液体フローに含まれる生物学的粒子を分別する装置ならびにその方法
【課題】セルソータにおいて、所望の細胞粒子の回収率の増大、および分別試料中の細胞粒子の純度の改善を図る。
【解決手段】本願発明に係る液体フローに含まれる生物学的粒子を分別する装置は、前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出する光学的機構と、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記液体フローにおける該生物学的粒子の移動速度を検出する制御部と、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいて、該生物学的粒子に電荷を与える荷電部とを備える。前記制御部は、ブレイク・オフ・ポイントで液体フローから分離する少なくとも１つの液滴フロー内における前記生物学的粒子のそれぞれの位置を、該生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいてモニタし、該位置に基づいて該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御する。
【解決手段】本願発明に係る液体フローに含まれる生物学的粒子を分別する装置は、前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出する光学的機構と、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記液体フローにおける該生物学的粒子の移動速度を検出する制御部と、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいて、該生物学的粒子に電荷を与える荷電部とを備える。前記制御部は、ブレイク・オフ・ポイントで液体フローから分離する少なくとも１つの液滴フロー内における前記生物学的粒子のそれぞれの位置を、該生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいてモニタし、該位置に基づいて該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、液体フローに含まれる生物学的粒子（例えば、細胞、染色体）の識別情報を収集し、この識別情報に基づいて生物学的粒子を分析および分別する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジの急速な発展に伴い、医学や生物学を含むさまざま分野で多数の細胞などを自動的に分析および分別するフローサイトメータおよびセルソータの需要がますます増大しつつある。フローサイトメータは、概略、生体（血液など）から採取された数多くの細胞粒子を蛍光標識試薬などで染色し、これらの細胞粒子をシースフロー内で一列に配列し、細胞粒子のそれぞれにレーザ光を照射して、細胞粒子から生じる散乱光（前方散乱光および側方散乱光）と蛍光標識試薬に依存するさまざまな多色蛍光を測定することにより、細胞を分析するものである。またフローサイトメータは、分析するために収集された散乱光および蛍光に関する識別情報を電気的信号に変換し、サンプルから採取された大量の細胞粒子についての電気的信号を統計的に評価することにより、生体の病変などの状態を診断することを可能にするものである。さらにセルソータは、散乱光と蛍光に関する識別情報を電気的信号に変換し、この電気的信号に基づいて、分取したい各細胞粒子を含む液滴を選択的に荷電し、この液滴が落下する経路上に直流電場を形成することにより、特定の細胞粒子を選択的に収集することを可能にするものである。
【０００３】
図１は、セルソータ１の一般的な構成を説明するための模式図である。このセルソータ１は、概略、蛍光標識試薬などで染色された細胞粒子をシースフロー内で一列に配列するための流体フロー機構１０と、各細胞粒子に波長の異なる複数のレーザ光を照射し、散乱光および蛍光を受光するための光学的機構４０と、散乱光および蛍光から得られた信号を解析し、所定のタイミングで細胞粒子に電荷を与えることにより細胞粒子を分別するためのソータ機構６０とを備える。
【０００４】
流体フロー機構１０は、図１に示すように、通常、シースフローを形成するための円筒状のフローチャンバ１２と、蛍光標識された細胞粒子を含むサンプル懸濁液を収容するためのサンプル容器１４と、シース液を収容するためのシース容器１６と、サンプル容器１４内の気圧を制御する圧力コントローラ１８と、大量のシース液を貯蔵しシース容器１６にシース液を供給するプレナム容器２４と、サンプル容器１４およびプレナム容器２４に圧縮空気を供給するためのエアポンプ２６，２７備える。フローチャンバ１２の下流側にはより断面積の小さいフローセル３０が形成されている。こうして構成された流体フロー機構１０において、エアポンプ２６，２７が作動すると、サンプル容器１４およびシース容器１６にそれぞれ収容されたサンプル懸濁液およびシース液がフローチャンバ１２内に供給され、シース液がサンプル懸濁液を円筒状に包み込むシースフロー（層流）が形成され、フローセル３０を通過した後、流路ブロック２８のオリフィス３４からジェットフローとして噴出される。このとき、フローセル３０には所定の周波数の振動が与えられ、ブレイク・オフ・ポイントＢＰにおいてジェットフローから液滴Ｄが分離する。
【０００５】
光学的機構４０は、ジェットフロー内を整列して通過する細胞粒子に異なる波長の複数のレーザビーム（励起光）を順次照射し、細胞粒子で散乱して生じた前方散乱光および側方散乱光、ならびに各レーザビームが細胞粒子を励起して生じたさまざまな波長を有する複数の蛍光を検出し、各細胞粒子の識別情報をソータ機構６０に供給する。
【０００６】
ソータ機構６０は、各細胞粒子の識別情報に基づいて、各細胞粒子の種類等を特定・同定し、フローセル３０の下方に配置した電極を用いて、ブレイク・オフ・ポイントＢＰにある細胞粒子に識別情報に応じた極性を有する電荷を与え、帯電した細胞粒子を含む液滴Ｄが所定の電圧差を有する偏向板６２の間を通過するときに所望のスライドグラス６８の方へ偏向し、分取されるように構成されている。
【０００７】
本願特許出願と同一の譲受人に譲渡された特許文献１に記載の発明においては、フローセル３０内の細胞粒子は、フローセル３０の中心に沿って移動することを前提とし、細胞粒子の移動速度は細胞粒子によらず一定であるものと仮定して、ソータ機構６０を用いて移動速度には依存しない一定のタイミングでブレイク・オフ・ポイントＢＰにおける細胞粒子に電荷を与えていた。
なお、特許文献１に記載された内容は、参考にここに一体のものとして統合される。
【特許文献１】特開２００５−３１５７９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところがフローセル３０内の実際の細胞粒子は、その大きさや形状等によっては必ずしもフローセル３０の中心Ｃに沿って移動するものではなく、図２に示すように、フローセル３０の中心Ｃから逸脱して流れることがある。フローセル３０内の細胞粒子は、一般に、側壁から中心Ｃに向かう方向の距離の２乗に比例した流速を有することが知られている（細胞粒子の流速は側壁においてゼロで、中心において最大流速ｖ０を有する）。図２では、一例として、フローセル３０の中心Ｃに沿って移動し、最大流速ｖ０を有する細胞粒子Ａ１，Ａ２，Ａ３と、フローセル３０の中心Ｃから逸脱して、最大流速ｖ０より遅い速度ｖ１を有する細胞粒子Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３が交互に流れたと仮定した場合（Ａ１，Ｂ１，Ａ２，Ｂ２，Ａ３，Ｂ３）を図示したものである。このとき、細胞粒子Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３は前掲特許文献１の発明で仮定した細胞粒子の位置（破線で示す）より遅れてシースフロー内を流れることになる（実線で示す）。したがって、細胞粒子Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３の移動速度ｖ１によらない一定のタイミングで細胞粒子に電荷を与えたとき、所望の細胞粒子Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３はブレイク・オフ・ポイントに到達しておらず、これらに適正に電荷を与えることができず、所望の細胞粒子の回収率が低減する場合があった。さらに、ブレイク・オフ・ポイントに遅れて到達した細胞粒子（たとえばＢ１）と最大流速ｖ０を有する細胞粒子（たとえばＡ１）が同時に荷電され、これらの異なる種類の複数の細胞粒子Ａ１，Ｂ１が単一の液滴内に包含されると、分別された細胞粒子の中に不要な細胞粒子が混入することになり、分別試料中の細胞粒子の純度が低下する場合がある。
【０００９】
そこで本願発明に係る１つの態様によれば、それぞれの細胞粒子の移動速度に基づいてブレイク・オフ・ポイントＢＰに到達するまでの遅延時間を計算し、これに応じたタイミングで細胞粒子に電荷を与えることにより所望の細胞粒子の回収率を増大させるとともに、所望の細胞粒子と所望しない細胞粒子とを確実に分別して、分別試料中の所望の細胞粒子のサンプル純度を改善するセルソータを実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
具体的には、本願発明の第１の態様に係るセルソータ、すなわち液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する装置は、前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出する光学的機構と、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記液体フローにおける該生物学的粒子の移動速度を検出する制御部と、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいて、該生物学的粒子に電荷を与える荷電部とを備えることを特徴とするものである。
【００１１】
好適には、前記制御部は、前記制御部は、ブレイク・オフ・ポイントで液体フローから分離する少なくとも１つの液滴フロー内における前記生物学的粒子のそれぞれの位置を、該生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいてモニタし、該位置に基づいて該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御する。
【００１２】
より好適には、前記制御部は、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、該生物学的粒子の識別情報を収集し、該識別情報に応じた極性を有する電荷を該生物学的粒子に与えるように前記荷電部を制御する。
【００１３】
さらに好適には、前記制御部は、異なる前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えないように前記荷電部を制御する。択一的には、前記制御部は、同一の前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御する。
【００１４】
また、前記制御部は、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度が所定の閾値より遅いとき、該生物学的粒子に電荷を与えないように荷電部を制御してもよい。
【００１５】
より具体的には、前記光学的機構は、第１の位置において光を照射する第１の光源と、該第１の光源で光を照射された前記生物学的粒子からの光を検出する第１の受光器と、第１の位置の下流側にある第２の位置において第２の光を照射する第２の光源と、該第２の光源で光を照射された前記生物学的粒子からの光を検出する第２の受光器とを有する。そして、前記制御部は、前記第１および第２の受光器で検出された光の信号に基づいて、前記生物学的粒子のそれぞれが第１の位置から第２の位置まで移動するために要した移動時間を計測して、該生物学的粒子の前記移動速度を検出する。
【００１６】
好適には、この装置は、前記液体フローおよび前記ブレイク・オフ・ポイントを含む撮像領域の画像を撮像する固定撮像部をさらに備える。このとき、前記制御部は、前記固定撮像部で撮像された画像に基づいて、第１の位置から前記ブレイク・オフ・ポイントまでのフロー距離、および前記液体フローから分離して形成された隣接する液滴間の液滴間隔を求めるとともに、該フロー距離、該液滴間隔および前記移動時間に基づいて、該生物学的粒子が第１の位置からブレイク・オフ・ポイントまで移動するために要する遅延時間を求める。
【００１７】
より好適には、第１および第２の光源で光を照射された前記生物学的粒子から検出された光は、該生物学的粒子からの側方散乱光または前方散乱光である。さらに好適には、前記生物学的粒子に照射する第１および第２の光は互いに波長の異なるレーザ光である。
【００１８】
また本願発明の第２の態様によれば、液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する方法が提供され、この方法は、前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出するステップと、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記液体フローにおける該生物学的粒子の移動速度を検出するステップと、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいて、該生物学的粒子に電荷を与えるステップとを有するものである。
【００１９】
さらに本願発明の第３の態様によれば、液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する装置が提供され、この装置は、シース液を収容するシース容器と、延長導管を介して前記シース容器と流体連通するプレナム容器と、前記プレナム容器に接続された第１の圧力源と、前記生物学的粒子を含むサンプル液を収納するサンプル容器と、圧力制御部を介してシース容器に接続された第２の圧力源と、前記シース容器および前記サンプル容器と流体連通し、サンプル液を包囲するシース液からなる液体フローを形成するフローセルと、シース液の温度が安定するように制御するシース温度制御部とを備えたことを特徴とするものである。
【００２０】
前記シース温度制御部は、延長導管の周囲に配設された保温材を含むことが好ましい。また、前記シース温度制御部は、前記シース容器の温度を安定させ、より好適には、前記シース容器の温度を４〜４２℃の範囲に制御する。
【００２１】
さらに好適には、この装置は、前記生物学的粒子が生存できる温度範囲にサンプル液の温度が安定するように制御するサンプル温度制御部をさらに備える。このとき、前記シース温度制御部は、前記生物学的粒子が生存できる温度範囲にシース液の温度を安定させるように構成されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本願発明に係る特定の態様によれば、所望の細胞粒子の回収率を増大させ、分別試料中の細胞粒子の純度を改善することができるセルソータを実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、添付図面を参照して本願発明に係るセルソータ１の実施形態を説明する。この説明において、理解を容易にするために方向を表す用語（例えば、「上方向」および「下方向」など）を適宜用いるが、これは説明のためのものであって、これらの用語は本願発明を限定するものでない。
【００２４】
図１に示すセルソータ１は、概略、蛍光標識試薬などで染色された細胞粒子をシースフロー内で一列に配列するための流体フロー機構１０と、各細胞粒子に波長の異なる複数のレーザ光を照射し、散乱光および蛍光を受光するための光学的機構４０と、散乱光および蛍光から得られた信号を解析し、所定のタイミングで細胞粒子に電荷を与えることにより細胞粒子を分別するためのソータ機構６０とを備える。
【００２５】
１．流体フロー機構
まず流体フロー機構１０について、図１、図３および図４を参照して以下説明する。
流体フロー機構１０は、概略、シースフローを形成するための円筒状のフローチャンバ１２と、蛍光染料や蛍光ラベルモノクロナール抗体などの蛍光標識試薬で蛍光標識された細胞粒子を含むサンプル懸濁液を収容するためのサンプル容器１４と、シース液を収容するためのシース容器１６とを備え、フローチャンバ１２の中心軸に沿って配設されたサンプル管１５にサンプル懸濁液が供給され、フローチャンバ１２の周縁部に接続されたシース管１７を介してフローチャンバ１２内にシース液が供給されるように構成されている。
【００２６】
また流体フロー機構１０は、図３において、サンプル容器１４内の気圧を制御する圧力コントローラ１８と、圧力コントローラ１８に圧縮空気を供給するためのエアポンプ２６と、実質的な長さを有する延長導管２０を介してシース容器１６と流体連通し、大量のシース液を貯蔵するためのプレナム容器２４と、プレナム容器２４に圧縮空気を供給するための別のエアポンプ２７とを備える。好適には、圧力コントローラ１８は、シース容器１６内の圧力をモニタして、サンプル容器１４内の圧力がシース容器より所定の圧力だけ大きくなるようにサンプル容器１４内の圧力を調整する。
【００２７】
本願発明に係るフローサイトメータおよびセルソータは、後述のように画像処理技術を用いてジェットフローの長さおよび隣接する液滴の間隔を測定することにより、細胞粒子に電荷を与えるタイミング（遅延時間）を求めている。このとき、精度の高いソーティング処理を実現するためには、ジェットフローの長さおよび液滴間隔が安定していることが求められる。ところが、ジェットフローの長さおよび液滴間隔は、シース液の温度に依存して伸縮することが知られている。すなわち、シース液の温度が上がれば、液滴の粘性が下がり、ジェットフローおよび液滴間隔は長くなる。逆に、シース液の温度が下がれば、液滴の粘性が増大し、ジェットフローおよび液滴間隔は短くなる。
【００２８】
そこで本願発明に係る流体フロー機構１０によれば、プレナム容器２４から供給されるシース液の温度を安定させる手段（シース温度制御部）が具備されている。具体的には、シース液は、プレナム容器２４からシース容器１６に向かって延長導管２０を通過しているときに、室温に接近するように温度が変動するので、図３に示すように、延長導管２０の周囲に保温材２１を設けて、室温の影響を極力抑えるようにしてもよい。また、シース容器１６を収容して一定温度に維持する温度安定器２３（破線で示す）を配置して、シース液の温度を安定させてもよい。また、シース容器１６の温度は、これに限定されるものではないが、４〜４２℃の範囲に制御してもよい。こうして、シース液の温度（ひいては粘性）を一定に制御して、シース液およびこれに含まれる細胞粒子の速度、ならびにジェットフローの長さおよび液滴間隔を一定に制御することにより、細胞粒子の分別回収率および純度を安定させることができる。
【００２９】
同様に、この流体フロー機構１０は、サンプル容器１４内のサンプル懸濁液に含まれる細胞粒子が温度に敏感で、限定的な温度範囲でのみ生存できる場合にも利用できるように、サンプル液の温度を安定させる不図示の手段（サンプル温度制御部）を備えることが好ましい。具体的には、サンプル温度制御部は、シース容器１６を収容する温度安定器２３と同様のものであってもよい。択一的には、サンプル容器１４およびシース容器１６の全体を１つのチャンバ（図示せず）の中に収容して、サンプル液およびシース液の両方の温度を安定させるように構成してもよい。
【００３０】
さらに、とりわけ図４に示すように、フローチャンバ１２の下端部には、水晶、ガラス、溶融シリカまたは透明プラスティックなどの透明部材を用いて漏斗状に形成された流路ブロック２８が配設され、その下方に断面積の小さいフローセル３０が構成されている。流路ブロック２８の上方周辺部には、周波数可変（たとえばｆ＝６０ｋＨｚ）のピエゾ圧電素子等を用いた振動器３２が配設され、流路ブロック２８の下方中央部にはオリフィス３４と、シースフローに接触してシースフローに含まれる細胞粒子に所望の極性を有する電荷を与えるための荷電電極（荷電部）３６とが設けられている。
【００３１】
こうして構成された流体フロー機構１０において、エアポンプ２６，２７が作動すると、サンプル容器１４およびシース容器１６にそれぞれ収容されたサンプル懸濁液およびシース液がフローチャンバ１２内に供給され、シース液がサンプル懸濁液を円筒状に包み込むシースフロー（層流）が形成され、フローセル３０を通過した後、流路ブロック２８のオリフィス３４からジェットフローとして噴出される。そして振動器３２により流路ブロック２８が所定の周波数で振動を与えられると、図４に示すように、ジェットフローの水平断面が鉛直方向に沿って振動器３２の周波数に同期して変調し、ブレイク・オフ・ポイントＢＰにおいてジェットフローから液滴Ｄが分離する。
【００３２】
詳細後述するが、分別すべき所望の細胞粒子がブレイク・オフ・ポイントＢＰに到達する直前と推定されるタイミングで、分別すべき細胞粒子の識別情報に応じた極性を有する電圧を荷電電極３６に印加することによりシースフローに含まれる細胞粒子に荷電し、帯電した細胞粒子を含む液滴Ｄが形成される。そして荷電電極３６の下方には、図１に示すソータ機構６０の構成部品として、所定の電圧差を有する一対の偏向板６２が配設され、落下する液滴Ｄが細胞粒子の帯電極性に応じて分別され、所定のスライドグラス６８に収容される。なお、分別すべき細胞粒子の識別情報の収集方法については、たとえば前掲の特許文献１に記載された手法を用いることができ、その開示内容はここに参考に一体のものとして統合される。
【００３３】
２．光学的機構
次に、図１および図５を参照して光学的機構４０について以下説明する。
光学的機構４０は、フローセル３０内を整列して通過する細胞粒子に異なる波長を有する複数の励起光を順次照射する第１、第２および第３の光源４１，４２，４３と、第１の光源４１からの光が細胞粒子で散乱して生じた前方散乱光を検出する前方散乱光検出装置４５と、第１、第２および第３の側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２，５３とを備える。
【００３４】
より具体的には、第１、第２および第３の光源４１，４２，４３は、レーザビームなどのコヒーレント光を生成することが好ましい。一例として、第１の光源４１は、青色レーザビーム（ピーク波長：４８８ｎｍ，出力：２０ｍＷ）を照射するＤＰＳＳレーザ（Diode Pumped Solid State Laser：半導体レーザ励起固体レーザ）であってもよい。第２の光源４２は、赤色レーザビーム（ピーク波長：６３５ｎｍ，出力：２０ｍＷ）を照射するダイオードレーザで、同様に、第３の光源４３は、近紫外レーザビーム（ピーク波長：３７５ｎｍ，出力：８ｍＷ）を照射するダイオードレーザであってもよい。
【００３５】
図５に示す前方散乱光検出装置４５は、シースフロー内の細胞粒子からの前方散乱光（ＦＳＣ）を検出する光検出器４６を有し、青色レーザビームを選択的に透過させるバンドパスフィルタ（図示せず）を介して、青色レーザビームが細胞粒子で散乱して生じた青色前方散乱光だけを検出する。
【００３６】
また、側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２，５３は、青色、赤色および紫外レーザビームが細胞粒子で散乱して生じた側方散乱光と、細胞粒子を励起して生じたさまざまな波長を有する複数の蛍光とを検出するものである。ただし、本願発明において、第３の光源４３からのレーザビームによる側方散乱光を検出することは必ずしも必要ではないので、第３の検出装置４３は蛍光のみを検出するものとして図示した。
【００３７】
より詳細には、図５において、第１（青色）の側方散乱光／蛍光検出装置５１は、青色レーザビームを受けた細胞粒子からの側方散乱光を検出する光検出器ＳＳＣ１と、微弱な蛍光を電気的に増幅して検出する複数の光電子増倍管ＦＬ１〜ＦＬ４とを有する。また、第２（赤色）の側方散乱光／蛍光検出装置５２は、赤色レーザビームを受けた細胞粒子からの側方散乱光を検出する光検出器ＳＳＣ２と、細胞粒子からの蛍光を検出する光電子増倍管ＦＬ５〜ＦＬ６とを有し、第３（紫色）の蛍光検出装置５３は、紫色レーザビームを受けた細胞粒子からの蛍光を検出する光電子増倍管ＦＬ７〜ＦＬ８を有する。さらに、各側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２，５３は、複数のハーフミラー５４と、所望の波長帯の光だけを透過する複数のバンドパスフィルタ５５を有する。
【００３８】
さらに、第１、第２および第３の光源４１，４２，４３は、フローセル３０に対して固定位置に配置され、図４に示すように、シースフローのフロー方向（鉛直下方）に沿って等間隔ｄの位置にあるシースフローに各レーザビームを照射するように構成されている。同様に、第１、第２および第３の側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２，５３は、フロー方向に沿って等間隔ｄの位置に配置されている。したがって、シースフロー内の第１の位置にある細胞粒子からの光が第１の側方散乱光／蛍光検出装置５１で検出された後、第１の位置より間隔ｄだけ下流側の第２の位置にある細胞粒子からの光が第２の側方散乱光／蛍光検出装置５２で検出されるまでの時間がｔ０であったとき、細胞粒子のシースフロー内に流れるときの移動速度ｖ０は、次式で表すことができる。
ｖ０＝ｄ／ｔ０ （１）
【００３９】
すなわち、後述するソータ機構６０のコントローラ６６は、光検出器ＳＳＣ１で細胞粒子からの側方散乱光（青色）を検出した後、光検出器ＳＳＣ２で細胞粒子からの側方散乱光（赤色）を検出するまでの時間ｔ０を測定することにより、式（１）から細胞粒子がシースフロー内で移動するときの移動速度ｖ０を算出することができる。また、光電子増倍管ＦＬ１〜ＦＬ８で検出された蛍光は、細胞粒子に固有の波長スペクトルを有し、前掲特許文献１に記載されたように、コントローラ６６は、これらの蛍光を分析することにより細胞粒子の識別情報を収集し、その種類を特定または同定することができる。
【００４０】
なお、上述の実施形態では、細胞粒子の移動速度（流速）を測定するために、側方散乱光を用いたが、前方散乱光を用いて測定することもできる。すなわち、前方散乱光検出装置４５に青色レーザビームおよび赤色レーザビームを選択的に透過させるバンドパスフィルタを設けて、細胞粒子からの青色および赤色の前方散乱光を検出する時間差により、式（１）のｔ０を検出して、移動速度ｖ０を算出してもよい。
【００４１】
３．ソータ機構
次に、図１および図６を参照してソータ機構６０について以下説明する。
ソータ機構６０は、図１に示すように、所定の電圧差を有する一対の偏向板６２と、固定撮像部６４と、コントローラ（制御部）６６とを備え、コントローラ６６は、偏向板６２、固定撮像部６４、および側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２，５３（光検出器ＳＳＣ１，ＳＳＣ２および光電子増倍管ＦＬ１〜ＦＬ８）に接続されている。
【００４２】
図６は、フローセル３０内のシースフローＦＳと、フローセル３０のオリフィス３４から噴出されるジェットフローＦＪ（およびジェットフローＦＪからブレイク・オフ・ポイントＢＰで分離する液滴Ｄを含む）とを簡略的に図示したものである。上述のように、流路ブロック２８に取り付けられた振動器３２が所定の周波数（たとえばｆ＝６０ｋＨｚ）で振動すると、図６に示すようにジェットフローＦＪの水平方向断面が鉛直下方に沿って振動器３２の周波数ｆに同期して変調する。このときのジェットフローＦＪの変調周期（隣接する極大点または極小点の間の距離および隣接する液滴Ｄの間の距離）λは一定となる。
【００４３】
固定撮像部６４は、ＣＣＤカメラなどの撮像部と点滅光源（図示せず）とを有し、フローセル３０に対して固定された位置に配置され、ジェットフローＦＪの下流側から下流方向に所定距離隔てた画像位置Ｐ１から、さらに下流側にあるＰ２までの撮像領域（破線で示す）７０におけるジェットフローＦＪおよび液滴Ｄの画像を撮像するように設計されている。また点滅光源は、撮像領域７０にあるジェットフローＦＪと液滴Ｄを、振動器３２の周波数ｆと同一の周波数で点滅照明するように構成されている。したがって、固定撮像部６４は、定常状態にあるジェットフローＦＪおよび液滴Ｄを振動器３２の周波数ｆで撮像するため、図６のように静止したように見える画像を得ることができる。
【００４４】
このとき、固定撮像部６４はフローセル３０に対して固定されているので、図６において、第１（青色）の側方散乱光／蛍光検出装置４１が細胞粒子からの側方散乱光（青色）を検出する位置Ｐ０から、画像位置Ｐ１までの距離ＬＢ０は一定である。前掲の特許文献１に記載の発明によれば、固定撮像部６４を用いてジェットフローＦＪの変調周期λを常時モニタし、画像処理技術により位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの正確な距離Ｌ（＝ＬＢ０＋ＬＢ）をリアルタイムで算出し、これに応じて荷電電極３６がブレイク・オフ・ポイントＢＰで細胞粒子に電荷を与える遅延時間を補正していた。ただし、前掲の特許文献１においては、細胞粒子の移動速度は細胞粒子によらず一定であると仮定していた。
【００４５】
ところが、上述したように、フローセル３０内の実際の細胞粒子は、その大きさや形状等によっては必ずしもフローセル３０の中心に沿って移動するものではなく、図２に示すように、フローセル３０の中心から逸脱して流れるために、一般の細胞粒子の移動速度はフローセル３０の中心に沿って移動する細胞粒子に比べて遅くなり、細胞粒子がブレイク・オフ・ポイントＢＰに到達するまでに要する遅延時間がより長くなり、実際には、ブレイク・オフ・ポイントＢＰで細胞粒子に適正に電荷を与えることができず、あるいは収集すべき細胞粒子の中に不要な細胞粒子が混入するといった問題があった。
【００４６】
そこで本願発明は、光検出器ＳＳＣ１および光検出器ＳＳＣ２で検出された時刻または細胞粒子の移動時間ｔ０に基づいて、それぞれの細胞粒子に関する移動速度を求め、この移動速度に基づいて、各細胞粒子がブレイク・オフ・ポイントＢＰに到達するまでの遅延時間を正確に求めて、この遅延時間に基づいて個々の細胞粒子に電荷を与えようとするものである。
【００４７】
ここで図１および図６を参照しながら、第１の側方散乱光／蛍光検出装置５１が側方散乱光（青色）を検出する位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離Ｌ、および固定撮像部６４を用いて画像処理技術により測定されたジェットフローＦＪの変調周期λ（または隣接する液滴間隔）から各細胞粒子の遅延時間を求める方法について詳細に説明する。
【００４８】
ステップ１ （標準ビーズを用いたＬＢ０の事前測定）
固定撮像部６４は、位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離Ｌが一定となるように、フローセル３０に対して固定された位置に配置されるように構成されるが、固定撮像部６４を流体フロー機構１０に組み立てた後の組み立て誤差等に起因して、必ずしも高精度に位置決めできないことがある。そこで、固定撮像部６４を流体フロー機構１０に組み立てた後、実際にサンプル懸濁液に含まれる細胞粒子を分別する前に、位置Ｐ０から撮像領域７０の画像位置Ｐ１までの距離ＬＢ０を以下のように正確に測定して必要がある。
【００４９】
粒子径サイズが均一で十分に小さく、ほぼ完全な球形形状を有し、フローセル３０の中心に沿って移動することが知られている標準ビーズを含むサンプル懸濁液を用いて、予備的にソーティング処理を行う。具体的には、フローセル３０に十分な間隔をあけて標準ビーズを流し、これを一例として第１の光検出器ＳＳＣ１が検出した後適当な時間Ｔが経過した時点において、荷電電極３６を用いて標準ビーズに所定極性の電荷を与え、所定の電圧が印加された一対の偏向板６２の間を落下させることにより、標準ビーズを含む液滴Ｄを所定のスライドグラス６８に分取する。そして、時間Ｔを変動させたときのスライドグラス６８に分取された液滴Ｄの収量と時間Ｔとの関係をプロットすると、ピーク値Ｔ０を有するガウス分布のグラフが得られる。このときのピーク値Ｔ０が、標準ビーズが位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離Ｌを移動する遅延時間に相当する。こうして、コントローラ６６は、標準ビーズの遅延時間Ｔ０を測定する。
【００５０】
標準ビーズは、フローセル３０内を移動するときには速度ｖ０ｆを有し、ジェットフローＦＪを移動するときには速度ｖ０ｊを有する。そして、速度ｖ０ｆとｖ０ｊは、フローセル３０の断面積ＳｊとジェットフローＦＪの断面積Ｓｆを用いて次式で表すことができる。
ｖ０ｊ＝ｋ・ｖ０ｆ， ｋ＝Ｓｆ／Ｓｊ（＞１） （２）
ここでフローセル３０の断面積ＳｆおよびジェットフローＦＪの断面積Ｓｊは、たとえば約２００００μｍ２および約３８５０μｍ２である。
【００５１】
したがって、標準ビーズが位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離Ｌを移動する遅延時間Ｔ０は、フローセル３０内を移動する時間とジェットフローＦＪを移動する時間の和であるから、次式が成り立つ。
Ｔ０＝Ｌｆ／ｖ０ｆ＋Ｌｊ／ｖ０ｊ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／ｖ０ｊ （３）
【００５２】
一方、振動器３２の周波数ｆと同一の周波数で点滅照明されたジェットフローＦＪおよび液滴Ｄの画像は、図６のように静止したように見え、ジェットフローＦＪの極大点（または極小点）および液滴Ｄは、点滅光源の発光周期τで、変調周期λに相当する距離を移動するのであるから、移動速度ｖ０、発光周期τ（振動器３２の発振周期ｆの逆数に一致）、および変調周期λには次の関係式が成り立つ。
ｖ０ｊ＝λ／τ （４）
【００５３】
ここで、式（３）および式（４）から次式を得る。
Ｔ０／τ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／λ （５）
式（５）の左辺（Ｔ０／τ）は、細胞粒子が位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離Ｌを移動する遅延時間Ｔ０を、点滅光源の発光周期τで割ったものであり、位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの間に形成され得るシースフローＦＳおよびジェットフローＦＪの極大点（または極小点）の個数に対応するものである。ここで、この左辺（Ｔ０／τ）をドロップ・ディレイＤＤ０と定義する。
ＤＤ０＝Ｔ０／τ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／λ＝（ＬＢ＋ＬＢ０）／λ （６）
また、式（５）を変形して次式を得る。
Ｌｊ＝λ・Ｔ０／τ−ｋＬｆ （７）
【００５４】
固定撮像部６４は、フローセル３０に対して固定された位置に配置され、画像位置Ｐ１からＰ２までの破線で示す撮像領域７０におけるジェットフローＦＪおよび液滴Ｄの画像を撮像するように配設されており、この撮像領域７０の背景には適当なスケールまたは基準測定物が配置されている。こうしてコントローラ６６は、前掲の特許文献１に記載されたような適当な画像処理技術を用いて、ジェットフローＦＪの変調周期（および隣接する液滴Ｄの間隔）λと、画像位置Ｐ１からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離ＬＢを測定する。
【００５５】
距離Ｌｆおよび係数ｋはフローセル３０に固有のものであり、点滅光源の発光周期τは既知であって調整可能であり、遅延時間Ｔ０および変調周期λは上述のように測定されるので、コントローラ６６は、式（７）より距離Ｌｊを正確に算出し、算出されたＬｊを式（６）に代入してドロップ・ディレイＤＤ０を一意的に決定することができる。同様に、図６から明らかなように、位置Ｐ０から画像位置Ｐ１までの距離ＬＢ０を特定することができる（ＬＢ＝Ｌ−ＬＢ０）。こうして得られた距離ＬＢ０およびドロップ・ディレイＤＤ０は、移動時間ｔ０とともに、コントローラ６６の図示しないメモリに記憶しておく。
【００５６】
ステップ２ （サンプル懸濁液に含まれる細胞粒子の測定）
サンプル懸濁液に含まれる細胞粒子は、図２の細胞粒子Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３のようにフローセル３０の中心から逸脱した経路を移動するとき、標準ビーズの移動速度ｖ０より遅い移動速度ｖ１を有し、とりわけフローセル３０内を移動するときには速度ｖ１ｆを有し、ジェットフローＦＪを移動するときには速度ｖ１ｊを有する。このとき、式（２）および式（３）と同様、次式が得られる。
ｖ１ｊ＝ｋ・ｖ１ｆ， ｋ＝Ｓｊ／Ｓｆ（＞１） （８）
Ｔ１＝Ｌｆ／ｖ１ｆ＋Ｌｊ／ｖ１ｊ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／ｖ１ｊ （９）
【００５７】
式（８）および式（９）を変形して、次式を得る。
Ｔ１／τ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／λ （１０）
同様に、ドロップ・ディレイＤＤ１を次のように定義する。
ＤＤ１＝Ｔ１／τ （１１）
【００５８】
上述のように、標準ビーズが移動速度ｖ０ｆで第１の光検出器ＳＳＣ１および第２の光検出器ＳＳＣ２の検出位置の間の距離ｄを時間ｔ０で移動したとき、移動速度ｖ０ｆは次式で与えられる。
ｖ０ｆ＝ｄ／ｔ０ （１２）
同様に、細胞粒子が移動速度ｖ１ｆで第１の光検出器ＳＳＣ１および第２の光検出器ＳＳＣ２の検出位置の間の距離ｄを時間ｔ１で移動したとき移動速度ｖｆは次式で与えられる。
ｖ１ｆ＝ｄ／ｔ１ （１３）
したがって、式（１２）および式（１３）から、次式が得られる。
ｖ１ｆ＝（ｔ０／ｔ１）・ｖ０ｆ （１４）
同様に、式（２）および式（８）から次式が得られる。
ｖ１ｊ＝（ｔ０／ｔ１）・ｖ０ｊ
＝（ｔ０／ｔ１）・λ／τ （ｖ０ｊ＝λ／τ 式（４）） （１５）
これを式（９）に代入して次式を得る。
Ｔ１＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／（ｔ０／ｔ１）・τ／λ （１６）
よってドロップ・ディレイＤＤ１（＝Ｔ１／τ）は次式で求めることができる。
ＤＤ１＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／（ｔ０／ｔ１）／λ
＝ＤＤ０／（ｔ０／ｔ１） （１７）
（ＤＤ０＝Ｔ０／τ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／λ 式（６））
【００５９】
式（１６）および式（１７）において、距離Ｌｆおよび係数ｋはフローセル３０に固有のものであり、距離ＬＢ０はステップ１で測定され、距離ＬＢは固定撮像部６４および画像処理技術を用いて測定可能であるから、距離Ｌｊ（＝ＬＢ０＋ＬＢ−ｋ・Ｌｆ）を測定することができる。また、点滅光源の発光周期τは既知であって調整可能であり、変調周期λおよび時間ｔ１および時間ｔ０も同様に測定することができる。したがって、コントローラ６６は、それぞれの細胞粒子に対するドロップ・ディレイＤＤ１および遅延時間Ｔ／τを正確に求めることができる。
【００６０】
次に、図７（ａ）〜図７（ｃ）を参照しながら、各細胞粒子に対して求められたドロップ・ディレイＤＤ１および遅延時間Ｔを用いて、各細胞粒子の識別情報に基づいた所定の極性を有する電荷を荷電電極３６から細胞粒子に与える方法（またはソーティングロジック）について説明する。
【００６１】
遅延時間とは、上述のように、細胞粒子が位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰに到達するまでの時間であるので、各細胞粒子の遅延時間が計算されると、ブレイク・オフ・ポイントＢＰ付近にあるジェットフローＦＪに存在する各細胞粒子の位置を任意の時刻において推定することができる。一例として、ブレイク・オフ・ポイントＢＰ付近にあるジェットフローＦＪの拡大図である図７（ａ）〜図７（ｃ）に示すように、ジェットフローＦＪは、通常、変調周期λで変動する水平断面を有し、断面積が極小となる複数の狭窄部ＤＣを有する。すなわち、ブレイク・オフ・ポイントＢＰ付近において、隣接する狭窄部ＤＣの間にある一部のジェットフローＦＪが分離して独立した液滴Ｄを形成する。ここで、隣接する狭窄部ＤＣの間のジェットフローＦＪの一部を「液滴フローＤＦ」と定義する（図７（ａ）〜図７（ｃ）では、５つの液滴フローＤＦ１〜ＤＦ５が図示されている。）。すなわちジェットフロー（液体フロー）ＦＪは、下流方向ブレイク・オフ・ポイントＢＰに近づくとき液滴フローＤＦを形成し、ブレイク・オフ・ポイントＢＰに直近の液滴フローＤＦ１は、ジェットフローＦＪから独立した液滴Ｄを形成するものである。
【００６２】
図７（ａ）に示すように、ある時刻において分取したい細胞粒子Ｔ（以下、「目的細胞粒子」という。図中、白丸で示す。）が液滴フローＤＦ１に含まれることが上記遅延時間に基づいて推定されるとき、液滴フローＤＦ１から液滴Ｄが分離するまでの時間（すなわち変調周期λに相当する時間）、荷電電極３６を用いてジェットフローＦＪ全体に電圧を印加することにより、目的細胞粒子Ｔを確実に荷電することができる。換言すると、本願発明のコントローラ６６は、各細胞粒子の移動速度（または上記遅延時間）に基づいて液滴フローＤＦ１における位置をリアルタイムでモニタし、目的細胞粒子Ｔが液滴フローＤＦ１の所定の適正位置に存在すると判断したとき、所定期間（変調周期λ）荷電電極３６を用いて目的細胞粒子Ｔを確実に荷電するものである。
【００６３】
択一的には、図７（ｂ）に示すように、目的細胞粒子Ｔがブレイク・オフ・ポイントＢＰの直近にある２つまたは３つの液滴フローＤＦ（たとえば液滴フローＤＦ２）に含まれることが認められる場合に、それぞれ変調周期λの２倍または３倍の時間、ジェットフローＦＪ全体に電圧を印加して、目的細胞粒子Ｔに電荷を与えてもよい。このときコントローラ６６は、目的細胞粒子Ｔの識別情報に応じて、目的細胞粒子Ｔに与える電荷の極性を選択する。
【００６４】
ところが、上述のように各細胞粒子の遅延時間（ブレイク・オフ・ポイントＢＰまで到達する時間）が互いに異なるので、図７（ｃ）に示すように、荷電電極３６から電圧が印加される液滴フローＤＦ１の中に、目的細胞粒子Ｔと、これとは種類の異なる細胞粒子Ｆ（以下、「非目的細胞粒子」という。図中、黒丸で示す。）が混在する場合がある。このとき、所望する細胞粒子Ｔの純度を高めるためには、本願発明に係るコントローラ６６は、これらの細胞粒子Ｔ，Ｆに電荷を与えないように荷電電極３６を制御する。あるいは、目的細胞粒子Ｔの純度を犠牲にしても、目的細胞粒子Ｔをより多く分取するためには、コントローラ６６は、これらの細胞粒子Ｔ，Ｆを含む液滴フローＤＦ１に荷電するように荷電電極３６を制御してもよい。目的細胞粒子Ｔの純度または収量のいずれを優先すべきか、ユーザが選択できるようにコントローラ６６を構成することが好ましい。さらに図７（ｂ）を参照して説明したように、目的細胞粒子Ｔがブレイク・オフ・ポイントＢＰの直近にある２つまたは３つの液滴フローＤＦ１〜ＤＦ３に含まれる場合に、それぞれ変調周期λの２倍または３倍の時間、これらの液滴フローＤＦ１〜ＤＦ３に電圧を印加して、目的細胞粒子Ｔを荷電してもよい。また、各細胞粒子の遅延時間が互いに異なることに起因して、荷電電極３６から電圧が印加される液滴フローＤＦ１の中に、目的細胞粒子Ｔが複数個含まれる場合には、コントローラ６６は、これらの目的細胞粒子Ｔを含む液滴フローＤＦに荷電するように荷電電極３６を制御することが好ましい。
【００６５】
また、目的細胞粒子Ｔの純度をさらに改善する例示的な方法について説明する。図７（ｂ）に示すように、目的細胞粒子Ｔがブレイク・オフ・ポイントＢＰの直近にある連続する３つの液滴フローＤＦ１〜ＤＦ３の中央に配置された液滴フローＤＦ２内に含まれ、かつ、その前後（上流側および下流側）にある液滴フローＤＦ１およびＤＦ３内には非目的細胞粒子Ｆが含まれない場合にのみ、コントローラ６６は、目的細胞粒子Ｔを含む液滴フローＤＦ２のみを荷電するように荷電電極３６を制御してもよい。こうして予期しない要因により、非目的細胞粒子Ｆが目的細胞粒子Ｔを含む液滴フローＤＦ内に混入するおそれをさらに低減することができる。また、詳細図示しないが、目的細胞粒子Ｔがブレイク・オフ・ポイントＢＰの直近にある連続する５つの液滴フローＤＦ１〜ＤＦ５のうちの中央に配置された３つの液滴フローＤＦ２〜ＤＦ４内に含まれ、かつ、その前後（上流側および下流側）にある液滴フローＤＦ１およびＤＦ５内には非目的細胞粒子Ｆが含まれない場合にのみ、コントローラ６６は、それぞれ変調周期λの３倍の時間、目的細胞粒子Ｔを含む中央に配置された液滴フローＤＦ２〜ＤＦ４のみを荷電するように荷電電極３６を制御してもよい。こうして、非目的細胞粒子Ｆをより精度よく（より確実に）排除して、目的細胞粒子Ｔの純度を改善することができる。
【００６６】
さらに択一的には、コントローラ６６は、式（１４）で測定されたフローセル３０内の移動速度ｖ１ｆが所定の閾値ｖｔｈより小さいと判断したとき（ｖ１ｆ＞ｖｔｈ）、または式（１６）で測定された遅延時間Ｔ１が所定の閾値Ｔｔｈより長いと判断したとき（Ｔ１＜Ｔｔｈ）、その細胞粒子に対して電荷を与えないように荷電電極３６を制御してもよい。
【００６７】
本願発明によれば、ソーティングロジックは上記のものに限定されるものではなく、他の任意のものを用いることができるが、細胞粒子のそれぞれに対して遅延時間を正確に求め、さらにブレイク・オフ・ポイントＢＰ付近にある液滴フローＤＦに含まれる目的細胞粒子Ｔの配置位置を正確に特定することにより、個々の目的細胞粒子Ｔの識別情報に基づいて高い精度で電荷を与えることができる。
【００６８】
より具体的には、第１および第２の側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２でそれぞれの細胞粒子から得られた光を検出する時間差から、ブレイク・オフ・ポイントＢＰ付近にある液滴フローＤＦに存在する各細胞粒子の位置をモニタすることができる。また、図２で説明したような最大流速ｖ０より遅い速度ｖ１を有する細胞粒子ＢのドロップディレイＤＤ１は、標準ビーズＡのドロップディレイをそれぞれＤＤ０を用いて、式（１７）により算出し、上記のソーティングロジックに容易に適用することができる。たとえば、ＤＤ０＝３０で、ｔ０／ｔ１＝０．９５の場合、ＤＤ１＝３１．５８となり、ｔ０／ｔ１＝１．０５の場合、ＤＤ１＝２８．５７となる。
【００６９】
上記のように、細胞粒子のそれぞれを識別情報に基づいて正確に分別するためには、ブレイク・オフ・ポイントＢＰにおける各細胞粒子の位置を勘案して分別すべきか否かを判断する必要がある。たとえば、標準ビーズＡの遅延時間Ｔ０が経過したときの、細胞粒子Ｂの到達位置ＰＢは、ドロップディレイＤＤ０を用いて次式で表される。
ＰＢ＝ｖ１ｊ／Ｔ０／λ＝（ｔ０／ｔ１）・λ／τ・Ｔ０
＝（ｔ０／ｔ１）・ＤＤ０ （１８）
したがって、細胞粒子Ｂが標準ビーズＡに対して遅延している距離ΔＤは、ドロップディレイＤＤ０を用いて次式で表される。
ΔＤ＝（ｔ０／ｔ１）ＤＤ０−ＤＤ０＝（ｔ０／ｔ１−１）・ＤＤ０ （１９）
このとき、細胞粒子Ｂは標準ビーズＡより遅いので（ｔ０＜ｔ１）、ΔＤは負の値となる。たとえば、ＤＤ０＝３０で、ｔ０／ｔ１＝０．９５のとき、細胞粒子Ｂは、ＤＤ０の１．５倍の距離だけ遅れることになる。同様にして、標準ビーズＡの遅延時間Ｔ０を含む任意の時間においてすべての細胞粒子の位置を、ドロップディレイＤＤ０を用いて特定することができる。こうして、各細胞粒子の位置をモニタして、目的細胞粒子Ｔが液滴フローＤＦ１の所定の適正位置に存在すると判断したとき、所定期間（変調周期λ）荷電電極３６を用いて目的細胞粒子Ｔを確実に荷電することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】セルソータの一般的な構成を説明するための模式図である。
【図２】シースフロー内に流れる細胞粒子がさまざまな移動速度を有し得る様子を示す概念図である。
【図３】本願発明に係る流体フロー機構の構成を示す概略図である。
【図４】図３に示すフローチャンバ、フローセル、およびジェットフローの拡大図である。
【図５】本願発明に係る光学的機構の構成を示す概略図である。
【図６】シースフロー、ジェットフロー、およびブレイク・オフ・ポイントで分離する液滴の拡大模式図である。
【図７】ブレイク・オフ・ポイント付近にあるジェットフローおよび液滴フロー、ならびに液滴の拡大図である。
【符号の説明】
【００７１】
１：セルソータ、１０：流体フロー機構、１２：フローチャンバ、１４：サンプル容器、１５：サンプル管、１６：シース容器、１７：シース管、１８：圧力コントローラ、２０：延長導管、２１：保温材、２３：温度安定器、２４：プレナム容器、２６，２７：エアポンプ、２８：流路ブロック、３０：フローセル、３２：振動器、３４：オリフィス、３６：荷電電極（荷電部）、４０：光学的機構、４１：第１の光源（青色）、４２：第２の光源（赤色）、４３：第３の光源（紫色）、４５：前方散乱光検出装置、４６：光検出器、５１：第１の側方散乱光／蛍光検出装置、５２：第２の側方散乱光／蛍光検出装置、５３：第３の蛍光検出装置、５４：ハーフミラー、５５：バンドパスフィルタ、６０：ソータ機構、６２：偏向板、６４：固定撮像部、６６：コントローラ（制御部）、６８：スライドグラス、７０：撮像領域、ＳＳＣ１，ＳＳＣ２：光検出器、ＦＬ１〜ＦＬ８：光電子増倍管、Ａ１〜Ａ３：標準細胞粒子（標準ビーズ）、細胞粒子Ｂ１〜Ｂ３：細胞粒子、ＢＰ：ブレイク・オフ・ポイント、ＦＳ：シースフロー、ＦＪ：ジェットフロー、Ｄ：液滴、ＤＣ：狭窄部、ＤＦ１〜ＤＦ５：液滴フロー、Ｔ：目的細胞粒子，Ｆ：非目的細胞粒子。
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、液体フローに含まれる生物学的粒子（例えば、細胞、染色体）の識別情報を収集し、この識別情報に基づいて生物学的粒子を分析および分別する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジの急速な発展に伴い、医学や生物学を含むさまざま分野で多数の細胞などを自動的に分析および分別するフローサイトメータおよびセルソータの需要がますます増大しつつある。フローサイトメータは、概略、生体（血液など）から採取された数多くの細胞粒子を蛍光標識試薬などで染色し、これらの細胞粒子をシースフロー内で一列に配列し、細胞粒子のそれぞれにレーザ光を照射して、細胞粒子から生じる散乱光（前方散乱光および側方散乱光）と蛍光標識試薬に依存するさまざまな多色蛍光を測定することにより、細胞を分析するものである。またフローサイトメータは、分析するために収集された散乱光および蛍光に関する識別情報を電気的信号に変換し、サンプルから採取された大量の細胞粒子についての電気的信号を統計的に評価することにより、生体の病変などの状態を診断することを可能にするものである。さらにセルソータは、散乱光と蛍光に関する識別情報を電気的信号に変換し、この電気的信号に基づいて、分取したい各細胞粒子を含む液滴を選択的に荷電し、この液滴が落下する経路上に直流電場を形成することにより、特定の細胞粒子を選択的に収集することを可能にするものである。
【０００３】
図１は、セルソータ１の一般的な構成を説明するための模式図である。このセルソータ１は、概略、蛍光標識試薬などで染色された細胞粒子をシースフロー内で一列に配列するための流体フロー機構１０と、各細胞粒子に波長の異なる複数のレーザ光を照射し、散乱光および蛍光を受光するための光学的機構４０と、散乱光および蛍光から得られた信号を解析し、所定のタイミングで細胞粒子に電荷を与えることにより細胞粒子を分別するためのソータ機構６０とを備える。
【０００４】
流体フロー機構１０は、図１に示すように、通常、シースフローを形成するための円筒状のフローチャンバ１２と、蛍光標識された細胞粒子を含むサンプル懸濁液を収容するためのサンプル容器１４と、シース液を収容するためのシース容器１６と、サンプル容器１４内の気圧を制御する圧力コントローラ１８と、大量のシース液を貯蔵しシース容器１６にシース液を供給するプレナム容器２４と、サンプル容器１４およびプレナム容器２４に圧縮空気を供給するためのエアポンプ２６，２７備える。フローチャンバ１２の下流側にはより断面積の小さいフローセル３０が形成されている。こうして構成された流体フロー機構１０において、エアポンプ２６，２７が作動すると、サンプル容器１４およびシース容器１６にそれぞれ収容されたサンプル懸濁液およびシース液がフローチャンバ１２内に供給され、シース液がサンプル懸濁液を円筒状に包み込むシースフロー（層流）が形成され、フローセル３０を通過した後、流路ブロック２８のオリフィス３４からジェットフローとして噴出される。このとき、フローセル３０には所定の周波数の振動が与えられ、ブレイク・オフ・ポイントＢＰにおいてジェットフローから液滴Ｄが分離する。
【０００５】
光学的機構４０は、ジェットフロー内を整列して通過する細胞粒子に異なる波長の複数のレーザビーム（励起光）を順次照射し、細胞粒子で散乱して生じた前方散乱光および側方散乱光、ならびに各レーザビームが細胞粒子を励起して生じたさまざまな波長を有する複数の蛍光を検出し、各細胞粒子の識別情報をソータ機構６０に供給する。
【０００６】
ソータ機構６０は、各細胞粒子の識別情報に基づいて、各細胞粒子の種類等を特定・同定し、フローセル３０の下方に配置した電極を用いて、ブレイク・オフ・ポイントＢＰにある細胞粒子に識別情報に応じた極性を有する電荷を与え、帯電した細胞粒子を含む液滴Ｄが所定の電圧差を有する偏向板６２の間を通過するときに所望のスライドグラス６８の方へ偏向し、分取されるように構成されている。
【０００７】
本願特許出願と同一の譲受人に譲渡された特許文献１に記載の発明においては、フローセル３０内の細胞粒子は、フローセル３０の中心に沿って移動することを前提とし、細胞粒子の移動速度は細胞粒子によらず一定であるものと仮定して、ソータ機構６０を用いて移動速度には依存しない一定のタイミングでブレイク・オフ・ポイントＢＰにおける細胞粒子に電荷を与えていた。
なお、特許文献１に記載された内容は、参考にここに一体のものとして統合される。
【特許文献１】特開２００５−３１５７９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところがフローセル３０内の実際の細胞粒子は、その大きさや形状等によっては必ずしもフローセル３０の中心Ｃに沿って移動するものではなく、図２に示すように、フローセル３０の中心Ｃから逸脱して流れることがある。フローセル３０内の細胞粒子は、一般に、側壁から中心Ｃに向かう方向の距離の２乗に比例した流速を有することが知られている（細胞粒子の流速は側壁においてゼロで、中心において最大流速ｖ０を有する）。図２では、一例として、フローセル３０の中心Ｃに沿って移動し、最大流速ｖ０を有する細胞粒子Ａ１，Ａ２，Ａ３と、フローセル３０の中心Ｃから逸脱して、最大流速ｖ０より遅い速度ｖ１を有する細胞粒子Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３が交互に流れたと仮定した場合（Ａ１，Ｂ１，Ａ２，Ｂ２，Ａ３，Ｂ３）を図示したものである。このとき、細胞粒子Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３は前掲特許文献１の発明で仮定した細胞粒子の位置（破線で示す）より遅れてシースフロー内を流れることになる（実線で示す）。したがって、細胞粒子Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３の移動速度ｖ１によらない一定のタイミングで細胞粒子に電荷を与えたとき、所望の細胞粒子Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３はブレイク・オフ・ポイントに到達しておらず、これらに適正に電荷を与えることができず、所望の細胞粒子の回収率が低減する場合があった。さらに、ブレイク・オフ・ポイントに遅れて到達した細胞粒子（たとえばＢ１）と最大流速ｖ０を有する細胞粒子（たとえばＡ１）が同時に荷電され、これらの異なる種類の複数の細胞粒子Ａ１，Ｂ１が単一の液滴内に包含されると、分別された細胞粒子の中に不要な細胞粒子が混入することになり、分別試料中の細胞粒子の純度が低下する場合がある。
【０００９】
そこで本願発明に係る１つの態様によれば、それぞれの細胞粒子の移動速度に基づいてブレイク・オフ・ポイントＢＰに到達するまでの遅延時間を計算し、これに応じたタイミングで細胞粒子に電荷を与えることにより所望の細胞粒子の回収率を増大させるとともに、所望の細胞粒子と所望しない細胞粒子とを確実に分別して、分別試料中の所望の細胞粒子のサンプル純度を改善するセルソータを実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
具体的には、本願発明の第１の態様に係るセルソータ、すなわち液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する装置は、前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出する光学的機構と、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記液体フローにおける該生物学的粒子の移動速度を検出する制御部と、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいて、該生物学的粒子に電荷を与える荷電部とを備えることを特徴とするものである。
【００１１】
好適には、前記制御部は、前記制御部は、ブレイク・オフ・ポイントで液体フローから分離する少なくとも１つの液滴フロー内における前記生物学的粒子のそれぞれの位置を、該生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいてモニタし、該位置に基づいて該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御する。
【００１２】
より好適には、前記制御部は、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、該生物学的粒子の識別情報を収集し、該識別情報に応じた極性を有する電荷を該生物学的粒子に与えるように前記荷電部を制御する。
【００１３】
さらに好適には、前記制御部は、異なる前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えないように前記荷電部を制御する。択一的には、前記制御部は、同一の前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御する。
【００１４】
また、前記制御部は、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度が所定の閾値より遅いとき、該生物学的粒子に電荷を与えないように荷電部を制御してもよい。
【００１５】
より具体的には、前記光学的機構は、第１の位置において光を照射する第１の光源と、該第１の光源で光を照射された前記生物学的粒子からの光を検出する第１の受光器と、第１の位置の下流側にある第２の位置において第２の光を照射する第２の光源と、該第２の光源で光を照射された前記生物学的粒子からの光を検出する第２の受光器とを有する。そして、前記制御部は、前記第１および第２の受光器で検出された光の信号に基づいて、前記生物学的粒子のそれぞれが第１の位置から第２の位置まで移動するために要した移動時間を計測して、該生物学的粒子の前記移動速度を検出する。
【００１６】
好適には、この装置は、前記液体フローおよび前記ブレイク・オフ・ポイントを含む撮像領域の画像を撮像する固定撮像部をさらに備える。このとき、前記制御部は、前記固定撮像部で撮像された画像に基づいて、第１の位置から前記ブレイク・オフ・ポイントまでのフロー距離、および前記液体フローから分離して形成された隣接する液滴間の液滴間隔を求めるとともに、該フロー距離、該液滴間隔および前記移動時間に基づいて、該生物学的粒子が第１の位置からブレイク・オフ・ポイントまで移動するために要する遅延時間を求める。
【００１７】
より好適には、第１および第２の光源で光を照射された前記生物学的粒子から検出された光は、該生物学的粒子からの側方散乱光または前方散乱光である。さらに好適には、前記生物学的粒子に照射する第１および第２の光は互いに波長の異なるレーザ光である。
【００１８】
また本願発明の第２の態様によれば、液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する方法が提供され、この方法は、前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出するステップと、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記液体フローにおける該生物学的粒子の移動速度を検出するステップと、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいて、該生物学的粒子に電荷を与えるステップとを有するものである。
【００１９】
さらに本願発明の第３の態様によれば、液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する装置が提供され、この装置は、シース液を収容するシース容器と、延長導管を介して前記シース容器と流体連通するプレナム容器と、前記プレナム容器に接続された第１の圧力源と、前記生物学的粒子を含むサンプル液を収納するサンプル容器と、圧力制御部を介してシース容器に接続された第２の圧力源と、前記シース容器および前記サンプル容器と流体連通し、サンプル液を包囲するシース液からなる液体フローを形成するフローセルと、シース液の温度が安定するように制御するシース温度制御部とを備えたことを特徴とするものである。
【００２０】
前記シース温度制御部は、延長導管の周囲に配設された保温材を含むことが好ましい。また、前記シース温度制御部は、前記シース容器の温度を安定させ、より好適には、前記シース容器の温度を４〜４２℃の範囲に制御する。
【００２１】
さらに好適には、この装置は、前記生物学的粒子が生存できる温度範囲にサンプル液の温度が安定するように制御するサンプル温度制御部をさらに備える。このとき、前記シース温度制御部は、前記生物学的粒子が生存できる温度範囲にシース液の温度を安定させるように構成されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本願発明に係る特定の態様によれば、所望の細胞粒子の回収率を増大させ、分別試料中の細胞粒子の純度を改善することができるセルソータを実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、添付図面を参照して本願発明に係るセルソータ１の実施形態を説明する。この説明において、理解を容易にするために方向を表す用語（例えば、「上方向」および「下方向」など）を適宜用いるが、これは説明のためのものであって、これらの用語は本願発明を限定するものでない。
【００２４】
図１に示すセルソータ１は、概略、蛍光標識試薬などで染色された細胞粒子をシースフロー内で一列に配列するための流体フロー機構１０と、各細胞粒子に波長の異なる複数のレーザ光を照射し、散乱光および蛍光を受光するための光学的機構４０と、散乱光および蛍光から得られた信号を解析し、所定のタイミングで細胞粒子に電荷を与えることにより細胞粒子を分別するためのソータ機構６０とを備える。
【００２５】
１．流体フロー機構
まず流体フロー機構１０について、図１、図３および図４を参照して以下説明する。
流体フロー機構１０は、概略、シースフローを形成するための円筒状のフローチャンバ１２と、蛍光染料や蛍光ラベルモノクロナール抗体などの蛍光標識試薬で蛍光標識された細胞粒子を含むサンプル懸濁液を収容するためのサンプル容器１４と、シース液を収容するためのシース容器１６とを備え、フローチャンバ１２の中心軸に沿って配設されたサンプル管１５にサンプル懸濁液が供給され、フローチャンバ１２の周縁部に接続されたシース管１７を介してフローチャンバ１２内にシース液が供給されるように構成されている。
【００２６】
また流体フロー機構１０は、図３において、サンプル容器１４内の気圧を制御する圧力コントローラ１８と、圧力コントローラ１８に圧縮空気を供給するためのエアポンプ２６と、実質的な長さを有する延長導管２０を介してシース容器１６と流体連通し、大量のシース液を貯蔵するためのプレナム容器２４と、プレナム容器２４に圧縮空気を供給するための別のエアポンプ２７とを備える。好適には、圧力コントローラ１８は、シース容器１６内の圧力をモニタして、サンプル容器１４内の圧力がシース容器より所定の圧力だけ大きくなるようにサンプル容器１４内の圧力を調整する。
【００２７】
本願発明に係るフローサイトメータおよびセルソータは、後述のように画像処理技術を用いてジェットフローの長さおよび隣接する液滴の間隔を測定することにより、細胞粒子に電荷を与えるタイミング（遅延時間）を求めている。このとき、精度の高いソーティング処理を実現するためには、ジェットフローの長さおよび液滴間隔が安定していることが求められる。ところが、ジェットフローの長さおよび液滴間隔は、シース液の温度に依存して伸縮することが知られている。すなわち、シース液の温度が上がれば、液滴の粘性が下がり、ジェットフローおよび液滴間隔は長くなる。逆に、シース液の温度が下がれば、液滴の粘性が増大し、ジェットフローおよび液滴間隔は短くなる。
【００２８】
そこで本願発明に係る流体フロー機構１０によれば、プレナム容器２４から供給されるシース液の温度を安定させる手段（シース温度制御部）が具備されている。具体的には、シース液は、プレナム容器２４からシース容器１６に向かって延長導管２０を通過しているときに、室温に接近するように温度が変動するので、図３に示すように、延長導管２０の周囲に保温材２１を設けて、室温の影響を極力抑えるようにしてもよい。また、シース容器１６を収容して一定温度に維持する温度安定器２３（破線で示す）を配置して、シース液の温度を安定させてもよい。また、シース容器１６の温度は、これに限定されるものではないが、４〜４２℃の範囲に制御してもよい。こうして、シース液の温度（ひいては粘性）を一定に制御して、シース液およびこれに含まれる細胞粒子の速度、ならびにジェットフローの長さおよび液滴間隔を一定に制御することにより、細胞粒子の分別回収率および純度を安定させることができる。
【００２９】
同様に、この流体フロー機構１０は、サンプル容器１４内のサンプル懸濁液に含まれる細胞粒子が温度に敏感で、限定的な温度範囲でのみ生存できる場合にも利用できるように、サンプル液の温度を安定させる不図示の手段（サンプル温度制御部）を備えることが好ましい。具体的には、サンプル温度制御部は、シース容器１６を収容する温度安定器２３と同様のものであってもよい。択一的には、サンプル容器１４およびシース容器１６の全体を１つのチャンバ（図示せず）の中に収容して、サンプル液およびシース液の両方の温度を安定させるように構成してもよい。
【００３０】
さらに、とりわけ図４に示すように、フローチャンバ１２の下端部には、水晶、ガラス、溶融シリカまたは透明プラスティックなどの透明部材を用いて漏斗状に形成された流路ブロック２８が配設され、その下方に断面積の小さいフローセル３０が構成されている。流路ブロック２８の上方周辺部には、周波数可変（たとえばｆ＝６０ｋＨｚ）のピエゾ圧電素子等を用いた振動器３２が配設され、流路ブロック２８の下方中央部にはオリフィス３４と、シースフローに接触してシースフローに含まれる細胞粒子に所望の極性を有する電荷を与えるための荷電電極（荷電部）３６とが設けられている。
【００３１】
こうして構成された流体フロー機構１０において、エアポンプ２６，２７が作動すると、サンプル容器１４およびシース容器１６にそれぞれ収容されたサンプル懸濁液およびシース液がフローチャンバ１２内に供給され、シース液がサンプル懸濁液を円筒状に包み込むシースフロー（層流）が形成され、フローセル３０を通過した後、流路ブロック２８のオリフィス３４からジェットフローとして噴出される。そして振動器３２により流路ブロック２８が所定の周波数で振動を与えられると、図４に示すように、ジェットフローの水平断面が鉛直方向に沿って振動器３２の周波数に同期して変調し、ブレイク・オフ・ポイントＢＰにおいてジェットフローから液滴Ｄが分離する。
【００３２】
詳細後述するが、分別すべき所望の細胞粒子がブレイク・オフ・ポイントＢＰに到達する直前と推定されるタイミングで、分別すべき細胞粒子の識別情報に応じた極性を有する電圧を荷電電極３６に印加することによりシースフローに含まれる細胞粒子に荷電し、帯電した細胞粒子を含む液滴Ｄが形成される。そして荷電電極３６の下方には、図１に示すソータ機構６０の構成部品として、所定の電圧差を有する一対の偏向板６２が配設され、落下する液滴Ｄが細胞粒子の帯電極性に応じて分別され、所定のスライドグラス６８に収容される。なお、分別すべき細胞粒子の識別情報の収集方法については、たとえば前掲の特許文献１に記載された手法を用いることができ、その開示内容はここに参考に一体のものとして統合される。
【００３３】
２．光学的機構
次に、図１および図５を参照して光学的機構４０について以下説明する。
光学的機構４０は、フローセル３０内を整列して通過する細胞粒子に異なる波長を有する複数の励起光を順次照射する第１、第２および第３の光源４１，４２，４３と、第１の光源４１からの光が細胞粒子で散乱して生じた前方散乱光を検出する前方散乱光検出装置４５と、第１、第２および第３の側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２，５３とを備える。
【００３４】
より具体的には、第１、第２および第３の光源４１，４２，４３は、レーザビームなどのコヒーレント光を生成することが好ましい。一例として、第１の光源４１は、青色レーザビーム（ピーク波長：４８８ｎｍ，出力：２０ｍＷ）を照射するＤＰＳＳレーザ（Diode Pumped Solid State Laser：半導体レーザ励起固体レーザ）であってもよい。第２の光源４２は、赤色レーザビーム（ピーク波長：６３５ｎｍ，出力：２０ｍＷ）を照射するダイオードレーザで、同様に、第３の光源４３は、近紫外レーザビーム（ピーク波長：３７５ｎｍ，出力：８ｍＷ）を照射するダイオードレーザであってもよい。
【００３５】
図５に示す前方散乱光検出装置４５は、シースフロー内の細胞粒子からの前方散乱光（ＦＳＣ）を検出する光検出器４６を有し、青色レーザビームを選択的に透過させるバンドパスフィルタ（図示せず）を介して、青色レーザビームが細胞粒子で散乱して生じた青色前方散乱光だけを検出する。
【００３６】
また、側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２，５３は、青色、赤色および紫外レーザビームが細胞粒子で散乱して生じた側方散乱光と、細胞粒子を励起して生じたさまざまな波長を有する複数の蛍光とを検出するものである。ただし、本願発明において、第３の光源４３からのレーザビームによる側方散乱光を検出することは必ずしも必要ではないので、第３の検出装置４３は蛍光のみを検出するものとして図示した。
【００３７】
より詳細には、図５において、第１（青色）の側方散乱光／蛍光検出装置５１は、青色レーザビームを受けた細胞粒子からの側方散乱光を検出する光検出器ＳＳＣ１と、微弱な蛍光を電気的に増幅して検出する複数の光電子増倍管ＦＬ１〜ＦＬ４とを有する。また、第２（赤色）の側方散乱光／蛍光検出装置５２は、赤色レーザビームを受けた細胞粒子からの側方散乱光を検出する光検出器ＳＳＣ２と、細胞粒子からの蛍光を検出する光電子増倍管ＦＬ５〜ＦＬ６とを有し、第３（紫色）の蛍光検出装置５３は、紫色レーザビームを受けた細胞粒子からの蛍光を検出する光電子増倍管ＦＬ７〜ＦＬ８を有する。さらに、各側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２，５３は、複数のハーフミラー５４と、所望の波長帯の光だけを透過する複数のバンドパスフィルタ５５を有する。
【００３８】
さらに、第１、第２および第３の光源４１，４２，４３は、フローセル３０に対して固定位置に配置され、図４に示すように、シースフローのフロー方向（鉛直下方）に沿って等間隔ｄの位置にあるシースフローに各レーザビームを照射するように構成されている。同様に、第１、第２および第３の側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２，５３は、フロー方向に沿って等間隔ｄの位置に配置されている。したがって、シースフロー内の第１の位置にある細胞粒子からの光が第１の側方散乱光／蛍光検出装置５１で検出された後、第１の位置より間隔ｄだけ下流側の第２の位置にある細胞粒子からの光が第２の側方散乱光／蛍光検出装置５２で検出されるまでの時間がｔ０であったとき、細胞粒子のシースフロー内に流れるときの移動速度ｖ０は、次式で表すことができる。
ｖ０＝ｄ／ｔ０ （１）
【００３９】
すなわち、後述するソータ機構６０のコントローラ６６は、光検出器ＳＳＣ１で細胞粒子からの側方散乱光（青色）を検出した後、光検出器ＳＳＣ２で細胞粒子からの側方散乱光（赤色）を検出するまでの時間ｔ０を測定することにより、式（１）から細胞粒子がシースフロー内で移動するときの移動速度ｖ０を算出することができる。また、光電子増倍管ＦＬ１〜ＦＬ８で検出された蛍光は、細胞粒子に固有の波長スペクトルを有し、前掲特許文献１に記載されたように、コントローラ６６は、これらの蛍光を分析することにより細胞粒子の識別情報を収集し、その種類を特定または同定することができる。
【００４０】
なお、上述の実施形態では、細胞粒子の移動速度（流速）を測定するために、側方散乱光を用いたが、前方散乱光を用いて測定することもできる。すなわち、前方散乱光検出装置４５に青色レーザビームおよび赤色レーザビームを選択的に透過させるバンドパスフィルタを設けて、細胞粒子からの青色および赤色の前方散乱光を検出する時間差により、式（１）のｔ０を検出して、移動速度ｖ０を算出してもよい。
【００４１】
３．ソータ機構
次に、図１および図６を参照してソータ機構６０について以下説明する。
ソータ機構６０は、図１に示すように、所定の電圧差を有する一対の偏向板６２と、固定撮像部６４と、コントローラ（制御部）６６とを備え、コントローラ６６は、偏向板６２、固定撮像部６４、および側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２，５３（光検出器ＳＳＣ１，ＳＳＣ２および光電子増倍管ＦＬ１〜ＦＬ８）に接続されている。
【００４２】
図６は、フローセル３０内のシースフローＦＳと、フローセル３０のオリフィス３４から噴出されるジェットフローＦＪ（およびジェットフローＦＪからブレイク・オフ・ポイントＢＰで分離する液滴Ｄを含む）とを簡略的に図示したものである。上述のように、流路ブロック２８に取り付けられた振動器３２が所定の周波数（たとえばｆ＝６０ｋＨｚ）で振動すると、図６に示すようにジェットフローＦＪの水平方向断面が鉛直下方に沿って振動器３２の周波数ｆに同期して変調する。このときのジェットフローＦＪの変調周期（隣接する極大点または極小点の間の距離および隣接する液滴Ｄの間の距離）λは一定となる。
【００４３】
固定撮像部６４は、ＣＣＤカメラなどの撮像部と点滅光源（図示せず）とを有し、フローセル３０に対して固定された位置に配置され、ジェットフローＦＪの下流側から下流方向に所定距離隔てた画像位置Ｐ１から、さらに下流側にあるＰ２までの撮像領域（破線で示す）７０におけるジェットフローＦＪおよび液滴Ｄの画像を撮像するように設計されている。また点滅光源は、撮像領域７０にあるジェットフローＦＪと液滴Ｄを、振動器３２の周波数ｆと同一の周波数で点滅照明するように構成されている。したがって、固定撮像部６４は、定常状態にあるジェットフローＦＪおよび液滴Ｄを振動器３２の周波数ｆで撮像するため、図６のように静止したように見える画像を得ることができる。
【００４４】
このとき、固定撮像部６４はフローセル３０に対して固定されているので、図６において、第１（青色）の側方散乱光／蛍光検出装置４１が細胞粒子からの側方散乱光（青色）を検出する位置Ｐ０から、画像位置Ｐ１までの距離ＬＢ０は一定である。前掲の特許文献１に記載の発明によれば、固定撮像部６４を用いてジェットフローＦＪの変調周期λを常時モニタし、画像処理技術により位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの正確な距離Ｌ（＝ＬＢ０＋ＬＢ）をリアルタイムで算出し、これに応じて荷電電極３６がブレイク・オフ・ポイントＢＰで細胞粒子に電荷を与える遅延時間を補正していた。ただし、前掲の特許文献１においては、細胞粒子の移動速度は細胞粒子によらず一定であると仮定していた。
【００４５】
ところが、上述したように、フローセル３０内の実際の細胞粒子は、その大きさや形状等によっては必ずしもフローセル３０の中心に沿って移動するものではなく、図２に示すように、フローセル３０の中心から逸脱して流れるために、一般の細胞粒子の移動速度はフローセル３０の中心に沿って移動する細胞粒子に比べて遅くなり、細胞粒子がブレイク・オフ・ポイントＢＰに到達するまでに要する遅延時間がより長くなり、実際には、ブレイク・オフ・ポイントＢＰで細胞粒子に適正に電荷を与えることができず、あるいは収集すべき細胞粒子の中に不要な細胞粒子が混入するといった問題があった。
【００４６】
そこで本願発明は、光検出器ＳＳＣ１および光検出器ＳＳＣ２で検出された時刻または細胞粒子の移動時間ｔ０に基づいて、それぞれの細胞粒子に関する移動速度を求め、この移動速度に基づいて、各細胞粒子がブレイク・オフ・ポイントＢＰに到達するまでの遅延時間を正確に求めて、この遅延時間に基づいて個々の細胞粒子に電荷を与えようとするものである。
【００４７】
ここで図１および図６を参照しながら、第１の側方散乱光／蛍光検出装置５１が側方散乱光（青色）を検出する位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離Ｌ、および固定撮像部６４を用いて画像処理技術により測定されたジェットフローＦＪの変調周期λ（または隣接する液滴間隔）から各細胞粒子の遅延時間を求める方法について詳細に説明する。
【００４８】
ステップ１ （標準ビーズを用いたＬＢ０の事前測定）
固定撮像部６４は、位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離Ｌが一定となるように、フローセル３０に対して固定された位置に配置されるように構成されるが、固定撮像部６４を流体フロー機構１０に組み立てた後の組み立て誤差等に起因して、必ずしも高精度に位置決めできないことがある。そこで、固定撮像部６４を流体フロー機構１０に組み立てた後、実際にサンプル懸濁液に含まれる細胞粒子を分別する前に、位置Ｐ０から撮像領域７０の画像位置Ｐ１までの距離ＬＢ０を以下のように正確に測定して必要がある。
【００４９】
粒子径サイズが均一で十分に小さく、ほぼ完全な球形形状を有し、フローセル３０の中心に沿って移動することが知られている標準ビーズを含むサンプル懸濁液を用いて、予備的にソーティング処理を行う。具体的には、フローセル３０に十分な間隔をあけて標準ビーズを流し、これを一例として第１の光検出器ＳＳＣ１が検出した後適当な時間Ｔが経過した時点において、荷電電極３６を用いて標準ビーズに所定極性の電荷を与え、所定の電圧が印加された一対の偏向板６２の間を落下させることにより、標準ビーズを含む液滴Ｄを所定のスライドグラス６８に分取する。そして、時間Ｔを変動させたときのスライドグラス６８に分取された液滴Ｄの収量と時間Ｔとの関係をプロットすると、ピーク値Ｔ０を有するガウス分布のグラフが得られる。このときのピーク値Ｔ０が、標準ビーズが位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離Ｌを移動する遅延時間に相当する。こうして、コントローラ６６は、標準ビーズの遅延時間Ｔ０を測定する。
【００５０】
標準ビーズは、フローセル３０内を移動するときには速度ｖ０ｆを有し、ジェットフローＦＪを移動するときには速度ｖ０ｊを有する。そして、速度ｖ０ｆとｖ０ｊは、フローセル３０の断面積ＳｊとジェットフローＦＪの断面積Ｓｆを用いて次式で表すことができる。
ｖ０ｊ＝ｋ・ｖ０ｆ， ｋ＝Ｓｆ／Ｓｊ（＞１） （２）
ここでフローセル３０の断面積ＳｆおよびジェットフローＦＪの断面積Ｓｊは、たとえば約２００００μｍ２および約３８５０μｍ２である。
【００５１】
したがって、標準ビーズが位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離Ｌを移動する遅延時間Ｔ０は、フローセル３０内を移動する時間とジェットフローＦＪを移動する時間の和であるから、次式が成り立つ。
Ｔ０＝Ｌｆ／ｖ０ｆ＋Ｌｊ／ｖ０ｊ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／ｖ０ｊ （３）
【００５２】
一方、振動器３２の周波数ｆと同一の周波数で点滅照明されたジェットフローＦＪおよび液滴Ｄの画像は、図６のように静止したように見え、ジェットフローＦＪの極大点（または極小点）および液滴Ｄは、点滅光源の発光周期τで、変調周期λに相当する距離を移動するのであるから、移動速度ｖ０、発光周期τ（振動器３２の発振周期ｆの逆数に一致）、および変調周期λには次の関係式が成り立つ。
ｖ０ｊ＝λ／τ （４）
【００５３】
ここで、式（３）および式（４）から次式を得る。
Ｔ０／τ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／λ （５）
式（５）の左辺（Ｔ０／τ）は、細胞粒子が位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離Ｌを移動する遅延時間Ｔ０を、点滅光源の発光周期τで割ったものであり、位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの間に形成され得るシースフローＦＳおよびジェットフローＦＪの極大点（または極小点）の個数に対応するものである。ここで、この左辺（Ｔ０／τ）をドロップ・ディレイＤＤ０と定義する。
ＤＤ０＝Ｔ０／τ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／λ＝（ＬＢ＋ＬＢ０）／λ （６）
また、式（５）を変形して次式を得る。
Ｌｊ＝λ・Ｔ０／τ−ｋＬｆ （７）
【００５４】
固定撮像部６４は、フローセル３０に対して固定された位置に配置され、画像位置Ｐ１からＰ２までの破線で示す撮像領域７０におけるジェットフローＦＪおよび液滴Ｄの画像を撮像するように配設されており、この撮像領域７０の背景には適当なスケールまたは基準測定物が配置されている。こうしてコントローラ６６は、前掲の特許文献１に記載されたような適当な画像処理技術を用いて、ジェットフローＦＪの変調周期（および隣接する液滴Ｄの間隔）λと、画像位置Ｐ１からブレイク・オフ・ポイントＢＰまでの距離ＬＢを測定する。
【００５５】
距離Ｌｆおよび係数ｋはフローセル３０に固有のものであり、点滅光源の発光周期τは既知であって調整可能であり、遅延時間Ｔ０および変調周期λは上述のように測定されるので、コントローラ６６は、式（７）より距離Ｌｊを正確に算出し、算出されたＬｊを式（６）に代入してドロップ・ディレイＤＤ０を一意的に決定することができる。同様に、図６から明らかなように、位置Ｐ０から画像位置Ｐ１までの距離ＬＢ０を特定することができる（ＬＢ＝Ｌ−ＬＢ０）。こうして得られた距離ＬＢ０およびドロップ・ディレイＤＤ０は、移動時間ｔ０とともに、コントローラ６６の図示しないメモリに記憶しておく。
【００５６】
ステップ２ （サンプル懸濁液に含まれる細胞粒子の測定）
サンプル懸濁液に含まれる細胞粒子は、図２の細胞粒子Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３のようにフローセル３０の中心から逸脱した経路を移動するとき、標準ビーズの移動速度ｖ０より遅い移動速度ｖ１を有し、とりわけフローセル３０内を移動するときには速度ｖ１ｆを有し、ジェットフローＦＪを移動するときには速度ｖ１ｊを有する。このとき、式（２）および式（３）と同様、次式が得られる。
ｖ１ｊ＝ｋ・ｖ１ｆ， ｋ＝Ｓｊ／Ｓｆ（＞１） （８）
Ｔ１＝Ｌｆ／ｖ１ｆ＋Ｌｊ／ｖ１ｊ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／ｖ１ｊ （９）
【００５７】
式（８）および式（９）を変形して、次式を得る。
Ｔ１／τ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／λ （１０）
同様に、ドロップ・ディレイＤＤ１を次のように定義する。
ＤＤ１＝Ｔ１／τ （１１）
【００５８】
上述のように、標準ビーズが移動速度ｖ０ｆで第１の光検出器ＳＳＣ１および第２の光検出器ＳＳＣ２の検出位置の間の距離ｄを時間ｔ０で移動したとき、移動速度ｖ０ｆは次式で与えられる。
ｖ０ｆ＝ｄ／ｔ０ （１２）
同様に、細胞粒子が移動速度ｖ１ｆで第１の光検出器ＳＳＣ１および第２の光検出器ＳＳＣ２の検出位置の間の距離ｄを時間ｔ１で移動したとき移動速度ｖｆは次式で与えられる。
ｖ１ｆ＝ｄ／ｔ１ （１３）
したがって、式（１２）および式（１３）から、次式が得られる。
ｖ１ｆ＝（ｔ０／ｔ１）・ｖ０ｆ （１４）
同様に、式（２）および式（８）から次式が得られる。
ｖ１ｊ＝（ｔ０／ｔ１）・ｖ０ｊ
＝（ｔ０／ｔ１）・λ／τ （ｖ０ｊ＝λ／τ 式（４）） （１５）
これを式（９）に代入して次式を得る。
Ｔ１＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／（ｔ０／ｔ１）・τ／λ （１６）
よってドロップ・ディレイＤＤ１（＝Ｔ１／τ）は次式で求めることができる。
ＤＤ１＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／（ｔ０／ｔ１）／λ
＝ＤＤ０／（ｔ０／ｔ１） （１７）
（ＤＤ０＝Ｔ０／τ＝（ｋ・Ｌｆ＋Ｌｊ）／λ 式（６））
【００５９】
式（１６）および式（１７）において、距離Ｌｆおよび係数ｋはフローセル３０に固有のものであり、距離ＬＢ０はステップ１で測定され、距離ＬＢは固定撮像部６４および画像処理技術を用いて測定可能であるから、距離Ｌｊ（＝ＬＢ０＋ＬＢ−ｋ・Ｌｆ）を測定することができる。また、点滅光源の発光周期τは既知であって調整可能であり、変調周期λおよび時間ｔ１および時間ｔ０も同様に測定することができる。したがって、コントローラ６６は、それぞれの細胞粒子に対するドロップ・ディレイＤＤ１および遅延時間Ｔ／τを正確に求めることができる。
【００６０】
次に、図７（ａ）〜図７（ｃ）を参照しながら、各細胞粒子に対して求められたドロップ・ディレイＤＤ１および遅延時間Ｔを用いて、各細胞粒子の識別情報に基づいた所定の極性を有する電荷を荷電電極３６から細胞粒子に与える方法（またはソーティングロジック）について説明する。
【００６１】
遅延時間とは、上述のように、細胞粒子が位置Ｐ０からブレイク・オフ・ポイントＢＰに到達するまでの時間であるので、各細胞粒子の遅延時間が計算されると、ブレイク・オフ・ポイントＢＰ付近にあるジェットフローＦＪに存在する各細胞粒子の位置を任意の時刻において推定することができる。一例として、ブレイク・オフ・ポイントＢＰ付近にあるジェットフローＦＪの拡大図である図７（ａ）〜図７（ｃ）に示すように、ジェットフローＦＪは、通常、変調周期λで変動する水平断面を有し、断面積が極小となる複数の狭窄部ＤＣを有する。すなわち、ブレイク・オフ・ポイントＢＰ付近において、隣接する狭窄部ＤＣの間にある一部のジェットフローＦＪが分離して独立した液滴Ｄを形成する。ここで、隣接する狭窄部ＤＣの間のジェットフローＦＪの一部を「液滴フローＤＦ」と定義する（図７（ａ）〜図７（ｃ）では、５つの液滴フローＤＦ１〜ＤＦ５が図示されている。）。すなわちジェットフロー（液体フロー）ＦＪは、下流方向ブレイク・オフ・ポイントＢＰに近づくとき液滴フローＤＦを形成し、ブレイク・オフ・ポイントＢＰに直近の液滴フローＤＦ１は、ジェットフローＦＪから独立した液滴Ｄを形成するものである。
【００６２】
図７（ａ）に示すように、ある時刻において分取したい細胞粒子Ｔ（以下、「目的細胞粒子」という。図中、白丸で示す。）が液滴フローＤＦ１に含まれることが上記遅延時間に基づいて推定されるとき、液滴フローＤＦ１から液滴Ｄが分離するまでの時間（すなわち変調周期λに相当する時間）、荷電電極３６を用いてジェットフローＦＪ全体に電圧を印加することにより、目的細胞粒子Ｔを確実に荷電することができる。換言すると、本願発明のコントローラ６６は、各細胞粒子の移動速度（または上記遅延時間）に基づいて液滴フローＤＦ１における位置をリアルタイムでモニタし、目的細胞粒子Ｔが液滴フローＤＦ１の所定の適正位置に存在すると判断したとき、所定期間（変調周期λ）荷電電極３６を用いて目的細胞粒子Ｔを確実に荷電するものである。
【００６３】
択一的には、図７（ｂ）に示すように、目的細胞粒子Ｔがブレイク・オフ・ポイントＢＰの直近にある２つまたは３つの液滴フローＤＦ（たとえば液滴フローＤＦ２）に含まれることが認められる場合に、それぞれ変調周期λの２倍または３倍の時間、ジェットフローＦＪ全体に電圧を印加して、目的細胞粒子Ｔに電荷を与えてもよい。このときコントローラ６６は、目的細胞粒子Ｔの識別情報に応じて、目的細胞粒子Ｔに与える電荷の極性を選択する。
【００６４】
ところが、上述のように各細胞粒子の遅延時間（ブレイク・オフ・ポイントＢＰまで到達する時間）が互いに異なるので、図７（ｃ）に示すように、荷電電極３６から電圧が印加される液滴フローＤＦ１の中に、目的細胞粒子Ｔと、これとは種類の異なる細胞粒子Ｆ（以下、「非目的細胞粒子」という。図中、黒丸で示す。）が混在する場合がある。このとき、所望する細胞粒子Ｔの純度を高めるためには、本願発明に係るコントローラ６６は、これらの細胞粒子Ｔ，Ｆに電荷を与えないように荷電電極３６を制御する。あるいは、目的細胞粒子Ｔの純度を犠牲にしても、目的細胞粒子Ｔをより多く分取するためには、コントローラ６６は、これらの細胞粒子Ｔ，Ｆを含む液滴フローＤＦ１に荷電するように荷電電極３６を制御してもよい。目的細胞粒子Ｔの純度または収量のいずれを優先すべきか、ユーザが選択できるようにコントローラ６６を構成することが好ましい。さらに図７（ｂ）を参照して説明したように、目的細胞粒子Ｔがブレイク・オフ・ポイントＢＰの直近にある２つまたは３つの液滴フローＤＦ１〜ＤＦ３に含まれる場合に、それぞれ変調周期λの２倍または３倍の時間、これらの液滴フローＤＦ１〜ＤＦ３に電圧を印加して、目的細胞粒子Ｔを荷電してもよい。また、各細胞粒子の遅延時間が互いに異なることに起因して、荷電電極３６から電圧が印加される液滴フローＤＦ１の中に、目的細胞粒子Ｔが複数個含まれる場合には、コントローラ６６は、これらの目的細胞粒子Ｔを含む液滴フローＤＦに荷電するように荷電電極３６を制御することが好ましい。
【００６５】
また、目的細胞粒子Ｔの純度をさらに改善する例示的な方法について説明する。図７（ｂ）に示すように、目的細胞粒子Ｔがブレイク・オフ・ポイントＢＰの直近にある連続する３つの液滴フローＤＦ１〜ＤＦ３の中央に配置された液滴フローＤＦ２内に含まれ、かつ、その前後（上流側および下流側）にある液滴フローＤＦ１およびＤＦ３内には非目的細胞粒子Ｆが含まれない場合にのみ、コントローラ６６は、目的細胞粒子Ｔを含む液滴フローＤＦ２のみを荷電するように荷電電極３６を制御してもよい。こうして予期しない要因により、非目的細胞粒子Ｆが目的細胞粒子Ｔを含む液滴フローＤＦ内に混入するおそれをさらに低減することができる。また、詳細図示しないが、目的細胞粒子Ｔがブレイク・オフ・ポイントＢＰの直近にある連続する５つの液滴フローＤＦ１〜ＤＦ５のうちの中央に配置された３つの液滴フローＤＦ２〜ＤＦ４内に含まれ、かつ、その前後（上流側および下流側）にある液滴フローＤＦ１およびＤＦ５内には非目的細胞粒子Ｆが含まれない場合にのみ、コントローラ６６は、それぞれ変調周期λの３倍の時間、目的細胞粒子Ｔを含む中央に配置された液滴フローＤＦ２〜ＤＦ４のみを荷電するように荷電電極３６を制御してもよい。こうして、非目的細胞粒子Ｆをより精度よく（より確実に）排除して、目的細胞粒子Ｔの純度を改善することができる。
【００６６】
さらに択一的には、コントローラ６６は、式（１４）で測定されたフローセル３０内の移動速度ｖ１ｆが所定の閾値ｖｔｈより小さいと判断したとき（ｖ１ｆ＞ｖｔｈ）、または式（１６）で測定された遅延時間Ｔ１が所定の閾値Ｔｔｈより長いと判断したとき（Ｔ１＜Ｔｔｈ）、その細胞粒子に対して電荷を与えないように荷電電極３６を制御してもよい。
【００６７】
本願発明によれば、ソーティングロジックは上記のものに限定されるものではなく、他の任意のものを用いることができるが、細胞粒子のそれぞれに対して遅延時間を正確に求め、さらにブレイク・オフ・ポイントＢＰ付近にある液滴フローＤＦに含まれる目的細胞粒子Ｔの配置位置を正確に特定することにより、個々の目的細胞粒子Ｔの識別情報に基づいて高い精度で電荷を与えることができる。
【００６８】
より具体的には、第１および第２の側方散乱光／蛍光検出装置５１，５２でそれぞれの細胞粒子から得られた光を検出する時間差から、ブレイク・オフ・ポイントＢＰ付近にある液滴フローＤＦに存在する各細胞粒子の位置をモニタすることができる。また、図２で説明したような最大流速ｖ０より遅い速度ｖ１を有する細胞粒子ＢのドロップディレイＤＤ１は、標準ビーズＡのドロップディレイをそれぞれＤＤ０を用いて、式（１７）により算出し、上記のソーティングロジックに容易に適用することができる。たとえば、ＤＤ０＝３０で、ｔ０／ｔ１＝０．９５の場合、ＤＤ１＝３１．５８となり、ｔ０／ｔ１＝１．０５の場合、ＤＤ１＝２８．５７となる。
【００６９】
上記のように、細胞粒子のそれぞれを識別情報に基づいて正確に分別するためには、ブレイク・オフ・ポイントＢＰにおける各細胞粒子の位置を勘案して分別すべきか否かを判断する必要がある。たとえば、標準ビーズＡの遅延時間Ｔ０が経過したときの、細胞粒子Ｂの到達位置ＰＢは、ドロップディレイＤＤ０を用いて次式で表される。
ＰＢ＝ｖ１ｊ／Ｔ０／λ＝（ｔ０／ｔ１）・λ／τ・Ｔ０
＝（ｔ０／ｔ１）・ＤＤ０ （１８）
したがって、細胞粒子Ｂが標準ビーズＡに対して遅延している距離ΔＤは、ドロップディレイＤＤ０を用いて次式で表される。
ΔＤ＝（ｔ０／ｔ１）ＤＤ０−ＤＤ０＝（ｔ０／ｔ１−１）・ＤＤ０ （１９）
このとき、細胞粒子Ｂは標準ビーズＡより遅いので（ｔ０＜ｔ１）、ΔＤは負の値となる。たとえば、ＤＤ０＝３０で、ｔ０／ｔ１＝０．９５のとき、細胞粒子Ｂは、ＤＤ０の１．５倍の距離だけ遅れることになる。同様にして、標準ビーズＡの遅延時間Ｔ０を含む任意の時間においてすべての細胞粒子の位置を、ドロップディレイＤＤ０を用いて特定することができる。こうして、各細胞粒子の位置をモニタして、目的細胞粒子Ｔが液滴フローＤＦ１の所定の適正位置に存在すると判断したとき、所定期間（変調周期λ）荷電電極３６を用いて目的細胞粒子Ｔを確実に荷電することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】セルソータの一般的な構成を説明するための模式図である。
【図２】シースフロー内に流れる細胞粒子がさまざまな移動速度を有し得る様子を示す概念図である。
【図３】本願発明に係る流体フロー機構の構成を示す概略図である。
【図４】図３に示すフローチャンバ、フローセル、およびジェットフローの拡大図である。
【図５】本願発明に係る光学的機構の構成を示す概略図である。
【図６】シースフロー、ジェットフロー、およびブレイク・オフ・ポイントで分離する液滴の拡大模式図である。
【図７】ブレイク・オフ・ポイント付近にあるジェットフローおよび液滴フロー、ならびに液滴の拡大図である。
【符号の説明】
【００７１】
１：セルソータ、１０：流体フロー機構、１２：フローチャンバ、１４：サンプル容器、１５：サンプル管、１６：シース容器、１７：シース管、１８：圧力コントローラ、２０：延長導管、２１：保温材、２３：温度安定器、２４：プレナム容器、２６，２７：エアポンプ、２８：流路ブロック、３０：フローセル、３２：振動器、３４：オリフィス、３６：荷電電極（荷電部）、４０：光学的機構、４１：第１の光源（青色）、４２：第２の光源（赤色）、４３：第３の光源（紫色）、４５：前方散乱光検出装置、４６：光検出器、５１：第１の側方散乱光／蛍光検出装置、５２：第２の側方散乱光／蛍光検出装置、５３：第３の蛍光検出装置、５４：ハーフミラー、５５：バンドパスフィルタ、６０：ソータ機構、６２：偏向板、６４：固定撮像部、６６：コントローラ（制御部）、６８：スライドグラス、７０：撮像領域、ＳＳＣ１，ＳＳＣ２：光検出器、ＦＬ１〜ＦＬ８：光電子増倍管、Ａ１〜Ａ３：標準細胞粒子（標準ビーズ）、細胞粒子Ｂ１〜Ｂ３：細胞粒子、ＢＰ：ブレイク・オフ・ポイント、ＦＳ：シースフロー、ＦＪ：ジェットフロー、Ｄ：液滴、ＤＣ：狭窄部、ＤＦ１〜ＤＦ５：液滴フロー、Ｔ：目的細胞粒子，Ｆ：非目的細胞粒子。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する装置であって、
前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出する光学的機構と、
前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記液体フローにおける該生物学的粒子の移動速度を検出する制御部と、
前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいて、該生物学的粒子に電荷を与える荷電部とを備えることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記制御部は、ブレイク・オフ・ポイントで液体フローから分離する少なくとも１つの液滴フロー内における前記生物学的粒子のそれぞれの位置を、該生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいてモニタし、該位置に基づいて該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記制御部は、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、該生物学的粒子の識別情報を収集し、該識別情報に応じた極性を有する電荷を該生物学的粒子に与えるように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記制御部は、異なる前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えないように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記制御部は、同一の前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記制御部は、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度が所定の閾値より遅いとき、該生物学的粒子に電荷を与えないように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記光学的機構は、第１の位置において光を照射する第１の光源と、該第１の光源で光を照射された前記生物学的粒子からの光を検出する第１の受光器と、第１の位置の下流側にある第２の位置において第２の光を照射する第２の光源と、該第２の光源で光を照射された前記生物学的粒子からの光を検出する第２の受光器とを有し、
前記制御部は、前記第１および第２の受光器で検出された光の信号に基づいて、前記生物学的粒子のそれぞれが第１の位置から第２の位置まで移動するために要した移動時間を計測して、該生物学的粒子の前記移動速度を検出することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記液体フローおよび前記ブレイク・オフ・ポイントを含む撮像領域の画像を撮像する固定撮像部をさらに備え、
前記制御部は、前記固定撮像部で撮像された画像に基づいて、第１の位置から前記ブレイク・オフ・ポイントまでのフロー距離、および前記液体フローから分離して形成された隣接する液滴間の液滴間隔を求めるとともに、該フロー距離、該液滴間隔および前記移動時間に基づいて、該生物学的粒子が第１の位置からブレイク・オフ・ポイントまで移動するために要する遅延時間を求めることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項９】
第１および第２の光源で光を照射された前記生物学的粒子から検出された光は、該生物学的粒子からの側方散乱光または前方散乱光であることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項１０】
前記生物学的粒子に照射する第１および第２の光は互いに波長の異なるレーザ光であることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項１１】
液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する方法であって、
前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出するステップと、
前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記液体フローにおける該生物学的粒子の移動速度を検出するステップと、
前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいて、該生物学的粒子に電荷を与えるステップとを有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
電荷を与えるステップは、ブレイク・オフ・ポイントで液体フローから分離する少なくとも１つの液滴フロー内における前記生物学的粒子のそれぞれの位置を、該生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいてモニタし、該位置に基づいて該生物学的粒子に電荷を与えるステップを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
電荷を与えるステップは、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、該生物学的粒子の識別情報を収集し、該識別情報に応じた極性を有する電荷を該生物学的粒子に与えるステップを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
電荷を与えるステップは、異なる前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えないステップを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
電荷を与えるステップは、同一の前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えるステップを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
電荷を与えるステップは、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度が所定の閾値より遅いとき、該生物学的粒子に電荷を与えないないステップを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
第１および第２の位置における複数の生物学的粒子に光を照射し、該生物学的粒子からの光を検出するステップと、
前記第１および第２の位置で検出された光の信号に基づいて、該生物学的粒子のそれぞれが第１の位置から第２の位置まで移動するために要した移動時間を計測して、該生物学的粒子の前記移動速度を検出するステップとを有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記液体フローおよびブレイク・オフ・ポイントを含む撮像領域の画像を撮像するステップと、
前記画像に基づいて、第１の位置からブレイク・オフ・ポイントまでのフロー距離、および前記液体フローから分離して形成された隣接する液滴間の液滴間隔を求めるとともに、該フロー距離、該液滴間隔および前記移動時間に基づいて、該生物学的粒子が第１の位置からブレイク・オフ・ポイントまで移動するために要する遅延時間を求めるステップとを有することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する装置であって、
シース液を収容するシース容器と、
延長導管を介して前記シース容器と流体連通するプレナム容器と、
前記プレナム容器に接続された第１の圧力源と、
前記生物学的粒子を含むサンプル液を収納するサンプル容器と、
圧力制御部を介してシース容器に接続された第２の圧力源と、
前記シース容器および前記サンプル容器と流体連通し、サンプル液を包囲するシース液からなる液体フローを形成するフローセルと、
シース液の温度が安定するように制御するシース温度制御部とを備えたことを特徴とする装置。
【請求項２０】
前記シース温度制御部は、延長導管の周囲に配設された保温材を含むことを特徴とする請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記シース温度制御部は、前記シース容器の温度を安定させることを特徴とする請求項１９に記載の装置。
【請求項２２】
前記シース温度制御部は、前記シース容器の温度を４〜４２℃の範囲に制御することを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記生物学的粒子が生存できる温度範囲にサンプル液の温度が安定するように制御するサンプル温度制御部をさらに備え、
前記シース温度制御部は、前記生物学的粒子が生存できる温度範囲にシース液の温度を安定させることを特徴とする請求項１９に記載の装置。
【請求項１】
液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する装置であって、
前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出する光学的機構と、
前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記液体フローにおける該生物学的粒子の移動速度を検出する制御部と、
前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいて、該生物学的粒子に電荷を与える荷電部とを備えることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記制御部は、ブレイク・オフ・ポイントで液体フローから分離する少なくとも１つの液滴フロー内における前記生物学的粒子のそれぞれの位置を、該生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいてモニタし、該位置に基づいて該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記制御部は、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、該生物学的粒子の識別情報を収集し、該識別情報に応じた極性を有する電荷を該生物学的粒子に与えるように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記制御部は、異なる前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えないように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記制御部は、同一の前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えるように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記制御部は、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度が所定の閾値より遅いとき、該生物学的粒子に電荷を与えないように前記荷電部を制御することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記光学的機構は、第１の位置において光を照射する第１の光源と、該第１の光源で光を照射された前記生物学的粒子からの光を検出する第１の受光器と、第１の位置の下流側にある第２の位置において第２の光を照射する第２の光源と、該第２の光源で光を照射された前記生物学的粒子からの光を検出する第２の受光器とを有し、
前記制御部は、前記第１および第２の受光器で検出された光の信号に基づいて、前記生物学的粒子のそれぞれが第１の位置から第２の位置まで移動するために要した移動時間を計測して、該生物学的粒子の前記移動速度を検出することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記液体フローおよび前記ブレイク・オフ・ポイントを含む撮像領域の画像を撮像する固定撮像部をさらに備え、
前記制御部は、前記固定撮像部で撮像された画像に基づいて、第１の位置から前記ブレイク・オフ・ポイントまでのフロー距離、および前記液体フローから分離して形成された隣接する液滴間の液滴間隔を求めるとともに、該フロー距離、該液滴間隔および前記移動時間に基づいて、該生物学的粒子が第１の位置からブレイク・オフ・ポイントまで移動するために要する遅延時間を求めることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項９】
第１および第２の光源で光を照射された前記生物学的粒子から検出された光は、該生物学的粒子からの側方散乱光または前方散乱光であることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項１０】
前記生物学的粒子に照射する第１および第２の光は互いに波長の異なるレーザ光であることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項１１】
液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する方法であって、
前記生物学的粒子のそれぞれに光を照射して、該生物学的粒子からの光を検出するステップと、
前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、前記液体フローにおける該生物学的粒子の移動速度を検出するステップと、
前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいて、該生物学的粒子に電荷を与えるステップとを有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
電荷を与えるステップは、ブレイク・オフ・ポイントで液体フローから分離する少なくとも１つの液滴フロー内における前記生物学的粒子のそれぞれの位置を、該生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度に基づいてモニタし、該位置に基づいて該生物学的粒子に電荷を与えるステップを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
電荷を与えるステップは、前記生物学的粒子のそれぞれからの光に基づいて、該生物学的粒子の識別情報を収集し、該識別情報に応じた極性を有する電荷を該生物学的粒子に与えるステップを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
電荷を与えるステップは、異なる前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えないステップを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
電荷を与えるステップは、同一の前記識別情報を有する複数の前記生物学的粒子が少なくとも１つの液滴フロー内に含まれるとき、該生物学的粒子に電荷を与えるステップを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
電荷を与えるステップは、前記生物学的粒子のそれぞれの前記移動速度が所定の閾値より遅いとき、該生物学的粒子に電荷を与えないないステップを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
第１および第２の位置における複数の生物学的粒子に光を照射し、該生物学的粒子からの光を検出するステップと、
前記第１および第２の位置で検出された光の信号に基づいて、該生物学的粒子のそれぞれが第１の位置から第２の位置まで移動するために要した移動時間を計測して、該生物学的粒子の前記移動速度を検出するステップとを有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記液体フローおよびブレイク・オフ・ポイントを含む撮像領域の画像を撮像するステップと、
前記画像に基づいて、第１の位置からブレイク・オフ・ポイントまでのフロー距離、および前記液体フローから分離して形成された隣接する液滴間の液滴間隔を求めるとともに、該フロー距離、該液滴間隔および前記移動時間に基づいて、該生物学的粒子が第１の位置からブレイク・オフ・ポイントまで移動するために要する遅延時間を求めるステップとを有することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
液体フローに含まれる複数の生物学的粒子を分別する装置であって、
シース液を収容するシース容器と、
延長導管を介して前記シース容器と流体連通するプレナム容器と、
前記プレナム容器に接続された第１の圧力源と、
前記生物学的粒子を含むサンプル液を収納するサンプル容器と、
圧力制御部を介してシース容器に接続された第２の圧力源と、
前記シース容器および前記サンプル容器と流体連通し、サンプル液を包囲するシース液からなる液体フローを形成するフローセルと、
シース液の温度が安定するように制御するシース温度制御部とを備えたことを特徴とする装置。
【請求項２０】
前記シース温度制御部は、延長導管の周囲に配設された保温材を含むことを特徴とする請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記シース温度制御部は、前記シース容器の温度を安定させることを特徴とする請求項１９に記載の装置。
【請求項２２】
前記シース温度制御部は、前記シース容器の温度を４〜４２℃の範囲に制御することを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記生物学的粒子が生存できる温度範囲にサンプル液の温度が安定するように制御するサンプル温度制御部をさらに備え、
前記シース温度制御部は、前記生物学的粒子が生存できる温度範囲にシース液の温度を安定させることを特徴とする請求項１９に記載の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−１４５２１３（Ｐ２００９−１４５２１３Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２３２２５（Ｐ２００７−３２３２２５）
【出願日】平成１９年１２月１４日（２００７．１２．１４）
【出願人】（５０２４３７７０２）ベイバイオサイエンス株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１４日（２００７．１２．１４）
【出願人】（５０２４３７７０２）ベイバイオサイエンス株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
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