無細胞タンパク質合成用細胞抽出物の調製及びその用途
ここに開示したのは、無細胞タンパク質合成の対費用効果と生産性を向上させる、遠心分離による無細胞タンパク質合成の触媒として使用するために細胞抽出物を単純に調製するためのプロセスである。特に、細胞抽出物を調製するための従来のプロセスは、複雑なステップ、すなわち細胞培養、細胞溶解、高速遠心分離、プレインキュベーション、透析などのステップを含む。それと比べて、遠心分離によって得られたばかりの細胞可溶化物はタンパク質の合成に直接適用され、それによって、従来のプロセスと比べて、タンパク質のより高い生産性とより安定した生産性を実現する。さらに、前記細胞抽出物は、より単純なプロセスによって調製されて、製造コストと製造時間をそれぞれ約６０%と約８０%低減する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物及び同抽出物を用いる無細胞タンパク質合成プロセスに関するものであり、特に、培養培地中で細胞を培養し、その培養細胞を溶解し、その細胞可溶化物を単純に遠心分離することによって得られ、さらに、標的タンパク質の合成に必要な細胞器官と細胞因子を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物と、前記細胞抽出物を用いる無細胞タンパク質合成プロセスと、に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近になって、さまざまなゲノムプロジェクトの進行により、多種多様な生物における遺伝子配列が明らかにされている。その結果、遺伝子によってコードされた多数のタンパク質の機能を同定することが直面する問題として持ち上がっている。従来の組換え遺伝子技術によれば、タンパク質は複数のステップ、すなわち遺伝子クローニング、前記クローニングした遺伝子の細胞への導入、前記導入遺伝子による前記細胞の培養、前記培養細胞の溶解、及び前記タンパク質の前記細胞可溶化物からの分離と精製からなるプロセスによって産生される。しかしながら、この技術には、タンパク質に関する新規の遺伝情報を劇的に増加する翻訳処理能力の観点で著しい制限がある。
【０００３】
よって、無細胞タンパク質合成は、従来のインビボ発現技術に対する代替法として新たな注目を集めている。無細胞タンパク質合成によれば、タンパク質合成に関連する細胞内の機構と因子が細胞から選択的に抽出され、タンパク質の合成プロセスが細胞外環境で人為的に繰り返され（細胞の生理学的制御機構の制御不能で）、それによって短期間で大規模に標的タンパク質が産生される。よって、タンパク質は、細胞培養手順を行うことなしに高速で合成することができる。さらに、従来のインビボ発現技術では、タンパク質の発現は細胞膜または細胞壁内の規定空間で起こる。それと反対に、無細胞タンパク質合成は物理的障壁がない完全開放系環境で行われるので、さまざまな用途のタンパク質合成条件を容易に改変できるという利点がある。例えば、無細胞タンパク質合成は、数時間以内で遺伝情報からタンパク質を産生すること、タンパク質分子、リボソームディスプレイ、固定化表面上のタンパク質配列などの選択的な標識を行うこと、に有用である。
【０００４】
無細胞タンパク質合成のためのシステムは当初、遺伝情報の翻訳と関連して科学的質問に取り組むためのツールとして使用され、次いで、１９５８年に Zamecmick によって最初に実証されたものである。その後、さまざまなバージョンの無細胞タンパク質合成システムがこれまでに開発されている。しかしながら、先の無細胞タンパク質合成システムは、高コストのため、幅広い利用と用途に限界があった。その高コスト問題は、無細胞タンパク質合成用触媒としての役割を果たす細胞抽出物調製の手順が複雑で費用のかかることに由来する。例えば、無細胞タンパク質合成に一般に使用される大腸菌の菌株由来の細胞抽出物は、細胞溶解、高速遠心分離（３０,０００ＲＣＦ）、プレインキュベーション、透析及び低速遠心分離（４,０００ＲＣＦ）の逐次段階からなる１９８４年にプラットによって提案されたプロセスによって調製された。細胞抽出物の調製コストは、無細胞タンパク質合成の全コストの約３０%以上の割り合いを占める。上記のように、前記細胞抽出物の調製には複雑で高価なステップを含むという問題がある。従って、無細胞タンパク質合成の高コスト問題を解決するため、細胞抽出物調製のより経済的なプロセスを開発することが重要である。前記調製コストに加えて、複雑な調製手順に起因する細胞抽出物タンパク質の不定な生産性が無細胞タンパク質合成システムを商業化する上で障害となっていた。いずれにせよ、前記手順を簡素化し、前記細胞抽出物調製の対費用効果を向上させるための研究は重点的に行われていないが、無細胞タンパク質合成におけるタンパク質の生産性を向上させるための研究は精力的に行われている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、標的タンパク質の合成に必要な細胞器官と細胞因子を含む細胞可溶化物を得るために培養培地中で培養された細胞を溶解し、次いで、対費用効果と生産性を向上させるために簡単な遠心分離によって前記細胞抽出物を分離することによって調製される無細胞タンパク質合成に用いられる細胞抽出物を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、上記のように得られた細胞抽出物が無細胞タンパク質合成システムに適用される、簡単で経済的な無細胞タンパク質合成プロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明は以下のステップを含むプロセスによって調製された細胞抽出物を提供する。標的タンパク質の合成に必要な細胞器官と細胞因子を含む細胞可溶化物を得るために培養培地中で培養された細胞を溶解するステップと、前記細胞可溶化物を１２,０００〜３０,０００Ｘｇにて遠心分離して、その上澄みを得るステップ。別の目的を達成するため、本発明が提供するのは、前記細胞抽出物が標的タンパク質を得るために反応溶媒に導入され、前記反応溶媒が以下を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成プロセスである。
【０００８】
グリシン（GIy、G）、アラニン（Ala、Ａ）、バリン（VaI、V）、ロイシン（Leu、L）、イソロイシン（lie、I）、プロリン（Pro、P）、フェニルアラニン（Phe、F）、チロシン（Tyr、Y）、トリプトファン（Trp、W）、システイン（Cys、C）、メチオニン（Met、M）、セリン（Ser、S）、トレオニン（Thr、T）、リシン（Lys、K）、アルギニン（Arg、R）、ヒスチジン（His、H）、アスパルタート（Ａsp、Ｄ）、グルタマート（GIu、E）、アスバラギン（Asp、N）及びグルタミン（GIn、Q）からなる群から選択される１つまたは複数のＬ-アミノ酸と、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ及びＵＴＰからなる群から選択される１つまたは複数のものを含むタンパク質合成のためのエネルギー源と、標的タンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む遺伝資源と、緩衝液。
【０００９】
本発明のその他及びさらなる目的、特徴及び利点は、以下の説明からより完全に理解されるであろう。
【００１０】
本明細書中で使用した技術用語または科学用語は、特に明示しない限り、当技術分野の当業者に理解されている意味を持つものとする。本明細書中では、従来の技術と同様の技術構成及び機能に関してはその説明を省略する。
【００１１】
本発明によれば、無細胞タンパク質合成の触媒として使用された細胞抽出物は遠心分離よって単純に調製され、それによって、無細胞タンパク質合成の対費用効果と生産性を改善する。特に、細胞抽出物調製の従来のプロセスが細胞培養、細胞溶解、高速遠心分離、プレインキュベーション及び透析という複雑なステップを要する一方、本発明における細胞抽出物は、複雑なステップなしに遠心分離よって単純に調製され、タンパク質の発現に直接使用される。よって、本発明の細胞抽出物は、従来のプロセスによって調製されたものと比べて、タンパク質のより高い産生能とより安定した生産性を示すものである。さらに、前記細胞抽出物は、より簡略化されたプロセスを介して調製されて、製造コストと製造時間をそれぞれ約６０%と約８０%低減する。
【００１２】
本発明では、培養細胞は、好ましくは、培養培地中で細胞を培養し、前記細胞培養を遠心分離して細胞ペレットを取得し、前記細胞ペレットを急凍し、さらに、前記凍結細胞ペレットを解凍することによって調製される。前記細胞溶解中に凍結され解凍された細胞はタンパク質合成に必要な細胞器官と細胞因子をその細胞質から細胞外培地へ容易に放出する。本発明で使用される細胞は、好ましく、大腸菌、枯草菌、コムギ胚芽、イネ胚芽、オオムギ胚芽、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞及び網状赤血球はからなる群から選択されるが、それらに限定されない。
【００１３】
本発明に係るタンパク質合成のためのアミノ酸及びエネルギー源は上記の成分に限定されるものではないが、本発明の目的を達成できるものであれば、任意のアミノ酸とエネルギー源を使用してもよい。
【００１４】
緩衝液は標的タンパク質の特性に好適な成分とｐＨを有する必要があるが、特定の成分を有する特定のものに限定されるものではない。
【００１５】
本明細書の全体にわたって遠心分離の遠心力は、Ｘｇ（重力）の単位で相対遠心力（ＲＣＦ）として表現されている。一実施形態では、本発明に係る高速遠心分離は３０,０００Ｘｇの遠心分離として規定され、低速遠心分離は４,０００Ｘｇの遠心分離として規定され、さらに簡単な遠心分離は１２,０００Ｘｇの遠心分離として規定されている。本発明では、タンパク質合成に関連する細胞器官と細胞因子を細胞可溶化物から分離するための最小遠心力は１２,０００Ｘｇであるので、前記細胞可溶化物は１２,０００〜３０,０００Ｘｇにて遠心分離される。前記遠心力が３０,０００Ｘｇを超える場合、抽出効率は大幅に高くならないが、その製造コストは著しく上昇する。
【００１６】
タンパク質合成を高めるためには、本発明に係る細胞抽出物は従来のシャペロンタンパク質、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ解酵素阻害剤または界面活性剤をさらに含むことも可能である。
【００１７】
本発明では、背景で開示した任意の無細胞タンパク質合成プロセスを本発明の細胞抽出物に使用することも可能であり、さらに、本発明の目的に適合する限り、開示されていなプロセスをも含めたいかなるプロセスを使用してよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を特定の実施例を参照してより詳細に説明する。但し、本発明は、それらの実施例によって限定されるものでなく、当業者であれば、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなくさまざまな改変及び変更を行い得ることは明らかであろう。
【００１９】
［実施例］
細胞抽出物の調製
（１）培養細胞の調製
まず、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）［米ノバジェン社、米国マディソン］を３Ｌの発酵槽（２ｘ ＹＴ培地）内で３７℃にて培養した。次いで、標的タンパク質コードする遺伝子（ＤＮＡ）から転写を誘導するためのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させるため、その吸光度（ＯＤ６００）が０.６に達した時点で、イソプロピルチオガラクトシド-β-Ｄ-ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度で前記発酵槽に導入した。その吸光度が４.５に達した時点で、細胞培養を停止させ、遠心分離（４,５００ｒｐｍ、２０分間、４℃）によって細胞ペレットを前記培地から選択的に採取した。
【００２０】
次いで、前記採取細胞ペレットに２０ｍＬの緩衝液Ａ［１０ｍＭのトリス-アセテート緩衝液（ｐＨ８.２）、１４ｍＭの酢酸マグネシウム、６０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０.０５%（ｖ／ｖ）２-メルカプトエタノール（２-ＭＥ）］を１ｇの細胞当たりに添加し、前記混合物を徹底的に洗浄した。上記遠心分離（４,５００ｒｐｍ、２０分間）のステップを３回繰り返した。上記のように徹底的に洗浄した大腸菌細胞を液体窒素中に-８０℃にて保管した。
【００２１】
（２）細胞可溶化物の調製
１０ｇの細胞当たり１２.７ｍＬの緩衝液Ｂ（２-ＭＥのみが緩衝液Ａから除外されていることを特徴とする）を実施例（１）から得た凍結された大腸菌細胞に添加し、前記細胞をその中に均一に分散させた。フレンチプレス（米アミンコ社）を用いることによって、前記細胞を一定圧力（２０,０００ｐｓｉ）にて分裂させた。
【００２２】
（３）細胞抽出物の調製
実施例（２）からの細胞可溶化物を単純に遠心分離（１２,０００ＲＣＦ、１０分間、４℃）して上澄みを得、それをプレインキュベーションなしに培養（３７℃、３０分間）して細胞抽出物を調製した。その得られた抽出物をＳ１２抽出物と命名した（Ｓ１２抽出物）。本発明に係る細胞抽出物（Ｓ１２抽出物）を無細胞タンパク質合成に使用される前に液体窒素中に保管した。
【００２３】
［比較例］
実施例（１）及び（２）における手順と同じ手順に従って調製した細胞可溶化物から、プラットの従来プロセスに従って細胞抽出物を調製した。
【００２４】
まず、前記細胞可溶化物を高速（３０,０００ＲＣＦ、３０分間、４℃）にて遠心分離し、その上に横たわる脂質層をそれから除去してその上澄みのみを回収した。前記上澄みを高速（３０,０００ＲＣＦ、３０分間、４℃）にて再度遠心分離した。次いで、１０ｍＬの上澄み当たり、３ｍＬのプレインキュベーション溶液（２９３.３ｍＭのトリス-アセテート、ｐＨ８.２、２ｍＭの酢酸マグネシウム、１０.４ｍＭのＡＴＰ、２００ｍＭのクレアチンリン酸、４.４ｍＭのＤＴＴ、０.０４ｍＭのアミノ酸、２６.７μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ）を、徹底的な攪拌とともに２回遠心分離されている前記上澄みに徐々に追加し、暗室内で３７℃にて８０分間プレインキュベーションを行った。前記プレインキュベートした溶液を透析チューブ（１０ｋＤＡ、スネークスキン（商標）、プリーツ透析チューブ、米国ロックフォード）に導入し、希釈倍率５０倍の緩衝液中で、４℃にて４５分間、４回透析してプレインキュベーションの不純物を除去した。前記透析チューブ内の溶液を低速度（４,０００ＲＣＦ、１０分間、４℃）にて遠心分離して、タンパク質合成のための細胞抽出物を得た。前記抽出物をＳ３０抽出物と命名した。次いで、Ｓ３０抽出物を無細胞タンパク質合成に使用する前に液体窒素中に保管した。
【００２５】
［実験例］
この実験例では、従来の細胞抽出物と比較した本発明の細胞抽出物の効果を評価するために、前記実施例と前記比較例の細胞抽出物から標的タンパク質の合成を測定した。
【００２６】
（１）無細胞タンパク質合成
無細胞タンパク質合成を以下の通り行った。まず、タンパク質合成能力を評価するために、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）を標的タンパク質としてコードする遺伝子（ｐＫ７-ＣＡＴ）を使用した。
【００２７】
無細胞タンパク質合成のため、本発明に係る細胞抽出物（Ｓ１２抽出物）とその比較例（Ｓ３０抽出物）を標準反応溶液［５７ｍＭのヘペス-ＫＯＨ（ｐＨ８.２）、１.２ｍＭのＡＴＰ、各０.８５ｍＭのＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ、２ｍＭのＤＴＴ、０.１７ｍｇ／ｍＬの大腸菌総転移ＲＮＡ混合物（菌株ＭＲＥ６００から）、０.６４ｍＭの環状ＡＭＰ、９０ｍＭのグルタミン酸カリウム、８０ｍＭの酢酸アンモニウム、１２ｍＭの酢酸マグネシウム、３４μｇ／ｍＬのＬ-５-ホルミル-５,６,７,８-テトラヒドロ葉酸（フォリン酸）、各１.５ｍＭの１９アミノ酸（０.５ｍＭのロイシンを除く）、２%のＰＥＧ８０００、６７ｍＭのクレアチンリン酸（ＣＰ）、３.２μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）、０.０１ＭＬ-［Ｕ-１４Ｃ］ロイシン（１１.３ＧＢｑ／ｍｍｏｌ、英アマシャムバイオサイエンス社）、６.７μｇ／ｍＬのＤＮＡ（ｐＫ７-ＣＡＴ）］にそれぞれ添加し、その濃度を２７%（ｖ／ｖ）に調整し、各混合物を均一に攪拌し、インキュベータ（３７℃）内で３時間タンパク質合成に供した。
【００２８】
無細胞タンパク質合成によって合成したタンパク質の全量を、放射性同位元素法を用いて（Kim and Swartz, 2000）、１４Ｃ-ロイシンとともにタンパク質量測定によって確認した。前記合成タンパク質（ＣＡＴ）の酵素活性を光学的方法（Shaw、１９７５）によって確認した。
【００２９】
（２）前記従来の細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）調製の各ステップから得られた細胞抽出分画物のタンパク質合成能力の評価
まず、プラットによって開示された従来のプロセスに従って、細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）から調製した。Ｓ３０抽出物調製の各ステップから得られた抽出分画物を取り込み、そのタンパク質合成の活性を試験した。その結果、図２から分かるように、驚いたことに、細胞抽出物の調製プロセス各ステップから採取した全ての細胞抽出物（最終的に得られた細胞抽出物を含む）が類似するタンパク質合成能力を示すことを見出した。例外的に、プレインキュベーション段階直後の細胞抽出物が著しく低いタンパク質合成能力を示したが、前記細胞抽出物のタンパク質合成能力は、透析段階を経た後には他の試料と類似するレベルにまで回復されることを確認した。図２では、１は非処理の細胞可溶化物を表し、２は第１遠心分離ステップを経た後の上澄みを表し、３は第２遠心分離ステップを経た後の上澄みを表し、４は前記プレインキュベーション溶液によりプレインキュベートした細胞抽出物を表し、５は透析した細胞抽出物を表し、６は透析した細胞抽出物の低速遠心分離によって得られた最終の細胞抽出物を表す。
【００３０】
上記の事実から、前記プレインキュベーション段階を介して蓄積された低分子量物質（例えば無機リン酸など）がタンパク質合成を阻害し、透析を介してそれらの物質を除去することによってタンパク質合成能力が回復されることが推定される。
【００３１】
本発明では、細胞抽出物の従来調製プロセスにおける細胞溶解の直後の粗細胞可溶化物が、驚いたことには、前記標準細胞抽出物（Ｓ３０）に類似するタンパク質産生能力を示すことを見出すことが最も重要である。よって、細胞抽出物製造コストのほとんどを占めるプレインキュベーション段階と透析段階を省略することが可能であり、それによって対費用効果を向上させ得ることを結論した。
【００３２】
（３）本発明に係る細胞可溶化物を用いる無細胞タンパク質合成
前述のように、前記細胞可溶化物によるタンパク質合成は、時間効果と費用効果の観点でさまざまな利点を提供する。この実験例の目的は、無細胞タンパク質合成に適用するため、タンパク質合成における細胞可溶化物の特性を確認することであった、その結果を表１に示す。本測定値は複製実験の平均値である。
【００３３】
まず、前記細胞可溶化物には前記標準細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）に類似するタンパク質合成能力があったが、前記細胞可溶化物から、著しい非特異的タンパク質の発現（バックグラウンド発現）が観察された。つまり、非特異的タンパク質の発現は０.９%（前記標準細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）における観察値）より大幅に高く、放射性同位元素方法によって測定された時に、その標的タンパク質の全産生量の３.５%を構成する。これは、タンパク質合成が前記細胞可溶化物における遺伝子材料（ｍＲＮＡ、ＤＮＡなど）から起こるので、前記細胞可溶化物は無細胞タンパク質合成への直接的な適用には適切でないことを意味する。さらに、前記細胞可溶化物は、その高粘性のため、マイクロピペットによる取り扱いが困難である。
【００３４】
しかしながら、表１から分かるように、かかる問題点は、前記細胞可溶化物を単純に遠心分離（１２,０００ＲＣＦ、１０分間、４℃）して、本発明に係る細胞抽出物（Ｓ１２抽出物）を得ることによって実質的に解決することができる。粘性が高すぎる問題や取り扱い性が悪いという問題を完全に解決し、非特異的な発現は簡単な遠心分離を介して約３４%低減した。特に、簡単な遠心分離後には、細胞可溶化物の上澄みのタンパク質合成能力は２８%の改善を示した。前記細胞抽出物からの遺伝子（ｐＫ７-ＣＡＴ）発現の生産性は、前記前記標準細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）からの遺伝子発現と比較して１.５倍増加した。
【００３５】
非特異的な発現問題をさらに解決するため、細胞可溶化物の上澄みを、さまざまな期間にわたって、プレインキュベーション溶液なしにインキュベータで培養した。その結果、約３０分間培養した細胞可溶化物の上澄みの非特異的な発現が１%以下に減少したばかりでなく、タンパク質合成能力もやや向上した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
（４）細胞の種類に応じた無細胞タンパク質合成
本発明に係る細胞抽出物の簡略化された調製プロセスがその他の種類の大腸菌細胞に適用可能であるかどうかを確認するため、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物の調製の材料として広く利用される４種類の公知の細胞（ロゼッタ（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１スター（ＤＥ３）、Ａ１９（ＤＥ３））を用いることによって、前記実施例のプロセスと前記比較例のプロセスに従って細胞抽出物を調製した。実験例（１）と同じ手順に従って無細胞タンパク質合成を行った。菌株Ａ１９は大腸菌の菌株Ｋ１２由来であり、他３つの菌株は大腸菌の菌株Ｂ由来である。
【００３８】
その結果、図３に示すように、本発明（Ｓ１２抽出物）の細胞抽出物の標的タンパク質（ＣＡＴ）の生産性は、ほとんどの場合、従来の細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）よりも高い生産性を示した。さらに、本発明の細胞抽出物を用いることによって、より安定した生産性が得られた。大腸菌Ｋ１２由来の菌株Ａ１９の場合にのみ、従来の細胞抽出物のタンパク質産生が本発明の細胞抽出物よりもやや高かった。図３では、塗りつぶしバーは合成されたＣＡＴの合計量を示し、塗りつぶされていないバーはＣＡＴの酵素活性を示す。
【００３９】
よって、本発明に従って調製された細胞抽出物（Ｓ１２抽出物）の時間効果、費用効果、及び特定のタンパク質合成率が従来のプロセスに従って調製された細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）と比較して優れていることを見出した。図４には、従来の細胞抽出物の製造コスト（７２米ドル）と時間（８時間）に対する本発明の細胞抽出物の相対製造コストと時間を示す。その結果、本発明に係る細胞抽出物は、従来のプロセスに従って調製された細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）に比べて２０%の費用で４０%の時間に無細胞タンパク質合成を行うことができる。また、本発明に係る細胞抽出物のタンパク質発現能力は１.５倍であった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
上記のように、本発明に係る細胞抽出物は、従来の細胞抽出物と比べて、より簡略化されたプロセスによって得ることができ、それによって製造コストと製造時間をそれぞれ約６０%と約８０%低減し、さらに、より高いタンパク質産生能力とより安定した生産性を示す。
【００４１】
上記の開示に対しては、特定の範囲で変更、改変及び置換を行うことが可能であり、本発明の特徴の一部のみを使用してもよい。よって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨及び範囲に適合する限り、広義に解釈される必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は本発明に係る細胞抽出物（Ｓ１２抽出物）と従来の細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）とを調製するためのプロセスを概要的に示すフローチャートである。
【図２】図２は前記細胞抽出物（Ｓ３０）を調製するための従来のプロセスの各ステップから得られた抽出分画物のタンパク質合成を示すグラフである。
【図３】図３は本発明の細胞抽出物（Ｓ１２）と従来の細胞抽出物（Ｓ３０）との無細胞タンパク質合成を細胞の種類に応じて示すグラフである。
【図４】図４は本発明の細胞抽出物（Ｓ１２）及び従来の細胞抽出物（Ｓ３０）の製造コストと製造時間を比較的に示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物及び同抽出物を用いる無細胞タンパク質合成プロセスに関するものであり、特に、培養培地中で細胞を培養し、その培養細胞を溶解し、その細胞可溶化物を単純に遠心分離することによって得られ、さらに、標的タンパク質の合成に必要な細胞器官と細胞因子を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物と、前記細胞抽出物を用いる無細胞タンパク質合成プロセスと、に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近になって、さまざまなゲノムプロジェクトの進行により、多種多様な生物における遺伝子配列が明らかにされている。その結果、遺伝子によってコードされた多数のタンパク質の機能を同定することが直面する問題として持ち上がっている。従来の組換え遺伝子技術によれば、タンパク質は複数のステップ、すなわち遺伝子クローニング、前記クローニングした遺伝子の細胞への導入、前記導入遺伝子による前記細胞の培養、前記培養細胞の溶解、及び前記タンパク質の前記細胞可溶化物からの分離と精製からなるプロセスによって産生される。しかしながら、この技術には、タンパク質に関する新規の遺伝情報を劇的に増加する翻訳処理能力の観点で著しい制限がある。
【０００３】
よって、無細胞タンパク質合成は、従来のインビボ発現技術に対する代替法として新たな注目を集めている。無細胞タンパク質合成によれば、タンパク質合成に関連する細胞内の機構と因子が細胞から選択的に抽出され、タンパク質の合成プロセスが細胞外環境で人為的に繰り返され（細胞の生理学的制御機構の制御不能で）、それによって短期間で大規模に標的タンパク質が産生される。よって、タンパク質は、細胞培養手順を行うことなしに高速で合成することができる。さらに、従来のインビボ発現技術では、タンパク質の発現は細胞膜または細胞壁内の規定空間で起こる。それと反対に、無細胞タンパク質合成は物理的障壁がない完全開放系環境で行われるので、さまざまな用途のタンパク質合成条件を容易に改変できるという利点がある。例えば、無細胞タンパク質合成は、数時間以内で遺伝情報からタンパク質を産生すること、タンパク質分子、リボソームディスプレイ、固定化表面上のタンパク質配列などの選択的な標識を行うこと、に有用である。
【０００４】
無細胞タンパク質合成のためのシステムは当初、遺伝情報の翻訳と関連して科学的質問に取り組むためのツールとして使用され、次いで、１９５８年に Zamecmick によって最初に実証されたものである。その後、さまざまなバージョンの無細胞タンパク質合成システムがこれまでに開発されている。しかしながら、先の無細胞タンパク質合成システムは、高コストのため、幅広い利用と用途に限界があった。その高コスト問題は、無細胞タンパク質合成用触媒としての役割を果たす細胞抽出物調製の手順が複雑で費用のかかることに由来する。例えば、無細胞タンパク質合成に一般に使用される大腸菌の菌株由来の細胞抽出物は、細胞溶解、高速遠心分離（３０,０００ＲＣＦ）、プレインキュベーション、透析及び低速遠心分離（４,０００ＲＣＦ）の逐次段階からなる１９８４年にプラットによって提案されたプロセスによって調製された。細胞抽出物の調製コストは、無細胞タンパク質合成の全コストの約３０%以上の割り合いを占める。上記のように、前記細胞抽出物の調製には複雑で高価なステップを含むという問題がある。従って、無細胞タンパク質合成の高コスト問題を解決するため、細胞抽出物調製のより経済的なプロセスを開発することが重要である。前記調製コストに加えて、複雑な調製手順に起因する細胞抽出物タンパク質の不定な生産性が無細胞タンパク質合成システムを商業化する上で障害となっていた。いずれにせよ、前記手順を簡素化し、前記細胞抽出物調製の対費用効果を向上させるための研究は重点的に行われていないが、無細胞タンパク質合成におけるタンパク質の生産性を向上させるための研究は精力的に行われている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、標的タンパク質の合成に必要な細胞器官と細胞因子を含む細胞可溶化物を得るために培養培地中で培養された細胞を溶解し、次いで、対費用効果と生産性を向上させるために簡単な遠心分離によって前記細胞抽出物を分離することによって調製される無細胞タンパク質合成に用いられる細胞抽出物を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、上記のように得られた細胞抽出物が無細胞タンパク質合成システムに適用される、簡単で経済的な無細胞タンパク質合成プロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明は以下のステップを含むプロセスによって調製された細胞抽出物を提供する。標的タンパク質の合成に必要な細胞器官と細胞因子を含む細胞可溶化物を得るために培養培地中で培養された細胞を溶解するステップと、前記細胞可溶化物を１２,０００〜３０,０００Ｘｇにて遠心分離して、その上澄みを得るステップ。別の目的を達成するため、本発明が提供するのは、前記細胞抽出物が標的タンパク質を得るために反応溶媒に導入され、前記反応溶媒が以下を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成プロセスである。
【０００８】
グリシン（GIy、G）、アラニン（Ala、Ａ）、バリン（VaI、V）、ロイシン（Leu、L）、イソロイシン（lie、I）、プロリン（Pro、P）、フェニルアラニン（Phe、F）、チロシン（Tyr、Y）、トリプトファン（Trp、W）、システイン（Cys、C）、メチオニン（Met、M）、セリン（Ser、S）、トレオニン（Thr、T）、リシン（Lys、K）、アルギニン（Arg、R）、ヒスチジン（His、H）、アスパルタート（Ａsp、Ｄ）、グルタマート（GIu、E）、アスバラギン（Asp、N）及びグルタミン（GIn、Q）からなる群から選択される１つまたは複数のＬ-アミノ酸と、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ及びＵＴＰからなる群から選択される１つまたは複数のものを含むタンパク質合成のためのエネルギー源と、標的タンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む遺伝資源と、緩衝液。
【０００９】
本発明のその他及びさらなる目的、特徴及び利点は、以下の説明からより完全に理解されるであろう。
【００１０】
本明細書中で使用した技術用語または科学用語は、特に明示しない限り、当技術分野の当業者に理解されている意味を持つものとする。本明細書中では、従来の技術と同様の技術構成及び機能に関してはその説明を省略する。
【００１１】
本発明によれば、無細胞タンパク質合成の触媒として使用された細胞抽出物は遠心分離よって単純に調製され、それによって、無細胞タンパク質合成の対費用効果と生産性を改善する。特に、細胞抽出物調製の従来のプロセスが細胞培養、細胞溶解、高速遠心分離、プレインキュベーション及び透析という複雑なステップを要する一方、本発明における細胞抽出物は、複雑なステップなしに遠心分離よって単純に調製され、タンパク質の発現に直接使用される。よって、本発明の細胞抽出物は、従来のプロセスによって調製されたものと比べて、タンパク質のより高い産生能とより安定した生産性を示すものである。さらに、前記細胞抽出物は、より簡略化されたプロセスを介して調製されて、製造コストと製造時間をそれぞれ約６０%と約８０%低減する。
【００１２】
本発明では、培養細胞は、好ましくは、培養培地中で細胞を培養し、前記細胞培養を遠心分離して細胞ペレットを取得し、前記細胞ペレットを急凍し、さらに、前記凍結細胞ペレットを解凍することによって調製される。前記細胞溶解中に凍結され解凍された細胞はタンパク質合成に必要な細胞器官と細胞因子をその細胞質から細胞外培地へ容易に放出する。本発明で使用される細胞は、好ましく、大腸菌、枯草菌、コムギ胚芽、イネ胚芽、オオムギ胚芽、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞及び網状赤血球はからなる群から選択されるが、それらに限定されない。
【００１３】
本発明に係るタンパク質合成のためのアミノ酸及びエネルギー源は上記の成分に限定されるものではないが、本発明の目的を達成できるものであれば、任意のアミノ酸とエネルギー源を使用してもよい。
【００１４】
緩衝液は標的タンパク質の特性に好適な成分とｐＨを有する必要があるが、特定の成分を有する特定のものに限定されるものではない。
【００１５】
本明細書の全体にわたって遠心分離の遠心力は、Ｘｇ（重力）の単位で相対遠心力（ＲＣＦ）として表現されている。一実施形態では、本発明に係る高速遠心分離は３０,０００Ｘｇの遠心分離として規定され、低速遠心分離は４,０００Ｘｇの遠心分離として規定され、さらに簡単な遠心分離は１２,０００Ｘｇの遠心分離として規定されている。本発明では、タンパク質合成に関連する細胞器官と細胞因子を細胞可溶化物から分離するための最小遠心力は１２,０００Ｘｇであるので、前記細胞可溶化物は１２,０００〜３０,０００Ｘｇにて遠心分離される。前記遠心力が３０,０００Ｘｇを超える場合、抽出効率は大幅に高くならないが、その製造コストは著しく上昇する。
【００１６】
タンパク質合成を高めるためには、本発明に係る細胞抽出物は従来のシャペロンタンパク質、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ解酵素阻害剤または界面活性剤をさらに含むことも可能である。
【００１７】
本発明では、背景で開示した任意の無細胞タンパク質合成プロセスを本発明の細胞抽出物に使用することも可能であり、さらに、本発明の目的に適合する限り、開示されていなプロセスをも含めたいかなるプロセスを使用してよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を特定の実施例を参照してより詳細に説明する。但し、本発明は、それらの実施例によって限定されるものでなく、当業者であれば、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなくさまざまな改変及び変更を行い得ることは明らかであろう。
【００１９】
［実施例］
細胞抽出物の調製
（１）培養細胞の調製
まず、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）［米ノバジェン社、米国マディソン］を３Ｌの発酵槽（２ｘ ＹＴ培地）内で３７℃にて培養した。次いで、標的タンパク質コードする遺伝子（ＤＮＡ）から転写を誘導するためのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させるため、その吸光度（ＯＤ６００）が０.６に達した時点で、イソプロピルチオガラクトシド-β-Ｄ-ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度で前記発酵槽に導入した。その吸光度が４.５に達した時点で、細胞培養を停止させ、遠心分離（４,５００ｒｐｍ、２０分間、４℃）によって細胞ペレットを前記培地から選択的に採取した。
【００２０】
次いで、前記採取細胞ペレットに２０ｍＬの緩衝液Ａ［１０ｍＭのトリス-アセテート緩衝液（ｐＨ８.２）、１４ｍＭの酢酸マグネシウム、６０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０.０５%（ｖ／ｖ）２-メルカプトエタノール（２-ＭＥ）］を１ｇの細胞当たりに添加し、前記混合物を徹底的に洗浄した。上記遠心分離（４,５００ｒｐｍ、２０分間）のステップを３回繰り返した。上記のように徹底的に洗浄した大腸菌細胞を液体窒素中に-８０℃にて保管した。
【００２１】
（２）細胞可溶化物の調製
１０ｇの細胞当たり１２.７ｍＬの緩衝液Ｂ（２-ＭＥのみが緩衝液Ａから除外されていることを特徴とする）を実施例（１）から得た凍結された大腸菌細胞に添加し、前記細胞をその中に均一に分散させた。フレンチプレス（米アミンコ社）を用いることによって、前記細胞を一定圧力（２０,０００ｐｓｉ）にて分裂させた。
【００２２】
（３）細胞抽出物の調製
実施例（２）からの細胞可溶化物を単純に遠心分離（１２,０００ＲＣＦ、１０分間、４℃）して上澄みを得、それをプレインキュベーションなしに培養（３７℃、３０分間）して細胞抽出物を調製した。その得られた抽出物をＳ１２抽出物と命名した（Ｓ１２抽出物）。本発明に係る細胞抽出物（Ｓ１２抽出物）を無細胞タンパク質合成に使用される前に液体窒素中に保管した。
【００２３】
［比較例］
実施例（１）及び（２）における手順と同じ手順に従って調製した細胞可溶化物から、プラットの従来プロセスに従って細胞抽出物を調製した。
【００２４】
まず、前記細胞可溶化物を高速（３０,０００ＲＣＦ、３０分間、４℃）にて遠心分離し、その上に横たわる脂質層をそれから除去してその上澄みのみを回収した。前記上澄みを高速（３０,０００ＲＣＦ、３０分間、４℃）にて再度遠心分離した。次いで、１０ｍＬの上澄み当たり、３ｍＬのプレインキュベーション溶液（２９３.３ｍＭのトリス-アセテート、ｐＨ８.２、２ｍＭの酢酸マグネシウム、１０.４ｍＭのＡＴＰ、２００ｍＭのクレアチンリン酸、４.４ｍＭのＤＴＴ、０.０４ｍＭのアミノ酸、２６.７μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ）を、徹底的な攪拌とともに２回遠心分離されている前記上澄みに徐々に追加し、暗室内で３７℃にて８０分間プレインキュベーションを行った。前記プレインキュベートした溶液を透析チューブ（１０ｋＤＡ、スネークスキン（商標）、プリーツ透析チューブ、米国ロックフォード）に導入し、希釈倍率５０倍の緩衝液中で、４℃にて４５分間、４回透析してプレインキュベーションの不純物を除去した。前記透析チューブ内の溶液を低速度（４,０００ＲＣＦ、１０分間、４℃）にて遠心分離して、タンパク質合成のための細胞抽出物を得た。前記抽出物をＳ３０抽出物と命名した。次いで、Ｓ３０抽出物を無細胞タンパク質合成に使用する前に液体窒素中に保管した。
【００２５】
［実験例］
この実験例では、従来の細胞抽出物と比較した本発明の細胞抽出物の効果を評価するために、前記実施例と前記比較例の細胞抽出物から標的タンパク質の合成を測定した。
【００２６】
（１）無細胞タンパク質合成
無細胞タンパク質合成を以下の通り行った。まず、タンパク質合成能力を評価するために、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）を標的タンパク質としてコードする遺伝子（ｐＫ７-ＣＡＴ）を使用した。
【００２７】
無細胞タンパク質合成のため、本発明に係る細胞抽出物（Ｓ１２抽出物）とその比較例（Ｓ３０抽出物）を標準反応溶液［５７ｍＭのヘペス-ＫＯＨ（ｐＨ８.２）、１.２ｍＭのＡＴＰ、各０.８５ｍＭのＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ、２ｍＭのＤＴＴ、０.１７ｍｇ／ｍＬの大腸菌総転移ＲＮＡ混合物（菌株ＭＲＥ６００から）、０.６４ｍＭの環状ＡＭＰ、９０ｍＭのグルタミン酸カリウム、８０ｍＭの酢酸アンモニウム、１２ｍＭの酢酸マグネシウム、３４μｇ／ｍＬのＬ-５-ホルミル-５,６,７,８-テトラヒドロ葉酸（フォリン酸）、各１.５ｍＭの１９アミノ酸（０.５ｍＭのロイシンを除く）、２%のＰＥＧ８０００、６７ｍＭのクレアチンリン酸（ＣＰ）、３.２μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）、０.０１ＭＬ-［Ｕ-１４Ｃ］ロイシン（１１.３ＧＢｑ／ｍｍｏｌ、英アマシャムバイオサイエンス社）、６.７μｇ／ｍＬのＤＮＡ（ｐＫ７-ＣＡＴ）］にそれぞれ添加し、その濃度を２７%（ｖ／ｖ）に調整し、各混合物を均一に攪拌し、インキュベータ（３７℃）内で３時間タンパク質合成に供した。
【００２８】
無細胞タンパク質合成によって合成したタンパク質の全量を、放射性同位元素法を用いて（Kim and Swartz, 2000）、１４Ｃ-ロイシンとともにタンパク質量測定によって確認した。前記合成タンパク質（ＣＡＴ）の酵素活性を光学的方法（Shaw、１９７５）によって確認した。
【００２９】
（２）前記従来の細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）調製の各ステップから得られた細胞抽出分画物のタンパク質合成能力の評価
まず、プラットによって開示された従来のプロセスに従って、細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）から調製した。Ｓ３０抽出物調製の各ステップから得られた抽出分画物を取り込み、そのタンパク質合成の活性を試験した。その結果、図２から分かるように、驚いたことに、細胞抽出物の調製プロセス各ステップから採取した全ての細胞抽出物（最終的に得られた細胞抽出物を含む）が類似するタンパク質合成能力を示すことを見出した。例外的に、プレインキュベーション段階直後の細胞抽出物が著しく低いタンパク質合成能力を示したが、前記細胞抽出物のタンパク質合成能力は、透析段階を経た後には他の試料と類似するレベルにまで回復されることを確認した。図２では、１は非処理の細胞可溶化物を表し、２は第１遠心分離ステップを経た後の上澄みを表し、３は第２遠心分離ステップを経た後の上澄みを表し、４は前記プレインキュベーション溶液によりプレインキュベートした細胞抽出物を表し、５は透析した細胞抽出物を表し、６は透析した細胞抽出物の低速遠心分離によって得られた最終の細胞抽出物を表す。
【００３０】
上記の事実から、前記プレインキュベーション段階を介して蓄積された低分子量物質（例えば無機リン酸など）がタンパク質合成を阻害し、透析を介してそれらの物質を除去することによってタンパク質合成能力が回復されることが推定される。
【００３１】
本発明では、細胞抽出物の従来調製プロセスにおける細胞溶解の直後の粗細胞可溶化物が、驚いたことには、前記標準細胞抽出物（Ｓ３０）に類似するタンパク質産生能力を示すことを見出すことが最も重要である。よって、細胞抽出物製造コストのほとんどを占めるプレインキュベーション段階と透析段階を省略することが可能であり、それによって対費用効果を向上させ得ることを結論した。
【００３２】
（３）本発明に係る細胞可溶化物を用いる無細胞タンパク質合成
前述のように、前記細胞可溶化物によるタンパク質合成は、時間効果と費用効果の観点でさまざまな利点を提供する。この実験例の目的は、無細胞タンパク質合成に適用するため、タンパク質合成における細胞可溶化物の特性を確認することであった、その結果を表１に示す。本測定値は複製実験の平均値である。
【００３３】
まず、前記細胞可溶化物には前記標準細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）に類似するタンパク質合成能力があったが、前記細胞可溶化物から、著しい非特異的タンパク質の発現（バックグラウンド発現）が観察された。つまり、非特異的タンパク質の発現は０.９%（前記標準細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）における観察値）より大幅に高く、放射性同位元素方法によって測定された時に、その標的タンパク質の全産生量の３.５%を構成する。これは、タンパク質合成が前記細胞可溶化物における遺伝子材料（ｍＲＮＡ、ＤＮＡなど）から起こるので、前記細胞可溶化物は無細胞タンパク質合成への直接的な適用には適切でないことを意味する。さらに、前記細胞可溶化物は、その高粘性のため、マイクロピペットによる取り扱いが困難である。
【００３４】
しかしながら、表１から分かるように、かかる問題点は、前記細胞可溶化物を単純に遠心分離（１２,０００ＲＣＦ、１０分間、４℃）して、本発明に係る細胞抽出物（Ｓ１２抽出物）を得ることによって実質的に解決することができる。粘性が高すぎる問題や取り扱い性が悪いという問題を完全に解決し、非特異的な発現は簡単な遠心分離を介して約３４%低減した。特に、簡単な遠心分離後には、細胞可溶化物の上澄みのタンパク質合成能力は２８%の改善を示した。前記細胞抽出物からの遺伝子（ｐＫ７-ＣＡＴ）発現の生産性は、前記前記標準細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）からの遺伝子発現と比較して１.５倍増加した。
【００３５】
非特異的な発現問題をさらに解決するため、細胞可溶化物の上澄みを、さまざまな期間にわたって、プレインキュベーション溶液なしにインキュベータで培養した。その結果、約３０分間培養した細胞可溶化物の上澄みの非特異的な発現が１%以下に減少したばかりでなく、タンパク質合成能力もやや向上した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
（４）細胞の種類に応じた無細胞タンパク質合成
本発明に係る細胞抽出物の簡略化された調製プロセスがその他の種類の大腸菌細胞に適用可能であるかどうかを確認するため、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物の調製の材料として広く利用される４種類の公知の細胞（ロゼッタ（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１スター（ＤＥ３）、Ａ１９（ＤＥ３））を用いることによって、前記実施例のプロセスと前記比較例のプロセスに従って細胞抽出物を調製した。実験例（１）と同じ手順に従って無細胞タンパク質合成を行った。菌株Ａ１９は大腸菌の菌株Ｋ１２由来であり、他３つの菌株は大腸菌の菌株Ｂ由来である。
【００３８】
その結果、図３に示すように、本発明（Ｓ１２抽出物）の細胞抽出物の標的タンパク質（ＣＡＴ）の生産性は、ほとんどの場合、従来の細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）よりも高い生産性を示した。さらに、本発明の細胞抽出物を用いることによって、より安定した生産性が得られた。大腸菌Ｋ１２由来の菌株Ａ１９の場合にのみ、従来の細胞抽出物のタンパク質産生が本発明の細胞抽出物よりもやや高かった。図３では、塗りつぶしバーは合成されたＣＡＴの合計量を示し、塗りつぶされていないバーはＣＡＴの酵素活性を示す。
【００３９】
よって、本発明に従って調製された細胞抽出物（Ｓ１２抽出物）の時間効果、費用効果、及び特定のタンパク質合成率が従来のプロセスに従って調製された細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）と比較して優れていることを見出した。図４には、従来の細胞抽出物の製造コスト（７２米ドル）と時間（８時間）に対する本発明の細胞抽出物の相対製造コストと時間を示す。その結果、本発明に係る細胞抽出物は、従来のプロセスに従って調製された細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）に比べて２０%の費用で４０%の時間に無細胞タンパク質合成を行うことができる。また、本発明に係る細胞抽出物のタンパク質発現能力は１.５倍であった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
上記のように、本発明に係る細胞抽出物は、従来の細胞抽出物と比べて、より簡略化されたプロセスによって得ることができ、それによって製造コストと製造時間をそれぞれ約６０%と約８０%低減し、さらに、より高いタンパク質産生能力とより安定した生産性を示す。
【００４１】
上記の開示に対しては、特定の範囲で変更、改変及び置換を行うことが可能であり、本発明の特徴の一部のみを使用してもよい。よって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨及び範囲に適合する限り、広義に解釈される必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は本発明に係る細胞抽出物（Ｓ１２抽出物）と従来の細胞抽出物（Ｓ３０抽出物）とを調製するためのプロセスを概要的に示すフローチャートである。
【図２】図２は前記細胞抽出物（Ｓ３０）を調製するための従来のプロセスの各ステップから得られた抽出分画物のタンパク質合成を示すグラフである。
【図３】図３は本発明の細胞抽出物（Ｓ１２）と従来の細胞抽出物（Ｓ３０）との無細胞タンパク質合成を細胞の種類に応じて示すグラフである。
【図４】図４は本発明の細胞抽出物（Ｓ１２）及び従来の細胞抽出物（Ｓ３０）の製造コストと製造時間を比較的に示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞抽出物を用いることによる無細胞タンパク質合成プロセスであって、
標的タンパク質の合成に必要な細胞器官と細胞因子を含む細胞可溶化物を得るために培養培地中で培養された細胞を溶解するステップと、
細胞抽出物を調整するため、当該細胞可溶化物を１２,０００〜３０,０００Ｘｇにて遠心分離してその上澄みを得るステップと、さらに、
１つまたは複数のアミノ酸、タンパク質合成のためのエネルギー源、遺伝資源及び緩衝液を含む反応溶媒に当該細胞抽出物を導入するステップと、を含むことを特徴とする細胞抽出物を用いることによる無細胞タンパク質合成プロセス。
【請求項２】
当該細胞が、大腸菌、枯草菌、コムギ胚芽、米病原菌、大麦病原菌、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞及び網状赤血球からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に係る無細胞タンパク質合成のプロセス。
【請求項３】
当該細胞可溶化物が１２,０００Ｘｇにて遠心分離されることを特徴とする請求項１に係る無細胞タンパク質合成のプロセス。
【請求項４】
請求項１に係る無細胞タンパク質合成のプロセスにおいて、前記アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルタート、グルタマート、アスバラギン及びグルタミンからなる群から選択される１つまたは複数のＬ-アミノ酸を含み、タンパク質合成ためのエネルギー源がＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ及びＵＴＰからなる群から選択される１つまたは複数のものであり、遺伝資源がＤＮＡまたはその標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成のプロセス。
【請求項１】
細胞抽出物を用いることによる無細胞タンパク質合成プロセスであって、
標的タンパク質の合成に必要な細胞器官と細胞因子を含む細胞可溶化物を得るために培養培地中で培養された細胞を溶解するステップと、
細胞抽出物を調整するため、当該細胞可溶化物を１２,０００〜３０,０００Ｘｇにて遠心分離してその上澄みを得るステップと、さらに、
１つまたは複数のアミノ酸、タンパク質合成のためのエネルギー源、遺伝資源及び緩衝液を含む反応溶媒に当該細胞抽出物を導入するステップと、を含むことを特徴とする細胞抽出物を用いることによる無細胞タンパク質合成プロセス。
【請求項２】
当該細胞が、大腸菌、枯草菌、コムギ胚芽、米病原菌、大麦病原菌、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞及び網状赤血球からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に係る無細胞タンパク質合成のプロセス。
【請求項３】
当該細胞可溶化物が１２,０００Ｘｇにて遠心分離されることを特徴とする請求項１に係る無細胞タンパク質合成のプロセス。
【請求項４】
請求項１に係る無細胞タンパク質合成のプロセスにおいて、前記アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルタート、グルタマート、アスバラギン及びグルタミンからなる群から選択される１つまたは複数のＬ-アミノ酸を含み、タンパク質合成ためのエネルギー源がＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ及びＵＴＰからなる群から選択される１つまたは複数のものであり、遺伝資源がＤＮＡまたはその標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成のプロセス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５２６５４６（Ｐ２００９−５２６５４６Ａ）
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５５１５１（Ｐ２００８−５５５１５１）
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／０００７９９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９４６２０
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０８２４７０５１）ハンソン バイオテック カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／０００７９９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９４６２０
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０８２４７０５１）ハンソン バイオテック カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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