄元素が前記マレイミド基に付加することにより、化学結合している、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２６】
請求項１ないし２５の何れかに記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントに、更に、基材と化学結合させるための官能基を備えた基材結合用セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載の標的認識分子において、
前記連結セグメントは、一方端の結合可能部位で標的認識ペプチドセグメントと化学結合し、前記一方端の結合可能部位から最も離れた他方端結合可能部位で前記帯電性セグメントと化学結合し、
前記帯電性セグメントは、前記連結セグメントと化学結合した部位から最も離れた結合可能部位で前記基材結合用セグメントと化学結合している、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２８】
実施例１−２、１−３、１−４
請求項２６または２７に記載の標的認識分子において、
前記基材結合用セグメントが、チオール基、アジド基、またはスクシンイミド基を含む、
ことを特徴とする標的認識分子。
【請求項２９】
マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項４、６〜１２、１６〜２５の何れか１項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。
【請求項３０】
マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項５〜９、１２〜１５、２０〜２５の何れか１項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。
【請求項３１】
マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項２６ないし２８の何れかに記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が６以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用セグメントと電極とを化学結合させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。
【請求項３２】
マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項２６ないし２８の何れかに記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が８以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液ｐＨをｐＨ７以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用セグメントと電極とを化学結合させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。
【請求項３３】
電極を備えた基板と、前記電極に固定化された標的認識分子と、を有する標的認識分子固定化電極基板であって、
前記標的認識分子が、上記請求項１ないし２８の何れか１項に記載された標的認識分子である、
ことを特徴とする標的認識分子固定化電極基板。
【請求項３４】
電極と、前記電極に固定化された標的認識分子と、標的認識分子が捕捉した標的分子を検出する検出器と、を有する特定分子検出装置であって、
前記標的認識分子が、上記請求項１ないし２８の何れか１項に記載された標的認識分子である、
ことを特徴とする特定分子検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−９３３７１（Ｐ２０１２−９３３７１Ａ）
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２４３２（Ｐ２０１２−２２４３２）
【出願日】平成２４年２月３日（２０１２．２．３）
【分割の表示】特願２００９−１１７８７３（Ｐ２００９−１１７８７３）の分割
【原出願日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（０００００５０４９）シャープ株式会社 (33,933)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月３日（２０１２．２．３）
【分割の表示】特願２００９−１１７８７３（Ｐ２００９−１１７８７３）の分割
【原出願日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（０００００５０４９）シャープ株式会社 (33,933)
【Ｆターム（参考）】
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