水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法
【課題】実用上十分な水溶性を有するとともに薬理活性が維持された水難溶性薬理活性物質複合体を提供する。
【解決手段】水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体。
【解決手段】水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水難溶性薬理活性物質を含む水溶性の複合体、その製造方法、及び水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
優れた薬理活性を有していても水に難溶性であるために、医薬製剤化し難い物質が多く存在する。
例えば、チャビコール化合物の一つである１’-アセトキシチャビコールアセテート（ＡＣＡ）は中国南部や東南アジア地域で胃薬や鎮痛薬、ショウガの代替品として用いられているLanguas galangaや Alpinia galangaといったショウガ科の根茎から単離された、抗腫瘍性（非特許文献１）、抗炎症性（非特許文献２）、コラーゲン産生促進（特許文献１）など様々な効果を有する生理活性物質である。これまでの研究でＡＣＡはＦａｓ及びミトコンドリアを介した二つのアポトーシス誘導経路を活性化するだけでなく（非特許文献３）、核移行転写因子であるＮＦ-κＢ活性化の抑制効果を有することも報告されている（非特許文献４）。
ところが、ＡＣＡは難水溶性であり、通常、in vitroでの実験ではＤＭＳＯもしくはＥｔＯＨ溶液として使用される。in vivoでの実験で難水溶性化合物を用いる場合、ひまし油あるいはその誘導体を用いて使用されるが、これら溶剤による毒性等も考慮する必要が生じる。そのため薬剤として用いるにはその水溶化が課題であるが、これまでに薬理活性を維持したままＡＣＡの水への可溶化に成功した報告例はない。
【０００３】
また、クルクミンは、ウコンやターメリックに含まれるポリフェノールの一種であるクルクミノイド黄色色素成分であり、抗酸化作用、抗炎症作用を有することから、飲食品、健康食品等に利用されてきた。また、最近の研究では、クルクミンがアルツハイマ−病における神経系のダメ−ジの防御能（アミロイド形成阻害能）を有することが明らかになっている（非特許文献５）。さらに、クルクミンは、特異的にがん細胞のアポトーシスの誘導能などの生理活性があることが明らかとなり、抗腫瘍作用、抗ガン活性が注目されている（特許文献２、非特許文献６）。このように、クルクミンの生理活性と医学的有用性が盛んに研究されている。
しかし、クルクミンは難水溶性であるため、主に原料のウコン等から有機溶媒によって抽出される。しかし、この方法によって得られたクルクミンは有機溶媒の除去等が必要である上に、水に溶かすことができず、利用し難い。また、クルクミンは、水に溶けないため、そのまま摂取しても腸管ではあまり吸収されず、体外に排泄されてしまう。
【０００４】
また、コエンザイムＱ１０等のユビキノンはミトコンドリア内膜や原核生物の細胞膜に存在する電子伝達体の1つであり、電子伝達系において呼吸鎖複合体IとIIIの電子の仲介を果たしているベンゾキノンの誘導体である。ユビキノンは、比較的長いイソプレン側鎖を持つので、その疎水性のために膜中に保持されることとなる。ユビキノンの抗酸化作用がマウスの老人性難聴の予防に効果があることが知られている（非特許文献７）。このように、ユビキノンは、抗酸化作用を有することから、飲食品、健康食品等に利用されてきた。
しかし、コエンザイムＱ１０等のユビキノンは難水溶性であり、発酵法によって生産されている。しかし、この方法によって得られたコエンザイムＱ１０は水に溶かすことができず、利用し難いという問題がある。また、コエンザイムＱ１０は、水に溶けないため、そのまま摂取しても腸管ではあまり吸収されず、体外に排泄されてしまう。そこで、コエンザイムＱ１０を溶媒、及び、キャリアオイルを含むソフトゲルカプセルとし、血漿中のコエンザイムＱ１０の吸収水準、及び、生物学的利用能水準を上昇させる方法が記載されている（特許文献３）。しかしながら、上記記載の方法では油脂等を用いるため、これら油脂による毒性等も考慮する必要が生じる。
【０００５】
また、ビタミンＤ(vitaminＤ) は、ビタミンの一種であり、脂溶性ビタミンに分類される。ビタミンＤは、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール、Ergocalciferol）とビタミンＤ３（コレカルシフェロール、Cholecalciferol）に分けられる。ビタミンＤ２は植物に、ビタミンＤ３は動物に多く含まれ、ヒトではビタミンＤ３が重要な働きを果たしている。ビタミンＤは、活性型ビタミンＤ（カルシトリオールまたは、1,25-ジヒドロキシコレカルシフェロール）として、血中のカルシウム（Ｃａ２+）濃度を高める作用がある（非特許文献８）。また、ビタミンＤは免疫反応などへの関与も示唆されている（非特許文献９）。
しかし、ビタミンＤは難水溶性であり、利用し難いという問題がある。また、ビタミンＤ３は、水に溶けないため、そのまま摂取しても腸管ではあまり吸収されず、体外に排泄されてしまう。そこで、親油性の薬剤（ビタミンＤ）、非イオン性可溶化剤、親油性の酸化防止剤を含む組成物を水性溶媒中で可溶化する方法が記載されている（特許文献４）。しかしながら、上記記載の方法では、非イオン性可溶化剤や親油性の酸化防止剤を用いるため、ビタミンＤ本来の薬理活性を阻害してしまう恐れがある。
【０００６】
また、パクリタキセル（タキソール）は、抗癌剤の一種であり、太平洋イチイ (Taxus brevifolia) の樹皮から分離された物質である。微小管に結合して安定化させ脱重合を阻害することで、腫瘍細胞の分裂を阻害する（非特許文献１０）。
しかし、パクリタキセル（タキソール）は難水溶性であり、現在はエタノール溶液として、もしくはリポソーム化剤のような水溶化技術により抗癌剤として利用されており、投与方法に制限が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2009-079004号公報
【特許文献２】特開2009-195198号公報
【特許文献３】特開2007-297395号公報
【特許文献４】特表2006-502185号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Cancer Res. 2005, 65, 4417.
【非特許文献２】Bioorg. Med. Chem.Lett. 2003, 13, 3197.
【非特許文献３】Clin. Cancer Res. 2004, 10, 2120.
【非特許文献４】J. Immunol. 2005, 174, 7383.
【非特許文献５】J. Biol. Chem. 2005, 280, 5892.
【非特許文献６】Bioorg. Med. Chem.Lett. 2003, 13, 3197.
【非特許文献７】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009, 106, 19432.
【非特許文献８】Voet, Donald; Voet, Judith G. (2004). Biochemistry. Volume one. Biomolecules, mechanisms of enzyme action, and metabolism, 3rd edition, pp. 663-664. New York: John Wiley & Sons.
【非特許文献９】Am. J. Clin. Nutr. 2004, 80, 1717S.
【非特許文献１０】J. Natl. Med. Assoc. 1993, 85, 427.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、実用上十分な水溶性を有するとともに薬理活性が維持された水難溶性薬理活性物質複合体、及び水難溶性薬理活性物質の薬理活性を損なうことなく実用上十分な水溶性を水難溶性薬理活性物質に与えることができる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの中でも、特に主鎖のβ-１，３結合に対する側鎖のβ-１，６結合の比率(分岐度)が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体にすることにより、水難溶性薬理活性物質の水溶性を著しく向上させることができることを見出した。また、驚くべきことに、複合体になっているにもかかわらず、水難溶性薬理活性物質の薬理活性が維持されていることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されたものであり、以下の水難溶性薬理活性物質複合体、その製造方法、及び水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法を提供する。
【００１１】
項１． 水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体。
項２． 水難溶性薬理活性物質が分子量１００〜３,０００の物質である項１に記載の複合体。
項３． 水難溶性薬理活性物質が、下記一般式（１）
【化１】
（式中、２’-３’結合は単結合もしくは二重結合である。Ｒ1, Ｒ２, Ｒ３及びＲ４は、同一または異なって、水素、メトキシ基、又はＲＣＯＯ-基（Ｒは炭素数１〜４のアルキル基）を示す。）
で表される化合物である項１に記載の複合体。
項４． 水難溶性薬理活性物質が、クルクミンである項１に記載の複合体。
項５． 水難溶性薬理活性物質が、下記一般式（２）
【化２】
[式中、ｎは６〜１０の整数を示す。]
で表されるユビキノンである項１に記載の複合体。
項６． 水難溶性薬理活性物質が、ビタミンＤである項１に記載の複合体。
項７． 水難溶性薬理活性物質が、パクリタキセル（タキソール）である項１に記載の複合体。
項８． 水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法。
項９． 水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法。
項１０． 水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体の製造方法。
項１１． 水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を損なうことなく、この物質に水溶性を付与することができる。これにより、水難溶性薬理活性物質の製剤化、及び生体への吸収が可能となった。また、食品成分としても利用されるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを用いて水難溶性薬理活性物質を水可溶化しているため、本発明の複合体は安全性が高く、健康食品、機能性食品、化粧品、医薬などとして実用可能なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実験例で得たオーレオバシジウム・プルランス由来のグルカンの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図２】実験例で得たオーレオバシジウム・プルランス由来のグルカンの超音波照射したときの培養液の粒度分布を示す図である。
【図３】１Ｈ ＮＭＲより算出したβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン/ＡＣＡ複合体組成比を示す図である。
【図４】β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンおよびそのＡＣＡ複合体のＲＡＷ２６４.７細胞に対する細胞障害性を示す図である。グラフの縦軸は細胞生存率を示し、図中の濃度はＡＣＡ濃度を示す。
【図５】マクロファージ細胞におけるＬＰＳ刺激後のＩκBα分解に対するＡＣＡ複合体の抑制効果を示す図である。
【図６】ヒト由来線維芽細胞の顕微鏡観察図、及びI型コラーゲン染色像図である。
【図７】β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン（アクアβ）により水可溶化されたクルクミンの吸収スペクトルである。
【図８】β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン（アクアβ）により水可溶化されたコエンザイムＱ１０の吸収スペクトルである。
【図９】β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン（アクアβ）により水可溶化されたビタミンＤ３の吸収スペクトルである。
【図１０】β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン（アクアβ）により水可溶化されたパクリタキセル（タキソール）の吸収スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）複合体
本発明の複合体は、水難溶性薬理活性物質と、主鎖のβ-１，３結合に対する側鎖のβ-１，６結合の比率(分岐度)が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体である。
【００１５】
（１−１）水難溶性薬理活性物質
水難溶性薬理活性物質とは、水に対する溶解度が１０ｍｇ／ｍｌ以下の薬理活性物質を意味する。例えば、第１５改正日本薬局方、通則で規定されている常温（１５〜２５℃）における溶解性が「極めて溶けにくい」及び「ほとんど溶けない」に該当する薬物が、水難溶性薬理活性物質に該当する。
本発明において、水難溶性薬理活性物質の種類は特に限定されない。
代表的には、下記一般式（１）
【化３】
（式中、２’-３’結合は単結合もしくは二重結合である。Ｒ1, Ｒ２, Ｒ３及びＲ４は、同一または異なって、水素、メトキシ基、又はＲＣＯＯ-基（Ｒは炭素数１〜４のアルキル基）を示す。）
で表される化合物が挙げられる。
【００１６】
一般式（１）で示される化合物には、例えば、１’-アセトキシチャビコール アセテート（２’-３’: Ｃ=Ｃ, Ｒ1= Ｒ４= ＣＨ３ＣＯＯ-, Ｒ２ = Ｒ３ = Ｈ-、以下ＡＣＡと称する）、ジヒドロ-１’-アセトキシチャビコール アセテート（２’-３’: Ｃ-Ｃ, Ｒ１ = Ｒ４ = ＣＨ３ＣＯＯ-, Ｒ２ = Ｒ３ = Ｈ-）、１’-アセトキシオイゲノール アセテート（２’-３’: Ｃ=Ｃ, Ｒ１ = Ｒ４ = ＣＨ３ＣＯＯ-, Ｒ２ = ＣＨ３Ｏ-, Ｒ３ = Ｈ-）、１’,２-ジアセトキシチャビコール アセテート（２’-３’: Ｃ=Ｃ, Ｒ１ = Ｒ３ = Ｒ４ = ＣＨ３ＣＯＯ-, Ｒ２ = Ｈ-）などが含まれる。中でも、薬理活性が強く医薬として有用である点で、ＡＣＡが好適である。ＡＣＡの分子量は２３４である。
また、上記一般式（１）で示される化合物は光学異性体を包含し、例えばラセミ体、Ｒ体、Ｓ体を包含する。
【００１７】
また、クルクミンも好適な水難溶性薬理活性物質である。クルクミンの構造式を以下に示す。
【化４】
クルクミンは、いずれの生物由来のものでも使用できる。例えば、ターメリック（Curcuma longa L.）のほか、マンゴージシジャー、インド産アロールート、ガジュツ、黄色ガジュツ、黒色ガジュツ、ガランガール等の植物由来のものを例示できる。クルクミンの分子量は３６８．３８である。
【００１８】
また、ユビキノンも好適な水難溶性薬理活性物質である。ユビキノンの構造式を以下に示す。
【化５】
[式中、ｎは６〜１０の整数を示す。]
【００１９】
上記の一般式（２）で表されるユビキノンの分子量は５９９〜８６３である。上記の一般式（２）で表されるユビキノンの中でも、ｎ＝１０のもの（コエンザイムＱ１０）が好ましい。本発明で用いるコエンザイムＱ１０は、牛等の動物の心臓から抽出されるものでもよく、合成法、発酵法で得たものでもよい。また、市販品を購入することもできる。市販品としては、食品素材コエンザイムＱ１０（日清ファルマ（株）製、商品名）、カネカ・コエンザイムＱ１０（鐘淵化学（株）製、商品名）、ＣｏＥｎｚｙｍｅＱ１０（旭化成（株）製、商品名）、ＢｉｏＱ10（三菱ガス化学社製）、和光純薬工業社製コエンザイムＱ１０等が挙げられる。ユビキノンの純度は限定されないが、本発明の複合体は、医薬、サプリメント、飲料、食品、化粧料に適用されるものであるため、用途に応じて純度が高いものを用いることが望ましい。
【００２０】
また、ビタミンＤも好適な水難溶性薬理活性物質である。ビタミンＤとしては、エルゴカシフェロール（ビタミンＤ２）、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）が挙げられる。エルゴカシフェロールの分子量は３９６．６５であり、コレカルシフェロールの分子量は３８４．６４である。ビタミンＤの中でも、下記式（３）で表されるビタミンＤ３が好ましい。
【化６】
【００２１】
また、パクリタキセル（Paclitaxel）（タキソール）も好適な水難溶性薬理活性物質である。パクリタキセルの構造を下記式（４）に示す。パクリタキセルの分子量は８５３．９である。
【化７】
【００２２】
その他、水難溶性薬理活性物質として、脂溶性ビタミン及び補酵素、化学療法薬；抗真菌薬；経口避妊薬、ニコチン又はニコチン置換薬、ミネラル、鎮痛薬、制酸薬、筋弛緩薬、抗ヒスタミン薬、鬱血除去薬、麻酔薬、鎮咳薬、利尿薬、抗炎症薬、抗生物質、抗ウイルス薬、精神治療薬、抗糖尿病薬及び心臓血管薬、栄養補助食品及び栄養補助剤などを例示することができる。
脂溶性ビタミン及び補酵素は、特に限定されないが、ニコチン酸、ピリドキシン、コリン、パラアミノ安息香酸、ビタミンＡ及びカロテノイド、レチノイン酸、ビタミンＥ、ビタミンＫなどを例示できる。カロテノイドとしては、αカロテン、βカロテン、γカロテン、δカロテン、リコピンのようなカロテン類；ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アントラキサンチン、ビオラキサンチンのようなキサントフィル類が挙げられる。
また、上記例示した水難溶性薬理活性物質の中でも植物性のものが好ましく、例えば、ポリフェノール(ブドウ種子抽出ポリフェノールなど)、イソフラボン（ダイズイソフラボンなど）、レスベラトロール、エピゲニン、アロエベラ，エキナセア、カモミール、Ｈａｍｍａｍｅｌｉｓ抽出物、フィーバーヒューパルテノライドのような抗炎症性植物抽出物；中国のｚｉｚｉｐｕｓ ｊｕｊｕｂａのような抗乾癬薬；Ｈａｍｍａｍｅｌｉｓのような収斂剤；アルテミシア、カモミール、ゴールデンシールのような抗菌薬；エキナセアのような免疫調節薬；抗加齢薬；ドセタキセル、カンプトテシンのような抗癌薬；抗光障害薬；回春薬などを例示できる。
また、シロスタゾール、レバミピド、アリピプラゾール、シクロスポリン、ニフェジピン、セラミドなども挙げられる。
【００２３】
主鎖のβ-１，３結合に対する側鎖のβ-１，６結合の比率(分岐度)が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体にすることにより水溶化できるか否かには、水難溶性薬理活性物質の大きさも影響する場合がある。物質の大きさの一つの指標として分子量がある。本発明において、水難溶性薬理活性物質の分子量は、約１００〜３,０００が好ましく、約１５０〜２,０００がより好ましく、約２００〜１,０００がさらにより好ましい。
【００２４】
（１−２）β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン
本発明に用いるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンにおいて、主鎖のβ-１，３結合に対する側鎖のβ-１，６結合の比率である分岐度は、通常約５０〜１００％、好ましくは約７５〜１００％、より好ましくは約８５〜１００％であればよい。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが上記分岐度を有することは、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンをエキソ型のβ−１，３−グルカナーゼ（キタラーゼ Ｍ、ケイアイ化成製）で加水分解処理した場合に分解生成物としてグルコースとゲンチオビオースが遊離すること、及びＮＭＲの積算比から確認できる（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。
【００２５】
(a)オーレオバシジウム属微生物が生産するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン
上記の分岐度を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物から得ることができる。
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物由来のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
上記の分岐度を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下のものである。上記粘度の下限値は通常１０ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。
本発明において、粘度は、ＢＭ型回転粘度計を用いて測定した値である。
オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、菌体外に分泌されるため、キノコ類やパン酵母の細胞壁に含まれるβ-グルカンと比べて、回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて産生することができる。
【００２６】
中でも、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)が生産するものが好ましく、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５及びＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６として寄託済み）が産生するものが好ましい。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）Ｋ-１株の変異株である。オーレオバシジウム属Ｋ−１株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが知られている。
また、オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、Ｋ-１株の産生するβ−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株が生産するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生する菌種、菌株も存在する。
【００２７】
ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ−グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが見かけ上２〜３０万の低分子量のβ−グルカンの両方を産生する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。このβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製しようとすると、その５０重量％以上が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。
【００２８】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンより低いものが好ましい。この低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、通常２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、よりさらに好ましくは１０ｃＰ以下である。
この低粘度グルカンは、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと同様の一次構造を有し得る。具体的には、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
【００２９】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、金属イオン濃度が、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。原料β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが水溶液状態のものである場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。
金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形で使用する場合は、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
【００３０】
(b)オーレオバシジウム属微生物によるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの生産方法
分岐度５０〜１００％のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、例えば、これを産生する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生させる方法は種々報告されている。培養培地に使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源等を挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源等を挙げることができる。場合によってはβ−グルカンの産生量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類等を添加するのも有効な方法である。
【００３１】
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを生産するものなら特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件等が挙げられる。
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは１〜４日間程度であり、これによりβ−グルカンを産生することが可能である。なお、β−グルカンの産生量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを主成分とするβ−グルカン多糖が０．１％(ｗ/ｖ)〜数％(ｗ/ｖ)含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ([ｍＰａ・s])から数千ｃＰ（[ｍＰａ・s]）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを沈殿物として得ることができる。
【００３２】
＜低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造方法＞
上記の高粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加してもよい。例えば水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは０．５％(ｗ/ｖ)以上、より好ましくは１．２５％(ｗ/ｖ)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。また、不溶性物質除去前のβ−Ｄ−グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性物質除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β−Ｄ−グルカン濃度は、０.１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ程度、好ましくは０.５ｍｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌ程度、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍｌ〜５ｍｇ/ｍｌ程度が良い。
次いで、グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。即ち、中和はｐＨ７に合わせることを必ずしも要さない。
【００３３】
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては、１００ｃＰ以下、５０ｃＰ以下、又は１０ｃＰ以下である。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
アルカリ処理された低粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
得られるグルカン水溶液からグルカンより低分子量の可溶性夾雑物（例えば塩類など）を除去する場合は、例えば限外ろ過を行えばよい。
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
このようにして得られる水溶液に含まれるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを析出させることができる。この場合にｐＨをクエン酸などの有機酸によりｐＨを酸性、好ましくはｐＨ４未満、さらに好ましくはｐＨ３−３．７に調製して、エタノールを添加すると高純度のβ-１,３-１,６-グルカンの粉末を得ることができる。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを低粘度化することにより、限外ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
固形物として得る場合は、低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。
【００３４】
（１−３）水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの比率
複合体における水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの比率（水難溶性薬理活性物質：β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン）は、乾燥重量比で、１：０．０１〜１０００程度が好ましく、１：０．１〜１００程度がより好ましく、１：０．１〜５０程度がさらにより好ましく、１：０．１〜２０程度が特に好ましい。上記範囲であれば、十分な水溶性が得られる。
【００３５】
（２）複合体の製造方法
（２−１）高速振動粉砕法
上記説明した本発明の複合体の製造方法は、特に限定されない。
例えば、水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む方法により、製造することができる。
水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの混合比率（水難溶性薬理活性物質：β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン）は、乾燥重量比で、１：０．０１〜１０００程度が好ましく、１：０．１〜１００程度がより好ましく、１：０．１〜５０程度がさらにより好ましく、１：０．１〜２０程度が特に好ましい。
固体状態での撹拌は、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとが充分に粉砕、混合されればよく、従来から知られた各種の混合・粉砕装置を用いて行うことができる。例えば、遊星式や遠心回転式のボールミルによる粉砕・混合法；混合される材料を硬球と共に容器内に入れ、この容器を高速で振動させる高速振動粉砕装置による高速振動粉砕法などが挙げられる。
中でも、高速振動粉砕法が好ましく、その振動数は、例えば約１０〜１２０ｓ−１（約１０〜１２０Ｈｚ）とすることができる。
また、振動時間は、例えば約５〜６０分間とすることができる。また、振幅は、例えば、容器中空部の底面直径１２ｍｍ、容器中空部の長手方向長さ５０ｍｍである場合、通常約５〜１００ｍｍは、振動に付される容器が振動の中心点を基準にして最大に変位した場合において、中心点から最大変位点までの長さをいう。また、容器中空部の底面直径１２ｍｍ、容器中空部の長手方向長さ５０ｍｍである場合、硬球直径は約１〜１０ｍｍとすればよい。硬球材料としては、メノウ、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、タングステンカーバイド、クロム鋼、テフロン（登録商標）などが挙げられる。容器に供される硬球の数は、約１〜１００個とすることができる。
【００３６】
固体状態での撹拌は、室温下で行うことができる。
このようにして得られた水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの混合物に水を添加して撹拌する。水は、複合体の形成を阻害しない範囲で、緩衝剤や塩などを含んでいてよい。水の量は、上記混合物１重量部に対して約１０〜１０,０００重量部とすることができる。この工程での撹拌は、例えば、マグネティックスターラーを使用して行うことができる。この攪拌工程は、室温下に少なくとも２日間、例えば、４〜７日間行うことが好ましい。
これにより、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体が溶解した液体が得られる。必要に応じて、約５，０００〜２０，０００ｇで約５〜６０分間の遠心分離などにより、水不溶性の夾雑物を除去すればよい。
【００３７】
(2-2)極性溶媒中で混合、熟成する方法
上記説明した本発明の複合体は、水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む方法によっても製造することができる。
水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの使用比率（水難溶性薬理活性物質：β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン）は、乾燥重量比で、１：０．０１〜１０００程度が好ましく、１：０．１〜１００程度がより好ましく、１：０．１〜５０程度がさらにより好ましく、１：０．１〜２０程度が特に好ましい。
極性溶媒の使用量は、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン１重量部に対して約１０〜１０,０００重量部とすることができる。
極性溶媒は、水、酢酸、蟻酸、低級アルコールのようなプロトン性極性溶媒でもよく、ジメチルスルホキシド、アセトン、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、テトラヒドロフランのような非プロトン性極性溶媒でもよいが、特に、非プロトン性極性溶媒が好ましく、ジメチルスルホキシドがより好ましい。
【００３８】
水難溶性薬理活性物質及びβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを同時に極性溶媒と混合してもよく、一方を先に極性溶媒と混合しておき、次いでそこに他方を添加して混合してもよい。
混合は、例えば、マグネティックスターラーを使用して行うことができる。
次いで、この混合物１重量部に対して水を好ましくは約１０〜１０,０００重量部添加し、通常、室温下に１〜３日間静置することにより熟成させればよい。水は、複合体の形成を阻害しない範囲で、緩衝剤や塩などを含んでいてよい。
これにより、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体が溶解した液体が得られる。必要に応じて、約５,０００〜２０，０００ｇで約５〜６０分間の遠心分離などにより、水不溶性の夾雑物を除去すればよい。
上記説明した本発明の複合体の製造方法は、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法と捉えることもできる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実験例（精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造）
（１）低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの調製
（１-１）β−グルカンの培養産生
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０Ｌ／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ＯＤで、多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、硫黄含量から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
【００４０】
＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(ｖ/ｖ)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
【００４１】
＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β−グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ−グルカンを回収した。このβ−グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ−グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。
このβ−グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
【００４２】
【表１】
【００４３】
（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の粘度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（(ｍＰａ・ｓ)）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(ｗ/ｖ)となるように２５％(ｗ/ｗ)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ([ｍＰａ・s])であった。
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、ほぼ１００％の回収率であった。
【００４４】
（１−３）β−グルカン水溶液の脱塩
上記のβ−グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ−グルカン水溶液を得た。この時のβ−グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(ｗ/ｖ)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。
【００４５】
＜硫黄含有量の測定＞
また、得られたβ−グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。本β−グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０．１２％であった。
＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ−１，３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
この結果、本β−グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンであることが証明された（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分比から、β−１，３結合／β−１，６結合の比は１．１５であることが判明した。従って、主鎖のβ−１，３結合に対する側鎖のβ−１，６結合の分岐度は、約８７％である。
【００４６】
＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
０．３μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
また、二次粒子はマグネチックスターラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
【００４７】
＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンとβ−１，３−１，６−Ｄグルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。
【００４８】
（２）粉末化β-グルカンの調製
（１−２）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
次いで、得られた乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
一方、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
【００４９】
（３）高純度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末の製造
（１）においてアルカリ処理を行い低粘度化した培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機40D-4を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、ｐＨを３．０-３．５にクエン酸により調整して、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置Ｒ-３を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
なお、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを得た。また、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末の濃度０．５（ｗ／ｖ％）の水溶液の粘度は２００ｃＰ以下であった（ｐＨ５．０、３０℃）。上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンを下記の試験に供した。
【００５０】
実施例１〜４および比較例１
（１’-Acetoxychavicol acetateの高速振動粉砕法による水溶化）
１’-Acetoxychavicol acetate（ＡＣＡ）はタイショウガ由来の抗潰瘍、殺虫活性を有する疎水性化合物である。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとしてダイソー社製（アクアβ）、又は三井製糖社製シゾフィラン（ＳＰＧ）を、「H. Azuma, K. Miyasaka, T. Yokotani, T. Tachibana, A. Kojima-Yuasa, I. Matsui-Yuasa, K. Ogino, Bioorg. Med. Chem., 14, 1811 (2006)」に記載の方法により合成したＡＣＡ（ラセミ体）と、以下の表２に示す所定量で混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ粉砕ボールと共に封入し、レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ２００）にて２５Ｈｚで６０分間高速振動粉砕した。
【００５１】
【表２】
次いで、粉砕物１重量部に対して水１０,０００重量部を添加し、マグネティックスターラーを使用して２日間室温下にて撹拌した。さらに懸濁液を１時間ボルテックスミキサーで攪拌後、遠心分離（２５℃，１０,０００g，１０ｍｉｎ）した上清を０.２２μmメンブレンフィルターでろ過した。
ろ液の一部を凍結乾燥させ、残渣についてＤ２Ｏ中で１Ｈ ＮＭＲを測定し、グルコースのプロトン（ＣＨ Ｘ ４,ＣＨ２ Ｘ １ 計６Ｈ ）とＡＣＡのアセチル基(３Ｈ Ｘ ２)またはベンゼン環(２Ｈ Ｘ ２)のプロトンの積分値を計算することによって、複合体における、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン／ＡＣＡの組成比（グルコース／ＡＣＡ比）を計算した。組成比を以下の表３に示す。
【表３】
【００５２】
供給するグルコース／ＡＣＡの比率に対する、複合体中のグルコース／ＡＣＡの比率を図３に示す。高速振動粉砕に用いるアクアβのグルコース１ユニット当たりのＡＣＡ使用量を増やしていくと、１Ｈ ＮＭＲより算出したグルコース/ＡＣＡモル比は低下していき、三重螺旋構造を形成するアクアβの内部疎水空孔により密にＡＣＡが取り込まれていくことが明らかとなった。
また、ＡＣＡ使用量をグルコース１ユニット当たり０.３３当量以上にしても複合体組成比はほぼ一定であり、算出されたグルコース/ＡＣＡ=６がアクアβを用いた際の最満充填状態と推定される。なお、グルコース６個は三重螺旋繰り返し単位１ユニット分に相当する。
一方、仕込み比グルコース/ＡＣＡ=５で調製したとき、複合体組成比（グルコース/ＡＣＡ）はシゾフィランでは１０、アクアβでは１２の値となった。つまり、ＡＣＡ一分子当たりが占有する三重螺旋繰り返し単位はシゾフィランでは２.５、アクアβでは２となり、同条件においてはシゾフィランよりもアクアβの方がより効率的に複合化することが分かった。
【００５３】
実施例５（アクアβ/ＡＣＡ複合体の細胞毒性評価）
９６穴プレートに５×１０３cellsずつになるようにＲＡＷ２６４.７細胞（マウスマクロファージ細胞）の細胞懸濁液を播き、ＲＰＭＩ培地（牛胎児血清を１０ｗ/ｖ％含む）を用い３７度、５ｖ/ｖ％ＣＯ２下で２４時間培養した。アスピレーターで培地をとり除き、グルコース/ＡＣＡ＝１２であるアクアβ/ＡＣＡ複合体のＡＣＡ濃度を所定濃度に調整した培地を１００μLずつ加え、２２時間培養し、ＷＳＴ試薬（（株）同仁化学研究所製、Cell-counting Kit-8）（M. Ishiyama, Y. Miyazono, K. Sasamoto, Y. Ohkura, K. Ueno, Talanta, 44, 1299 (1997)参照）を１０μL加えて更に２時間培養し呈色反応を行った。
プレートリーダー（ThermoLab Systems社製、MultiSkan Acent BIF）を用い、４５０ｎｍ（リファレンス６５０ｎｍ）の吸光度を測定し、細胞生存率を算出した（M. Ishiyama, Y. Miyazono, K. Sasamoto, Y. Ohkura, K. Ueno, Talanta, 44, 1299 (1997)）。
結果を図４に示す。図４の縦軸は細胞生存率を示し、図中の各濃度はＡＣＡの濃度を示す。
ＡＣＡはアポトーシス活性を有することが既に知られている（K. Ito, T. Nakazato, A. Murakami, H. Ohigashi, Y. Ikeda, M. Kizaki, Biochem. Biophys. Res. Commun., 338, 1702 (2005)）。ＲＡＷ２６４.7細胞に対しても１０μＭ で細胞生存率２０％と著しい細胞障害性を示した。一方、アクアβ又はシゾフィランとの複合体は２０μＭでも有意な細胞毒性を示さず、β-1,3-グルカンと複合化することでＡＣＡの細胞障害性を抑制できることが明らかとなった。
【００５４】
実施例６（アクアβ/ＡＣＡ複合体のＮＦ-κＢ抑制効果の確認 ）
実施例１で調製したアクアβ/ＡＣＡ複合体のサンプル（グルコース/ＡＣＡ=１に）を用いて、ＡＣＡの活性であるＮＦ-κB抑制効果の評価をウエスタンブロッティングにより行った。
３５ｍｍ Ｄｉｓｈに５×１０５cellsになるようにＲＡＷ２６４.７細胞懸濁液を１ｍｌ捲き、２４時間培養後、最終ＡＣＡ濃度が０, １, ５μMになるように各サンプルを加え、３０分培養した。さらにＬＰＳ(１０ｍｇ/ｍｌ)を１０μL加え１５分培養後、細胞を回収した。ＬＰＳは使用前に５分間超音波処理した。
５％の２-メルカプトエタノール溶液を加え、９５℃で５分間熱処理を行い、１２％のゲルにてＳＤＳ-ＰＡＧＥ（２０ｍＡ）、転写（７０ｍＡ、９０分）、ブロッキング、抗体（IκBα抗体）反応を行った。
結果を図５に示す。ＮＦ-κＢ は各種炎症性サイトカインの転写因子である。種々の炎症性シグナルが細胞に伝達された際、細胞質でＮＦ-κＢ の抑制因子であるＩκBαがリン酸化そして分解することでＮＦ-κＢ は活性化され核内移行し転写因子として機能する。つまり、炎症性物質であるＬＰＳでマクロファージ細胞を刺激すると、ＩκBαが分解され、ＮＦ-κＢ は活性化される（図５、左から２番目レーン）。マクロファージ細胞は刺激がない場合にはＮＦ-κＢ を抑制するためにIκBαが存在し、検出される（図５コントロールｃレーン）。既に、ＡＣＡはIκBα活性化を抑制することが知られているが（H. Matsuda, T. Morikawa, H. Managi, M. Yoshikawa, Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 3197 (2003)）、今回５μM のACAでIκBαの分解を抑制することが確認できた（図５、左から３番目レーン）。
しかし、ＡＣＡ を免疫抑制剤として使用する場合先に述べたように、細胞障害性が問題となる。一方、アクアβ/ＡＣＡでも濃度依存的にIκBαの分解つまりＮＦ-κＢの活性化を抑制していることが分かった（図５、左から４，５番目レーン）。アクアβ/ＡＣＡ は細胞毒性も問題とならないことから、有用な免疫抑制剤として機能することが期待される。
【００５５】
実施例７（コラーゲン産生促進作用の評価 ）
実施例１で調製したアクアβ/ＡＣＡ複合体の（グルコース/ＡＣＡ=６）を用いて特開2009-079004号公報に開示された方法によりヒト線維芽細胞におけるコラーゲン産生亢進能評価を行った。
具体的には、ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（ＣＣＤ-１０５９ＳＫ、大日本製薬（株））を１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を含むＥＭＥＭ培地で３〜６回継代培養した。次いで、細胞数が１ x １０６cells になるようにカルチャースライド（Falcon社製）に調製し、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地で２４時間培養して、細胞をスライドに固定させ、さらに、細胞周期を同調するためにＥＭＥＭ培地のみ出に４時間培養した。次いで、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地に交換し、最終ＡＣＡ濃度が０, ０.１, １．０μＭになるように各サンプルを加え、２４時間培養した。コントロール実験として、ＡＣＡ（ラセミ体）を用い、アクアβ/ＡＣＡ複合体と活性を比較した。
カルチャースライドをＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、４％ホルマリン溶液を添加し４度で一晩静置し固定化した。０.１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘを含むＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、３％Ｈ２Ｏ２溶液で５分間、内在性ペルオキシダーゼのブロッキングを行った。次いで、１０％標準ヤギ血清を用いて５分間非特異的反応のブロッキングを行った。そして、抗ラットI型コラーゲン抗体（Anti-rat type I collagen抗体（LSL社製）２００倍希釈液）を用いて一次抗体の反応を６０分間行った。ＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、ビオチン標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（Biotinylated Goat anti-rabbit immunogloblins抗体（DAKO社製）４００倍希釈液）を用いて二次抗体反応を３０分間行った。ＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、酵素溶液（Horseradish peroxidase-labelled streptavidin-biotin complex（ＤＡＫＯ社製）４００倍希釈液）による反応を３０分間行った。ＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、ＤＡＢ (３,３-diaminobenzidine tetrahydrochloride)溶液を５分間反応させ、ペルオキシダーゼ発色反応を行った。ＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、水溶性封入剤で封入し、標本を作製した。
得られた各サンプルの顕微鏡図および染色図を図６に示す。アクアβ/ＡＣＡ複合体（グルコース/ＡＣＡ=６）は低濃度（０．１μＭ）、及び高濃度（１．０μＭ）のいずれにおいてもＡＣＡ単独時よりもより高いコラーゲン産生亢進能を有していることが明らかとなり、皮膚のコラーゲン量を増加させる化粧品や医薬品として期待される。
【００５６】
実施例８（クルクミンの高速振動粉砕法による水溶化）
クルクミンは抗酸化作用、抗炎症作用そして抗腫瘍作用を有する疎水性化合物である。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとしてダイソー社製（アクアβ）１０ｍｇと、和光純薬工業社製クルクミン ０.７５ｍｇとを混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ粉砕ボールと共に封入し、レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ２００）にて２５Ｈｚ、６０分間高速振動粉砕した。次いで、粉砕物１重量部に対して水１０，０００重量部を添加しマグネティックスターラーを使用して２日間室温下にて撹拌した。さらに懸濁液を１時間ボルテックスミキサーで攪拌後、遠心分離（２５℃，１０,０００g，１０ｍｉｎ）して上清を得た。
上清の吸収スペクトルを測定した(図７（Ｂ）)。また、クルクミンの２１．７μM エタノール溶液の吸収スペクトルを測定し（図７（Ａ））、極大吸収波長４２０ ｎｍにおけるモル吸光係数 ε= ５.５６ x １０４ を用い、クルクミン/アクアβ複合体水溶液中のクルクミン濃度を算出した。その結果、[クルクミン] = ２０μＭ（水溶化率９．８％）の水溶液を調製できた。この水溶化率はモル吸光係数より求めた値である。
【００５７】
実施例９（コエンザイムＱ１０の高速振動粉砕法による水溶化）
コエンザイムＱ１０は抗酸化作用を有する難水溶性化合物である。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとしてダイソー社製（アクアβ）１４．１ｍｇを用い、和光純薬工業社製コエンザイムＱ１０ ３．６７ｍｇを混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ粉砕ボールと共に封入し、レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ２００）にて２５Ｈｚ，２０分間高速振動粉砕を行った。その後、粉砕物１重量部に対して超純水１０，０００重量部を添加した。さらに懸濁液を１時間ボルテックスミキサーで攪拌後、遠心分離（２５℃，１０，０００ｇ，１０ｍｉｎ）した上清を得た。
上清の吸収スペクトル、及びアクアβ非存在下で同様の処理を行った水溶液の吸収スペクトルをそれぞれ測定した（図８）。極大吸収波長２７５ｎｍにおけるモル吸光係数 ε= １．３３ x １０４ を用い、コエンザイムＱ１０/アクアβ複合体水溶液中のコエンザイムＱ１０濃度を算出した。その結果、[コエンザイムＱ１０] = １１９μＭ（水溶化率２８％）の水溶液を調製することに成功した。この水溶化率はモル吸光係数より求めた値である。
【００５８】
実施例１０（ビタミンＤ３の高速振動粉砕法による水溶化）
ビタミンＤ３（ＶＤ３）は種々の生理活性を有する難水溶性化合物である。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとしてダイソー社製（アクアβ）１３．９ｍｇを用い、和光純薬工業社製ビタミンＤ３ ３．６２ｍｇを混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ粉砕ボールと共に封入し、レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ２００）にて２５Ｈｚ，２０分間高速振動粉砕を行った。その後、粉砕物１重量部に対して超純水１０，０００重量部を添加した。さらに懸濁液を１時間ボルテックスミキサーで攪拌後、遠心分離（２５℃，１０，０００ｇ，１０ｍｉｎ）した上清を得た。
上清の吸収スペクトル、及びアクアβ非存在下で同様の処理を行った水溶液の吸収スペクトルをそれぞれ測定した（図９）。極大吸収波長２７１ ｎｍにおけるモル吸光係数 ε= １．５０ x １０３ を用い、ビタミンＤ３/アクアβ複合体水溶液中のビタミンＤ３濃度を算出した。その結果、[ビタミンＤ３] = １４９μＭ（水溶化率１６％）の水溶液を調製することに成功した。この水溶化率はモル吸光係数より求めた値である。
【００５９】
実施例１１ パクリタキセル（タキソール）の高速振動粉砕法による水溶化
パクリタキセル（タキソール）は抗腫瘍活性を有する難水溶性化合物である。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとしてダイソー社製（アクアβ）１５．０ｍｇを用い、和光純薬工業社製パクリタキセル（タキソール）３．８４ｍｇを混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ粉砕ボールと共に封入し、レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ２００）にて２５Ｈｚ、２０分間高速振動粉砕を行った。粉砕物１重量部に対して超純水１０，０００重量部を添加した。さらに懸濁液を１時間ボルテックスミキサーで攪拌後、遠心分離（２５℃、１０，０００ｇ、１０ｍｉｎ）した上清を得た。
上清の吸収スペクトル、及びアクアβ非存在下で同様の処理を行った水溶液の吸収スペクトルをそれぞれ測定した（図１０）。極大吸収波長２３０ｎｍにおけるモル吸光係数 ε= ２．９６ x １０４ を用い、パクリタキセル（タキソール）/アクアβ複合体水溶液中のパクリタキセル（タキソール）濃度を算出した。その結果、パクリタキセル（タキソール）=１８６μＭ（水溶化率４１％）の水溶液を調製することに成功した。この水溶化率はモル吸光係数より求めた値である。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の複合体は、難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性が付与されているため、健康食品、機能性食品、医薬、化粧品などとして実用可能なものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水難溶性薬理活性物質を含む水溶性の複合体、その製造方法、及び水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
優れた薬理活性を有していても水に難溶性であるために、医薬製剤化し難い物質が多く存在する。
例えば、チャビコール化合物の一つである１’-アセトキシチャビコールアセテート（ＡＣＡ）は中国南部や東南アジア地域で胃薬や鎮痛薬、ショウガの代替品として用いられているLanguas galangaや Alpinia galangaといったショウガ科の根茎から単離された、抗腫瘍性（非特許文献１）、抗炎症性（非特許文献２）、コラーゲン産生促進（特許文献１）など様々な効果を有する生理活性物質である。これまでの研究でＡＣＡはＦａｓ及びミトコンドリアを介した二つのアポトーシス誘導経路を活性化するだけでなく（非特許文献３）、核移行転写因子であるＮＦ-κＢ活性化の抑制効果を有することも報告されている（非特許文献４）。
ところが、ＡＣＡは難水溶性であり、通常、in vitroでの実験ではＤＭＳＯもしくはＥｔＯＨ溶液として使用される。in vivoでの実験で難水溶性化合物を用いる場合、ひまし油あるいはその誘導体を用いて使用されるが、これら溶剤による毒性等も考慮する必要が生じる。そのため薬剤として用いるにはその水溶化が課題であるが、これまでに薬理活性を維持したままＡＣＡの水への可溶化に成功した報告例はない。
【０００３】
また、クルクミンは、ウコンやターメリックに含まれるポリフェノールの一種であるクルクミノイド黄色色素成分であり、抗酸化作用、抗炎症作用を有することから、飲食品、健康食品等に利用されてきた。また、最近の研究では、クルクミンがアルツハイマ−病における神経系のダメ−ジの防御能（アミロイド形成阻害能）を有することが明らかになっている（非特許文献５）。さらに、クルクミンは、特異的にがん細胞のアポトーシスの誘導能などの生理活性があることが明らかとなり、抗腫瘍作用、抗ガン活性が注目されている（特許文献２、非特許文献６）。このように、クルクミンの生理活性と医学的有用性が盛んに研究されている。
しかし、クルクミンは難水溶性であるため、主に原料のウコン等から有機溶媒によって抽出される。しかし、この方法によって得られたクルクミンは有機溶媒の除去等が必要である上に、水に溶かすことができず、利用し難い。また、クルクミンは、水に溶けないため、そのまま摂取しても腸管ではあまり吸収されず、体外に排泄されてしまう。
【０００４】
また、コエンザイムＱ１０等のユビキノンはミトコンドリア内膜や原核生物の細胞膜に存在する電子伝達体の1つであり、電子伝達系において呼吸鎖複合体IとIIIの電子の仲介を果たしているベンゾキノンの誘導体である。ユビキノンは、比較的長いイソプレン側鎖を持つので、その疎水性のために膜中に保持されることとなる。ユビキノンの抗酸化作用がマウスの老人性難聴の予防に効果があることが知られている（非特許文献７）。このように、ユビキノンは、抗酸化作用を有することから、飲食品、健康食品等に利用されてきた。
しかし、コエンザイムＱ１０等のユビキノンは難水溶性であり、発酵法によって生産されている。しかし、この方法によって得られたコエンザイムＱ１０は水に溶かすことができず、利用し難いという問題がある。また、コエンザイムＱ１０は、水に溶けないため、そのまま摂取しても腸管ではあまり吸収されず、体外に排泄されてしまう。そこで、コエンザイムＱ１０を溶媒、及び、キャリアオイルを含むソフトゲルカプセルとし、血漿中のコエンザイムＱ１０の吸収水準、及び、生物学的利用能水準を上昇させる方法が記載されている（特許文献３）。しかしながら、上記記載の方法では油脂等を用いるため、これら油脂による毒性等も考慮する必要が生じる。
【０００５】
また、ビタミンＤ(vitaminＤ) は、ビタミンの一種であり、脂溶性ビタミンに分類される。ビタミンＤは、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール、Ergocalciferol）とビタミンＤ３（コレカルシフェロール、Cholecalciferol）に分けられる。ビタミンＤ２は植物に、ビタミンＤ３は動物に多く含まれ、ヒトではビタミンＤ３が重要な働きを果たしている。ビタミンＤは、活性型ビタミンＤ（カルシトリオールまたは、1,25-ジヒドロキシコレカルシフェロール）として、血中のカルシウム（Ｃａ２+）濃度を高める作用がある（非特許文献８）。また、ビタミンＤは免疫反応などへの関与も示唆されている（非特許文献９）。
しかし、ビタミンＤは難水溶性であり、利用し難いという問題がある。また、ビタミンＤ３は、水に溶けないため、そのまま摂取しても腸管ではあまり吸収されず、体外に排泄されてしまう。そこで、親油性の薬剤（ビタミンＤ）、非イオン性可溶化剤、親油性の酸化防止剤を含む組成物を水性溶媒中で可溶化する方法が記載されている（特許文献４）。しかしながら、上記記載の方法では、非イオン性可溶化剤や親油性の酸化防止剤を用いるため、ビタミンＤ本来の薬理活性を阻害してしまう恐れがある。
【０００６】
また、パクリタキセル（タキソール）は、抗癌剤の一種であり、太平洋イチイ (Taxus brevifolia) の樹皮から分離された物質である。微小管に結合して安定化させ脱重合を阻害することで、腫瘍細胞の分裂を阻害する（非特許文献１０）。
しかし、パクリタキセル（タキソール）は難水溶性であり、現在はエタノール溶液として、もしくはリポソーム化剤のような水溶化技術により抗癌剤として利用されており、投与方法に制限が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2009-079004号公報
【特許文献２】特開2009-195198号公報
【特許文献３】特開2007-297395号公報
【特許文献４】特表2006-502185号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Cancer Res. 2005, 65, 4417.
【非特許文献２】Bioorg. Med. Chem.Lett. 2003, 13, 3197.
【非特許文献３】Clin. Cancer Res. 2004, 10, 2120.
【非特許文献４】J. Immunol. 2005, 174, 7383.
【非特許文献５】J. Biol. Chem. 2005, 280, 5892.
【非特許文献６】Bioorg. Med. Chem.Lett. 2003, 13, 3197.
【非特許文献７】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009, 106, 19432.
【非特許文献８】Voet, Donald; Voet, Judith G. (2004). Biochemistry. Volume one. Biomolecules, mechanisms of enzyme action, and metabolism, 3rd edition, pp. 663-664. New York: John Wiley & Sons.
【非特許文献９】Am. J. Clin. Nutr. 2004, 80, 1717S.
【非特許文献１０】J. Natl. Med. Assoc. 1993, 85, 427.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、実用上十分な水溶性を有するとともに薬理活性が維持された水難溶性薬理活性物質複合体、及び水難溶性薬理活性物質の薬理活性を損なうことなく実用上十分な水溶性を水難溶性薬理活性物質に与えることができる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの中でも、特に主鎖のβ-１，３結合に対する側鎖のβ-１，６結合の比率(分岐度)が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体にすることにより、水難溶性薬理活性物質の水溶性を著しく向上させることができることを見出した。また、驚くべきことに、複合体になっているにもかかわらず、水難溶性薬理活性物質の薬理活性が維持されていることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されたものであり、以下の水難溶性薬理活性物質複合体、その製造方法、及び水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法を提供する。
【００１１】
項１． 水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体。
項２． 水難溶性薬理活性物質が分子量１００〜３,０００の物質である項１に記載の複合体。
項３． 水難溶性薬理活性物質が、下記一般式（１）
【化１】
（式中、２’-３’結合は単結合もしくは二重結合である。Ｒ1, Ｒ２, Ｒ３及びＲ４は、同一または異なって、水素、メトキシ基、又はＲＣＯＯ-基（Ｒは炭素数１〜４のアルキル基）を示す。）
で表される化合物である項１に記載の複合体。
項４． 水難溶性薬理活性物質が、クルクミンである項１に記載の複合体。
項５． 水難溶性薬理活性物質が、下記一般式（２）
【化２】
[式中、ｎは６〜１０の整数を示す。]
で表されるユビキノンである項１に記載の複合体。
項６． 水難溶性薬理活性物質が、ビタミンＤである項１に記載の複合体。
項７． 水難溶性薬理活性物質が、パクリタキセル（タキソール）である項１に記載の複合体。
項８． 水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法。
項９． 水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法。
項１０． 水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体の製造方法。
項１１． 水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を損なうことなく、この物質に水溶性を付与することができる。これにより、水難溶性薬理活性物質の製剤化、及び生体への吸収が可能となった。また、食品成分としても利用されるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを用いて水難溶性薬理活性物質を水可溶化しているため、本発明の複合体は安全性が高く、健康食品、機能性食品、化粧品、医薬などとして実用可能なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実験例で得たオーレオバシジウム・プルランス由来のグルカンの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図２】実験例で得たオーレオバシジウム・プルランス由来のグルカンの超音波照射したときの培養液の粒度分布を示す図である。
【図３】１Ｈ ＮＭＲより算出したβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン/ＡＣＡ複合体組成比を示す図である。
【図４】β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンおよびそのＡＣＡ複合体のＲＡＷ２６４.７細胞に対する細胞障害性を示す図である。グラフの縦軸は細胞生存率を示し、図中の濃度はＡＣＡ濃度を示す。
【図５】マクロファージ細胞におけるＬＰＳ刺激後のＩκBα分解に対するＡＣＡ複合体の抑制効果を示す図である。
【図６】ヒト由来線維芽細胞の顕微鏡観察図、及びI型コラーゲン染色像図である。
【図７】β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン（アクアβ）により水可溶化されたクルクミンの吸収スペクトルである。
【図８】β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン（アクアβ）により水可溶化されたコエンザイムＱ１０の吸収スペクトルである。
【図９】β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン（アクアβ）により水可溶化されたビタミンＤ３の吸収スペクトルである。
【図１０】β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン（アクアβ）により水可溶化されたパクリタキセル（タキソール）の吸収スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）複合体
本発明の複合体は、水難溶性薬理活性物質と、主鎖のβ-１，３結合に対する側鎖のβ-１，６結合の比率(分岐度)が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体である。
【００１５】
（１−１）水難溶性薬理活性物質
水難溶性薬理活性物質とは、水に対する溶解度が１０ｍｇ／ｍｌ以下の薬理活性物質を意味する。例えば、第１５改正日本薬局方、通則で規定されている常温（１５〜２５℃）における溶解性が「極めて溶けにくい」及び「ほとんど溶けない」に該当する薬物が、水難溶性薬理活性物質に該当する。
本発明において、水難溶性薬理活性物質の種類は特に限定されない。
代表的には、下記一般式（１）
【化３】
（式中、２’-３’結合は単結合もしくは二重結合である。Ｒ1, Ｒ２, Ｒ３及びＲ４は、同一または異なって、水素、メトキシ基、又はＲＣＯＯ-基（Ｒは炭素数１〜４のアルキル基）を示す。）
で表される化合物が挙げられる。
【００１６】
一般式（１）で示される化合物には、例えば、１’-アセトキシチャビコール アセテート（２’-３’: Ｃ=Ｃ, Ｒ1= Ｒ４= ＣＨ３ＣＯＯ-, Ｒ２ = Ｒ３ = Ｈ-、以下ＡＣＡと称する）、ジヒドロ-１’-アセトキシチャビコール アセテート（２’-３’: Ｃ-Ｃ, Ｒ１ = Ｒ４ = ＣＨ３ＣＯＯ-, Ｒ２ = Ｒ３ = Ｈ-）、１’-アセトキシオイゲノール アセテート（２’-３’: Ｃ=Ｃ, Ｒ１ = Ｒ４ = ＣＨ３ＣＯＯ-, Ｒ２ = ＣＨ３Ｏ-, Ｒ３ = Ｈ-）、１’,２-ジアセトキシチャビコール アセテート（２’-３’: Ｃ=Ｃ, Ｒ１ = Ｒ３ = Ｒ４ = ＣＨ３ＣＯＯ-, Ｒ２ = Ｈ-）などが含まれる。中でも、薬理活性が強く医薬として有用である点で、ＡＣＡが好適である。ＡＣＡの分子量は２３４である。
また、上記一般式（１）で示される化合物は光学異性体を包含し、例えばラセミ体、Ｒ体、Ｓ体を包含する。
【００１７】
また、クルクミンも好適な水難溶性薬理活性物質である。クルクミンの構造式を以下に示す。
【化４】
クルクミンは、いずれの生物由来のものでも使用できる。例えば、ターメリック（Curcuma longa L.）のほか、マンゴージシジャー、インド産アロールート、ガジュツ、黄色ガジュツ、黒色ガジュツ、ガランガール等の植物由来のものを例示できる。クルクミンの分子量は３６８．３８である。
【００１８】
また、ユビキノンも好適な水難溶性薬理活性物質である。ユビキノンの構造式を以下に示す。
【化５】
[式中、ｎは６〜１０の整数を示す。]
【００１９】
上記の一般式（２）で表されるユビキノンの分子量は５９９〜８６３である。上記の一般式（２）で表されるユビキノンの中でも、ｎ＝１０のもの（コエンザイムＱ１０）が好ましい。本発明で用いるコエンザイムＱ１０は、牛等の動物の心臓から抽出されるものでもよく、合成法、発酵法で得たものでもよい。また、市販品を購入することもできる。市販品としては、食品素材コエンザイムＱ１０（日清ファルマ（株）製、商品名）、カネカ・コエンザイムＱ１０（鐘淵化学（株）製、商品名）、ＣｏＥｎｚｙｍｅＱ１０（旭化成（株）製、商品名）、ＢｉｏＱ10（三菱ガス化学社製）、和光純薬工業社製コエンザイムＱ１０等が挙げられる。ユビキノンの純度は限定されないが、本発明の複合体は、医薬、サプリメント、飲料、食品、化粧料に適用されるものであるため、用途に応じて純度が高いものを用いることが望ましい。
【００２０】
また、ビタミンＤも好適な水難溶性薬理活性物質である。ビタミンＤとしては、エルゴカシフェロール（ビタミンＤ２）、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）が挙げられる。エルゴカシフェロールの分子量は３９６．６５であり、コレカルシフェロールの分子量は３８４．６４である。ビタミンＤの中でも、下記式（３）で表されるビタミンＤ３が好ましい。
【化６】
【００２１】
また、パクリタキセル（Paclitaxel）（タキソール）も好適な水難溶性薬理活性物質である。パクリタキセルの構造を下記式（４）に示す。パクリタキセルの分子量は８５３．９である。
【化７】
【００２２】
その他、水難溶性薬理活性物質として、脂溶性ビタミン及び補酵素、化学療法薬；抗真菌薬；経口避妊薬、ニコチン又はニコチン置換薬、ミネラル、鎮痛薬、制酸薬、筋弛緩薬、抗ヒスタミン薬、鬱血除去薬、麻酔薬、鎮咳薬、利尿薬、抗炎症薬、抗生物質、抗ウイルス薬、精神治療薬、抗糖尿病薬及び心臓血管薬、栄養補助食品及び栄養補助剤などを例示することができる。
脂溶性ビタミン及び補酵素は、特に限定されないが、ニコチン酸、ピリドキシン、コリン、パラアミノ安息香酸、ビタミンＡ及びカロテノイド、レチノイン酸、ビタミンＥ、ビタミンＫなどを例示できる。カロテノイドとしては、αカロテン、βカロテン、γカロテン、δカロテン、リコピンのようなカロテン類；ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アントラキサンチン、ビオラキサンチンのようなキサントフィル類が挙げられる。
また、上記例示した水難溶性薬理活性物質の中でも植物性のものが好ましく、例えば、ポリフェノール(ブドウ種子抽出ポリフェノールなど)、イソフラボン（ダイズイソフラボンなど）、レスベラトロール、エピゲニン、アロエベラ，エキナセア、カモミール、Ｈａｍｍａｍｅｌｉｓ抽出物、フィーバーヒューパルテノライドのような抗炎症性植物抽出物；中国のｚｉｚｉｐｕｓ ｊｕｊｕｂａのような抗乾癬薬；Ｈａｍｍａｍｅｌｉｓのような収斂剤；アルテミシア、カモミール、ゴールデンシールのような抗菌薬；エキナセアのような免疫調節薬；抗加齢薬；ドセタキセル、カンプトテシンのような抗癌薬；抗光障害薬；回春薬などを例示できる。
また、シロスタゾール、レバミピド、アリピプラゾール、シクロスポリン、ニフェジピン、セラミドなども挙げられる。
【００２３】
主鎖のβ-１，３結合に対する側鎖のβ-１，６結合の比率(分岐度)が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体にすることにより水溶化できるか否かには、水難溶性薬理活性物質の大きさも影響する場合がある。物質の大きさの一つの指標として分子量がある。本発明において、水難溶性薬理活性物質の分子量は、約１００〜３,０００が好ましく、約１５０〜２,０００がより好ましく、約２００〜１,０００がさらにより好ましい。
【００２４】
（１−２）β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン
本発明に用いるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンにおいて、主鎖のβ-１，３結合に対する側鎖のβ-１，６結合の比率である分岐度は、通常約５０〜１００％、好ましくは約７５〜１００％、より好ましくは約８５〜１００％であればよい。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが上記分岐度を有することは、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンをエキソ型のβ−１，３−グルカナーゼ（キタラーゼ Ｍ、ケイアイ化成製）で加水分解処理した場合に分解生成物としてグルコースとゲンチオビオースが遊離すること、及びＮＭＲの積算比から確認できる（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。
【００２５】
(a)オーレオバシジウム属微生物が生産するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン
上記の分岐度を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物から得ることができる。
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物由来のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
上記の分岐度を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下のものである。上記粘度の下限値は通常１０ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。
本発明において、粘度は、ＢＭ型回転粘度計を用いて測定した値である。
オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、菌体外に分泌されるため、キノコ類やパン酵母の細胞壁に含まれるβ-グルカンと比べて、回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて産生することができる。
【００２６】
中でも、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)が生産するものが好ましく、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５及びＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６として寄託済み）が産生するものが好ましい。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）Ｋ-１株の変異株である。オーレオバシジウム属Ｋ−１株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが知られている。
また、オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、Ｋ-１株の産生するβ−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株が生産するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生する菌種、菌株も存在する。
【００２７】
ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ−グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが見かけ上２〜３０万の低分子量のβ−グルカンの両方を産生する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。このβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製しようとすると、その５０重量％以上が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。
【００２８】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンより低いものが好ましい。この低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、通常２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、よりさらに好ましくは１０ｃＰ以下である。
この低粘度グルカンは、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと同様の一次構造を有し得る。具体的には、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
【００２９】
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、金属イオン濃度が、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。原料β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが水溶液状態のものである場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。
金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形で使用する場合は、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
【００３０】
(b)オーレオバシジウム属微生物によるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの生産方法
分岐度５０〜１００％のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、例えば、これを産生する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生させる方法は種々報告されている。培養培地に使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源等を挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源等を挙げることができる。場合によってはβ−グルカンの産生量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類等を添加するのも有効な方法である。
【００３１】
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを生産するものなら特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件等が挙げられる。
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは１〜４日間程度であり、これによりβ−グルカンを産生することが可能である。なお、β−グルカンの産生量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを主成分とするβ−グルカン多糖が０．１％(ｗ/ｖ)〜数％(ｗ/ｖ)含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ([ｍＰａ・s])から数千ｃＰ（[ｍＰａ・s]）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを沈殿物として得ることができる。
【００３２】
＜低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造方法＞
上記の高粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加してもよい。例えば水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは０．５％(ｗ/ｖ)以上、より好ましくは１．２５％(ｗ/ｖ)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。また、不溶性物質除去前のβ−Ｄ−グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性物質除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β−Ｄ−グルカン濃度は、０.１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ程度、好ましくは０.５ｍｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌ程度、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍｌ〜５ｍｇ/ｍｌ程度が良い。
次いで、グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。即ち、中和はｐＨ７に合わせることを必ずしも要さない。
【００３３】
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては、１００ｃＰ以下、５０ｃＰ以下、又は１０ｃＰ以下である。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
アルカリ処理された低粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
得られるグルカン水溶液からグルカンより低分子量の可溶性夾雑物（例えば塩類など）を除去する場合は、例えば限外ろ過を行えばよい。
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
このようにして得られる水溶液に含まれるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを析出させることができる。この場合にｐＨをクエン酸などの有機酸によりｐＨを酸性、好ましくはｐＨ４未満、さらに好ましくはｐＨ３−３．７に調製して、エタノールを添加すると高純度のβ-１,３-１,６-グルカンの粉末を得ることができる。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを低粘度化することにより、限外ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
固形物として得る場合は、低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。
【００３４】
（１−３）水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの比率
複合体における水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの比率（水難溶性薬理活性物質：β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン）は、乾燥重量比で、１：０．０１〜１０００程度が好ましく、１：０．１〜１００程度がより好ましく、１：０．１〜５０程度がさらにより好ましく、１：０．１〜２０程度が特に好ましい。上記範囲であれば、十分な水溶性が得られる。
【００３５】
（２）複合体の製造方法
（２−１）高速振動粉砕法
上記説明した本発明の複合体の製造方法は、特に限定されない。
例えば、水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む方法により、製造することができる。
水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの混合比率（水難溶性薬理活性物質：β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン）は、乾燥重量比で、１：０．０１〜１０００程度が好ましく、１：０．１〜１００程度がより好ましく、１：０．１〜５０程度がさらにより好ましく、１：０．１〜２０程度が特に好ましい。
固体状態での撹拌は、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとが充分に粉砕、混合されればよく、従来から知られた各種の混合・粉砕装置を用いて行うことができる。例えば、遊星式や遠心回転式のボールミルによる粉砕・混合法；混合される材料を硬球と共に容器内に入れ、この容器を高速で振動させる高速振動粉砕装置による高速振動粉砕法などが挙げられる。
中でも、高速振動粉砕法が好ましく、その振動数は、例えば約１０〜１２０ｓ−１（約１０〜１２０Ｈｚ）とすることができる。
また、振動時間は、例えば約５〜６０分間とすることができる。また、振幅は、例えば、容器中空部の底面直径１２ｍｍ、容器中空部の長手方向長さ５０ｍｍである場合、通常約５〜１００ｍｍは、振動に付される容器が振動の中心点を基準にして最大に変位した場合において、中心点から最大変位点までの長さをいう。また、容器中空部の底面直径１２ｍｍ、容器中空部の長手方向長さ５０ｍｍである場合、硬球直径は約１〜１０ｍｍとすればよい。硬球材料としては、メノウ、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、タングステンカーバイド、クロム鋼、テフロン（登録商標）などが挙げられる。容器に供される硬球の数は、約１〜１００個とすることができる。
【００３６】
固体状態での撹拌は、室温下で行うことができる。
このようにして得られた水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの混合物に水を添加して撹拌する。水は、複合体の形成を阻害しない範囲で、緩衝剤や塩などを含んでいてよい。水の量は、上記混合物１重量部に対して約１０〜１０,０００重量部とすることができる。この工程での撹拌は、例えば、マグネティックスターラーを使用して行うことができる。この攪拌工程は、室温下に少なくとも２日間、例えば、４〜７日間行うことが好ましい。
これにより、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体が溶解した液体が得られる。必要に応じて、約５，０００〜２０，０００ｇで約５〜６０分間の遠心分離などにより、水不溶性の夾雑物を除去すればよい。
【００３７】
(2-2)極性溶媒中で混合、熟成する方法
上記説明した本発明の複合体は、水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む方法によっても製造することができる。
水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの使用比率（水難溶性薬理活性物質：β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン）は、乾燥重量比で、１：０．０１〜１０００程度が好ましく、１：０．１〜１００程度がより好ましく、１：０．１〜５０程度がさらにより好ましく、１：０．１〜２０程度が特に好ましい。
極性溶媒の使用量は、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン１重量部に対して約１０〜１０,０００重量部とすることができる。
極性溶媒は、水、酢酸、蟻酸、低級アルコールのようなプロトン性極性溶媒でもよく、ジメチルスルホキシド、アセトン、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、テトラヒドロフランのような非プロトン性極性溶媒でもよいが、特に、非プロトン性極性溶媒が好ましく、ジメチルスルホキシドがより好ましい。
【００３８】
水難溶性薬理活性物質及びβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを同時に極性溶媒と混合してもよく、一方を先に極性溶媒と混合しておき、次いでそこに他方を添加して混合してもよい。
混合は、例えば、マグネティックスターラーを使用して行うことができる。
次いで、この混合物１重量部に対して水を好ましくは約１０〜１０,０００重量部添加し、通常、室温下に１〜３日間静置することにより熟成させればよい。水は、複合体の形成を阻害しない範囲で、緩衝剤や塩などを含んでいてよい。
これにより、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体が溶解した液体が得られる。必要に応じて、約５,０００〜２０，０００ｇで約５〜６０分間の遠心分離などにより、水不溶性の夾雑物を除去すればよい。
上記説明した本発明の複合体の製造方法は、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法と捉えることもできる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実験例（精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造）
（１）低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの調製
（１-１）β−グルカンの培養産生
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０Ｌ／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ＯＤで、多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、硫黄含量から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
【００４０】
＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(ｖ/ｖ)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
【００４１】
＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β−グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ−グルカンを回収した。このβ−グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ−グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。
このβ−グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
【００４２】
【表１】
【００４３】
（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の粘度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（(ｍＰａ・ｓ)）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(ｗ/ｖ)となるように２５％(ｗ/ｗ)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ([ｍＰａ・s])であった。
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、ほぼ１００％の回収率であった。
【００４４】
（１−３）β−グルカン水溶液の脱塩
上記のβ−グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ−グルカン水溶液を得た。この時のβ−グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(ｗ/ｖ)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。
【００４５】
＜硫黄含有量の測定＞
また、得られたβ−グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。本β−グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０．１２％であった。
＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ−１，３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
この結果、本β−グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンであることが証明された（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分比から、β−１，３結合／β−１，６結合の比は１．１５であることが判明した。従って、主鎖のβ−１，３結合に対する側鎖のβ−１，６結合の分岐度は、約８７％である。
【００４６】
＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
０．３μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
また、二次粒子はマグネチックスターラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
【００４７】
＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンとβ−１，３−１，６−Ｄグルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。
【００４８】
（２）粉末化β-グルカンの調製
（１−２）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
次いで、得られた乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
一方、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
【００４９】
（３）高純度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末の製造
（１）においてアルカリ処理を行い低粘度化した培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機40D-4を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、ｐＨを３．０-３．５にクエン酸により調整して、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置Ｒ-３を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
なお、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを得た。また、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末の濃度０．５（ｗ／ｖ％）の水溶液の粘度は２００ｃＰ以下であった（ｐＨ５．０、３０℃）。上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンを下記の試験に供した。
【００５０】
実施例１〜４および比較例１
（１’-Acetoxychavicol acetateの高速振動粉砕法による水溶化）
１’-Acetoxychavicol acetate（ＡＣＡ）はタイショウガ由来の抗潰瘍、殺虫活性を有する疎水性化合物である。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとしてダイソー社製（アクアβ）、又は三井製糖社製シゾフィラン（ＳＰＧ）を、「H. Azuma, K. Miyasaka, T. Yokotani, T. Tachibana, A. Kojima-Yuasa, I. Matsui-Yuasa, K. Ogino, Bioorg. Med. Chem., 14, 1811 (2006)」に記載の方法により合成したＡＣＡ（ラセミ体）と、以下の表２に示す所定量で混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ粉砕ボールと共に封入し、レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ２００）にて２５Ｈｚで６０分間高速振動粉砕した。
【００５１】
【表２】
次いで、粉砕物１重量部に対して水１０,０００重量部を添加し、マグネティックスターラーを使用して２日間室温下にて撹拌した。さらに懸濁液を１時間ボルテックスミキサーで攪拌後、遠心分離（２５℃，１０,０００g，１０ｍｉｎ）した上清を０.２２μmメンブレンフィルターでろ過した。
ろ液の一部を凍結乾燥させ、残渣についてＤ２Ｏ中で１Ｈ ＮＭＲを測定し、グルコースのプロトン（ＣＨ Ｘ ４,ＣＨ２ Ｘ １ 計６Ｈ ）とＡＣＡのアセチル基(３Ｈ Ｘ ２)またはベンゼン環(２Ｈ Ｘ ２)のプロトンの積分値を計算することによって、複合体における、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン／ＡＣＡの組成比（グルコース／ＡＣＡ比）を計算した。組成比を以下の表３に示す。
【表３】
【００５２】
供給するグルコース／ＡＣＡの比率に対する、複合体中のグルコース／ＡＣＡの比率を図３に示す。高速振動粉砕に用いるアクアβのグルコース１ユニット当たりのＡＣＡ使用量を増やしていくと、１Ｈ ＮＭＲより算出したグルコース/ＡＣＡモル比は低下していき、三重螺旋構造を形成するアクアβの内部疎水空孔により密にＡＣＡが取り込まれていくことが明らかとなった。
また、ＡＣＡ使用量をグルコース１ユニット当たり０.３３当量以上にしても複合体組成比はほぼ一定であり、算出されたグルコース/ＡＣＡ=６がアクアβを用いた際の最満充填状態と推定される。なお、グルコース６個は三重螺旋繰り返し単位１ユニット分に相当する。
一方、仕込み比グルコース/ＡＣＡ=５で調製したとき、複合体組成比（グルコース/ＡＣＡ）はシゾフィランでは１０、アクアβでは１２の値となった。つまり、ＡＣＡ一分子当たりが占有する三重螺旋繰り返し単位はシゾフィランでは２.５、アクアβでは２となり、同条件においてはシゾフィランよりもアクアβの方がより効率的に複合化することが分かった。
【００５３】
実施例５（アクアβ/ＡＣＡ複合体の細胞毒性評価）
９６穴プレートに５×１０３cellsずつになるようにＲＡＷ２６４.７細胞（マウスマクロファージ細胞）の細胞懸濁液を播き、ＲＰＭＩ培地（牛胎児血清を１０ｗ/ｖ％含む）を用い３７度、５ｖ/ｖ％ＣＯ２下で２４時間培養した。アスピレーターで培地をとり除き、グルコース/ＡＣＡ＝１２であるアクアβ/ＡＣＡ複合体のＡＣＡ濃度を所定濃度に調整した培地を１００μLずつ加え、２２時間培養し、ＷＳＴ試薬（（株）同仁化学研究所製、Cell-counting Kit-8）（M. Ishiyama, Y. Miyazono, K. Sasamoto, Y. Ohkura, K. Ueno, Talanta, 44, 1299 (1997)参照）を１０μL加えて更に２時間培養し呈色反応を行った。
プレートリーダー（ThermoLab Systems社製、MultiSkan Acent BIF）を用い、４５０ｎｍ（リファレンス６５０ｎｍ）の吸光度を測定し、細胞生存率を算出した（M. Ishiyama, Y. Miyazono, K. Sasamoto, Y. Ohkura, K. Ueno, Talanta, 44, 1299 (1997)）。
結果を図４に示す。図４の縦軸は細胞生存率を示し、図中の各濃度はＡＣＡの濃度を示す。
ＡＣＡはアポトーシス活性を有することが既に知られている（K. Ito, T. Nakazato, A. Murakami, H. Ohigashi, Y. Ikeda, M. Kizaki, Biochem. Biophys. Res. Commun., 338, 1702 (2005)）。ＲＡＷ２６４.7細胞に対しても１０μＭ で細胞生存率２０％と著しい細胞障害性を示した。一方、アクアβ又はシゾフィランとの複合体は２０μＭでも有意な細胞毒性を示さず、β-1,3-グルカンと複合化することでＡＣＡの細胞障害性を抑制できることが明らかとなった。
【００５４】
実施例６（アクアβ/ＡＣＡ複合体のＮＦ-κＢ抑制効果の確認 ）
実施例１で調製したアクアβ/ＡＣＡ複合体のサンプル（グルコース/ＡＣＡ=１に）を用いて、ＡＣＡの活性であるＮＦ-κB抑制効果の評価をウエスタンブロッティングにより行った。
３５ｍｍ Ｄｉｓｈに５×１０５cellsになるようにＲＡＷ２６４.７細胞懸濁液を１ｍｌ捲き、２４時間培養後、最終ＡＣＡ濃度が０, １, ５μMになるように各サンプルを加え、３０分培養した。さらにＬＰＳ(１０ｍｇ/ｍｌ)を１０μL加え１５分培養後、細胞を回収した。ＬＰＳは使用前に５分間超音波処理した。
５％の２-メルカプトエタノール溶液を加え、９５℃で５分間熱処理を行い、１２％のゲルにてＳＤＳ-ＰＡＧＥ（２０ｍＡ）、転写（７０ｍＡ、９０分）、ブロッキング、抗体（IκBα抗体）反応を行った。
結果を図５に示す。ＮＦ-κＢ は各種炎症性サイトカインの転写因子である。種々の炎症性シグナルが細胞に伝達された際、細胞質でＮＦ-κＢ の抑制因子であるＩκBαがリン酸化そして分解することでＮＦ-κＢ は活性化され核内移行し転写因子として機能する。つまり、炎症性物質であるＬＰＳでマクロファージ細胞を刺激すると、ＩκBαが分解され、ＮＦ-κＢ は活性化される（図５、左から２番目レーン）。マクロファージ細胞は刺激がない場合にはＮＦ-κＢ を抑制するためにIκBαが存在し、検出される（図５コントロールｃレーン）。既に、ＡＣＡはIκBα活性化を抑制することが知られているが（H. Matsuda, T. Morikawa, H. Managi, M. Yoshikawa, Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 3197 (2003)）、今回５μM のACAでIκBαの分解を抑制することが確認できた（図５、左から３番目レーン）。
しかし、ＡＣＡ を免疫抑制剤として使用する場合先に述べたように、細胞障害性が問題となる。一方、アクアβ/ＡＣＡでも濃度依存的にIκBαの分解つまりＮＦ-κＢの活性化を抑制していることが分かった（図５、左から４，５番目レーン）。アクアβ/ＡＣＡ は細胞毒性も問題とならないことから、有用な免疫抑制剤として機能することが期待される。
【００５５】
実施例７（コラーゲン産生促進作用の評価 ）
実施例１で調製したアクアβ/ＡＣＡ複合体の（グルコース/ＡＣＡ=６）を用いて特開2009-079004号公報に開示された方法によりヒト線維芽細胞におけるコラーゲン産生亢進能評価を行った。
具体的には、ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（ＣＣＤ-１０５９ＳＫ、大日本製薬（株））を１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を含むＥＭＥＭ培地で３〜６回継代培養した。次いで、細胞数が１ x １０６cells になるようにカルチャースライド（Falcon社製）に調製し、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地で２４時間培養して、細胞をスライドに固定させ、さらに、細胞周期を同調するためにＥＭＥＭ培地のみ出に４時間培養した。次いで、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地に交換し、最終ＡＣＡ濃度が０, ０.１, １．０μＭになるように各サンプルを加え、２４時間培養した。コントロール実験として、ＡＣＡ（ラセミ体）を用い、アクアβ/ＡＣＡ複合体と活性を比較した。
カルチャースライドをＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、４％ホルマリン溶液を添加し４度で一晩静置し固定化した。０.１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘを含むＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、３％Ｈ２Ｏ２溶液で５分間、内在性ペルオキシダーゼのブロッキングを行った。次いで、１０％標準ヤギ血清を用いて５分間非特異的反応のブロッキングを行った。そして、抗ラットI型コラーゲン抗体（Anti-rat type I collagen抗体（LSL社製）２００倍希釈液）を用いて一次抗体の反応を６０分間行った。ＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、ビオチン標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（Biotinylated Goat anti-rabbit immunogloblins抗体（DAKO社製）４００倍希釈液）を用いて二次抗体反応を３０分間行った。ＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、酵素溶液（Horseradish peroxidase-labelled streptavidin-biotin complex（ＤＡＫＯ社製）４００倍希釈液）による反応を３０分間行った。ＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、ＤＡＢ (３,３-diaminobenzidine tetrahydrochloride)溶液を５分間反応させ、ペルオキシダーゼ発色反応を行った。ＰＢＳ溶液で５分間計３回洗浄後、水溶性封入剤で封入し、標本を作製した。
得られた各サンプルの顕微鏡図および染色図を図６に示す。アクアβ/ＡＣＡ複合体（グルコース/ＡＣＡ=６）は低濃度（０．１μＭ）、及び高濃度（１．０μＭ）のいずれにおいてもＡＣＡ単独時よりもより高いコラーゲン産生亢進能を有していることが明らかとなり、皮膚のコラーゲン量を増加させる化粧品や医薬品として期待される。
【００５６】
実施例８（クルクミンの高速振動粉砕法による水溶化）
クルクミンは抗酸化作用、抗炎症作用そして抗腫瘍作用を有する疎水性化合物である。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとしてダイソー社製（アクアβ）１０ｍｇと、和光純薬工業社製クルクミン ０.７５ｍｇとを混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ粉砕ボールと共に封入し、レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ２００）にて２５Ｈｚ、６０分間高速振動粉砕した。次いで、粉砕物１重量部に対して水１０，０００重量部を添加しマグネティックスターラーを使用して２日間室温下にて撹拌した。さらに懸濁液を１時間ボルテックスミキサーで攪拌後、遠心分離（２５℃，１０,０００g，１０ｍｉｎ）して上清を得た。
上清の吸収スペクトルを測定した(図７（Ｂ）)。また、クルクミンの２１．７μM エタノール溶液の吸収スペクトルを測定し（図７（Ａ））、極大吸収波長４２０ ｎｍにおけるモル吸光係数 ε= ５.５６ x １０４ を用い、クルクミン/アクアβ複合体水溶液中のクルクミン濃度を算出した。その結果、[クルクミン] = ２０μＭ（水溶化率９．８％）の水溶液を調製できた。この水溶化率はモル吸光係数より求めた値である。
【００５７】
実施例９（コエンザイムＱ１０の高速振動粉砕法による水溶化）
コエンザイムＱ１０は抗酸化作用を有する難水溶性化合物である。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとしてダイソー社製（アクアβ）１４．１ｍｇを用い、和光純薬工業社製コエンザイムＱ１０ ３．６７ｍｇを混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ粉砕ボールと共に封入し、レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ２００）にて２５Ｈｚ，２０分間高速振動粉砕を行った。その後、粉砕物１重量部に対して超純水１０，０００重量部を添加した。さらに懸濁液を１時間ボルテックスミキサーで攪拌後、遠心分離（２５℃，１０，０００ｇ，１０ｍｉｎ）した上清を得た。
上清の吸収スペクトル、及びアクアβ非存在下で同様の処理を行った水溶液の吸収スペクトルをそれぞれ測定した（図８）。極大吸収波長２７５ｎｍにおけるモル吸光係数 ε= １．３３ x １０４ を用い、コエンザイムＱ１０/アクアβ複合体水溶液中のコエンザイムＱ１０濃度を算出した。その結果、[コエンザイムＱ１０] = １１９μＭ（水溶化率２８％）の水溶液を調製することに成功した。この水溶化率はモル吸光係数より求めた値である。
【００５８】
実施例１０（ビタミンＤ３の高速振動粉砕法による水溶化）
ビタミンＤ３（ＶＤ３）は種々の生理活性を有する難水溶性化合物である。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとしてダイソー社製（アクアβ）１３．９ｍｇを用い、和光純薬工業社製ビタミンＤ３ ３．６２ｍｇを混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ粉砕ボールと共に封入し、レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ２００）にて２５Ｈｚ，２０分間高速振動粉砕を行った。その後、粉砕物１重量部に対して超純水１０，０００重量部を添加した。さらに懸濁液を１時間ボルテックスミキサーで攪拌後、遠心分離（２５℃，１０，０００ｇ，１０ｍｉｎ）した上清を得た。
上清の吸収スペクトル、及びアクアβ非存在下で同様の処理を行った水溶液の吸収スペクトルをそれぞれ測定した（図９）。極大吸収波長２７１ ｎｍにおけるモル吸光係数 ε= １．５０ x １０３ を用い、ビタミンＤ３/アクアβ複合体水溶液中のビタミンＤ３濃度を算出した。その結果、[ビタミンＤ３] = １４９μＭ（水溶化率１６％）の水溶液を調製することに成功した。この水溶化率はモル吸光係数より求めた値である。
【００５９】
実施例１１ パクリタキセル（タキソール）の高速振動粉砕法による水溶化
パクリタキセル（タキソール）は抗腫瘍活性を有する難水溶性化合物である。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとしてダイソー社製（アクアβ）１５．０ｍｇを用い、和光純薬工業社製パクリタキセル（タキソール）３．８４ｍｇを混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ粉砕ボールと共に封入し、レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ２００）にて２５Ｈｚ、２０分間高速振動粉砕を行った。粉砕物１重量部に対して超純水１０，０００重量部を添加した。さらに懸濁液を１時間ボルテックスミキサーで攪拌後、遠心分離（２５℃、１０，０００ｇ、１０ｍｉｎ）した上清を得た。
上清の吸収スペクトル、及びアクアβ非存在下で同様の処理を行った水溶液の吸収スペクトルをそれぞれ測定した（図１０）。極大吸収波長２３０ｎｍにおけるモル吸光係数 ε= ２．９６ x １０４ を用い、パクリタキセル（タキソール）/アクアβ複合体水溶液中のパクリタキセル（タキソール）濃度を算出した。その結果、パクリタキセル（タキソール）=１８６μＭ（水溶化率４１％）の水溶液を調製することに成功した。この水溶化率はモル吸光係数より求めた値である。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の複合体は、難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性が付与されているため、健康食品、機能性食品、医薬、化粧品などとして実用可能なものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体。
【請求項２】
水難溶性薬理活性物質の分子量が１００〜３，０００である請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
水難溶性薬理活性物質が、下記一般式（１）
【化１】
（式中、２’-３’結合は単結合もしくは二重結合である。Ｒ1, Ｒ２, Ｒ３及びＲ４は、同一または異なって、水素、メトキシ基、又はＲＣＯＯ-基（Ｒは炭素数１〜４のアルキル基）を示す。）
で表される化合物である請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
水難溶性薬理活性物質が、クルクミンである請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
水難溶性薬理活性物質が、下記一般式（２）
【化２】
[式中、ｎは６〜１０の整数を示す。]
で表されるユビキノンである請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
水難溶性薬理活性物質が、ビタミンＤである請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
水難溶性薬理活性物質が、パクリタキセル（タキソール）である請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法。
【請求項９】
水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法。
【請求項１０】
水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体の製造方法。
【請求項１１】
水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体の製造方法。
【請求項１】
水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体。
【請求項２】
水難溶性薬理活性物質の分子量が１００〜３，０００である請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
水難溶性薬理活性物質が、下記一般式（１）
【化１】
（式中、２’-３’結合は単結合もしくは二重結合である。Ｒ1, Ｒ２, Ｒ３及びＲ４は、同一または異なって、水素、メトキシ基、又はＲＣＯＯ-基（Ｒは炭素数１〜４のアルキル基）を示す。）
で表される化合物である請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
水難溶性薬理活性物質が、クルクミンである請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
水難溶性薬理活性物質が、下記一般式（２）
【化２】
[式中、ｎは６〜１０の整数を示す。]
で表されるユビキノンである請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
水難溶性薬理活性物質が、ビタミンＤである請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
水難溶性薬理活性物質が、パクリタキセル（タキソール）である請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法。
【請求項９】
水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質の薬理活性を維持しながら水溶性を付与する方法。
【請求項１０】
水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体の製造方法。
【請求項１１】
水難溶性薬理活性物質と、β−１，３結合に対するβ−１，６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、水難溶性薬理活性物質とβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとの複合体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１３２２２３（Ｐ２０１１−１３２２２３Ａ）
【公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６３０８９（Ｐ２０１０−２６３０８９）
【出願日】平成２２年１１月２６日（２０１０．１１．２６）
【出願人】（０００１０８９９３）ダイソー株式会社 (229)
【出願人】（５０６１２２３２７）公立大学法人大阪市立大学 (122)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月２６日（２０１０．１１．２６）
【出願人】（０００１０８９９３）ダイソー株式会社 (229)
【出願人】（５０６１２２３２７）公立大学法人大阪市立大学 (122)
【Ｆターム（参考）】
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