歯周病の診断方法及び歯周病診断キット
【解決手段】唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを指標とし、検出手段が免疫学的測定法であることを特徴とする歯周病の診断方法。
唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを免疫学的測定法により検出又は測定する手段とを含み、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定することを特徴とする歯周病診断キット。
【効果】本発明の歯周病の診断方法及び診断キットによれば、歯周病の有無の診断あるいはその進行の予測を迅速に、簡便かつ正確に行うことができる。
唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを免疫学的測定法により検出又は測定する手段とを含み、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定することを特徴とする歯周病診断キット。
【効果】本発明の歯周病の診断方法及び診断キットによれば、歯周病の有無の診断あるいはその進行の予測を迅速に、簡便かつ正確に行うことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを免疫学的測定法により検出又は測定することにより、歯周病の有無あるいは進行を正確かつ簡便に診断することができる歯周病の診断方法及び歯周病診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は局所における細菌感染とそれに対する免疫防御反応の結果引き起こされる、歯周組織の破壊と歯槽骨の吸収を伴う慢性炎症疾患である。歯周病の初期症状としては、歯肉の発赤、腫脹、出血が挙げられるが、これらの症状は見過ごされる場合が多く、病状はさらに進行して歯肉の退縮、歯槽骨の吸収が起こり、最終的には歯の喪失に繋がる。歯の喪失を防ぐには適切な治療、処置が必要であり、そのためには歯周病の有無、程度を的確にとらえる診断が重要である。
【０００３】
現在行われている歯周病の診断には、炎症の程度や出血の有無を目視で判断する歯肉炎指数：Ｇｉｎｇｉｖａｌ Ｉｎｄｅｘ（ＧＩ）、歯肉出血指数：Ｂｌｅｅｄｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ（ＢＩ）、歯周ポケット深さを測定する、歯肉溝滲出液量を測定する、レントゲン撮影により歯槽骨吸収を確認する、歯の動揺を確認する方法等がある。しかし、これらの方法は、歯科医師等の経験を積んだ技術が必要であり、しかも一人当たりの検診時間に長時間を要するという欠点があり、汎用し難い技術であった。
【０００４】
また、歯垢中の歯周病原性細菌、歯肉溝滲出液や唾液に含まれる特定の酵素や特定の蛋白質などを診断指標として、歯周病の程度を判断する方法や、抗ラクトフェリン抗体等の特定の抗体を用いた方法、唾液中の肝細胞増殖因子濃度を測定する方法（特許文献１〜５参照）などが提案されている。しかし、これらの方法は、測定結果と歯周疾患の程度との相関は高いとは言い難く、診断方法として満足できるものではなく、新たな歯周病の診断技術が望まれる。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−０４３１６５号公報
【特許文献２】特開平１０−５０１０７０号公報
【特許文献３】特許第３１６５７８８号公報
【特許文献４】特開２００３−０６６０３９号公報
【特許文献５】国際公開第０２／０７９７８０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０３／０７６６１４号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ Ｉｎｔ Ａｃａｄ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ，２００３ Ａｐｒ；５（２）：３５−４０
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，２００７ Ａｐｒ；５３（４）：７５７−６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、歯周病の有無の診断あるいはその進行の予測を迅速に、簡便かつ正確に行うことができる歯周病の診断方法及び歯周病診断キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成するため種々検討した結果、ヒトの唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシン、特にβ−デフェンシン２又はβ−デフェンシン３の濃度と歯周病の程度との間に高い相関があり、このヒトの唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを指標とし、β−デフェンシンを検出又は測定することにより、歯周病の有無の診断あるいはその進行を予測できること、更に、β−デフェンシンを検出又は測定を、抗β−デフェンシン抗体を用いた免疫学的測定法、特に酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により行うことで、検体（ヒトの唾液又は歯肉溝浸出液）中のβ−デフェンシンの存在又は含有量を目視で判定でき、操作も簡単かつ短時間に行うことができ、歯周病の診断をより迅速、かつ簡便にできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
デフェンシンは、高等生物に存在する抗菌ペプチドの一種で、その構造から大きくα−デフェンシンとβ−デフェンシンに分類され、皮膚、口腔、気管といった外部と接触する上皮組織に存在することが知られている。更に、歯周病原菌に対する殺菌作用を有することから、歯周病のケアに有用であるという報告（非特許文献１参照）や、唾液中のα−デフェンシン１と血清中の炎症マーカーが相関を示すことから、口腔の炎症性疾患のマーカーとしてのα−デフェンシン１の可能性を示唆した報告もある（非特許文献２参照）。しかし、従来の技術は、歯周病診断指標として利用できるほどの精度はなく、また、上記報告では、α−デフェンシン１の測定に高速液体クロマトグラフを使用しており、操作が面倒で簡便性に劣るもので、歯周病の診断技術としては採用し難い。
【０００９】
なお、国際公開第０３／０７６６１４号パンフレット（特許文献６）には、デフェンシン産生の消長が歯周疾患の発病に密接に関わることから、デフェンシンの発現を制御するデフェンシン遺伝子の発現能力を制御するプロモーター活性の変動を調べることにより、歯周疾患の罹患感受性を推定するためのデータを得る方法が提案されている。
【００１０】
このようにデフェンシンが歯周疾患に関連することは知られているが、本発明では、唾液又は歯肉溝浸出液中のデフェンシン、とりわけβ−デフェンシン２又はβ−デフェンシン３を指標とすること、特にβ−デフェンシンを免疫学的測定法で検出又は測定することにより、更には、唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを免疫学的測定法により検出又は測定する手段とを含むキットで、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定することにより、煩雑な前処理等を行うことなく、簡便な操作で短時間に、しかも、潜血を用いた方法や高速液体クロマトグラフによる測定方法に比較して高精度に歯周病の有無の診断あるいはその進行の予測を行うことができ、汎用性が高いものである。
【００１１】
従って、本発明は、唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを指標とし、検出手段が免疫学的測定法であることを特徴とする歯周病の診断方法、及び唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを免疫学的測定法により検出又は測定する手段とを含み、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定することを特徴とする歯周病診断キットを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の歯周病の診断方法及び診断キットによれば、歯周病の有無の診断あるいはその進行の予測を迅速に、簡便かつ正確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明につき更に詳細に説明する。本発明の歯周病の診断方法は、唾液又は歯肉溝浸出液中に含まれるβ−デフェンシンを測定し、歯周病の有無あるいはその進行を予測するものであり、歯周病診断キットは、唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定する手段とを含み、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定するものである。
【００１４】
デフェンシンは、高等生物に存在する抗菌ペプチドの一種で、その構造から大きくα−デフェンシンとβ−デフェンシンに分類され、皮膚、口腔、気管といった外部と接触する上皮組織に存在することが知られている。β−デフェンシンは、上皮由来の感染防御因子として機能し、歯肉、舌、唾液腺、他の口腔内で発現し、３種のβ−デフェンシン（β−デフェンシン１，β−デフェンシン２、β−デフェンシン３）が知られている。
【００１５】
本発明では、ヒトの唾液又は歯肉溝浸出液を検体とし、この検体中のβ−デフェンシンを検出又はその濃度を測定するものであり、β−デフェンシンの中でも特にβ−デフェンシン２又はβ−デフェンシン３を検出又はその濃度を測定することが、歯周病の診断に有効である。なお、β−デフェンシン２の重量平均分子量は、ＭＷ３３７１、β−デフェンシン３の重量平均分子量は、ＭＷ３４８６である。
【００１６】
検体としては、口腔内から採取した唾液又は歯肉溝浸出液を用いることができる。
唾液を検体に用いる場合、唾液の種類としては、安静状態で分泌された唾液を吐出して採取した安静唾液、又はパラフィンガムを咀嚼することによって短時間で安静唾液と比較して大量の唾液を採取可能な刺激唾液がある。安静唾液と刺激唾液では、パラフィンガム咀嚼に伴う口腔内刺激の有無によって、唾液の分泌量や歯肉溝液の滲出、口腔内の汚れや細菌数等が異なるとされているが、検体にはいずれをも用いることができる。
唾液の採取手段は、通常の方法を用いることができ、安静状態で口中にたまった唾液を容器に吐出す方法、パラフィンガムを咀嚼することで口中にたまった唾液を容器に吐出す方法などを採用できる。
【００１７】
口腔内から採取する唾液の量は、０．１〜１０ｍＬが好ましく、１〜５ｍＬがより好ましい。０．１ｍＬに満たないと、唾液採取容器から分注や遠心分離処理がやりにくいといった支障をきたし、１０ｍＬを超えて採取するには、時間がかかり被験者に負担がかかるといった弊害があることがある。
【００１８】
検体の唾液としては、採取した唾液をそのまま用いる全唾液、唾液を遠心分離して不溶物を除去した唾液上清のいずれをも使用できる。唾液上清はそのまま検体として用いてもよいが、唾液上清を溶媒希釈して用いることが、唾液成分による測定への干渉を低減して、より正確な結果を得られるという点から好ましい。
なお、唾液は、採取直後に検体として使用するか、あるいは保存する場合は、採取後に凍結することなく４〜１０℃で低温保存することが望ましいが、予め採取して凍結保存したものを融解して用いてもよい。
【００１９】
唾液の遠心分離は、回転数３０００〜１２０００ｒｐｍ、特に５０００〜１００００ｒｐｍで行うことが好ましく、３０００ｒｐｍ未満では、唾液の不溶物を除去できないことがあり、１２０００ｒｐｍを超える条件で処理を行っても結果に変化はない。また、処理時間は５〜３０分、特に１０〜２０分間が好ましい。５分未満では、唾液の不溶物を除去できないことがあり、３０分を超えて処理を行っても変化はない。処理温度は２５℃以下、特に１０℃以下が好ましい。２５℃より高いと、唾液に含まれるタンパク分解酵素により唾液成分が変性することがある。
【００２０】
唾液を希釈する場合、希釈溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液などを用いることができる。
唾液上清の希釈倍率は、遠心分離して得た上清を２〜５倍希釈することが好ましく、２倍に満たないと唾液成分による干渉を受け、５倍を超えるとデフェンシン濃度が低くなり検出限界に満たない場合がある。
【００２１】
また、歯肉溝浸出液を検体として用いる場合は、口腔内の歯肉溝から浸出液を採取して用いる。歯肉溝浸出液の採取手段としては、口腔内の歯肉溝に濾紙片等の液体吸収性を有する検体採取用の支持体を挿入して、浸出液をしみ込ませた後、この浸出液がしみ込んだ濾紙片等の支持体から、抽出溶媒を用いた抽出処理などによりβ−デフェンシンを抽出し、これを歯肉溝浸出液の検体として測定に供することができる。
【００２２】
歯肉溝に濾紙片を挿入し、好ましくは指等で濾紙片を上から歯肉溝に押し当て、３０秒〜５分間放置することが、歯肉溝の浸出液を濾紙片に十分にしみ込ませることから望ましい。また、β−デフェンシンの抽出手段としては、溶媒抽出が好ましい。
【００２３】
また、溶媒抽出において、抽出溶媒としては、例えば蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液等を用いることができ、抽出条件は、歯肉溝の浸出液をしみ込ませた濾紙片をマイクロテストチューブあるいは試験管に入れ、そこに抽出溶媒を５０μＬ〜１ｍＬ入れ、ボルテックスミキサー、振とう器で振とう抽出する。抽出後、これを検体として使用することができる。
【００２４】
本発明では、唾液又は歯肉溝浸出液中に含まれるβ−デフェンシンの検出又は測定を免疫学的測定法で行う。免疫学的測定法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ラテックス凝集法、免疫比濁法など一般的に使用されている方法を用いることができるが、特にＥＬＩＳＡ法が好適に採用される。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、プラスチックの表面などの固相に、検体、例えば唾液もしくは希釈した唾液５０〜２００μＬを接触させ、溶液中のタンパク質を吸着させた後、目的物質と特異的に反応する抗体を加えると、抗体は固相に吸着した成分の中で目的成分とのみ結合する。そして、結合した抗体と反応して発色する化学物質を用いることで、色の濃さにより結合した抗体量（＝目的物質量）が分かるものである。
【００２５】
ＥＬＩＳＡ法は、検体中に含まれる目的物質を、酵素標識した抗体又は抗原を用い、抗原抗体反応を利用して定量的に検出する方法であり、目的物質を高感度で検出でき、定量性にも優れた方法である。抗原抗体反応を利用して検出するため粗抽出段階で測定が可能であり、面倒な精製や前処理等の工程を行わなくてもよく、短時間で測定することができる。ＥＬＩＳＡ法は、測定原理の違いからサンドイッチ法（非競合法）と競合法とに大別されるが、本発明ではどちらの方法を用いてもよい。
【００２６】
抗体は、市販されているものでよく、例えば、ａｎｔｉ−ｂｅｔａ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２ Ｈｕｍａｎ Ｒａｂｂｉｔ（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ社製）やａｎｔｉ−ｂｅｔａ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ３ Ｈｕｍａｎ Ｒａｂｂｉｔ（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ社製）などが挙げられる。
検出用に使用する酵素標識抗体としては、使用する一次抗体の免疫動物に合わせたアルカリフォスファターゼやペルオキシターゼ標識の２次抗体、例えば、Ａｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＡＬＰ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）やＡｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）などが挙げられる。
反応条件は、一般的なＥＬＩＳＡ反応条件で行い、検出方法は発色の程度を目視で判定する方法や、分光光度計で吸光度を測定する方法があるが、目視による判定が特別な機器を必要とせず、簡便であることから好ましい。検出濃度は、使用する抗体の種類、反応条件により異なるが、β−デフェンシン濃度として８ｐｇ／ｍＬ以上であれば検出することができる。
【００２７】
ＥＬＩＳＡ法による測定には、市販のβ−デフェンシン２又はβ−デフェンシン３測定用キット、例えば、β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ、β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｋｉｔ；Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ，Ｌｔｄ、β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ３（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣなどを用いることができる。前述のキットは、競合ＥＬＩＳＡ法によるもので、抗βデフェンシン２抗体を固定したマイクロプレート、２次抗体としてビオチン化抗β−デフェンシン抗体および検出用ストレプトアビジン化ペルオキシダーゼ溶液からなる。後述のキットは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるもので、２種類の抗βデフェンシン２抗体とアビジン標識ペルオキシダーゼ溶液からなる。
【００２８】
本発明の歯周病診断キットは、上記したような唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定する手段とを含み、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定するものであり、剤型は、唾液を採取するための容器、もしくは歯肉溝浸出液を採取するための濾紙片と、免疫学的測定法に用いる抗β−デフェンシン抗体、検出用試薬等を含む検出又は測定手段からなる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、以下の例において％は特に断らない限り、いずれも質量％である。
【００３０】
［実施例１］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清を生理食塩水で４倍希釈して唾液溶液とし、これを検体（唾液サンプル）として用いた。
【００３１】
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ）を用い、キット付属のプレートの各ウェルにβ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２標準液又は唾液サンプル１００μＬを加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ビオチン化抗β−デフェンシン２抗体溶液１００μＬを加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ストレプトアビジン化ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄した後、基質溶液１００μＬを加え、室温で２０分間インキュベートし、反応停止液１００μＬを加えた。反応液の色の濃淡を目視により判定した。
【００３２】
反応液の色は、β−デフェンシン２量が検出限界未満の場合は無色で、β−デフェンシン２量が少ないと薄い黄色を呈し、量が多くなるにつれて黄色が濃くなる。β−デフェンシン２の検出限界は８ｐｇ／ｍＬであり、この濃度未満では無色、８ｐｇ／ｍＬ以上１００ｐｇ／ｍＬ未満ではうすい黄色、１００ｐｇ／ｍＬ以上５００ｐｇ／ｍＬ未満では黄色、５００ｐｇ／ｍＬ以上では濃い黄色を呈色する。よって、判定基準は以下の通りとした。なお、試薬は全てキット付属の物を用いた。
判定基準；
０：無色 １：うすい黄色 ２：黄色 ３：濃い黄色
【００３３】
［実施例２］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清を唾液溶液とし、これを検体（唾液サンプル）とした。
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ）を用い、実施例１と同様に試験を行った。
【００３４】
［実施例３］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、これをそのまま検体（唾液サンプル）として用い、試験に供した。
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ）を用い、実施例１と同様に試験を行った。
【００３５】
［実施例４］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清を生理食塩水で２倍希釈して唾液溶液とし、これを検体（唾液サンプル）として用いた。
【００３６】
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｋｉｔ；Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ，Ｌｔｄ）を用い、９６ウェルプレート（Ｈ−Ｔｙｐｅ Ｐｌａｔｅ；ＳＵＭＩＬＯＮ）の各ウェルにβ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２標準液又は唾液サンプル１００μＬを加え、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ビオチン化抗β−デフェンシン２抗体溶液１００μＬを加え、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ストレプトアビジン化ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄した後、基質溶液１００μＬを加え、室温で１５分間インキュベートし、反応停止液１００μＬを加えた。反応液の色の濃淡を目視により判定した。
【００３７】
反応液の色は、β−デフェンシン２量が検出限界未満の場合は無色で、β−デフェンシン２量が少ないと、うすい黄色を呈し、量が多くなるにつれて黄色が濃くなる。β−デフェンシン２の検出限界は８ｐｇ／ｍＬであり、この濃度未満では無色、８ｐｇ／ｍＬ以上１００ｐｇ／ｍＬ未満ではうすい黄色、１００ｐｇ／ｍＬ以上５００ｐｇ／ｍＬ未満では黄色、５００ｐｇ／ｍＬ以上では濃い黄色を呈色する。判定基準は実施例１と同様に行った。なお、試薬は全てキット付属の物を用いた。
【００３８】
［実施例５］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清を生理食塩水で４倍希釈して唾液溶液とし、これを検体（唾液サンプル）として用いた。
【００３９】
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ３測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ３（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ）を用い、キット付属のプレートの各ウェルにβ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ３標準液又は唾液サンプル１００μＬを加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ビオチン化抗β−デフェンシン３抗体溶液１００μＬを加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ストレプトアビジン化ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄した後、基質溶液１００μＬを加え、室温で２０分間インキュベートし、反応停止液１００μＬを加えた。
【００４０】
反応液の色の濃淡を目視により判定した。反応液の色はβ−デフェンシン３量が検出限界未満の場合は無色で、β−デフェンシン３量が少ないと、うすい黄色を呈し、量が多くなるにつれて黄色が濃くなる。β−デフェンシン３の検出限界は８ｐｇ／ｍＬであり、この濃度未満では無色、８ｐｇ／ｍＬ以上１００ｐｇ／ｍＬ未満ではうすい黄色、１００ｐｇ／ｍＬ以上５００ｐｇ／ｍＬ未満では黄色、５００ｐｇ／ｍＬ以上では濃い黄色を呈色する。判定基準は実施例１と同様とした。なお、試薬は全てキット付属の物を用いた。
【００４１】
［実施例６］
被験者の歯肉ポケットにペリオペーパー（株式会社ヨシダ）を差し入れ、１分間おいて浸出液を染み込ませた。２００μＬのリン酸緩衝液にペリオペーパーを入れ、室温にて、ボルテックスミキサーで５分間振とうして浸出液成分を抽出し、検体２００μＬを得た。これを検体（歯肉溝浸出液サンプル）として用い、試験に供した。なお、リン酸緩衝液は、以下のように調製した。
【００４２】
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）：
リン酸水素２ナトリウム・１２水和物８．６ｇ、リン酸２水素ナトリウム・２水和物０．９９ｇ、塩化ナトリウム２５．５ｇをイオン交換水に溶解し、３Ｌとした。
【００４３】
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ）を用い、上記の歯肉溝浸出液サンプルを用いて、実施例１と同様に試験を行った。
【００４４】
［比較例１］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清をリン酸緩衝液で５倍希釈して唾液溶液とした。
【００４５】
唾液溶液１００μＬをプロテインチップ（ＣＭ１０ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ａｒｒａｙ；ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ）にのせ、サンプルを添加するサンプルプレートに官能基を修飾して解析対象を捕捉する表面増強レーザー脱離イオン化による飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）システム（ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ）により、唾液成分測定を行った。このＳＥＬＤＥＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステムによる測定値からβ−デフェンシン２の分子量（ＭＷ＝３３７１）に相当するピーク強度を測定した。得られたβ−デフェンシン２のピーク強度から、唾液中のβ−デフェンシン２量を判定した。なお、ピーク強度とは、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）で表し、判定基準は以下の通りとした。
【００４６】
判定基準
０点： β−デフェンシン２のピークが検出されない
１点： β−デフェンシン２の弱いピーク（Ｓ／Ｎ比＝２５未満）が検出される
２点： β−デフェンシン２のピーク（Ｓ／Ｎ比＝２５以上７５未満）が検出される
３点： β−デフェンシン２の強いピーク（Ｓ／Ｎ比＝７５以上）が検出される
【００４７】
［比較例２］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清をリン酸緩衝液で５倍希釈して唾液溶液とした。
【００４８】
唾液溶液１００μＬをプロテインチップ（ＣＭ１０ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ａｒｒａｙ；ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ）にのせ、ＳＥＬＤＥＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステム（ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ）により、唾液成分測定を行った。β−デフェンシン３の分子量（ＭＷ＝３４８６）に相当するピーク強度から、唾液中のβ−デフェンシン３量を判定した。なお、ピーク強度とは、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）で表し、判定基準は上記と同様である。
【００４９】
［比較例３］唾液中の潜血評価
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、唾液をそのまま検体として用いて試験に供した。
唾液検査試験紙（サリバスター潜血用；昭和薬品化工（株）製）を用い、唾液潜血を評価した。判定は本品の指示に従って行い、その判定基準は以下の通りであった。
【００５０】
判定基準
−（黄色） ： 出血なし
＋（青） ： 僅かに出血あり
＋＋（濃い青） ： 多少出血あり
【００５１】
［比較例４］唾液中α−デフェンシン１評価
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清を唾液溶液とした。
唾液溶液及び５ｎｇ／ｍＬのα−デフェンシン１標準液各１０μＬについて、ＨＰＬＣ分析（高速液体クロマトグラフ分析）を下記条件で行い、１５分付近に溶出するα−デフェンシン１のピークを検出し、そのピーク面積を得た。唾液中のα−デフェンシン１濃度は、以下の式で計算した。
【００５２】
ＨＰＬＣ分析の条件
カラム ：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０ＴＭ（４．６×２５０ｍｍ）
移動相Ａ液 ：０．０５％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリル*1
移動相Ｂ液 ：０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル*2
グラジエント：０ｍｉｎ．Ａ １００％ → ２０ｍｉｎ．Ｂ １００％
検出 ：ＵＶ ２２５ｎｍ
移動相流量 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度 ：４０℃
【００５３】
＊１；
０．０５％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリル：アセトニトリル（和光純薬工業（株）から購入）１００ｍＬにイオン交換水を加えて１０００ｍＬとし、これにトリフルオロ酢酸（和光純薬工業（株）から購入）０．５ｇを加え、混和した。
＊２；
０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル：アセトニトリル（和光純薬工業（株）から購入）５００ｍＬにイオン交換水を加えて１０００ｍＬとし、これにトリフルオロ酢酸（和光純薬工業（株）から購入）０．５ｇを加え、混和した。
【００５４】
【数１】
【００５５】
上記実施例及び比較例において、健常人と歯周病患者との唾液又は歯肉溝浸出液を使用して、各々について同様に評価した。結果を表１に示す。
【００５６】
なお、被験者は、ＧＩが０．５未満の場合を健常、ＧＩが０．５以上の場合を歯周病として、各群（各実施例及び比較例）について８名ずつの試験を行った。ＧＩとは、歯肉の状態を判断する指標で、その基準は以下の通りである。
ＧＩ基準
０＝正常歯肉。
１＝軽度の炎症。軽度の色変化、浮腫があるが、探針により出血しないもの。
２＝中程度の炎症。発赤、浮腫があり、探針により出血するもの。
３＝高度の炎症。著しい発赤、腫脹、自然出血の傾向、潰瘍形成のあるもの。
【００５７】
表１に示す実施例及び比較例における健常人及び歯周病患者の唾液又は歯肉溝浸出液（検体）の測定結果と各方法の判定精度及び簡便性の基準は、以下の通りである。
判定精度
◎＝健常人と歯周病患者の測定結果に明らかな差が認められる
○＝健常人と歯周病患者の測定結果に差が認められる
△＝健常人と歯周病患者の測定結果に差が認めにくい
簡便性
◎＝非常に簡便である（検体の前処理が必要ない、目視による判定が可能である）
○＝簡便である（検体の前処理を要する、目視による判定が可能である）
△＝簡便性に劣る（判定に特別な装置を要する）
【００５８】
【表１】
【００５９】
表１の結果から、実施例１〜６では、健常人の唾液又は歯肉溝浸出液は無色〜うすい黄色（ほとんどの唾液が無色）を示したのに対し、歯周病患者の唾液又は歯肉溝浸出液はほとんどが黄色〜濃い黄色を示すことから、歯周病において唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシン２あるいはβ−デフェンシン３量が増えることがわかった。よって、ＥＬＩＳＡ法を採用して、唾液又は歯肉溝浸出液の発色を見ることで、歯周病に罹患しているか、そうでないかの判定ができることが確認された。また、実施例３の結果から、唾液の前処理を行わないと、健常人の唾液もうすい黄色を示し、歯周病患者との差は認められるものの、遠心分離や希釈といった前処理を行ったほうが、より歯周病に罹患しているか、そうでないかの判定がしやすいことがわかった。
比較例１，２，４は、健常人と歯周病患者の判定はできるが、測定に質量分析計や液体クロマトグラフを用いる点で簡便性に劣る。また、比較例３に示した潜血を判定基準とする歯周病診断は、非常に簡便な方法ではあるが、判定結果から歯周病に罹患しているか、そうでないかを明確に判定することは困難であった。
【００６０】
このような表１の結果から、歯周病患者の唾液又は歯肉溝浸出液中には、健常人と比較してβ−デフェンシンが多く存在することが認められ、β−デフェンシンを免疫学的測定法で測定することで、歯周病の診断が可能であり、本発明の診断キット及び診断方法によれば、歯周病の有無、更には進行の程度を簡便かつ精度良く予測でき、歯周病の診断が簡便にできることがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを免疫学的測定法により検出又は測定することにより、歯周病の有無あるいは進行を正確かつ簡便に診断することができる歯周病の診断方法及び歯周病診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は局所における細菌感染とそれに対する免疫防御反応の結果引き起こされる、歯周組織の破壊と歯槽骨の吸収を伴う慢性炎症疾患である。歯周病の初期症状としては、歯肉の発赤、腫脹、出血が挙げられるが、これらの症状は見過ごされる場合が多く、病状はさらに進行して歯肉の退縮、歯槽骨の吸収が起こり、最終的には歯の喪失に繋がる。歯の喪失を防ぐには適切な治療、処置が必要であり、そのためには歯周病の有無、程度を的確にとらえる診断が重要である。
【０００３】
現在行われている歯周病の診断には、炎症の程度や出血の有無を目視で判断する歯肉炎指数：Ｇｉｎｇｉｖａｌ Ｉｎｄｅｘ（ＧＩ）、歯肉出血指数：Ｂｌｅｅｄｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ（ＢＩ）、歯周ポケット深さを測定する、歯肉溝滲出液量を測定する、レントゲン撮影により歯槽骨吸収を確認する、歯の動揺を確認する方法等がある。しかし、これらの方法は、歯科医師等の経験を積んだ技術が必要であり、しかも一人当たりの検診時間に長時間を要するという欠点があり、汎用し難い技術であった。
【０００４】
また、歯垢中の歯周病原性細菌、歯肉溝滲出液や唾液に含まれる特定の酵素や特定の蛋白質などを診断指標として、歯周病の程度を判断する方法や、抗ラクトフェリン抗体等の特定の抗体を用いた方法、唾液中の肝細胞増殖因子濃度を測定する方法（特許文献１〜５参照）などが提案されている。しかし、これらの方法は、測定結果と歯周疾患の程度との相関は高いとは言い難く、診断方法として満足できるものではなく、新たな歯周病の診断技術が望まれる。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−０４３１６５号公報
【特許文献２】特開平１０−５０１０７０号公報
【特許文献３】特許第３１６５７８８号公報
【特許文献４】特開２００３−０６６０３９号公報
【特許文献５】国際公開第０２／０７９７８０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０３／０７６６１４号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ Ｉｎｔ Ａｃａｄ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ，２００３ Ａｐｒ；５（２）：３５−４０
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，２００７ Ａｐｒ；５３（４）：７５７−６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、歯周病の有無の診断あるいはその進行の予測を迅速に、簡便かつ正確に行うことができる歯周病の診断方法及び歯周病診断キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成するため種々検討した結果、ヒトの唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシン、特にβ−デフェンシン２又はβ−デフェンシン３の濃度と歯周病の程度との間に高い相関があり、このヒトの唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを指標とし、β−デフェンシンを検出又は測定することにより、歯周病の有無の診断あるいはその進行を予測できること、更に、β−デフェンシンを検出又は測定を、抗β−デフェンシン抗体を用いた免疫学的測定法、特に酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により行うことで、検体（ヒトの唾液又は歯肉溝浸出液）中のβ−デフェンシンの存在又は含有量を目視で判定でき、操作も簡単かつ短時間に行うことができ、歯周病の診断をより迅速、かつ簡便にできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
デフェンシンは、高等生物に存在する抗菌ペプチドの一種で、その構造から大きくα−デフェンシンとβ−デフェンシンに分類され、皮膚、口腔、気管といった外部と接触する上皮組織に存在することが知られている。更に、歯周病原菌に対する殺菌作用を有することから、歯周病のケアに有用であるという報告（非特許文献１参照）や、唾液中のα−デフェンシン１と血清中の炎症マーカーが相関を示すことから、口腔の炎症性疾患のマーカーとしてのα−デフェンシン１の可能性を示唆した報告もある（非特許文献２参照）。しかし、従来の技術は、歯周病診断指標として利用できるほどの精度はなく、また、上記報告では、α−デフェンシン１の測定に高速液体クロマトグラフを使用しており、操作が面倒で簡便性に劣るもので、歯周病の診断技術としては採用し難い。
【０００９】
なお、国際公開第０３／０７６６１４号パンフレット（特許文献６）には、デフェンシン産生の消長が歯周疾患の発病に密接に関わることから、デフェンシンの発現を制御するデフェンシン遺伝子の発現能力を制御するプロモーター活性の変動を調べることにより、歯周疾患の罹患感受性を推定するためのデータを得る方法が提案されている。
【００１０】
このようにデフェンシンが歯周疾患に関連することは知られているが、本発明では、唾液又は歯肉溝浸出液中のデフェンシン、とりわけβ−デフェンシン２又はβ−デフェンシン３を指標とすること、特にβ−デフェンシンを免疫学的測定法で検出又は測定することにより、更には、唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを免疫学的測定法により検出又は測定する手段とを含むキットで、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定することにより、煩雑な前処理等を行うことなく、簡便な操作で短時間に、しかも、潜血を用いた方法や高速液体クロマトグラフによる測定方法に比較して高精度に歯周病の有無の診断あるいはその進行の予測を行うことができ、汎用性が高いものである。
【００１１】
従って、本発明は、唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを指標とし、検出手段が免疫学的測定法であることを特徴とする歯周病の診断方法、及び唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを免疫学的測定法により検出又は測定する手段とを含み、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定することを特徴とする歯周病診断キットを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の歯周病の診断方法及び診断キットによれば、歯周病の有無の診断あるいはその進行の予測を迅速に、簡便かつ正確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明につき更に詳細に説明する。本発明の歯周病の診断方法は、唾液又は歯肉溝浸出液中に含まれるβ−デフェンシンを測定し、歯周病の有無あるいはその進行を予測するものであり、歯周病診断キットは、唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定する手段とを含み、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定するものである。
【００１４】
デフェンシンは、高等生物に存在する抗菌ペプチドの一種で、その構造から大きくα−デフェンシンとβ−デフェンシンに分類され、皮膚、口腔、気管といった外部と接触する上皮組織に存在することが知られている。β−デフェンシンは、上皮由来の感染防御因子として機能し、歯肉、舌、唾液腺、他の口腔内で発現し、３種のβ−デフェンシン（β−デフェンシン１，β−デフェンシン２、β−デフェンシン３）が知られている。
【００１５】
本発明では、ヒトの唾液又は歯肉溝浸出液を検体とし、この検体中のβ−デフェンシンを検出又はその濃度を測定するものであり、β−デフェンシンの中でも特にβ−デフェンシン２又はβ−デフェンシン３を検出又はその濃度を測定することが、歯周病の診断に有効である。なお、β−デフェンシン２の重量平均分子量は、ＭＷ３３７１、β−デフェンシン３の重量平均分子量は、ＭＷ３４８６である。
【００１６】
検体としては、口腔内から採取した唾液又は歯肉溝浸出液を用いることができる。
唾液を検体に用いる場合、唾液の種類としては、安静状態で分泌された唾液を吐出して採取した安静唾液、又はパラフィンガムを咀嚼することによって短時間で安静唾液と比較して大量の唾液を採取可能な刺激唾液がある。安静唾液と刺激唾液では、パラフィンガム咀嚼に伴う口腔内刺激の有無によって、唾液の分泌量や歯肉溝液の滲出、口腔内の汚れや細菌数等が異なるとされているが、検体にはいずれをも用いることができる。
唾液の採取手段は、通常の方法を用いることができ、安静状態で口中にたまった唾液を容器に吐出す方法、パラフィンガムを咀嚼することで口中にたまった唾液を容器に吐出す方法などを採用できる。
【００１７】
口腔内から採取する唾液の量は、０．１〜１０ｍＬが好ましく、１〜５ｍＬがより好ましい。０．１ｍＬに満たないと、唾液採取容器から分注や遠心分離処理がやりにくいといった支障をきたし、１０ｍＬを超えて採取するには、時間がかかり被験者に負担がかかるといった弊害があることがある。
【００１８】
検体の唾液としては、採取した唾液をそのまま用いる全唾液、唾液を遠心分離して不溶物を除去した唾液上清のいずれをも使用できる。唾液上清はそのまま検体として用いてもよいが、唾液上清を溶媒希釈して用いることが、唾液成分による測定への干渉を低減して、より正確な結果を得られるという点から好ましい。
なお、唾液は、採取直後に検体として使用するか、あるいは保存する場合は、採取後に凍結することなく４〜１０℃で低温保存することが望ましいが、予め採取して凍結保存したものを融解して用いてもよい。
【００１９】
唾液の遠心分離は、回転数３０００〜１２０００ｒｐｍ、特に５０００〜１００００ｒｐｍで行うことが好ましく、３０００ｒｐｍ未満では、唾液の不溶物を除去できないことがあり、１２０００ｒｐｍを超える条件で処理を行っても結果に変化はない。また、処理時間は５〜３０分、特に１０〜２０分間が好ましい。５分未満では、唾液の不溶物を除去できないことがあり、３０分を超えて処理を行っても変化はない。処理温度は２５℃以下、特に１０℃以下が好ましい。２５℃より高いと、唾液に含まれるタンパク分解酵素により唾液成分が変性することがある。
【００２０】
唾液を希釈する場合、希釈溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液などを用いることができる。
唾液上清の希釈倍率は、遠心分離して得た上清を２〜５倍希釈することが好ましく、２倍に満たないと唾液成分による干渉を受け、５倍を超えるとデフェンシン濃度が低くなり検出限界に満たない場合がある。
【００２１】
また、歯肉溝浸出液を検体として用いる場合は、口腔内の歯肉溝から浸出液を採取して用いる。歯肉溝浸出液の採取手段としては、口腔内の歯肉溝に濾紙片等の液体吸収性を有する検体採取用の支持体を挿入して、浸出液をしみ込ませた後、この浸出液がしみ込んだ濾紙片等の支持体から、抽出溶媒を用いた抽出処理などによりβ−デフェンシンを抽出し、これを歯肉溝浸出液の検体として測定に供することができる。
【００２２】
歯肉溝に濾紙片を挿入し、好ましくは指等で濾紙片を上から歯肉溝に押し当て、３０秒〜５分間放置することが、歯肉溝の浸出液を濾紙片に十分にしみ込ませることから望ましい。また、β−デフェンシンの抽出手段としては、溶媒抽出が好ましい。
【００２３】
また、溶媒抽出において、抽出溶媒としては、例えば蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液等を用いることができ、抽出条件は、歯肉溝の浸出液をしみ込ませた濾紙片をマイクロテストチューブあるいは試験管に入れ、そこに抽出溶媒を５０μＬ〜１ｍＬ入れ、ボルテックスミキサー、振とう器で振とう抽出する。抽出後、これを検体として使用することができる。
【００２４】
本発明では、唾液又は歯肉溝浸出液中に含まれるβ−デフェンシンの検出又は測定を免疫学的測定法で行う。免疫学的測定法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ラテックス凝集法、免疫比濁法など一般的に使用されている方法を用いることができるが、特にＥＬＩＳＡ法が好適に採用される。
ＥＬＩＳＡ法による測定は、プラスチックの表面などの固相に、検体、例えば唾液もしくは希釈した唾液５０〜２００μＬを接触させ、溶液中のタンパク質を吸着させた後、目的物質と特異的に反応する抗体を加えると、抗体は固相に吸着した成分の中で目的成分とのみ結合する。そして、結合した抗体と反応して発色する化学物質を用いることで、色の濃さにより結合した抗体量（＝目的物質量）が分かるものである。
【００２５】
ＥＬＩＳＡ法は、検体中に含まれる目的物質を、酵素標識した抗体又は抗原を用い、抗原抗体反応を利用して定量的に検出する方法であり、目的物質を高感度で検出でき、定量性にも優れた方法である。抗原抗体反応を利用して検出するため粗抽出段階で測定が可能であり、面倒な精製や前処理等の工程を行わなくてもよく、短時間で測定することができる。ＥＬＩＳＡ法は、測定原理の違いからサンドイッチ法（非競合法）と競合法とに大別されるが、本発明ではどちらの方法を用いてもよい。
【００２６】
抗体は、市販されているものでよく、例えば、ａｎｔｉ−ｂｅｔａ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２ Ｈｕｍａｎ Ｒａｂｂｉｔ（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ社製）やａｎｔｉ−ｂｅｔａ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ３ Ｈｕｍａｎ Ｒａｂｂｉｔ（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ社製）などが挙げられる。
検出用に使用する酵素標識抗体としては、使用する一次抗体の免疫動物に合わせたアルカリフォスファターゼやペルオキシターゼ標識の２次抗体、例えば、Ａｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＡＬＰ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）やＡｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）などが挙げられる。
反応条件は、一般的なＥＬＩＳＡ反応条件で行い、検出方法は発色の程度を目視で判定する方法や、分光光度計で吸光度を測定する方法があるが、目視による判定が特別な機器を必要とせず、簡便であることから好ましい。検出濃度は、使用する抗体の種類、反応条件により異なるが、β−デフェンシン濃度として８ｐｇ／ｍＬ以上であれば検出することができる。
【００２７】
ＥＬＩＳＡ法による測定には、市販のβ−デフェンシン２又はβ−デフェンシン３測定用キット、例えば、β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ、β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｋｉｔ；Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ，Ｌｔｄ、β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ３（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣなどを用いることができる。前述のキットは、競合ＥＬＩＳＡ法によるもので、抗βデフェンシン２抗体を固定したマイクロプレート、２次抗体としてビオチン化抗β−デフェンシン抗体および検出用ストレプトアビジン化ペルオキシダーゼ溶液からなる。後述のキットは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるもので、２種類の抗βデフェンシン２抗体とアビジン標識ペルオキシダーゼ溶液からなる。
【００２８】
本発明の歯周病診断キットは、上記したような唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定する手段とを含み、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定するものであり、剤型は、唾液を採取するための容器、もしくは歯肉溝浸出液を採取するための濾紙片と、免疫学的測定法に用いる抗β−デフェンシン抗体、検出用試薬等を含む検出又は測定手段からなる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、以下の例において％は特に断らない限り、いずれも質量％である。
【００３０】
［実施例１］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清を生理食塩水で４倍希釈して唾液溶液とし、これを検体（唾液サンプル）として用いた。
【００３１】
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ）を用い、キット付属のプレートの各ウェルにβ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２標準液又は唾液サンプル１００μＬを加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ビオチン化抗β−デフェンシン２抗体溶液１００μＬを加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ストレプトアビジン化ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄した後、基質溶液１００μＬを加え、室温で２０分間インキュベートし、反応停止液１００μＬを加えた。反応液の色の濃淡を目視により判定した。
【００３２】
反応液の色は、β−デフェンシン２量が検出限界未満の場合は無色で、β−デフェンシン２量が少ないと薄い黄色を呈し、量が多くなるにつれて黄色が濃くなる。β−デフェンシン２の検出限界は８ｐｇ／ｍＬであり、この濃度未満では無色、８ｐｇ／ｍＬ以上１００ｐｇ／ｍＬ未満ではうすい黄色、１００ｐｇ／ｍＬ以上５００ｐｇ／ｍＬ未満では黄色、５００ｐｇ／ｍＬ以上では濃い黄色を呈色する。よって、判定基準は以下の通りとした。なお、試薬は全てキット付属の物を用いた。
判定基準；
０：無色 １：うすい黄色 ２：黄色 ３：濃い黄色
【００３３】
［実施例２］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清を唾液溶液とし、これを検体（唾液サンプル）とした。
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ）を用い、実施例１と同様に試験を行った。
【００３４】
［実施例３］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、これをそのまま検体（唾液サンプル）として用い、試験に供した。
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ）を用い、実施例１と同様に試験を行った。
【００３５】
［実施例４］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清を生理食塩水で２倍希釈して唾液溶液とし、これを検体（唾液サンプル）として用いた。
【００３６】
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｋｉｔ；Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ，Ｌｔｄ）を用い、９６ウェルプレート（Ｈ−Ｔｙｐｅ Ｐｌａｔｅ；ＳＵＭＩＬＯＮ）の各ウェルにβ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２標準液又は唾液サンプル１００μＬを加え、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ビオチン化抗β−デフェンシン２抗体溶液１００μＬを加え、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ストレプトアビジン化ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄した後、基質溶液１００μＬを加え、室温で１５分間インキュベートし、反応停止液１００μＬを加えた。反応液の色の濃淡を目視により判定した。
【００３７】
反応液の色は、β−デフェンシン２量が検出限界未満の場合は無色で、β−デフェンシン２量が少ないと、うすい黄色を呈し、量が多くなるにつれて黄色が濃くなる。β−デフェンシン２の検出限界は８ｐｇ／ｍＬであり、この濃度未満では無色、８ｐｇ／ｍＬ以上１００ｐｇ／ｍＬ未満ではうすい黄色、１００ｐｇ／ｍＬ以上５００ｐｇ／ｍＬ未満では黄色、５００ｐｇ／ｍＬ以上では濃い黄色を呈色する。判定基準は実施例１と同様に行った。なお、試薬は全てキット付属の物を用いた。
【００３８】
［実施例５］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清を生理食塩水で４倍希釈して唾液溶液とし、これを検体（唾液サンプル）として用いた。
【００３９】
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ３測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ３（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ）を用い、キット付属のプレートの各ウェルにβ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ３標準液又は唾液サンプル１００μＬを加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ビオチン化抗β−デフェンシン３抗体溶液１００μＬを加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ストレプトアビジン化ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄した後、基質溶液１００μＬを加え、室温で２０分間インキュベートし、反応停止液１００μＬを加えた。
【００４０】
反応液の色の濃淡を目視により判定した。反応液の色はβ−デフェンシン３量が検出限界未満の場合は無色で、β−デフェンシン３量が少ないと、うすい黄色を呈し、量が多くなるにつれて黄色が濃くなる。β−デフェンシン３の検出限界は８ｐｇ／ｍＬであり、この濃度未満では無色、８ｐｇ／ｍＬ以上１００ｐｇ／ｍＬ未満ではうすい黄色、１００ｐｇ／ｍＬ以上５００ｐｇ／ｍＬ未満では黄色、５００ｐｇ／ｍＬ以上では濃い黄色を呈色する。判定基準は実施例１と同様とした。なお、試薬は全てキット付属の物を用いた。
【００４１】
［実施例６］
被験者の歯肉ポケットにペリオペーパー（株式会社ヨシダ）を差し入れ、１分間おいて浸出液を染み込ませた。２００μＬのリン酸緩衝液にペリオペーパーを入れ、室温にて、ボルテックスミキサーで５分間振とうして浸出液成分を抽出し、検体２００μＬを得た。これを検体（歯肉溝浸出液サンプル）として用い、試験に供した。なお、リン酸緩衝液は、以下のように調製した。
【００４２】
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）：
リン酸水素２ナトリウム・１２水和物８．６ｇ、リン酸２水素ナトリウム・２水和物０．９９ｇ、塩化ナトリウム２５．５ｇをイオン交換水に溶解し、３Ｌとした。
【００４３】
β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２測定用ＥＬＩＳＡキット（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２（Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ）を用い、上記の歯肉溝浸出液サンプルを用いて、実施例１と同様に試験を行った。
【００４４】
［比較例１］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清をリン酸緩衝液で５倍希釈して唾液溶液とした。
【００４５】
唾液溶液１００μＬをプロテインチップ（ＣＭ１０ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ａｒｒａｙ；ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ）にのせ、サンプルを添加するサンプルプレートに官能基を修飾して解析対象を捕捉する表面増強レーザー脱離イオン化による飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）システム（ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ）により、唾液成分測定を行った。このＳＥＬＤＥＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステムによる測定値からβ−デフェンシン２の分子量（ＭＷ＝３３７１）に相当するピーク強度を測定した。得られたβ−デフェンシン２のピーク強度から、唾液中のβ−デフェンシン２量を判定した。なお、ピーク強度とは、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）で表し、判定基準は以下の通りとした。
【００４６】
判定基準
０点： β−デフェンシン２のピークが検出されない
１点： β−デフェンシン２の弱いピーク（Ｓ／Ｎ比＝２５未満）が検出される
２点： β−デフェンシン２のピーク（Ｓ／Ｎ比＝２５以上７５未満）が検出される
３点： β−デフェンシン２の強いピーク（Ｓ／Ｎ比＝７５以上）が検出される
【００４７】
［比較例２］
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清をリン酸緩衝液で５倍希釈して唾液溶液とした。
【００４８】
唾液溶液１００μＬをプロテインチップ（ＣＭ１０ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ａｒｒａｙ；ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ）にのせ、ＳＥＬＤＥＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステム（ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ）により、唾液成分測定を行った。β−デフェンシン３の分子量（ＭＷ＝３４８６）に相当するピーク強度から、唾液中のβ−デフェンシン３量を判定した。なお、ピーク強度とは、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）で表し、判定基準は上記と同様である。
【００４９】
［比較例３］唾液中の潜血評価
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、唾液をそのまま検体として用いて試験に供した。
唾液検査試験紙（サリバスター潜血用；昭和薬品化工（株）製）を用い、唾液潜血を評価した。判定は本品の指示に従って行い、その判定基準は以下の通りであった。
【００５０】
判定基準
−（黄色） ： 出血なし
＋（青） ： 僅かに出血あり
＋＋（濃い青） ： 多少出血あり
【００５１】
［比較例４］唾液中α−デフェンシン１評価
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．）し、この遠心上清を唾液溶液とした。
唾液溶液及び５ｎｇ／ｍＬのα−デフェンシン１標準液各１０μＬについて、ＨＰＬＣ分析（高速液体クロマトグラフ分析）を下記条件で行い、１５分付近に溶出するα−デフェンシン１のピークを検出し、そのピーク面積を得た。唾液中のα−デフェンシン１濃度は、以下の式で計算した。
【００５２】
ＨＰＬＣ分析の条件
カラム ：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０ＴＭ（４．６×２５０ｍｍ）
移動相Ａ液 ：０．０５％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリル*1
移動相Ｂ液 ：０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル*2
グラジエント：０ｍｉｎ．Ａ １００％ → ２０ｍｉｎ．Ｂ １００％
検出 ：ＵＶ ２２５ｎｍ
移動相流量 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度 ：４０℃
【００５３】
＊１；
０．０５％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリル：アセトニトリル（和光純薬工業（株）から購入）１００ｍＬにイオン交換水を加えて１０００ｍＬとし、これにトリフルオロ酢酸（和光純薬工業（株）から購入）０．５ｇを加え、混和した。
＊２；
０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル：アセトニトリル（和光純薬工業（株）から購入）５００ｍＬにイオン交換水を加えて１０００ｍＬとし、これにトリフルオロ酢酸（和光純薬工業（株）から購入）０．５ｇを加え、混和した。
【００５４】
【数１】
【００５５】
上記実施例及び比較例において、健常人と歯周病患者との唾液又は歯肉溝浸出液を使用して、各々について同様に評価した。結果を表１に示す。
【００５６】
なお、被験者は、ＧＩが０．５未満の場合を健常、ＧＩが０．５以上の場合を歯周病として、各群（各実施例及び比較例）について８名ずつの試験を行った。ＧＩとは、歯肉の状態を判断する指標で、その基準は以下の通りである。
ＧＩ基準
０＝正常歯肉。
１＝軽度の炎症。軽度の色変化、浮腫があるが、探針により出血しないもの。
２＝中程度の炎症。発赤、浮腫があり、探針により出血するもの。
３＝高度の炎症。著しい発赤、腫脹、自然出血の傾向、潰瘍形成のあるもの。
【００５７】
表１に示す実施例及び比較例における健常人及び歯周病患者の唾液又は歯肉溝浸出液（検体）の測定結果と各方法の判定精度及び簡便性の基準は、以下の通りである。
判定精度
◎＝健常人と歯周病患者の測定結果に明らかな差が認められる
○＝健常人と歯周病患者の測定結果に差が認められる
△＝健常人と歯周病患者の測定結果に差が認めにくい
簡便性
◎＝非常に簡便である（検体の前処理が必要ない、目視による判定が可能である）
○＝簡便である（検体の前処理を要する、目視による判定が可能である）
△＝簡便性に劣る（判定に特別な装置を要する）
【００５８】
【表１】
【００５９】
表１の結果から、実施例１〜６では、健常人の唾液又は歯肉溝浸出液は無色〜うすい黄色（ほとんどの唾液が無色）を示したのに対し、歯周病患者の唾液又は歯肉溝浸出液はほとんどが黄色〜濃い黄色を示すことから、歯周病において唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシン２あるいはβ−デフェンシン３量が増えることがわかった。よって、ＥＬＩＳＡ法を採用して、唾液又は歯肉溝浸出液の発色を見ることで、歯周病に罹患しているか、そうでないかの判定ができることが確認された。また、実施例３の結果から、唾液の前処理を行わないと、健常人の唾液もうすい黄色を示し、歯周病患者との差は認められるものの、遠心分離や希釈といった前処理を行ったほうが、より歯周病に罹患しているか、そうでないかの判定がしやすいことがわかった。
比較例１，２，４は、健常人と歯周病患者の判定はできるが、測定に質量分析計や液体クロマトグラフを用いる点で簡便性に劣る。また、比較例３に示した潜血を判定基準とする歯周病診断は、非常に簡便な方法ではあるが、判定結果から歯周病に罹患しているか、そうでないかを明確に判定することは困難であった。
【００６０】
このような表１の結果から、歯周病患者の唾液又は歯肉溝浸出液中には、健常人と比較してβ−デフェンシンが多く存在することが認められ、β−デフェンシンを免疫学的測定法で測定することで、歯周病の診断が可能であり、本発明の診断キット及び診断方法によれば、歯周病の有無、更には進行の程度を簡便かつ精度良く予測でき、歯周病の診断が簡便にできることがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを指標とし、検出手段が免疫学的測定法であることを特徴とする歯周病の診断方法。
【請求項２】
唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを免疫学的測定法により検出又は測定する手段とを含み、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定することを特徴とする歯周病診断キット。
【請求項１】
唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを指標とし、検出手段が免疫学的測定法であることを特徴とする歯周病の診断方法。
【請求項２】
唾液又は歯肉溝浸出液を採取する手段と、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを免疫学的測定法により検出又は測定する手段とを含み、前記唾液又は歯肉溝浸出液中のβ−デフェンシンを検出又は測定することを特徴とする歯周病診断キット。
【公開番号】特開２００９−１４５２２０（Ｐ２００９−１４５２２０Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２３３４６（Ｐ２００７−３２３３４６）
【出願日】平成１９年１２月１４日（２００７．１２．１４）
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１４日（２００７．１２．１４）
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
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