【課題】タイプＩＶコラーゲンＮＣ１領域由来のペプチド及びその抗体を用いて、腎炎の検出、動物モデルの作製、腎炎治療薬の開発。
【解決手段】ペプチド及び、それらの抗体（新規に精製できた自己抗体及び従来手法で作製の動物由来抗体）を用いる。具体的には、これらのペプチドを抗原としたＥＩＡ法（ＥＬＩＳＡ法も含む）の測定試薬を開発し、腎炎試料から抗ペプチド抗体を見出した。測定方法は、免疫反応である限り、どのような方法でも良く、現在市販されている試薬に用いられている方法なら速やかに導入できる。ペプチド抗体の検出は、抗ＮＣ１抗体の検出に比べ格段に高感度である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タイプＩＶコラーゲン由来のペプチド及びその抗体の利用に関する。特にタイプＩＶコラーゲンのＮＣ１領域由来のペプチド及びその抗体を利用した測定試薬である。
【背景技術】
【０００２】
タイプＩＶコラーゲンは、三本鎖螺旋構造の７Ｓと中央螺旋域（以下、ＴＨ）、非螺旋構造のＮＣ１領域とに分けられる。従来、タイプＩＶコラーゲンの三本鎖螺旋領域はタイプＩＶコラーゲンの名称で、腎炎尿より検出されるとして、その測定試薬は臨床診断薬に用いられている。又、タイプＩＶコラーゲンのＮＣ１領域（以下、ＮＣ１）は、腎炎でＮＣ１の尿中濃度測定が有用であることが判明した（特願２００３−４３６１５０）。
【０００３】
タイプＩＶコラーゲンはａ１鎖からａ６鎖までの６鎖があり、タイプＩＶコラーゲン１分子はａ鎖三本で構成されている（文献；Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３０（５）：１２１９−１２２９，１９９５）。稀な腎炎であるグッドパスチャー症候群（狭義の抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎）の抗原は、ＮＣ１のａ３鎖上の特定の立体構造部位であると考えられている（文献；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（１６）：１１２６７−１１２７４，１９９９．）。抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎では、ａ３鎖のＮＣ１以外も含む巨大なＧＢＭを抗原とした測定法で抗ＧＢＭ抗体が血中より測定され、その測定試薬キットは臨床診断薬に用いられている。
【発明の開示】

【発明が解決しょうとする課題】
【０００４】
これらは次のような問題があった。測定試薬キットで、タイプＩＶコラーゲン三本鎖領域を標準品に用いるときや抗タイプＩＶコラーゲン三本鎖領域抗体作製時には、通常ヒトもしくは動物の胎盤や腎臓や眼球から三本鎖を抽出する必要があり、多大の時間と格別の技術を要する。ＮＣ１も三本鎖と同様に抽出と精製には多大の労力と技術を要する。三本鎖螺旋領域（以下、三本鎖）やＮＣ１を含めてタイプＩＶコラーゲンは分子量が大きいので、尿中に測定される三本鎖やＮＣ１の分子全体が同じように疾患に関与しているのでは無く、一部が中核として疾患に関与している可能性がある。
そのような観点も入れて、腎炎に関しては、タイプＩＶコラーゲンに限らず広く健常者と異なる蛋白やペプチドを患者の血液や尿から得る努力が払われている。が、未だ、健常者と腎炎患者を識別する物質の特定には至っていない。
実際、患者さんの試料（組織、抽出物、血液、尿など）から蛋白やペプチドを電気泳動で分離して解析することは、疾患に関わる中核部分を見出そうとする試みであるが、蛋白やペプチドの特定にはやはり至っていない。
抗ＧＢＭ抗体腎炎では抗原部位が特定されているが、患者さんの尿や血清試料からの抗原はもちろん、それに代わる蛋白やペプチド検出の報告も無い。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者は、長年のタイプＩＶコラーゲン研究の結果、本願を成し遂げた。それは、既に報告しているペプチド（文献；医学と薬学５７（５）：６０５−６１３，２００７．ｙｐ５，８，１０，１２，１３）及び、それらの抗体（新規に精製できた自己抗体及び従来手法で作製の動物由来抗体）を用いることである。
【０００６】
具体的には、これらのペプチド（以下、ペプチド）を抗原としたＥＩＡ法（ＥＬＩＳＡ法も含む）の測定試薬を開発し、腎炎試料から抗ペプチド抗体が見出した。測定方法は、免疫反応である限り、どのような方法でも良く、現在市販されている試薬に用いられている方法なら速やかに導入できる。
ペプチド抗体の検出は、抗ＮＣ１抗体の検出に比べ格段に高感度である。
高感度であることは、少ない検体量で健常者と腎炎との識別がより明瞭にする。例えば、尿を試料とするなら、抗ＮＣ１抗体の測定では４−５倍の希釈で１００ｕｌ使用であるが、抗ペプチド抗体の測定は１０−２０倍の希釈で５０ｕｌ使用で済み、特に採取量が少ない血清が試料なら、充分に希釈して使用できることは検査として望ましい。希釈倍率を上げなければ同じ免疫方法では、より短時間の測定をも可能にする。
【０００７】
続いて、本願発明者は、ペプチドを動物（ラット、モルモット及びウサギ）に投与して作製した抗ペプチド抗体を用いて、尿中から抗原ペプチドをＥＩＡ法で検出した。
【０００８】
この結果、尿蛋白がマイナスやプラスマイナスの健常者や軽症腎炎とされる尿中にも、抗ＮＣ１抗体やＮＣ１、抗ペプチド抗体やペプチドを検出し、尿蛋白の結果と腎障害の程度とが必ずしも一致しないことを見出した。
【０００９】
患者さんからの試料を尿とするときには、早朝尿を除く日中のものを、特に午前に採取したものがふさわしい。更に、高血圧疾患なら午前採取が良い。
従来の尿蛋白試験では、一日の中でもっとも蛋白が濃縮されているとして早朝尿を用いる。しかし、発明者は、腎炎（慢性腎炎、高血圧性腎炎、糖尿病性腎炎、ＩｇＡ腎症他）の検討で、抗ＮＣ１抗体は、一日の中で日中、特に午前がもっとも高くなることを見出した。腎炎の早朝尿は一日の中でもっとも抗ＮＣ１抗体が低く、症例によっては健常者の平均プラス２倍の標準偏差（２ＳＤ）以内で健常範囲となり、腎炎としての識別は困難であった。
健常者の測定では、運動を行っても、一日の間に大きな変動は無かった。
高血圧性腎炎や降圧剤を投与中の腎炎患者さんでは特に午前の検査試料を用いることが有効である。又、健常者に比べ腎炎での腎臓は、負荷の時の耐用域が狭いものと考える。従って、心臓の検査でトレッドミルでの負荷試験を行う様に、腎臓機能検査も負荷を与えて調べる事は、患者さんの体に適した労働を選ぶのに有効と考える。その意味では、特別な負荷試験を行わず、腎機能検査として日常生活の中で尿を終日頻回採取して調べるのが現在の生活環境や労働環境がふさわしいのかを判断するのに最も良いと考える。なお、トレッドミルによる心臓機能検査は、明らかに心臓に障害が認められる時には、危険とされている。
【発明の効果】
【００１０】
抗ペプチド抗体とペプチドの測定結果は、抗ＮＣ１抗体と同じ傾向であったので、抗ペプチド抗体やペプチドの検出は、ＮＣ１や抗ＮＣ１抗体の測定に代えて利用できるだけでなく、より高感度な結果をもたらす。
利用するペプチドは合成品なので生体抽出のＮＣ１と異なり一定品質を得られる。ペプチドは抗ペプチド抗体の抗原としても、ペプチド測定の標準品としても利用できる。抗ペプチド抗体は、免疫反応の一種である免疫組織染色法にも使用できる。
更に、ペプチド及び抗ペプチド抗体は動物に投与することで腎炎モデルの作製、腎炎の治療薬として利用可能である。
以下、実施例を示すがこれに本願は限定されるものではない。
【実施例１】
【００１１】
尿中ペプチドの検索／実験Ｎｏ．７１２１９
実験概要；ＥＩＡ法による
試料の固相化；マイクロプレート（Ｍａｘｉ ｓｏａｐ ＮＵＮＫ）に希釈尿を固相化
健常者（ｎ＝１０）腎炎患者（ｎ＝９）；２倍希釈尿 ５０ｕｌ／ｗｅｌｌ
ブロック剤；０．２％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ ３００ｕｌ／ｗｅｌｌ
検出抗体；抗ｙｐ８抗体（ウサギ由来）Ｘ１，０００ ５０ｕｌ／ｗｅｌｌ、抗ｙｐ１２抗体（ウサギ由来）Ｘ１，０００ ５０ｕｌ／ｗｅｌｌ、
酵素標識抗ウサギ抗体；（ヤギ由来ＣＡＰＰＥＬ）Ｘ５，０００ ５０ｕｌ／ｗｅｌｌ
発色基質；ＴＭＢ（＋）（ＤＡＫＯ） ５０ｕｌ／ｗｅｌｌ
反応停止液（１Ｎ硫酸）５０ｕｌ／ｗｅｌｌ
抗体希釈液及びサンプル希釈液は０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ
操作後、吸光度をＡ４５０ｎｍにて測定
測定結果；
ｙｐ８ ｙｐ１２
健常者Ｎｏ．０１ ０．１３２ ０．２１４
０２ ０．３２１ ０．５７２
０３ ０．０４２ ０．０５７
０４ ０．０００ ０．０００
０５ ０．０１６ ０．０３７
１１ ０．００２ ０．０２８
１２ ０．０００ ０．０２９
１３ ０．０００ ０．０００
１４ ０．７２８ １．８２９
１５ ０．０２６ ０．０４２
ＡＶＥ． ０．１２８ ０．２８１
ＳＤ． ０．２３３ ０．５７１
ＡＶＥ＋２ＳＤ／０．５９４ １．４２３
腎炎患者Ｎｏ．Ｎ０２ ０．２１６ ０．２４５
Ｎ０３ ０．２８９ ０．３６７
Ｎ０４ ０．７８１ ０．８３４
Ｎ０５ ０．７２２ ０．７４９
Ｎ１１ ０．２４９ ０．８９０
Ｎ１２ ０．２７７ ０．６０２
Ｎ１３ ０．０００ ０．０１９ ネフローゼ症候群の回復後
Ｎ１４ ０．０８６ ０．２２２
Ｎ１５ ０．３０６ ０．７７９
陽性標準 ０．６２５ ０．６３６
（いずれもブランク控除後）
ブランク値 ０．０８２ ０．１４４
【実施例２】
【００１２】
尿中抗ペプチド抗体の測定／実験Ｎｏ．８０５０１
実験概要；；
ペプチド固相化マイクロプレート（固相化 １０ｕｇ／ｍｌ，１００ｕｌ／ｗｅｌｌ；ＮＣ１、（ｙｐ５，ｙｐ８，ｙｐ１２））、ブロック剤（ＰＢＳ−０．２％Ｔｗｅｅｎ）、検体尿；検体希釈液（ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ）にて１０倍希釈１００ｕｌ／ｗｅｌｌ，室温×１時間、検出抗体（酵素標識抗ヒトＩｇＧ／ＣＡＰＰＥＬを５，０００倍希釈）室温×３０分、基質液（ＴＭＢ（＋）ＤＡＫＯ）１００ｕｌ／ｗｅｌｌ 室温×１５分、停止。液（１Ｎ硫酸）１００ｕｌ／ｗｅｌｌＡ４５０ｎｍ
健常者（ｎ＝２１）
ＮＯ． ＮＣ１ ｙｐ５ ｙｐ８ ｙｐ１２
６ ０．０５６ ０．０１２ ０．７０６ ０．０２５
７ ０．０３３ ０．０００ ０．５７３ ０．００３
８ ０．０４４ ０．０３７ １．３１４ ０．００４
９ ０．０２６ ０．０００ ０．９０５ ０．００４
１０ ０．０２１ ０．０００ ０．５１３ ０．０１１
１７ ０．００３ ０．０００ １．２９６ ０．０３４
１８ ０．３５２ ０．０２３ ０．０７８ ０．０２９
１９ ０．１０１ ０．０３６ ０．９４６ ０．００８
２０ ０．０６９ ０．０１３ ０．４２４ ０．０００
２１ ０．０１０ ０．００１ ０．０００ ０．００５
２２ ０．２８２ ０．０７０ １．３４６ ０．０８２
２４ ０．０３０ ０．０００ １．２２８ ０．０１８
２５ ０．０６５ ０．００７ ０．１５２ ０．０１９
２６ ０．０１９ ０．０００ ０．２５１ ０．０００
２７ ０．０１３ ０．０１７ ０．４５６ ０．０００
２８ ０．０２２ ０．０００ １．１４８ ０．００９
２９ ０．０９０ ０．０００ ０．４８８ ０．０１５
３０ ０．０１５ ０．０００ １．０４８ ０．００９
３２ ０．１６６ ０．０８０ １．７４８ ０．０５７
３３ ０．００３ ０．００５ ０．１７８ ０．０００
３４ ０．２３２ ０．０３５ ０．７３２ ０．０１３
Ａｖｅ． ０．０８０ ０．０１６ ０．７３９ ０．０１６
ＳＤ． ０．０９７ ０．０２３ ０．４９０ ０．０２１
Ａｖｅ．＋２ＳＤ ０．２７４ ０．０６２ １．７１９ ０．０５８
腎炎患者
（ｎ＝９）
６ ０．４４９ ０．５１２ ２．７５４ ０．３０１
７ ０．６６１ ０．６３０ ２．７５４ ０．３００
８ ０．３０４ ０．４７４ ２．７５４ ０．１９６
９ ０．１１３ ０．０５０ １．４２０ ０．０２２
１０ ０．３０６ ０．２３３ ２．７５２ ０．０９４
１６ ０．２２５ ０．４１２ ２．７５４ ０．１２５
１７ ０．７９２ ０．９９８ ２．７５４ ０．５０２
１８ ０．１２２ ０．２２３ ２．３５４ ０．０８８
１９ ０．２０９ ０．０６８ ２．０５３ ０．０７１
ブランク ０．０８９ ０．１７２ ０．７４６ ０．０７５
【実施例３】
【００１３】
ＥＩＡ法による抗ペプチド抗体の測定
１ 検体と方法
１）検体 腎炎患者（１９例）の尿を検体とした。対照は尿試験紙で尿蛋白が陰性の健常者尿（３４例）とした（表１）。
２）方法
（１）ペプチドとしてｙｐ５（ａ５（ＩＶ）ＮＣ１の６１〜８０位のアミノ酸配列、ＳＴＭＰＦＭＦＣＮＩＮＮＶＣＮＦＡＳＲＮ）、ｙｐ８（１０６〜１２５位のアミノ酸配列、ＰＦＩＳＲＣＡＶＣＥＡＰＡＶＶＩＡＶＨＳ）、ｙｐ１２（１６６〜１８５位のアミノ酸配列、ＳＣＬＥＥＦＲＳＡＰＦＩＥＣＨＧＲＧＴＣ）をそれぞれ異なる９６穴マイクロプレートに０．５μｇ／穴塗布し、４〜８℃にて一夜放置して固相化した。
（２）固相化したマイクロプレートにブロック剤としてＰＢＳ（０．２％−Ｔｗｅｅｎ２０含有）を加えて２時間放置した。
（３）次にＰＢＳ（０．０５％−Ｔｗｅｅｎ２０含む）で洗浄し、ＰＢＳで１０倍に希釈した尿を５０μｌ／穴加えて、室温で２時間放置した。
（４）続いて洗浄し、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ウサギ由来、ＤＡＫＯ社）を５０μｌ／穴加えて、室温で１時間放置した。
（５）さらに洗浄し、酵素基質液（ＴＭＢ（＋）、ＤＡＫＯ社）を５０μｌ／穴加えて１０分経過後、反応停止液（１Ｎ−硫酸）を５０μｌ加え、直ちに波長４５０ｎｍで吸光度（Ａ４５０ｎｍ）をバイオラッドラボラトリーズ社のＭｏｄｅｌ６８０を測用いて測定した。
２ 測定結果
各抗ペプチド抗体のＡ４５０ｎｍでの吸光度は、次のとおりであった。
（１）抗ｙｐ５抗体；健常者尿３４例は平均（０．３４７）及び標準偏差（ＳＤ，０．１０８）で、腎炎患者尿１９例は平均（０．９８９）及び標準偏差（０．４００）であった。健常者の平均＋２ＳＤをカットオフポイント（０．５６３）とすると、健常者での陽性は２例（陽性率６％）、腎炎患者での陽性は１８例（陽性率９５％）であった。
（２）抗ｙｐ８抗体；健常者尿３４例は平均（０．３６９）及び標準偏差（ＳＤ，０．１２１）で、腎炎患者尿１９例は平均（１．８２０）及び標準偏差（０．７４６）であった。健常者の平均＋２ＳＤをカットオフポイント（０．６１１）とすると、健常者での陽性は無く（陽性率０％）、腎炎患者での陽性は１８例（陽性率９５％）であった。
（３）抗ｙｐ１２抗体；健常者尿３４例は平均（０．０６７）及び標準偏差（ＳＤ，０．０１６）で、腎炎患者尿２５例は平均（０．３００）及び標準偏差（０．１９４）であった。健常者の平均＋２ＳＤをカットオフポイント（０．０９９）とすると、健常者での陽性は２例（陽性率６％）、腎炎患者での陽性は１６例（陽性率８４％）であった。
実測値は下記の通り。
Ｈ４ＮＡ５−５ Ｈ４Ｎ５−８ Ｈ４Ｎ５−１２
０．４６０ ０．５０８ ０．０６５
０．５７４ ０．２９８ ０．０８９
０．３２２ ０．２７５ ０．０５８
０．３９４ ０．５４６ ０．０６３
０．２９５ ０．２８５ ０．０６０
０．３４４ ０．４３４ ０．０７１
０．２１６ ０．２１７ ０．０５５
０．３８６ ０．４６９ ０．０６５
０．３９５ ０．４０４ ０．０５９
０．３１０ ０．２６５ ０．０５３
０．４２１ ０．５６７ ０．０６７
０．２３２ ０．２６９ ０．０５６
０．３３０ ０．２８５ ０．０６１
０．６８２ ０．４５７ ０．１２０
０．２９４ ０．２９７ ０．０５７
０．２３６ ０．３９０ ０．０６３
０．３１４ ０．２５７ ０．０８７
０．４１６ ０．３８８ ０．０５７
０．２５０ ０．４８６ ０．０６１
０．２４８ ０．２４２ ０．０５７
０．４０９ ０．５６９ ０．１１３
０．３６０ ０．４９０ ０．０８８
０．２１５ ０．３３５ ０．０５４
０．３０７ ０．２３７ ０．０５４
０．２８８ ０．２５１ ０．０５４
０．３２８ ０．４４８ ０．０５９
０．３０３ ０．５７４ ０．０５５
０．３８３ ０．５０２ ０．０７５
０．１８４ ０．３３０ ０．０６５
０．２８９ ０．２２８ ０．０５９
０．５３１ ０．３２１ ０．０７０
０．４０１ ０．１７０ ０．０６５
以下腎炎 以下腎炎 以下腎炎
１．２５１ ２．２４７ ０．４４２
０．８１３ １．３６３ ０．１８９
０．８４２ １．８８１ ０．２５９
１．１８７ ２．５３６ ０．３２２
１．０９３ ２．２９９ ０．６２５
１．７３９ ２．７０４ ０．５２３
１．４１４ ２．３６２ ０．４５６
０．７９６ ２．１０８ ０．２２７
０．５９６ ０．８８２ ０．０８５
０．６６４ １．４８９ ０．２２８
０．６６０ １．２８４ ０．１２１
１．４９８ ２．４６７ ０．５０８
０．２４５ ０．２４１ ０．０６０
０．６５５ ０．６２４ ０．１１７
１．３２８ ２．６５９ ０．５０４
０．７２３ １．１８２ ０．０９２
１．６０６ ２．７２８ ０．６８５
０．７２１ １．４９３ ０．２０１
０．９５７ ２．０４１ ０．２３９
採取時間帯で測定値に違いが生じるのかを１例につき検討した。本例（女性、５２歳）は、高血圧症としてかかりつけていた大学病院専門外来にて慢性腎炎と診断されて間もないものである。尿は連続した２日間の勤務中の合間に随時採取したもので、測定は表題の測定と同時に行い、結果は次のとおりであった。
抗ｙｐ５抗体（初日午後６時頃；１．２６４→初日午後１１時頃；０．７１３→２日午前６時頃；０．４８６→２日午前１０時頃；０．９５７→２日午後３時頃；０．６１２）、抗ｙｐ８抗体（初日午後６時頃；２．３７４→初日午後１１時頃；１．４６８→２日午前６時頃；１．０１５→２日午前１０時頃；２．０４１→２日午後３時頃；１．５６２）、抗ｙｐ１２抗体（初日午後６時頃；０．３４５→初日午後１１時頃；０．１５８→２日早朝尿／午前６時頃；０．１２９→２日午前１０時頃；０．２３９→２日午後３時頃；０．１９５）。
同時測定時のカットオフポイントは、抗ｙｐ５抗体が０．５６３、抗ｙｐ８抗体が０．６１１、抗ｙｐ１２抗体が０．０９９なので、測定した慢性腎炎の早朝尿（午前６時頃）ではいずれの抗体もカットオフポイント以内であり、健常者域にある。しかし、その他の時間帯での採取尿はいずれの抗体も全て陽性を示した。この結果から、本例では休息の重要性（２日目早朝尿の正常化）と勤務形態が腎臓に負荷を与えていること（初日夕６時の高値）をうかがわせた。又、健常者（２例）ではスポーツを行った後でも尿中の抗体がカットオフポイント内で健常域にとどまったので、測定に用いる腎炎尿の採取時間帯は、体に負荷のかかる活動時に採取することが腎機能を反映する検体としてふさわしいことと思われた。
３ 結論
測定結果は、腎炎尿にはａ５（ＩＶ）ＮＣ１上のペプチドを抗原とする抗体が広く存在し、これらの抗体測定は腎炎の検出に有用である。
【表１】


【表２】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドとして
ｙｐ５（ａ５（ＩＶ）ＮＣ１の６１〜８０位のアミノ酸配列、ＳＴＭＰＦＭＦＣＮＩＮＮＶＣＮＦＡＳＲＮ）、ｙｐ８（１０６〜１２５位のアミノ酸配列、ＰＦＩＳＲＣＡＶＣＥＡＰＡＶＶＩＡＶＨＳ）、ｙｐ１２（１６６〜１８５位のアミノ酸配列、ＳＣＬＥＥＦＲＳＡＰＦＩＥＣＨＧＲＧＴＣ）
を用いて、対応する抗体を試料から免疫反応で腎炎を検出する方法。
【請求項２】
請求項のペプチドにより作製した抗ペプチド抗体を用いて、試料中から対応するペプチドを免疫反応で腎炎を検出する方法。
【請求項３】
請求項１のペプチド及び／又は請求項２の抗ペプチド抗体を用いて作製する腎炎モデル。
【請求項４】
請求項１のペプチド及び／又は請求項２の抗ペプチド抗体を用いた腎炎治療剤。

【公開番号】特開２０１０−２７１２９５（Ｐ２０１０−２７１２９５Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４２７４４（Ｐ２００９−１４２７４４）
【出願日】平成２１年５月２４日（２００９．５．２４）
【出願人】（５９８１００３４６）
【Ｆターム（参考）】