灌流可能な微小血管システムを作製する方法
細胞外マトリックスタンパク質の支持マトリックス内、例えば、ゲル内に、萌芽する組織工学により作製した親血管（２００、２０２）から、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて微小血管ネットワークを産生する。流体による制御された灌流を可能にする機器内に、微小血管システムを統合する。血管は、１つの細胞型由来の細胞、例えば、内皮細胞、又は２つ以上の細胞型の組合せ由来の細胞を含んでよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理学的及び病理学的な血管成長、並びに血管新生促進因子又は血管新生抑制因子に応答する血管成長の研究法に関する。
【０００２】
米国連邦政府による委託研究に関する文言
本発明は、ＮＩＨ米国立心肺血液研究所が与える助成金番号１ Ｒ２１ＨＬ０８１１５２−０１に基づく政府援助によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
血管成長の正常な過程（例えば、月経周期、胎盤形成、体脂肪の変化、創傷修復、炎症）では、新たな血管の創出が調節され、最終的には停止する。血管成長の調節異常は、病理学のきわめて重要な要素である。例えば、腫瘍成長、糖尿病性網膜症、関節炎、及び乾癬は、直接的に病理学的状態に寄与する血管の過剰な増殖を伴う。一方、老齢者に特徴的な血管成長の障害は、創傷治癒、及び外傷又は疾患により虚血状態となった組織の血管再構築を損なう。したがって、新たな血管の構築を導く機構、並びに血管成長を開始及び停止する過程の理解が、疾患における血管構築を制御する戦略を開発する上で重要である。
【０００４】
新たな血管の成長（血管新生）においては、毛細血管及び細静脈−血管系の最小の分枝の内腔を覆う内皮細胞から萌芽が生じる。血管新生は、複雑で多段階の過程である。血管新生に関して公表された研究は何千にも及ぶが、血管新生においてその成長及び形態形成を媒介し調節する細胞機構はほとんど分かっていない。
【０００５】
血管新生の萌芽についての詳細は、大半の組織が不透明であるため、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて「リアルタイム」で観察することは難しい。組織切片は、３Ｄで再構成することが難しく、血管の動的な成長過程はわかりにくい。さらに、血管新生の萌芽の先端付近の領域−血管浸潤及び形態形成の制御の重要な領域−を組織切片において見出すことはほとんどない。このような従来の組織学の限界を克服するため、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける各種の血管新生「モデル」が開発されている。
【０００６】
ｉｎ ｖｉｖｏにおける血管新生モデル：生体組織の不透明性を回避するため、研究者らは、生来的に透明な両生類幼生の尾（Ｃｌａｒｋ及びＣｌａｒｋ、１９３９）、或いはウサギの耳（Ｃｌａｒｋ及びＣｌａｒｋ、１９３９）、マウスの皮膚（Ａｌｇｉｒｅ、Ｃｈａｌｋｌｅｙら、１９４５）、及びハムスターの頬嚢（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ及びＳｈｕｂｉ、１９６８）に植え込んだか、又はウサギの角膜ポケット（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、Ｃｏｔｒａｎら、１９７４）若しくはニワトリの漿尿膜（Ａｕｓｐｒｕｎｋ、Ｋｎｉｇｈｔｏｎら、１９７４）から発生させた、特殊化した観察チャンバーを含む、生きている動物内の「窓」を通して、血管新生を観察してきた。大半は記述的なこれらの初期の研究から、腫瘍が誘導する血管走化性という中心的枠組みが検証され、これに対応して、血管成長を促進する拡散性で腫瘍に由来する分子が発見された。ｉｎ ｖｉｖｏにおける血管新生に関するより新規のアッセイでは、げっ歯類の皮下に植え込んだゲル化基底膜タンパク質のスポンジ状又はプラグ状のポリマー中への血管成長を評価している（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２；Ａｎｄｒａｄｅ、Ｍａｃｈａｄｏら、１９９７；Ａｋｈｔａｒ、Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎら、２００２；Ｋｏｉｋｅ、Ｖｅｒｎｏｎら、２００３）。その正確さにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏにおける手法は、（１）血管新生を促進する反応に、動物種間のばらつきが存在すること、（２）動物種間における結果を直接的に比較できないこと、（３）動物の購入及び維持の費用が高額であること、（４）研究目的での動物の使用に対し否定的な世論が存在すること、（５）動物に対する外科処置、並びに結果の視覚化及び評価が複雑であること、により困難である。
【０００７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管新生の２次元（２Ｄ）モデル：血管新生の分子的機構を理解しようとする中で、大血管から単離した内皮細胞を、血管の内膜に類似する集密状態の被覆様単層を形成するまで平皿内で培養した（Ｊａｆｆｅ、Ｎａｃｈｍａｎら、１９７３；Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、１９７６）。大血管における内皮損傷に対する増殖性反応のモデルとしては有用（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、Ｃｏｔｒａｎら、１９７４；Ｆｉｓｈｍａｎ、Ｒｙａｎら、１９７５；Ｍａｄｒｉ及びＳｔｅｎｎ、１９８２；Ｍａｄｒｉ及びＰｒａｔｔ、１９８６；Ｊｏｚａｋｉ、Ｍａｒｕｃｈａら、１９９０；Ｒｏｓｅｎ、Ｍｅｒｏｍｓｋｙら、１９９０）であるが、剛体基質上での内皮細胞の単層培養物は、血管新生を模した実験において、通常、毛細血管様チューブを組織しない。しかし、１９８０年に、毛細血管内皮細胞の長期培養の成功（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄら、１９７９）により、ウシ又はヒトの毛細血管内皮細胞を２０〜４０日間培養することで、集密状態の細胞単層上に２Ｄの細胞ネットワークが発生し、このプロセスは「ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管新生」と名付けられると報告された（Ｆｏｌｋｍａｎ及びＨａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄ、１９８０）。該ネットワークの内皮細胞は、細胞が組織される基質となる「マンドレル」の、内因的に合成されたネットワークとして解釈される、線維状／アモルファス状の物質で充満した「内腔」を有する「チューブ」として現れた。後年の研究により、大血管由来の内皮細胞（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２；Ｍａｄｒｉ、１９８２；Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３）、及び基底膜タンパク質の柔軟な水和ゲル（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲル）上に播種した内皮細胞（Ｋｕｂｏｔａ、Ｋｌｅｉｎｍａｎら、１９８８）による、同様の２Ｄネットワークの形成が報告されている。
【０００８】
血管発生の２Ｄモデルは今日でも用いられている（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に基づくアッセイ（Ｋｕｂｏｔａ、Ｋｌｅｉｎｍａｎら、１９８８）は、市販されている）が、該モデルは、真の血管新生を定義する以下の５つの特性を欠いている。
１．浸潤−２Ｄモデルにおける内皮細胞は、細胞外マトリックス上にネットワークを形成するが、細胞外マトリックス内に潜伏する傾向はほとんど示さない（Ｖｅｒｎｏｎ、Ａｎｇｅｌｌｏら、１９９２；Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。
２．方向性−２Ｄモデルでは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける内皮細胞ネットワークが、あらかじめ位置付けられた細胞領域全体にわたりほぼ同時的に形成されるのに対し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血管新生は、複数レベルの分枝化により樹状化するフィラメント状の萌芽によって、細胞外マトリックスに対する有向性の浸潤を含む。
３．適正な極性−２Ｄモデルは、毛細血管と顕著に類似する単細胞チューブを作製する（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２；Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３；Ｓａｇｅ及びＶｅｒｎｏｎ、１９９４）が、その極性は「内外が逆」である、すなわち、該モデルは、その内腔表面に基底膜物質を堆積させ、血栓形成面を外側である周囲の培地に向かわせる（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２；Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３）−これはｉｎ ｖｉｖｏにおける状況と逆である。
４．内腔の形成−２Ｄモデルが、開存した内腔を有する内皮細胞（ＥＣ）チューブを形成するという証拠はほとんどない。内皮細胞チューブは、（外因性であるか、又は細胞が合成した）細胞外マトリックスで充満した「内腔状の」空間を有するのが通例である（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２；Ｍａｄｒｉ、１９８２；Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３；Ｓａｇｅ及びＶｅｒｎｏｎ、１９９４；Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。開存した内腔は、存在する場合でも、内皮細胞細胞質の厚い壁で覆われたスリット様又は狭隘な円筒状の空間として現れるのが通例である−これは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける毛細血管に典型的な、膨張した薄壁の内皮細胞チューブとは全く異なっている。
５．細胞特異性−２Ｄモデルにおける細胞ネットワークは、おそらくは非ＥＣの細胞型により実現される力学的プロセスにより形成される（Ｖｅｒｎｏｎ、Ａｎｇｅｌｌｏら、１９９２；Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。実際、柔軟な２Ｄの細胞外マトリックス（内因的に合成され、又は供給される（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲル））に張力を加えることのできる、任意の付着性細胞型が、最適条件下においてネットワークを形成し得ることを、数学的モデルが示している（Ｍａｎｏｕｓｓａｋｉ、Ｌｕｂｋｉｎら、１９９６）。
【０００９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管新生の３次元（３Ｄ）モデル：ｉｎ ｖｉｖｏにおける血管新生が、３Ｄの細胞外マトリックス内で生じるという認識は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞外マトリックスの３Ｄゲル内で萌芽を誘導する、各種モデルをもたらした。初期の３Ｄモデルでは、コラーゲンゲル内に分散させた内皮細胞（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ、Ｏｒｃｉら、１９８３）が、コードとチューブのネットワークを形成した（Ｅｌｓｄａｌｅ及びＢａｒｄ、１９７２）。内皮細胞チューブは、適正な極性を示したが、浸潤及び方向性の特性を欠いていた（内皮細胞は、細胞外マトリックス中にあらかじめ埋め込み、均等に分散させた）。それにもかかわらず、この手法は、内腔形成の研究（Ｄａｖｉｓ及びＣａｍａｒｉｌｌｏ、１９９６）、及び成長因子に対する内皮細胞の応答（Ｍａｄｒｉ、Ｐｒａｔｔら、１９８８；Ｍｅｒｗｉｎ、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９０；Ｋｕｚｕｙａ及びＫｉｎｓｅｌｌａ、１９９４；Ｍａｒｘ、Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒら、１９９４；Ｄａｖｉｓ及びＣａｍａｒｉｌｌｏ、１９９６）の研究において有用であることが示された。
【００１０】
別の手法では、３Ｄの血漿塊中に埋め込んだラット大動脈の１ｍｍ切片（リング）が、分枝状の吻合性チューブを形成した（Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｔｃｈａｏら、１９８２）。大動脈リングからの萌芽は、血管新生様の極性に加えて、血管新生様の浸潤及び方向性をも示した。ラット由来の大動脈リング又はマウス由来の微小血管断片を用いる移植モデルが、血管新生に対する腫瘍、成長因子、各種細胞外マトリックスの担体、及び老化状態の影響の研究に用いられている（Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｔｃｈａｏら、１９８３；Ｍｏｒｉ、Ｓａｄａｈｉｒａら、１９８８；Ｎｉｃｏｓｉａ及びＯｔｔｉｎｅｔｔｉ、１９９０；Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｂｏｎａｎｎｏら、１９９２；Ｖｉｌｌａｓｃｈｉ及びＮｉｃｏｓｉａ、１９９３；Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｂｏｎａｎｎｏら、１９９４；Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｎｉｃｏｓｉａら、１９９４；Ｎｉｃｏｓｉａ及びＴｕｓｚｙｎｓｋｉ、１９９４；Ｈｏｙｉｎｇ、Ｂｏｓｗｅｌｌら、１９９６；Ａｒｔｈｕｒ、Ｖｅｒｎｏｎら、１９９８）。
【００１１】
（単層又は凝集塊として）精製した内皮細胞を誘導して、基底又は周囲の３Ｄ細胞外マトリックスゲル内に浸潤的に萌芽させる各種のモデルが存在する（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ及びＯｒｃｉ、１９８５；Ｐｅｐｐｅｒ、Ｍｏｎｔｅｓａｎｏら、１９９１；Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ、Ｐｅｐｐｅｒら、１９９３；Ｎｅｈｌｓ及びＤｒｅｎｃｋｈａｈｎ、１９９５；Ｎｅｈｌｓ及びＨｅｒｒｍａｎｎ、１９９６；Ｖｅｒｎｏｎ及びＳａｇｅ、１９９９；Ｖｅｒｎｏｎ及びＧｏｏｄｅｎ、２００２）。これらモデルの各々は、萌芽形成の視覚化が難しいこと、萌芽が制限されること、切片化が必要であること、又は内皮細胞の特定の種別では有効性を欠くこと、を含む個別の限界を有する。
【００１２】
Ｗｏｌｖｅｒｉｎｅ及びＧｕｌｅｃが、腫瘍組織の断片をマトリックス内に埋め込むことを含む３Ｄ血管新生システム（米国特許出願第２００２／０１５０８７９ Ａ１号）を開示した。微小血管の成長を特性化することで、組織が血管新生を促進する可能性を分析している。しかし、この手法は、微小血管の内腔における灌流を提供しない。
【００１３】
Ｎｅｕｍａｎｎ（本発明の発明者）ら、２００３は、人工組織内に組み入れることのできる、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける灌流微小血管を作製する可能性を開示した。Ｎｅｕｍａｎｎら、２００３は、１２７マイクロメートルのナイロン製釣り糸を、収縮チューブが保持する微小血管作製用マンドレルとして用いることを教示する。血管は、寒天中に埋め込んだラット大動脈の平滑筋細胞から作製した。これらの微小血管は、試験的なものであり、ヒト用血管グラフトを作製するには適切でない。
【００１４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管新生：新たな手法：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける２次元の血管成長モデルは、前出の血管新生を定義する特性を確立しないのに対し、既存の３Ｄモデルは、該特性の一部又は大半を再現する。重要なことは、現在作製可能な３Ｄモデルが、流動し循環する加圧流体を含む親血管を再構築しないことである。結果として、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける既存の３Ｄモデルのいずれによっても、内腔圧及び内腔流が血管成長及び形態形成に与える寄与についての研究は可能とならない。
【特許文献１】米国特許出願第２００２／０１５０８７９ Ａ１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、３Ｄ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に浸潤性でチューブ状の微小血管萌芽を形成する実証ずみの方法を、内腔流の源泉となる組織工学による親血管作製のための新規手法と組み合わせることにより、既存の血管新生モデルの限界を克服する。灌流物により、血管新生を調節する化合物を、特異的な標的受容体の存在が知られる内皮細胞の内腔面に投与することができる。栄養培地の内腔流が存在することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける毛細チューブの生存時間が実質的に増大する。開示された血管新生システムを用いて、低酸素症／高酸素症、特定の可溶性の生物活性化合物の検査、遺伝子改変細胞の使用、及びウイルストランスフェクションによる遺伝子の導入を含む、各種の実験パラメータを評価することができる。本システムは、創修復、老化、癌、及び動脈硬化に関する血管新生の研究を可能とする。重要なことは、本発明の教示に従うモデルを応用することで、生体工学による人工組織に組み込むことの可能な、十分に機能的な血管システムを提供し得るということである。
【００１６】
本発明は、微小血管の作製、内皮細胞由来の微小血管の作製、及びより大きな血管（例えば、冠動脈のサイズを有する）の作製用のマニホールドの設計を含む新たな新規手法をも提供する。例えば、微小血管ネットワークの作製法を含む、これら及び他の重要な新しい教示は、本明細書及び本明細書の下記に添付した特許請求の範囲から明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、灌流可能な微小血管ネットワークを作製する方法であって、前記方法が、
一組のマンドレルの上及び周囲において細胞を培養することにより、少なくとも１つの親血管を作製するステップと、
前記少なくとも１つの親血管をマトリックスに埋め込むステップと、
前記少なくとも１つの親血管を誘導して、前記マトリックス中に萌芽を作製するステップと、
前記一組のマンドレルを引き抜くステップと、
前記少なくとも１つの親血管及び萌芽に内腔灌流を施して、毛細血管床の動脈端から静脈端への本来の血流を模倣し、その結果微小血管ネットワークが作製されるステップと
を含む方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書で提供する実施例は、本発明の理解を深めることを目的とする。実施例は、例示的であり、本発明は、実施例の実施形態に限定されない。本発明の方法は、生理学的及び病理学的な血管成長、並びに血管新生促進因子又は血管新生抑制因子に対する応答による血管成長の研究に有用である。他の有用な応用は、癌組織が血管新生を促進する可能性、及び抗血管新生促進剤への反応を評価する方法への応用である。加えて、本発明の方法は、各種の創治癒機器の構築、及び組織工学による生産物に基づく血管構築に用いてよい。
【００１９】
一例として、灌流可能な３次元の微小血管ネットワークを作製するための方法及び機器を開示する。本明細書で用いる「ＥＣ」とは内皮細胞を指し、「ＳＭＣ」とは平滑筋細胞を指し、「ＣＡＳ」とは冠動脈代用物を指す。
【００２０】
一般に、微小血管ネットワークの培養及び灌流のための機器は、中央に１つ又は複数のマンドレルを保持するチャンバーからなる（図１に最良の形で図示）。チャンバーは、様々な技法、例えば、レーザー加工によるフレームを重ね合わせることなどにより、任意の生体適合性材料からも作製することができる。マンドレルは、チャンバー内で引き抜き式となるように組み立てる。これは、例えば、熱収縮により（図２に図示）チューブ内にマンドレル端を装着することにより実現することができる。マンドレルの直径は、所望の血管内径によって決まる。構成を変更して、単一の血管、２つの血管、又は２Ｄ若しくは３Ｄにおける血管の配置全体までに対応させることができる。マンドレルは、ポリマー繊維、ガラス繊維、ワイヤーなど各種の材料製であり得る。
【００２１】
マンドレル上に細胞を播種し、細胞を刺激してマンドレルの周囲に増殖させ、細胞が血管壁を形成した時点でマンドレルを引き抜くことにより、微小血管を作製する。次いで、血管をマトリックスに埋め込む。培養条件、マトリックスの成分、及び血管新生を促進する刺激（例えば、成長因子）に応じて、親血管が、周囲のマトリックス内へ萌芽する。萌芽が互いに吻合し合うことによって、毛細血管ネットワークの形成をもたらす。マンドレルの除去後、該機器を灌流システムに接続し、血管内腔に流体を流す。
【００２２】
ここで、図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃを参照することにより、本発明の方法が用いる親血管作製に関する概略的な例を示す。図１Ａは、培養増殖培地１００中の内皮細胞１を、機器本体３中の収縮チューブ４が保持するマンドレル２に播種した状況を示す。図１Ｂは、細胞１が増殖し、細胞スリーブ１０２の形で環状層を形成したことを示す。図１Ｃは、マンドレル２を引き抜いた後で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ゲル１１０中の細胞スリーブを、培養増殖培地１００で灌流する状況を示す。本発明は、灌流可能な生体人工血管構造を、組織工学の応用及び研究モデル用に加工することを含む。本発明の一般的な原理は、薄壁チューブ又はその他の器具にぴったり装着する取り外し式のマンドレル周囲における層状の細胞培養を含む。細胞層が所望の壁厚に達したら、マンドレルを取り外し、こうして作製した生体人工血管（ＢＡＶ）を、灌流システムを用いて、培地、血液、血液代用物、又は他の流体で灌流してよい。本発明の方法は、量産又は特注製による血管、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける灌流血管新生モデル、創治癒機器、組織成分、全組織及び全器官のほか、研究モデルの作製を可能にする。
【００２３】
培養／灌流機器の作製
ここで、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄを参照することにより、本発明の方法の一実施形態において用いる、既知の熱収縮プロセスに関する概略的な例を示す。図２Ａで具体的に示す通り、各培養／灌流機器（ＣＰＤ）は、支持フレーム１２が保持する１つ又は複数のマンドレル２を含んでよい。所望の血管内径の直径を有するマンドレル２は、その端部を、医療グレードの収縮チューブ断片４内にぴったり装着する。マンドレル２は、模造する血管サイズに応じて、数マイクロメートルから数ミリメートルの直径を有する、生体適合性の繊維（例えば、ポリマー、ガラス）、ワイヤー、又は同等物を使用してよい。
【００２４】
図２Ｂのより詳細な図面に示す通り、各収縮チューブ断片４の中央部分１４は、マンドレル２の１つの周囲で熱収縮する。次いで、図２Ｃで具体的に示す通り、マンドレル２を引き抜き、チューブを切断する。図２Ｄは、マンドレルの位置を移した後の、ここでは切断されて分離した収縮チューブ断片４がマンドレルの両端を封止する状況を示す。フレーム１２は、各種の材料及び技法を用いて作製してよい。構成を変更して、単一の生体人工血管又は多数の生体人工血管のどちらに対応させてもよい。同様に、マンドレルが配置されている複数の平面を層状化することによって、血管ネットワークを伴う厚く灌流可能な組織を形成してよい。
【００２５】
灌流チャンバーの加工
ここで、図３Ａを参照することにより、複数のマンドレル／収縮チューブアセンブリー１１の灌流用の既知の構成を示す。フレーム２０は、有利には、ポリカーボネート又は同等の材料から圧延することができる。分配チャンバー３０を設計に含めることで、多数の生体人工血管の同時的灌流が可能となる。マンドレル２を含む一組の糸状物の端部を、シリコンチューブ２３内に集める。
【００２６】
Ｍｙｌａｒフレームのレーザー加工
ここで、図３Ｂを参照することにより、本発明の方法に準拠して用いる培養／灌流機器を組み込む製造法で用いる新規の設計を概略的に示す。単一血管設計であるＣＰＤ７０は、有利には、熱収縮チューブ４が保持するマンドレル２を、レーザー加工による２つのＭｙｌａｒ（登録商標）フレーム２２の間に挟み込むことによって作製することができる。有利には、下記に詳述する通りに構成する、円筒形のエポキシ製マニホールド２１を用いて、マンドレル／収縮チューブアセンブリー１１を保持することができる。
【００２７】
マンドレル／収縮チューブアセンブリーを、Ｍｙｌａｒ（登録商標）などのポリエステルフィルム製などの２つのフレームの粘着性の面同士を押圧してフレーム間に挟み込み、各マンドレルを、各端部の２本の収縮チューブ断片４’により、フレームウインドウ７６内に吊架させてよい。２本の収縮チューブ断片４’は、少なくとも１本の細い固定ワイヤー２６をフレーム２２に組み入れ、シリコンチューブの鋳型を用いて収縮チューブと少なくとも１本の細い固定ワイヤー２６との周囲に成型される円筒形のエポキシ製マニホールド内に封入することにより固定し、強化する。２本の収縮チューブ断片４’は、最終的に、ＣＰＤ７０の流入及び流出ポートとなる。
【００２８】
ここで、図４Ａ及び図４Ｂを参照することにより、本発明の方法に準拠した機器用にマニホールドを作製する方法を概略的に示す。図４Ａは、例えば、シリコンチューブ５０のスリーブを通して引き抜く、複数の収縮チューブ／マンドレルアセンブリー１１を特に示す。エポキシ接着剤４０を注入して、シリコンチューブ５０を満たし、硬化させる。
【００２９】
図４Ｂは、特に、エポキシ接着剤４０が硬化し、シリコンチューブ５０を開口し除去した後の状態を示す。硬化したエポキシ製ロッド４４が残されている。エポキシ製ロッド４４は、収縮チューブが作製したチャネル４２を残して切断部からマンドレルを引き抜いた後で切断する。多数の収縮チューブの端部４６を統合して、マニホールド２１を形成する。個々のＣＰＤ又はＣＰＤフレームアセンブリーの積重ねを用いて、３Ｄ血管配置を作製することができる。
【００３０】
代替方法
ここで、図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃを参照することにより、本発明の方法に準拠した、微細加工による培養／灌流機器の設計代案を概略的に示す。図５Ａは、特に、収縮チューブの代替物である、スリーブ５６を有する小型の穿孔部５４を通して導入する一組のマンドレル２を示す。図５Ｂは、特に、フレーム壁面５２に組み込む一組のマンドレル２を含む、細胞播種前のＣＰＤを示す。
【００３１】
図５Ｃは、特に、血管６２を備える培養／灌流機器の代替的な例を示し、その例では、微細加工によるマニホールド６４をフレーム５２の外側のスリーブ５６に取り付けてよい。血管６２は、本明細書に示す通り、マンドレル上で成長し、マンドレルを取り外した後に残る。微細成型などの微細加工法を用いて、該ＣＰＤフレームアセンブリーを量産することができる。
【００３２】
血管作製と灌流
ここで、図６を参照することにより、本発明の方法に準拠した細胞播種手順を概略的に示す。細胞播種用のＣＰＤ７０を準備するため、まず洗浄し、次いでＵＶ滅菌する。滅菌条件下において、ＣＰＤを表面、例えば、ペトリ皿７２の底面に固定する。次いで、ＣＰＤフレームアセンブリー７０の内部ウインドウ７６（図３Ｂに図示）を、ラミニン−１などの接着性タンパク質を含む溶液で満たす。必要に応じ、１つ又は複数のスペーサー７７を用いてよい。インキュベーション時間の経過後、接着性タンパク質を含む溶液を除去し、次いで、培地中の所望の細胞型（例えば、平滑筋細胞又は内皮細胞）の懸濁液を、ＣＰＤ７０のウインドウ７６内に移す。
【００３３】
細胞播種は、一定量の細胞懸濁液をウインドウ７６内に満たし、ＣＰＤフレームアセンブリー７０を上下裏返して、懸滴８０を滴下させることにより行うことができる。約４５分間のインキュベーション時間において、大多数の細胞が、ＣＰＤフレームアセンブリー内のマンドレル／収縮チューブアセンブリーに付着する。余剰細胞は、懸滴の先端部に沈下し、容易に採取及び廃棄し得る。次いで、１つ又は複数のＣＰＤフレームアセンブリーを含むペトリ皿を、正立位に戻し、ＣＰＤフレームアセンブリーが溢れるまで培地で満たし、インキュベートした。１つの実施例におけるインキュベーション条件は、３７℃で５％ＣＯ２の環境中であった。マンドレル／収縮チューブアセンブリーに付着した細胞は、広がり増殖し、同心的単層（例えば、内皮細胞）又は１５０μｍ以上の厚さの多層（例えば、平滑筋細胞）を形成した。
【００３４】
所望の壁面の形状又は厚さでマンドレルを引き抜き、これによって中空の細胞チューブを作製する。薄い壁面は、マンドレルを引き抜く前に、例えば、アガロース、コラーゲン、基底膜タンパク質ゲルなどのゲルを細胞スリーブの周囲に流し込むことによって破断を防ぐことができる。次いで、ＣＰＤフレームアセンブリーのマニホールドを灌流システムに接続し、増殖培地など選択の流体で灌流する。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から内皮「親」血管を作製する方法は、以下のステップを含む。
【００３６】
まず、培養機器を洗浄し、次いで、各面３０分間にわたるＵＶ曝露により滅菌する。滅菌条件下で、滅菌ストリップでペトリ皿の底面に該機器を固定する。
【００３７】
次いで、該機器の内部ウインドウを、ラミニン−１の接着性タンパク質溶液（フィブロネクチン、フィブリン、又はゼラチンなどの他の接着性タンパク質で代用することができる）で満たす。
【００３８】
１晩のインキュベーション後、接着性タンパク質を含む溶液を除去し、次いで、培地中のヒト血管内皮細胞懸濁液を、該機器のウインドウ内に移す。
【００３９】
次いで、ペトリ皿を上下裏返すことで、該機器ウインドウ内で細胞培地懸濁液の懸滴を形成させる。細胞培養インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）における４５分間のインキュベーション時間の経過後、数多くの細胞が、機器内のマンドレル／収縮チューブアセンブリーに付着する。
【００４０】
次いで、ペトリ皿を正立位に戻し、機器が浸るまでヒト血管内皮細胞用の増殖培地で満たす。
【００４１】
マンドレルに結合しなかった細胞は浮遊するので、吸引し廃棄する。
【００４２】
次いで、ペトリ皿をインキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）に留置する。マンドレルに付着した細胞は、広がり増殖し、ヒト血管内皮細胞の同心的単層を形成する。
【００４３】
次いで、ペトリ皿から培地を除去する。コラーゲン溶液を培養機器のウインドウ内に満たし、固形化させることにより、マンドレルを細胞層に埋め込む。
【００４４】
ヒト血管内皮細胞は、コラーゲンゲル内に萌芽を形成する。次いで、マンドレルをゆっくりと引き抜き、ヒト血管内皮細胞の灌流可能な「親」微小血管を後に残す。
【００４５】
次いで、機器のマニホールドを灌流システムに接続し、ヒト血管内皮細胞増殖培地で灌流する。
【００４６】
灌流システム
ＣＰＤは、直線状モード又は循環状モードのいずれの灌流システムに取り付けてもよい。直線状の構成は、重力流下システム、又は市販される若しくは特注製のシリンジポンプにより作製してよい。シリンジは灌流培地で満たし、シリンジポンプ内に組み込み、気密チューブによりＣＰＤの上流端に接続する。ＣＰＤを滅菌条件下のインキュベータ内に保存してもよく、滅菌細胞培養環境をＣＰＤ内で確立してもよい。ＣＰＤの下流マニホールドを、灌流物を回収する末端容器に接続する。蠕動式ポンプを用いることにより、循環状システムを構成してよい。直線状及び循環状のいずれのシステムにも、ガス交換機器を取り付けてよい。ガス濃度、灌流圧、流量、温度、並びに栄養物及び代謝副産物の濃度は、センサーで測定する。収集したデータは、フィードバックループに投入することで、所望のパラメータの厳密な制御が可能となる。
【００４７】
具体的用途
血管新生関連の研究用モデル
ここで、図７を参照する。図７は、本発明の方法に準拠する２つの生体人工親血管２００、２０２の間の毛細血管ネットワークの概略を示す。「静脈側の」親血管２０２への流量（ｆ）を減少させ、「動脈側の」親血管２００における抵抗（Ｒ）を増大させることにより、流体の灌流物２０４を毛細血管２０６を介する経路に変更する。この結果、灌流物（２０４）がより高圧の血管からより低圧の血管へと流れ、毛細血管床の動脈端から静脈端への本来の血流を模倣する。
【００４８】
マンドレル法は、血管新生研究用のモデル開発や、必要に応じて、創修復、老化、並びに癌、糖尿病、関節炎、及び乾癬などの疾患における薬学的試験及び研究にも用いることができる。内皮細胞のみ、又は内皮細胞、平滑筋細胞、及び周皮細胞の組合せを用いると、親生体人工微小血管（ＢＭＶ）を、ミクロン直径のマンドレルの周囲に培養し、細胞外マトリックスの支持ゲル内に埋め込むことができる。次いで、マンドレルを引き抜き、開存した内皮細胞チューブを細胞外マトリックスゲル２１０（コラーゲンゲル、基底膜マトリックス（ＢＭＭ）等）内に残す。引き抜きは、手で、又は自動機器により、きわめて遅いスピードからきわめて速いスピードまでのさまざまなスピードで行ってよい。他の態様として、凍結状態にある生体人工微小血管からのマンドレルの引き抜き、熱反応性ポリマーによるマンドレルのコーティング、又はマンドレルの両端を引っ張り、細くして破断させることを含んでよい。
【００４９】
周囲のゲル２１０内への親血管の萌芽は、ゲル及び／又は灌流物（例えば、増殖培地）に添加する、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、及びホルボール１２−ミリスチン酸−１３−アセテート（ＰＭＡ）などの化合物により誘導する。
【００５０】
複雑な毛細血管ネットワーク２２２は、２つの隣接する生体人工親微細血管の間に圧力差を確立し、動脈及び静脈の血流を模倣することにより作製することができる。次いで、「動脈側の」生体人工微小血管から、相互接続した萌芽を通して「静脈側の」生体人工微小血管へと、流体流の経過を変更する。
【００５１】
灌流物は、有利には、血清及び血管新生促進物質又は血管新生抑制物質を含まない酸素化細胞増殖培地を含んでよい。別の例では、灌流物が、血清、及び／又は血管新生に影響する化合物を補充した酸素化細胞増殖培地でよい。さらに別の実施形態の例では、灌流物は、酸素化生理食塩液でよい。別の例では、灌流物は、酸素化した血液、血液成分、又は血液代用物を含んでよい。さらに別の例の実施形態では、灌流物は酸素化物でなくてもよく、システムの酸素化は、マトリックスを介しての拡散により実現される。さらに別の例の実施形態では、血管新生を促進する化合物又は血管新生を抑制する化合物を灌流物に添加することができる。
【００５２】
実施形態の一例では、血管新生を促進する化合物及び血管新生を抑制する化合物などを、マトリックスに添加する。さらに別の実施形態の例では、細胞は、灌流物又はマトリックスに産物を放出する遺伝子改変細胞を含む。さらに別の実施形態の例では、マトリックスは、有利には、フィブリン、コラーゲン、及びゼラチンを含んでよい。有用なマトリックスの一型は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲルである。別の実施形態の例では、マトリックスは、寒天、アガロース、アルギネート、又はシリカゲルを含んでよい。
【００５３】
実施形態の一例では、細胞は、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、遺伝子改変細胞からなる群から選択することができる。マトリックスには、ヒト細胞、動物細胞、及び植物細胞からなる群から選択される細胞が、全体に分散し、又は局所的に集中して、存在してよい。場合によっては、健康組織又は癌組織などの罹患組織の断片をマトリックスに埋め込む。
【００５４】
親血管からの萌芽は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、材料の切片化、又は全載標本により顕微鏡で調べてよい。蛍光溶液（例えば、蛍光デキストラン）による生体人工微細血管の灌流は、萌芽直径、萌芽内腔の開存性、及び吻合程度の分析に役立つ。萌芽形態の３Ｄ再構成は、共焦点顕微鏡により採取した落射蛍光画像のｚ軸方向の積重ねにより実施することができる。萌芽２２０による周皮細胞基底膜マトリックスの合成は、抗ラミニン及びＩＶ型コラーゲンによる第一抗体、並びに蛍光又はペルオキシダーゼにより標識した第二抗体で免疫標識することにより、全載及び組織学的（パラフィン）切片においてモニターしてよい。
【００５５】
ＥＣ／ＳＭＣ複合萌芽では、ヒトＣＤ３１に対するＦＩＴＣ−モノクローナル抗体（ＭＡｂ）（クローンＰ２Ｂ１−Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）又はヒト内皮細胞に対する特異的なマーカーであるＦＩＴＣ−ＵＥＡ １アグルチニンで内皮細胞を標識することにより、２つの細胞型間の空間的関係を検討することができる。平滑筋細胞は、ヒトアルファ−ＳＭアクチンに対するＭＡｂ及び、その後のＲＩＴＣ−抗マウス第二抗体で標識することができる。内腔構造及び内皮細胞と平滑筋細胞との間の相互作用の詳細は、前出の試薬で標識したパラフィン切片から得てよい。
【００５６】
記載の作製法は、再現性の高い血管新生機器の市販向け量産のための基盤である。適切な保存（例えば、冷凍保存）により、成長前の親血管又は全毛細血管ネットワークが、即時に研究者に使用可能となり得る。
【００５７】
冠動脈代用物
冠動脈代用物を作製する場合は、内径約４ｍｍ〜５．５ｍｍの血管内腔を有する冠動脈代用物が得られる外径を有するマンドレルを選択する。或いは、マンドレルは、冠動脈代用物の成長期間中における栄養物及びガスの交換を可能にするのに十分な灌流を受け十分な透過性を示す中空のチューブでもよい。冠動脈代用物は、平滑筋細胞のみから成長させて、血管内の培地層に構造類似物を提示してもよく、あるいは２つ又は３つの細胞型からの複合構造として作製してもよい。
【００５８】
平滑筋細胞をマンドレル上に播種し、３００〜４００μｍの環状層に成長させる。冠動脈代用物の作製を加速化させるため、成長初期には細胞を高度に増殖性の表現型とし、次いで、血管壁が所望の厚さに達した後は分化状態に切り替わるようにＳＭＣ表現型を操作してよい。表現型の切替えは、平滑筋細胞の成長速度を顕著に遅速化させ、コラーゲン及びエラスチンなど、血管の適正な力学的特性に必須である細胞外マトリックスタンパク質の産生を誘導する。表現型の切替えは、特定の遺伝子発現を制御することにより達成してよい。例えば、テトラサイクリン反応性プロモーターを用いることにより、血管壁が所望の厚さに達するまでは、遺伝子発現（例えば、エラスチン産出）を抑制することができる。増殖培地からテトラサイクリンを除けば、挿入された遺伝子が活性化される。例えば、エラスチンの過剰発現は、血管壁内における更なる細胞増殖を阻害し、構造的機能及びシグナル伝達機能を働かせる。力学的な調節、例えば、拍動流を用いて、冠動脈代用物を強化し、細胞の生理学的アライメントを誘導してよい。他の外部又は内部の「表現型の切替え」もまた、用いることができる。
【００５９】
内皮細胞は、マンドレル除去の直後、又は平滑筋細胞の調節及び再構築後、のいずれにおいてＳＭＣスリーブ内に播種してもよい。内皮細胞の播種は、ＳＭＣスリーブ内への内皮細胞懸濁液の注入により行うことができる。次いで、注入流を一定時間停止し、内皮細胞を適正に付着させる。必要ならば、血管を回転させるか繰り返し上下の向きを逆にして、内皮細胞の均等な分布を促してよい。
【００６０】
或いは、まず、内皮細胞をマンドレル上に播種することもできる。この場合、集密状態の内皮細胞層の上に平滑筋細胞を播種する。この方法では、内皮細胞が、酸素及び栄養分の豊富な冠動脈代替物の辺縁部へと移動することを防止する必要がある。
【００６１】
所望の場合は、ＳＭＣスリーブの外側に線維芽細胞を播種することで、外膜層を作製することができる。
【００６２】
冠動脈代替物作製用の細胞は、自家の、他家の、又は異種の材料に由来してよい。細胞は、幹細胞、前駆細胞、又は分化細胞であってよい。細胞を遺伝子改変することにより、特定の表現型を実現するか、又は宿主生物の免疫反応を低下させることができる。
【００６３】
本発明の方法は、即時に利用可能な血管代用物、又は受容者ごとに特注設計する血管代用物の量産という選択肢を提供する。本発明の方法は、冠動脈代用物の組織工学モデル、アテローム発生、動脈形成の研究モデル、異なる血管細胞型同士及び細胞外マトリックス成分との相互作用の研究モデル、酸化窒素の効果に関する研究モデル、並びに各種医薬品の研究モデルの開発にも適している。
【００６４】
異なるサイズ又は型の血管及びリンパ管
本発明の方法を用いて、冠動脈以外の直径及び型を持つ血管を作製してよい。マンドレルの直径を変化させると、血管の直径が変化する。脈管の型（動脈、静脈、リンパ管）は、細胞の表現型、及び／又は細胞増殖が阻害される時点により変化することがある。例えば、静脈は、小型の平滑筋細胞層のみを含む。
【００６５】
他の管状様組織
本発明の方法を用いて、胆管、涙管、耳管、卵管、輸精管、尿管、尿道など他の管状組織を加工してよい。本発明の方法は、神経成長及び修復を誘導するために、グリア細胞を含む異なる細胞型から神経導管を形成するのに有用であることがある。
【００６６】
組織工学のためのＢＡＶシステム
本発明の方法を用い、多数の取り外し式マンドレルを骨格として用いることにより、組織及び器官を加工してよい。所望の組織／器官（筋肉、肝臓、腎臓、肺、皮膚など）の細胞を、接着性タンパク質でコーティングしたマンドレル上に播種する。これらマンドレルは、固体の繊維又はワイヤー、或いは、セルロースなどの灌流可能な透過性チューブから作製してよい。マンドレル同士を、単一の細胞スリーブが融合できる適正な間隔だけ離して置く。この方法により、組織のシート又はブロックを形成してよい。次いで、マンドレルを引き抜き（又は別のやり方で除去し）、灌流システムを用いて生体人工組織を内部灌流する。
【００６７】
創傷治癒機器
製造前の生体人工血管システムを用いて、糖尿病患者における慢性潰瘍などの創治癒を補助してよい。生体人工毛細血管ネットワークを支持材料（例えば、血管新生を促進する成長因子の豊富な細胞外マトリックスゲルに由来する）のパッチに埋め込み、創部に貼付することができると考えられる。酸素化した栄養分溶液で自己灌流すると、生体人工血管は、ドナーの血管系及び皮膚の萌芽を促進すると考えられる。或いは、こうした生体人工血管パッチを創と皮膚グラフトとの間に挟み、グラフトの内部成長を促進することができると考えられる。
【００６８】
遺伝子治療用機器
生体人工血管は、植え込み式薬剤送達機器に用いることができると考えられる。患者から採取した細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子を改変することにより、特定のタンパク質（ホルモン、酵素など）を産生することができると考えられる。次いで、これらの細胞は、前述の方法を用いて、生体人工血管又は血管ネットワークに成長させてよい。宿主に再度植え込むと、細胞は、標的物質を産生し続け、局所又は全身に該物質を放出し続ける。
【００６９】
人工組織及び器官
前述の組織工学による血管ネットワークは、組織の作製に、又は全器官の作製にまで使用することができる。１つの手法は、１つ又は複数のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける灌流親血管の作製である。所望の組織又は器官からの間質細胞を、例えば、ゲル中の親血管周囲に播種する。間質細胞には、親血管経由で栄養物及び酸素を供給する。間質細胞が増殖すると、栄養及び酸素の要求が増大する。細胞は、血管新生促進因子を放出し、血管を刺激して萌芽させる。血管システムは、組織が成長するのと同じ、自然の成長にきわめて近い速度で萌芽する。したがって、このシステムは、発達生物学における研究用にも良好なモデルになると考えられる。
【００７０】
別の手法は、多数の平行なマンドレルを、間質細胞の骨格として用いる。間質細胞が増殖するに従って、細胞層がマンドレル周囲に形成される。最終的に、すべてのマンドレル間の空間が間質細胞で満たされ、組織シートとなる。マンドレルを除去した後に、マンドレルの跡に残ったチャネルを通して、組織を灌流してよい。これらのチャネルは、内腔における播種により、内皮細胞化することができる。本手法は２Ｄに限定されない。複数のシートを積み重ねてもよく、３Ｄの骨格を用いてもよい。本発明者は、２Ｄの配置並びに３Ｄの配置を用いて、筋肉組織を加工した。
【００７１】
さらに別の手法では、組織層及び血管ネットワーク層を個別に作製し、次いで、これらを断続的に積み重ねることができると考えられる。これらすべての手法は、１つ又は２つの細胞型による単純なモデル、又は複数の細胞型からなるやや複雑な構築物のいずれをも産生することができる。
【００７２】
これらの方法により加工した組織又は器官は、植え込んだ際に血流に直接接続してもよく、又は宿主血管系がグラフトに成長するまでは灌流システムにより灌流を維持してもよい。
【００７３】
組織工学による灌流筋肉構築物の実施例
ここで、図８Ａを参照することにより、本発明の方法に準拠して平滑筋細胞を播種した後における、複数のマンドレルの例のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける画像を示す。複数のマンドレル及び収縮チューブの単位Ｍを、Ｍｙｌａｒ（登録商標）フレーム上に重ね合わせる。マンドレルＭ間の間隔は、約１００μｍに調節した。すべての収縮チューブ断片の端部を、１つの上流マニホールド及び１つの下流マニホールド（図示せず）に統合した。Ｍｙｌａｒフレームを滅菌し、ラミニンでコーティングし、５×１０６個／ｍｌのラット大動脈平滑筋細胞ＳＭ（ＲＡＳＭＣ）懸濁液を播種した。該細胞ＳＭは、各個別のマンドレルＭに付着し増殖することによって、環状層を形成した。１０日後、個々の層が融合し、１枚の厚い平滑筋細胞シート又はプレートとなった。増殖培地内でさらに７日放置した後、培地に５０Ｕ／ｍｌのへパリンを補充し、さらに７日間放置した。次いで、すべてのマンドレルを引き抜き、流量１０ｍｌ／日のヘパリン培地で組織を灌流した。灌流チャンバーは、へパリン培地で満たした１００ｍｍペトリ皿の底面に固定した。ＳＭＣプレートは、１１日間灌流した。同期間にわたり、チャネルＣＨは機能を維持し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて依然として明らかに目視可能であった（図８Ｂに最も良好に示す）。
【００７４】
ここで、図８Ｂを参照することにより、本発明の方法に準拠して作製した灌流筋肉プレートＭＰの実施例を示す。チューブ端（Ｔ）から、マンドレルを引き抜いた後に残ったチャネル（ＣＨ）内に流体を灌流させる様子を示す。
【００７５】
特許法に準拠し、本発明の新規の原理を応用し、例示的で特殊な成分を構築し用いるのに必要な情報を当業者に与えるために、本明細書では本発明をかなり詳細に記載してきた。しかし、本発明は、具体的に異なる装置、並びに機器及び再構築アルゴリズムにより実施でき、設備の詳細と作業手順のどちらについても、本発明の真の趣旨及び範囲を逸脱せずに、様々な変更を加えることができることを理解されたい。
【００７６】
本明細書に引用したすべての参考文献の完全な開示を、参照により本明細書に組み込む。ただし、別段に解決不能な矛盾が生じた場合は、本明細書の統御するところとする。
（参考文献）
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の方法に準拠して用いる、親血管作製の例を概略的に示す図である。
【図２】本発明の方法に準拠して用いる、既知の熱収縮プロセスの例を概略的に示す図である。
【図３Ａ】本発明の方法に準拠して用いる、培養／灌流機器を組み込む既知の設計を概略的に示す図である。
【図３Ｂ】本発明の方法に準拠して用いる、培養／灌流機器を組み込む製造法で用いる設計を概略的に示す図である。
【図４】本発明の方法に準拠して用いる、培養／灌流機器のマニホールドの作製を概略的に示す図である。
【図５】本発明の方法に準拠して構築する、微小加工による培養／灌流機器の代替設計を概略的に示す図である。
【図６】本発明の方法に準拠して用いる、細胞播種手順を概略的に示す図である。
【図７】本発明の方法に準拠する、２本の生体人工親血管の間の毛細血管ネットワークの概略を示す図である。
【図８Ａ】本発明の方法に準拠して平滑筋細胞を播種した後における、複数のマンドレルの例のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける画像を示す図である。
【図８Ｂ】本発明の方法に準拠して作製する、灌流筋肉プレートの例を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理学的及び病理学的な血管成長、並びに血管新生促進因子又は血管新生抑制因子に応答する血管成長の研究法に関する。
【０００２】
米国連邦政府による委託研究に関する文言
本発明は、ＮＩＨ米国立心肺血液研究所が与える助成金番号１ Ｒ２１ＨＬ０８１１５２−０１に基づく政府援助によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
血管成長の正常な過程（例えば、月経周期、胎盤形成、体脂肪の変化、創傷修復、炎症）では、新たな血管の創出が調節され、最終的には停止する。血管成長の調節異常は、病理学のきわめて重要な要素である。例えば、腫瘍成長、糖尿病性網膜症、関節炎、及び乾癬は、直接的に病理学的状態に寄与する血管の過剰な増殖を伴う。一方、老齢者に特徴的な血管成長の障害は、創傷治癒、及び外傷又は疾患により虚血状態となった組織の血管再構築を損なう。したがって、新たな血管の構築を導く機構、並びに血管成長を開始及び停止する過程の理解が、疾患における血管構築を制御する戦略を開発する上で重要である。
【０００４】
新たな血管の成長（血管新生）においては、毛細血管及び細静脈−血管系の最小の分枝の内腔を覆う内皮細胞から萌芽が生じる。血管新生は、複雑で多段階の過程である。血管新生に関して公表された研究は何千にも及ぶが、血管新生においてその成長及び形態形成を媒介し調節する細胞機構はほとんど分かっていない。
【０００５】
血管新生の萌芽についての詳細は、大半の組織が不透明であるため、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて「リアルタイム」で観察することは難しい。組織切片は、３Ｄで再構成することが難しく、血管の動的な成長過程はわかりにくい。さらに、血管新生の萌芽の先端付近の領域−血管浸潤及び形態形成の制御の重要な領域−を組織切片において見出すことはほとんどない。このような従来の組織学の限界を克服するため、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける各種の血管新生「モデル」が開発されている。
【０００６】
ｉｎ ｖｉｖｏにおける血管新生モデル：生体組織の不透明性を回避するため、研究者らは、生来的に透明な両生類幼生の尾（Ｃｌａｒｋ及びＣｌａｒｋ、１９３９）、或いはウサギの耳（Ｃｌａｒｋ及びＣｌａｒｋ、１９３９）、マウスの皮膚（Ａｌｇｉｒｅ、Ｃｈａｌｋｌｅｙら、１９４５）、及びハムスターの頬嚢（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ及びＳｈｕｂｉ、１９６８）に植え込んだか、又はウサギの角膜ポケット（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、Ｃｏｔｒａｎら、１９７４）若しくはニワトリの漿尿膜（Ａｕｓｐｒｕｎｋ、Ｋｎｉｇｈｔｏｎら、１９７４）から発生させた、特殊化した観察チャンバーを含む、生きている動物内の「窓」を通して、血管新生を観察してきた。大半は記述的なこれらの初期の研究から、腫瘍が誘導する血管走化性という中心的枠組みが検証され、これに対応して、血管成長を促進する拡散性で腫瘍に由来する分子が発見された。ｉｎ ｖｉｖｏにおける血管新生に関するより新規のアッセイでは、げっ歯類の皮下に植え込んだゲル化基底膜タンパク質のスポンジ状又はプラグ状のポリマー中への血管成長を評価している（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２；Ａｎｄｒａｄｅ、Ｍａｃｈａｄｏら、１９９７；Ａｋｈｔａｒ、Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎら、２００２；Ｋｏｉｋｅ、Ｖｅｒｎｏｎら、２００３）。その正確さにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏにおける手法は、（１）血管新生を促進する反応に、動物種間のばらつきが存在すること、（２）動物種間における結果を直接的に比較できないこと、（３）動物の購入及び維持の費用が高額であること、（４）研究目的での動物の使用に対し否定的な世論が存在すること、（５）動物に対する外科処置、並びに結果の視覚化及び評価が複雑であること、により困難である。
【０００７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管新生の２次元（２Ｄ）モデル：血管新生の分子的機構を理解しようとする中で、大血管から単離した内皮細胞を、血管の内膜に類似する集密状態の被覆様単層を形成するまで平皿内で培養した（Ｊａｆｆｅ、Ｎａｃｈｍａｎら、１９７３；Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、１９７６）。大血管における内皮損傷に対する増殖性反応のモデルとしては有用（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ、Ｃｏｔｒａｎら、１９７４；Ｆｉｓｈｍａｎ、Ｒｙａｎら、１９７５；Ｍａｄｒｉ及びＳｔｅｎｎ、１９８２；Ｍａｄｒｉ及びＰｒａｔｔ、１９８６；Ｊｏｚａｋｉ、Ｍａｒｕｃｈａら、１９９０；Ｒｏｓｅｎ、Ｍｅｒｏｍｓｋｙら、１９９０）であるが、剛体基質上での内皮細胞の単層培養物は、血管新生を模した実験において、通常、毛細血管様チューブを組織しない。しかし、１９８０年に、毛細血管内皮細胞の長期培養の成功（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄら、１９７９）により、ウシ又はヒトの毛細血管内皮細胞を２０〜４０日間培養することで、集密状態の細胞単層上に２Ｄの細胞ネットワークが発生し、このプロセスは「ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管新生」と名付けられると報告された（Ｆｏｌｋｍａｎ及びＨａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄ、１９８０）。該ネットワークの内皮細胞は、細胞が組織される基質となる「マンドレル」の、内因的に合成されたネットワークとして解釈される、線維状／アモルファス状の物質で充満した「内腔」を有する「チューブ」として現れた。後年の研究により、大血管由来の内皮細胞（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２；Ｍａｄｒｉ、１９８２；Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３）、及び基底膜タンパク質の柔軟な水和ゲル（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲル）上に播種した内皮細胞（Ｋｕｂｏｔａ、Ｋｌｅｉｎｍａｎら、１９８８）による、同様の２Ｄネットワークの形成が報告されている。
【０００８】
血管発生の２Ｄモデルは今日でも用いられている（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に基づくアッセイ（Ｋｕｂｏｔａ、Ｋｌｅｉｎｍａｎら、１９８８）は、市販されている）が、該モデルは、真の血管新生を定義する以下の５つの特性を欠いている。
１．浸潤−２Ｄモデルにおける内皮細胞は、細胞外マトリックス上にネットワークを形成するが、細胞外マトリックス内に潜伏する傾向はほとんど示さない（Ｖｅｒｎｏｎ、Ａｎｇｅｌｌｏら、１９９２；Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。
２．方向性−２Ｄモデルでは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける内皮細胞ネットワークが、あらかじめ位置付けられた細胞領域全体にわたりほぼ同時的に形成されるのに対し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血管新生は、複数レベルの分枝化により樹状化するフィラメント状の萌芽によって、細胞外マトリックスに対する有向性の浸潤を含む。
３．適正な極性−２Ｄモデルは、毛細血管と顕著に類似する単細胞チューブを作製する（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２；Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３；Ｓａｇｅ及びＶｅｒｎｏｎ、１９９４）が、その極性は「内外が逆」である、すなわち、該モデルは、その内腔表面に基底膜物質を堆積させ、血栓形成面を外側である周囲の培地に向かわせる（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２；Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３）−これはｉｎ ｖｉｖｏにおける状況と逆である。
４．内腔の形成−２Ｄモデルが、開存した内腔を有する内皮細胞（ＥＣ）チューブを形成するという証拠はほとんどない。内皮細胞チューブは、（外因性であるか、又は細胞が合成した）細胞外マトリックスで充満した「内腔状の」空間を有するのが通例である（Ｍａｃｉａｇ、Ｋａｄｉｓｈら、１９８２；Ｍａｄｒｉ、１９８２；Ｆｅｄｅｒ、Ｍａｒａｓａら、１９８３；Ｓａｇｅ及びＶｅｒｎｏｎ、１９９４；Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。開存した内腔は、存在する場合でも、内皮細胞細胞質の厚い壁で覆われたスリット様又は狭隘な円筒状の空間として現れるのが通例である−これは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける毛細血管に典型的な、膨張した薄壁の内皮細胞チューブとは全く異なっている。
５．細胞特異性−２Ｄモデルにおける細胞ネットワークは、おそらくは非ＥＣの細胞型により実現される力学的プロセスにより形成される（Ｖｅｒｎｏｎ、Ａｎｇｅｌｌｏら、１９９２；Ｖｅｒｎｏｎ、Ｌａｒａら、１９９５）。実際、柔軟な２Ｄの細胞外マトリックス（内因的に合成され、又は供給される（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲル））に張力を加えることのできる、任意の付着性細胞型が、最適条件下においてネットワークを形成し得ることを、数学的モデルが示している（Ｍａｎｏｕｓｓａｋｉ、Ｌｕｂｋｉｎら、１９９６）。
【０００９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管新生の３次元（３Ｄ）モデル：ｉｎ ｖｉｖｏにおける血管新生が、３Ｄの細胞外マトリックス内で生じるという認識は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞外マトリックスの３Ｄゲル内で萌芽を誘導する、各種モデルをもたらした。初期の３Ｄモデルでは、コラーゲンゲル内に分散させた内皮細胞（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ、Ｏｒｃｉら、１９８３）が、コードとチューブのネットワークを形成した（Ｅｌｓｄａｌｅ及びＢａｒｄ、１９７２）。内皮細胞チューブは、適正な極性を示したが、浸潤及び方向性の特性を欠いていた（内皮細胞は、細胞外マトリックス中にあらかじめ埋め込み、均等に分散させた）。それにもかかわらず、この手法は、内腔形成の研究（Ｄａｖｉｓ及びＣａｍａｒｉｌｌｏ、１９９６）、及び成長因子に対する内皮細胞の応答（Ｍａｄｒｉ、Ｐｒａｔｔら、１９８８；Ｍｅｒｗｉｎ、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９０；Ｋｕｚｕｙａ及びＫｉｎｓｅｌｌａ、１９９４；Ｍａｒｘ、Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒら、１９９４；Ｄａｖｉｓ及びＣａｍａｒｉｌｌｏ、１９９６）の研究において有用であることが示された。
【００１０】
別の手法では、３Ｄの血漿塊中に埋め込んだラット大動脈の１ｍｍ切片（リング）が、分枝状の吻合性チューブを形成した（Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｔｃｈａｏら、１９８２）。大動脈リングからの萌芽は、血管新生様の極性に加えて、血管新生様の浸潤及び方向性をも示した。ラット由来の大動脈リング又はマウス由来の微小血管断片を用いる移植モデルが、血管新生に対する腫瘍、成長因子、各種細胞外マトリックスの担体、及び老化状態の影響の研究に用いられている（Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｔｃｈａｏら、１９８３；Ｍｏｒｉ、Ｓａｄａｈｉｒａら、１９８８；Ｎｉｃｏｓｉａ及びＯｔｔｉｎｅｔｔｉ、１９９０；Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｂｏｎａｎｎｏら、１９９２；Ｖｉｌｌａｓｃｈｉ及びＮｉｃｏｓｉａ、１９９３；Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｂｏｎａｎｎｏら、１９９４；Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｎｉｃｏｓｉａら、１９９４；Ｎｉｃｏｓｉａ及びＴｕｓｚｙｎｓｋｉ、１９９４；Ｈｏｙｉｎｇ、Ｂｏｓｗｅｌｌら、１９９６；Ａｒｔｈｕｒ、Ｖｅｒｎｏｎら、１９９８）。
【００１１】
（単層又は凝集塊として）精製した内皮細胞を誘導して、基底又は周囲の３Ｄ細胞外マトリックスゲル内に浸潤的に萌芽させる各種のモデルが存在する（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ及びＯｒｃｉ、１９８５；Ｐｅｐｐｅｒ、Ｍｏｎｔｅｓａｎｏら、１９９１；Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ、Ｐｅｐｐｅｒら、１９９３；Ｎｅｈｌｓ及びＤｒｅｎｃｋｈａｈｎ、１９９５；Ｎｅｈｌｓ及びＨｅｒｒｍａｎｎ、１９９６；Ｖｅｒｎｏｎ及びＳａｇｅ、１９９９；Ｖｅｒｎｏｎ及びＧｏｏｄｅｎ、２００２）。これらモデルの各々は、萌芽形成の視覚化が難しいこと、萌芽が制限されること、切片化が必要であること、又は内皮細胞の特定の種別では有効性を欠くこと、を含む個別の限界を有する。
【００１２】
Ｗｏｌｖｅｒｉｎｅ及びＧｕｌｅｃが、腫瘍組織の断片をマトリックス内に埋め込むことを含む３Ｄ血管新生システム（米国特許出願第２００２／０１５０８７９ Ａ１号）を開示した。微小血管の成長を特性化することで、組織が血管新生を促進する可能性を分析している。しかし、この手法は、微小血管の内腔における灌流を提供しない。
【００１３】
Ｎｅｕｍａｎｎ（本発明の発明者）ら、２００３は、人工組織内に組み入れることのできる、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける灌流微小血管を作製する可能性を開示した。Ｎｅｕｍａｎｎら、２００３は、１２７マイクロメートルのナイロン製釣り糸を、収縮チューブが保持する微小血管作製用マンドレルとして用いることを教示する。血管は、寒天中に埋め込んだラット大動脈の平滑筋細胞から作製した。これらの微小血管は、試験的なものであり、ヒト用血管グラフトを作製するには適切でない。
【００１４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管新生：新たな手法：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける２次元の血管成長モデルは、前出の血管新生を定義する特性を確立しないのに対し、既存の３Ｄモデルは、該特性の一部又は大半を再現する。重要なことは、現在作製可能な３Ｄモデルが、流動し循環する加圧流体を含む親血管を再構築しないことである。結果として、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける既存の３Ｄモデルのいずれによっても、内腔圧及び内腔流が血管成長及び形態形成に与える寄与についての研究は可能とならない。
【特許文献１】米国特許出願第２００２／０１５０８７９ Ａ１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、３Ｄ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に浸潤性でチューブ状の微小血管萌芽を形成する実証ずみの方法を、内腔流の源泉となる組織工学による親血管作製のための新規手法と組み合わせることにより、既存の血管新生モデルの限界を克服する。灌流物により、血管新生を調節する化合物を、特異的な標的受容体の存在が知られる内皮細胞の内腔面に投与することができる。栄養培地の内腔流が存在することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける毛細チューブの生存時間が実質的に増大する。開示された血管新生システムを用いて、低酸素症／高酸素症、特定の可溶性の生物活性化合物の検査、遺伝子改変細胞の使用、及びウイルストランスフェクションによる遺伝子の導入を含む、各種の実験パラメータを評価することができる。本システムは、創修復、老化、癌、及び動脈硬化に関する血管新生の研究を可能とする。重要なことは、本発明の教示に従うモデルを応用することで、生体工学による人工組織に組み込むことの可能な、十分に機能的な血管システムを提供し得るということである。
【００１６】
本発明は、微小血管の作製、内皮細胞由来の微小血管の作製、及びより大きな血管（例えば、冠動脈のサイズを有する）の作製用のマニホールドの設計を含む新たな新規手法をも提供する。例えば、微小血管ネットワークの作製法を含む、これら及び他の重要な新しい教示は、本明細書及び本明細書の下記に添付した特許請求の範囲から明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、灌流可能な微小血管ネットワークを作製する方法であって、前記方法が、
一組のマンドレルの上及び周囲において細胞を培養することにより、少なくとも１つの親血管を作製するステップと、
前記少なくとも１つの親血管をマトリックスに埋め込むステップと、
前記少なくとも１つの親血管を誘導して、前記マトリックス中に萌芽を作製するステップと、
前記一組のマンドレルを引き抜くステップと、
前記少なくとも１つの親血管及び萌芽に内腔灌流を施して、毛細血管床の動脈端から静脈端への本来の血流を模倣し、その結果微小血管ネットワークが作製されるステップと
を含む方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書で提供する実施例は、本発明の理解を深めることを目的とする。実施例は、例示的であり、本発明は、実施例の実施形態に限定されない。本発明の方法は、生理学的及び病理学的な血管成長、並びに血管新生促進因子又は血管新生抑制因子に対する応答による血管成長の研究に有用である。他の有用な応用は、癌組織が血管新生を促進する可能性、及び抗血管新生促進剤への反応を評価する方法への応用である。加えて、本発明の方法は、各種の創治癒機器の構築、及び組織工学による生産物に基づく血管構築に用いてよい。
【００１９】
一例として、灌流可能な３次元の微小血管ネットワークを作製するための方法及び機器を開示する。本明細書で用いる「ＥＣ」とは内皮細胞を指し、「ＳＭＣ」とは平滑筋細胞を指し、「ＣＡＳ」とは冠動脈代用物を指す。
【００２０】
一般に、微小血管ネットワークの培養及び灌流のための機器は、中央に１つ又は複数のマンドレルを保持するチャンバーからなる（図１に最良の形で図示）。チャンバーは、様々な技法、例えば、レーザー加工によるフレームを重ね合わせることなどにより、任意の生体適合性材料からも作製することができる。マンドレルは、チャンバー内で引き抜き式となるように組み立てる。これは、例えば、熱収縮により（図２に図示）チューブ内にマンドレル端を装着することにより実現することができる。マンドレルの直径は、所望の血管内径によって決まる。構成を変更して、単一の血管、２つの血管、又は２Ｄ若しくは３Ｄにおける血管の配置全体までに対応させることができる。マンドレルは、ポリマー繊維、ガラス繊維、ワイヤーなど各種の材料製であり得る。
【００２１】
マンドレル上に細胞を播種し、細胞を刺激してマンドレルの周囲に増殖させ、細胞が血管壁を形成した時点でマンドレルを引き抜くことにより、微小血管を作製する。次いで、血管をマトリックスに埋め込む。培養条件、マトリックスの成分、及び血管新生を促進する刺激（例えば、成長因子）に応じて、親血管が、周囲のマトリックス内へ萌芽する。萌芽が互いに吻合し合うことによって、毛細血管ネットワークの形成をもたらす。マンドレルの除去後、該機器を灌流システムに接続し、血管内腔に流体を流す。
【００２２】
ここで、図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃを参照することにより、本発明の方法が用いる親血管作製に関する概略的な例を示す。図１Ａは、培養増殖培地１００中の内皮細胞１を、機器本体３中の収縮チューブ４が保持するマンドレル２に播種した状況を示す。図１Ｂは、細胞１が増殖し、細胞スリーブ１０２の形で環状層を形成したことを示す。図１Ｃは、マンドレル２を引き抜いた後で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ゲル１１０中の細胞スリーブを、培養増殖培地１００で灌流する状況を示す。本発明は、灌流可能な生体人工血管構造を、組織工学の応用及び研究モデル用に加工することを含む。本発明の一般的な原理は、薄壁チューブ又はその他の器具にぴったり装着する取り外し式のマンドレル周囲における層状の細胞培養を含む。細胞層が所望の壁厚に達したら、マンドレルを取り外し、こうして作製した生体人工血管（ＢＡＶ）を、灌流システムを用いて、培地、血液、血液代用物、又は他の流体で灌流してよい。本発明の方法は、量産又は特注製による血管、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける灌流血管新生モデル、創治癒機器、組織成分、全組織及び全器官のほか、研究モデルの作製を可能にする。
【００２３】
培養／灌流機器の作製
ここで、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄを参照することにより、本発明の方法の一実施形態において用いる、既知の熱収縮プロセスに関する概略的な例を示す。図２Ａで具体的に示す通り、各培養／灌流機器（ＣＰＤ）は、支持フレーム１２が保持する１つ又は複数のマンドレル２を含んでよい。所望の血管内径の直径を有するマンドレル２は、その端部を、医療グレードの収縮チューブ断片４内にぴったり装着する。マンドレル２は、模造する血管サイズに応じて、数マイクロメートルから数ミリメートルの直径を有する、生体適合性の繊維（例えば、ポリマー、ガラス）、ワイヤー、又は同等物を使用してよい。
【００２４】
図２Ｂのより詳細な図面に示す通り、各収縮チューブ断片４の中央部分１４は、マンドレル２の１つの周囲で熱収縮する。次いで、図２Ｃで具体的に示す通り、マンドレル２を引き抜き、チューブを切断する。図２Ｄは、マンドレルの位置を移した後の、ここでは切断されて分離した収縮チューブ断片４がマンドレルの両端を封止する状況を示す。フレーム１２は、各種の材料及び技法を用いて作製してよい。構成を変更して、単一の生体人工血管又は多数の生体人工血管のどちらに対応させてもよい。同様に、マンドレルが配置されている複数の平面を層状化することによって、血管ネットワークを伴う厚く灌流可能な組織を形成してよい。
【００２５】
灌流チャンバーの加工
ここで、図３Ａを参照することにより、複数のマンドレル／収縮チューブアセンブリー１１の灌流用の既知の構成を示す。フレーム２０は、有利には、ポリカーボネート又は同等の材料から圧延することができる。分配チャンバー３０を設計に含めることで、多数の生体人工血管の同時的灌流が可能となる。マンドレル２を含む一組の糸状物の端部を、シリコンチューブ２３内に集める。
【００２６】
Ｍｙｌａｒフレームのレーザー加工
ここで、図３Ｂを参照することにより、本発明の方法に準拠して用いる培養／灌流機器を組み込む製造法で用いる新規の設計を概略的に示す。単一血管設計であるＣＰＤ７０は、有利には、熱収縮チューブ４が保持するマンドレル２を、レーザー加工による２つのＭｙｌａｒ（登録商標）フレーム２２の間に挟み込むことによって作製することができる。有利には、下記に詳述する通りに構成する、円筒形のエポキシ製マニホールド２１を用いて、マンドレル／収縮チューブアセンブリー１１を保持することができる。
【００２７】
マンドレル／収縮チューブアセンブリーを、Ｍｙｌａｒ（登録商標）などのポリエステルフィルム製などの２つのフレームの粘着性の面同士を押圧してフレーム間に挟み込み、各マンドレルを、各端部の２本の収縮チューブ断片４’により、フレームウインドウ７６内に吊架させてよい。２本の収縮チューブ断片４’は、少なくとも１本の細い固定ワイヤー２６をフレーム２２に組み入れ、シリコンチューブの鋳型を用いて収縮チューブと少なくとも１本の細い固定ワイヤー２６との周囲に成型される円筒形のエポキシ製マニホールド内に封入することにより固定し、強化する。２本の収縮チューブ断片４’は、最終的に、ＣＰＤ７０の流入及び流出ポートとなる。
【００２８】
ここで、図４Ａ及び図４Ｂを参照することにより、本発明の方法に準拠した機器用にマニホールドを作製する方法を概略的に示す。図４Ａは、例えば、シリコンチューブ５０のスリーブを通して引き抜く、複数の収縮チューブ／マンドレルアセンブリー１１を特に示す。エポキシ接着剤４０を注入して、シリコンチューブ５０を満たし、硬化させる。
【００２９】
図４Ｂは、特に、エポキシ接着剤４０が硬化し、シリコンチューブ５０を開口し除去した後の状態を示す。硬化したエポキシ製ロッド４４が残されている。エポキシ製ロッド４４は、収縮チューブが作製したチャネル４２を残して切断部からマンドレルを引き抜いた後で切断する。多数の収縮チューブの端部４６を統合して、マニホールド２１を形成する。個々のＣＰＤ又はＣＰＤフレームアセンブリーの積重ねを用いて、３Ｄ血管配置を作製することができる。
【００３０】
代替方法
ここで、図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃを参照することにより、本発明の方法に準拠した、微細加工による培養／灌流機器の設計代案を概略的に示す。図５Ａは、特に、収縮チューブの代替物である、スリーブ５６を有する小型の穿孔部５４を通して導入する一組のマンドレル２を示す。図５Ｂは、特に、フレーム壁面５２に組み込む一組のマンドレル２を含む、細胞播種前のＣＰＤを示す。
【００３１】
図５Ｃは、特に、血管６２を備える培養／灌流機器の代替的な例を示し、その例では、微細加工によるマニホールド６４をフレーム５２の外側のスリーブ５６に取り付けてよい。血管６２は、本明細書に示す通り、マンドレル上で成長し、マンドレルを取り外した後に残る。微細成型などの微細加工法を用いて、該ＣＰＤフレームアセンブリーを量産することができる。
【００３２】
血管作製と灌流
ここで、図６を参照することにより、本発明の方法に準拠した細胞播種手順を概略的に示す。細胞播種用のＣＰＤ７０を準備するため、まず洗浄し、次いでＵＶ滅菌する。滅菌条件下において、ＣＰＤを表面、例えば、ペトリ皿７２の底面に固定する。次いで、ＣＰＤフレームアセンブリー７０の内部ウインドウ７６（図３Ｂに図示）を、ラミニン−１などの接着性タンパク質を含む溶液で満たす。必要に応じ、１つ又は複数のスペーサー７７を用いてよい。インキュベーション時間の経過後、接着性タンパク質を含む溶液を除去し、次いで、培地中の所望の細胞型（例えば、平滑筋細胞又は内皮細胞）の懸濁液を、ＣＰＤ７０のウインドウ７６内に移す。
【００３３】
細胞播種は、一定量の細胞懸濁液をウインドウ７６内に満たし、ＣＰＤフレームアセンブリー７０を上下裏返して、懸滴８０を滴下させることにより行うことができる。約４５分間のインキュベーション時間において、大多数の細胞が、ＣＰＤフレームアセンブリー内のマンドレル／収縮チューブアセンブリーに付着する。余剰細胞は、懸滴の先端部に沈下し、容易に採取及び廃棄し得る。次いで、１つ又は複数のＣＰＤフレームアセンブリーを含むペトリ皿を、正立位に戻し、ＣＰＤフレームアセンブリーが溢れるまで培地で満たし、インキュベートした。１つの実施例におけるインキュベーション条件は、３７℃で５％ＣＯ２の環境中であった。マンドレル／収縮チューブアセンブリーに付着した細胞は、広がり増殖し、同心的単層（例えば、内皮細胞）又は１５０μｍ以上の厚さの多層（例えば、平滑筋細胞）を形成した。
【００３４】
所望の壁面の形状又は厚さでマンドレルを引き抜き、これによって中空の細胞チューブを作製する。薄い壁面は、マンドレルを引き抜く前に、例えば、アガロース、コラーゲン、基底膜タンパク質ゲルなどのゲルを細胞スリーブの周囲に流し込むことによって破断を防ぐことができる。次いで、ＣＰＤフレームアセンブリーのマニホールドを灌流システムに接続し、増殖培地など選択の流体で灌流する。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から内皮「親」血管を作製する方法は、以下のステップを含む。
【００３６】
まず、培養機器を洗浄し、次いで、各面３０分間にわたるＵＶ曝露により滅菌する。滅菌条件下で、滅菌ストリップでペトリ皿の底面に該機器を固定する。
【００３７】
次いで、該機器の内部ウインドウを、ラミニン−１の接着性タンパク質溶液（フィブロネクチン、フィブリン、又はゼラチンなどの他の接着性タンパク質で代用することができる）で満たす。
【００３８】
１晩のインキュベーション後、接着性タンパク質を含む溶液を除去し、次いで、培地中のヒト血管内皮細胞懸濁液を、該機器のウインドウ内に移す。
【００３９】
次いで、ペトリ皿を上下裏返すことで、該機器ウインドウ内で細胞培地懸濁液の懸滴を形成させる。細胞培養インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）における４５分間のインキュベーション時間の経過後、数多くの細胞が、機器内のマンドレル／収縮チューブアセンブリーに付着する。
【００４０】
次いで、ペトリ皿を正立位に戻し、機器が浸るまでヒト血管内皮細胞用の増殖培地で満たす。
【００４１】
マンドレルに結合しなかった細胞は浮遊するので、吸引し廃棄する。
【００４２】
次いで、ペトリ皿をインキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）に留置する。マンドレルに付着した細胞は、広がり増殖し、ヒト血管内皮細胞の同心的単層を形成する。
【００４３】
次いで、ペトリ皿から培地を除去する。コラーゲン溶液を培養機器のウインドウ内に満たし、固形化させることにより、マンドレルを細胞層に埋め込む。
【００４４】
ヒト血管内皮細胞は、コラーゲンゲル内に萌芽を形成する。次いで、マンドレルをゆっくりと引き抜き、ヒト血管内皮細胞の灌流可能な「親」微小血管を後に残す。
【００４５】
次いで、機器のマニホールドを灌流システムに接続し、ヒト血管内皮細胞増殖培地で灌流する。
【００４６】
灌流システム
ＣＰＤは、直線状モード又は循環状モードのいずれの灌流システムに取り付けてもよい。直線状の構成は、重力流下システム、又は市販される若しくは特注製のシリンジポンプにより作製してよい。シリンジは灌流培地で満たし、シリンジポンプ内に組み込み、気密チューブによりＣＰＤの上流端に接続する。ＣＰＤを滅菌条件下のインキュベータ内に保存してもよく、滅菌細胞培養環境をＣＰＤ内で確立してもよい。ＣＰＤの下流マニホールドを、灌流物を回収する末端容器に接続する。蠕動式ポンプを用いることにより、循環状システムを構成してよい。直線状及び循環状のいずれのシステムにも、ガス交換機器を取り付けてよい。ガス濃度、灌流圧、流量、温度、並びに栄養物及び代謝副産物の濃度は、センサーで測定する。収集したデータは、フィードバックループに投入することで、所望のパラメータの厳密な制御が可能となる。
【００４７】
具体的用途
血管新生関連の研究用モデル
ここで、図７を参照する。図７は、本発明の方法に準拠する２つの生体人工親血管２００、２０２の間の毛細血管ネットワークの概略を示す。「静脈側の」親血管２０２への流量（ｆ）を減少させ、「動脈側の」親血管２００における抵抗（Ｒ）を増大させることにより、流体の灌流物２０４を毛細血管２０６を介する経路に変更する。この結果、灌流物（２０４）がより高圧の血管からより低圧の血管へと流れ、毛細血管床の動脈端から静脈端への本来の血流を模倣する。
【００４８】
マンドレル法は、血管新生研究用のモデル開発や、必要に応じて、創修復、老化、並びに癌、糖尿病、関節炎、及び乾癬などの疾患における薬学的試験及び研究にも用いることができる。内皮細胞のみ、又は内皮細胞、平滑筋細胞、及び周皮細胞の組合せを用いると、親生体人工微小血管（ＢＭＶ）を、ミクロン直径のマンドレルの周囲に培養し、細胞外マトリックスの支持ゲル内に埋め込むことができる。次いで、マンドレルを引き抜き、開存した内皮細胞チューブを細胞外マトリックスゲル２１０（コラーゲンゲル、基底膜マトリックス（ＢＭＭ）等）内に残す。引き抜きは、手で、又は自動機器により、きわめて遅いスピードからきわめて速いスピードまでのさまざまなスピードで行ってよい。他の態様として、凍結状態にある生体人工微小血管からのマンドレルの引き抜き、熱反応性ポリマーによるマンドレルのコーティング、又はマンドレルの両端を引っ張り、細くして破断させることを含んでよい。
【００４９】
周囲のゲル２１０内への親血管の萌芽は、ゲル及び／又は灌流物（例えば、増殖培地）に添加する、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、及びホルボール１２−ミリスチン酸−１３−アセテート（ＰＭＡ）などの化合物により誘導する。
【００５０】
複雑な毛細血管ネットワーク２２２は、２つの隣接する生体人工親微細血管の間に圧力差を確立し、動脈及び静脈の血流を模倣することにより作製することができる。次いで、「動脈側の」生体人工微小血管から、相互接続した萌芽を通して「静脈側の」生体人工微小血管へと、流体流の経過を変更する。
【００５１】
灌流物は、有利には、血清及び血管新生促進物質又は血管新生抑制物質を含まない酸素化細胞増殖培地を含んでよい。別の例では、灌流物が、血清、及び／又は血管新生に影響する化合物を補充した酸素化細胞増殖培地でよい。さらに別の実施形態の例では、灌流物は、酸素化生理食塩液でよい。別の例では、灌流物は、酸素化した血液、血液成分、又は血液代用物を含んでよい。さらに別の例の実施形態では、灌流物は酸素化物でなくてもよく、システムの酸素化は、マトリックスを介しての拡散により実現される。さらに別の例の実施形態では、血管新生を促進する化合物又は血管新生を抑制する化合物を灌流物に添加することができる。
【００５２】
実施形態の一例では、血管新生を促進する化合物及び血管新生を抑制する化合物などを、マトリックスに添加する。さらに別の実施形態の例では、細胞は、灌流物又はマトリックスに産物を放出する遺伝子改変細胞を含む。さらに別の実施形態の例では、マトリックスは、有利には、フィブリン、コラーゲン、及びゼラチンを含んでよい。有用なマトリックスの一型は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲルである。別の実施形態の例では、マトリックスは、寒天、アガロース、アルギネート、又はシリカゲルを含んでよい。
【００５３】
実施形態の一例では、細胞は、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、遺伝子改変細胞からなる群から選択することができる。マトリックスには、ヒト細胞、動物細胞、及び植物細胞からなる群から選択される細胞が、全体に分散し、又は局所的に集中して、存在してよい。場合によっては、健康組織又は癌組織などの罹患組織の断片をマトリックスに埋め込む。
【００５４】
親血管からの萌芽は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、材料の切片化、又は全載標本により顕微鏡で調べてよい。蛍光溶液（例えば、蛍光デキストラン）による生体人工微細血管の灌流は、萌芽直径、萌芽内腔の開存性、及び吻合程度の分析に役立つ。萌芽形態の３Ｄ再構成は、共焦点顕微鏡により採取した落射蛍光画像のｚ軸方向の積重ねにより実施することができる。萌芽２２０による周皮細胞基底膜マトリックスの合成は、抗ラミニン及びＩＶ型コラーゲンによる第一抗体、並びに蛍光又はペルオキシダーゼにより標識した第二抗体で免疫標識することにより、全載及び組織学的（パラフィン）切片においてモニターしてよい。
【００５５】
ＥＣ／ＳＭＣ複合萌芽では、ヒトＣＤ３１に対するＦＩＴＣ−モノクローナル抗体（ＭＡｂ）（クローンＰ２Ｂ１−Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）又はヒト内皮細胞に対する特異的なマーカーであるＦＩＴＣ−ＵＥＡ １アグルチニンで内皮細胞を標識することにより、２つの細胞型間の空間的関係を検討することができる。平滑筋細胞は、ヒトアルファ−ＳＭアクチンに対するＭＡｂ及び、その後のＲＩＴＣ−抗マウス第二抗体で標識することができる。内腔構造及び内皮細胞と平滑筋細胞との間の相互作用の詳細は、前出の試薬で標識したパラフィン切片から得てよい。
【００５６】
記載の作製法は、再現性の高い血管新生機器の市販向け量産のための基盤である。適切な保存（例えば、冷凍保存）により、成長前の親血管又は全毛細血管ネットワークが、即時に研究者に使用可能となり得る。
【００５７】
冠動脈代用物
冠動脈代用物を作製する場合は、内径約４ｍｍ〜５．５ｍｍの血管内腔を有する冠動脈代用物が得られる外径を有するマンドレルを選択する。或いは、マンドレルは、冠動脈代用物の成長期間中における栄養物及びガスの交換を可能にするのに十分な灌流を受け十分な透過性を示す中空のチューブでもよい。冠動脈代用物は、平滑筋細胞のみから成長させて、血管内の培地層に構造類似物を提示してもよく、あるいは２つ又は３つの細胞型からの複合構造として作製してもよい。
【００５８】
平滑筋細胞をマンドレル上に播種し、３００〜４００μｍの環状層に成長させる。冠動脈代用物の作製を加速化させるため、成長初期には細胞を高度に増殖性の表現型とし、次いで、血管壁が所望の厚さに達した後は分化状態に切り替わるようにＳＭＣ表現型を操作してよい。表現型の切替えは、平滑筋細胞の成長速度を顕著に遅速化させ、コラーゲン及びエラスチンなど、血管の適正な力学的特性に必須である細胞外マトリックスタンパク質の産生を誘導する。表現型の切替えは、特定の遺伝子発現を制御することにより達成してよい。例えば、テトラサイクリン反応性プロモーターを用いることにより、血管壁が所望の厚さに達するまでは、遺伝子発現（例えば、エラスチン産出）を抑制することができる。増殖培地からテトラサイクリンを除けば、挿入された遺伝子が活性化される。例えば、エラスチンの過剰発現は、血管壁内における更なる細胞増殖を阻害し、構造的機能及びシグナル伝達機能を働かせる。力学的な調節、例えば、拍動流を用いて、冠動脈代用物を強化し、細胞の生理学的アライメントを誘導してよい。他の外部又は内部の「表現型の切替え」もまた、用いることができる。
【００５９】
内皮細胞は、マンドレル除去の直後、又は平滑筋細胞の調節及び再構築後、のいずれにおいてＳＭＣスリーブ内に播種してもよい。内皮細胞の播種は、ＳＭＣスリーブ内への内皮細胞懸濁液の注入により行うことができる。次いで、注入流を一定時間停止し、内皮細胞を適正に付着させる。必要ならば、血管を回転させるか繰り返し上下の向きを逆にして、内皮細胞の均等な分布を促してよい。
【００６０】
或いは、まず、内皮細胞をマンドレル上に播種することもできる。この場合、集密状態の内皮細胞層の上に平滑筋細胞を播種する。この方法では、内皮細胞が、酸素及び栄養分の豊富な冠動脈代替物の辺縁部へと移動することを防止する必要がある。
【００６１】
所望の場合は、ＳＭＣスリーブの外側に線維芽細胞を播種することで、外膜層を作製することができる。
【００６２】
冠動脈代替物作製用の細胞は、自家の、他家の、又は異種の材料に由来してよい。細胞は、幹細胞、前駆細胞、又は分化細胞であってよい。細胞を遺伝子改変することにより、特定の表現型を実現するか、又は宿主生物の免疫反応を低下させることができる。
【００６３】
本発明の方法は、即時に利用可能な血管代用物、又は受容者ごとに特注設計する血管代用物の量産という選択肢を提供する。本発明の方法は、冠動脈代用物の組織工学モデル、アテローム発生、動脈形成の研究モデル、異なる血管細胞型同士及び細胞外マトリックス成分との相互作用の研究モデル、酸化窒素の効果に関する研究モデル、並びに各種医薬品の研究モデルの開発にも適している。
【００６４】
異なるサイズ又は型の血管及びリンパ管
本発明の方法を用いて、冠動脈以外の直径及び型を持つ血管を作製してよい。マンドレルの直径を変化させると、血管の直径が変化する。脈管の型（動脈、静脈、リンパ管）は、細胞の表現型、及び／又は細胞増殖が阻害される時点により変化することがある。例えば、静脈は、小型の平滑筋細胞層のみを含む。
【００６５】
他の管状様組織
本発明の方法を用いて、胆管、涙管、耳管、卵管、輸精管、尿管、尿道など他の管状組織を加工してよい。本発明の方法は、神経成長及び修復を誘導するために、グリア細胞を含む異なる細胞型から神経導管を形成するのに有用であることがある。
【００６６】
組織工学のためのＢＡＶシステム
本発明の方法を用い、多数の取り外し式マンドレルを骨格として用いることにより、組織及び器官を加工してよい。所望の組織／器官（筋肉、肝臓、腎臓、肺、皮膚など）の細胞を、接着性タンパク質でコーティングしたマンドレル上に播種する。これらマンドレルは、固体の繊維又はワイヤー、或いは、セルロースなどの灌流可能な透過性チューブから作製してよい。マンドレル同士を、単一の細胞スリーブが融合できる適正な間隔だけ離して置く。この方法により、組織のシート又はブロックを形成してよい。次いで、マンドレルを引き抜き（又は別のやり方で除去し）、灌流システムを用いて生体人工組織を内部灌流する。
【００６７】
創傷治癒機器
製造前の生体人工血管システムを用いて、糖尿病患者における慢性潰瘍などの創治癒を補助してよい。生体人工毛細血管ネットワークを支持材料（例えば、血管新生を促進する成長因子の豊富な細胞外マトリックスゲルに由来する）のパッチに埋め込み、創部に貼付することができると考えられる。酸素化した栄養分溶液で自己灌流すると、生体人工血管は、ドナーの血管系及び皮膚の萌芽を促進すると考えられる。或いは、こうした生体人工血管パッチを創と皮膚グラフトとの間に挟み、グラフトの内部成長を促進することができると考えられる。
【００６８】
遺伝子治療用機器
生体人工血管は、植え込み式薬剤送達機器に用いることができると考えられる。患者から採取した細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子を改変することにより、特定のタンパク質（ホルモン、酵素など）を産生することができると考えられる。次いで、これらの細胞は、前述の方法を用いて、生体人工血管又は血管ネットワークに成長させてよい。宿主に再度植え込むと、細胞は、標的物質を産生し続け、局所又は全身に該物質を放出し続ける。
【００６９】
人工組織及び器官
前述の組織工学による血管ネットワークは、組織の作製に、又は全器官の作製にまで使用することができる。１つの手法は、１つ又は複数のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける灌流親血管の作製である。所望の組織又は器官からの間質細胞を、例えば、ゲル中の親血管周囲に播種する。間質細胞には、親血管経由で栄養物及び酸素を供給する。間質細胞が増殖すると、栄養及び酸素の要求が増大する。細胞は、血管新生促進因子を放出し、血管を刺激して萌芽させる。血管システムは、組織が成長するのと同じ、自然の成長にきわめて近い速度で萌芽する。したがって、このシステムは、発達生物学における研究用にも良好なモデルになると考えられる。
【００７０】
別の手法は、多数の平行なマンドレルを、間質細胞の骨格として用いる。間質細胞が増殖するに従って、細胞層がマンドレル周囲に形成される。最終的に、すべてのマンドレル間の空間が間質細胞で満たされ、組織シートとなる。マンドレルを除去した後に、マンドレルの跡に残ったチャネルを通して、組織を灌流してよい。これらのチャネルは、内腔における播種により、内皮細胞化することができる。本手法は２Ｄに限定されない。複数のシートを積み重ねてもよく、３Ｄの骨格を用いてもよい。本発明者は、２Ｄの配置並びに３Ｄの配置を用いて、筋肉組織を加工した。
【００７１】
さらに別の手法では、組織層及び血管ネットワーク層を個別に作製し、次いで、これらを断続的に積み重ねることができると考えられる。これらすべての手法は、１つ又は２つの細胞型による単純なモデル、又は複数の細胞型からなるやや複雑な構築物のいずれをも産生することができる。
【００７２】
これらの方法により加工した組織又は器官は、植え込んだ際に血流に直接接続してもよく、又は宿主血管系がグラフトに成長するまでは灌流システムにより灌流を維持してもよい。
【００７３】
組織工学による灌流筋肉構築物の実施例
ここで、図８Ａを参照することにより、本発明の方法に準拠して平滑筋細胞を播種した後における、複数のマンドレルの例のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける画像を示す。複数のマンドレル及び収縮チューブの単位Ｍを、Ｍｙｌａｒ（登録商標）フレーム上に重ね合わせる。マンドレルＭ間の間隔は、約１００μｍに調節した。すべての収縮チューブ断片の端部を、１つの上流マニホールド及び１つの下流マニホールド（図示せず）に統合した。Ｍｙｌａｒフレームを滅菌し、ラミニンでコーティングし、５×１０６個／ｍｌのラット大動脈平滑筋細胞ＳＭ（ＲＡＳＭＣ）懸濁液を播種した。該細胞ＳＭは、各個別のマンドレルＭに付着し増殖することによって、環状層を形成した。１０日後、個々の層が融合し、１枚の厚い平滑筋細胞シート又はプレートとなった。増殖培地内でさらに７日放置した後、培地に５０Ｕ／ｍｌのへパリンを補充し、さらに７日間放置した。次いで、すべてのマンドレルを引き抜き、流量１０ｍｌ／日のヘパリン培地で組織を灌流した。灌流チャンバーは、へパリン培地で満たした１００ｍｍペトリ皿の底面に固定した。ＳＭＣプレートは、１１日間灌流した。同期間にわたり、チャネルＣＨは機能を維持し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて依然として明らかに目視可能であった（図８Ｂに最も良好に示す）。
【００７４】
ここで、図８Ｂを参照することにより、本発明の方法に準拠して作製した灌流筋肉プレートＭＰの実施例を示す。チューブ端（Ｔ）から、マンドレルを引き抜いた後に残ったチャネル（ＣＨ）内に流体を灌流させる様子を示す。
【００７５】
特許法に準拠し、本発明の新規の原理を応用し、例示的で特殊な成分を構築し用いるのに必要な情報を当業者に与えるために、本明細書では本発明をかなり詳細に記載してきた。しかし、本発明は、具体的に異なる装置、並びに機器及び再構築アルゴリズムにより実施でき、設備の詳細と作業手順のどちらについても、本発明の真の趣旨及び範囲を逸脱せずに、様々な変更を加えることができることを理解されたい。
【００７６】
本明細書に引用したすべての参考文献の完全な開示を、参照により本明細書に組み込む。ただし、別段に解決不能な矛盾が生じた場合は、本明細書の統御するところとする。
（参考文献）
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の方法に準拠して用いる、親血管作製の例を概略的に示す図である。
【図２】本発明の方法に準拠して用いる、既知の熱収縮プロセスの例を概略的に示す図である。
【図３Ａ】本発明の方法に準拠して用いる、培養／灌流機器を組み込む既知の設計を概略的に示す図である。
【図３Ｂ】本発明の方法に準拠して用いる、培養／灌流機器を組み込む製造法で用いる設計を概略的に示す図である。
【図４】本発明の方法に準拠して用いる、培養／灌流機器のマニホールドの作製を概略的に示す図である。
【図５】本発明の方法に準拠して構築する、微小加工による培養／灌流機器の代替設計を概略的に示す図である。
【図６】本発明の方法に準拠して用いる、細胞播種手順を概略的に示す図である。
【図７】本発明の方法に準拠する、２本の生体人工親血管の間の毛細血管ネットワークの概略を示す図である。
【図８Ａ】本発明の方法に準拠して平滑筋細胞を播種した後における、複数のマンドレルの例のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける画像を示す図である。
【図８Ｂ】本発明の方法に準拠して作製する、灌流筋肉プレートの例を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、灌流可能な微小血管ネットワークを作製する方法であって、
一組のマンドレル（２）の上及び周囲において細胞（１）を培養することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも１つの親血管（２００）を作製するステップと、
前記少なくとも１つの親血管（２００）をマトリックスに埋め込むステップと、
前記少なくとも１つの親血管（２００）を誘導して、前記マトリックス中に萌芽（２２０）を作製するステップと、
前記一組のマンドレル（２）を引き抜くステップと、
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施して、毛細血管床の動脈端から静脈端への本来の血流を模倣し、その結果微小血管ネットワークが作製されるステップと
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つの親血管（２００）を作製する前記ステップが２つ以上の親血管を作製し、萌芽が吻合して毛細血管ネットワークを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの親血管（２００）をさらに作製する前記ステップが、灌流可能な血管の多次元的配置を作製することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記灌流物（２０４）が、血清及び血管新生促進物質又は血管新生抑制物質を含まない酸素化細胞増殖培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、血清、及び／又は血管新生に影響する化合物を補充した酸素化細胞増殖培地を含む灌流物（２０４）を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、酸素化生理食塩液で灌流することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、酸素化した血液、血液成分、又は血液代用物で灌流することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、酸素化していない灌流物（２０４）で灌流することを含み、システムの酸素化が、前記マトリックスを介しての拡散により実現される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、少なくとも１つの血管新生を促進する化合物及び血管新生を抑制する化合物を灌流物（２０４）に添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、少なくとも１つの血管新生を促進する化合物及び血管新生を抑制する化合物を前記マトリックスに添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、灌流物（２０４）又は前記マトリックスに産物を放出する遺伝子改変細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記マトリックスが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、ゲル化した基底膜、寒天、アガロース、アルギネート、基底膜タンパク質、シリカゲル、及びその組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、内皮細胞、平滑筋細胞（ＳＭＣ）、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、遺伝子改変細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記マトリックス全体に分散し、又は局所的に集中しているヒト細胞、動物細胞、及び植物細胞からなる群から選択される細胞が前記マトリックスに存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
健康組織又は罹患組織の断片を前記マトリックスに埋め込む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
癌組織の断片を前記マトリックスに埋め込む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
静脈側の親血管（２０２）への流量を減少させ、動脈側の親血管（２００）における抵抗を増大させることにより、流体の灌流物（２０４）を毛細血管（２０６）を介する経路に変更し、その結果、灌流物（２０４）がより高圧の血管からより低圧の血管へと流れる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記微小血管ネットワークが、生体人工微小血管、開存した内皮細胞チューブ、及び平滑筋細胞チューブのうち選択された１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
微小血管ネットワークが、前記灌流物（２０４）内に因子を放出する正常細胞又は遺伝子改変細胞からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、灌流物（２０４）内に因子を放出する正常細胞又は遺伝子改変細胞を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト血管内皮細胞から内皮親血管を作製する方法であって、
内部ウインドウを有する培養機器を洗浄し滅菌するステップと、
滅菌条件下で、滅菌ストリップで容器の底面に前記培養機器を固定するステップと、
前記内部ウインドウを接着性タンパク質溶液で満たすステップと、
インキュベーション後、前記接着性タンパク質を含む溶液を除去するステップと、
培地中のヒト血管内皮細胞（ＥＣ）懸濁液を前記ウインドウ内に移すステップと、
前記培養機器の前記ウインドウ内で細胞培養懸濁液の懸滴を形成させるステップと、
前記容器を正立位に戻し、前記培養機器が浸るまでヒト血管内皮細胞（ＥＣ）用の増殖培地で満たすステップと、
マンドレル（２）に付着した細胞が広がり増殖し、ヒト血管内皮細胞の同心的単層を形成するまで、前記容器をインキュベータに留置するステップと、
前記培地を除去するステップと、
前記ウインドウをコラーゲン溶液で満たし固形化させることにより、前記マンドレルを細胞層に埋め込むステップと、
前記マンドレルをゆっくりと引き抜き、前記コラーゲンゲル内に萌芽するヒト血管内皮細胞の灌流可能な親微小血管を後に残すステップと、
ヒト血管内皮細胞増殖培地で灌流するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記接着性タンパク質溶液が、ラミニン−１、フィブロネクチン、フィブリン、及びゼラチンからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
組織を作製する方法であって、
複数のマンドレル（２）をフレーム上に並置するステップであって、所定の間隔を置いてマンドレル（２）同士が実質的に平行となり、前記複数のマンドレル（２）の各々の両端をチューブにより保持するステップと、
すべてのチューブの端部を１つの上流マニホールド及び１つの下流マニホールドに統合するステップと、
前記フレームを滅菌するステップと、
前記フレームをコーティングするステップと、
前記フレームに細胞懸濁液を播種するステップと、
各マンドレルに付着した前記細胞を増殖させ、個々の層が融合して組織になるまで環状層を形成させるステップと、
前記組織を増殖培地にさらすステップと、
前記マンドレル（２）を引き抜くステップと、
前記組織を灌流物（２０４）で灌流するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
前記灌流物がヘパリンを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、ヒト平滑筋細胞（ＳＭＣ）、内皮細胞（ＥＣ）、間質細胞、及びヒト血管内皮細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト冠動脈代用物を作製する方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト冠動脈を形成するサイズのマンドレル上及びマンドレル周囲にヒト平滑筋細胞（ＳＭＣ）を培養することにより細胞チューブを作製するステップと、
前記細胞チューブをマトリックス内に埋め込むステップと、
前記マンドレルを引き抜くステップと、
前記細胞チューブに内腔灌流を施すステップと
を含む方法。
【請求項２７】
前記細胞チューブが内腔面を含み、培地内に播種することにより前記内腔面を内皮細胞でコーティングするステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞チューブが外表面を含み、培地内に播種することにより前記外表面を線維芽細胞でコーティングするステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記マンドレルが、４ｍｍ〜５．５ｍｍの範囲にある内腔径を有する細胞チューブを形成するサイズである、請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、灌流可能な微小血管ネットワークを作製する方法であって、
一組のマンドレル（２）の上及び周囲において細胞（１）を培養することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも１つの親血管（２００）を作製するステップと、
前記少なくとも１つの親血管（２００）をマトリックスに埋め込むステップと、
前記少なくとも１つの親血管（２００）を誘導して、前記マトリックス中に萌芽（２２０）を作製するステップと、
前記一組のマンドレル（２）を引き抜くステップと、
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施して、毛細血管床の動脈端から静脈端への本来の血流を模倣し、その結果微小血管ネットワークが作製されるステップと
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つの親血管（２００）を作製する前記ステップが２つ以上の親血管を作製し、萌芽が吻合して毛細血管ネットワークを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの親血管（２００）をさらに作製する前記ステップが、灌流可能な血管の多次元的配置を作製することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記灌流物（２０４）が、血清及び血管新生促進物質又は血管新生抑制物質を含まない酸素化細胞増殖培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、血清、及び／又は血管新生に影響する化合物を補充した酸素化細胞増殖培地を含む灌流物（２０４）を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、酸素化生理食塩液で灌流することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、酸素化した血液、血液成分、又は血液代用物で灌流することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、酸素化していない灌流物（２０４）で灌流することを含み、システムの酸素化が、前記マトリックスを介しての拡散により実現される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、少なくとも１つの血管新生を促進する化合物及び血管新生を抑制する化合物を灌流物（２０４）に添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、少なくとも１つの血管新生を促進する化合物及び血管新生を抑制する化合物を前記マトリックスに添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、灌流物（２０４）又は前記マトリックスに産物を放出する遺伝子改変細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記マトリックスが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、ゲル化した基底膜、寒天、アガロース、アルギネート、基底膜タンパク質、シリカゲル、及びその組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、内皮細胞、平滑筋細胞（ＳＭＣ）、周皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、幹細胞、遺伝子改変細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記マトリックス全体に分散し、又は局所的に集中しているヒト細胞、動物細胞、及び植物細胞からなる群から選択される細胞が前記マトリックスに存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
健康組織又は罹患組織の断片を前記マトリックスに埋め込む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
癌組織の断片を前記マトリックスに埋め込む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
静脈側の親血管（２０２）への流量を減少させ、動脈側の親血管（２００）における抵抗を増大させることにより、流体の灌流物（２０４）を毛細血管（２０６）を介する経路に変更し、その結果、灌流物（２０４）がより高圧の血管からより低圧の血管へと流れる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記微小血管ネットワークが、生体人工微小血管、開存した内皮細胞チューブ、及び平滑筋細胞チューブのうち選択された１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
微小血管ネットワークが、前記灌流物（２０４）内に因子を放出する正常細胞又は遺伝子改変細胞からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの親血管（２００）及び萌芽に内腔灌流を施す前記ステップが、灌流物（２０４）内に因子を放出する正常細胞又は遺伝子改変細胞を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト血管内皮細胞から内皮親血管を作製する方法であって、
内部ウインドウを有する培養機器を洗浄し滅菌するステップと、
滅菌条件下で、滅菌ストリップで容器の底面に前記培養機器を固定するステップと、
前記内部ウインドウを接着性タンパク質溶液で満たすステップと、
インキュベーション後、前記接着性タンパク質を含む溶液を除去するステップと、
培地中のヒト血管内皮細胞（ＥＣ）懸濁液を前記ウインドウ内に移すステップと、
前記培養機器の前記ウインドウ内で細胞培養懸濁液の懸滴を形成させるステップと、
前記容器を正立位に戻し、前記培養機器が浸るまでヒト血管内皮細胞（ＥＣ）用の増殖培地で満たすステップと、
マンドレル（２）に付着した細胞が広がり増殖し、ヒト血管内皮細胞の同心的単層を形成するまで、前記容器をインキュベータに留置するステップと、
前記培地を除去するステップと、
前記ウインドウをコラーゲン溶液で満たし固形化させることにより、前記マンドレルを細胞層に埋め込むステップと、
前記マンドレルをゆっくりと引き抜き、前記コラーゲンゲル内に萌芽するヒト血管内皮細胞の灌流可能な親微小血管を後に残すステップと、
ヒト血管内皮細胞増殖培地で灌流するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記接着性タンパク質溶液が、ラミニン−１、フィブロネクチン、フィブリン、及びゼラチンからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
組織を作製する方法であって、
複数のマンドレル（２）をフレーム上に並置するステップであって、所定の間隔を置いてマンドレル（２）同士が実質的に平行となり、前記複数のマンドレル（２）の各々の両端をチューブにより保持するステップと、
すべてのチューブの端部を１つの上流マニホールド及び１つの下流マニホールドに統合するステップと、
前記フレームを滅菌するステップと、
前記フレームをコーティングするステップと、
前記フレームに細胞懸濁液を播種するステップと、
各マンドレルに付着した前記細胞を増殖させ、個々の層が融合して組織になるまで環状層を形成させるステップと、
前記組織を増殖培地にさらすステップと、
前記マンドレル（２）を引き抜くステップと、
前記組織を灌流物（２０４）で灌流するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
前記灌流物がヘパリンを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、ヒト平滑筋細胞（ＳＭＣ）、内皮細胞（ＥＣ）、間質細胞、及びヒト血管内皮細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト冠動脈代用物を作製する方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト冠動脈を形成するサイズのマンドレル上及びマンドレル周囲にヒト平滑筋細胞（ＳＭＣ）を培養することにより細胞チューブを作製するステップと、
前記細胞チューブをマトリックス内に埋め込むステップと、
前記マンドレルを引き抜くステップと、
前記細胞チューブに内腔灌流を施すステップと
を含む方法。
【請求項２７】
前記細胞チューブが内腔面を含み、培地内に播種することにより前記内腔面を内皮細胞でコーティングするステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞チューブが外表面を含み、培地内に播種することにより前記外表面を線維芽細胞でコーティングするステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記マンドレルが、４ｍｍ〜５．５ｍｍの範囲にある内腔径を有する細胞チューブを形成するサイズである、請求項２６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５３１０６７（Ｐ２００９−５３１０６７Ａ）
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０３１２５（Ｐ２００９−５０３１２５）
【出願日】平成１９年３月９日（２００７．３．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６３７０８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１２１９２
【国際公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【出願人】（５０９１２１８７９）ノーティス，インク． (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月９日（２００７．３．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６３７０８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１２１９２
【国際公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【出願人】（５０９１２１８７９）ノーティス，インク． (3)
【Ｆターム（参考）】
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