毒素原性大腸菌に対する免疫原性組成物に基づく付着因子−腸毒素キメラ
【課題】コレラ毒素Ａサブユニットまたは易熱性大腸菌毒素Ａサブユニットなどの細菌毒素Ａサブユニットに融合した大腸菌からの構造的に安定した付着因子を含むキメラ分子から構成される免疫原性組成物、及び前記Ａサブユニットと同じまたは異なる種の毒素Ｂサブユニットと非共有結合的に会合した付着因子−毒素キメラを提供する。
【解決手段】免疫応答を惹起するための付着因子／毒素融合組成物を利用する。
【解決手段】免疫応答を惹起するための付着因子／毒素融合組成物を利用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、細菌線毛成分および免疫原性細菌毒素から構成されるタンパク様キメラ分子を使用して毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を誘導する方法に関する。本発明の組成物は、付着因子−トキソイドキメラを生じさせるように下痢原性細菌毒素に分子融合した大腸菌付着因子を意図する。
【背景技術】
【０００２】
下痢原性大腸菌の幾つかの病原型のうちの１つである毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、軽度からコレラ様瀉下にわたる分泌型下痢を引き起こす。ＥＴＥＣは、多くの発展途上国に住む人およびそこを訪ねる旅行者に重要な医療上の懸念を提起する。物資が乏しい国の幼児において、およびこれらの地域を旅する者においても、ＥＴＥＣは下痢の主原因である（非特許文献１、非特許文献２）。乳児および幼児に、この生物が年間２億１千万件の下痢および３８万の死を引き起こすと推定される（非特許文献３）。
【０００３】
ＥＴＥＣは、小腸上皮細胞への付着ならびに易熱性（ＬＴＩ）および／または熱安定性（ＳＴ）腸毒素の発現によって疾病を生じさせる（非特許文献４）。一般に、ＥＴＥＣは、定着因子（ＣＦ）として知られている糸状細菌表面構造によって宿主細胞に付着する。２０より多くの異なるＣＦが記載されており、それらのうちの少数は、疑う余地なく病理発生の原因とみなされている（非特許文献５）。
【０００４】
記載する第一ヒト特異的ＥＴＥＣ ＣＦである定着因子抗原Ｉ（ＣＦＡ／Ｉ）には、病原的役割についての確固たる証拠が存在する。ＣＦＡ／Ｉは、遺伝子的および生化学的特徴を共有する８のＥＴＥＣ線毛から構成される１つのファミリーの原型である（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。このファミリーは、大腸菌表面抗原１（ＣＳ１）、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９および推定定着因子Ｏ７１（ＰＣＦＯ７１）を含む。この線毛ファミリーの８すべてのメンバーをコードする遺伝子クラスターの完全ＤＮＡ配列は、出版物に掲載されている（非特許文献１０）、（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。（順番に）ペリプラズムシャペロン、線毛大サブユニット、外膜ｕｓｈｅｒタンパク質および線毛小サブユニットをコードする、ＣＦＡ／Ｉおよび関連線毛の４遺伝子生体組み立てオペロンが、同様に構成される。ＣＦＡ／Ｉの組み立ては、Ｉ型線毛形成の古典的シャペロン−ｕｓｈｅｒ経路およびＩＶ型線毛などの他の糸状構造のものとは異なる、代替シャペロン経路によって行われる（非特許文献１４、非特許文献１５）。線毛大サブユニットの一次配列に基づき、ＣＦＡ／Ｉおよび関連線毛は、クラス５線毛と分類された（非特許文献１６）。
【０００５】
ＣＳ１の研究は、クラス５線毛の組成および機能的特徴に関する詳細をもたらした（非特許文献１７）。ＣＳ１線毛柄（ｆｉｍｂｒｉａｌ ｓｔａｌｋ）は、反復ＣｏｏＡ大サブユニットから構成される。そのＣｏｏＤ小サブユニットは、伝えられるところによると、線毛先端（その線毛量の極めて小さな割合を構成する）に位置し、線毛形成の開始に必要とされる（非特許文献１８）。従って、大サブユニットが結合を媒介することを示唆する先行の証拠（非特許文献１９）とは対照的に、最近の発見は、小サブユニットを線毛媒介付着の責任を負うものとして関係付け、ＣＳ１およびＣＦＡ／Ｉ線毛のインビトロ付着に必要な特定のアミノ酸残基を同定した（非特許文献２０）。大サブユニットは、小サブユニットとそれぞれの線毛の血清学的相違の原因となる（非特許文献２１）。
【０００６】
クラス５大および小サブユニットの比較進化分析は、大サブユニットと比較して大きな構造的保存が小サブユニットの間に存在することを明示している。これは、異種、サブクラス関連線毛を発現するＥＴＥＣのマンノース耐性血球凝集反応（ＭＲＨＡ）を阻害する、抗大サブユニットおよび線毛抗体ではなく、抗小サブユニットの能力と一致する（非特許文献２２）。
【０００７】
１およびＰ型線毛を含む尿路病原性大腸菌株に関する以前の研究努力が、これらの細菌株上の線毛組み立てメカニズムを解明するためにモデルとして利用された。これらの研究は、尿路病原性大腸菌における組み立てが、シャペロン−ｕｓｈｅｒ経路によって行われることを示した（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５）。この研究の成果は、ドナー鎖の相補性の原理、線毛サブユニットが、重要な欠失β鎖の相互作用性サブユニット間シャッフリングにより隣接サブユニットと非共有結合的にからみ合うプロセス、の開発であった（非特許文献２６、非特許文献２７；非特許文献２８）。証拠は、この同じメカニズムを、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血球凝集性線毛（非特許文献２９）およびペスト菌莢膜タンパク質、非線毛タンパク質重合体（非特許文献３０）のフォールディングおよび４次構造完全性に関係付けた。これらの両方の構造は、古典的シャペロン−ｕｓｈｅｒ経路によって組み立てられる、クラスＩの１およびＰ型線毛の遠縁ある。
【０００８】
尿路病原性大腸菌における努力にもかかわらず、ＥＴＥＣにおける付着部分の同定および線毛組み立てメカニズムは不明であった。これらの異なる経路の線毛組み立ておよび構造成分が配列類似性を共有しないことは、それらが、収束進化の道を通って生じたことを示唆している。それにもかかわらず、ＣＦＡ／Ｉ構造サブユニットのコンピュータ分析は、ドナー鎖の相補性がシャペロン−サブユニットおよびサブユニット−サブユニット相互作用も支配し得る可能性を示唆している。
【０００９】
８つのＥＴＥＣクラス５線毛は、メンバー数３（ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ４およびＣＳ１４）、４（ＣＳ１、ＰＣＦＯ７１、ＣＳ１７およびＣＳ１９）および１（ＣＳ２）の３つのサブクラス（それぞれ、サブクラス５ａ、５ｂおよび５ｃと呼ばれる）にクラスタリングされた（非特許文献３１）。以前の報告は、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４およびＣＳ１９を有するＥＴＥＣが、クラスター化Ｃａｃｏ−２細胞への付着をはっきりと示すことを明示した（非特許文献３２、非特許文献３３）。しかし、ＣＦＡ／ＩおよびＣＳ１のどの成分サブユニットが付着を媒介するかに関して相反するデータが発表された（非特許文献３４、非特許文献３５）。
【００１０】
どの線毛成分が付着媒介に責任を負うかというこの疑問には、無損傷ＣＦＡ／Ｉ線毛、ＣｆａＢ（大サブユニット）への、ならびに２つの異なるインビトロ付着モデルにおけるＣｆａＥ（小サブユニット）の非オーバーラッピングアミノ末端（残基２３〜２１１）およびカルボキシ末端（残基２１２〜３６０）半分への抗体の付着阻害活性を評価することによるアプローチがとられた（非特許文献３６）。ＣＦＡ／Ｉ付着に最も重要なドメインは、付着因子ＣｆａＥのアミノ末端半分に存するが実証された。
【００１１】
上で簡単に説明した研究は、ＣＦＡ／Ｉの小サブユニット、ならびに他のクラス５線毛の同種サブユニットが受容体結合部分であるという証拠を提供している（非特許文献３７、非特許文献３８）。これらの観察とも一致して、小サブユニットの低レベルの配列多様性が線毛サブクラス５ａおよび５ｂ内で観察された（非特許文献３９）ため、進化の関係は、これら２つのサブクラスのそれぞれを代表する小サブユニットのアミノ末端半分に対する抗体の交差反応と相関した（非特許文献４０）。
【００１２】
類似しているがクラス５線毛とは異なる大腸菌表面抗原（ＣＳ３）は、ＥＴＥＣ定着因子抗原ＩＩ（ＣＦＡ／ＩＩ）複合体の共通付着微細線維の代表である。これらの抗原を発現するＥＴＥＣは、世界の多くの地域において流行している。ＣＳ３は、２つのサブユニット、ＣｓｔＨおよびＣｓｔＧから構成される。さらに、ＣｓｔＧではなく、抗血清抗原ＣｓｔＨは、血球凝集反応阻害を示した。これは、ＣｓｔＨがＣＳ３付着因子であることを示唆している。
【００１３】
ＣＳ３微細線維の組み立ては、ＰａｐＤスーパーファミリーへのＣＳ３ペリプラズムシャペロンの遺伝子的関連性に基づき、古典的シャペロン−ｕｓｈｅｒ（ＣＵ）経路のメンバーとして分類された（非特許文献４１）。興味深いことに、それは、細長い微細線維状またはａｆｉｍｂｒｉａｌ付着オルガネラの組み立てを媒介するＦＧＬ（Ｆ１−Ｇ１ ｌｏｎｇ）サブファミリー（シャペロンの固有の構造的特徴を指す）に分類される（非特許文献４２）。ＣｓｔＨのＮ末端アミノ酸スパンとペスト菌Ｆ１莢膜サブユニットのアラインメントは、（成熟ＣｓｔＨポリペプチドを参照して）アミノ酸１６による交互疎水性残基の共通モチーフを示す。Ｆ１莢膜サブユニット（Ｃａｆ１）のこのスパンは、莢膜組み立ておよびサブユニット連結中にＣａｆ１Ｍシャペロンと相互作用し、Ｆ１タンパク質サブユニットに隣接することにより、ドナー鎖として機能する（非特許文献４３）。従って、ＣｓｔＨも同様に機能し得ると、当然、推論される。
【００１４】
コレラ毒素（ＣＴ）および大腸菌腸毒素（ＬＴＩおよびＬＴＩＩ）は、易熱性腸毒素ファミリーのメンバーである（非特許文献４４、非特許文献４５、非特許文献４６）。それらは、小腸の腸細胞に対して作用し、分泌性下痢を引き起こす。それぞれの毒素は、単一のＡポリペプチドおよび５つの同一のＢポリペプチド（すべて、非共有結合性相互作用によって付いている）から構成される。ＣＴおよびＬＴＩの公知変異体は、血清群Ｉに属し、ＬＴＩＩの変異体は、血清群ＩＩに属する。
【００１５】
ＣＴ、ＬＴＩおよびＬＴＩＩｂの構造は、血清群Ｉの毒素のＢポリペプチドと血清群ＩＩの毒素のＢポリペプチドとでアミノ酸配列が異なるにもかかわらず、すべてが、密接に関連したフォールディングパターンを有することを示す（非特許文献４７）。５つの同一のＢポリペプチドが、１つのドーナツ形分子を形成する。Ａポリペプチドは、Ｂサブユニットの上面のすぐ隣に位置するＡ１ドメインと、Ｂ五量体の中央の孔を通るＡ２ドメインとを有する。Ａ１およびＡ２は、短い表面露出ループによって連結されている。そのループ内のタンパク質溶解性分解は、ジスルフィド結合によって連結されたフラグメントＡ１およびＡ２を伴う、ニックを有するホロトキシンを生じさせる。そのＢ五量体の下面の５つの同一の結合部位は、ターゲット細胞上の特定の受容体と相互作用する。腸毒素間の受容体結合特異性は大いに異なる。ＣＴおよびＬＴＩは、ガングリオシドＧＭ１にしっかりと結合する。ＣＴではなくＬＴＩは、アシアロガングリオシドＧＭ１および一定の糖タンパク質に結合し、ならびにＬＴＩＩａおよびＬＴＩＩｂは、ガングリオシドＧＤ１ｂおよびＧＤ１ａに、それぞれ、最もよく結合する。
【００１６】
ＥＴＥＣが定着した時の上皮細胞などの細胞に対する腸毒素の活性は、事象の複雑な連鎖によって媒介される（非特許文献４８、非特許文献４９、非特許文献５０、非特許文献５１）。定着すると、ＥＴＥＣ熱安定性（ＳＴ）および／または易熱性（ＬＴＩ）腸毒素は、上皮細胞に対して作用する。ＬＴＩに加えて、ＥＴＥＣ熱安定性腸毒素（ＳＴ）は、腸膜に結合したグアニル酸シクラーゼを活性化する腸ペプチドグアニリンの非免疫原性ペプチド類似体である（非特許文献５２）。
【００１７】
幼児の血清免疫学的研究によって、血清抗ＣＦＡ／Ｉ ＩｇＧ抗体レベルとＣＦＡ／Ｉ−ＥＴＥＣでの疾病のリスクの間の逆相間が証明された（非特許文献５３）。しかし、研究は、抗ＬＴＩ抗体が防御的であることを実証することができなかった。ＣＴのＢサブユニット（ＣＴ−Ｂ）の投与が、抗原的に類似たＬＩＴ腸毒素を発現する、ＥＴＥＣに起因する下痢に対しての有意な防御をもたらすとう証拠が存在する（非特許文献５４、非特許文献５５）。さらに、動物攻撃試験は、抗線毛抗体と抗ＬＴＩ抗体が相乗的に作用して、ＥＴＥＣ攻撃から防御することを示唆した（非特許文献５６）。
【００１８】
非毒性形態のＬＴＩまたはＣＴを伴うＣＦＡ／Ｉおよび他の大腸菌表面抗原に対する有望な免疫応答のため、これらの抗原がＥＴＥＣに対する粘膜ワクチン製剤の中心になった（非特許文献５７）。ＣＴ−Ｂと共同投与される経口、死菌全細胞ＥＴＥＣワクチンが広範に試験された（非特許文献５８、非特許文献５９）。このワクチンが安全であることはわかったが、乳児には効かなかった（非特許文献６０）。さらに、弱毒生ＥＴＥＣ生ワクチンは、弱毒化と免疫原性との適正なバランスを達成できないことに、一部起因して、有効でないことが判明した（非特許文献６１、非特許文献６２、非特許文献６３、非特許文献６４）。従って、より有効に抗付着性免疫を誘導する線毛成分の同定の重要性は、ますます深刻になってきている。ＥＴＥＣにおいて、この部分は、ＣｆａＥなどの線毛小サブユニットであることが明らかになった。従って、本発明の態様は、ＣＴまたはＬＴなどの細菌トキソイドの成分とのコンジュゲーションでの構造安定性ＥＴＥＣ線毛付着因子または付着ドメインの構築、および下痢原性ＥＴＥＣに対する免疫を誘導するためのそれらの使用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｂｌａｃｋ，Ｒ．Ｅ．１９９０．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｒａｖｅｌｅｒｓ’ｄｉａｒｒｈｅａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ９８，５ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳ ５６０ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｒｅｖ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １２（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ７３−Ｓ７９．
【非特許文献２】Ｈｕｉｌａｎ，Ｓ．，Ｌ．Ｇ．Ｚｈｅｎ，Ｍ．Ｍ．Ｍａｔｈａｎ，Ｍ．Ｍ．Ｍａｔｈｅｗ，Ｊ．Ｏｌａｒｔｅ，Ｒ．Ｅｓｐｅｊｏ，Ｕ．Ｋｈｉｎ Ｍａｕｎｇ，Ｍ．Ａ．Ｇｈａｆｏｏｒ，Ｍ．Ａ．Ｋｈａｎ，Ｚ．Ｓａｍｉ，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ａｍｏｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｆｉｖｅ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ．Ｂｕｌｌ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ ６９：５４９−５５．
【非特許文献３】Ｑａｄｒｉ，Ｆ．，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ａ．Ｓ．Ｆａｒｕｑｕｅ，ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｓａｃｋ．１００５．Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ １８：４６５−４８３．
【非特許文献４】Ｎａｔａｒｏ，Ｊ．Ｐ．，ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋａｐｅｒ．１９９８．Ｄｉａｒｒｈｅａｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １１：１４２−２０１．
【非特許文献５】Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ．１９９６．Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ５９０ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：４４４−４５２．
【非特許文献６】Ｅｖａｎｓ，Ｄ．Ｇ．，Ｒ．Ｐ．Ｓｉｌｖｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ，Ｊｒ．，Ｄ．Ｇ．Ｃｈａｓｅ，ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｇｏｒｂａｃｈ．１９７５．Ｐｌａｓｍｉｄ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ／／ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １２：６５６−６６７．
【非特許文献７】Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ．１９９６．Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ５９０ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：４４４−４５２．
【非特許文献８】Ｇｒｅｗａｌ，Ｈ．Ｍ．，Ｈ．Ｖａｌｖａｔｎｅ，Ｍ．Ｋ．Ｂｈａｎ，Ｌ．ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｗ．Ｇａａｓｔｒａ，ａｎｄ Ｈ．Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ．１９９７．Ａ ｎｅｗ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，ＣＳ １９，ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５：５０７−５１３．
【非特許文献９】Ｋｈａｌｉｌ，Ｓ．Ｂ．，Ｆ．Ｊ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｉ．Ｓｈａｈｅｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｐａｎｎｅｌｌ，Ｋ．Ａ．Ｋａｍａｌ，Ｂ．Ｔ．Ｐｉｔｔｎｅｒ，Ｍ．Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｒ．Ｆｒｅｎｃｋ，Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ，ａｎｄ Ｐ．Ｌ．Ｆ．２０００．Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ＴＨＥ １００ｔｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ＴＨＥ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ．
【非特許文献１０】Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ，Ｂ．Ｊ．，Ａ．Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ，Ｌ．Ｒ．Ｍｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｃ．Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９４．ＣｏｏＣ ａｎｄ ＣｏｏＤ ＡＲＥ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ．ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２：３８７４０１．
【非特許文献１１】Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ，Ｂ．Ｊ．，Ａ．Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ，Ｈ．Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９５．Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ９８，５４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳＣＳ２ ｐｉｌｉ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｏｒ ＣＳｌ ｐｉｌｉ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４８４９−５６．
【非特許文献１２】Ｐｅｒｅｚ−Ｃａｓａｌ，Ｊ．，Ｊ．Ｓ．Ｓｗａｒｔｌｅｙ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９０．Ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＴＨＥ ｍａｊｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５８：３５９４−３６００．
【非特許文献１３】Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｊ．Ｃ．Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｐ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐ．Ｅ．Ｏｒｎｄｏｒｆｆ，ａｎｄ Ｂ．Ｊ．Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ．１９９２．ＣｏｏＢ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉｎ．ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：２９３−３００．
【非特許文献１４】Ｒａｍｅｒ，Ｓ．Ｗ．，Ｇ．Ｋ．Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ，Ｃ．Ｙ．Ｗｕ，Ｊ．Ｈｗａｎｇ，Ｓ．Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，ａｎｄ Ｄ．６５０ Ｂｉｅｂｅｒ．２００２．ｔｈｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｕｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｏｍｐｌｅｘ：Ｂｉｏｇｅｎｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ＴＨＥ Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ９８，５４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳ ｂｕｎｄｌｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｉｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８４：３４５７−６５．
【非特許文献１５】Ｓｏｔｏ，Ｇ．Ｅ．，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ．１９９９．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎｓ：ｃｏｍｍｏｎ ｔｈｅｍｅｓ ａｎｄｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１０５９−１０７１．
【非特許文献１６】Ｌｏｗ，Ｄ．，Ｂ．Ｂｒａａｔｅｎ，ａｎｄ Ｍ．Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅ．１９９６．Ｆｉｍｂｒｉａｅ，Ｐ．１４６−１５７．Ｉｎ Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ｉｉｉ，Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｅ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｌｏｗ，Ｂ．Ｍａｇａｓａｎｉｋ，Ｗ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｍ．Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ，ａｎｄ Ｈ．Ｅ．Ｕｍｂａｒｇｅｒ（ｅｄ．），Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ，ｖｏｌ．Ｖｏｌｕｍｅ１．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
【非特許文献１７】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９８．Ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ａｎ ｏｌｄ ｔｒａｄｅ：ＣＳｌ ｐｉｌｕｓ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３０：６８１−７．
【非特許文献１８】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，Ｖ．Ｒ．Ｐｅｎｕｍａｌｌｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９９．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｏｒ ｐｉｌｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＣｏｏＤ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＣＳ １ ｐｉｌｉ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１６９４−７．
【非特許文献１９】Ｂｕｈｌｅｒ，Ｔ．，Ｈ．Ｈｏｓｃｈｕｔｚｋｙ，ａｎｄ Ｋ．Ｊａｎｎ．１９９１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ，ａｎ ａｄｈｅｓｉｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ７８：Ｈ１１：ｆｉｍｂｒｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：３８７６−３８８２．
【非特許文献２０】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，Ｇ．Ｐ．Ｍｕｎｓｏｎ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９９．Ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｉｐ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＣＳｌ ａｎｄ ＣＦ Ａ／Ｉ ｐｉｌｉ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨＡＴ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ９８，５４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳ ｆｏｒ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９６：１２８２８−１２８３２．
【非特許文献２１】Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ．１９９６．Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：４４４−４５２．
【非特許文献２２】Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【非特許文献２３】Ｋｕｅｈｎ ＭＪ，Ｊ．Ｈｅｕｓｅｒ，Ｓ．Ｎｏｒｍａｒｋ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ．１９９２．Ｐ ｐｉｌｉ ｉｎ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＲＥ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｆｉｂｒｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｉｂｒｉｌｌａｒ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｔｉｐｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３５６：２５２−５．
【非特許文献２４】Ｓａｕｅｒ ＦＧ，Ｋ．Ｆｕｔｔｅｒｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｐｉｎｋｎｅｒ，Ｋ．Ｗ．Ｄｏｄｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ ａｎｄ Ｇ．Ｗａｋｓｍａｎ．１９９９．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｉｌｕｓ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１０５８−６１．
【非特許文献２５】Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｄ３ Ａ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｖ．Ｓｔｏｊａｎｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ａｄｈｅｓｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８５：１０６１−６．
【非特許文献２６】Ｓａｕｅｒ ＦＧ，Ｋ．Ｆｕｔｔｅｒｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｐｉｎｋｎｅｒ，Ｋ．Ｗ．Ｄｏｄｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ ａｎｄ Ｇ．Ｗａｋｓｍａｎ．１９９９．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｉｌｕｓ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１０５８−６１．
【非特許文献２７】Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｄ３ Ａ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｖ．Ｓｔｏｊａｎｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ａｄｈｅｓｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８５：１０６１−６．
【非特許文献２８】Ｂａｍｈａｒｔ ＭＭ，Ｐｉｎｋｎｅｒ ＪＳ，Ｓｏｔｏ ＧＥ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｖｅｒ：ＰａｐＤ−ｌｉｋｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｍｉｓｓｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｐｉｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００；９７：７７０９−１４．
【非特許文献２９】Ｋｒａｓａｎ ＧＰ，Ｓａｕｅｒ ＦＧ，Ｃｕｔｔｅｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｄｏｎｏｒ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｐｉｌｉ．ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００；３５：１３３５−４７．
【非特許文献３０】Ｚａｖｉａｌｏｖ ＡＶ，Ｋｅｒｓｌｅｙ Ｊ，Ｋｏｒｐｅｌａ Ｔ，Ｚａｖ’ｙａｌｏｖ ＶＰ，Ｍａｃｌｎｔｙｒｅ Ｓ ａｎｄ Ｋｎｉｇｈｔ ＳＤ．Ｄｏｎｏｒ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｐｉｌｕｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２；４５：９８３−９９５．
【非特許文献３１】Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【非特許文献３２】Ｇｒｅｗａｌ，Ｈ．Ｍ．，Ｈ．Ｖａｌｖａｔｎｅ，Ｍ．Ｋ．Ｂｈａｎ，Ｌ．ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｗ．Ｇａａｓｔｒａ，ａｎｄ Ｈ．Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ．１９９７．Ａ ｎｅｗ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，ＣＳ １９，ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５：５０７−５１３．
【非特許文献３３】Ｖｉｂｏｕｄ，Ｇ．Ｉ．，Ｍ．Ｍ．ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ａ．Ｈｅｌａｎｄｅｒ，ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ．１９９６．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃａｃｏ−２ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ２１：１３９ １４７．
【非特許文献３４】Ｂｕｈｌｅｒ，Ｔ．，Ｈ．Ｈｏｓｃｈｕｔｚｋｙ，ａｎｄ Ｋ．Ｊａｎｎ．１９９１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ，ａｎ ａｄｈｅｓｉｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ７８：Ｈ１１：ｆｉｍｂｒｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：３８７６−３８８２．
【非特許文献３５】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，Ｖ．Ｒ．Ｐｅｎｕｍａｌｌｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９９．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｏｒ ｐｉｌｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＣｏｏＤ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＣＳ １ ｐｉｌｉ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１６９４−７．
【非特許文献３６】Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【非特許文献３７】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，Ｖ．Ｒ．Ｐｅｎｕｍａｌｌｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９９．ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＣＳ １ ｐｉｌｉ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１６９４−７．
【非特許文献３８】Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【非特許文献３９】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，Ｖ．Ｒ．Ｐｅｎｕｍａｌｌｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９９．ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｏｒ ｐｉｌｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＣｏｏＤ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＣＳ １ ｐｉｌｉ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１６９４−７．
【非特許文献４０】Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【非特許文献４１】Ｈｕｎｇ，Ｄ．Ｌ．，Ｓ．Ｄ．Ｋｎｉｇｈｔ，Ｒ．Ｍ．Ｗｏｏｄｓ，Ｊ．Ｓ．Ｐｉｎｋｎｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ．１９９６．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．１５：３７９２−３８０５．
【非特許文献４２】Ｓｏｔｏ，Ｇ．Ｅ．，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ．１９９９．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎｓ：ｃｏｍｍｏｎ ｔｈｅｍｅｓ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１０５９−１０７１．
【非特許文献４３】Ｚａｖｉａｌｏｖ，Ａ．Ｖ．，Ｊ．Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ａ．Ｆ．Ｐｕｄｎｃｙ，ｅｔ ａｌ．，２００３．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｐｓｕｌａｒ Ｆｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ：ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｄｒｉｖｅｓ ｆｉｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １１３：５８７−５９６．
【非特許文献４４】Ｈｉｒｓｔ，ｋ Ｔ．Ｒ．１９９９．Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ，Ｐ．１０４−１２９．Ｉｎ Ｅ．Ａｌｏｕｆ ａｎｄ Ｊ．Ｈ．Ｆｒｅｅｒ（ｅｄ．），Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ，２ ｅｄ，ｖｏｌ．６．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．
【非特許文献４５】Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．１９９７．Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），Ｐ．３０−３３．ＩｎＲ．Ｒａｐｐｕｌｏｉ ａｎｄ Ｃ．Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ（ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ ＵＳＥ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
【非特許文献４６】Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ Ｒ．Ｋ．Ｈｏｌｍｅｓ．２００５．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐ．９−４６．Ｉｎ Ｔ．Ｐｒｏｆｔ（ｅｄ．），Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ．１９．Ｊｏｒｄｉ，Ｂ．Ｊ．Ａ．Ｍ．，Ｇ．Ａ．Ｗｉｌｌｓｈａｗ，Ａ．Ｍ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ，ａｎｄ Ｗ．Ｇａａｓｔｒａ．１９９２．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｔｈｅ ＣＦ Ａ／Ｉ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＤＮＡ Ｓｅｑ ２：２５７−２６
【非特許文献４７】Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉ，Ｍ．，Ｍ．Ｐｉｚｚａ，Ｍ．Ｇ．Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｒ．Ｋ．Ｈｏｌｍｅｓ，ａｎｄ Ｒ．Ｒａｐｐｕｌｏｌｉ．１９９５．Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｒｏｒｓ ａｍｏｎｇ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｔｒｉｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｏｒｒｅｃｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ．ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５：１１６５−１１６７．
【非特許文献４８】Ｈｉｒｓｔ，ｋ Ｔ．Ｒ．１９９９．Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ，Ｐ．１０４−１２９．Ｉｎ Ｅ．Ａｌｏｕｆ ａｎｄ Ｊ．Ｈ．Ｆｒｅｅｒ（ｅｄ．），Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ，２ ｅｄ，ｖｏｌ．６．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．
【非特許文献４９】Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．１９９７．Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），Ｐ．３０−３３．ＩｎＲ．Ｒａｐｐｕｌｏｉ ａｎｄ Ｃ．Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ（ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ ＵＳＥ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
【非特許文献５０】Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ Ｒ．Ｋ．Ｈｏｌｍｅｓ．２００５．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐ．９−４６．Ｉｎ Ｔ．Ｐｒｏｆｔ（ｅｄ．），Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ．１９．Ｊｏｒｄｉ，Ｂ．Ｊ．Ａ．Ｍ．，Ｇ．Ａ．Ｗｉｌｌｓｈａｗ，Ａ．Ｍ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ，ａｎｄ Ｗ．Ｇａａｓｔｒａ．１９９２．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｔｈｅ ＣＦ Ａ／Ｉ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＤＮＡ Ｓｅｑ ２：２５７−２６．
【非特許文献５１】Ｓｐａｎｇｌｅｒ，Ｂ．Ｄ．１９９２．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６：６２２−６４７．
【非特許文献５２】Ｓｃｈｕｌｚ，Ｓ．，Ｍ．Ｊ．Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．Ｋｕｈｎ，ａｎｄ Ｄ．Ｌ．Ｇａｒｂｅｒｓ．１９９７．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕａｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ−Ｃ ｇｅｎｅ ｌｅａｄｓ ｔｏ ａ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１５９０−１５９５．
【非特許文献５３】Ｒａｏ，Ｍ．Ｒ．，Ｔ．Ｆ．Ｗｉｅｒｚｂａ，Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ，Ｒ．Ａｂｕ−Ｅｌｙａｚｅｅｄ，Ｎ．Ｅｌ−Ｇｈｏｒｅｂ，Ｅ．Ｒ．Ｈａｌｌ，Ａ．Ｎａｆｉｃｙ，Ｉ Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｓｓｉｈ，Ｒ．Ｗ．Ｆｒｅｎｃｋ，Ｊｒ．，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｓ．２００５．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｄｉａｒｒｈｅａ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９１：５６２−５７０．
【非特許文献５４】Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｄ．Ａ．Ｓａｃｋ，Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｃｈａｒｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｐ．Ｋ．Ｎｅｏｇｙ，Ｂ．Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｎ．Ｈｕｄａ，Ｍ．Ｕ．Ｋｈａｎ，Ｂ．Ａ．Ｋａｙ，Ｍ．Ｒ．Ｋｈａｎ，Ｍ．Ａｎａｓａｒｕｚｚａｍａｎ，Ｍ．Ｙｕｎｕｓ，Ｍ．Ｒ．Ｒａｏ，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，ａｎｄ Ｊ．Ｈｏｌｍｇｒｅｎ．１９８８．Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｃｈｏｌｅｒａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉａｒｒｈｅａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｆｉｅｌｄ ｔｒｉａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５８：３７２−３７７．
【非特許文献５５】Ｐｅｌｔｏｌａ，Ｈ．，Ａ．Ｓｉｉｔｏｎｅｎ，Ｈ．Ｋｙｒｏｎｓｅｐｐａ，Ｉ．Ｓｉｍｕｌａ，Ｌ．Ｍａｔｔｉｌａ，Ｐ．Ｏｋｓａｎｅｎ，ＭＪ．Ｋａｔａｊａ，ａｎｄ Ｍ．Ｃａｄｏｚ．１９９１．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｖｅｌｌｅｒ’Ｓ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ｂｙ ｏｒａｌ Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔ／ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌ Ｉ ｃｈｏｌｅｒａ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｌａｎｃｅｔ ３３８：１２８５−１２８９．
【非特許文献５６】Ａｈｒｅｎ，ＣＭ．，ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ．１９８２．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ５４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓＪｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３８：７４−７９．
【非特許文献５７】Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｃ．Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ．２００５．Ｍｕｓｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．ｌ ｌ：Ｓ４５−５３．
【非特許文献５８】Ｓａｖａｒｉｎｏ，Ｓ．Ｊ．，Ｅ．Ｒ．Ｈａｌｌ，Ｓ．Ｂａｓｓｉｌｙ，Ｆ．Ｍ．Ｂｒｏｗｎ，Ｆ．Ｙｏｕｓｓｅｆ，Ｔ．Ｆ．Ｗｉｅｒｚｂａ，Ｌ．Ｐｅｒｕｓｋｉ，Ｎ．Ａ．Ｅｌ−Ｍａｓｒｙ，Ｍ．Ｓａｆｗａｔ，Ｍ．Ｒａｏ，Ｈ．Ｅｌ Ｍｏｈａｍａｄｙ，Ｒ．Ａｂｕ−ｅｌｙａｚｅｅｄ，Ａ．Ｎａｆｉｃｙ，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ｍ．Ｊｅｒｔｂｏｒｎ，ＹＪ．Ｌｅｅ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｓ．１９９９．Ｏｒａｌ，ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ，ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌｕｓ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．ＰＲＩＤＥ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７９：１０７−１１４．
【非特許文献５９】Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ａ．Ｍ．，Ｃ．Ａｈｒｅｎ，ａｎｄ Ｍ．Ｊｅｒｔｂｏｍ．１９９７．Ｏｒａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｐ．８６５−８７４．Ｉｎ Ｍ．Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗ，Ｊ．Ｂ．Ｋａｐｅｒ，ａｎｄ Ｇ．Ｓ．Ｇａｂｏｎ（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＩＩ ｅｄ．Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
【非特許文献６０】Ｓａｖａｒｉｎｏ，Ｓ．Ｊ．，Ｒ．Ａｂｕ−Ｅｌｙａｚｅｅｄ，Ｍ．Ｒ．Ｒａｏ，Ｒ．Ｗ．Ｆｒｅｎｃｋ，Ｉ．Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｓｓｉｈ，Ｈ．Ｅ．Ｒ．，Ｓ．Ｐｕｔｎａｍ，Ｈ．Ｅｌ−Ｍｏｈａｍａｄｙ，Ｔ．Ｗｉｅｒｚｂａ，Ｂ．Ｐｉｔｔｎｅｒ，Ｋ．Ｋａｍａｌ，Ｐ．Ｍｏｙｅｒ，Ｍ．Ｂ．Ｚ．，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ｙ．Ｊ．Ｌｅｅ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｓ．２００３．Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ．
【非特許文献６１】Ａｌｔｂｏｕｍ，Ｚ．，Ｍ．Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ｅ．Ｇａｌｅｎ，ａｎｄ Ｅ．Ｍ．Ｂａｒｒｙ．２００３．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｏｌｉ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ４ ｆｒｏｍ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｈｅｎ ｉｔ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｌｉｖｅ−ｖｅｃｔｏｒ ｓｔｒａｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：１３５２−１３６０．
【非特許文献６２】Ｂａｒｒｙ，Ｅ．Ｍ．，Ｚ．Ａｌｔｂｏｕｍ，Ｇ．Ｌｏｓｏｎｓｋｙ，ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ．２００３．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｉｍｂｒｉａｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＬＴ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ １７：３３３−３４０．
【非特許文献６３】Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｒ．Ｅ．Ｂｌａｃｋ，Ｍ．Ｌ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＲ．Ｙｏｕｎｇ，ＣＰ．Ｃｈｅｎｅｙ，ａｎｄ Ｐ．Ｓｃｈａｄ．１９８４．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｄｉａｒｒｒｈｅａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｎ ｉｎ ｍａｎ ｂｙ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔｈａｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ａｎｔｉ−ａｄｈｅｓｉｏｎ（ａｎｔｉ−ｐｉｌｉ）ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｐ２２３−２４４．Ｉｎ Ｅ．Ｃ．Ｂｏｅｄｅｋｅｒ（ｅｄ．），Ａｔｔａｃｈｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｓｕｒｆａｃｅ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ．Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ９８，５４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳ．
【非特許文献６４】Ｔｕｒｎｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｔ．Ｄ．Ｔｅｒｒｙ，Ｄ．Ａ．Ｓａｃｋ，Ｐ．Ｌｏｎｄｏｎｏ−Ａｒｃｉｌａ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｄａｒｓｌｅｙ．２００１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｒｏ ｏｍｐ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ９８，５４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｃｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４９６９−４９７９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、大腸菌の幾つかの重要な病原型うちの１つであり、下痢原性大腸菌株の最も重要な病原型の１つである。前記生物は、軽度からコレラ様瀉下にわたる分泌型下痢を引き起こす。現在、ＥＴＥＣに対して効くワクチンは存在しない。従って、これらの生物に対する新規ワクチン製剤は、特に、下痢疾患が最も流行しており、医療基幹施設が乏しい発展途上国には、重要である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の目的は、ワクチン製剤において使用するための構造的に安定でプロテアーゼ耐性の付着因子ポリペプチド−毒素融合構築物を含む組成物である。考えられる融合構築物は、任意の細菌毒素Ａサブユニットを含む。加えて、考えられる変型は、同じまたは異なる毒素の毒素Ｂサブユニットと非共有結合的に会合している、融合生成物に含まれている、Ａサブユニットを含む。本組成物は、大腸菌に対する免疫応答の誘導に有用である。毒素の例としては、コレラ毒素および毒素原性大腸菌易熱性腸毒素が挙げられる。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、毒素Ｂサブユニットと非共有結合的に会合しているまたはしていない、構造的に安定でプロテアーゼ耐性の付着因子ポリペプチド−細菌毒素Ａサブユニット融合構築物であり、この場合、毒素ＡおよびＢサブユニットは、コレラ毒素または大腸菌易熱性毒素に由来する。
【００２３】
本発明の、さらなる目的は、キメラ分子またはキメラ分子の混合物の投与により、大腸菌線毛または大腸菌（クラス５大腸菌および大腸菌ＣＳ３微細線維を含む）に対する免疫応答を誘導する方法であり、前記キメラ分子は、それぞれ、免疫修飾効果およびアジュバント効果を示す細菌トキソイドの成分（例えば、コレラまたはＥＴＥＣ易熱性毒素からのもの）に遺伝子的に融合した安定化ＥＴＥＣ付着因子ポリペプチドから構成される。
【００２４】
追加の目的は、宿主へのＥＴＥＣ線毛または微細線維の付着を阻害することによる大腸菌の定着の予防である。
【００２５】
さらなる追加の目的は、キメラ分子またはキメラ分子の混合物の投与により、腸毒素に対する抗体免疫応答を誘導する方法であり、前記キメラ分子は、それぞれ、細菌トキソイドの成分（例えば、コレラまたはＥＴＥＣ易熱性毒素からのもの）に遺伝子的に融合した安定化ＥＴＥＣ付着因子ポリペプチドから構成される。
本発明のこれらおよび他の目的は、免疫を誘導するためのワクチン成分として大腸菌付着因子ポリペプチドを利用することによって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】付着因子−エンテロトキソイドキメラをコードするプラスミドインサートのマップを示す図である。上から順番に、それぞれ、プラスミドインサートＢおよびＣの構築においてｄｓｃＣｆａＥ遺伝子を増幅したＴ７系クローン、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢ５キメラ発現のためのｐＢＡＤ系クローン、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＬＴＢ５キメラ発現のためのｐＢＡＤ系クローン、ＣｆａＥ付着因子ドメイン（ＣｆａＥａｄ）が付着因子成分を構成するキメラタンパク質の発現のための計画インサート、ＣｆａＥ付着因子ドメイン（ＣｆａＥａｄ）が付着因子成分を構成するキメラタンパク質の発現のための計画インサートを示す。
【図２Ａ】キメラ発現プラスミドのマップを示す図である。プラスミドｐ０８０９Ｃ３を構築し、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢ５キメラの生産に使用した。
【図２Ｂ】キメラ発現プラスミドのマップを示す図である。ｐ１１２１Ｃ１を構築し、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＬＴＢ５キメラの生産に使用した。それぞれが、ｐ１５Ａ複製起点と、クロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）と、付着因子−ＣＴＡ２融合体およびＢ−エンテロトキソイドをコードするタンデム遺伝子の上流のアラビノース誘導性プロモータ（ｐＢＡＤ）とを特徴とする。
【図３】ＣＦＡ／Ｉ ＥＴＥＣ誘導ＭＲＨＡの阻害を示す図である。
【図４】ＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラでの免疫処置後のＣｆａＥへのマウス血清ＩｇＧ応答を示す図である。
【図５】ＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラでの鼻腔内免疫処置後のＣｆａＥへのマウス血清ＩｇＧ応答を示す図である。
【図６】ＣａｆＥ、ＣａｆＥとＣＴＢの混合物またはＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢでの鼻腔内免疫処置後のＣｆａＥへのマウス血清ＩｇＡ応答を示す図である。
【図７】Ｔａｌｏｎクロマトグラフィー、その後のゲル濾過による、ＣｆａＥ−ＣＴＡ／ＣＴＢキメラの２段階精製を示す図である。
【図８】固定化ＧＭ１へのキメラの結合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
付着因子−毒素キメラの設計および構築
本発明は、構造的に安定な、従って免疫活性の付着因子ポリペプチドの投与により抗付着性免疫応答を誘導するための方法および生物学的組成物に関する。本発明の組成物において考えられる付着因子としては、クラス５線毛からのもの、およびＣＳ３からのもの（すなわち、ＣｓｔＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。付着因子（毒素原性大腸菌線毛および微細線維の遠位分子成分）は、宿主細胞への細菌付着のための有望なエフェクターである（文献６５）。従って、付着因子は、細菌の定着および病原性にとって重要である。
【００２８】
［文献６５］Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【００２９】
多数の病原性細菌種、例えばＬＴまたはＣＴからのポリペプチド配列は、効力ある免疫修飾因子であることが明らかになった。さらに、ＣＴ Ｂ−サブユニット（ＣＴＢ）は、ＥＴＥＣに起因するジフテリアに対する有意な防御をもたらす（文献６６、文献６７）。従って、細菌毒素と付着要素の併用投与は、他のＥＴＥＣ部分を含有する製剤より下痢原性細菌に対して大きな防御免疫をもたらすことができる。本発明は、細菌付着因子に特異的に結合して、その細菌付着因子の活性を阻害することによって下痢原性細菌の定着を崩壊させる、ならびに易熱性腸毒素の活性を阻害することによっても、および細菌定着を防止し、その結果、インビボで、易熱性腸毒素と熱安定性腸毒素の両方の生産を減少させるといった二次的効果としても、易熱性腸毒素の下痢への寄与を減少させる組成物、および免疫の誘導（主として、免疫グロブリンによって媒介される）のための前記組成物の使用法を提供する。
【００３０】
［文献６６］Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｄ．Ａ．Ｓａｃｋ，Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｃｈａｒｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｐ．Ｋ．Ｎｅｏｇｙ，Ｂ．Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｎ．Ｈｕｄａ，Ｍ．Ｕ．Ｋｈａｎ，Ｂ．Ａ．Ｋａｙ，Ｍ．Ｒ．Ｋｈａｎ，Ｍ．Ａｎａｓａｒｕｚｚａｍａｎ，Ｍ．Ｙｕｎｕｓ，Ｍ．Ｒ．Ｒａｏ，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，ａｎｄ Ｊ．Ｈｏｌｍｇｒｅｎ．１９８８．Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｃｈｏｌｅｒａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉａｒｒｈｅａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ」ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｆｉｅｌｄ ｔｒｉａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５８：３７２−３７７．
［文献６７］Ｐｅｌｔｏｌａ，Ｈ．， Ａ．Ｓｉｉｔｏｎｅｎ，Ｈ．Ｋｙｒｏｎｓｅｐｐａ，Ｉ．Ｓｉｍｕｌａ，Ｌ．Ｍａｔｔｉｌａ，Ｐ．Ｏｋｓａｎｅｎ，ＭＪ．Ｋａｔａｊａ，ａｎｄ Ｍ．Ｃａｄｏｚ．１９９１．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｖｅｌｌｅｒ’Ｓ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ｂｙ ｏｒａｌ Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔ／ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌ Ｉ ｃｈｏｌｅｒａ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｌａｎｃｅｔ ３３８：１２８５−１２８９．
【００３１】
付着因子ポリペプチドの構造安定性およびことによるとプロテアーゼ耐性は、最大免疫原性の確保に有用である。付着因子単量体の構造完全性は、隣接するサブユニットによって提供される供与β鎖によって付与される。クラス５線毛の場合、例えば、ＣＦＡ／Ｉ付着因子、ＣｆａＥ、の構造安定性は、ＣｆａＢからのドナーβ鎖によってもたらされる。ＣＳ３の場合、安定性は、隣接する単量体からのペプチドドナー鎖によってもたらされることもある。これに関しては、ＣｓｔＨドナー鎖が、隣接するＣｓｔＨ付着因子単量体に安定性をもたらす。
【００３２】
本発明の１つの態様は、細菌毒素サブユニット（例えば、ＬＴまたはＣＴからのもの）と近位にある構造安定性が付与された付着因子ポリペプチドを有するキメラ分子である。改善されたワクチン効能を随伴する、付着因子ポリペプチド免疫原の構造安定性を確保するために、本発明の１つの態様は、毒素タンパク質またはポリペプチドに動作可能に融合している隣接した付着因子ポリペプチド配列にドナーβ鎖を動作可能に提供するように設計されたポリペプチド構築物である。前記構築物の付着因子成分は、そのＣ末端先端でリンカーポリペプチドに連結されている付着因子ポリペプチドから成り、そのリンカーポリペプチドは、そのＣ末端でドナー鎖ポリペプチドにも連結されている。ドナー鎖は、ＣｆａＢなどの線毛構造大サブユニットのすべてまたは一部を含む多数の源によって提供され得る。それにまた、前記付着因子成分は、細菌毒素Ａサブユニット由来のポリペプチドに遺伝子的に融合している。本発明のキメラは、毒素Ａサブユニット成分を含有する発現されたキメラが、その後、毒素Ｂサブユニットとともに組み立てられてキメラ腸毒素様分子を形成するように、毒素Ｂサブユニットと共に発現させることもできる。
【００３３】
本発明の組成物は、任意の付着因子ポリペプチド、例えばＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤ、ＣｏｔＤおよびＣｓｔＨから構成される組成物を考えている。前記付着因子は、その付着因子のＣ末端でリンカーポリペプチドによってドナー鎖に融合している。前記ドナー鎖は、線毛大サブユニット、例えばＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡ、ＣｓｄＡ、ＣｏｔＡおよびＣｓｔＨ、をはじめとする任意の数の源に由来し得る。そうした構造安定化付着因子を本明細書では接頭語「ｄｓｃ」と付けて記載する。本発明の組成物は、図１に図示するように構造安定化付着因子が細菌毒素Ａサブユニットとも融合していることを、さらに考えている。本発明の組成物のさらなる延長は、本発明の組成物の安定な付着因子成分として天然付着因子構造のＮ末端ドメインのみの使用を考えている。そうした構造的に安定な付着因子ドメインを本明細書では接尾語「ａｄ」を付け、接頭語「ｄｓｃ」を付けずに記載する。
【００３４】
構造安定化付着因子の例としては、ｄｓｃＣｆａＥ（配列番号６）、ｄｓｃＣｓｂＤ（配列番号１２）、ｄｓｃＣｏｔＤ（配列番号１５）が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、それぞれ、ＣｆａＢ、ＣｏｔＢおよびＣｏｔＤからのドナー鎖を含有する。加えて、ＣｓｔＨのＮ末端領域（配列番号２８）にリーダー配列（配列番号２７）を融合させ、これを、リンカー（配列番号１）により、ＣｓｔＨからのドナー鎖（配列番号２９）に融合させることによってＣｓｔＨなどの非クラス５線毛付着因子を使用することができる。安定な、ｄｓｃＣｓｔＨ、配列を配列番号３０に示す。
【００３５】
それにまた、構造的に安定な付着因子は、完全長またはトランケートされたＡ２細菌毒素Ａサブユニットに融合している。本発明の組成物は、任意の数の細菌毒素Ａサブユニットを使用できることを考えている。Ａサブユニットの例としては、ＬＴＡ２（配列番号１８）およびＣＴＡ２（配列番号１９）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、本発明の組成物は、付着因子−毒素ＡサブユニットおよびＢサブユニットが自発的に分子相互作用し、毒素様分子へと組み立てられることができるように、図２に図示するように単一オペロン下で、または単一のプラスミド上もしくは別々だが適合性のプラスミド上で別々のプロモータから発現された遺伝子として、安定化付着因子−毒素Ａサブユニットキメラと毒素Ｂサブユニットを協調的におよび随伴的に発現できる能力を考えている。前記ＡおよびＢサブユニットは、同じ細菌種から形成される場合もあり、または異なる細菌種から形成される場合もある。毒素Ｂサブユニットの例としては、ＣＴＢ（配列番号２１）およびＬＴＢ（配列番号２３）が挙げられるが、これらに限定されない。前記Ｂサブユニットは、ＣＴＢおよびＬＴＢのためのそれぞれ配列番号２０および配列番号２２の場合のように、改善された発現のためにＬＴＩＩｂリーダー配列（配列番号２４）を含有することがある。さらに、ＣＴＡ２またはＬＴＡ２のいずれかのＮ末端五（５）アミノ酸を配列番号２５および２６のアミノ酸配列の代わりに用いることができる。表１は、それらの配列の要約である。
【００３６】
【表１】
【実施例】
【００３７】
実施例１：ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴおよびＬＴキメラの構築
本発明をさらに十分に例証するために、ＣｆａＥ、ＣＦＡ／Ｉの小サブユニット、を含有する抗ＥＴＥＣ組成物の例を説明する。図１（Ａ）を参照して、ＣｆａＥのコーディング配列の３’末端にヘアピンリンカーを遺伝子的に連結させることにより、構造的に安定なＣｆａＥを構築した。リンカーのアミノ酸配列は、配列番号１、２および３によって記載する。その後、ＣｆａＢからのアミノ酸ドナー鎖（配列番号４に記載する）をそのリンカーの３’末端で連結させ、最後に、ヘキサヒスチジンタグをそのＣｆａＢドナー鎖の３’末端で連結させた。その後、その構築物をｐＥＴ２４プラスミドに挿入し、大腸菌において発現させた。得られたポリペプチド（ｄｓｃＣｆａＥと呼ぶ）をニッケルまたはコバルト親和性およびカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。その組換えポリペプチドは、可溶性であり、安定していた。ゲル濾過に基づき、そのｄｓｃＣｆａＥポリペプチドは単量体として存在し、ＣＤスペクトル分析により、主としてβ鎖分子の存在と一致する結果を得た。
【００３８】
図１を参照して、コレラ毒素ＡサブユニットのＡ２フラグメントをｄｓｃＣｆａＥのカルボキシル末端（Ｃ末端）に遺伝子的に融合させた。しかし、ＣＴＡのＡ２フラグメントの代わりに、他の毒素のＡサブユニットからのＡ２フラグメント、例えばＬＴ−Ｉを使用できることに留意しなければならない。単量体ｄｓｃＣｆａＥの精製を助長するために、ヒスチジン（Ｈｉｓ−６）テールをｄｓｃＣｆａＥのＣ末端に付加させた（図１Ａ参照）。しかし、天然配列を最小限にしか修飾しないキメラの精製を助長するために、他の構築物では、ＬＴの毒素配列内の選択された部位でＨｉｓを置換した。しかし、ＣＴの五量体Ｂサブユニットは、自発的にニッケルまたはコバルトに結合するため、ＣＴＢ五量体単独、またはキメラ付着因子−ＣＴＡ２融合ポリペプチドとＣＴＢ五量体の両方を含有する抗原構築物、いずれかを、付着因子−ＣＴＡ２融合ポリペプチドおよびＣＴＢポリペプチドのいずれにもＨｉｓ−６タグを付加させる必要なく、ニッケルまたはコバルト親和性クロマトグラフィーによって直接精製することができる。それ故、ｄｓｃＣｆａＥにおけるＨｉｓ−６タグについてのコーディング領域は、図１Ｂに示す構築物には含まれなかった。五量体ＣＴＢとは異なり、ＬＴ−Ｉの五量体Ｂサブユニットは、ニッケルまたはびコバルトを含有する樹脂のいずれにも自発的に結合しない。しかし、成熟ＬＴ−１Ｂポリペプチドの配列へのＲ１３ＨおよびＮ９４Ｈ置換の導入により、五量体ＬＴ−１Ｂ（またはキメラ付着因子−ＣＴＡ２融合ポリペプチドとＬＴ−ＩＢ五量体の両方を含有する、対応する抗原構築物）（読者は図１Ｃに注目）をニッケルまたはコバルト含有樹脂に結合させ、ニッケルまたはコバルト親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。
【００３９】
さらに、付着因子ドメインは、２つのドメイン内ジスルフィド架橋によって安定化されているので、ＣｆａＥ残基１９９から２０４の後の停止コドンの配置により、当初の２ドメイン２ドメイン付着因子の線毛形成性ドメインが無い安定な１ドメイン付着因子を結果的に生産することとなる。停止コドンがこの場所に導入された付着因子単量体は、接尾語「ａｄ」を有する。例えば、ＣｆａＥａｄ（配列番号７）、ＣｓｂＤａｄ（配列番号１３）およびＣｏｔＤａｄ（配列番号１６）。従って、対応する安定な１ドメイン付着因子についてのコーディング配列を、安定な２ドメインｄｓｃ−付着因子変異体についてのコーディング配列の代わりに使用して、付着因子−ａｄ−ＣＴＡ２融合ポリペプチドが、上で説明したｄｓｃ−付着因子−ＣＴＡ２融合ポリペプチドに置き換わっている抗原構築体を生産することができる（図１Ｄおよび１Ｅ参照）。
【００４０】
図１を参照して、付着因子−ＣＴＡ２融合タンパク質および細菌毒素Ｂサブユニットについてのコーディング領域が、両方とも、発現プラスミドにおけるオペロンの中に存在するときには、付着因子−毒素Ａサブユニットキメラと毒素Ｂサブユニットが付随して生産される。これにより、発現されたＡおよびＢ毒素サブユニットポリペプチドの両方を大腸菌宿主細胞のペリプラズムに分泌させ、そのペリプラズムにおいて自発的に組み立てさせて所望のキメラ腸毒素様抗原を形成することができる。前記ＡおよびＢサブユニットは、同じ細菌種からのものである場合もあり、または異なる細菌種からのものである場合もある。さらなる例証として、図２Ａおよび２Ｂは、ＣＴおよびＬＴ−１からの五量体Ｂサブユニットをそれぞれ含有するキメラ構築物をコードするプラスミドのマップを示す。
【００４１】
図１は、コレラ毒素または大腸菌ＬＴのいずれかのＢサブユニットと協調的に発現されるｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２融合体を示す。ＬＴＩＩＢシグナル配列の付加は、組換え生成物の有望な発現を増進する。組換えＬＴＩＩｂが、組換えＣＴまたはＣＴＢに対してほぼ１００倍のレベルで生産されるからである。ＣＴ様キメラの構築を助長するために、付着因子遺伝子配列を有するフレームのすぐ下流またはそのフレーム内にＣＴＡ２についてのコーディング領域を追加することにより発現ベクターを修飾して、対象となるタンパク質が、ペリプラズムに分泌されるばかりでなく、そのＣ末端にＣＴのＡ２ポリペプチドも含有するようにした。
【００４２】
ｄｓｃＣｆａＥのコーディング配列を、コレラ毒素Ｂサブユニット遺伝子から上流の、Ｎ末端ＬＴＩＩｂ−Ｂシグナル配列およびＣ末端Ａ２融合体を有するＡ１置換抗原の発現のための２つのベクターに、インフレームでクローニングした。それらのｐＬＤＲ５およびｐＡＲＬＤＲ１９ベクターは、修飾コレラ毒素オペロンを、それぞれ、ｌａｃプロモータまたはアラビノース誘導性ｐＢＡＤプロモータ（ｐ０８０９Ｃ３）の制御下に置く。これらのクローンを発現に適する大腸菌株に形質転換させた。両方の構築物は、誘導条件下、豊富な培地中で増殖させたとき、そのペリプラズムにおいてキメラを生産した。
【００４３】
誘導後、細胞をポリミキシンＢで処理して、ペリプラズム内容物を放出させ、可溶性画分を金属親和性クロマトグラフィーによって精製した（文献６８）。遊離ＣＴＢ五量体を、ゲル濾過によって、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラから分離した。ＣＴＡ、ＣＴＢおよびＣｆａＥに特異的な抗体を使用する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法によるキメラの分析は、抗ＣＴＢ反応性バンド、および抗ＣＴＡ抗血清と抗ＣｆａＥ抗血清の両方と反応したｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２融合タンパク質バンドを示した。図８を参照して、ＧＭ１被覆プレートでの９６ウエルＥＬＩＳＡフォーマットおよび一次抗ＣｆａＥ抗体での検出を用いて、本発明者らは、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラが実際にＧＭ１に結合することを実証した。
【００４４】
［文献６８］Ｄｅｒｔｚｂａｕｇｈ，Ｍ．Ｔ．，ａｎｄ Ｌ．Ｍ．Ｃｏｘ．１９９８．Ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ｆｏｒ Ｎｉ２＋ ｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１１：５７７−５８１．
【００４５】
発現生成物のさらなる機能強化として、ＣＴＡ２のＮ末端は残基１９４において生じるので、ＣＴＡ２におけるシステイン−１９９残基のみをセリンに変えて、抗原−ＣＴＡ２融合タンパク質の抗原ドメイン内のシステイン−１９９と他のシステインとの一切の異所ジスルフィド結合形成を防止した。加えて、ｌａｃプロモータの代わりにアラビノース誘導性ｐＢＡＤプロモータの制御下、キメラの生産増進のために、ｐＡＲＬＤＲ１９などの他のベクターを作製した（文献６９、文献７０）。
【００４６】
［文献６９］Ｔｉｎｋｅｒ，Ｊ．Ｋ．，Ｊ．Ｌ．Ｅｒｂｅ，ａｎｄ Ｒ．Ｋ．Ｈｏｌｍｅｓ．２００５．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｏｆ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ＵＳＥ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：３６２７−３６３５．
［文献７０］Ｌｉ，Ｘ．，Ｊ．Ｌ．Ｅｒｂｅ，ＣＶ．Ｌｏｃｋａｔｅｌｌ，Ｄ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｇ．Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｒ．Ｋ．Ｈｏｌｍｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｌ．Ｍｏｂｌｅｙ．２００４．Ｕｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭｒｐＨ ｆｉｍｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ａ２ ｄｏｍａｉｎ，ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ，ａｓ ａｎ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２：７３０６−７３１０．
【００４７】
実施例２：キメラ構築物の機能分析
構築物を機能的に試験した。図１Ａまたは図１Ｂにおける構築物を３μｍラテックスビーズに吸着させ、ヒトまたはウシ赤血球に添加し、結果としてＭＲＨＡを誘導した。この観察は、ＣｆａＥがＥＴＥＣにおける付着因子である明瞭な証拠をもたらす。
【００４８】
２．３Å分解能でのｄｓｃＣｆａＥの結晶構造解析は、ループによりその中間点付近で連結された２つの細長いドメインを明らかにした。βシート構造からのＮ末端およびＣ末端ドメインとＣｆａＢからのドナーβ鎖の両方が、Ｃ末端ドメインの疎水性の溝を塞ぎ、その結果、その分子を安定させる。付着因子ドメインは、２つのドメイン内ジスルフィド架橋によって安定化されている。ＣｆａＥ残基１９９の後の停止コドンの配置（図１Ｃ参照）により、安定なＣｆａＥ付着因子ドメイン（ＣｆａＥ−ａｄと呼ぶ）が生じるであろう。
【００４９】
ｄｓｃＣｆａＥの抗原性および免疫原性を動物モデルにおいて試験した。最初に、２匹のウサギに、１用量当たり２５０μｇの４用量（０、２８、５６および８４日）投薬計画で、フロイントアジュバントでの非経口的免疫処置を施した。最後の追加抗原刺激の２８日後に採取した血清は、ＣｆａＥ酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、それぞれのウサギにおいて高い抗ＣｆａＥ力価を示した。さらに、血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）アッセイにおいて、これらの抗血清は、ＣＦＡ／ＩならびにＣＳ４およびＣＳ１４線毛を発現するＥＴＥＣのＭＲＨＡを阻害した。
【００５０】
マウス実験を行って、ＣＦＡ／Ｉ線毛との比較でｄｓｃＣｆａＥの相対粘膜免疫原性を判定した。マウス６匹の群に、２５μｇの試験抗原を単独で、または１．５μｇの遺伝子的に解毒したＬＴＲ１９２粘膜アジュバントとの併用投与で、鼻腔内（ＩＮ）投与した。別のコホートのマウスには、２５０μｇの用量で、１０μｇのＬＴＩＲ １９２Ｇと共にまたは伴わずに、経口胃管により免疫処置を施した。すべての動物に２週間間隔での３用量スケジュールを施した。固体化抗原が、免疫処置に使用した抗原と同種であったとき、ＥＬＩＳＡによって強い力価が観察された。ＨＡＩアッセイによる抗付着因子抗体レベルの直接的（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）比較では、ｄｓｃＣｆａＥで免疫された群は、対応するＣＦＡ／Ｉで免疫された群より有意に高いＨＡＩ抗体力価を示した。考え合わせると、これらの動物研究は、ＣｆａＥが、非経口または粘膜（ＩＮ）免疫処置で血清抗体応答を誘導できることを示唆している。さらに、この抗原は、機能的抗付着因子抗体を惹起する点でＣＦＡ／Ｉより優れている。
【００５１】
他のマウス免疫処置研究は、キメラの抗原性、特に、抗付着因子抗体応答を誘導するその能力、を評価するために、およびＩＮ免疫処置でのｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラの免疫修飾特性を評価するために行った。この免疫処置研究では、３群のマウス（１群当たりｎ＝３）に、該当抗原の約５０μｇの初回抗原刺激用量および２５μｇの追加抗原刺激用量での、第０および２８日におけるｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラ、またはｄｓｃＣｆａＥ単独もしくはＣＴＢ単独の２用量投薬計画で、腹腔内的（ＩＰ）免疫処置を施した。免疫処置前、追加抗原刺激用量の１２日後（第４０日）に血清を採取し、標準濃度のＣＦＡ／Ｉ−ＥＴＥＣ（Ｈ１０４０７株）と抗血清の滅菌希釈物とをインキュベートし、その後、ヒト赤血球に添加し、ＨＡＩ活性を判定することによって、ＭＲＨＡのインビトロ阻害について試験した。いずれの免疫処置前の血清も、試験した最低希釈（１：２０）でＨＡＩ活性を示さず、ＣＴＢで免疫処置したマウスからの免疫処置後の血清も示さなかった。対照的に、ｄｓｃＣｆａＥで免疫処置した群およびｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢで免疫処置した群、両方からの血清は、図３に図示するように、同様の希釈でＭＲＨＡを阻害した。これらは、両方の群において第４０日にＥＬＩＳＡによって測定して、高い血清抗ＣｆａＥ ＩｇＧ力価に相当した。ＣｆａＥ群の幾何平均力価は、４２３，０００であり、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢ群の幾何平均力価は、２３３，０００であった。従って、ｄｓｃＣｆａ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラは、機能的抗体応答の誘導のためにその付着因子を有効に提示する。
【００５２】
図４を参照して、５群のマウス（１群当たりｎ＝１０）に、第０、１４および２８日に次の抗原でＩＮ免疫処置を施した：（１）ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２Ｂ（８μｇのＣｆａＥおよび１１μｇのＣＴＢを与えるように計算した２０μｇの総重量）；（２）混合したｄｓｃＣｆａＥ（８μｇ）＋ＣＴＢ（１３μｇ）；（３）ｄｓｃＣｆａＥ単独（２５μｇ）；（４）ＣＴＢ単独（１３μｇ）；およびＰＢＳ陰性対照。ＣｆａＥおよびＣＴＢに対する血清ＩｇＧ抗体力価を第０、１４、２８および４２日にＥＬＩＳＡによって判定した。ＣｆａＥキメラのＩＮ投与後に、マウス血清血球凝集反応阻害を試験した。図３の場合と同様、図４に図示するように、ＨＡＩ力価は、第４２日において、他の群のそれぞれより有意に高かった。加えて、図５を参照して、任意の形態でＣＴＢを受けたすべての群が、予想通り、第４２日において高い血清抗ＣＴＢ力価を示した。ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラ群は、第１４、２８および４２日において、ＣｆａＥ＋ＣＴＢ混合物またはｄｓｃＣｆａＥ群より有意に高い血清ＩｇＧ抗ＣｆａＥ応答を示した。
【００５３】
ＩｇＧに加えて、ＩｇＡ力価も、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢ５の投与後に試験した。抗ＣｆａＥ力価を第０および４２日にＥＬＩＳＡによって測定した。それを図６に図示する。ベースライン（第０日）でのＩｇＡ力価は、図５におけるすべての群について検出限界より下であった。結果は、図６に図示するように、キメラ群が他の群より有意に高いＩｇＡ力価を生じることを示している。
【００５４】
実施例３：ワクチン製剤における本発明のキメラの可能な使用
易熱性腸毒素の活性の防止も防御に寄与しうるが、付着因子が下痢原性大腸菌に対する免疫の誘導に最も重要な成分である可能性は高い。線毛付着因子は本質的には不安定であり、隣接するサブユニットへのそれらの非共有結合的連結が無ければ分解されるため、本発明は、構造安定性を付与することにより付着因子の免疫原性の素質を有意に改善する。加えて、構造安定性付着因子の免疫原的有効度は、効力ある免疫原性とアジュバント活性の両方を有する腸毒素成分をキメラとして付着因子構築物に備えさせることにより、有意に改善される可能性が高い。
本発明の構築物は、下痢原性大腸菌に対する免疫応答および／または抗毒素免疫を誘導するためのワクチン成分として有用であると予想される。免疫の誘導方法は、次の段階を含む：
【００５５】
ａ．毒素Ａサブユニットに由来する無損傷またはトランケートされたＡ２ポリペプチドに融合した構造的に安定な２ドメインまたは１ドメイン付着因子融合成分を含有するキメラポリペプチドを含む免疫原の投与による初回抗原刺激。前記免疫原は、その無損傷またはトランケートされたＡ２ポリペプチドと毒素Ｂサブユニットポリペプチドとの非共有結合性相互作用によって腸毒素様キメラに組み立てられたキメラポリペプチドも含むことができる。前記毒素ＡおよびＢサブユニットは、いずれの細菌毒素（例えば、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）または大腸菌易熱性腸毒素）に由来してもよい。免疫原の単位用量の範囲は、５０μｇから１ｍｇであり、それを、経皮的に（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、例えばドライパッチにより、皮膚を通して（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、筋肉内に、ミルクもしくは他の溶液で経口的に、経皮的にまたは経鼻的に、投与することができる。
【００５６】
ｂ．初回抗原刺激用量後、２から４の追加抗原刺激用量も、同様の経路により、５０μｇから１ｍｇの免疫原の単位用量で投与する。
【００５７】
代替ワクチンアプローチは、弱毒化生菌ベクターに挿入されたキメラポリペプチドを発現することができるＤＮＡ構築物の投与である。可能性のあるベクターの例としては、ビブリオコレラをはじめとするブリオ菌属のメンバー；大腸菌；カンピロバクター（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ）属のメンバー；サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属のメンバー；および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
実施例４：ＤｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラのスケールアップ
妥当な量の付着因子／毒素キメラを生産するために、生産および精製計画の開発を開示する。好ましい生産および精製手順の一例を提示するが、安定な免疫原性付着因子／毒素キメラ生成物を最終的に生じさせることができる他の方法を利用してもよい。
【００５９】
この実施例では、ＬｏｎおよびＯｍｐＴプロテアーゼが欠失した大腸菌株ＢＬ２１を形質転換するために、アラビノース誘導性ベクター（ｐ０８０９Ｃ３）を選択し、使用した。３０ｇの細胞ペーストで出発し、マイクロフルイダイゼーションを用いて細胞を破壊した。可溶性画分をＴａｌｏｎ樹脂クロマトグラフィーおよびＦＰＬＣによるゲル濾過の二段階プロセスに付した。Ｔａｌｏｎ樹脂の負荷および洗浄後、５０ｍＭのイミダゾールでキメラ画分を溶離した。図７を参照して、ピークの下の溶離画分をプールし、濃縮し、ゲル濾過に付した。ゲル濾過溶離は、類似した高さのキメラ（初期ピーク）とＣＴＢ五量体（後期ピーク）に対応する２つのピークを有する、２こぶピークパターンを示した。プールしたキメラ画分を、抗ＣＴＢ、抗ＣＴＡおよび抗ＣｆａＥ抗血清を用いてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット法によって分析した。
【００６０】
生成物の機能的完全性を確認するために、図８に図示するように、生成物をガングリオシドＧＭ−１に結合するその能力について試験した。マイクロタイタープレートのウエル内に固定したＧＭ１を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。このアッセイでは、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢをＧＭ１固定化プレートに暴露し、結合したキメラを抗ＣｆａＥ抗血清によって視覚化した。対照実験において、結合したＣｆａＥ抗原について抗ＣｆａＥ抗血清でプローブする前に、ＧＴＢまたはｄｓｃＣｆａＥをマイクロタイタープレート内に固定されたＧＭ１と相互作用させたとき、抗ＣｆａＥの反応性は観察されなかった。図８では、ＧＭ１が入っているウエルに添加した０．２５から２μｇ／ｍＬのキメラ濃度範囲にわたって用量応答を観察した。この手順に使用したキメラの収量は、およそ０．０５ｍｇ／（出発細胞ペーストのｇ）であった。
【００６１】
［付記１］
毒素Ａサブユニットポリペプチドに、直接、またはリンカーおよびドナー鎖ポリペプチド配列によって、動作可能に接続された大腸菌線毛付着因子ポリペプチドを含有する精製された融合タンパク質を含む免疫原性組成物。
［付記２］
前記付着因子ポリペプチドが、前記付着因子のＣ末端で動作可能に連結されている前記リンカーによって、前記毒素Ａサブユニットに連結されており、および前記リンカーが、そのＣ末端で前記毒素Ａサブユニットに動作可能に連結されている前記ドナー鎖にも、そのＣ末端で動作可能に連結されている、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記３］
前記融合タンパク質が、毒素Ｂサブユニットに非共有結合的に連結されている、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記４］
前記毒素Ａサブユニットが、コレラ毒素Ａ、コレラ毒素Ａ２サブユニット、大腸菌易熱性毒素Ａ、大腸菌易熱性毒素Ａ２から構成される群より選択される、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記５］
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、クラス５線毛またはＣＳ３線毛に由来する、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記６］
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、定着因子抗原Ｉ、ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１、ＰＣＦ０７１、ＣＳ１９、ＣＳ２およびＣＳ３から構成される群より選択される大腸菌線毛に由来する、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記７］
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドフラグメントが、付着因子ポリペプチドの単量体または重合体である、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記８］
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドフラグメントが、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤ、ＣｏｔＤおよびＣｓｔＨから構成される群より選択される、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記９］
前記リンカーが、配列番号１、配列番号２および配列番号３から構成される群より選択されるアミノ酸配列から構成される、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１０］
前記ドナー鎖が、配列番号５の配列で示されるアミノ酸配列を有する、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１１］
前記ドナー鎖が、ＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡ、ＣｓｄＡ、ＣｏｔＡおよびＣｓｔＨから構成される群より選択される大腸菌線毛大サブユニットまたは付着因子単量体からの８から２０アミノ酸配列である、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１２］
前記融合タンパク質が、前記リンカーのＣ末端および前記毒素のＮ末端先端に動作可能に連結されたヒスチニンタグを含有する、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１３］
前記構造安定性付着因子構築物が、配列番号６；配列番号７；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１６および配列番号３０から構成される群より選択される配列で示される配列のポリペプチドまたはフラグメントである、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１４］
前記毒素Ａサブユニットが、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４および配列番号３５から構成される群より選択される配列を有するポリペプチドから構成される、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１５］
前記融合タンパク質または前記毒素Ｂサブユニットが、それらのＮ末端先端でシグナル配列に動作可能に接続されている、付記３に記載の免疫原性組成物。
［付記１６］
前記毒素Ｂサブユニットが、コレラ毒素Ｂまたは大腸菌易熱性毒素Ｂである、付記３に記載の免疫原性組成物。
［付記１７］
前記融合タンパク質および前記毒素Ｂサブユニットが、単一の発現ベクターから発現される、付記３に記載の免疫原性組成物。
［付記１８］
前記毒素Ｂサブユニットが、配列番号２０；配列番号２１および配列番号３３から構成される群より選択される配列で示されるポリペプチド配列から構成される、付記３に記載の免疫原性組成物。
［付記１９］
前記毒素ＡサブユニットのＮ末端が、配列番号２５および配列番号２６で示される配列を含有する、付記１４に記載の免疫原性組成物。
［付記２０］
前記シグナル配列が、配列番号２４のＬＴＩＩｂ毒素シグナル配列である、付記１５に記載の免疫原性組成物。
［付記２１］
ａ．付記１に記載の組成物の１つ以上の構築物を含む免疫原の初回抗原刺激用量を投与する段階と、
ｂ．免疫応答を惹起する、緩衝水溶液中の前記免疫原の５０μｇから１ｍｇの単位用量範囲での初回抗原刺激用量の少なくとも１週間後に、第一用量での追加抗原刺激用量を投与する段階と、
を含む、免疫応答を誘導する方法。
［付記２２］
前記融合タンパク質が、毒素Ｂサブユニットに非共有結合的に連結されている、付記２１に記載の方法。
［付記２３］
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤ、ＣｏｔＤおよびＣｓｔＨから構成される群より選択される、付記２１に記載の方法。
［付記２４］
前記付着因子のポリペプチドが、前記付着因子のＣ末端で動作可能に連結されている前記リンカーによって、前記毒素Ａサブユニットに連結されており、および前記リンカーが、そのＣ末端で前記毒素Ａサブユニットに動作可能に連結されている前記ドナー鎖にも、そのＣ末端で動作可能に連結されている、付記２１に記載の方法。
［付記２５］
前記大腸菌付着因子のポリペプチドが、付着因子ポリペプチドの単量体または重合体である、付記２１に記載の方法。
［付記２６］
前記構造安定性付着因子構築物が、配列番号６；配列番号７；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１６および配列番号３０から構成される群より選択される配列で示される配列のポリペプチドまたはフラグメントである、付記２１に記載の方法。
［付記２７］
前記毒素Ａサブユニットが、コレラ毒素Ａ、コレラ毒素Ａ２および大腸菌易熱性毒素Ａ、大腸菌易熱性毒素Ａ２から構成される群より選択される、付記２１に記載の方法。
［付記２８］
前記毒素Ａサブユニットが、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４および配列番号３５から構成される群より選択される配列を有するポリペプチドから構成される、付記２１に記載の方法。
［付記２９］
前記毒素ＡサブユニットのＮ末端が、配列番号２５および配列番号２６で示される配列を含有する、付記２８に記載の方法。
［付記３０］
前記免疫応答が、ヒト細胞への毒素原性大腸菌線毛付着を阻害する、付記２１に記載の方法。
［付記３１］
前記免疫応答が、ヒトにおける下痢を軽減または予防する、付記２１に記載の方法。
［付記３２］
前記組成物が、皮下的に、皮膚を通して、筋肉内に、経口的に、経皮的にまたは経鼻的に投与される、付記２１に記載の方法。
［付記３３］
前記免疫原が、ＤＮＡ発現系内にコードされ、弱毒化生菌ベクター内で発現される、付記２１に記載の方法。
［付記３４］
前記毒素Ｂサブユニットが、配列番号２０；配列番号２１および配列番号３３から構成される群より選択される配列で示されるポリペプチド配列から構成される、付記２２に記載の方法。
［付記３５］
前記組成物が、皮下的に、皮膚を通して、筋肉内に、経口的に、経皮的にまたは経鼻的に投与される、付記２２に記載の方法。
［付記３６］
前記免疫原が、ＤＮＡ発現系内にコードされ、弱毒化生菌ベクター内で発現される、付記２２に記載の方法。
［付記３７］
前記免疫応答が、ヒト細胞への毒素原性大腸菌線毛付着を阻害する、付記２２に記載の方法。
［付記３８］
前記免疫応答が、ヒトにおける下痢を軽減または予防する、付記２２に記載の方法。
［付記３９］
前記ドナー鎖が、ＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡ、ＣｓｄＡ、ＣｏｔＡおよびＣｓｔＨから構成される群より選択される大腸菌主構造線毛大サブユニットまたは付着因子単量体からの８から２０アミノ酸配列である、付記２４に記載の方法。
［付記４０］
前記経口投与が、溶液、または腸溶性顆粒カプセルによる、付記３２に記載の方法。
［付記４１］
前記経皮投与が、ドライパッチによる、付記３２に記載の方法。
［付記４２］
前記細菌ベクターが、大腸菌、赤痢菌属のメンバー、カンピロバクター属のメンバー、サルモネラ菌属のメンバー、およびビブリオ菌属のメンバーから構成される群より選択される、付記３３に記載の方法。
［付記４３］
前記経口投与が、溶液、または腸溶性顆粒カプセルによる、付記３５に記載の方法。
［付記４４］
前記細菌ベクターが、大腸菌、赤痢菌属のメンバー、カンピロバクター属のメンバー、サルモネラ菌属のメンバーおよびビブリオ菌属のメンバーから構成される群より選択される、付記３６に記載の方法。
［付記４５］
前記経皮投与が、ドライパッチによる、付記３５に記載の方法。
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、細菌線毛成分および免疫原性細菌毒素から構成されるタンパク様キメラ分子を使用して毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を誘導する方法に関する。本発明の組成物は、付着因子−トキソイドキメラを生じさせるように下痢原性細菌毒素に分子融合した大腸菌付着因子を意図する。
【背景技術】
【０００２】
下痢原性大腸菌の幾つかの病原型のうちの１つである毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、軽度からコレラ様瀉下にわたる分泌型下痢を引き起こす。ＥＴＥＣは、多くの発展途上国に住む人およびそこを訪ねる旅行者に重要な医療上の懸念を提起する。物資が乏しい国の幼児において、およびこれらの地域を旅する者においても、ＥＴＥＣは下痢の主原因である（非特許文献１、非特許文献２）。乳児および幼児に、この生物が年間２億１千万件の下痢および３８万の死を引き起こすと推定される（非特許文献３）。
【０００３】
ＥＴＥＣは、小腸上皮細胞への付着ならびに易熱性（ＬＴＩ）および／または熱安定性（ＳＴ）腸毒素の発現によって疾病を生じさせる（非特許文献４）。一般に、ＥＴＥＣは、定着因子（ＣＦ）として知られている糸状細菌表面構造によって宿主細胞に付着する。２０より多くの異なるＣＦが記載されており、それらのうちの少数は、疑う余地なく病理発生の原因とみなされている（非特許文献５）。
【０００４】
記載する第一ヒト特異的ＥＴＥＣ ＣＦである定着因子抗原Ｉ（ＣＦＡ／Ｉ）には、病原的役割についての確固たる証拠が存在する。ＣＦＡ／Ｉは、遺伝子的および生化学的特徴を共有する８のＥＴＥＣ線毛から構成される１つのファミリーの原型である（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。このファミリーは、大腸菌表面抗原１（ＣＳ１）、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９および推定定着因子Ｏ７１（ＰＣＦＯ７１）を含む。この線毛ファミリーの８すべてのメンバーをコードする遺伝子クラスターの完全ＤＮＡ配列は、出版物に掲載されている（非特許文献１０）、（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。（順番に）ペリプラズムシャペロン、線毛大サブユニット、外膜ｕｓｈｅｒタンパク質および線毛小サブユニットをコードする、ＣＦＡ／Ｉおよび関連線毛の４遺伝子生体組み立てオペロンが、同様に構成される。ＣＦＡ／Ｉの組み立ては、Ｉ型線毛形成の古典的シャペロン−ｕｓｈｅｒ経路およびＩＶ型線毛などの他の糸状構造のものとは異なる、代替シャペロン経路によって行われる（非特許文献１４、非特許文献１５）。線毛大サブユニットの一次配列に基づき、ＣＦＡ／Ｉおよび関連線毛は、クラス５線毛と分類された（非特許文献１６）。
【０００５】
ＣＳ１の研究は、クラス５線毛の組成および機能的特徴に関する詳細をもたらした（非特許文献１７）。ＣＳ１線毛柄（ｆｉｍｂｒｉａｌ ｓｔａｌｋ）は、反復ＣｏｏＡ大サブユニットから構成される。そのＣｏｏＤ小サブユニットは、伝えられるところによると、線毛先端（その線毛量の極めて小さな割合を構成する）に位置し、線毛形成の開始に必要とされる（非特許文献１８）。従って、大サブユニットが結合を媒介することを示唆する先行の証拠（非特許文献１９）とは対照的に、最近の発見は、小サブユニットを線毛媒介付着の責任を負うものとして関係付け、ＣＳ１およびＣＦＡ／Ｉ線毛のインビトロ付着に必要な特定のアミノ酸残基を同定した（非特許文献２０）。大サブユニットは、小サブユニットとそれぞれの線毛の血清学的相違の原因となる（非特許文献２１）。
【０００６】
クラス５大および小サブユニットの比較進化分析は、大サブユニットと比較して大きな構造的保存が小サブユニットの間に存在することを明示している。これは、異種、サブクラス関連線毛を発現するＥＴＥＣのマンノース耐性血球凝集反応（ＭＲＨＡ）を阻害する、抗大サブユニットおよび線毛抗体ではなく、抗小サブユニットの能力と一致する（非特許文献２２）。
【０００７】
１およびＰ型線毛を含む尿路病原性大腸菌株に関する以前の研究努力が、これらの細菌株上の線毛組み立てメカニズムを解明するためにモデルとして利用された。これらの研究は、尿路病原性大腸菌における組み立てが、シャペロン−ｕｓｈｅｒ経路によって行われることを示した（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５）。この研究の成果は、ドナー鎖の相補性の原理、線毛サブユニットが、重要な欠失β鎖の相互作用性サブユニット間シャッフリングにより隣接サブユニットと非共有結合的にからみ合うプロセス、の開発であった（非特許文献２６、非特許文献２７；非特許文献２８）。証拠は、この同じメカニズムを、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血球凝集性線毛（非特許文献２９）およびペスト菌莢膜タンパク質、非線毛タンパク質重合体（非特許文献３０）のフォールディングおよび４次構造完全性に関係付けた。これらの両方の構造は、古典的シャペロン−ｕｓｈｅｒ経路によって組み立てられる、クラスＩの１およびＰ型線毛の遠縁ある。
【０００８】
尿路病原性大腸菌における努力にもかかわらず、ＥＴＥＣにおける付着部分の同定および線毛組み立てメカニズムは不明であった。これらの異なる経路の線毛組み立ておよび構造成分が配列類似性を共有しないことは、それらが、収束進化の道を通って生じたことを示唆している。それにもかかわらず、ＣＦＡ／Ｉ構造サブユニットのコンピュータ分析は、ドナー鎖の相補性がシャペロン−サブユニットおよびサブユニット−サブユニット相互作用も支配し得る可能性を示唆している。
【０００９】
８つのＥＴＥＣクラス５線毛は、メンバー数３（ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ４およびＣＳ１４）、４（ＣＳ１、ＰＣＦＯ７１、ＣＳ１７およびＣＳ１９）および１（ＣＳ２）の３つのサブクラス（それぞれ、サブクラス５ａ、５ｂおよび５ｃと呼ばれる）にクラスタリングされた（非特許文献３１）。以前の報告は、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４およびＣＳ１９を有するＥＴＥＣが、クラスター化Ｃａｃｏ−２細胞への付着をはっきりと示すことを明示した（非特許文献３２、非特許文献３３）。しかし、ＣＦＡ／ＩおよびＣＳ１のどの成分サブユニットが付着を媒介するかに関して相反するデータが発表された（非特許文献３４、非特許文献３５）。
【００１０】
どの線毛成分が付着媒介に責任を負うかというこの疑問には、無損傷ＣＦＡ／Ｉ線毛、ＣｆａＢ（大サブユニット）への、ならびに２つの異なるインビトロ付着モデルにおけるＣｆａＥ（小サブユニット）の非オーバーラッピングアミノ末端（残基２３〜２１１）およびカルボキシ末端（残基２１２〜３６０）半分への抗体の付着阻害活性を評価することによるアプローチがとられた（非特許文献３６）。ＣＦＡ／Ｉ付着に最も重要なドメインは、付着因子ＣｆａＥのアミノ末端半分に存するが実証された。
【００１１】
上で簡単に説明した研究は、ＣＦＡ／Ｉの小サブユニット、ならびに他のクラス５線毛の同種サブユニットが受容体結合部分であるという証拠を提供している（非特許文献３７、非特許文献３８）。これらの観察とも一致して、小サブユニットの低レベルの配列多様性が線毛サブクラス５ａおよび５ｂ内で観察された（非特許文献３９）ため、進化の関係は、これら２つのサブクラスのそれぞれを代表する小サブユニットのアミノ末端半分に対する抗体の交差反応と相関した（非特許文献４０）。
【００１２】
類似しているがクラス５線毛とは異なる大腸菌表面抗原（ＣＳ３）は、ＥＴＥＣ定着因子抗原ＩＩ（ＣＦＡ／ＩＩ）複合体の共通付着微細線維の代表である。これらの抗原を発現するＥＴＥＣは、世界の多くの地域において流行している。ＣＳ３は、２つのサブユニット、ＣｓｔＨおよびＣｓｔＧから構成される。さらに、ＣｓｔＧではなく、抗血清抗原ＣｓｔＨは、血球凝集反応阻害を示した。これは、ＣｓｔＨがＣＳ３付着因子であることを示唆している。
【００１３】
ＣＳ３微細線維の組み立ては、ＰａｐＤスーパーファミリーへのＣＳ３ペリプラズムシャペロンの遺伝子的関連性に基づき、古典的シャペロン−ｕｓｈｅｒ（ＣＵ）経路のメンバーとして分類された（非特許文献４１）。興味深いことに、それは、細長い微細線維状またはａｆｉｍｂｒｉａｌ付着オルガネラの組み立てを媒介するＦＧＬ（Ｆ１−Ｇ１ ｌｏｎｇ）サブファミリー（シャペロンの固有の構造的特徴を指す）に分類される（非特許文献４２）。ＣｓｔＨのＮ末端アミノ酸スパンとペスト菌Ｆ１莢膜サブユニットのアラインメントは、（成熟ＣｓｔＨポリペプチドを参照して）アミノ酸１６による交互疎水性残基の共通モチーフを示す。Ｆ１莢膜サブユニット（Ｃａｆ１）のこのスパンは、莢膜組み立ておよびサブユニット連結中にＣａｆ１Ｍシャペロンと相互作用し、Ｆ１タンパク質サブユニットに隣接することにより、ドナー鎖として機能する（非特許文献４３）。従って、ＣｓｔＨも同様に機能し得ると、当然、推論される。
【００１４】
コレラ毒素（ＣＴ）および大腸菌腸毒素（ＬＴＩおよびＬＴＩＩ）は、易熱性腸毒素ファミリーのメンバーである（非特許文献４４、非特許文献４５、非特許文献４６）。それらは、小腸の腸細胞に対して作用し、分泌性下痢を引き起こす。それぞれの毒素は、単一のＡポリペプチドおよび５つの同一のＢポリペプチド（すべて、非共有結合性相互作用によって付いている）から構成される。ＣＴおよびＬＴＩの公知変異体は、血清群Ｉに属し、ＬＴＩＩの変異体は、血清群ＩＩに属する。
【００１５】
ＣＴ、ＬＴＩおよびＬＴＩＩｂの構造は、血清群Ｉの毒素のＢポリペプチドと血清群ＩＩの毒素のＢポリペプチドとでアミノ酸配列が異なるにもかかわらず、すべてが、密接に関連したフォールディングパターンを有することを示す（非特許文献４７）。５つの同一のＢポリペプチドが、１つのドーナツ形分子を形成する。Ａポリペプチドは、Ｂサブユニットの上面のすぐ隣に位置するＡ１ドメインと、Ｂ五量体の中央の孔を通るＡ２ドメインとを有する。Ａ１およびＡ２は、短い表面露出ループによって連結されている。そのループ内のタンパク質溶解性分解は、ジスルフィド結合によって連結されたフラグメントＡ１およびＡ２を伴う、ニックを有するホロトキシンを生じさせる。そのＢ五量体の下面の５つの同一の結合部位は、ターゲット細胞上の特定の受容体と相互作用する。腸毒素間の受容体結合特異性は大いに異なる。ＣＴおよびＬＴＩは、ガングリオシドＧＭ１にしっかりと結合する。ＣＴではなくＬＴＩは、アシアロガングリオシドＧＭ１および一定の糖タンパク質に結合し、ならびにＬＴＩＩａおよびＬＴＩＩｂは、ガングリオシドＧＤ１ｂおよびＧＤ１ａに、それぞれ、最もよく結合する。
【００１６】
ＥＴＥＣが定着した時の上皮細胞などの細胞に対する腸毒素の活性は、事象の複雑な連鎖によって媒介される（非特許文献４８、非特許文献４９、非特許文献５０、非特許文献５１）。定着すると、ＥＴＥＣ熱安定性（ＳＴ）および／または易熱性（ＬＴＩ）腸毒素は、上皮細胞に対して作用する。ＬＴＩに加えて、ＥＴＥＣ熱安定性腸毒素（ＳＴ）は、腸膜に結合したグアニル酸シクラーゼを活性化する腸ペプチドグアニリンの非免疫原性ペプチド類似体である（非特許文献５２）。
【００１７】
幼児の血清免疫学的研究によって、血清抗ＣＦＡ／Ｉ ＩｇＧ抗体レベルとＣＦＡ／Ｉ−ＥＴＥＣでの疾病のリスクの間の逆相間が証明された（非特許文献５３）。しかし、研究は、抗ＬＴＩ抗体が防御的であることを実証することができなかった。ＣＴのＢサブユニット（ＣＴ−Ｂ）の投与が、抗原的に類似たＬＩＴ腸毒素を発現する、ＥＴＥＣに起因する下痢に対しての有意な防御をもたらすとう証拠が存在する（非特許文献５４、非特許文献５５）。さらに、動物攻撃試験は、抗線毛抗体と抗ＬＴＩ抗体が相乗的に作用して、ＥＴＥＣ攻撃から防御することを示唆した（非特許文献５６）。
【００１８】
非毒性形態のＬＴＩまたはＣＴを伴うＣＦＡ／Ｉおよび他の大腸菌表面抗原に対する有望な免疫応答のため、これらの抗原がＥＴＥＣに対する粘膜ワクチン製剤の中心になった（非特許文献５７）。ＣＴ−Ｂと共同投与される経口、死菌全細胞ＥＴＥＣワクチンが広範に試験された（非特許文献５８、非特許文献５９）。このワクチンが安全であることはわかったが、乳児には効かなかった（非特許文献６０）。さらに、弱毒生ＥＴＥＣ生ワクチンは、弱毒化と免疫原性との適正なバランスを達成できないことに、一部起因して、有効でないことが判明した（非特許文献６１、非特許文献６２、非特許文献６３、非特許文献６４）。従って、より有効に抗付着性免疫を誘導する線毛成分の同定の重要性は、ますます深刻になってきている。ＥＴＥＣにおいて、この部分は、ＣｆａＥなどの線毛小サブユニットであることが明らかになった。従って、本発明の態様は、ＣＴまたはＬＴなどの細菌トキソイドの成分とのコンジュゲーションでの構造安定性ＥＴＥＣ線毛付着因子または付着ドメインの構築、および下痢原性ＥＴＥＣに対する免疫を誘導するためのそれらの使用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｂｌａｃｋ，Ｒ．Ｅ．１９９０．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｒａｖｅｌｅｒｓ’ｄｉａｒｒｈｅａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ９８，５ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳ ５６０ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｒｅｖ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １２（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ７３−Ｓ７９．
【非特許文献２】Ｈｕｉｌａｎ，Ｓ．，Ｌ．Ｇ．Ｚｈｅｎ，Ｍ．Ｍ．Ｍａｔｈａｎ，Ｍ．Ｍ．Ｍａｔｈｅｗ，Ｊ．Ｏｌａｒｔｅ，Ｒ．Ｅｓｐｅｊｏ，Ｕ．Ｋｈｉｎ Ｍａｕｎｇ，Ｍ．Ａ．Ｇｈａｆｏｏｒ，Ｍ．Ａ．Ｋｈａｎ，Ｚ．Ｓａｍｉ，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ａｍｏｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｆｉｖｅ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ．Ｂｕｌｌ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ ６９：５４９−５５．
【非特許文献３】Ｑａｄｒｉ，Ｆ．，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ａ．Ｓ．Ｆａｒｕｑｕｅ，ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｓａｃｋ．１００５．Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ １８：４６５−４８３．
【非特許文献４】Ｎａｔａｒｏ，Ｊ．Ｐ．，ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋａｐｅｒ．１９９８．Ｄｉａｒｒｈｅａｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １１：１４２−２０１．
【非特許文献５】Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ．１９９６．Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ５９０ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：４４４−４５２．
【非特許文献６】Ｅｖａｎｓ，Ｄ．Ｇ．，Ｒ．Ｐ．Ｓｉｌｖｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ，Ｊｒ．，Ｄ．Ｇ．Ｃｈａｓｅ，ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｇｏｒｂａｃｈ．１９７５．Ｐｌａｓｍｉｄ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ／／ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １２：６５６−６６７．
【非特許文献７】Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ．１９９６．Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ５９０ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：４４４−４５２．
【非特許文献８】Ｇｒｅｗａｌ，Ｈ．Ｍ．，Ｈ．Ｖａｌｖａｔｎｅ，Ｍ．Ｋ．Ｂｈａｎ，Ｌ．ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｗ．Ｇａａｓｔｒａ，ａｎｄ Ｈ．Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ．１９９７．Ａ ｎｅｗ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，ＣＳ １９，ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５：５０７−５１３．
【非特許文献９】Ｋｈａｌｉｌ，Ｓ．Ｂ．，Ｆ．Ｊ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｉ．Ｓｈａｈｅｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｐａｎｎｅｌｌ，Ｋ．Ａ．Ｋａｍａｌ，Ｂ．Ｔ．Ｐｉｔｔｎｅｒ，Ｍ．Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｒ．Ｆｒｅｎｃｋ，Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ，ａｎｄ Ｐ．Ｌ．Ｆ．２０００．Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ＴＨＥ １００ｔｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ＴＨＥ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ．
【非特許文献１０】Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ，Ｂ．Ｊ．，Ａ．Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ，Ｌ．Ｒ．Ｍｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｃ．Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９４．ＣｏｏＣ ａｎｄ ＣｏｏＤ ＡＲＥ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ．ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２：３８７４０１．
【非特許文献１１】Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ，Ｂ．Ｊ．，Ａ．Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ，Ｈ．Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９５．Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ９８，５４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳＣＳ２ ｐｉｌｉ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｏｒ ＣＳｌ ｐｉｌｉ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４８４９−５６．
【非特許文献１２】Ｐｅｒｅｚ−Ｃａｓａｌ，Ｊ．，Ｊ．Ｓ．Ｓｗａｒｔｌｅｙ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９０．Ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＴＨＥ ｍａｊｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５８：３５９４−３６００．
【非特許文献１３】Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｊ．Ｃ．Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｐ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐ．Ｅ．Ｏｒｎｄｏｒｆｆ，ａｎｄ Ｂ．Ｊ．Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ．１９９２．ＣｏｏＢ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉｎ．ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：２９３−３００．
【非特許文献１４】Ｒａｍｅｒ，Ｓ．Ｗ．，Ｇ．Ｋ．Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ，Ｃ．Ｙ．Ｗｕ，Ｊ．Ｈｗａｎｇ，Ｓ．Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，ａｎｄ Ｄ．６５０ Ｂｉｅｂｅｒ．２００２．ｔｈｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｕｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｏｍｐｌｅｘ：Ｂｉｏｇｅｎｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ＴＨＥ Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ９８，５４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳ ｂｕｎｄｌｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｉｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８４：３４５７−６５．
【非特許文献１５】Ｓｏｔｏ，Ｇ．Ｅ．，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ．１９９９．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎｓ：ｃｏｍｍｏｎ ｔｈｅｍｅｓ ａｎｄｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１０５９−１０７１．
【非特許文献１６】Ｌｏｗ，Ｄ．，Ｂ．Ｂｒａａｔｅｎ，ａｎｄ Ｍ．Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅ．１９９６．Ｆｉｍｂｒｉａｅ，Ｐ．１４６−１５７．Ｉｎ Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ｉｉｉ，Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｅ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｌｏｗ，Ｂ．Ｍａｇａｓａｎｉｋ，Ｗ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｍ．Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ，ａｎｄ Ｈ．Ｅ．Ｕｍｂａｒｇｅｒ（ｅｄ．），Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ，ｖｏｌ．Ｖｏｌｕｍｅ１．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
【非特許文献１７】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９８．Ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ａｎ ｏｌｄ ｔｒａｄｅ：ＣＳｌ ｐｉｌｕｓ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３０：６８１−７．
【非特許文献１８】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，Ｖ．Ｒ．Ｐｅｎｕｍａｌｌｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９９．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｏｒ ｐｉｌｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＣｏｏＤ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＣＳ １ ｐｉｌｉ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１６９４−７．
【非特許文献１９】Ｂｕｈｌｅｒ，Ｔ．，Ｈ．Ｈｏｓｃｈｕｔｚｋｙ，ａｎｄ Ｋ．Ｊａｎｎ．１９９１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ，ａｎ ａｄｈｅｓｉｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ７８：Ｈ１１：ｆｉｍｂｒｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：３８７６−３８８２．
【非特許文献２０】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，Ｇ．Ｐ．Ｍｕｎｓｏｎ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９９．Ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｉｐ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＣＳｌ ａｎｄ ＣＦ Ａ／Ｉ ｐｉｌｉ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨＡＴ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ９８，５４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳ ｆｏｒ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９６：１２８２８−１２８３２．
【非特許文献２１】Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ．１９９６．Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：４４４−４５２．
【非特許文献２２】Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【非特許文献２３】Ｋｕｅｈｎ ＭＪ，Ｊ．Ｈｅｕｓｅｒ，Ｓ．Ｎｏｒｍａｒｋ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ．１９９２．Ｐ ｐｉｌｉ ｉｎ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＲＥ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｆｉｂｒｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｉｂｒｉｌｌａｒ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｔｉｐｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３５６：２５２−５．
【非特許文献２４】Ｓａｕｅｒ ＦＧ，Ｋ．Ｆｕｔｔｅｒｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｐｉｎｋｎｅｒ，Ｋ．Ｗ．Ｄｏｄｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ ａｎｄ Ｇ．Ｗａｋｓｍａｎ．１９９９．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｉｌｕｓ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１０５８−６１．
【非特許文献２５】Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｄ３ Ａ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｖ．Ｓｔｏｊａｎｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ａｄｈｅｓｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８５：１０６１−６．
【非特許文献２６】Ｓａｕｅｒ ＦＧ，Ｋ．Ｆｕｔｔｅｒｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｐｉｎｋｎｅｒ，Ｋ．Ｗ．Ｄｏｄｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ ａｎｄ Ｇ．Ｗａｋｓｍａｎ．１９９９．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｉｌｕｓ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１０５８−６１．
【非特許文献２７】Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｄ３ Ａ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｖ．Ｓｔｏｊａｎｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ａｄｈｅｓｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８５：１０６１−６．
【非特許文献２８】Ｂａｍｈａｒｔ ＭＭ，Ｐｉｎｋｎｅｒ ＪＳ，Ｓｏｔｏ ＧＥ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｖｅｒ：ＰａｐＤ−ｌｉｋｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｍｉｓｓｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｐｉｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００；９７：７７０９−１４．
【非特許文献２９】Ｋｒａｓａｎ ＧＰ，Ｓａｕｅｒ ＦＧ，Ｃｕｔｔｅｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｄｏｎｏｒ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｐｉｌｉ．ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００；３５：１３３５−４７．
【非特許文献３０】Ｚａｖｉａｌｏｖ ＡＶ，Ｋｅｒｓｌｅｙ Ｊ，Ｋｏｒｐｅｌａ Ｔ，Ｚａｖ’ｙａｌｏｖ ＶＰ，Ｍａｃｌｎｔｙｒｅ Ｓ ａｎｄ Ｋｎｉｇｈｔ ＳＤ．Ｄｏｎｏｒ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｐｉｌｕｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２；４５：９８３−９９５．
【非特許文献３１】Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【非特許文献３２】Ｇｒｅｗａｌ，Ｈ．Ｍ．，Ｈ．Ｖａｌｖａｔｎｅ，Ｍ．Ｋ．Ｂｈａｎ，Ｌ．ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｗ．Ｇａａｓｔｒａ，ａｎｄ Ｈ．Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ．１９９７．Ａ ｎｅｗ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，ＣＳ １９，ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５：５０７−５１３．
【非特許文献３３】Ｖｉｂｏｕｄ，Ｇ．Ｉ．，Ｍ．Ｍ．ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ａ．Ｈｅｌａｎｄｅｒ，ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ．１９９６．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃａｃｏ−２ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ２１：１３９ １４７．
【非特許文献３４】Ｂｕｈｌｅｒ，Ｔ．，Ｈ．Ｈｏｓｃｈｕｔｚｋｙ，ａｎｄ Ｋ．Ｊａｎｎ．１９９１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ，ａｎ ａｄｈｅｓｉｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ７８：Ｈ１１：ｆｉｍｂｒｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：３８７６−３８８２．
【非特許文献３５】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，Ｖ．Ｒ．Ｐｅｎｕｍａｌｌｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９９．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｏｒ ｐｉｌｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＣｏｏＤ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＣＳ １ ｐｉｌｉ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１６９４−７．
【非特許文献３６】Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【非特許文献３７】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，Ｖ．Ｒ．Ｐｅｎｕｍａｌｌｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９９．ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＣＳ １ ｐｉｌｉ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１６９４−７．
【非特許文献３８】Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【非特許文献３９】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ，Ｈ．，Ｖ．Ｒ．Ｐｅｎｕｍａｌｌｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔ．１９９９．ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｏｒ ｐｉｌｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＣｏｏＤ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＣＳ １ ｐｉｌｉ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１６９４−７．
【非特許文献４０】Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【非特許文献４１】Ｈｕｎｇ，Ｄ．Ｌ．，Ｓ．Ｄ．Ｋｎｉｇｈｔ，Ｒ．Ｍ．Ｗｏｏｄｓ，Ｊ．Ｓ．Ｐｉｎｋｎｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ．１９９６．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．１５：３７９２−３８０５．
【非特許文献４２】Ｓｏｔｏ，Ｇ．Ｅ．，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｕｌｔｇｒｅｎ．１９９９．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎｓ：ｃｏｍｍｏｎ ｔｈｅｍｅｓ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１０５９−１０７１．
【非特許文献４３】Ｚａｖｉａｌｏｖ，Ａ．Ｖ．，Ｊ．Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ａ．Ｆ．Ｐｕｄｎｃｙ，ｅｔ ａｌ．，２００３．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｐｓｕｌａｒ Ｆｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ：ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｄｒｉｖｅｓ ｆｉｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １１３：５８７−５９６．
【非特許文献４４】Ｈｉｒｓｔ，ｋ Ｔ．Ｒ．１９９９．Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ，Ｐ．１０４−１２９．Ｉｎ Ｅ．Ａｌｏｕｆ ａｎｄ Ｊ．Ｈ．Ｆｒｅｅｒ（ｅｄ．），Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ，２ ｅｄ，ｖｏｌ．６．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．
【非特許文献４５】Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．１９９７．Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），Ｐ．３０−３３．ＩｎＲ．Ｒａｐｐｕｌｏｉ ａｎｄ Ｃ．Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ（ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ ＵＳＥ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
【非特許文献４６】Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ Ｒ．Ｋ．Ｈｏｌｍｅｓ．２００５．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐ．９−４６．Ｉｎ Ｔ．Ｐｒｏｆｔ（ｅｄ．），Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ．１９．Ｊｏｒｄｉ，Ｂ．Ｊ．Ａ．Ｍ．，Ｇ．Ａ．Ｗｉｌｌｓｈａｗ，Ａ．Ｍ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ，ａｎｄ Ｗ．Ｇａａｓｔｒａ．１９９２．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｔｈｅ ＣＦ Ａ／Ｉ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＤＮＡ Ｓｅｑ ２：２５７−２６
【非特許文献４７】Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉ，Ｍ．，Ｍ．Ｐｉｚｚａ，Ｍ．Ｇ．Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｒ．Ｋ．Ｈｏｌｍｅｓ，ａｎｄ Ｒ．Ｒａｐｐｕｌｏｌｉ．１９９５．Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｒｏｒｓ ａｍｏｎｇ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｔｒｉｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｏｒｒｅｃｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ．ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５：１１６５−１１６７．
【非特許文献４８】Ｈｉｒｓｔ，ｋ Ｔ．Ｒ．１９９９．Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ，Ｐ．１０４−１２９．Ｉｎ Ｅ．Ａｌｏｕｆ ａｎｄ Ｊ．Ｈ．Ｆｒｅｅｒ（ｅｄ．），Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ，２ ｅｄ，ｖｏｌ．６．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．
【非特許文献４９】Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．１９９７．Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），Ｐ．３０−３３．ＩｎＲ．Ｒａｐｐｕｌｏｉ ａｎｄ Ｃ．Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ（ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ ＵＳＥ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
【非特許文献５０】Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ Ｒ．Ｋ．Ｈｏｌｍｅｓ．２００５．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐ．９−４６．Ｉｎ Ｔ．Ｐｒｏｆｔ（ｅｄ．），Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ．１９．Ｊｏｒｄｉ，Ｂ．Ｊ．Ａ．Ｍ．，Ｇ．Ａ．Ｗｉｌｌｓｈａｗ，Ａ．Ｍ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ，ａｎｄ Ｗ．Ｇａａｓｔｒａ．１９９２．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｔｈｅ ＣＦ Ａ／Ｉ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＤＮＡ Ｓｅｑ ２：２５７−２６．
【非特許文献５１】Ｓｐａｎｇｌｅｒ，Ｂ．Ｄ．１９９２．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６：６２２−６４７．
【非特許文献５２】Ｓｃｈｕｌｚ，Ｓ．，Ｍ．Ｊ．Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．Ｋｕｈｎ，ａｎｄ Ｄ．Ｌ．Ｇａｒｂｅｒｓ．１９９７．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕａｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ−Ｃ ｇｅｎｅ ｌｅａｄｓ ｔｏ ａ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１５９０−１５９５．
【非特許文献５３】Ｒａｏ，Ｍ．Ｒ．，Ｔ．Ｆ．Ｗｉｅｒｚｂａ，Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ，Ｒ．Ａｂｕ−Ｅｌｙａｚｅｅｄ，Ｎ．Ｅｌ−Ｇｈｏｒｅｂ，Ｅ．Ｒ．Ｈａｌｌ，Ａ．Ｎａｆｉｃｙ，Ｉ Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｓｓｉｈ，Ｒ．Ｗ．Ｆｒｅｎｃｋ，Ｊｒ．，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｓ．２００５．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｄｉａｒｒｈｅａ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９１：５６２−５７０．
【非特許文献５４】Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｄ．Ａ．Ｓａｃｋ，Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｃｈａｒｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｐ．Ｋ．Ｎｅｏｇｙ，Ｂ．Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｎ．Ｈｕｄａ，Ｍ．Ｕ．Ｋｈａｎ，Ｂ．Ａ．Ｋａｙ，Ｍ．Ｒ．Ｋｈａｎ，Ｍ．Ａｎａｓａｒｕｚｚａｍａｎ，Ｍ．Ｙｕｎｕｓ，Ｍ．Ｒ．Ｒａｏ，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，ａｎｄ Ｊ．Ｈｏｌｍｇｒｅｎ．１９８８．Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｃｈｏｌｅｒａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉａｒｒｈｅａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｆｉｅｌｄ ｔｒｉａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５８：３７２−３７７．
【非特許文献５５】Ｐｅｌｔｏｌａ，Ｈ．，Ａ．Ｓｉｉｔｏｎｅｎ，Ｈ．Ｋｙｒｏｎｓｅｐｐａ，Ｉ．Ｓｉｍｕｌａ，Ｌ．Ｍａｔｔｉｌａ，Ｐ．Ｏｋｓａｎｅｎ，ＭＪ．Ｋａｔａｊａ，ａｎｄ Ｍ．Ｃａｄｏｚ．１９９１．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｖｅｌｌｅｒ’Ｓ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ｂｙ ｏｒａｌ Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔ／ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌ Ｉ ｃｈｏｌｅｒａ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｌａｎｃｅｔ ３３８：１２８５−１２８９．
【非特許文献５６】Ａｈｒｅｎ，ＣＭ．，ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ．１９８２．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ５４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓＪｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３８：７４−７９．
【非特許文献５７】Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｃ．Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ．２００５．Ｍｕｓｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．ｌ ｌ：Ｓ４５−５３．
【非特許文献５８】Ｓａｖａｒｉｎｏ，Ｓ．Ｊ．，Ｅ．Ｒ．Ｈａｌｌ，Ｓ．Ｂａｓｓｉｌｙ，Ｆ．Ｍ．Ｂｒｏｗｎ，Ｆ．Ｙｏｕｓｓｅｆ，Ｔ．Ｆ．Ｗｉｅｒｚｂａ，Ｌ．Ｐｅｒｕｓｋｉ，Ｎ．Ａ．Ｅｌ−Ｍａｓｒｙ，Ｍ．Ｓａｆｗａｔ，Ｍ．Ｒａｏ，Ｈ．Ｅｌ Ｍｏｈａｍａｄｙ，Ｒ．Ａｂｕ−ｅｌｙａｚｅｅｄ，Ａ．Ｎａｆｉｃｙ，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ｍ．Ｊｅｒｔｂｏｒｎ，ＹＪ．Ｌｅｅ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｓ．１９９９．Ｏｒａｌ，ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ，ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌｕｓ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．ＰＲＩＤＥ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７９：１０７−１１４．
【非特許文献５９】Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ａ．Ｍ．，Ｃ．Ａｈｒｅｎ，ａｎｄ Ｍ．Ｊｅｒｔｂｏｍ．１９９７．Ｏｒａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｐ．８６５−８７４．Ｉｎ Ｍ．Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗ，Ｊ．Ｂ．Ｋａｐｅｒ，ａｎｄ Ｇ．Ｓ．Ｇａｂｏｎ（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＩＩ ｅｄ．Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
【非特許文献６０】Ｓａｖａｒｉｎｏ，Ｓ．Ｊ．，Ｒ．Ａｂｕ−Ｅｌｙａｚｅｅｄ，Ｍ．Ｒ．Ｒａｏ，Ｒ．Ｗ．Ｆｒｅｎｃｋ，Ｉ．Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｓｓｉｈ，Ｈ．Ｅ．Ｒ．，Ｓ．Ｐｕｔｎａｍ，Ｈ．Ｅｌ−Ｍｏｈａｍａｄｙ，Ｔ．Ｗｉｅｒｚｂａ，Ｂ．Ｐｉｔｔｎｅｒ，Ｋ．Ｋａｍａｌ，Ｐ．Ｍｏｙｅｒ，Ｍ．Ｂ．Ｚ．，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ｙ．Ｊ．Ｌｅｅ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｓ．２００３．Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ．
【非特許文献６１】Ａｌｔｂｏｕｍ，Ｚ．，Ｍ．Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ｅ．Ｇａｌｅｎ，ａｎｄ Ｅ．Ｍ．Ｂａｒｒｙ．２００３．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｏｌｉ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ４ ｆｒｏｍ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｈｅｎ ｉｔ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｌｉｖｅ−ｖｅｃｔｏｒ ｓｔｒａｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：１３５２−１３６０．
【非特許文献６２】Ｂａｒｒｙ，Ｅ．Ｍ．，Ｚ．Ａｌｔｂｏｕｍ，Ｇ．Ｌｏｓｏｎｓｋｙ，ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ．２００３．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｉｍｂｒｉａｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＬＴ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ １７：３３３−３４０．
【非特許文献６３】Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｒ．Ｅ．Ｂｌａｃｋ，Ｍ．Ｌ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＲ．Ｙｏｕｎｇ，ＣＰ．Ｃｈｅｎｅｙ，ａｎｄ Ｐ．Ｓｃｈａｄ．１９８４．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｄｉａｒｒｒｈｅａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｎ ｉｎ ｍａｎ ｂｙ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔｈａｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ａｎｔｉ−ａｄｈｅｓｉｏｎ（ａｎｔｉ−ｐｉｌｉ）ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｐ２２３−２４４．Ｉｎ Ｅ．Ｃ．Ｂｏｅｄｅｋｅｒ（ｅｄ．），Ａｔｔａｃｈｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｓｕｒｆａｃｅ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ．Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ９８，５４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳ．
【非特許文献６４】Ｔｕｒｎｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｔ．Ｄ．Ｔｅｒｒｙ，Ｄ．Ａ．Ｓａｃｋ，Ｐ．Ｌｏｎｄｏｎｏ−Ａｒｃｉｌａ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｄａｒｓｌｅｙ．２００１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｒｏ ｏｍｐ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ａｔｔｎｙ Ｄｏｃｋｅｔ ９８，５４４ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＱ ４３８６６５７９１ ＵＳ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｃｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４９６９−４９７９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、大腸菌の幾つかの重要な病原型うちの１つであり、下痢原性大腸菌株の最も重要な病原型の１つである。前記生物は、軽度からコレラ様瀉下にわたる分泌型下痢を引き起こす。現在、ＥＴＥＣに対して効くワクチンは存在しない。従って、これらの生物に対する新規ワクチン製剤は、特に、下痢疾患が最も流行しており、医療基幹施設が乏しい発展途上国には、重要である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の目的は、ワクチン製剤において使用するための構造的に安定でプロテアーゼ耐性の付着因子ポリペプチド−毒素融合構築物を含む組成物である。考えられる融合構築物は、任意の細菌毒素Ａサブユニットを含む。加えて、考えられる変型は、同じまたは異なる毒素の毒素Ｂサブユニットと非共有結合的に会合している、融合生成物に含まれている、Ａサブユニットを含む。本組成物は、大腸菌に対する免疫応答の誘導に有用である。毒素の例としては、コレラ毒素および毒素原性大腸菌易熱性腸毒素が挙げられる。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、毒素Ｂサブユニットと非共有結合的に会合しているまたはしていない、構造的に安定でプロテアーゼ耐性の付着因子ポリペプチド−細菌毒素Ａサブユニット融合構築物であり、この場合、毒素ＡおよびＢサブユニットは、コレラ毒素または大腸菌易熱性毒素に由来する。
【００２３】
本発明の、さらなる目的は、キメラ分子またはキメラ分子の混合物の投与により、大腸菌線毛または大腸菌（クラス５大腸菌および大腸菌ＣＳ３微細線維を含む）に対する免疫応答を誘導する方法であり、前記キメラ分子は、それぞれ、免疫修飾効果およびアジュバント効果を示す細菌トキソイドの成分（例えば、コレラまたはＥＴＥＣ易熱性毒素からのもの）に遺伝子的に融合した安定化ＥＴＥＣ付着因子ポリペプチドから構成される。
【００２４】
追加の目的は、宿主へのＥＴＥＣ線毛または微細線維の付着を阻害することによる大腸菌の定着の予防である。
【００２５】
さらなる追加の目的は、キメラ分子またはキメラ分子の混合物の投与により、腸毒素に対する抗体免疫応答を誘導する方法であり、前記キメラ分子は、それぞれ、細菌トキソイドの成分（例えば、コレラまたはＥＴＥＣ易熱性毒素からのもの）に遺伝子的に融合した安定化ＥＴＥＣ付着因子ポリペプチドから構成される。
本発明のこれらおよび他の目的は、免疫を誘導するためのワクチン成分として大腸菌付着因子ポリペプチドを利用することによって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】付着因子−エンテロトキソイドキメラをコードするプラスミドインサートのマップを示す図である。上から順番に、それぞれ、プラスミドインサートＢおよびＣの構築においてｄｓｃＣｆａＥ遺伝子を増幅したＴ７系クローン、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢ５キメラ発現のためのｐＢＡＤ系クローン、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＬＴＢ５キメラ発現のためのｐＢＡＤ系クローン、ＣｆａＥ付着因子ドメイン（ＣｆａＥａｄ）が付着因子成分を構成するキメラタンパク質の発現のための計画インサート、ＣｆａＥ付着因子ドメイン（ＣｆａＥａｄ）が付着因子成分を構成するキメラタンパク質の発現のための計画インサートを示す。
【図２Ａ】キメラ発現プラスミドのマップを示す図である。プラスミドｐ０８０９Ｃ３を構築し、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢ５キメラの生産に使用した。
【図２Ｂ】キメラ発現プラスミドのマップを示す図である。ｐ１１２１Ｃ１を構築し、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＬＴＢ５キメラの生産に使用した。それぞれが、ｐ１５Ａ複製起点と、クロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）と、付着因子−ＣＴＡ２融合体およびＢ−エンテロトキソイドをコードするタンデム遺伝子の上流のアラビノース誘導性プロモータ（ｐＢＡＤ）とを特徴とする。
【図３】ＣＦＡ／Ｉ ＥＴＥＣ誘導ＭＲＨＡの阻害を示す図である。
【図４】ＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラでの免疫処置後のＣｆａＥへのマウス血清ＩｇＧ応答を示す図である。
【図５】ＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラでの鼻腔内免疫処置後のＣｆａＥへのマウス血清ＩｇＧ応答を示す図である。
【図６】ＣａｆＥ、ＣａｆＥとＣＴＢの混合物またはＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢでの鼻腔内免疫処置後のＣｆａＥへのマウス血清ＩｇＡ応答を示す図である。
【図７】Ｔａｌｏｎクロマトグラフィー、その後のゲル濾過による、ＣｆａＥ−ＣＴＡ／ＣＴＢキメラの２段階精製を示す図である。
【図８】固定化ＧＭ１へのキメラの結合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
付着因子−毒素キメラの設計および構築
本発明は、構造的に安定な、従って免疫活性の付着因子ポリペプチドの投与により抗付着性免疫応答を誘導するための方法および生物学的組成物に関する。本発明の組成物において考えられる付着因子としては、クラス５線毛からのもの、およびＣＳ３からのもの（すなわち、ＣｓｔＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。付着因子（毒素原性大腸菌線毛および微細線維の遠位分子成分）は、宿主細胞への細菌付着のための有望なエフェクターである（文献６５）。従って、付着因子は、細菌の定着および病原性にとって重要である。
【００２８】
［文献６５］Ａｎａｎｔｈａ，Ｒａｖｉ Ｐ．，Ａ．Ｌ．ＭｃＶｅｉｇｈ，Ｌ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｇｎｅｗ，ＦＪ．Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｔ Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｓａｖａｒｉｎｏ．２００４．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎｆａｎｄ ｌｍｍ．７２：７１９０−７２０１．
【００２９】
多数の病原性細菌種、例えばＬＴまたはＣＴからのポリペプチド配列は、効力ある免疫修飾因子であることが明らかになった。さらに、ＣＴ Ｂ−サブユニット（ＣＴＢ）は、ＥＴＥＣに起因するジフテリアに対する有意な防御をもたらす（文献６６、文献６７）。従って、細菌毒素と付着要素の併用投与は、他のＥＴＥＣ部分を含有する製剤より下痢原性細菌に対して大きな防御免疫をもたらすことができる。本発明は、細菌付着因子に特異的に結合して、その細菌付着因子の活性を阻害することによって下痢原性細菌の定着を崩壊させる、ならびに易熱性腸毒素の活性を阻害することによっても、および細菌定着を防止し、その結果、インビボで、易熱性腸毒素と熱安定性腸毒素の両方の生産を減少させるといった二次的効果としても、易熱性腸毒素の下痢への寄与を減少させる組成物、および免疫の誘導（主として、免疫グロブリンによって媒介される）のための前記組成物の使用法を提供する。
【００３０】
［文献６６］Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｄ．Ａ．Ｓａｃｋ，Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｃｈａｒｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｐ．Ｋ．Ｎｅｏｇｙ，Ｂ．Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｎ．Ｈｕｄａ，Ｍ．Ｕ．Ｋｈａｎ，Ｂ．Ａ．Ｋａｙ，Ｍ．Ｒ．Ｋｈａｎ，Ｍ．Ａｎａｓａｒｕｚｚａｍａｎ，Ｍ．Ｙｕｎｕｓ，Ｍ．Ｒ．Ｒａｏ，Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，ａｎｄ Ｊ．Ｈｏｌｍｇｒｅｎ．１９８８．Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｃｈｏｌｅｒａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉａｒｒｈｅａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ」ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｆｉｅｌｄ ｔｒｉａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５８：３７２−３７７．
［文献６７］Ｐｅｌｔｏｌａ，Ｈ．， Ａ．Ｓｉｉｔｏｎｅｎ，Ｈ．Ｋｙｒｏｎｓｅｐｐａ，Ｉ．Ｓｉｍｕｌａ，Ｌ．Ｍａｔｔｉｌａ，Ｐ．Ｏｋｓａｎｅｎ，ＭＪ．Ｋａｔａｊａ，ａｎｄ Ｍ．Ｃａｄｏｚ．１９９１．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｖｅｌｌｅｒ’Ｓ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ｂｙ ｏｒａｌ Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔ／ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌ Ｉ ｃｈｏｌｅｒａ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｌａｎｃｅｔ ３３８：１２８５−１２８９．
【００３１】
付着因子ポリペプチドの構造安定性およびことによるとプロテアーゼ耐性は、最大免疫原性の確保に有用である。付着因子単量体の構造完全性は、隣接するサブユニットによって提供される供与β鎖によって付与される。クラス５線毛の場合、例えば、ＣＦＡ／Ｉ付着因子、ＣｆａＥ、の構造安定性は、ＣｆａＢからのドナーβ鎖によってもたらされる。ＣＳ３の場合、安定性は、隣接する単量体からのペプチドドナー鎖によってもたらされることもある。これに関しては、ＣｓｔＨドナー鎖が、隣接するＣｓｔＨ付着因子単量体に安定性をもたらす。
【００３２】
本発明の１つの態様は、細菌毒素サブユニット（例えば、ＬＴまたはＣＴからのもの）と近位にある構造安定性が付与された付着因子ポリペプチドを有するキメラ分子である。改善されたワクチン効能を随伴する、付着因子ポリペプチド免疫原の構造安定性を確保するために、本発明の１つの態様は、毒素タンパク質またはポリペプチドに動作可能に融合している隣接した付着因子ポリペプチド配列にドナーβ鎖を動作可能に提供するように設計されたポリペプチド構築物である。前記構築物の付着因子成分は、そのＣ末端先端でリンカーポリペプチドに連結されている付着因子ポリペプチドから成り、そのリンカーポリペプチドは、そのＣ末端でドナー鎖ポリペプチドにも連結されている。ドナー鎖は、ＣｆａＢなどの線毛構造大サブユニットのすべてまたは一部を含む多数の源によって提供され得る。それにまた、前記付着因子成分は、細菌毒素Ａサブユニット由来のポリペプチドに遺伝子的に融合している。本発明のキメラは、毒素Ａサブユニット成分を含有する発現されたキメラが、その後、毒素Ｂサブユニットとともに組み立てられてキメラ腸毒素様分子を形成するように、毒素Ｂサブユニットと共に発現させることもできる。
【００３３】
本発明の組成物は、任意の付着因子ポリペプチド、例えばＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤ、ＣｏｔＤおよびＣｓｔＨから構成される組成物を考えている。前記付着因子は、その付着因子のＣ末端でリンカーポリペプチドによってドナー鎖に融合している。前記ドナー鎖は、線毛大サブユニット、例えばＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡ、ＣｓｄＡ、ＣｏｔＡおよびＣｓｔＨ、をはじめとする任意の数の源に由来し得る。そうした構造安定化付着因子を本明細書では接頭語「ｄｓｃ」と付けて記載する。本発明の組成物は、図１に図示するように構造安定化付着因子が細菌毒素Ａサブユニットとも融合していることを、さらに考えている。本発明の組成物のさらなる延長は、本発明の組成物の安定な付着因子成分として天然付着因子構造のＮ末端ドメインのみの使用を考えている。そうした構造的に安定な付着因子ドメインを本明細書では接尾語「ａｄ」を付け、接頭語「ｄｓｃ」を付けずに記載する。
【００３４】
構造安定化付着因子の例としては、ｄｓｃＣｆａＥ（配列番号６）、ｄｓｃＣｓｂＤ（配列番号１２）、ｄｓｃＣｏｔＤ（配列番号１５）が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、それぞれ、ＣｆａＢ、ＣｏｔＢおよびＣｏｔＤからのドナー鎖を含有する。加えて、ＣｓｔＨのＮ末端領域（配列番号２８）にリーダー配列（配列番号２７）を融合させ、これを、リンカー（配列番号１）により、ＣｓｔＨからのドナー鎖（配列番号２９）に融合させることによってＣｓｔＨなどの非クラス５線毛付着因子を使用することができる。安定な、ｄｓｃＣｓｔＨ、配列を配列番号３０に示す。
【００３５】
それにまた、構造的に安定な付着因子は、完全長またはトランケートされたＡ２細菌毒素Ａサブユニットに融合している。本発明の組成物は、任意の数の細菌毒素Ａサブユニットを使用できることを考えている。Ａサブユニットの例としては、ＬＴＡ２（配列番号１８）およびＣＴＡ２（配列番号１９）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、本発明の組成物は、付着因子−毒素ＡサブユニットおよびＢサブユニットが自発的に分子相互作用し、毒素様分子へと組み立てられることができるように、図２に図示するように単一オペロン下で、または単一のプラスミド上もしくは別々だが適合性のプラスミド上で別々のプロモータから発現された遺伝子として、安定化付着因子−毒素Ａサブユニットキメラと毒素Ｂサブユニットを協調的におよび随伴的に発現できる能力を考えている。前記ＡおよびＢサブユニットは、同じ細菌種から形成される場合もあり、または異なる細菌種から形成される場合もある。毒素Ｂサブユニットの例としては、ＣＴＢ（配列番号２１）およびＬＴＢ（配列番号２３）が挙げられるが、これらに限定されない。前記Ｂサブユニットは、ＣＴＢおよびＬＴＢのためのそれぞれ配列番号２０および配列番号２２の場合のように、改善された発現のためにＬＴＩＩｂリーダー配列（配列番号２４）を含有することがある。さらに、ＣＴＡ２またはＬＴＡ２のいずれかのＮ末端五（５）アミノ酸を配列番号２５および２６のアミノ酸配列の代わりに用いることができる。表１は、それらの配列の要約である。
【００３６】
【表１】
【実施例】
【００３７】
実施例１：ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴおよびＬＴキメラの構築
本発明をさらに十分に例証するために、ＣｆａＥ、ＣＦＡ／Ｉの小サブユニット、を含有する抗ＥＴＥＣ組成物の例を説明する。図１（Ａ）を参照して、ＣｆａＥのコーディング配列の３’末端にヘアピンリンカーを遺伝子的に連結させることにより、構造的に安定なＣｆａＥを構築した。リンカーのアミノ酸配列は、配列番号１、２および３によって記載する。その後、ＣｆａＢからのアミノ酸ドナー鎖（配列番号４に記載する）をそのリンカーの３’末端で連結させ、最後に、ヘキサヒスチジンタグをそのＣｆａＢドナー鎖の３’末端で連結させた。その後、その構築物をｐＥＴ２４プラスミドに挿入し、大腸菌において発現させた。得られたポリペプチド（ｄｓｃＣｆａＥと呼ぶ）をニッケルまたはコバルト親和性およびカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。その組換えポリペプチドは、可溶性であり、安定していた。ゲル濾過に基づき、そのｄｓｃＣｆａＥポリペプチドは単量体として存在し、ＣＤスペクトル分析により、主としてβ鎖分子の存在と一致する結果を得た。
【００３８】
図１を参照して、コレラ毒素ＡサブユニットのＡ２フラグメントをｄｓｃＣｆａＥのカルボキシル末端（Ｃ末端）に遺伝子的に融合させた。しかし、ＣＴＡのＡ２フラグメントの代わりに、他の毒素のＡサブユニットからのＡ２フラグメント、例えばＬＴ−Ｉを使用できることに留意しなければならない。単量体ｄｓｃＣｆａＥの精製を助長するために、ヒスチジン（Ｈｉｓ−６）テールをｄｓｃＣｆａＥのＣ末端に付加させた（図１Ａ参照）。しかし、天然配列を最小限にしか修飾しないキメラの精製を助長するために、他の構築物では、ＬＴの毒素配列内の選択された部位でＨｉｓを置換した。しかし、ＣＴの五量体Ｂサブユニットは、自発的にニッケルまたはコバルトに結合するため、ＣＴＢ五量体単独、またはキメラ付着因子−ＣＴＡ２融合ポリペプチドとＣＴＢ五量体の両方を含有する抗原構築物、いずれかを、付着因子−ＣＴＡ２融合ポリペプチドおよびＣＴＢポリペプチドのいずれにもＨｉｓ−６タグを付加させる必要なく、ニッケルまたはコバルト親和性クロマトグラフィーによって直接精製することができる。それ故、ｄｓｃＣｆａＥにおけるＨｉｓ−６タグについてのコーディング領域は、図１Ｂに示す構築物には含まれなかった。五量体ＣＴＢとは異なり、ＬＴ−Ｉの五量体Ｂサブユニットは、ニッケルまたはびコバルトを含有する樹脂のいずれにも自発的に結合しない。しかし、成熟ＬＴ−１Ｂポリペプチドの配列へのＲ１３ＨおよびＮ９４Ｈ置換の導入により、五量体ＬＴ−１Ｂ（またはキメラ付着因子−ＣＴＡ２融合ポリペプチドとＬＴ−ＩＢ五量体の両方を含有する、対応する抗原構築物）（読者は図１Ｃに注目）をニッケルまたはコバルト含有樹脂に結合させ、ニッケルまたはコバルト親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。
【００３９】
さらに、付着因子ドメインは、２つのドメイン内ジスルフィド架橋によって安定化されているので、ＣｆａＥ残基１９９から２０４の後の停止コドンの配置により、当初の２ドメイン２ドメイン付着因子の線毛形成性ドメインが無い安定な１ドメイン付着因子を結果的に生産することとなる。停止コドンがこの場所に導入された付着因子単量体は、接尾語「ａｄ」を有する。例えば、ＣｆａＥａｄ（配列番号７）、ＣｓｂＤａｄ（配列番号１３）およびＣｏｔＤａｄ（配列番号１６）。従って、対応する安定な１ドメイン付着因子についてのコーディング配列を、安定な２ドメインｄｓｃ−付着因子変異体についてのコーディング配列の代わりに使用して、付着因子−ａｄ−ＣＴＡ２融合ポリペプチドが、上で説明したｄｓｃ−付着因子−ＣＴＡ２融合ポリペプチドに置き換わっている抗原構築体を生産することができる（図１Ｄおよび１Ｅ参照）。
【００４０】
図１を参照して、付着因子−ＣＴＡ２融合タンパク質および細菌毒素Ｂサブユニットについてのコーディング領域が、両方とも、発現プラスミドにおけるオペロンの中に存在するときには、付着因子−毒素Ａサブユニットキメラと毒素Ｂサブユニットが付随して生産される。これにより、発現されたＡおよびＢ毒素サブユニットポリペプチドの両方を大腸菌宿主細胞のペリプラズムに分泌させ、そのペリプラズムにおいて自発的に組み立てさせて所望のキメラ腸毒素様抗原を形成することができる。前記ＡおよびＢサブユニットは、同じ細菌種からのものである場合もあり、または異なる細菌種からのものである場合もある。さらなる例証として、図２Ａおよび２Ｂは、ＣＴおよびＬＴ−１からの五量体Ｂサブユニットをそれぞれ含有するキメラ構築物をコードするプラスミドのマップを示す。
【００４１】
図１は、コレラ毒素または大腸菌ＬＴのいずれかのＢサブユニットと協調的に発現されるｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２融合体を示す。ＬＴＩＩＢシグナル配列の付加は、組換え生成物の有望な発現を増進する。組換えＬＴＩＩｂが、組換えＣＴまたはＣＴＢに対してほぼ１００倍のレベルで生産されるからである。ＣＴ様キメラの構築を助長するために、付着因子遺伝子配列を有するフレームのすぐ下流またはそのフレーム内にＣＴＡ２についてのコーディング領域を追加することにより発現ベクターを修飾して、対象となるタンパク質が、ペリプラズムに分泌されるばかりでなく、そのＣ末端にＣＴのＡ２ポリペプチドも含有するようにした。
【００４２】
ｄｓｃＣｆａＥのコーディング配列を、コレラ毒素Ｂサブユニット遺伝子から上流の、Ｎ末端ＬＴＩＩｂ−Ｂシグナル配列およびＣ末端Ａ２融合体を有するＡ１置換抗原の発現のための２つのベクターに、インフレームでクローニングした。それらのｐＬＤＲ５およびｐＡＲＬＤＲ１９ベクターは、修飾コレラ毒素オペロンを、それぞれ、ｌａｃプロモータまたはアラビノース誘導性ｐＢＡＤプロモータ（ｐ０８０９Ｃ３）の制御下に置く。これらのクローンを発現に適する大腸菌株に形質転換させた。両方の構築物は、誘導条件下、豊富な培地中で増殖させたとき、そのペリプラズムにおいてキメラを生産した。
【００４３】
誘導後、細胞をポリミキシンＢで処理して、ペリプラズム内容物を放出させ、可溶性画分を金属親和性クロマトグラフィーによって精製した（文献６８）。遊離ＣＴＢ五量体を、ゲル濾過によって、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラから分離した。ＣＴＡ、ＣＴＢおよびＣｆａＥに特異的な抗体を使用する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法によるキメラの分析は、抗ＣＴＢ反応性バンド、および抗ＣＴＡ抗血清と抗ＣｆａＥ抗血清の両方と反応したｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２融合タンパク質バンドを示した。図８を参照して、ＧＭ１被覆プレートでの９６ウエルＥＬＩＳＡフォーマットおよび一次抗ＣｆａＥ抗体での検出を用いて、本発明者らは、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラが実際にＧＭ１に結合することを実証した。
【００４４】
［文献６８］Ｄｅｒｔｚｂａｕｇｈ，Ｍ．Ｔ．，ａｎｄ Ｌ．Ｍ．Ｃｏｘ．１９９８．Ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ｆｏｒ Ｎｉ２＋ ｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１１：５７７−５８１．
【００４５】
発現生成物のさらなる機能強化として、ＣＴＡ２のＮ末端は残基１９４において生じるので、ＣＴＡ２におけるシステイン−１９９残基のみをセリンに変えて、抗原−ＣＴＡ２融合タンパク質の抗原ドメイン内のシステイン−１９９と他のシステインとの一切の異所ジスルフィド結合形成を防止した。加えて、ｌａｃプロモータの代わりにアラビノース誘導性ｐＢＡＤプロモータの制御下、キメラの生産増進のために、ｐＡＲＬＤＲ１９などの他のベクターを作製した（文献６９、文献７０）。
【００４６】
［文献６９］Ｔｉｎｋｅｒ，Ｊ．Ｋ．，Ｊ．Ｌ．Ｅｒｂｅ，ａｎｄ Ｒ．Ｋ．Ｈｏｌｍｅｓ．２００５．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｏｆ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ＵＳＥ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：３６２７−３６３５．
［文献７０］Ｌｉ，Ｘ．，Ｊ．Ｌ．Ｅｒｂｅ，ＣＶ．Ｌｏｃｋａｔｅｌｌ，Ｄ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｇ．Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｒ．Ｋ．Ｈｏｌｍｅｓ，ａｎｄ Ｈ．Ｌ．Ｍｏｂｌｅｙ．２００４．Ｕｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭｒｐＨ ｆｉｍｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ａ２ ｄｏｍａｉｎ，ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ，ａｓ ａｎ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２：７３０６−７３１０．
【００４７】
実施例２：キメラ構築物の機能分析
構築物を機能的に試験した。図１Ａまたは図１Ｂにおける構築物を３μｍラテックスビーズに吸着させ、ヒトまたはウシ赤血球に添加し、結果としてＭＲＨＡを誘導した。この観察は、ＣｆａＥがＥＴＥＣにおける付着因子である明瞭な証拠をもたらす。
【００４８】
２．３Å分解能でのｄｓｃＣｆａＥの結晶構造解析は、ループによりその中間点付近で連結された２つの細長いドメインを明らかにした。βシート構造からのＮ末端およびＣ末端ドメインとＣｆａＢからのドナーβ鎖の両方が、Ｃ末端ドメインの疎水性の溝を塞ぎ、その結果、その分子を安定させる。付着因子ドメインは、２つのドメイン内ジスルフィド架橋によって安定化されている。ＣｆａＥ残基１９９の後の停止コドンの配置（図１Ｃ参照）により、安定なＣｆａＥ付着因子ドメイン（ＣｆａＥ−ａｄと呼ぶ）が生じるであろう。
【００４９】
ｄｓｃＣｆａＥの抗原性および免疫原性を動物モデルにおいて試験した。最初に、２匹のウサギに、１用量当たり２５０μｇの４用量（０、２８、５６および８４日）投薬計画で、フロイントアジュバントでの非経口的免疫処置を施した。最後の追加抗原刺激の２８日後に採取した血清は、ＣｆａＥ酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、それぞれのウサギにおいて高い抗ＣｆａＥ力価を示した。さらに、血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）アッセイにおいて、これらの抗血清は、ＣＦＡ／ＩならびにＣＳ４およびＣＳ１４線毛を発現するＥＴＥＣのＭＲＨＡを阻害した。
【００５０】
マウス実験を行って、ＣＦＡ／Ｉ線毛との比較でｄｓｃＣｆａＥの相対粘膜免疫原性を判定した。マウス６匹の群に、２５μｇの試験抗原を単独で、または１．５μｇの遺伝子的に解毒したＬＴＲ１９２粘膜アジュバントとの併用投与で、鼻腔内（ＩＮ）投与した。別のコホートのマウスには、２５０μｇの用量で、１０μｇのＬＴＩＲ １９２Ｇと共にまたは伴わずに、経口胃管により免疫処置を施した。すべての動物に２週間間隔での３用量スケジュールを施した。固体化抗原が、免疫処置に使用した抗原と同種であったとき、ＥＬＩＳＡによって強い力価が観察された。ＨＡＩアッセイによる抗付着因子抗体レベルの直接的（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）比較では、ｄｓｃＣｆａＥで免疫された群は、対応するＣＦＡ／Ｉで免疫された群より有意に高いＨＡＩ抗体力価を示した。考え合わせると、これらの動物研究は、ＣｆａＥが、非経口または粘膜（ＩＮ）免疫処置で血清抗体応答を誘導できることを示唆している。さらに、この抗原は、機能的抗付着因子抗体を惹起する点でＣＦＡ／Ｉより優れている。
【００５１】
他のマウス免疫処置研究は、キメラの抗原性、特に、抗付着因子抗体応答を誘導するその能力、を評価するために、およびＩＮ免疫処置でのｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラの免疫修飾特性を評価するために行った。この免疫処置研究では、３群のマウス（１群当たりｎ＝３）に、該当抗原の約５０μｇの初回抗原刺激用量および２５μｇの追加抗原刺激用量での、第０および２８日におけるｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラ、またはｄｓｃＣｆａＥ単独もしくはＣＴＢ単独の２用量投薬計画で、腹腔内的（ＩＰ）免疫処置を施した。免疫処置前、追加抗原刺激用量の１２日後（第４０日）に血清を採取し、標準濃度のＣＦＡ／Ｉ−ＥＴＥＣ（Ｈ１０４０７株）と抗血清の滅菌希釈物とをインキュベートし、その後、ヒト赤血球に添加し、ＨＡＩ活性を判定することによって、ＭＲＨＡのインビトロ阻害について試験した。いずれの免疫処置前の血清も、試験した最低希釈（１：２０）でＨＡＩ活性を示さず、ＣＴＢで免疫処置したマウスからの免疫処置後の血清も示さなかった。対照的に、ｄｓｃＣｆａＥで免疫処置した群およびｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢで免疫処置した群、両方からの血清は、図３に図示するように、同様の希釈でＭＲＨＡを阻害した。これらは、両方の群において第４０日にＥＬＩＳＡによって測定して、高い血清抗ＣｆａＥ ＩｇＧ力価に相当した。ＣｆａＥ群の幾何平均力価は、４２３，０００であり、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢ群の幾何平均力価は、２３３，０００であった。従って、ｄｓｃＣｆａ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラは、機能的抗体応答の誘導のためにその付着因子を有効に提示する。
【００５２】
図４を参照して、５群のマウス（１群当たりｎ＝１０）に、第０、１４および２８日に次の抗原でＩＮ免疫処置を施した：（１）ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２Ｂ（８μｇのＣｆａＥおよび１１μｇのＣＴＢを与えるように計算した２０μｇの総重量）；（２）混合したｄｓｃＣｆａＥ（８μｇ）＋ＣＴＢ（１３μｇ）；（３）ｄｓｃＣｆａＥ単独（２５μｇ）；（４）ＣＴＢ単独（１３μｇ）；およびＰＢＳ陰性対照。ＣｆａＥおよびＣＴＢに対する血清ＩｇＧ抗体力価を第０、１４、２８および４２日にＥＬＩＳＡによって判定した。ＣｆａＥキメラのＩＮ投与後に、マウス血清血球凝集反応阻害を試験した。図３の場合と同様、図４に図示するように、ＨＡＩ力価は、第４２日において、他の群のそれぞれより有意に高かった。加えて、図５を参照して、任意の形態でＣＴＢを受けたすべての群が、予想通り、第４２日において高い血清抗ＣＴＢ力価を示した。ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラ群は、第１４、２８および４２日において、ＣｆａＥ＋ＣＴＢ混合物またはｄｓｃＣｆａＥ群より有意に高い血清ＩｇＧ抗ＣｆａＥ応答を示した。
【００５３】
ＩｇＧに加えて、ＩｇＡ力価も、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢ５の投与後に試験した。抗ＣｆａＥ力価を第０および４２日にＥＬＩＳＡによって測定した。それを図６に図示する。ベースライン（第０日）でのＩｇＡ力価は、図５におけるすべての群について検出限界より下であった。結果は、図６に図示するように、キメラ群が他の群より有意に高いＩｇＡ力価を生じることを示している。
【００５４】
実施例３：ワクチン製剤における本発明のキメラの可能な使用
易熱性腸毒素の活性の防止も防御に寄与しうるが、付着因子が下痢原性大腸菌に対する免疫の誘導に最も重要な成分である可能性は高い。線毛付着因子は本質的には不安定であり、隣接するサブユニットへのそれらの非共有結合的連結が無ければ分解されるため、本発明は、構造安定性を付与することにより付着因子の免疫原性の素質を有意に改善する。加えて、構造安定性付着因子の免疫原的有効度は、効力ある免疫原性とアジュバント活性の両方を有する腸毒素成分をキメラとして付着因子構築物に備えさせることにより、有意に改善される可能性が高い。
本発明の構築物は、下痢原性大腸菌に対する免疫応答および／または抗毒素免疫を誘導するためのワクチン成分として有用であると予想される。免疫の誘導方法は、次の段階を含む：
【００５５】
ａ．毒素Ａサブユニットに由来する無損傷またはトランケートされたＡ２ポリペプチドに融合した構造的に安定な２ドメインまたは１ドメイン付着因子融合成分を含有するキメラポリペプチドを含む免疫原の投与による初回抗原刺激。前記免疫原は、その無損傷またはトランケートされたＡ２ポリペプチドと毒素Ｂサブユニットポリペプチドとの非共有結合性相互作用によって腸毒素様キメラに組み立てられたキメラポリペプチドも含むことができる。前記毒素ＡおよびＢサブユニットは、いずれの細菌毒素（例えば、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）または大腸菌易熱性腸毒素）に由来してもよい。免疫原の単位用量の範囲は、５０μｇから１ｍｇであり、それを、経皮的に（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、例えばドライパッチにより、皮膚を通して（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、筋肉内に、ミルクもしくは他の溶液で経口的に、経皮的にまたは経鼻的に、投与することができる。
【００５６】
ｂ．初回抗原刺激用量後、２から４の追加抗原刺激用量も、同様の経路により、５０μｇから１ｍｇの免疫原の単位用量で投与する。
【００５７】
代替ワクチンアプローチは、弱毒化生菌ベクターに挿入されたキメラポリペプチドを発現することができるＤＮＡ構築物の投与である。可能性のあるベクターの例としては、ビブリオコレラをはじめとするブリオ菌属のメンバー；大腸菌；カンピロバクター（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ）属のメンバー；サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属のメンバー；および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
実施例４：ＤｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢキメラのスケールアップ
妥当な量の付着因子／毒素キメラを生産するために、生産および精製計画の開発を開示する。好ましい生産および精製手順の一例を提示するが、安定な免疫原性付着因子／毒素キメラ生成物を最終的に生じさせることができる他の方法を利用してもよい。
【００５９】
この実施例では、ＬｏｎおよびＯｍｐＴプロテアーゼが欠失した大腸菌株ＢＬ２１を形質転換するために、アラビノース誘導性ベクター（ｐ０８０９Ｃ３）を選択し、使用した。３０ｇの細胞ペーストで出発し、マイクロフルイダイゼーションを用いて細胞を破壊した。可溶性画分をＴａｌｏｎ樹脂クロマトグラフィーおよびＦＰＬＣによるゲル濾過の二段階プロセスに付した。Ｔａｌｏｎ樹脂の負荷および洗浄後、５０ｍＭのイミダゾールでキメラ画分を溶離した。図７を参照して、ピークの下の溶離画分をプールし、濃縮し、ゲル濾過に付した。ゲル濾過溶離は、類似した高さのキメラ（初期ピーク）とＣＴＢ五量体（後期ピーク）に対応する２つのピークを有する、２こぶピークパターンを示した。プールしたキメラ画分を、抗ＣＴＢ、抗ＣＴＡおよび抗ＣｆａＥ抗血清を用いてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット法によって分析した。
【００６０】
生成物の機能的完全性を確認するために、図８に図示するように、生成物をガングリオシドＧＭ−１に結合するその能力について試験した。マイクロタイタープレートのウエル内に固定したＧＭ１を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。このアッセイでは、ｄｓｃＣｆａＥ−ＣＴＡ２／ＣＴＢをＧＭ１固定化プレートに暴露し、結合したキメラを抗ＣｆａＥ抗血清によって視覚化した。対照実験において、結合したＣｆａＥ抗原について抗ＣｆａＥ抗血清でプローブする前に、ＧＴＢまたはｄｓｃＣｆａＥをマイクロタイタープレート内に固定されたＧＭ１と相互作用させたとき、抗ＣｆａＥの反応性は観察されなかった。図８では、ＧＭ１が入っているウエルに添加した０．２５から２μｇ／ｍＬのキメラ濃度範囲にわたって用量応答を観察した。この手順に使用したキメラの収量は、およそ０．０５ｍｇ／（出発細胞ペーストのｇ）であった。
【００６１】
［付記１］
毒素Ａサブユニットポリペプチドに、直接、またはリンカーおよびドナー鎖ポリペプチド配列によって、動作可能に接続された大腸菌線毛付着因子ポリペプチドを含有する精製された融合タンパク質を含む免疫原性組成物。
［付記２］
前記付着因子ポリペプチドが、前記付着因子のＣ末端で動作可能に連結されている前記リンカーによって、前記毒素Ａサブユニットに連結されており、および前記リンカーが、そのＣ末端で前記毒素Ａサブユニットに動作可能に連結されている前記ドナー鎖にも、そのＣ末端で動作可能に連結されている、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記３］
前記融合タンパク質が、毒素Ｂサブユニットに非共有結合的に連結されている、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記４］
前記毒素Ａサブユニットが、コレラ毒素Ａ、コレラ毒素Ａ２サブユニット、大腸菌易熱性毒素Ａ、大腸菌易熱性毒素Ａ２から構成される群より選択される、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記５］
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、クラス５線毛またはＣＳ３線毛に由来する、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記６］
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、定着因子抗原Ｉ、ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１、ＰＣＦ０７１、ＣＳ１９、ＣＳ２およびＣＳ３から構成される群より選択される大腸菌線毛に由来する、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記７］
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドフラグメントが、付着因子ポリペプチドの単量体または重合体である、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記８］
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドフラグメントが、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤ、ＣｏｔＤおよびＣｓｔＨから構成される群より選択される、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記９］
前記リンカーが、配列番号１、配列番号２および配列番号３から構成される群より選択されるアミノ酸配列から構成される、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１０］
前記ドナー鎖が、配列番号５の配列で示されるアミノ酸配列を有する、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１１］
前記ドナー鎖が、ＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡ、ＣｓｄＡ、ＣｏｔＡおよびＣｓｔＨから構成される群より選択される大腸菌線毛大サブユニットまたは付着因子単量体からの８から２０アミノ酸配列である、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１２］
前記融合タンパク質が、前記リンカーのＣ末端および前記毒素のＮ末端先端に動作可能に連結されたヒスチニンタグを含有する、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１３］
前記構造安定性付着因子構築物が、配列番号６；配列番号７；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１６および配列番号３０から構成される群より選択される配列で示される配列のポリペプチドまたはフラグメントである、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１４］
前記毒素Ａサブユニットが、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４および配列番号３５から構成される群より選択される配列を有するポリペプチドから構成される、付記１に記載の免疫原性組成物。
［付記１５］
前記融合タンパク質または前記毒素Ｂサブユニットが、それらのＮ末端先端でシグナル配列に動作可能に接続されている、付記３に記載の免疫原性組成物。
［付記１６］
前記毒素Ｂサブユニットが、コレラ毒素Ｂまたは大腸菌易熱性毒素Ｂである、付記３に記載の免疫原性組成物。
［付記１７］
前記融合タンパク質および前記毒素Ｂサブユニットが、単一の発現ベクターから発現される、付記３に記載の免疫原性組成物。
［付記１８］
前記毒素Ｂサブユニットが、配列番号２０；配列番号２１および配列番号３３から構成される群より選択される配列で示されるポリペプチド配列から構成される、付記３に記載の免疫原性組成物。
［付記１９］
前記毒素ＡサブユニットのＮ末端が、配列番号２５および配列番号２６で示される配列を含有する、付記１４に記載の免疫原性組成物。
［付記２０］
前記シグナル配列が、配列番号２４のＬＴＩＩｂ毒素シグナル配列である、付記１５に記載の免疫原性組成物。
［付記２１］
ａ．付記１に記載の組成物の１つ以上の構築物を含む免疫原の初回抗原刺激用量を投与する段階と、
ｂ．免疫応答を惹起する、緩衝水溶液中の前記免疫原の５０μｇから１ｍｇの単位用量範囲での初回抗原刺激用量の少なくとも１週間後に、第一用量での追加抗原刺激用量を投与する段階と、
を含む、免疫応答を誘導する方法。
［付記２２］
前記融合タンパク質が、毒素Ｂサブユニットに非共有結合的に連結されている、付記２１に記載の方法。
［付記２３］
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤ、ＣｏｔＤおよびＣｓｔＨから構成される群より選択される、付記２１に記載の方法。
［付記２４］
前記付着因子のポリペプチドが、前記付着因子のＣ末端で動作可能に連結されている前記リンカーによって、前記毒素Ａサブユニットに連結されており、および前記リンカーが、そのＣ末端で前記毒素Ａサブユニットに動作可能に連結されている前記ドナー鎖にも、そのＣ末端で動作可能に連結されている、付記２１に記載の方法。
［付記２５］
前記大腸菌付着因子のポリペプチドが、付着因子ポリペプチドの単量体または重合体である、付記２１に記載の方法。
［付記２６］
前記構造安定性付着因子構築物が、配列番号６；配列番号７；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１６および配列番号３０から構成される群より選択される配列で示される配列のポリペプチドまたはフラグメントである、付記２１に記載の方法。
［付記２７］
前記毒素Ａサブユニットが、コレラ毒素Ａ、コレラ毒素Ａ２および大腸菌易熱性毒素Ａ、大腸菌易熱性毒素Ａ２から構成される群より選択される、付記２１に記載の方法。
［付記２８］
前記毒素Ａサブユニットが、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４および配列番号３５から構成される群より選択される配列を有するポリペプチドから構成される、付記２１に記載の方法。
［付記２９］
前記毒素ＡサブユニットのＮ末端が、配列番号２５および配列番号２６で示される配列を含有する、付記２８に記載の方法。
［付記３０］
前記免疫応答が、ヒト細胞への毒素原性大腸菌線毛付着を阻害する、付記２１に記載の方法。
［付記３１］
前記免疫応答が、ヒトにおける下痢を軽減または予防する、付記２１に記載の方法。
［付記３２］
前記組成物が、皮下的に、皮膚を通して、筋肉内に、経口的に、経皮的にまたは経鼻的に投与される、付記２１に記載の方法。
［付記３３］
前記免疫原が、ＤＮＡ発現系内にコードされ、弱毒化生菌ベクター内で発現される、付記２１に記載の方法。
［付記３４］
前記毒素Ｂサブユニットが、配列番号２０；配列番号２１および配列番号３３から構成される群より選択される配列で示されるポリペプチド配列から構成される、付記２２に記載の方法。
［付記３５］
前記組成物が、皮下的に、皮膚を通して、筋肉内に、経口的に、経皮的にまたは経鼻的に投与される、付記２２に記載の方法。
［付記３６］
前記免疫原が、ＤＮＡ発現系内にコードされ、弱毒化生菌ベクター内で発現される、付記２２に記載の方法。
［付記３７］
前記免疫応答が、ヒト細胞への毒素原性大腸菌線毛付着を阻害する、付記２２に記載の方法。
［付記３８］
前記免疫応答が、ヒトにおける下痢を軽減または予防する、付記２２に記載の方法。
［付記３９］
前記ドナー鎖が、ＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡ、ＣｓｄＡ、ＣｏｔＡおよびＣｓｔＨから構成される群より選択される大腸菌主構造線毛大サブユニットまたは付着因子単量体からの８から２０アミノ酸配列である、付記２４に記載の方法。
［付記４０］
前記経口投与が、溶液、または腸溶性顆粒カプセルによる、付記３２に記載の方法。
［付記４１］
前記経皮投与が、ドライパッチによる、付記３２に記載の方法。
［付記４２］
前記細菌ベクターが、大腸菌、赤痢菌属のメンバー、カンピロバクター属のメンバー、サルモネラ菌属のメンバー、およびビブリオ菌属のメンバーから構成される群より選択される、付記３３に記載の方法。
［付記４３］
前記経口投与が、溶液、または腸溶性顆粒カプセルによる、付記３５に記載の方法。
［付記４４］
前記細菌ベクターが、大腸菌、赤痢菌属のメンバー、カンピロバクター属のメンバー、サルモネラ菌属のメンバーおよびビブリオ菌属のメンバーから構成される群より選択される、付記３６に記載の方法。
［付記４５］
前記経皮投与が、ドライパッチによる、付記３５に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒素Ａサブユニットポリペプチドに、直接、またはリンカーおよびドナー鎖ポリペプチド配列によって、動作可能に接続された大腸菌線毛付着因子ポリペプチドを含有する精製された融合タンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項１】
毒素Ａサブユニットポリペプチドに、直接、またはリンカーおよびドナー鎖ポリペプチド配列によって、動作可能に接続された大腸菌線毛付着因子ポリペプチドを含有する精製された融合タンパク質を含む免疫原性組成物。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−２１１２０３（Ｐ２０１２−２１１２０３Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１７３４７９（Ｐ２０１２−１７３４７９）
【出願日】平成２４年８月３日（２０１２．８．３）
【分割の表示】特願２００８−５５０４００（Ｐ２００８−５５０４００）の分割
【原出願日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０７３８６１３９）アメリカ合衆国 (6)
【出願人】（５１１２６６６６７）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディ コーポレイト (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年８月３日（２０１２．８．３）
【分割の表示】特願２００８−５５０４００（Ｐ２００８−５５０４００）の分割
【原出願日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０７３８６１３９）アメリカ合衆国 (6)
【出願人】（５１１２６６６６７）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディ コーポレイト (1)
【Ｆターム（参考）】
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