流路系、及びハイブリダイゼーション検出装置
【課題】内部でハイブリット形成可能な新規流路系を提供すること。
【解決手段】ビーズが充填された細管からなる流路系１であって、核酸鎖Ｎが固定されているハイブリット形成用ビーズ２と、カチオン性イオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズ３と、が少なくとも充填されたカラム層を有することにより、流路系１内での多孔質マイクロビーズへの核酸の吸着を防止し、反応効率の上昇、及び反応条件を安定させることが可能な流路系を提供する。
【解決手段】ビーズが充填された細管からなる流路系１であって、核酸鎖Ｎが固定されているハイブリット形成用ビーズ２と、カチオン性イオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズ３と、が少なくとも充填されたカラム層を有することにより、流路系１内での多孔質マイクロビーズへの核酸の吸着を防止し、反応効率の上昇、及び反応条件を安定させることが可能な流路系を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出に係わる技術に関する。より詳しくは、流路系内でハイブリダイゼーションを進行させ、これを検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析、遺伝子ネットワーク解明等に利用され得るバイオアッセイ技術の開発が進んでいる。例えば、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれる集積基板を用いた方法が挙げられる。
【０００３】
このＤＮＡチップやタンパク質を集積したプロテインチップなどに代表されるようなセンサーチップ技術は、検出用物質（プローブと称されることが多い。）とターゲット物質との間の特異的な相互作用を利用して、ターゲット物質の含有量、構成成分、機能等を調べる方法である。
【０００４】
最近では、検出用物質とターゲット物質との間の特異的な相互作用を、流路やキャピラリーを利用して行う技術が提案されている。例えば、特許文献１には、ポリヌクレオチドの増幅を行う部分と、検出用オリゴヌクレオチドが固定されている多孔質層を有するハイブリダイゼーション部分とが、流路によって連結されているポリヌクレオチドの分析用部材が開示されている。
【０００５】
特許文献２には、毛細管状の流路の内壁にプローブ化合物を固定して、被検ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションを進行させるポリヌクレオチドの分析方法が開示されている。
【０００６】
特許文献３には、５種の異なるＤＮＡプローブが担持された各マイクロビーズを、マイクロアレイ容器の流路に充填し、検体とビーズに固定されたＤＮＡプローブとの間で選択的にハイブリダイゼーションを形成させる方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００５−１３０７９５号公報。
【特許文献２】特開２００４−１２１２２６号公報。
【特許文献３】特開２００２−３０３６２７号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、流路やキャピラリーなどの細い流路内において、ハイブリット形成を進行させる場合、反応効率をよくするために多孔質のマイクロビーズを用いることが多い。しかし、多孔質のマイクロビーズを用いると、送液中のターゲット核酸が多孔質マイクロビーズに吸着することがある。そのため、ターゲット検出の際、マイクロビーズに固定された核酸鎖とのハイブリット形成なのか、多孔質マイクロビーズへの吸着なのかの区別が困難となる。
【０００８】
また、ターゲット核酸が多孔質マイクロビーズに吸着してしまうと、マイクロビーズ上の核酸鎖にターゲット核酸が十分な濃度や量で行き届かず、反応効率が低下するばかりか、反応条件が不安定となる問題もあった。
【０００９】
そこで、本発明は、多孔質マイクロビーズへの核酸の吸着を防止し、反応効率の上昇、及び反応条件を安定させることを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者は、前記課題を解決するために、充填するビーズの好適な条件などについて鋭意研究した結果、反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能な新規流路系などを見出した。
【００１１】
本発明では、ビーズが充填された細管からなる流路系であって、核酸鎖が固定されているハイブリット形成用ビーズと、カチオン性イオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズと、が少なくとも充填されたカラム層を有する流路系を提供する。
【００１２】
前記多孔質マイクロビーズは、カチオン性イオン交換能を持つものであれば特に限定されないが、好適な一例としては、パフュージョンクロマトグラフィー粒子が挙げられる。
【００１３】
前記ハイブリット形成用ビーズ上では、固定された前記核酸鎖と、ターゲット核酸とが相補結合するハイブリット形成を進行させることができる。
【００１４】
前記核酸鎖を、同種塩基配列を有するリンカーとすれば、前記ハイブリット形成用ビーズ上では、固定された該リンカーとターゲット核酸とが相補結合する第１ハイブリット形成と、該ターゲット核酸の一本鎖部分と送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、を進行させることもできる。
【００１５】
前記リンカーの同種塩基配列の一例としては、ポリＴ又はポリＵ等が挙げられる。この場合、流路系内のハイブリット形成用ビーズ上では、該ポリＴ又はポリＵと全ＲＮＡサンプル中のポリＡテール部分を有するｍＲＮＡとが相補結合する第１ハイブリット形成と、該ｍＲＮＡと送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、を進行させることができる。
【００１６】
本発明に係る流路系は、前記ハイブリット形成用ビーズが少なくとも充填されている反応部と、前記多孔質マイクロビーズが充填されている送液促進部と、が順に層をなすように形成してもよい。一例を挙げると、前記反応部と、前記反応部の上流領域に設けられた前記送液促進部と、前記反応部の下流領域に設けられた前記送液促進部と、からなる３層構造となるように形成することができる。
【００１７】
また、本発明に係る流路系は、前記ハイブリット形成用ビーズと、前記多孔質マイクロビーズと、を混合充填して形成してもよい。
【００１８】
さらに、本発明に係る流路系は、前記ハイブリット形成ビーズと前記多孔質マイクロビーズとが混合充填されている反応部と、前記多孔質マイクロビーズが充填されている送液促進部と、が順に層をなすように形成してもよい。一例を挙げると、前記反応部と、前記反応部の上流領域に設けられた前記送液促進部と、前記反応部の下流領域に設けられた前記送液促進部と、からなる３層構造となるように形成することができる。
【００１９】
本発明に係る流路系に送液する全溶液は、界面活性作用及び核酸分解酵素失活作用を有する物質を同濃度含む溶液が望ましい。前記物質の一例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を挙げることができる。
【００２０】
本発明に係る流路系は、ハイブリダイゼーション検出装置に用いることができる。例えば、本発明に係る流路系と、前記ハイブリット形成用ビーズ上におけるハイブリット形成を検出する検出部と、を少なくとも備えるハイブリダイゼーション検出装置を提供できる。
【００２１】
以下、本発明で使用する技術用語の定義付けを行う。「ターゲット核酸」とは、サンプル溶液中に含まれる核酸であって、本発明に係る流路系を用いて、その含有量、構成成分、機能などの分析を行うことを目的とする核酸をいう。「塩基配列」とは、重合している２以上の塩基を意味する。「リンカー」とは、ビーズに対して核酸を保持するために利用される所定配列の核酸である。
【００２２】
「プローブ核酸」とは、ハイブリダイゼーション検出に有用な情報を提供できる核酸であって、例えば、蛍光物質が標識された一本鎖核酸、あるいは放射性物質が標識された一本鎖核酸などを挙げることができ、前者では励起蛍光を検出し、後者では放射線を検出することによって、ハイブリダイゼーションを検出できる。
【００２３】
「ポリ」とは、塩基が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＴ」とは塩基チミン（Ｔ）が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＵ」とは、塩基ウラシル（Ｕ）が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＡテール（poli(A)tail）」とは、ｍＲＮＡの３’末端に付加されているアデニノシンの鎖である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る流路系は、多孔質マイクロビーズへの核酸の吸着を防止できるため、流路内でのハイブリダイゼーション等の反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２６】
まず、図１を用いて、本発明に係る流路系の構成を説明する。図１は、本発明に係る流路系の一実施形態を示す図である。
【００２７】
この図１に符号１で示す流路系は、大別して、サンプル溶液の流路となる口径０．５ｍｍ程度の細管１１と、該細管１１の一端に形成された導入部１２と、該細管１１の他端側に形成された排出部１３と、から構成されている。なお、図１に示された矢印Ｗは、サンプル溶液等の流れる方向を示している。
【００２８】
この図示された流路系１には、導入部１２に近接する細管１１部分の内部に微小粒径のハイブリット形成用ビーズ２が多数充填されている。ハイブリット形成用ビーズ２には、核酸鎖Ｎが固定されている（後述の図２参照）。このハイブリット形成用ビーズ２上では、ハイブリダイゼーションなどの所望の相互作用が進行する。
【００２９】
ハイブリット形成用ビーズ２のビーズベット長Ｂは、自由に設計することができる。一般に、ビーズベット長Ｂが長くなるほど、マイクロ流路内圧も上昇するので、好適な一例を挙げると、ビーズベット長４ｍｍ以下、より好ましくは２ｍｍ以下である。
【００３０】
ハイブリット形成用ビーズ２の下流側（即ち、排出部１３側）に多孔質マイクロビーズ３が多数充填されている。この多孔質マイクロビーズ３は、送液されてくるサンプル溶液や洗浄用のバッファー溶液などの送液速度を促進するための役割を担う。
【００３１】
多孔質マイクロビーズ３は、送液されるサンプル溶液中のターゲット核酸を吸着しないものが望ましい。ターゲット核酸が多孔質マイクロビーズ３に吸着してしまうと、ターゲットの検出の際、ハイブリット形成用ビーズ２に固定された核酸鎖Ｎとのハイブリット形成なのか、多孔質マイクロビーズ３への吸着なのかの区別が困難となる。また、ターゲット核酸が多孔質マイクロビーズに吸着してしまうと、マイクロビーズ上の核酸鎖に、ターゲット核酸が十分な濃度や量で行き届かず、反応効率が著しく低下し、更に、反応条件も不安定となる。
【００３２】
本発明では、多孔質マイクロビーズ３として、カチオン性イオン交換能を持つものを用いることにより、ターゲット核酸の吸着を防止することに成功した。そのため、流路系１内での反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能となった。
【００３３】
多孔質マイクロビーズ３は、送液を促進し、かつ、カチオン性イオン交換能を有するものであれば特に限定されないが、好適な一例としては、パフュージョンクロマトグラフィー粒子を挙げることができる。
【００３４】
このパフュージョンクロマトグラフィー粒子の典型的なものは、貫通孔（Through pore）と称される大きなポアと吸着孔（Diffusive pore）と称される小さなポアを持っている。これにより、バッファー溶液に溶け込んだ分子は、前記貫通孔を通りぬけ、吸着孔の隅々まで運ばれる。このため、分子と充填材表面の官能基との接触面積が大きくなり、バッファーの流れと官能基との距離は充填材の粒径に関係がなく非常に小さくなる（１μｍ以下）ので、高流速で、かつ低圧の送液を行うことができる。
【００３５】
次に、図２から図６を用いて、ハイブリット形成用ビーズ２上におけるハイブリット形成の様子を説明する。
【００３６】
図２は、流路系１内に充填されているハイブリット形成用ビーズ２１の表面上の物質構成の一例を模式的に示す図である。
【００３７】
ハイブリット形成用ビーズ２１は、例えばポリスチレンなどの材料で形成された微小なマイクロビーズである。このハイブリット形成用ビーズ２１の表面は、核酸の一末端を化学的に結合させるのに好適な構成を備えている。
【００３８】
ハイブリット形成用ビーズ２１は、該ハイブリット形成用ビーズ２１の表面に対して、例えば、アビジン-ビオチン結合やカップリング反応（例えば、ジアゾカップリング反応）などを介して結合された核酸鎖Ｎを備えている。この状態で、ハイブリット形成用ビーズ２１を流路系１に充填する（図１参照）。
【００３９】
核酸鎖Ｎは、ハイブリット形成用ビーズ２１に保持された状態で、流路系１内において待ち受けており、送液されてくるサンプル液中の相補的なターゲット核酸Ｘとハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションの様子を、図３に示す。
【００４０】
図３では、ハイブリット形成用ビーズ２１に保持された状態の核酸鎖Ｎの一本鎖部分に対して、ターゲット核酸Ｘがハイブリダイゼーションし、二本鎖を形成している様子を模式的に示す。図示しないが、核酸鎖Ｎ、又はターゲット核酸Ｘに、予めハイブリダイゼーション検出に利用できる蛍光物質、あるいは放射性物質などを標識（ラベル）しておくことで、該標識物質から得られる光情報や放射線情報を捕捉することによって、前記ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００４１】
図４は、図２とは異なる実施形態のハイブリット形成用ビーズ２２の表面上の物質構成を模式的に示す図である。
【００４２】
このハイブリット形成用ビーズ２２は、該ハイブリット形成用ビーズ２２の表面に対して、例えば、アビジン-ビオチン結合やカップリング反応（例えば、ジアゾカップリング反応）などを介して結合されたオリゴ核酸であるリンカーＬを備えている。該リンカーＬは、ターゲット核酸Ｘと相補結合する塩基配列を有していれば特に限定されないが、一例を挙げると、同種塩基配列であるポリＴ又はポリＵを有するものが好適である。
【００４３】
図５は、リンカーＬとターゲット核酸Ｘが相補結合する様子を模式的に示す図である。例えば、図５に示すように、リンカーＬがポリＴ塩基配列部分を有する場合、ターゲット核酸ＸのポリＡ部位がポリＡセレクションプロセスに基づいて、前記ポリＴ部分と相補結合する。ターゲット核酸Ｘの好適例の一つとして、ポリＡテールを有するｍＲＮＡを挙げることができる。
【００４４】
前記ターゲット核酸Ｘは、リンカーＬを介してハイブリット形成用ビーズ２２に保持された状態で、流路系１内において待ち受けており、送液されてくるサンプル溶液中の相補的なプローブ核酸Ｐとのハイブリダイゼーションを進行する。ハイブリダイゼーションの様子を図６に示す。
【００４５】
図６は、ハイブリット形成用ビーズ２２にリンカーＬを介して保持されたターゲット核酸Ｘの一本鎖部分に対して、プローブ核酸Ｐがハイブリダイゼーションし、二本鎖を形成している様子を模式的に示している。
【００４６】
この図６に示すように、プローブ核酸Ｐには、予めハイブリダイゼーション検出に利用できる蛍光物質Ｆ、あるいは放射性物質（図示せず）などを標識（ラベル）しておくことで、該標識物質から得られる光情報や放射線情報を捕捉することによって、前記ハイブリダイゼーションを検出することが可能となる。
【００４７】
このようなハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、被験者の細胞などから抽出されたｍＲＮＡをハイブリット形成用ビーズ２２に、リンカーＬを介して保持しておき、このｍＲＮＡに対して、公知の疾病発現原因遺伝子に係わる塩基配列を有するプローブ核酸Ｐがハイブリダイズするか否かを判定する目的の検査などに利用できる。
【００４８】
以上のアッセイは、例えば、図７の工程図に示された方法に基づいて実施できる。まず、流路系１を構成する細管１１の所定位置に向けて、パフュージョンクロマトグラフィー粒子のような多孔質マイクロビーズ３を充填する（図７中の（Ｉ）参照）。
【００４９】
次に、多孔質マイクロビーズ３の上流側に向けて、リンカーＬが固定化されているハイブリット形成用ビーズ２２を充填する（図７中の（II）参照）。
【００５０】
そして、ハイブリット形成用ビーズ２２に向けて、ターゲット核酸Ｘを含む第１サンプル溶液Ｓ１を送液する（図７中の（III）参照）。このとき、ハイブリット形成用ビーズ２２に保持されているリンカーＬ（例えば、ポリＴ）とターゲット核酸Ｘ（例えば、ポリＡテール部分）とが、相補結合する（第１ハイブリット形成、図７中の（IV）参照）。
【００５１】
続いて、プローブ核酸Ｐを含有する第２サンプル溶液Ｓ２を、前記第１ハイブリット形成後のハイブリット形成用ビーズ２２へ向けて送液する（図７中の（Ｖ）参照）。そして、所定温度、ｐＨ条件で所定時間、ターゲット核酸Ｘとプローブ核酸Ｐとの間のハイブリダイゼーションを進行させる（第２ハイブリット形成、図７中の（VI）参照）。このときのプローブ核酸Ｐから得られる情報（例えば、標識された蛍光物質からの励起蛍光情報）により、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００５２】
以上説明した本発明に係る流路系１は、図８に示すように、ハイブリット形成用ビーズ２が充填されている反応部１１１ａと、多孔質マイクロビーズ３が充填されている送液促進部１１２ａが順に層をなすように形成している（図８中符号１ａで示す）が、その構成は限定されない。図９から図１１を用いて、本発明に係る流路系１への各ビーズの充填方法を例示する。
【００５３】
図９は、図８とは異なる実施形態の流路系１ｂを示す図である。本実施形態に係る流路系１ｂは、ハイブリット形成用ビーズ２を充填した反応部１１１ａと、反応部１１１ａの上流領域（導入部１２側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ａ１と、反応部１１１ａの下流領域（排出部１３側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ａ２と、からなる３層構造をしている。即ち、反応部１１１ａの両側を、送液促進部１１２ａ１、１１２ａ２で挟み込んだ構成となっている。
【００５４】
送液促進部１１２ａ１、１１２ａ２を設けることにより、送液促進だけでなく、以下の効果も期待できる。一般に、導入部１２や排出部１３の近傍の細管部分では、外部ポンプ等との接続のためのナットなどの諸部材が設けられることが多い。そのため、この部分に反応部１１１ａを設けると、光などの検出や測定などが困難となる。しかし、送液促進部１１２ａ１、１１２ａ２を反応部１１１ａの下流側、及び上流側に設けることによって、検出、測定などの対象となる反応部１１１ａが流路系１の中央部近くに配置できるようになるので、検出、測定などが容易になるという利点が生まれる。
【００５５】
また、反応部１１１ａの両側を、送液促進部１１２ａ１、１１２ａ２で挟み込む構成をとることで、流路系１ｂ内には、隙間なくビーズを充填することができる。流路系１ｂ内に隙間なくビーズを充填することで、輸送などによる振動の影響も受け難くすることができる。
【００５６】
図１０は、図８、及び図９とは異なる実施形態の流路系１ｃを示す図である。本実施形態に係る流路系１ｃには、ハイブリット形成用ビーズ２と多孔質マイクロビーズ３を混合充填している。
【００５７】
本発明に用いる多孔質マイクロビーズ３は、核酸を吸着しないため、ハイブリット形成用ビーズ２と混合しても、ハイブリット形成用ビーズ２上でのハイブリット形成を阻害しない。従って、ハイブリット形成用ビーズ２と多孔質マイクロビーズ３を混合充填することにより、流路系１ｃ内の反応効率の低下、及び反応条件の不安定化を招くことなく、送液促進効果を得ることができる。
【００５８】
図８で示した実施形態と同様に、ハイブリット形成用ビーズ２と多孔質マイクロビーズ３を混合充填した反応部１１１ｂの下流領域（排出部１３側）に、多孔質マイクロビーズ３を充填した送液促進部１１２ｂを設け、反応部１１１ｂと送液促進部１１２ｂが順に層をなすように形成してもよい（図１１参照）。
【００５９】
また、図９で示した実施形態と同様に、前記反応部１１１ｂと、反応部１１１ｂの上流領域（導入部１２側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ｂ１と、反応部１１１ｂの下流領域（排出部１３側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ｂ２と、からなる３層構造としてもよい（図１２参照）。即ち、反応部１１１ｂの両側を、送液促進部１１２ｂ１、１１２ｂ２で挟み込んだ構成をとることも自由である。
【００６０】
送液促進部１１２ｂ１、１１２ｂ２を設けることにより、送液促進だけでなく、上記と同様の効果も期待できる。即ち、検出、測定などの対象となる反応部１１１ｂが流路系１の中央部近くに配置できるようになり、検出、測定などが容易になるという利点、及び、流路系１ｅ内に隙間なくビーズを充填することで、輸送などによる振動の影響を受け難くなるという利点が生じる。
【００６１】
本発明に係る流路系１（１ａ〜１ｅ）に送液するサンプル溶液などの溶液は、ハイブリット形成等に影響を与えない限り、目的に合わせてあらゆる物質を含ませることができる。例えば、流路系１（１ａ〜１ｅ）に送液する溶液全部に、界面活性作用を有する物質を含ませれば、マイクロビーズへの核酸等の吸着を防止することができるため、洗浄等を行う必要がなく、液相の置換の必要もなくなる。そのため、総測定時間の短縮を図ることができる。
【００６２】
また、核酸分解酵素失活作用を有する物質を含ませれば、RNaseやDNaseなどの核酸分解酵素による影響を抑制することができる。そのため、効率の良い、安定した測定を行うことができる。
【００６３】
界面活性作用及び核酸分解酵素失活作用を有する物質の好適な一例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」とする。）を挙げることができる。ＳＤＳは、マイクロビーズへの核酸等の吸着を防止する効果があるため、サンプル液などの送液後に、洗浄を行う必要がない。また、後述の実施例３で説明するとおり、ＳＤＳは、蛍光測定に影響を及ぼさないため、蛍光測定時に、ＳＤＳを含まない液相に置換する必要がない。そのため、RNaseやDNaseなどの核酸分解酵素による影響を抑制し、安定した測定を行うことができる。
【００６４】
本発明に係る流路系１（１ａ〜１ｅ）へサンプル液を送液する場合、そのまま送液することも可能であるが、サンプル液を濾過した後に流路系１（１ａ〜１ｅ）へ送液することがより好ましい。浮遊物質などを除去するためである。サンプル液中の浮遊物質などを予め濾過しておけば、流路系１（１ａ〜１ｅ）の目詰まりを防止できる。
【００６５】
濾過に用いるフィルタは、浮遊物質や長鎖の核酸を除去できるものが望ましい。好適な一例としては、その孔径が０．６５μｍ以下、より好ましくは０．１μｍ以下のフィルタを挙げることができる。フィルタ濾過する前に、濾過の精度を上げるために、遠心分離を行うことも自由である。
【００６６】
本発明に係る流路系１（１ａ〜１ｅ）では、排出部１３において、減圧を行うことも可能である。一般に、上流からの送液により、流路系１（１ａ〜１ｅ）の上流側に圧力が集中するが、下流側を陰圧に保つことで、流路系１（１ａ〜１ｅ）中の液相の流れを改善することができる。減圧の仕方の一例としては、排出部１３に図示しないがシリンジなどを接続し、該シリンジを吸引することで排出側を陰圧に保つことができる。
【００６７】
以上で説明した流路系１（１ａ〜１ｅ）は、単独で使用してもよいが、多数本セットした構成のマルチ流路系（図示せず）を採用してもよい。例えば、導入部１２を共通にして、同一のサンプル溶液を同時に多数の流路系１（１ａ〜１ｅ）へ送液できるようにし、さらには、各流路系の反応部１１１ａ（１１１ｂ）には、異なる種類のターゲット核酸Ｘを保持させておくことによって、網羅的なハイブリダイゼーション検出を同時一斉に行うようにしてもよい。
【００６８】
図１３は、流路系１（１ａ〜１ｅ）を用いるハイブリダイゼーション検出装置の検出部の好適な実施形態の一例を示す図である。
【００６９】
図１３に示された検出部４は、ハイブリダイゼーションを蛍光検出する場合の典型的な構成を備える。ハイブリット形成用ビーズ２上においてハイブリダイゼーションした状態で存在する核酸Ｎ、若しくはプローブ核酸Ｐには、予め蛍光物質が標識されている。
【００７０】
流路系１（１ａ〜１ｅ）のハイブリット形成用ビーズ２が充填されている反応部１１１ａ（１１１ｂ）へ向けて、所定波長の蛍光励起光Ｌを図示しない光源から出射して平行光に途中変換し、反応部１１１ａ（１１１ｂ）の近傍に配置されたレンズ４１によって反応部１１１ａ（１１１ｂ）へ向けて絞り込んで照射する。
【００７１】
これにより、反応部１１１ａ（１１１ｂ）内で励起された蛍光ｆを、前記レンズ４１で平行光に変換し、さらに後方に配置されたレンズ４２で絞り込み、その後方に配置された光ディテクタ４３で検出し、蛍光強度を測定する。なお、本発明に係わる検出部は、この蛍光検出手段に限定されず、核酸Ｎ、若しくはプローブ核酸Ｐが提供する情報種に応じて、これを検出できる構成を採用することが可能である。
【実施例１】
【００７２】
実施例１では、本発明にかかる流路形に充填する多孔質マイクロビーズとして、好適なものを調べた。
【００７３】
＜マイクロビーズの調整＞
まず、逆相性、疎水性、アニオン性のイオン交換性、カチオン性のイオン交換性をそれぞれ持つ多孔質のマイクロビーズ（PORPS、Applied Biosystems）を準備した。それぞれのマイクロビーズの特性を表１に示す。10％エタノール水溶液に、それぞれのマイクロビーズを2.5％で懸濁し、マイクロビーズ懸濁液を調整した。
【表１】
【００７４】
＜マイクロカラムの作製＞
まず、流路系を構成する細管として、内径０．５３ｍｍ、外径０．６８ｍｍ、長さ６ｃｍのフューズド・シリカ・キャピラリー・チューブ（ジーエルサイエンス株式会社製）を用意した。
【００７５】
そして、送液の下流側端部に、孔径１μｍのフィルタをセットした排出部、上流側にはフィルタをセットしない導入部を、それぞれチュービングスリーブ、フェラル、ナットを用いて取り付けた。また、上流側の導入部には、レオダイン型シリンジに対応するフィルポートを取り付け、下流側の排出部にはルアー・ロック・ニードルを取り付けた。
【００７６】
＜送液促進部の形成＞
上記で調整した各種マイクロビーズ懸濁液をマイクロチューブ内に注入した。注入後、マイクロチューブ中に充填されたマイクロビーズのベットを純水で十分洗浄、乾燥した。
【００７７】
＜マイクロカラムのセット＞
前記で作製したマイクロカラムからルアー・ロック・ニードルとフィルポートを取り外し、蛍光顕微鏡のステージであるヒートプレート上に固定し、温度制御を行った。上流側のシリコン・チューブは圧力計に接続し、下流側のシリコン・チューブは廃液貯めにセットした。圧力計は、シリンジ・ポンプにセットしたシリンジと接続し、シリンジ中の液相を圧力計経由でマイクロカラムに注入できるようにした。送液中の内圧を常時モニターした。
【００７８】
＜コンディショニング液・洗浄液・核酸溶液の調整＞
ベットのコンディショニング液として、0.5M塩化ナトリウム水溶液を調整した。洗浄液として、0.1％SDSを含有した0.5M塩化ナトリウム水溶液を調製した。核酸溶液として、5’側をCy3で標識した21-merのポリデオキシヌクレオチドを、5μMの濃度で0.5M塩化ナトリウム水溶液に溶解し、調整した。
【００７９】
＜Cy3標識核酸の各種マイクロビーズへの吸着の測定＞
まず、上記で調整したコンディショニング液700μLをマイクロカラム内へ注入し、マイクロカラムの液相を置換した。次に上記で調整した核酸溶液400μLをマイクロカラム内へ注入し、各種マイクロビーズへ核酸を吸着させた。その後、上記で調整した洗浄液700μLをマイクロカラム内へ注入し、ベットの洗浄を行った。最後に、上記で調整したコンディショニング液700μLを再度マイクロカラム内へ注入し、マイクロカラムの液相を置換した。この間、ヒートプレートを用いて、マイクロカラムを37℃に温度制御した。
【００８０】
最初にコンディショニング液を注入した後と、最後にコンディショニング液を注入した後に、蛍光測定を行った。蛍光測定は、以下のように行った。
【００８１】
多芯の光ファイバー・プローブを用意し、光ファイバーの一部は照明系へ、他は受光系へ分けた。プローブの先端にはレンズを置き、直径500μｍの範囲の照明と受光ができるようにした。照明は、高圧水銀光源からの光を、Cy3用の励起光用の蛍光フィルタを通して、光ファイバーの照明系の方へ入れることにより行った。蛍光の測定は光ファイバーの受光系の方から放射される蛍光を、Cy3用の蛍光用の蛍光フィルタを通して、分光器に導光して行った。
【００８２】
＜結果＞
最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを図１４に示す。570ｎｍ付近にピークを持つスペクトルがCy3に起因する蛍光である。
【００８３】
図１４に示す通り、逆相性のOligoR3（図１４中Ｃ参照）と疎水性のPOROS20HP2（図１４中Ｂ参照）、アニオン性のイオン交換能を持つPOROS20HQ（図１４中Ｄ参照）では、蛍光の増加が確認できる。これにより、逆相性、疎水性、アニオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズには、ポリヌクレオチドが吸着することが分かった。
【００８４】
なお、逆相性のPOROS20R1（図１４中Ａ）では蛍光の減少がみられたが、検討の結果、ポリヌクレオチドの吸着は認められるものの、洗浄液中のSDSの作用によって、POROS20R1自信の蛍光が消失していることが分かった。
【００８５】
一方、カチオン性のイオン交換能を持つPOROS20HS1（図１４中Ｅ参照）、POROS20S（図１４中Ｆ参照）、POROS10S（図１４中Ｇ参照）では、蛍光変化はほとんど確認できなかった。これにより、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズには、ポリヌクレオチドがほとんど吸着しないことが分かった。
【００８６】
実施例１では、本発明に係るマイクロ流路系の送液促進部に充填するマイクロビーズとしては、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズが最も好適であることが分かった。
【実施例２】
【００８７】
実施例２では、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズが、本発明に係るマイクロ流路系を用いたハイブリット形成へ影響がないか調べた。
【００８８】
＜マイクロビーズの調整、及び送液促進部の形成＞
カチオン性のイオン交換能を持つPOROS20Sを用い、実施例１と同様の方法により、POROS20S懸濁液を調整した。実施例１と同様の方法でマイクロカラムを作製し、調整したPOROS20S懸濁液をマイクロチューブ内に注入した。注入後、マイクロチューブ中に充填されたPOROS20Sのベットを純水で十分洗浄、乾燥した。
【００８９】
＜ポリヌクレオチド結合マイクロビーズの調整＞
Streptavidin Coated Microsphere plain（直径６μｍ、Polysciences）の水溶液に、５'末端にビオチンを修飾したデオキシチミジン（ｄＴ）のポリヌクレオチド（２１ｍｅｒ）を加えて、アビジン−ビオチン結合によりポリｄＴが固定されたビーズ（以下、「ポリｄＴビーズ」と称する。）を調製した。
【００９０】
＜ハイブリット形成部の形成＞
調整したポリｄＴビーズを、実施例１と同様の方法で上記で形成した送液促進部の上流へ注入し、ハイブリット形成部を形成し、２層のマイクロカラムとした。
【００９１】
＜コンディショニング液・洗浄液・核酸溶液の調整＞
実施例１と同様に、コンディショニング液、洗浄液を調整した。また、核酸溶液として、３’末端をCy3で標識した120-merのポリ（ｄＡ）のポリデオキシヌクレオチドを、5μMの濃度で0.5M塩化ナトリウム水溶液に溶解し、調整した。
【００９２】
＜ハイブリット形成、及び蛍光測定＞
実施例１と同様の方法で、最初のコンディショニング液の注入、核酸溶液の注入、洗浄液の注入、最後のコンディショニング液の注入を順番に行った。最初にコンディショニング液を注入した後と、最後にコンディショニング液を注入した後に、核酸溶液中のCy3標識したポリｄＡ配列とポリｄＴビーズ上ポリｄＴ配列間のハイブリット形成を、実施例１と同様の方法で蛍光測定した。
【００９３】
＜結果＞
最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを図１５に示す。図１５に示す通り、Cy3に起因する蛍光の増加が観察された。これにより、ハイブリット形成部において、ハイブリット形成が行われたことが確認できた。
【００９４】
実施例２では、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを用いても、ハイブリット形成に影響を与えないことが分かった。
【００９５】
実施例１、及び２の結果から、ハイブリット形成部を、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを充填した送液促進部で挟み込み、３層化することも可能であると示唆された。即ち、ハイブリット形成部の上流に送液促進部を形成しても、核酸がほとんど吸着しないため、ハイブリット形成部においての核酸濃度や量の低下はないと考えられる。
【実施例３】
【００９６】
実施例３では、SDSを常時含んだ液相を用いる場合のハイブリット形成への影響、及びハイブリット形成部に、ポリｄＴビーズとカチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを混合したベットを用いた場合のハイブリット形成への影響をそれぞれ調べた。
【００９７】
＜混合マイクロビーズ懸濁液の調整＞
実施例２と同様の方法でポリｄＴビーズを、実施例１と同様の方法により、カチオン性のイオン交換能を持つPOROS20S懸濁液をそれぞれ調整した。調整したそれぞれの懸濁液を、ポリｄＴビーズの重量比が、0％、25％、50％、100％となるように混合した。
【００９８】
＜送液促進部・ハイブリット形成部の形成＞
実施例１と同様の方法でマイクロカラムを作製し、調整したPOROS20S懸濁液をマイクロチューブ内に注入した。注入後、マイクロチューブ中に充填されたPOROS20Sのベットを純水で十分洗浄、乾燥して、送液促進部を形成した。
【００９９】
調整した混合マイクロビーズ懸濁液を、上記で形成した送液促進部の上流へ、実施例１と同様の方法で注入し、ハイブリット形成部を形成し、２層のマイクロカラムとした。
【０１００】
＜コンディショニング液・洗浄液・核酸溶液の調整＞
コンディショニング液、及び洗浄液として、0.1％SDSを含有した0.5M塩化ナトリウム水溶液を調製した。核酸溶液として、３’末端をCy3で標識した120-merのポリ（ｄＡ）のポリデオキシヌクレオチドを、5μMの濃度で、0.1％SDSを含有する0.5M塩化ナトリウム水溶液に溶解し、調整した。
【０１０１】
＜ハイブリット形成、及び蛍光測定＞
実施例１と同様の方法で、コンディショニング液の注入、核酸溶液の注入、洗浄液の注入を順番に行った。コンディショニング液を注入した後と、洗浄液を注入した後に、核酸溶液中のCy3標識したポリｄＡ配列とポリｄＴビーズ上ポリｄＴ配列間のハイブリット形成を、実施例１と同様の方法で蛍光測定した。
【０１０２】
＜結果＞
コンディショニング液注入後の蛍光と、洗浄液注入後の蛍光との差スペクトルを図１６に示す。図１６に示す通り、Cy3に起因する蛍光の増加が観察された。これにより、ハイブリット形成部において、ハイブリット形成が行われたことが確認できた。即ち、SDSを常時含んだ液相を用いても、ハイブリット形成に影響はないことが分かった。
【０１０３】
また、図１６に示す通り、蛍光強度は、ポリｄＴビーズの含有量に従って増加する傾向がみられた（図１６中Ａ〜Ｄ参照）。そこで、ポリｄＴビーズの含有量に対しての570ｎｍでの蛍光の増加を図１７にプロットしたところ、ほぼ比例していることが分かった。即ち、ハイブリット形成部に、ポリｄＴビーズとカチオン性のイ
オン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを混合したベットを用いても、ハイブリット形成に影響を与えないことが分かった。
【０１０４】
実施例３では、本発明に係るマイクロ流路系において、SDSを常時含んだ液相を用いることが可能であることが確認できた。このことから、蛍光測定のための液相の置換が不要となり、総測定時間を大幅に短縮できることが明らかとなった。
【０１０５】
また、本発明に係るマイクロ流路系のハイブリット形成部において、ポリｄＴビーズとカチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを混合したベットを用いることが可能であることも確認できた。このように、多孔質マイクロビーズを、送液促進部だけでなく、ハイブリット形成部へも用いることができると、送液促進だけでなく、試料に起因する目詰まりを減少できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明に係る流路系は、多孔質マイクロビーズへの核酸の吸着を防止できるため、流路内でのハイブリダイゼーション等の反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能となる。また、多孔質マイクロビーズを用いることで、マイクロ流路内での目詰まり、及びマイクロ流路内圧上昇の防止ができる。そのため、高流量送液が可能である。特に、様々な浮遊物、長鎖の核酸などを含む全ＲＮＡサンプルの送液にも有効に利用できる。更に、送液する全溶液に界面活性作用、及び核酸分解酵素失活作用を有する物質を含ませれば、総測定時間の短縮を図ることができ、RNaseやDNaseなどの核酸分解酵素による影響を抑制し、効率的で安定した測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本発明に係る流路系の一実施形態を示す図である。
【図２】流路系１内に充填されているハイブリット形成用ビーズ２１の表面上の物質構成の一例を模式的に示す図である。
【図３】ハイブリット形成用ビーズ２１に保持された核酸鎖Ｎとターゲット核酸Ｘがハイブリット形成する様子を模式的に示す図である。
【図４】図２とは異なる実施形態のハイブリット形成用ビーズ２２の表面上の物質構成を模式的に示す図である。
【図５】ハイブリット形成用ビーズ２２に保持されたリンカーＬとターゲット核酸Ｘが相補結合する様子を模式的に示す図である。
【図６】ハイブリット形成用ビーズ２２にリンカーＬを介して保持された状態のターゲット核酸Ｘとプローブ核酸Ｙがハイブリダイゼーションする様子を模式的に示す図である。
【図７】本発明に係る流路系１を用いたアッセイの工程例を示す図である。
【図８】本発明に係る流路系１ａの一実施形態を示す図である。
【図９】図８とは異なる実施形態の流路系１ｂを示す図である。
【図１０】図８、及び図９とは異なる実施形態の流路系１ｃを示す図である。
【図１１】図８、図９、及び図１０とは異なる実施形態の流路系１ｄを示す図である。
【図１２】図８、図９、図１０、及び図１１とは異なる実施形態の流路系１ｅを示す図である。
【図１３】流路系１（１ａ〜１ｅ）を用いるハイブリダイゼーション検出装置の検出部の好適な実施形態の一例を示す図である。
【図１４】実施例１において、最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを示す図面代用グラフである。
【図１５】実施例２において、最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを示す図面代用グラフである。
【図１６】実施例３において、コンディショニング液注入後の蛍光と、洗浄液注入後の蛍光との差スペクトルを示す図面代用グラフである。
【図１７】実施例３において、ポリｄＴビーズの含有量に対しての570ｎｍでの蛍光の増加を示す図面代用グラフである。
【符号の説明】
【０１０８】
１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ マイクロ流路系
１１ 細管
１２ 導入部
１３ 排出部
２、２１、２２ ハイブリット形成用ビーズ
３ 多孔質マイクロビーズ
１１１、１１１ａ、１１１ｂ 反応部
１１２、１１２ａ、１１２ｂ 送液促進部
Ｎ 核酸鎖
Ｐ プローブ核酸
Ｘ ターゲット核酸
Ｌ リンカー
Ｆ 蛍光物質
Ｓ１ 第１サンプル液
Ｓ２ 第２サンプル液
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出に係わる技術に関する。より詳しくは、流路系内でハイブリダイゼーションを進行させ、これを検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析、遺伝子ネットワーク解明等に利用され得るバイオアッセイ技術の開発が進んでいる。例えば、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれる集積基板を用いた方法が挙げられる。
【０００３】
このＤＮＡチップやタンパク質を集積したプロテインチップなどに代表されるようなセンサーチップ技術は、検出用物質（プローブと称されることが多い。）とターゲット物質との間の特異的な相互作用を利用して、ターゲット物質の含有量、構成成分、機能等を調べる方法である。
【０００４】
最近では、検出用物質とターゲット物質との間の特異的な相互作用を、流路やキャピラリーを利用して行う技術が提案されている。例えば、特許文献１には、ポリヌクレオチドの増幅を行う部分と、検出用オリゴヌクレオチドが固定されている多孔質層を有するハイブリダイゼーション部分とが、流路によって連結されているポリヌクレオチドの分析用部材が開示されている。
【０００５】
特許文献２には、毛細管状の流路の内壁にプローブ化合物を固定して、被検ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションを進行させるポリヌクレオチドの分析方法が開示されている。
【０００６】
特許文献３には、５種の異なるＤＮＡプローブが担持された各マイクロビーズを、マイクロアレイ容器の流路に充填し、検体とビーズに固定されたＤＮＡプローブとの間で選択的にハイブリダイゼーションを形成させる方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００５−１３０７９５号公報。
【特許文献２】特開２００４−１２１２２６号公報。
【特許文献３】特開２００２−３０３６２７号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、流路やキャピラリーなどの細い流路内において、ハイブリット形成を進行させる場合、反応効率をよくするために多孔質のマイクロビーズを用いることが多い。しかし、多孔質のマイクロビーズを用いると、送液中のターゲット核酸が多孔質マイクロビーズに吸着することがある。そのため、ターゲット検出の際、マイクロビーズに固定された核酸鎖とのハイブリット形成なのか、多孔質マイクロビーズへの吸着なのかの区別が困難となる。
【０００８】
また、ターゲット核酸が多孔質マイクロビーズに吸着してしまうと、マイクロビーズ上の核酸鎖にターゲット核酸が十分な濃度や量で行き届かず、反応効率が低下するばかりか、反応条件が不安定となる問題もあった。
【０００９】
そこで、本発明は、多孔質マイクロビーズへの核酸の吸着を防止し、反応効率の上昇、及び反応条件を安定させることを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者は、前記課題を解決するために、充填するビーズの好適な条件などについて鋭意研究した結果、反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能な新規流路系などを見出した。
【００１１】
本発明では、ビーズが充填された細管からなる流路系であって、核酸鎖が固定されているハイブリット形成用ビーズと、カチオン性イオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズと、が少なくとも充填されたカラム層を有する流路系を提供する。
【００１２】
前記多孔質マイクロビーズは、カチオン性イオン交換能を持つものであれば特に限定されないが、好適な一例としては、パフュージョンクロマトグラフィー粒子が挙げられる。
【００１３】
前記ハイブリット形成用ビーズ上では、固定された前記核酸鎖と、ターゲット核酸とが相補結合するハイブリット形成を進行させることができる。
【００１４】
前記核酸鎖を、同種塩基配列を有するリンカーとすれば、前記ハイブリット形成用ビーズ上では、固定された該リンカーとターゲット核酸とが相補結合する第１ハイブリット形成と、該ターゲット核酸の一本鎖部分と送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、を進行させることもできる。
【００１５】
前記リンカーの同種塩基配列の一例としては、ポリＴ又はポリＵ等が挙げられる。この場合、流路系内のハイブリット形成用ビーズ上では、該ポリＴ又はポリＵと全ＲＮＡサンプル中のポリＡテール部分を有するｍＲＮＡとが相補結合する第１ハイブリット形成と、該ｍＲＮＡと送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、を進行させることができる。
【００１６】
本発明に係る流路系は、前記ハイブリット形成用ビーズが少なくとも充填されている反応部と、前記多孔質マイクロビーズが充填されている送液促進部と、が順に層をなすように形成してもよい。一例を挙げると、前記反応部と、前記反応部の上流領域に設けられた前記送液促進部と、前記反応部の下流領域に設けられた前記送液促進部と、からなる３層構造となるように形成することができる。
【００１７】
また、本発明に係る流路系は、前記ハイブリット形成用ビーズと、前記多孔質マイクロビーズと、を混合充填して形成してもよい。
【００１８】
さらに、本発明に係る流路系は、前記ハイブリット形成ビーズと前記多孔質マイクロビーズとが混合充填されている反応部と、前記多孔質マイクロビーズが充填されている送液促進部と、が順に層をなすように形成してもよい。一例を挙げると、前記反応部と、前記反応部の上流領域に設けられた前記送液促進部と、前記反応部の下流領域に設けられた前記送液促進部と、からなる３層構造となるように形成することができる。
【００１９】
本発明に係る流路系に送液する全溶液は、界面活性作用及び核酸分解酵素失活作用を有する物質を同濃度含む溶液が望ましい。前記物質の一例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を挙げることができる。
【００２０】
本発明に係る流路系は、ハイブリダイゼーション検出装置に用いることができる。例えば、本発明に係る流路系と、前記ハイブリット形成用ビーズ上におけるハイブリット形成を検出する検出部と、を少なくとも備えるハイブリダイゼーション検出装置を提供できる。
【００２１】
以下、本発明で使用する技術用語の定義付けを行う。「ターゲット核酸」とは、サンプル溶液中に含まれる核酸であって、本発明に係る流路系を用いて、その含有量、構成成分、機能などの分析を行うことを目的とする核酸をいう。「塩基配列」とは、重合している２以上の塩基を意味する。「リンカー」とは、ビーズに対して核酸を保持するために利用される所定配列の核酸である。
【００２２】
「プローブ核酸」とは、ハイブリダイゼーション検出に有用な情報を提供できる核酸であって、例えば、蛍光物質が標識された一本鎖核酸、あるいは放射性物質が標識された一本鎖核酸などを挙げることができ、前者では励起蛍光を検出し、後者では放射線を検出することによって、ハイブリダイゼーションを検出できる。
【００２３】
「ポリ」とは、塩基が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＴ」とは塩基チミン（Ｔ）が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＵ」とは、塩基ウラシル（Ｕ）が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＡテール（poli(A)tail）」とは、ｍＲＮＡの３’末端に付加されているアデニノシンの鎖である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る流路系は、多孔質マイクロビーズへの核酸の吸着を防止できるため、流路内でのハイブリダイゼーション等の反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２６】
まず、図１を用いて、本発明に係る流路系の構成を説明する。図１は、本発明に係る流路系の一実施形態を示す図である。
【００２７】
この図１に符号１で示す流路系は、大別して、サンプル溶液の流路となる口径０．５ｍｍ程度の細管１１と、該細管１１の一端に形成された導入部１２と、該細管１１の他端側に形成された排出部１３と、から構成されている。なお、図１に示された矢印Ｗは、サンプル溶液等の流れる方向を示している。
【００２８】
この図示された流路系１には、導入部１２に近接する細管１１部分の内部に微小粒径のハイブリット形成用ビーズ２が多数充填されている。ハイブリット形成用ビーズ２には、核酸鎖Ｎが固定されている（後述の図２参照）。このハイブリット形成用ビーズ２上では、ハイブリダイゼーションなどの所望の相互作用が進行する。
【００２９】
ハイブリット形成用ビーズ２のビーズベット長Ｂは、自由に設計することができる。一般に、ビーズベット長Ｂが長くなるほど、マイクロ流路内圧も上昇するので、好適な一例を挙げると、ビーズベット長４ｍｍ以下、より好ましくは２ｍｍ以下である。
【００３０】
ハイブリット形成用ビーズ２の下流側（即ち、排出部１３側）に多孔質マイクロビーズ３が多数充填されている。この多孔質マイクロビーズ３は、送液されてくるサンプル溶液や洗浄用のバッファー溶液などの送液速度を促進するための役割を担う。
【００３１】
多孔質マイクロビーズ３は、送液されるサンプル溶液中のターゲット核酸を吸着しないものが望ましい。ターゲット核酸が多孔質マイクロビーズ３に吸着してしまうと、ターゲットの検出の際、ハイブリット形成用ビーズ２に固定された核酸鎖Ｎとのハイブリット形成なのか、多孔質マイクロビーズ３への吸着なのかの区別が困難となる。また、ターゲット核酸が多孔質マイクロビーズに吸着してしまうと、マイクロビーズ上の核酸鎖に、ターゲット核酸が十分な濃度や量で行き届かず、反応効率が著しく低下し、更に、反応条件も不安定となる。
【００３２】
本発明では、多孔質マイクロビーズ３として、カチオン性イオン交換能を持つものを用いることにより、ターゲット核酸の吸着を防止することに成功した。そのため、流路系１内での反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能となった。
【００３３】
多孔質マイクロビーズ３は、送液を促進し、かつ、カチオン性イオン交換能を有するものであれば特に限定されないが、好適な一例としては、パフュージョンクロマトグラフィー粒子を挙げることができる。
【００３４】
このパフュージョンクロマトグラフィー粒子の典型的なものは、貫通孔（Through pore）と称される大きなポアと吸着孔（Diffusive pore）と称される小さなポアを持っている。これにより、バッファー溶液に溶け込んだ分子は、前記貫通孔を通りぬけ、吸着孔の隅々まで運ばれる。このため、分子と充填材表面の官能基との接触面積が大きくなり、バッファーの流れと官能基との距離は充填材の粒径に関係がなく非常に小さくなる（１μｍ以下）ので、高流速で、かつ低圧の送液を行うことができる。
【００３５】
次に、図２から図６を用いて、ハイブリット形成用ビーズ２上におけるハイブリット形成の様子を説明する。
【００３６】
図２は、流路系１内に充填されているハイブリット形成用ビーズ２１の表面上の物質構成の一例を模式的に示す図である。
【００３７】
ハイブリット形成用ビーズ２１は、例えばポリスチレンなどの材料で形成された微小なマイクロビーズである。このハイブリット形成用ビーズ２１の表面は、核酸の一末端を化学的に結合させるのに好適な構成を備えている。
【００３８】
ハイブリット形成用ビーズ２１は、該ハイブリット形成用ビーズ２１の表面に対して、例えば、アビジン-ビオチン結合やカップリング反応（例えば、ジアゾカップリング反応）などを介して結合された核酸鎖Ｎを備えている。この状態で、ハイブリット形成用ビーズ２１を流路系１に充填する（図１参照）。
【００３９】
核酸鎖Ｎは、ハイブリット形成用ビーズ２１に保持された状態で、流路系１内において待ち受けており、送液されてくるサンプル液中の相補的なターゲット核酸Ｘとハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションの様子を、図３に示す。
【００４０】
図３では、ハイブリット形成用ビーズ２１に保持された状態の核酸鎖Ｎの一本鎖部分に対して、ターゲット核酸Ｘがハイブリダイゼーションし、二本鎖を形成している様子を模式的に示す。図示しないが、核酸鎖Ｎ、又はターゲット核酸Ｘに、予めハイブリダイゼーション検出に利用できる蛍光物質、あるいは放射性物質などを標識（ラベル）しておくことで、該標識物質から得られる光情報や放射線情報を捕捉することによって、前記ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００４１】
図４は、図２とは異なる実施形態のハイブリット形成用ビーズ２２の表面上の物質構成を模式的に示す図である。
【００４２】
このハイブリット形成用ビーズ２２は、該ハイブリット形成用ビーズ２２の表面に対して、例えば、アビジン-ビオチン結合やカップリング反応（例えば、ジアゾカップリング反応）などを介して結合されたオリゴ核酸であるリンカーＬを備えている。該リンカーＬは、ターゲット核酸Ｘと相補結合する塩基配列を有していれば特に限定されないが、一例を挙げると、同種塩基配列であるポリＴ又はポリＵを有するものが好適である。
【００４３】
図５は、リンカーＬとターゲット核酸Ｘが相補結合する様子を模式的に示す図である。例えば、図５に示すように、リンカーＬがポリＴ塩基配列部分を有する場合、ターゲット核酸ＸのポリＡ部位がポリＡセレクションプロセスに基づいて、前記ポリＴ部分と相補結合する。ターゲット核酸Ｘの好適例の一つとして、ポリＡテールを有するｍＲＮＡを挙げることができる。
【００４４】
前記ターゲット核酸Ｘは、リンカーＬを介してハイブリット形成用ビーズ２２に保持された状態で、流路系１内において待ち受けており、送液されてくるサンプル溶液中の相補的なプローブ核酸Ｐとのハイブリダイゼーションを進行する。ハイブリダイゼーションの様子を図６に示す。
【００４５】
図６は、ハイブリット形成用ビーズ２２にリンカーＬを介して保持されたターゲット核酸Ｘの一本鎖部分に対して、プローブ核酸Ｐがハイブリダイゼーションし、二本鎖を形成している様子を模式的に示している。
【００４６】
この図６に示すように、プローブ核酸Ｐには、予めハイブリダイゼーション検出に利用できる蛍光物質Ｆ、あるいは放射性物質（図示せず）などを標識（ラベル）しておくことで、該標識物質から得られる光情報や放射線情報を捕捉することによって、前記ハイブリダイゼーションを検出することが可能となる。
【００４７】
このようなハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、被験者の細胞などから抽出されたｍＲＮＡをハイブリット形成用ビーズ２２に、リンカーＬを介して保持しておき、このｍＲＮＡに対して、公知の疾病発現原因遺伝子に係わる塩基配列を有するプローブ核酸Ｐがハイブリダイズするか否かを判定する目的の検査などに利用できる。
【００４８】
以上のアッセイは、例えば、図７の工程図に示された方法に基づいて実施できる。まず、流路系１を構成する細管１１の所定位置に向けて、パフュージョンクロマトグラフィー粒子のような多孔質マイクロビーズ３を充填する（図７中の（Ｉ）参照）。
【００４９】
次に、多孔質マイクロビーズ３の上流側に向けて、リンカーＬが固定化されているハイブリット形成用ビーズ２２を充填する（図７中の（II）参照）。
【００５０】
そして、ハイブリット形成用ビーズ２２に向けて、ターゲット核酸Ｘを含む第１サンプル溶液Ｓ１を送液する（図７中の（III）参照）。このとき、ハイブリット形成用ビーズ２２に保持されているリンカーＬ（例えば、ポリＴ）とターゲット核酸Ｘ（例えば、ポリＡテール部分）とが、相補結合する（第１ハイブリット形成、図７中の（IV）参照）。
【００５１】
続いて、プローブ核酸Ｐを含有する第２サンプル溶液Ｓ２を、前記第１ハイブリット形成後のハイブリット形成用ビーズ２２へ向けて送液する（図７中の（Ｖ）参照）。そして、所定温度、ｐＨ条件で所定時間、ターゲット核酸Ｘとプローブ核酸Ｐとの間のハイブリダイゼーションを進行させる（第２ハイブリット形成、図７中の（VI）参照）。このときのプローブ核酸Ｐから得られる情報（例えば、標識された蛍光物質からの励起蛍光情報）により、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００５２】
以上説明した本発明に係る流路系１は、図８に示すように、ハイブリット形成用ビーズ２が充填されている反応部１１１ａと、多孔質マイクロビーズ３が充填されている送液促進部１１２ａが順に層をなすように形成している（図８中符号１ａで示す）が、その構成は限定されない。図９から図１１を用いて、本発明に係る流路系１への各ビーズの充填方法を例示する。
【００５３】
図９は、図８とは異なる実施形態の流路系１ｂを示す図である。本実施形態に係る流路系１ｂは、ハイブリット形成用ビーズ２を充填した反応部１１１ａと、反応部１１１ａの上流領域（導入部１２側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ａ１と、反応部１１１ａの下流領域（排出部１３側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ａ２と、からなる３層構造をしている。即ち、反応部１１１ａの両側を、送液促進部１１２ａ１、１１２ａ２で挟み込んだ構成となっている。
【００５４】
送液促進部１１２ａ１、１１２ａ２を設けることにより、送液促進だけでなく、以下の効果も期待できる。一般に、導入部１２や排出部１３の近傍の細管部分では、外部ポンプ等との接続のためのナットなどの諸部材が設けられることが多い。そのため、この部分に反応部１１１ａを設けると、光などの検出や測定などが困難となる。しかし、送液促進部１１２ａ１、１１２ａ２を反応部１１１ａの下流側、及び上流側に設けることによって、検出、測定などの対象となる反応部１１１ａが流路系１の中央部近くに配置できるようになるので、検出、測定などが容易になるという利点が生まれる。
【００５５】
また、反応部１１１ａの両側を、送液促進部１１２ａ１、１１２ａ２で挟み込む構成をとることで、流路系１ｂ内には、隙間なくビーズを充填することができる。流路系１ｂ内に隙間なくビーズを充填することで、輸送などによる振動の影響も受け難くすることができる。
【００５６】
図１０は、図８、及び図９とは異なる実施形態の流路系１ｃを示す図である。本実施形態に係る流路系１ｃには、ハイブリット形成用ビーズ２と多孔質マイクロビーズ３を混合充填している。
【００５７】
本発明に用いる多孔質マイクロビーズ３は、核酸を吸着しないため、ハイブリット形成用ビーズ２と混合しても、ハイブリット形成用ビーズ２上でのハイブリット形成を阻害しない。従って、ハイブリット形成用ビーズ２と多孔質マイクロビーズ３を混合充填することにより、流路系１ｃ内の反応効率の低下、及び反応条件の不安定化を招くことなく、送液促進効果を得ることができる。
【００５８】
図８で示した実施形態と同様に、ハイブリット形成用ビーズ２と多孔質マイクロビーズ３を混合充填した反応部１１１ｂの下流領域（排出部１３側）に、多孔質マイクロビーズ３を充填した送液促進部１１２ｂを設け、反応部１１１ｂと送液促進部１１２ｂが順に層をなすように形成してもよい（図１１参照）。
【００５９】
また、図９で示した実施形態と同様に、前記反応部１１１ｂと、反応部１１１ｂの上流領域（導入部１２側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ｂ１と、反応部１１１ｂの下流領域（排出部１３側）に多孔質マイクロビーズ３を充填して設けられた送液促進部１１２ｂ２と、からなる３層構造としてもよい（図１２参照）。即ち、反応部１１１ｂの両側を、送液促進部１１２ｂ１、１１２ｂ２で挟み込んだ構成をとることも自由である。
【００６０】
送液促進部１１２ｂ１、１１２ｂ２を設けることにより、送液促進だけでなく、上記と同様の効果も期待できる。即ち、検出、測定などの対象となる反応部１１１ｂが流路系１の中央部近くに配置できるようになり、検出、測定などが容易になるという利点、及び、流路系１ｅ内に隙間なくビーズを充填することで、輸送などによる振動の影響を受け難くなるという利点が生じる。
【００６１】
本発明に係る流路系１（１ａ〜１ｅ）に送液するサンプル溶液などの溶液は、ハイブリット形成等に影響を与えない限り、目的に合わせてあらゆる物質を含ませることができる。例えば、流路系１（１ａ〜１ｅ）に送液する溶液全部に、界面活性作用を有する物質を含ませれば、マイクロビーズへの核酸等の吸着を防止することができるため、洗浄等を行う必要がなく、液相の置換の必要もなくなる。そのため、総測定時間の短縮を図ることができる。
【００６２】
また、核酸分解酵素失活作用を有する物質を含ませれば、RNaseやDNaseなどの核酸分解酵素による影響を抑制することができる。そのため、効率の良い、安定した測定を行うことができる。
【００６３】
界面活性作用及び核酸分解酵素失活作用を有する物質の好適な一例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」とする。）を挙げることができる。ＳＤＳは、マイクロビーズへの核酸等の吸着を防止する効果があるため、サンプル液などの送液後に、洗浄を行う必要がない。また、後述の実施例３で説明するとおり、ＳＤＳは、蛍光測定に影響を及ぼさないため、蛍光測定時に、ＳＤＳを含まない液相に置換する必要がない。そのため、RNaseやDNaseなどの核酸分解酵素による影響を抑制し、安定した測定を行うことができる。
【００６４】
本発明に係る流路系１（１ａ〜１ｅ）へサンプル液を送液する場合、そのまま送液することも可能であるが、サンプル液を濾過した後に流路系１（１ａ〜１ｅ）へ送液することがより好ましい。浮遊物質などを除去するためである。サンプル液中の浮遊物質などを予め濾過しておけば、流路系１（１ａ〜１ｅ）の目詰まりを防止できる。
【００６５】
濾過に用いるフィルタは、浮遊物質や長鎖の核酸を除去できるものが望ましい。好適な一例としては、その孔径が０．６５μｍ以下、より好ましくは０．１μｍ以下のフィルタを挙げることができる。フィルタ濾過する前に、濾過の精度を上げるために、遠心分離を行うことも自由である。
【００６６】
本発明に係る流路系１（１ａ〜１ｅ）では、排出部１３において、減圧を行うことも可能である。一般に、上流からの送液により、流路系１（１ａ〜１ｅ）の上流側に圧力が集中するが、下流側を陰圧に保つことで、流路系１（１ａ〜１ｅ）中の液相の流れを改善することができる。減圧の仕方の一例としては、排出部１３に図示しないがシリンジなどを接続し、該シリンジを吸引することで排出側を陰圧に保つことができる。
【００６７】
以上で説明した流路系１（１ａ〜１ｅ）は、単独で使用してもよいが、多数本セットした構成のマルチ流路系（図示せず）を採用してもよい。例えば、導入部１２を共通にして、同一のサンプル溶液を同時に多数の流路系１（１ａ〜１ｅ）へ送液できるようにし、さらには、各流路系の反応部１１１ａ（１１１ｂ）には、異なる種類のターゲット核酸Ｘを保持させておくことによって、網羅的なハイブリダイゼーション検出を同時一斉に行うようにしてもよい。
【００６８】
図１３は、流路系１（１ａ〜１ｅ）を用いるハイブリダイゼーション検出装置の検出部の好適な実施形態の一例を示す図である。
【００６９】
図１３に示された検出部４は、ハイブリダイゼーションを蛍光検出する場合の典型的な構成を備える。ハイブリット形成用ビーズ２上においてハイブリダイゼーションした状態で存在する核酸Ｎ、若しくはプローブ核酸Ｐには、予め蛍光物質が標識されている。
【００７０】
流路系１（１ａ〜１ｅ）のハイブリット形成用ビーズ２が充填されている反応部１１１ａ（１１１ｂ）へ向けて、所定波長の蛍光励起光Ｌを図示しない光源から出射して平行光に途中変換し、反応部１１１ａ（１１１ｂ）の近傍に配置されたレンズ４１によって反応部１１１ａ（１１１ｂ）へ向けて絞り込んで照射する。
【００７１】
これにより、反応部１１１ａ（１１１ｂ）内で励起された蛍光ｆを、前記レンズ４１で平行光に変換し、さらに後方に配置されたレンズ４２で絞り込み、その後方に配置された光ディテクタ４３で検出し、蛍光強度を測定する。なお、本発明に係わる検出部は、この蛍光検出手段に限定されず、核酸Ｎ、若しくはプローブ核酸Ｐが提供する情報種に応じて、これを検出できる構成を採用することが可能である。
【実施例１】
【００７２】
実施例１では、本発明にかかる流路形に充填する多孔質マイクロビーズとして、好適なものを調べた。
【００７３】
＜マイクロビーズの調整＞
まず、逆相性、疎水性、アニオン性のイオン交換性、カチオン性のイオン交換性をそれぞれ持つ多孔質のマイクロビーズ（PORPS、Applied Biosystems）を準備した。それぞれのマイクロビーズの特性を表１に示す。10％エタノール水溶液に、それぞれのマイクロビーズを2.5％で懸濁し、マイクロビーズ懸濁液を調整した。
【表１】
【００７４】
＜マイクロカラムの作製＞
まず、流路系を構成する細管として、内径０．５３ｍｍ、外径０．６８ｍｍ、長さ６ｃｍのフューズド・シリカ・キャピラリー・チューブ（ジーエルサイエンス株式会社製）を用意した。
【００７５】
そして、送液の下流側端部に、孔径１μｍのフィルタをセットした排出部、上流側にはフィルタをセットしない導入部を、それぞれチュービングスリーブ、フェラル、ナットを用いて取り付けた。また、上流側の導入部には、レオダイン型シリンジに対応するフィルポートを取り付け、下流側の排出部にはルアー・ロック・ニードルを取り付けた。
【００７６】
＜送液促進部の形成＞
上記で調整した各種マイクロビーズ懸濁液をマイクロチューブ内に注入した。注入後、マイクロチューブ中に充填されたマイクロビーズのベットを純水で十分洗浄、乾燥した。
【００７７】
＜マイクロカラムのセット＞
前記で作製したマイクロカラムからルアー・ロック・ニードルとフィルポートを取り外し、蛍光顕微鏡のステージであるヒートプレート上に固定し、温度制御を行った。上流側のシリコン・チューブは圧力計に接続し、下流側のシリコン・チューブは廃液貯めにセットした。圧力計は、シリンジ・ポンプにセットしたシリンジと接続し、シリンジ中の液相を圧力計経由でマイクロカラムに注入できるようにした。送液中の内圧を常時モニターした。
【００７８】
＜コンディショニング液・洗浄液・核酸溶液の調整＞
ベットのコンディショニング液として、0.5M塩化ナトリウム水溶液を調整した。洗浄液として、0.1％SDSを含有した0.5M塩化ナトリウム水溶液を調製した。核酸溶液として、5’側をCy3で標識した21-merのポリデオキシヌクレオチドを、5μMの濃度で0.5M塩化ナトリウム水溶液に溶解し、調整した。
【００７９】
＜Cy3標識核酸の各種マイクロビーズへの吸着の測定＞
まず、上記で調整したコンディショニング液700μLをマイクロカラム内へ注入し、マイクロカラムの液相を置換した。次に上記で調整した核酸溶液400μLをマイクロカラム内へ注入し、各種マイクロビーズへ核酸を吸着させた。その後、上記で調整した洗浄液700μLをマイクロカラム内へ注入し、ベットの洗浄を行った。最後に、上記で調整したコンディショニング液700μLを再度マイクロカラム内へ注入し、マイクロカラムの液相を置換した。この間、ヒートプレートを用いて、マイクロカラムを37℃に温度制御した。
【００８０】
最初にコンディショニング液を注入した後と、最後にコンディショニング液を注入した後に、蛍光測定を行った。蛍光測定は、以下のように行った。
【００８１】
多芯の光ファイバー・プローブを用意し、光ファイバーの一部は照明系へ、他は受光系へ分けた。プローブの先端にはレンズを置き、直径500μｍの範囲の照明と受光ができるようにした。照明は、高圧水銀光源からの光を、Cy3用の励起光用の蛍光フィルタを通して、光ファイバーの照明系の方へ入れることにより行った。蛍光の測定は光ファイバーの受光系の方から放射される蛍光を、Cy3用の蛍光用の蛍光フィルタを通して、分光器に導光して行った。
【００８２】
＜結果＞
最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを図１４に示す。570ｎｍ付近にピークを持つスペクトルがCy3に起因する蛍光である。
【００８３】
図１４に示す通り、逆相性のOligoR3（図１４中Ｃ参照）と疎水性のPOROS20HP2（図１４中Ｂ参照）、アニオン性のイオン交換能を持つPOROS20HQ（図１４中Ｄ参照）では、蛍光の増加が確認できる。これにより、逆相性、疎水性、アニオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズには、ポリヌクレオチドが吸着することが分かった。
【００８４】
なお、逆相性のPOROS20R1（図１４中Ａ）では蛍光の減少がみられたが、検討の結果、ポリヌクレオチドの吸着は認められるものの、洗浄液中のSDSの作用によって、POROS20R1自信の蛍光が消失していることが分かった。
【００８５】
一方、カチオン性のイオン交換能を持つPOROS20HS1（図１４中Ｅ参照）、POROS20S（図１４中Ｆ参照）、POROS10S（図１４中Ｇ参照）では、蛍光変化はほとんど確認できなかった。これにより、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズには、ポリヌクレオチドがほとんど吸着しないことが分かった。
【００８６】
実施例１では、本発明に係るマイクロ流路系の送液促進部に充填するマイクロビーズとしては、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズが最も好適であることが分かった。
【実施例２】
【００８７】
実施例２では、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズが、本発明に係るマイクロ流路系を用いたハイブリット形成へ影響がないか調べた。
【００８８】
＜マイクロビーズの調整、及び送液促進部の形成＞
カチオン性のイオン交換能を持つPOROS20Sを用い、実施例１と同様の方法により、POROS20S懸濁液を調整した。実施例１と同様の方法でマイクロカラムを作製し、調整したPOROS20S懸濁液をマイクロチューブ内に注入した。注入後、マイクロチューブ中に充填されたPOROS20Sのベットを純水で十分洗浄、乾燥した。
【００８９】
＜ポリヌクレオチド結合マイクロビーズの調整＞
Streptavidin Coated Microsphere plain（直径６μｍ、Polysciences）の水溶液に、５'末端にビオチンを修飾したデオキシチミジン（ｄＴ）のポリヌクレオチド（２１ｍｅｒ）を加えて、アビジン−ビオチン結合によりポリｄＴが固定されたビーズ（以下、「ポリｄＴビーズ」と称する。）を調製した。
【００９０】
＜ハイブリット形成部の形成＞
調整したポリｄＴビーズを、実施例１と同様の方法で上記で形成した送液促進部の上流へ注入し、ハイブリット形成部を形成し、２層のマイクロカラムとした。
【００９１】
＜コンディショニング液・洗浄液・核酸溶液の調整＞
実施例１と同様に、コンディショニング液、洗浄液を調整した。また、核酸溶液として、３’末端をCy3で標識した120-merのポリ（ｄＡ）のポリデオキシヌクレオチドを、5μMの濃度で0.5M塩化ナトリウム水溶液に溶解し、調整した。
【００９２】
＜ハイブリット形成、及び蛍光測定＞
実施例１と同様の方法で、最初のコンディショニング液の注入、核酸溶液の注入、洗浄液の注入、最後のコンディショニング液の注入を順番に行った。最初にコンディショニング液を注入した後と、最後にコンディショニング液を注入した後に、核酸溶液中のCy3標識したポリｄＡ配列とポリｄＴビーズ上ポリｄＴ配列間のハイブリット形成を、実施例１と同様の方法で蛍光測定した。
【００９３】
＜結果＞
最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを図１５に示す。図１５に示す通り、Cy3に起因する蛍光の増加が観察された。これにより、ハイブリット形成部において、ハイブリット形成が行われたことが確認できた。
【００９４】
実施例２では、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを用いても、ハイブリット形成に影響を与えないことが分かった。
【００９５】
実施例１、及び２の結果から、ハイブリット形成部を、カチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを充填した送液促進部で挟み込み、３層化することも可能であると示唆された。即ち、ハイブリット形成部の上流に送液促進部を形成しても、核酸がほとんど吸着しないため、ハイブリット形成部においての核酸濃度や量の低下はないと考えられる。
【実施例３】
【００９６】
実施例３では、SDSを常時含んだ液相を用いる場合のハイブリット形成への影響、及びハイブリット形成部に、ポリｄＴビーズとカチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを混合したベットを用いた場合のハイブリット形成への影響をそれぞれ調べた。
【００９７】
＜混合マイクロビーズ懸濁液の調整＞
実施例２と同様の方法でポリｄＴビーズを、実施例１と同様の方法により、カチオン性のイオン交換能を持つPOROS20S懸濁液をそれぞれ調整した。調整したそれぞれの懸濁液を、ポリｄＴビーズの重量比が、0％、25％、50％、100％となるように混合した。
【００９８】
＜送液促進部・ハイブリット形成部の形成＞
実施例１と同様の方法でマイクロカラムを作製し、調整したPOROS20S懸濁液をマイクロチューブ内に注入した。注入後、マイクロチューブ中に充填されたPOROS20Sのベットを純水で十分洗浄、乾燥して、送液促進部を形成した。
【００９９】
調整した混合マイクロビーズ懸濁液を、上記で形成した送液促進部の上流へ、実施例１と同様の方法で注入し、ハイブリット形成部を形成し、２層のマイクロカラムとした。
【０１００】
＜コンディショニング液・洗浄液・核酸溶液の調整＞
コンディショニング液、及び洗浄液として、0.1％SDSを含有した0.5M塩化ナトリウム水溶液を調製した。核酸溶液として、３’末端をCy3で標識した120-merのポリ（ｄＡ）のポリデオキシヌクレオチドを、5μMの濃度で、0.1％SDSを含有する0.5M塩化ナトリウム水溶液に溶解し、調整した。
【０１０１】
＜ハイブリット形成、及び蛍光測定＞
実施例１と同様の方法で、コンディショニング液の注入、核酸溶液の注入、洗浄液の注入を順番に行った。コンディショニング液を注入した後と、洗浄液を注入した後に、核酸溶液中のCy3標識したポリｄＡ配列とポリｄＴビーズ上ポリｄＴ配列間のハイブリット形成を、実施例１と同様の方法で蛍光測定した。
【０１０２】
＜結果＞
コンディショニング液注入後の蛍光と、洗浄液注入後の蛍光との差スペクトルを図１６に示す。図１６に示す通り、Cy3に起因する蛍光の増加が観察された。これにより、ハイブリット形成部において、ハイブリット形成が行われたことが確認できた。即ち、SDSを常時含んだ液相を用いても、ハイブリット形成に影響はないことが分かった。
【０１０３】
また、図１６に示す通り、蛍光強度は、ポリｄＴビーズの含有量に従って増加する傾向がみられた（図１６中Ａ〜Ｄ参照）。そこで、ポリｄＴビーズの含有量に対しての570ｎｍでの蛍光の増加を図１７にプロットしたところ、ほぼ比例していることが分かった。即ち、ハイブリット形成部に、ポリｄＴビーズとカチオン性のイ
オン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを混合したベットを用いても、ハイブリット形成に影響を与えないことが分かった。
【０１０４】
実施例３では、本発明に係るマイクロ流路系において、SDSを常時含んだ液相を用いることが可能であることが確認できた。このことから、蛍光測定のための液相の置換が不要となり、総測定時間を大幅に短縮できることが明らかとなった。
【０１０５】
また、本発明に係るマイクロ流路系のハイブリット形成部において、ポリｄＴビーズとカチオン性のイオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズを混合したベットを用いることが可能であることも確認できた。このように、多孔質マイクロビーズを、送液促進部だけでなく、ハイブリット形成部へも用いることができると、送液促進だけでなく、試料に起因する目詰まりを減少できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明に係る流路系は、多孔質マイクロビーズへの核酸の吸着を防止できるため、流路内でのハイブリダイゼーション等の反応効率を上昇させ、かつ反応条件を安定させることが可能となる。また、多孔質マイクロビーズを用いることで、マイクロ流路内での目詰まり、及びマイクロ流路内圧上昇の防止ができる。そのため、高流量送液が可能である。特に、様々な浮遊物、長鎖の核酸などを含む全ＲＮＡサンプルの送液にも有効に利用できる。更に、送液する全溶液に界面活性作用、及び核酸分解酵素失活作用を有する物質を含ませれば、総測定時間の短縮を図ることができ、RNaseやDNaseなどの核酸分解酵素による影響を抑制し、効率的で安定した測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本発明に係る流路系の一実施形態を示す図である。
【図２】流路系１内に充填されているハイブリット形成用ビーズ２１の表面上の物質構成の一例を模式的に示す図である。
【図３】ハイブリット形成用ビーズ２１に保持された核酸鎖Ｎとターゲット核酸Ｘがハイブリット形成する様子を模式的に示す図である。
【図４】図２とは異なる実施形態のハイブリット形成用ビーズ２２の表面上の物質構成を模式的に示す図である。
【図５】ハイブリット形成用ビーズ２２に保持されたリンカーＬとターゲット核酸Ｘが相補結合する様子を模式的に示す図である。
【図６】ハイブリット形成用ビーズ２２にリンカーＬを介して保持された状態のターゲット核酸Ｘとプローブ核酸Ｙがハイブリダイゼーションする様子を模式的に示す図である。
【図７】本発明に係る流路系１を用いたアッセイの工程例を示す図である。
【図８】本発明に係る流路系１ａの一実施形態を示す図である。
【図９】図８とは異なる実施形態の流路系１ｂを示す図である。
【図１０】図８、及び図９とは異なる実施形態の流路系１ｃを示す図である。
【図１１】図８、図９、及び図１０とは異なる実施形態の流路系１ｄを示す図である。
【図１２】図８、図９、図１０、及び図１１とは異なる実施形態の流路系１ｅを示す図である。
【図１３】流路系１（１ａ〜１ｅ）を用いるハイブリダイゼーション検出装置の検出部の好適な実施形態の一例を示す図である。
【図１４】実施例１において、最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを示す図面代用グラフである。
【図１５】実施例２において、最初のコンディショニング液注入後の蛍光と、最後のコンディショニング液注入後の蛍光との差スペクトルを示す図面代用グラフである。
【図１６】実施例３において、コンディショニング液注入後の蛍光と、洗浄液注入後の蛍光との差スペクトルを示す図面代用グラフである。
【図１７】実施例３において、ポリｄＴビーズの含有量に対しての570ｎｍでの蛍光の増加を示す図面代用グラフである。
【符号の説明】
【０１０８】
１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ マイクロ流路系
１１ 細管
１２ 導入部
１３ 排出部
２、２１、２２ ハイブリット形成用ビーズ
３ 多孔質マイクロビーズ
１１１、１１１ａ、１１１ｂ 反応部
１１２、１１２ａ、１１２ｂ 送液促進部
Ｎ 核酸鎖
Ｐ プローブ核酸
Ｘ ターゲット核酸
Ｌ リンカー
Ｆ 蛍光物質
Ｓ１ 第１サンプル液
Ｓ２ 第２サンプル液
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズが充填された細管からなる流路系であって、
核酸鎖が固定されているハイブリット形成用ビーズと、
カチオン性イオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズと、
が少なくとも充填されたカラム層を有する流路系。
【請求項２】
前記多孔質マイクロビーズは、パフュージョンクロマトグラフィー粒子であることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項３】
前記ハイブリット形成用ビーズ上では、
固定された前記核酸鎖と、ターゲット核酸とが相補結合するハイブリット形成が行われることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項４】
前記核酸鎖は同種塩基配列を有するリンカーであって、
前記ハイブリット形成用ビーズ上では、
固定された該リンカーとターゲット核酸とが相補結合する第１ハイブリット形成と、
該ターゲット核酸の一本鎖部分と送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、
が行われることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項５】
前記リンカーの同種塩基配列はポリＴ又はポリＵであり、
該ポリＴ又はポリＵと全ＲＮＡサンプル中のポリＡテール部分を有するｍＲＮＡとが相補結合する第１ハイブリット形成と、
該ｍＲＮＡと送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、
が行われることを特徴とする請求項４記載の流路系。
【請求項６】
前記ハイブリット形成用ビーズが少なくとも充填されている反応部と、
前記多孔質マイクロビーズが充填されている送液促進部と、
が順に層をなすことを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項７】
前記反応部と、
前記反応部の上流領域に設けられた前記送液促進部と、
前記反応部の下流領域に設けられた前記送液促進部と、
からなる３層構造であることを特徴とする請求項６記載の流路系。
【請求項８】
前記ハイブリット形成用ビーズと、
前記多孔質マイクロビーズと、
が混合充填されていることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項９】
前記ハイブリット形成ビーズと前記多孔質マイクロビーズとが混合充填されている反応部と、
前記多孔質マイクロビーズが充填されている送液促進部と、
が順に層をなすことを特徴とする請求項８記載の流路系。
【請求項１０】
前記反応部と、
前記反応部の上流領域に設けられた前記送液促進部と、
前記反応部の下流領域に設けられた前記送液促進部と、
からなる３層構造であることを特徴とする請求項９記載の流路系。
【請求項１１】
前記流路系に送液する全溶液は、界面活性作用及び核酸分解酵素失活作用を有する物質を同濃度含む溶液であることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項１２】
前記物質は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）であることを特徴とする請求項１１記載の流路系。
【請求項１３】
請求項１記載の流路系と、
前記ハイブリット形成用ビーズ上におけるハイブリット形成を検出する検出部と、
を少なくとも備えるハイブリダイゼーション検出装置。
【請求項１】
ビーズが充填された細管からなる流路系であって、
核酸鎖が固定されているハイブリット形成用ビーズと、
カチオン性イオン交換能を持つ多孔質マイクロビーズと、
が少なくとも充填されたカラム層を有する流路系。
【請求項２】
前記多孔質マイクロビーズは、パフュージョンクロマトグラフィー粒子であることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項３】
前記ハイブリット形成用ビーズ上では、
固定された前記核酸鎖と、ターゲット核酸とが相補結合するハイブリット形成が行われることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項４】
前記核酸鎖は同種塩基配列を有するリンカーであって、
前記ハイブリット形成用ビーズ上では、
固定された該リンカーとターゲット核酸とが相補結合する第１ハイブリット形成と、
該ターゲット核酸の一本鎖部分と送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、
が行われることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項５】
前記リンカーの同種塩基配列はポリＴ又はポリＵであり、
該ポリＴ又はポリＵと全ＲＮＡサンプル中のポリＡテール部分を有するｍＲＮＡとが相補結合する第１ハイブリット形成と、
該ｍＲＮＡと送液中のプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成と、
が行われることを特徴とする請求項４記載の流路系。
【請求項６】
前記ハイブリット形成用ビーズが少なくとも充填されている反応部と、
前記多孔質マイクロビーズが充填されている送液促進部と、
が順に層をなすことを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項７】
前記反応部と、
前記反応部の上流領域に設けられた前記送液促進部と、
前記反応部の下流領域に設けられた前記送液促進部と、
からなる３層構造であることを特徴とする請求項６記載の流路系。
【請求項８】
前記ハイブリット形成用ビーズと、
前記多孔質マイクロビーズと、
が混合充填されていることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項９】
前記ハイブリット形成ビーズと前記多孔質マイクロビーズとが混合充填されている反応部と、
前記多孔質マイクロビーズが充填されている送液促進部と、
が順に層をなすことを特徴とする請求項８記載の流路系。
【請求項１０】
前記反応部と、
前記反応部の上流領域に設けられた前記送液促進部と、
前記反応部の下流領域に設けられた前記送液促進部と、
からなる３層構造であることを特徴とする請求項９記載の流路系。
【請求項１１】
前記流路系に送液する全溶液は、界面活性作用及び核酸分解酵素失活作用を有する物質を同濃度含む溶液であることを特徴とする請求項１記載の流路系。
【請求項１２】
前記物質は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）であることを特徴とする請求項１１記載の流路系。
【請求項１３】
請求項１記載の流路系と、
前記ハイブリット形成用ビーズ上におけるハイブリット形成を検出する検出部と、
を少なくとも備えるハイブリダイゼーション検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００８−１０２０５３（Ｐ２００８−１０２０５３Ａ）
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８５７７６（Ｐ２００６−２８５７７６）
【出願日】平成１８年１０月２０日（２００６．１０．２０）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２０日（２００６．１０．２０）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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