生体および化学反応分析キット
【課題】 イムノクロマトにおける反応層に対し、均一かつ低損失で試薬を供給できる試薬導入部をシンプルな構造で実現する。
【解決手段】 検出層を試薬層と反応層の間に配置する。そして、フィルタ層と吸収層を、これらの構造を挟み込むように配置する。検出層は反応層と吸収層の間に配置することも可能である。検出層の検出結果は、無線を介して制御用ＰＣに送信される。
【解決手段】 検出層を試薬層と反応層の間に配置する。そして、フィルタ層と吸収層を、これらの構造を挟み込むように配置する。検出層は反応層と吸収層の間に配置することも可能である。検出層の検出結果は、無線を介して制御用ＰＣに送信される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸、タンパク質、微生物などの生体物質を対象とする分析デバイスと、当該キットを応用した分析システムに関する。また、無線機能を有するセンサチップを適用した安価・簡便かつ高感度・迅速な分析デバイスと、本デバイスを応用した分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
成人病・腫瘍などの疾患マーカやウィルス・細菌などの免疫検査あるいは糖や電解質などの生化学検査などの検体検査では、従来、省力化によるコスト削減の観点から専ら大規模病院や検査センタに設置された集中検査装置が利用されてきた。一方で、診療所や小規模の病院においてその場で結果を得て治療や処方に利用できるようなPOCT(Point of Care Testing)に対するニーズが拡大している。例えばインフルエンザなどのウィルス感染症や心筋梗塞マーカなどの検出においてイムノクロマトが広く利用されるようになっている。また、血糖値や血中電解質についてもその場で簡便に検査結果が得られる小型の検査装置が上市されている。
【０００３】
イムノクロマト法は安価・簡便なその場検査キットに適した技術である。しかし、目視によって呈色反応を検出するため、集中検査装置に比較すると感度が低く、定量計測が困難である。広く利用されているインフルエンザウィルス用のイムノクロマト検査薬は15分以内にウィルス感染の有無を表示できる迅速性を持つが[非特許文献1]，感染初期のウィルスが少ない時期の検体については偽陰性となり[非特許文献2]，感度の向上が望まれている[非特許文献3]。また，代表的な生活習慣病のひとつである心筋梗塞については，troponinやmyoglobinなどの疾患マーカと重篤な血栓発症の危険率との間には強い相関が見出されている[非特許文献4-6]。リスクを有する人が胸部不快を感じた場合，迅速な定量計測が望ましい。こうした背景から感度を向上し、定量計測に向けた検査装置が提案されている。イムノクロマトのもつ安価・簡便性を維持して、高感度化、定量計測を可能にするためイムノクロマトの膜部材を利用し、ここに発光ダイオード(LED; Light Emitting Diode)やレーザダイオード(LD; Laser Diode)によって光を照射し、フォトダイオード(PD; Photo Diode)で反射光を読取って呈色反応あるいは微粒子凝集の濃淡を数値化する方法が提案されている[特許文献1-3]。
【０００４】
また、生化学分析を対象としたPOCTでは酵素センサとして機能する電極あるいはISFET(Ｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ)を組み込んだカートリッジ式のテストデバイスが使用される。テストデバイスに試料溶液を滴下し、信号を読み取り装置によって検出する。テストデバイス中では試料溶液中のターゲット濃度に対応した信号（ボルタンメトリでは電圧、アンペロメトリでは電流）が発生する。これを信号読み取り装置に読み取ることにより、ターゲットを計測することができる。ＰＯＣＴの場合、テストデバイスは一つの計測が終わると廃棄するディスポーザブル型である。テストデバイスと信号読み取り装置には着脱可能な電極コネクタが設けられている。
【０００５】
【特許文献１】特開昭57-200862号公報
【特許文献２】特許公報2818191号公報
【特許文献３】特表2001-516040号公報
【非特許文献１】川上他， インフルエンザ，6(4)，pp. 35 (2005)
【非特許文献２】日経メディカル 11月号 pp.46 (2003)
【非特許文献３】日経メディカル 2月号 pp.54 (2003)
【非特許文献４】E. M. Ohman, et al., N. Engl. J. Med., 335, pp.1333, (1996)
【非特許文献５】R. H. Christenson, et al., Clinical Chemistry, 44(3), pp. 494, (1998)
【非特許文献６】P. Stubbs, et al., Circulation, 94(6), pp. 1291, (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
イムノクロマト法によってタンパク質やウィルスなどの対象物を検出する際、従来は目視によって微粒子凝集や酵素による呈色反応によって免疫反応を計測してきた。高い感度が必要とされる場合には、例えば特許文献５、特許文献６に示されるように、化学発光を誘起する酵素や蛍光色素を使い、化学発光や蛍光を読み取り装置によって読み取る方式が提案されている。化学発光は蛍光法で必要な励起光源が不要であるため、読み取り装置を小型化することが容易である。
【０００７】
化学発光の一例として発光基質CDP-starを使った場合の発光反応を図１９に示す。この反応では酵素としてアルカリフォスファターゼが使用される。光基質CDP-starを使った場合の化学発光を、無線機能を内蔵したセンサチップで読み取る場合のイムノクロマトデバイス構成を図２（及び図３(a)）に示す。測定対象となるタンパク質やウィルスなどの計測対象抗原４１を含む試料溶液４５はフィルタ層３３から導入される。試薬層３１には酵素４３で修飾された抗体４２があらかじめ保持されており、試料溶液４５の導入とともに酵素に修飾された抗体１００は反応層３０に浸透する。反応層３０の一部にはターゲットに特異的な抗体４２が固定化されたテスト部３４が設けられ、ここに対面もしくは密着する様にセンサチップ５０が配置される。免疫反応や酵素反応は多孔質の反応層３０で専ら行われる。酵素で修飾された抗体１００は抗原４１と結合しながら反応層を拡散し、テスト部３４において反応層に固定化された抗体４２に結合し、酵素４３が局在する。発光基質４４が発光基質溶液４６として流され、テスト部３４に局在した酵素によって触媒された化学発光を検出層５０で検出する。一般にイムノクロマト法では、反応層３０にはニトロセルロースが用いられるが、ニトロセルロース製反応層における発光基質の拡散距離が問題となる。
【０００８】
POCTのカートリッジ式のテストデバイスでは、テストデバイスで検出された信号は電極コネクタを介して読み取り装置に伝達され、増幅や信号処理された後、表示や転送や記録が行われる。ここでこの電極コネクタはテストデバイス製造の上でコストを増大させる要因となる他、着脱の繰り返しによる電気的接続の信頼性の低下が問題であった。
【０００９】
【特許文献５】特開平01-244370号公報
【特許文献６】特表平08-502968号公報
【課題を解決するための手段】
【００１０】
高感度で定量計測が可能であって簡便・安価な反応分析装置を実現するため，免疫反応あるいは酵素反応を利用する新規の検査・分析デバイスを考案した。本デバイスは，試薬層，反応層，検出層，吸収層を積層する構造を有し、この検出層を反応層とともに試薬層および吸収層の間に挟む。ここで試薬層とは検出対象物質に作用する酵素や抗体を含有する層，反応層とは，試薬と試料溶液中の検出対象物質の反応が行われる層，検出層とは，反応層における検出対象物と試薬が作用し合った結果として発生した化学発光，蛍光，電流，電気ポテンシャル，磁気ポテンシャル，機械的応力などの発生あるいは変動を検出し，増幅・ディジタル化などの信号処理を行って無線機能によって外部のリーダに検出信号を送信する層，吸収層とは，計測中において反応層を通過した試薬溶液および試料溶液を吸収する層である。検出層と反応層の位置は入れ替えることが可能である。試料溶液は試薬層側から滴下され，反応層において試薬と試料溶液中の計測対象物と反応する。試薬溶液は吸収層のドレイン機能によって反応層内の溶液流れを促進して洗浄効果を向上する。
【００１１】
本発明に係る分析デバイスは一例として、検査対象物質と特異的に結合する第1抗体を保持する保持領域を備える第１膜と、保持領域と対面して設置される検出層と、検査対象物質と特異的に結合する第２抗体を一部に保持する第2膜とを有する。
【００１２】
ここで、検出層は、第１膜と第２膜の間に位置してもよい。また、第1膜と対面して設置され、液体に対して吸収性を有する第3膜をさらに有し、検出層は第２膜と第３膜との間に位置してもよい。また、第１抗体は、化学発光を触媒する酵素が結合されていてもよい。
【００１３】
本発明に係る分析システムは一例として、検査対象物質と特異的に結合する第1抗体を保持する保持領域を備える第１膜と、前記保持領域と対面して設置され、通信回路を備える検出層と、検査対象物質と特異的に結合する第２抗体を一部に保持する第2膜とを有するデバイスと、デバイスと情報を送受信するリーダライタと、リーダライタと接続する制御機とを有する。
【発明の効果】
【００１４】
試薬層，反応層，検出層，吸収層からなる積層構造を有する検査デバイス構成により、反応層において試薬が試薬層から反応層の抗体固定領域に拡散する距離を短縮することができ，発光反応における発光基質の輸送効率向上によって発光強度が増大する。さらに反応層において検出対象物質に作用する固定試薬領域を限定することにより基質が周囲の面内の全方位から供給されるためやはり感度の向上を期待することができる。さらに本検査デバイスは基本的に積層構造であるので単純かつ安価な製造工程を利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明からなる検査デバイス、分析デバイス、計測デバイスとして実施の一例を示す。試薬層，反応層，検出層，吸収層を積層する構造を有し、この検出層を反応層とともに試薬層および吸収層の間に挟むことを特徴とする。ここで、試薬層は親水性であって空孔（径１−１００μｍ）を有する層、反応層は空孔（径０．１−１００μｍ）を有し、ＩｇＧとして１０μｇ／ｃｍ２のタンパク質吸着性能を有する層、検出層は有機あるいは無機の半導体材料を用いることによって光、電荷、イオン、電磁場、温度、圧力、歪を電気信号に変換する性質を有する層、吸収層は親水性であって例えば１ｇ／１００ｃｍ２以上の吸水性能を有する層、試料として血液を用いる場合には血球を除去するため、親水性であって空孔径１−１００μｍを有するフィルタ層を試薬層の上部に追加してもよい。本実地例では、フィルタ層はＢｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅガラスファイバーを用いることにより異物の除去、血球の分離を行う。試薬層はＢｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅガラスファイバーを用いることにより修飾抗体などの試薬を保持し、計測デバイス外から試料溶液あるいは試薬溶液が導入されたときに、導入溶液によって保持する修飾抗体を開放する機能を有する。反応層はニトロセルロースメンブレンあるいはナイロン、あるいはＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を用いることにより、ここに抗体を固定して抗原抗体反応を起こし、その後，抗原に結合した酵素修飾抗体による酵素反応が起こる場所を提供する。 検出層として、信越半導体Siliconウェハ ｐ型１０Ωｃｍ 直径６インチ上に０．３５ミクロンＣＭＯＳテクノロジーを用いることにより形成したフォトダイオード，信号処理回路（増幅器，ＡＤ変換器），受動型ＲＦ通信回路，電源発生回路を含む集積回路を形成する。検出層は，反応層における検出対象物と試薬が作用し合った結果として発生した化学発光などの発生あるいは変動を検出し，増幅・ディジタル化などの信号処理を行って無線機能によって外部のリーダに検出信号を送信する機能を有する。吸収層として，Ｗｈａｔｍａｎ ９００ Ｃｏｔｔｏｎ ｌｉｎｔｅｒｓなどを用いることにより計測中において反応層を通過した試薬溶液および試料溶液を吸収する。検出層と反応層は互いにそれらの位置を入れ替えることが可能である。試料溶液は試薬層側から滴下され，反応層において試薬と試料溶液中の計測対象物と反応する。
【実施例１】
【００１６】
本発明の一実施例を図１により説明する。フィルタ層１３としてＢｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅガラスファイバー、試薬層１１としてＷｈａｔｍａｎ ３３Ｇｌａｓｓ Ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ ｇｌａｓｓ ｆｉｂｅｒ，反応層１０としてＷｈａｔｍａｎ(登録商標) ＰＲＩＭＡ８５ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，吸収層１２として，Ｗｈａｔｍａｎ(登録商標) ９００ Ｃｏｔｔｏｎ ｌｉｎｔｅｒｓ，検出層５０として、ｐ型１０Ωｃｍ 直径６インチSiliconウェハ上に０．３５ミクロンＣＭＯＳテクノロジーにより形成したフォトダイオード，増幅器，ＡＤ変換器，受動型ＲＦ通信回路，電源発生回路を含む集積回路を用いる。検出対象物の一例として妊娠マーカや腫瘍マーカとして使われているhCG(human Chorionic Gonadotropin)を検出する方法について説明する。ここで反応層１０部材としてニトロセルロースの他、ナイロン、ポリビニリジンフルオライド（PVDF、polyvinylidene-Fluoride）などを使うことができるが、抗体固定化の容易さの点でニトロセルロースが多く利用される。検出対象物質の検出・定量はイムノクロマトの場合と同様に図６に示すようなサンドイッチ法による。試薬層１１にはhCGに特異的に結合する抗体４２が保持されている。ここで抗体４２は酵素４３で修飾されている。試料溶液４５をフィルタ層１３上から滴下する。試料溶液中の抗原４１は試薬層１１に保持された酵素修飾抗体４２と反応しながら、反応層１０に固定された抗体１００と反応する。その後、発光基質４４を含む溶液４６が滴下されると発光基質は反応層１０の中を拡散して、反応層１０中の１次抗体の固定領域に局在した酵素４３によって発光基質４４の発光が触媒される。未反応の抗原や抗体は反応層に局在することなく、吸収層１２に到達する。発光は検出層５０によって検出される。抗原４１の例であるhCGとして、ロート製薬R-505（マウス由来細胞）を用い、固定化抗体１００として、抗hCG IgG（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、品番100066、マウス由来monoclonal anti-human alpha-subunit 6601 SPR-5）をスポッタ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ(登録商標)）により反応層３０となるニトロセルロース製メンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ(登録商標)、PRIMA 85）へ固定化した。アルカリフォスファターゼ（AP）修飾抗体４２は、抗hCG IgG（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、品番100006、マウス由来monoclonal anti-hCG 5008 SP-5）に、APラベリングキット（Ｄｏｊｉｎｄｏ(登録商標)、Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH）を用いてAP修飾する。発光基質４４にはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ(登録商標)、CDP-StarTM、（ready-to-use仕様、0.25mＭ）を用いることができる。なお、発光基質溶液にはNitro-Block-II（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を5%（v/v）添加してニトロセルロースメンブレンを疎水化処理することで発光基質を動きやすくすることができる。
【００１７】
検出層の構造を図８（ａ）のブロックダイアグラムに示す。反応層１０で発生した光は検出層５０のセンサ６４によって検出される。検出層５０は無線を介して制御用パーソナルコンピュータ（ＰＣ）８０およびリーダ７０によってデータの通信を行う。ここでセンサ６４はシリコンウェハ上に形成されたフォトダイオード(ＰＤ; Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｏｄｅ)、フォトトランジスタ、フォトセル、ＦＥＴ（Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）など光に感応する素子によって構成することができる。センサ６４で捕獲された光は検出層５０を構成するシリコンチップ上に形成された信号処理回路６３で増幅、アナログ−ディジタル（A-D）変換され、同じくシリコンチップ上に形成された通信回路６１に送られ、アンテナコイル７４からリーダに送信される。
【００１８】
図８（ｂ）は検出デバイスとリーダコイル７１の配置を示す。検出層とリーダとの通信には電磁波、交流磁場、交流電場などを用いることができる。本発明ではいずれを用いることも可能であるが、ここでは一般的に多く用いられている、13.56MHzの交流磁場を採用した場合について説明する。リーダ７０で生成された交流磁場はリーダコイル７１によって検出デバイスの置かれた領域に向けて放射される。本交流磁場は磁場振幅を変動することによってデータを転送する。
【００１９】
図１３に、本発明における検出デバイスの積層の例を示す。なお、簡単のため、ここでは各層を分離して表示する。ここで検出層５０は試薬層１１と反応層１０の間に配置されている。そして、フィルタ層１３と吸収層１２がこれらの構造を挟み込むように配置される。図１４に示すように、検出層５０は反応層１０と吸収層１２の間に配置することも可能である。検出層５０を試薬層１１と反応層１０に間に配置した場合は、試料溶液中の抗原は試薬層１１を通過して試薬層１１中に保持された修飾抗体と混合しながら検出層１１を迂回して反応層１０中の抗体固定部(テスト部)１４に到達する。試料溶液が検出層１１を迂回すると、試料溶液が検出層１１を迂回する間に試料中の抗原４１と試薬層中に保持されていた修飾抗体４２が反応する時間を確保することができ、抗原抗体反応の効率をより向上することができる。一方、検出層５０を反応層１０と吸収層１２に間に配置した場合は、抗原４１が反応層１０中の抗体固定部(テスト部)１４に早期に到達するため早い信号の立ち上がり期待できる。したがって、より高い感度を得たい場合には検出層を試薬層と反応層の間に配置し、より早い応答速度を得たい場合には検出層を反応層と吸収層の間に配置してもよい。
【００２０】
ここで図１３および１４の構造の検出デバイスについて、図８（ｂ）で示したようなリーダコイルについては、積層構造の上部、下部のいずれに配置しても通信を行うことができる。
【００２１】
本構造によれば、外部読取装置による信号検出用の窓形成が不要であることから、以下に述べるような窓形成に伴う信号強度の低下やバックグランド増加の要因を少なくできる。検出層５０は測定対象物の濃度に応じて変動する信号、ここでは化学発光が発生する反応層１０に密着して配置される。すなわち、本発明の構造では、試薬層１１、反応層１０、吸収層１０が密着して配置されることにより、試薬層から反応層に対する試薬の供給や未反応物の吸収層１２への排出が効率的に行われる。従来の検出デバイスでは、特許文献１にあるように、試薬層あるいは吸収層の全部または一部を除去することによって反射率や吸収率や発光を外部計測装置によって計測する構造を採用している。また特許文献２にあるように反応層の色変化を目視によって確認できるように試薬層に相当する部分を着脱式とし、計測時にはこれをはずして観察している。従来方式によれば、このように信号観察用の窓の形成により、窓領域の反応層は試薬層あるいは吸収層とは接していない部分ができ、この部分では試薬の供給が不足による信号強度の低下、あるいは未反応の修飾抗体の吸収層への排出が滞ることによるバックグランド信号の増加、などの問題が発生する。本構造によれば、信号検出は検出層５０によって行われ、検出結果は無線によって外部に伝達されるため、反応層における信号観察のために試薬層や吸収層に観察用の窓を形成する必要がなく、このため、試薬供給や未反応修飾抗体の排出が阻害する要因が除かれることで感度の向上、バックグランド信号の低減が可能になる。
【００２２】
また、本構造によれば、２次抗体の標識酵素としてアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）を用いた場合に発光基質の輸送効率を向上できる。これは特にCDP-starのようなジオキセタン系の発光基質をニトロセルロースの反応層中で用いた場合に顕著となる。
【００２３】
図３にイムノクロマトデバイスについて発光基質の拡散を調べた結果を示す。 ここに発光基質４４を含む溶液４６を図３(a)のＡで示す位置から滴下した場合の反応層３０の発光分布をＣＣＤカメラで観察した結果を図３（ｂ）に示す。ここで、発光基質の滴下位置は中心部に白丸で示す。
反応層３０の一部に一次抗体１００を固定化し、抗原４１を含む試料溶液、続いて発光酵素４３で修飾された抗体１００を含む溶液を流す。修飾抗体を３４の領域に局在させた後、発光基質４４を含む溶液４６を流して抗体が固定されていないブランク部の発光分布を調べた。図３（ｂ）は発光のＣＣＤイメージである。ここで抗原と結合していない未反応の酵素修飾抗体を洗い流す洗浄工程は入れていないのでブランク部には修飾抗体溶液の濃度に応じた未反応の酵素修飾抗体が一様に分布している。酵素の一様分布にもかかわらず発光は基質の添加位置（滴下部）近傍に限定されていることがわかった。このことから化学発光反応で用いた発光基質のニトロセルロース製の反応層３０の中では拡散が大きく阻害されていることがわかった。
【００２４】
図３（ｂ）にさらに、基質滴下点周辺（ＣＣＤカメラ確認結果に両端が矢印の線分で示した範囲）の発光分布を数値化し，下記に示す定常的な拡散の式（数１）でフィッティングした結果を示す。
【００２５】
【数１】
【００２６】
ここでは，発光の強度は発光基質の濃度を反映していると考えられる。xは反応層の長さ方向に沿った位置座標，ＬＤはニトロセルロース製反応層内の拡散長である。フィッティングからＬＤを求めた結果，約1mmであった。ラテラルフロー型のイムノクロマト検査デバイスでは、計測対象物に伴う呈色反応を目視によって判定するために試料導入部と呈色部には一定の距離が必要であり、反応層３０の中で発光反応が起こる抗体１００が固定された領域３４と基質を滴下する試薬滴下位置（図３(a) Ａ）は10mm程度の距離に設定されている。
以上のように、定常状態における拡散の式から拡散距離ＬDは約１ｍｍであることがわかった。したがって、基質添加位置を抗体固定領域３４に近づけることにより信号強度は大幅に増大する。
【００２７】
図４（ａ）に従来のラテラルフローによるイムノクロマト構造における試薬層３１からの試薬の供給を示す。ここでラテラルフロー構造とは、試料溶液や試薬溶液がデバイスの積層構造の層に対して主として実質的に平行に流れる構造、すなわち、イムノクロマト構造において、試料溶液が導入される試薬層３１と試薬溶液が吸収される吸収層５２が上面からみて重なりをもたない構造である。図４（ｂ）はフロースルー構造における試薬の流れを示す。ここでフロースルー構造とは、試料溶液や試薬溶液は積層構造の層に主として実質的に垂直に流れることを特徴とする構造、すなわち、試料溶液が導入される試薬層１１と試薬溶液が吸収される吸収層１２が上面からみて重なりをもつ構造である。フロースルー構造では反応層の中で１次抗体が固定され、酵素が局在する領域１７に対して吸収層１２は反応層１０の下部（吸収層と対面する関係）に配置されているため、発光試薬（基質）を効率的に供給することができる。特にＡＰを使った化学発光の系で発光基質の拡散距離が短く、図４（ｂ）に示すフロースルー構造では、検出層５０の大きさを基質の拡散距離ＬDに対して同じかそれ以下にすることによって抗体固定領域１７に対して反応層面内のあらゆる方向から基質が供給される。図４（ｃ）はラテラルフローとフロースルーのイムノクロマト構造について基質滴下位置と反応領域の距離と基質到達量（相対値）の関係を示す。ここで基質の拡散距離ＬDは図３（ｂ）で求めた値（１ｍｍ）を用いた。フロースルー構造はラテラルフロー構造に比べて基質滴下位置と反応領域の距離が短くなるため図に示すように信号強度の増加が期待できる。
【００２８】
また、本構造によれば、検出デバイス組み立て工程の簡略化することができる。ＡＰに対するジオキセタン系発光基質のように拡散距離の短い発光試薬を供給しようとする場合、検出デバイスの感度ばらつきを抑えるには１次抗体が固定化されたテスト部に対して発光基質の添加位置を正確に規定する必要があるが、図４（ａ）の構造では、試薬層３１と抗体固定位置３４および検出層５０を正確に決める必要があり、製造組み立ての工数増が問題になる。図４（ｂ）のフロースルー構造では、反応層１０中の抗体固定領域１７と検出層５０の位置を正確に決めれば、試薬層１１や吸収層１２は単に積層するだけでよく、正確な位置決めは不要である。これについて以下説明する。抗体固定領域１７と検出層５０を互いに位置合わせする場合、検出デバイス組立て時における位置合わせばらつきに対してデバイス毎に感度が異ならないようにすることが重要である。抗体固定領域の形状と検出層における受光部の形状が同一の場合、位置合わせばらつきが生ずると抗体固定領域と受光部の重なり面積が変化して感度が低下する方向に変化する。これに対し、受光部の大きさに対して抗体固定領域を大きく設定する、あるいは受光部の大きさに対して抗体固定領域を小さく設定することによって組立て時の位置合わせばらつきによる感度の変動を抑制することができる。一般の組立工程において位置合わせ精度を100μmとすることは格別に困難ではない。そこで、受光部と抗体固定領域の形状を100μmの位置合わせずれがあっても重なり部分の面積が変化しないように形状を定めればよい。位置合わせの具体的手段としては、反応層に位置合わせマークをつけることによって精度良くデバイスを組立てることができる。位置合わせマークは反応層上への染料の滴下、反応層の加工（穿孔、切りかき形成、圧刻）等によって形成することができる。抗体固定領域１７と検出層５０の形状をこのように定めて位置を合わせれば、他の試薬層１１や吸収層１２は抗体固定領域に対して十分に大きいため1mm程度の位置合わせ精度で十分であり組立て時の位置合わせについて精密な注意をはらう必要はない。検出層５０は一般にシリコンなどの溶液に対して非浸透性の材料で構成されているため、発光試薬の供給経路は検出層５０の形状によって規定される。
【実施例２】
【００２９】
図５（ａ）および図７に、１次抗体が固定された領域１４からの発光と同時に１次抗体が固定されていないブランク部分からの発光を計測して、その差分を実際の信号として処理する実施例を示す。ここでは、１次抗体が固定された領域を複数有しかつ検出層を複数有し、複数の検出層は、複数の検査領域の少なくとも２つに対面して設置される。本構造は、実際の計測において感度と再現性の向上に有効である。
【００３０】
これは、抗体固定部１４からの信号を検出するための検出層５１とブランク部からの信号を検出する検出層５２を設けることによって容易に実現することができる。ここで検出層５１と検出層５２が接しないように配置すれば抗体固定部１４への試料溶液あるいは試薬溶液の流れを検出層５１の中心に対して対称にすることができ、固定抗体と抗原の反応効率を向上できる。各検出層は図８（ａ）の構造を有し、検出層が１個の時と同様にひとつのリーダによってデータを読み出すことができる。識別番号（ＵＩＤ：ｕｎｉｑｕｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）による衝突防止制御機能を有する無線通信プロトコルを使用することにより、複数の検出層についても図９（ａ）のようにデータ読み出しシステムは検出層１個の場合とまったく変わらない。図９（ｂ）の制御フローに示すようにｉｎｖｅｎｔｏｒｙ(通信フィールド内にある検出層の確認)、ｐｒｅ−ｃｈａｒｇｅ(フォトダイオードのリセットと計測開始)、ｍｅａｓｕｒｅ(計測データのＡＤ変換)などの共通コマンドはリーダから一括して各検出層に送信される。各検出層からの信号はＵＩＤを使って個別に順次読み取る。
【００３１】
複数の検出層を制御してそれぞれの信号を検出する場合、各検出層に固有のＵＩＤが必要となる。ＵＩＤを付与する方法としては、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＰＲＯＭ（Ｐｒｏｇａｍｍａｂｌｅ ＲＯＭ）、乱数発生回路を用いることができる。PROMについては電気的に書き換えが可能なＥＥＰＲＯＭ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｅｒａｓａｂｌｅ Ｐｒｏｇａｍｍａｂｌｅ ＲＯＭ）、乱数発生回路としてはＭＯＳトランジスタの閾値ばらつきを利用する方式を用いることができる。
【実施例３】
【００３２】
他の実施例を図５（ｂ）により説明する。本実施例は１個の検査デバイスで複数の計測対照物をする手段を容易に提供することができる。反応層１０の中に第１の計測対象物に特異的に結合する抗体を固定化した抗体固定領域１４を形成し、さらに第２の計測対象物に特異的に結合する抗体を固定化した抗体固定領域１５を形成する。各抗体固定化領域に隣接して第１の検出層５１および第２の検出層５３を配置する。さらに抗体を固定化しないブランク部には検出層５２を配置する。第１の計測対象物からの信号は検出層５１とブランク部の検出層５２の差分、第２の計測対象物からの信号は検出層５３と検出層５２の差分をとって算出する。この場合、３つの検出層を同時に駆動する必要があるが、図９に示した２個の検出層の駆動の場合と同様に各検出層に固有のＵＩＤを用いた輻輳制御機能によって３個の検出層を駆動して、独立にデータを読み取るこが可能である。なお、３個以上の計測対象物についても、各々について検出層と計測対象物に特異的に結合する交代を固定化した領域とを新たに設置することによって対応できる。
【実施例４】
【００３３】
他の実施例を図１０により説明する。本発明からなる計測デバイスを構成する各層の保護性能、計測時の遮光性能、取扱の容易性を向上するため、フィルタ層１３、試薬層１１、検出層５０、反応層１０、吸収層１２の各層をケース(カバー)２０に収納する。試料はケースに設けられた試料導入部から添加する。ケースは検出層と外部の読み出しリーダとの通信を阻害しないように、樹脂等の誘電体材料たとえばポリエチレンテレフタレート、ＡＢＳ樹脂等で構成する。計測デバイスは上記の実施例に記載したデバイスと同様である。
【００３４】
本発明の計測デバイスをケースに収納する場合についての実施例を、さらに図１１および１２により説明する。検出層により化学発光を正確に計測するには、試料導入部２１からの外部光侵入を抑制する手段が必要になる。これに対し、光吸収性の染料をガラスファイバ、ＰＶＦ（ｐｏｌｙ ｖｉｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ｎｙｌｏｎなどの多孔質材料を遮光層２２を試料導入部２１に配置する。これにより、試料導入部２１から進入する光は、試料溶液の流れは妨げられず、試料導入部２１からケースの内側に進入した光が各層（１３、１１、１０、１２）において散乱されて検出層２２に到達して雑音源となることを抑制することができる。図１２は遮光性能を向上するケースの構造を示す。ケース２０の内側に試料導入部２１を囲むように凸部２３を設けることにより、ケース２０と遮光層２２の間隙にそって侵入する光を遮断することができる。また、テーパ形状を有する試料導入部２０を設けることでデバイスに導入する溶液の飛散を防止できる。また、図１１におけるケース２０を図１２のように２４と２５に分割することにより、積層構造部分の収納を容易に行うことが可能になる。
【実施例５】
【００３５】
他の実施例を図１５により説明する。計測デバイスは上記の実施例に記載したデバイスと同様である。図１５（ａ）に示すように、溶液流の制限層１８を設けることにより、１次抗体の固定領域に溶液流を集中して感度を向上することができる。制限層１８は、吸収層の少なくとも一部に面する層状部材である。さらには、抗体固定部１４に接さないように配置される。制限層は液体を浸透しない材料であって、分子吸着の少ない材料あるいは表面処理がなされていることが必要である。このような性質を有する材料としてたとえばポリエステルフィルム、ＰＶＣ（Ｐｏｌｙ ｖｉｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）フィルム等を用いることができる。
【００３６】
微量試料を計測する場合には、ブランク部を設けてブランク部の発光をさらに計測することができる。図１５（ｂ）に示すようにブランク部にも溶液流が集中するように溶液流制限層を設けることによりブランク部の洗浄効果が向上してバックグランド信号を低減することができる。
【実施例６】
【００３７】
図１７に、検出層として光センサだけでなく、温度センサ、ＩＳＦＥＴ（Ｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）センサを組み込んだ検出層を同時に利用する実施例の制御のフローを示す。計測デバイスは上記の実施例に記載したデバイスと同様である。各検出層の制御と信号の読み出しは図９で説明した複数の同種センサを搭載した検出層を用いる場合と同様に、ＵＩＤを用いて各検出層を識別することにより、ひとつのリーダで複数の検出層を制御することができる。本実施例の特徴は異なる物理量・化学量をひとつのリーダによって同時に計測することである。光センサによって免疫反応を使ったタンパク質計測を行いながら、温度およびｐＨを計測してその計測条件を明確にし、タンパク質計測結果を補正することが可能になる。ここで温度センサは半導体のバンドギャップの温度依存性によりダイオード特性が変化することを使って温度を計測する。図８の検出層の構造におけるセンサ６４の部分にｐｎ接合を使った温度計測部を形成することにより、計測した温度をディジタル化して外部に送信することができる。
【００３８】
ＩＳＦＥＴは、通常のＭＯＳトランジスタのゲート電極を試料溶液に接するようにしてここにイオン感応膜を堆積することによって形成する。温度センサの場合と同様に、図８の検出層の構造におけるセンサ６４の部分にＩＳＦＥＴを形成することにより、計測したｐＨをディジタル化して外部に送信することができる。ここで、図２０(ａ)に示すように検出層におけるセンサ、信号処理回路、通信回路の一部または全部を有機半導体で構成される検出層３８を導入する。有機半導体材料としては例えば比較的低分子量のペンタセン（例えば非特許文献７）、あるいは比較的項分量のポリチオフェン（例えば非特許文献８）などを用いることができる。
【００３９】
有機半導体による検出層３８の形成方法と材料構成について以下説明する。ＰＥＴ（poly ethylene terephthalate）やpolyesterなどフィルム５２上に前記半導体材料をグリニヤール法、電解重合、溶液塗布法や化学的気相成長法などによって堆積し、フォトリソグラフィー技術によってセンサ、信号処理回路、通信回路を含む層５１を形成する(図２０(ｂ))。図２０(ａ)の検出層３８は層５１とフィルム５２を合わせたものである。ここで実施例１の試薬層、検出層、反応層、吸収層の一部、あるいはすべてを共通のフィルム５２上の層５１に連続して堆積することにより、簡便かつ安価に検出デバイスを形成できる(図２０（ｃ）)。有機半導体は大面積のフィルム上に回路やセンサを形成できるため、製造コストの点で有利である。しかし、一般に有機半導体が形成されるフィルムには溶液透過性がないので、フィルムには図２１（ａ）のように溶液を透過させるためのスルーホール３９を形成する。上記各層の一部を別々のフィルム上に形成する場合には、同様に吸収層以外の層が形成されたフィルムにスルーホールを形成する。スルーホール３９の間隔d1は前記の基質の拡散長に対して同程度以下とすることが望ましい(図２１（ｂ）)。これにより、発光基質がメンブレンによって捕獲される割合を減らして基質の利用効率を向上し、発光強度を増大することができる。
【実施例７】
【００４０】
本実施例では、計測デバイスを全血試料計測関連に用いる例を記載する。ここでは特に、心筋梗塞のマーカして利用されているtroponinなどを全血試料から計測する例を検討する。
【００４１】
計測デバイスは上記の実施例の構成と同様の構成を基本とする。従来の目視によるイムノクロマトデバイスでは視認性の点から血球を除くことが必須であるが、本実施例では検出層による発光や電位によって免疫反応を計測するため、反応層における免疫反応は酵素反応が阻害されなければ血球除去は必須ではない。しかし、メンブレンの目詰まり防止の観点から本実施例においても血球を除去するフィルタ層を設けることが望ましい。血球フィルタ層４０を導入した計測デバイスの実施例を図２２に示す。血球フィルタ層４０は、試料の流路において試薬層よりも実質的に下流に配置される。ここで血球フィルタ層４０として、例えばＰＡＬＬ社製ＢＴＳを用いることができる（図２２）。前述のとおり計測は目視計測にたよらないため、反応層１０への着色汚染は問題とならず血球フィルタ性能の選定条件は緩和され、血球フィルタコストの点で有利である。
【００４２】
【非特許文献７】Ｙ．Ｙ．Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．：ＩＥＥＥ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．６０６−６０８（１９９７）．
【非特許文献８】Denise M. Wilson, Sean Hoyt, Jiri Janata, Karl Booksh and LouisObando, IEEE Sensors Journal, vol. 1,4, pp. 256-274,（ 2001）
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例１における反応分析キットの構成を示す図。
【図２】従来の反応分析キットの構成の一例を示す図。
【図３】発光試薬の拡散を示す図。
【図４】試薬の供給方法による効果を示す図。
【図５】複数の検出層を導入したときの本発明の実施例を示す図。
【図６】本発明の実施例を示す図。
【図７】本発明の実施例を示す図。
【図８】検出層の構造と通信の原理を示す図。
【図９】複数検出層の駆動と制御シーケンスを説明する図。
【図１０】検出デバイスのケース収納を説明する図。
【図１１】検出デバイスのケース収納を説明する図。
【図１２】検出デバイスのケース収納を説明する図。
【図１３】検出デバイスの構造を示す図。
【図１４】検出デバイスの構造を示す図。
【図１５】溶液の流れを制限する構造を示す図。
【図１６】本発明の実施例を示す図。
【図１７】本発明の制御シーケンスの一実施例を説明する図。
【図１８】本発明の検出層構造の一実施例を説明する図。
【図１９】発光基質CDP-starを使った場合の発光反応。
【図２０】フィルム上に形成した有機半導体を用いた検出層の構造を示す図。
【図２１】フィルム上に形成した有機半導体を用いた検出層の構造を示す図。
【図２２】血球除去フィルタを付加した検出デバイスの構造を示す図。
【符号の説明】
【００４４】
図において、１０：反応層、１１：試薬層、１２：吸収層、１３：フィルタ層、１４：抗体固定部（テスト部）、１５：抗体固定部（テスト部）、１６：試薬・試料の流れ、１７：試薬・試料の流れ、１８：溶液流の制限層、２０：ケース、２１：試料導入口、２２：遮光層、２３：ケース内側に設けられた遮光用の凸部、２４：ケース部品、３０：反応層、３１：試薬層、３３：フィルタ層、３４：抗体固定部（テスト部）、３５：メンブレン中の試薬・試料溶液の流れ、３６：メンブレン中の試薬・試料溶液の流れ、３７：メンブレン中の試薬・試料溶液の流れ、３８：有機半導体検出層、３９：スルーホール、４０：血球フィルタ層、４１：抗原、４２：抗体、４３：酵素、４４：発光基質、４５：試料溶液、４６：発光基質溶液、４７：血球、５０：検出層、５１：検出層を構成する有機半導体で形成された回路やセンサを含む層、５２：フィルム、５３：試薬層、６０：検出層、６１：通信回路、６２：通信処理回路、６３：信号処理回路、６４：センサ、６５：ＵＩＤ格納部、６６：補正データ収納部、７０：リーダ、７１：リーダコイル、７２：検出層からリーダに送信される信号、７３：リーダから検出層に送られる信号、７４：チップコイル：７５：共振用容量、７６：磁力線、８０：制御用PC、８１：ｉｎｖｅｎｔｏｒｙコマンド、８２：ｐｒｅ−ｃｈａｒｇｅコマンド、８３：ｍｅａｓｕｒｅコマンド、８４：readコマンド、85:readコマンド、８６：検出層１に固有のＵＩＤ、８７：検出層１における信号蓄積期間、８８：検出層１におけるＡ−Ｄ変換期間、８９：検出層１から送信される計測データ、９０：検出層２に固有のＵＩＤ、９１：検出層２における信号蓄積期間、９２：検出層２におけるＡ−Ｄ変換期間、９３：検出層２から送信される計測データ、を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸、タンパク質、微生物などの生体物質を対象とする分析デバイスと、当該キットを応用した分析システムに関する。また、無線機能を有するセンサチップを適用した安価・簡便かつ高感度・迅速な分析デバイスと、本デバイスを応用した分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
成人病・腫瘍などの疾患マーカやウィルス・細菌などの免疫検査あるいは糖や電解質などの生化学検査などの検体検査では、従来、省力化によるコスト削減の観点から専ら大規模病院や検査センタに設置された集中検査装置が利用されてきた。一方で、診療所や小規模の病院においてその場で結果を得て治療や処方に利用できるようなPOCT(Point of Care Testing)に対するニーズが拡大している。例えばインフルエンザなどのウィルス感染症や心筋梗塞マーカなどの検出においてイムノクロマトが広く利用されるようになっている。また、血糖値や血中電解質についてもその場で簡便に検査結果が得られる小型の検査装置が上市されている。
【０００３】
イムノクロマト法は安価・簡便なその場検査キットに適した技術である。しかし、目視によって呈色反応を検出するため、集中検査装置に比較すると感度が低く、定量計測が困難である。広く利用されているインフルエンザウィルス用のイムノクロマト検査薬は15分以内にウィルス感染の有無を表示できる迅速性を持つが[非特許文献1]，感染初期のウィルスが少ない時期の検体については偽陰性となり[非特許文献2]，感度の向上が望まれている[非特許文献3]。また，代表的な生活習慣病のひとつである心筋梗塞については，troponinやmyoglobinなどの疾患マーカと重篤な血栓発症の危険率との間には強い相関が見出されている[非特許文献4-6]。リスクを有する人が胸部不快を感じた場合，迅速な定量計測が望ましい。こうした背景から感度を向上し、定量計測に向けた検査装置が提案されている。イムノクロマトのもつ安価・簡便性を維持して、高感度化、定量計測を可能にするためイムノクロマトの膜部材を利用し、ここに発光ダイオード(LED; Light Emitting Diode)やレーザダイオード(LD; Laser Diode)によって光を照射し、フォトダイオード(PD; Photo Diode)で反射光を読取って呈色反応あるいは微粒子凝集の濃淡を数値化する方法が提案されている[特許文献1-3]。
【０００４】
また、生化学分析を対象としたPOCTでは酵素センサとして機能する電極あるいはISFET(Ｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ)を組み込んだカートリッジ式のテストデバイスが使用される。テストデバイスに試料溶液を滴下し、信号を読み取り装置によって検出する。テストデバイス中では試料溶液中のターゲット濃度に対応した信号（ボルタンメトリでは電圧、アンペロメトリでは電流）が発生する。これを信号読み取り装置に読み取ることにより、ターゲットを計測することができる。ＰＯＣＴの場合、テストデバイスは一つの計測が終わると廃棄するディスポーザブル型である。テストデバイスと信号読み取り装置には着脱可能な電極コネクタが設けられている。
【０００５】
【特許文献１】特開昭57-200862号公報
【特許文献２】特許公報2818191号公報
【特許文献３】特表2001-516040号公報
【非特許文献１】川上他， インフルエンザ，6(4)，pp. 35 (2005)
【非特許文献２】日経メディカル 11月号 pp.46 (2003)
【非特許文献３】日経メディカル 2月号 pp.54 (2003)
【非特許文献４】E. M. Ohman, et al., N. Engl. J. Med., 335, pp.1333, (1996)
【非特許文献５】R. H. Christenson, et al., Clinical Chemistry, 44(3), pp. 494, (1998)
【非特許文献６】P. Stubbs, et al., Circulation, 94(6), pp. 1291, (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
イムノクロマト法によってタンパク質やウィルスなどの対象物を検出する際、従来は目視によって微粒子凝集や酵素による呈色反応によって免疫反応を計測してきた。高い感度が必要とされる場合には、例えば特許文献５、特許文献６に示されるように、化学発光を誘起する酵素や蛍光色素を使い、化学発光や蛍光を読み取り装置によって読み取る方式が提案されている。化学発光は蛍光法で必要な励起光源が不要であるため、読み取り装置を小型化することが容易である。
【０００７】
化学発光の一例として発光基質CDP-starを使った場合の発光反応を図１９に示す。この反応では酵素としてアルカリフォスファターゼが使用される。光基質CDP-starを使った場合の化学発光を、無線機能を内蔵したセンサチップで読み取る場合のイムノクロマトデバイス構成を図２（及び図３(a)）に示す。測定対象となるタンパク質やウィルスなどの計測対象抗原４１を含む試料溶液４５はフィルタ層３３から導入される。試薬層３１には酵素４３で修飾された抗体４２があらかじめ保持されており、試料溶液４５の導入とともに酵素に修飾された抗体１００は反応層３０に浸透する。反応層３０の一部にはターゲットに特異的な抗体４２が固定化されたテスト部３４が設けられ、ここに対面もしくは密着する様にセンサチップ５０が配置される。免疫反応や酵素反応は多孔質の反応層３０で専ら行われる。酵素で修飾された抗体１００は抗原４１と結合しながら反応層を拡散し、テスト部３４において反応層に固定化された抗体４２に結合し、酵素４３が局在する。発光基質４４が発光基質溶液４６として流され、テスト部３４に局在した酵素によって触媒された化学発光を検出層５０で検出する。一般にイムノクロマト法では、反応層３０にはニトロセルロースが用いられるが、ニトロセルロース製反応層における発光基質の拡散距離が問題となる。
【０００８】
POCTのカートリッジ式のテストデバイスでは、テストデバイスで検出された信号は電極コネクタを介して読み取り装置に伝達され、増幅や信号処理された後、表示や転送や記録が行われる。ここでこの電極コネクタはテストデバイス製造の上でコストを増大させる要因となる他、着脱の繰り返しによる電気的接続の信頼性の低下が問題であった。
【０００９】
【特許文献５】特開平01-244370号公報
【特許文献６】特表平08-502968号公報
【課題を解決するための手段】
【００１０】
高感度で定量計測が可能であって簡便・安価な反応分析装置を実現するため，免疫反応あるいは酵素反応を利用する新規の検査・分析デバイスを考案した。本デバイスは，試薬層，反応層，検出層，吸収層を積層する構造を有し、この検出層を反応層とともに試薬層および吸収層の間に挟む。ここで試薬層とは検出対象物質に作用する酵素や抗体を含有する層，反応層とは，試薬と試料溶液中の検出対象物質の反応が行われる層，検出層とは，反応層における検出対象物と試薬が作用し合った結果として発生した化学発光，蛍光，電流，電気ポテンシャル，磁気ポテンシャル，機械的応力などの発生あるいは変動を検出し，増幅・ディジタル化などの信号処理を行って無線機能によって外部のリーダに検出信号を送信する層，吸収層とは，計測中において反応層を通過した試薬溶液および試料溶液を吸収する層である。検出層と反応層の位置は入れ替えることが可能である。試料溶液は試薬層側から滴下され，反応層において試薬と試料溶液中の計測対象物と反応する。試薬溶液は吸収層のドレイン機能によって反応層内の溶液流れを促進して洗浄効果を向上する。
【００１１】
本発明に係る分析デバイスは一例として、検査対象物質と特異的に結合する第1抗体を保持する保持領域を備える第１膜と、保持領域と対面して設置される検出層と、検査対象物質と特異的に結合する第２抗体を一部に保持する第2膜とを有する。
【００１２】
ここで、検出層は、第１膜と第２膜の間に位置してもよい。また、第1膜と対面して設置され、液体に対して吸収性を有する第3膜をさらに有し、検出層は第２膜と第３膜との間に位置してもよい。また、第１抗体は、化学発光を触媒する酵素が結合されていてもよい。
【００１３】
本発明に係る分析システムは一例として、検査対象物質と特異的に結合する第1抗体を保持する保持領域を備える第１膜と、前記保持領域と対面して設置され、通信回路を備える検出層と、検査対象物質と特異的に結合する第２抗体を一部に保持する第2膜とを有するデバイスと、デバイスと情報を送受信するリーダライタと、リーダライタと接続する制御機とを有する。
【発明の効果】
【００１４】
試薬層，反応層，検出層，吸収層からなる積層構造を有する検査デバイス構成により、反応層において試薬が試薬層から反応層の抗体固定領域に拡散する距離を短縮することができ，発光反応における発光基質の輸送効率向上によって発光強度が増大する。さらに反応層において検出対象物質に作用する固定試薬領域を限定することにより基質が周囲の面内の全方位から供給されるためやはり感度の向上を期待することができる。さらに本検査デバイスは基本的に積層構造であるので単純かつ安価な製造工程を利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明からなる検査デバイス、分析デバイス、計測デバイスとして実施の一例を示す。試薬層，反応層，検出層，吸収層を積層する構造を有し、この検出層を反応層とともに試薬層および吸収層の間に挟むことを特徴とする。ここで、試薬層は親水性であって空孔（径１−１００μｍ）を有する層、反応層は空孔（径０．１−１００μｍ）を有し、ＩｇＧとして１０μｇ／ｃｍ２のタンパク質吸着性能を有する層、検出層は有機あるいは無機の半導体材料を用いることによって光、電荷、イオン、電磁場、温度、圧力、歪を電気信号に変換する性質を有する層、吸収層は親水性であって例えば１ｇ／１００ｃｍ２以上の吸水性能を有する層、試料として血液を用いる場合には血球を除去するため、親水性であって空孔径１−１００μｍを有するフィルタ層を試薬層の上部に追加してもよい。本実地例では、フィルタ層はＢｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅガラスファイバーを用いることにより異物の除去、血球の分離を行う。試薬層はＢｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅガラスファイバーを用いることにより修飾抗体などの試薬を保持し、計測デバイス外から試料溶液あるいは試薬溶液が導入されたときに、導入溶液によって保持する修飾抗体を開放する機能を有する。反応層はニトロセルロースメンブレンあるいはナイロン、あるいはＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を用いることにより、ここに抗体を固定して抗原抗体反応を起こし、その後，抗原に結合した酵素修飾抗体による酵素反応が起こる場所を提供する。 検出層として、信越半導体Siliconウェハ ｐ型１０Ωｃｍ 直径６インチ上に０．３５ミクロンＣＭＯＳテクノロジーを用いることにより形成したフォトダイオード，信号処理回路（増幅器，ＡＤ変換器），受動型ＲＦ通信回路，電源発生回路を含む集積回路を形成する。検出層は，反応層における検出対象物と試薬が作用し合った結果として発生した化学発光などの発生あるいは変動を検出し，増幅・ディジタル化などの信号処理を行って無線機能によって外部のリーダに検出信号を送信する機能を有する。吸収層として，Ｗｈａｔｍａｎ ９００ Ｃｏｔｔｏｎ ｌｉｎｔｅｒｓなどを用いることにより計測中において反応層を通過した試薬溶液および試料溶液を吸収する。検出層と反応層は互いにそれらの位置を入れ替えることが可能である。試料溶液は試薬層側から滴下され，反応層において試薬と試料溶液中の計測対象物と反応する。
【実施例１】
【００１６】
本発明の一実施例を図１により説明する。フィルタ層１３としてＢｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅガラスファイバー、試薬層１１としてＷｈａｔｍａｎ ３３Ｇｌａｓｓ Ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ ｇｌａｓｓ ｆｉｂｅｒ，反応層１０としてＷｈａｔｍａｎ(登録商標) ＰＲＩＭＡ８５ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，吸収層１２として，Ｗｈａｔｍａｎ(登録商標) ９００ Ｃｏｔｔｏｎ ｌｉｎｔｅｒｓ，検出層５０として、ｐ型１０Ωｃｍ 直径６インチSiliconウェハ上に０．３５ミクロンＣＭＯＳテクノロジーにより形成したフォトダイオード，増幅器，ＡＤ変換器，受動型ＲＦ通信回路，電源発生回路を含む集積回路を用いる。検出対象物の一例として妊娠マーカや腫瘍マーカとして使われているhCG(human Chorionic Gonadotropin)を検出する方法について説明する。ここで反応層１０部材としてニトロセルロースの他、ナイロン、ポリビニリジンフルオライド（PVDF、polyvinylidene-Fluoride）などを使うことができるが、抗体固定化の容易さの点でニトロセルロースが多く利用される。検出対象物質の検出・定量はイムノクロマトの場合と同様に図６に示すようなサンドイッチ法による。試薬層１１にはhCGに特異的に結合する抗体４２が保持されている。ここで抗体４２は酵素４３で修飾されている。試料溶液４５をフィルタ層１３上から滴下する。試料溶液中の抗原４１は試薬層１１に保持された酵素修飾抗体４２と反応しながら、反応層１０に固定された抗体１００と反応する。その後、発光基質４４を含む溶液４６が滴下されると発光基質は反応層１０の中を拡散して、反応層１０中の１次抗体の固定領域に局在した酵素４３によって発光基質４４の発光が触媒される。未反応の抗原や抗体は反応層に局在することなく、吸収層１２に到達する。発光は検出層５０によって検出される。抗原４１の例であるhCGとして、ロート製薬R-505（マウス由来細胞）を用い、固定化抗体１００として、抗hCG IgG（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、品番100066、マウス由来monoclonal anti-human alpha-subunit 6601 SPR-5）をスポッタ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ(登録商標)）により反応層３０となるニトロセルロース製メンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ(登録商標)、PRIMA 85）へ固定化した。アルカリフォスファターゼ（AP）修飾抗体４２は、抗hCG IgG（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、品番100006、マウス由来monoclonal anti-hCG 5008 SP-5）に、APラベリングキット（Ｄｏｊｉｎｄｏ(登録商標)、Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH）を用いてAP修飾する。発光基質４４にはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ(登録商標)、CDP-StarTM、（ready-to-use仕様、0.25mＭ）を用いることができる。なお、発光基質溶液にはNitro-Block-II（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を5%（v/v）添加してニトロセルロースメンブレンを疎水化処理することで発光基質を動きやすくすることができる。
【００１７】
検出層の構造を図８（ａ）のブロックダイアグラムに示す。反応層１０で発生した光は検出層５０のセンサ６４によって検出される。検出層５０は無線を介して制御用パーソナルコンピュータ（ＰＣ）８０およびリーダ７０によってデータの通信を行う。ここでセンサ６４はシリコンウェハ上に形成されたフォトダイオード(ＰＤ; Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｏｄｅ)、フォトトランジスタ、フォトセル、ＦＥＴ（Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）など光に感応する素子によって構成することができる。センサ６４で捕獲された光は検出層５０を構成するシリコンチップ上に形成された信号処理回路６３で増幅、アナログ−ディジタル（A-D）変換され、同じくシリコンチップ上に形成された通信回路６１に送られ、アンテナコイル７４からリーダに送信される。
【００１８】
図８（ｂ）は検出デバイスとリーダコイル７１の配置を示す。検出層とリーダとの通信には電磁波、交流磁場、交流電場などを用いることができる。本発明ではいずれを用いることも可能であるが、ここでは一般的に多く用いられている、13.56MHzの交流磁場を採用した場合について説明する。リーダ７０で生成された交流磁場はリーダコイル７１によって検出デバイスの置かれた領域に向けて放射される。本交流磁場は磁場振幅を変動することによってデータを転送する。
【００１９】
図１３に、本発明における検出デバイスの積層の例を示す。なお、簡単のため、ここでは各層を分離して表示する。ここで検出層５０は試薬層１１と反応層１０の間に配置されている。そして、フィルタ層１３と吸収層１２がこれらの構造を挟み込むように配置される。図１４に示すように、検出層５０は反応層１０と吸収層１２の間に配置することも可能である。検出層５０を試薬層１１と反応層１０に間に配置した場合は、試料溶液中の抗原は試薬層１１を通過して試薬層１１中に保持された修飾抗体と混合しながら検出層１１を迂回して反応層１０中の抗体固定部(テスト部)１４に到達する。試料溶液が検出層１１を迂回すると、試料溶液が検出層１１を迂回する間に試料中の抗原４１と試薬層中に保持されていた修飾抗体４２が反応する時間を確保することができ、抗原抗体反応の効率をより向上することができる。一方、検出層５０を反応層１０と吸収層１２に間に配置した場合は、抗原４１が反応層１０中の抗体固定部(テスト部)１４に早期に到達するため早い信号の立ち上がり期待できる。したがって、より高い感度を得たい場合には検出層を試薬層と反応層の間に配置し、より早い応答速度を得たい場合には検出層を反応層と吸収層の間に配置してもよい。
【００２０】
ここで図１３および１４の構造の検出デバイスについて、図８（ｂ）で示したようなリーダコイルについては、積層構造の上部、下部のいずれに配置しても通信を行うことができる。
【００２１】
本構造によれば、外部読取装置による信号検出用の窓形成が不要であることから、以下に述べるような窓形成に伴う信号強度の低下やバックグランド増加の要因を少なくできる。検出層５０は測定対象物の濃度に応じて変動する信号、ここでは化学発光が発生する反応層１０に密着して配置される。すなわち、本発明の構造では、試薬層１１、反応層１０、吸収層１０が密着して配置されることにより、試薬層から反応層に対する試薬の供給や未反応物の吸収層１２への排出が効率的に行われる。従来の検出デバイスでは、特許文献１にあるように、試薬層あるいは吸収層の全部または一部を除去することによって反射率や吸収率や発光を外部計測装置によって計測する構造を採用している。また特許文献２にあるように反応層の色変化を目視によって確認できるように試薬層に相当する部分を着脱式とし、計測時にはこれをはずして観察している。従来方式によれば、このように信号観察用の窓の形成により、窓領域の反応層は試薬層あるいは吸収層とは接していない部分ができ、この部分では試薬の供給が不足による信号強度の低下、あるいは未反応の修飾抗体の吸収層への排出が滞ることによるバックグランド信号の増加、などの問題が発生する。本構造によれば、信号検出は検出層５０によって行われ、検出結果は無線によって外部に伝達されるため、反応層における信号観察のために試薬層や吸収層に観察用の窓を形成する必要がなく、このため、試薬供給や未反応修飾抗体の排出が阻害する要因が除かれることで感度の向上、バックグランド信号の低減が可能になる。
【００２２】
また、本構造によれば、２次抗体の標識酵素としてアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）を用いた場合に発光基質の輸送効率を向上できる。これは特にCDP-starのようなジオキセタン系の発光基質をニトロセルロースの反応層中で用いた場合に顕著となる。
【００２３】
図３にイムノクロマトデバイスについて発光基質の拡散を調べた結果を示す。 ここに発光基質４４を含む溶液４６を図３(a)のＡで示す位置から滴下した場合の反応層３０の発光分布をＣＣＤカメラで観察した結果を図３（ｂ）に示す。ここで、発光基質の滴下位置は中心部に白丸で示す。
反応層３０の一部に一次抗体１００を固定化し、抗原４１を含む試料溶液、続いて発光酵素４３で修飾された抗体１００を含む溶液を流す。修飾抗体を３４の領域に局在させた後、発光基質４４を含む溶液４６を流して抗体が固定されていないブランク部の発光分布を調べた。図３（ｂ）は発光のＣＣＤイメージである。ここで抗原と結合していない未反応の酵素修飾抗体を洗い流す洗浄工程は入れていないのでブランク部には修飾抗体溶液の濃度に応じた未反応の酵素修飾抗体が一様に分布している。酵素の一様分布にもかかわらず発光は基質の添加位置（滴下部）近傍に限定されていることがわかった。このことから化学発光反応で用いた発光基質のニトロセルロース製の反応層３０の中では拡散が大きく阻害されていることがわかった。
【００２４】
図３（ｂ）にさらに、基質滴下点周辺（ＣＣＤカメラ確認結果に両端が矢印の線分で示した範囲）の発光分布を数値化し，下記に示す定常的な拡散の式（数１）でフィッティングした結果を示す。
【００２５】
【数１】
【００２６】
ここでは，発光の強度は発光基質の濃度を反映していると考えられる。xは反応層の長さ方向に沿った位置座標，ＬＤはニトロセルロース製反応層内の拡散長である。フィッティングからＬＤを求めた結果，約1mmであった。ラテラルフロー型のイムノクロマト検査デバイスでは、計測対象物に伴う呈色反応を目視によって判定するために試料導入部と呈色部には一定の距離が必要であり、反応層３０の中で発光反応が起こる抗体１００が固定された領域３４と基質を滴下する試薬滴下位置（図３(a) Ａ）は10mm程度の距離に設定されている。
以上のように、定常状態における拡散の式から拡散距離ＬDは約１ｍｍであることがわかった。したがって、基質添加位置を抗体固定領域３４に近づけることにより信号強度は大幅に増大する。
【００２７】
図４（ａ）に従来のラテラルフローによるイムノクロマト構造における試薬層３１からの試薬の供給を示す。ここでラテラルフロー構造とは、試料溶液や試薬溶液がデバイスの積層構造の層に対して主として実質的に平行に流れる構造、すなわち、イムノクロマト構造において、試料溶液が導入される試薬層３１と試薬溶液が吸収される吸収層５２が上面からみて重なりをもたない構造である。図４（ｂ）はフロースルー構造における試薬の流れを示す。ここでフロースルー構造とは、試料溶液や試薬溶液は積層構造の層に主として実質的に垂直に流れることを特徴とする構造、すなわち、試料溶液が導入される試薬層１１と試薬溶液が吸収される吸収層１２が上面からみて重なりをもつ構造である。フロースルー構造では反応層の中で１次抗体が固定され、酵素が局在する領域１７に対して吸収層１２は反応層１０の下部（吸収層と対面する関係）に配置されているため、発光試薬（基質）を効率的に供給することができる。特にＡＰを使った化学発光の系で発光基質の拡散距離が短く、図４（ｂ）に示すフロースルー構造では、検出層５０の大きさを基質の拡散距離ＬDに対して同じかそれ以下にすることによって抗体固定領域１７に対して反応層面内のあらゆる方向から基質が供給される。図４（ｃ）はラテラルフローとフロースルーのイムノクロマト構造について基質滴下位置と反応領域の距離と基質到達量（相対値）の関係を示す。ここで基質の拡散距離ＬDは図３（ｂ）で求めた値（１ｍｍ）を用いた。フロースルー構造はラテラルフロー構造に比べて基質滴下位置と反応領域の距離が短くなるため図に示すように信号強度の増加が期待できる。
【００２８】
また、本構造によれば、検出デバイス組み立て工程の簡略化することができる。ＡＰに対するジオキセタン系発光基質のように拡散距離の短い発光試薬を供給しようとする場合、検出デバイスの感度ばらつきを抑えるには１次抗体が固定化されたテスト部に対して発光基質の添加位置を正確に規定する必要があるが、図４（ａ）の構造では、試薬層３１と抗体固定位置３４および検出層５０を正確に決める必要があり、製造組み立ての工数増が問題になる。図４（ｂ）のフロースルー構造では、反応層１０中の抗体固定領域１７と検出層５０の位置を正確に決めれば、試薬層１１や吸収層１２は単に積層するだけでよく、正確な位置決めは不要である。これについて以下説明する。抗体固定領域１７と検出層５０を互いに位置合わせする場合、検出デバイス組立て時における位置合わせばらつきに対してデバイス毎に感度が異ならないようにすることが重要である。抗体固定領域の形状と検出層における受光部の形状が同一の場合、位置合わせばらつきが生ずると抗体固定領域と受光部の重なり面積が変化して感度が低下する方向に変化する。これに対し、受光部の大きさに対して抗体固定領域を大きく設定する、あるいは受光部の大きさに対して抗体固定領域を小さく設定することによって組立て時の位置合わせばらつきによる感度の変動を抑制することができる。一般の組立工程において位置合わせ精度を100μmとすることは格別に困難ではない。そこで、受光部と抗体固定領域の形状を100μmの位置合わせずれがあっても重なり部分の面積が変化しないように形状を定めればよい。位置合わせの具体的手段としては、反応層に位置合わせマークをつけることによって精度良くデバイスを組立てることができる。位置合わせマークは反応層上への染料の滴下、反応層の加工（穿孔、切りかき形成、圧刻）等によって形成することができる。抗体固定領域１７と検出層５０の形状をこのように定めて位置を合わせれば、他の試薬層１１や吸収層１２は抗体固定領域に対して十分に大きいため1mm程度の位置合わせ精度で十分であり組立て時の位置合わせについて精密な注意をはらう必要はない。検出層５０は一般にシリコンなどの溶液に対して非浸透性の材料で構成されているため、発光試薬の供給経路は検出層５０の形状によって規定される。
【実施例２】
【００２９】
図５（ａ）および図７に、１次抗体が固定された領域１４からの発光と同時に１次抗体が固定されていないブランク部分からの発光を計測して、その差分を実際の信号として処理する実施例を示す。ここでは、１次抗体が固定された領域を複数有しかつ検出層を複数有し、複数の検出層は、複数の検査領域の少なくとも２つに対面して設置される。本構造は、実際の計測において感度と再現性の向上に有効である。
【００３０】
これは、抗体固定部１４からの信号を検出するための検出層５１とブランク部からの信号を検出する検出層５２を設けることによって容易に実現することができる。ここで検出層５１と検出層５２が接しないように配置すれば抗体固定部１４への試料溶液あるいは試薬溶液の流れを検出層５１の中心に対して対称にすることができ、固定抗体と抗原の反応効率を向上できる。各検出層は図８（ａ）の構造を有し、検出層が１個の時と同様にひとつのリーダによってデータを読み出すことができる。識別番号（ＵＩＤ：ｕｎｉｑｕｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）による衝突防止制御機能を有する無線通信プロトコルを使用することにより、複数の検出層についても図９（ａ）のようにデータ読み出しシステムは検出層１個の場合とまったく変わらない。図９（ｂ）の制御フローに示すようにｉｎｖｅｎｔｏｒｙ(通信フィールド内にある検出層の確認)、ｐｒｅ−ｃｈａｒｇｅ(フォトダイオードのリセットと計測開始)、ｍｅａｓｕｒｅ(計測データのＡＤ変換)などの共通コマンドはリーダから一括して各検出層に送信される。各検出層からの信号はＵＩＤを使って個別に順次読み取る。
【００３１】
複数の検出層を制御してそれぞれの信号を検出する場合、各検出層に固有のＵＩＤが必要となる。ＵＩＤを付与する方法としては、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＰＲＯＭ（Ｐｒｏｇａｍｍａｂｌｅ ＲＯＭ）、乱数発生回路を用いることができる。PROMについては電気的に書き換えが可能なＥＥＰＲＯＭ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｅｒａｓａｂｌｅ Ｐｒｏｇａｍｍａｂｌｅ ＲＯＭ）、乱数発生回路としてはＭＯＳトランジスタの閾値ばらつきを利用する方式を用いることができる。
【実施例３】
【００３２】
他の実施例を図５（ｂ）により説明する。本実施例は１個の検査デバイスで複数の計測対照物をする手段を容易に提供することができる。反応層１０の中に第１の計測対象物に特異的に結合する抗体を固定化した抗体固定領域１４を形成し、さらに第２の計測対象物に特異的に結合する抗体を固定化した抗体固定領域１５を形成する。各抗体固定化領域に隣接して第１の検出層５１および第２の検出層５３を配置する。さらに抗体を固定化しないブランク部には検出層５２を配置する。第１の計測対象物からの信号は検出層５１とブランク部の検出層５２の差分、第２の計測対象物からの信号は検出層５３と検出層５２の差分をとって算出する。この場合、３つの検出層を同時に駆動する必要があるが、図９に示した２個の検出層の駆動の場合と同様に各検出層に固有のＵＩＤを用いた輻輳制御機能によって３個の検出層を駆動して、独立にデータを読み取るこが可能である。なお、３個以上の計測対象物についても、各々について検出層と計測対象物に特異的に結合する交代を固定化した領域とを新たに設置することによって対応できる。
【実施例４】
【００３３】
他の実施例を図１０により説明する。本発明からなる計測デバイスを構成する各層の保護性能、計測時の遮光性能、取扱の容易性を向上するため、フィルタ層１３、試薬層１１、検出層５０、反応層１０、吸収層１２の各層をケース(カバー)２０に収納する。試料はケースに設けられた試料導入部から添加する。ケースは検出層と外部の読み出しリーダとの通信を阻害しないように、樹脂等の誘電体材料たとえばポリエチレンテレフタレート、ＡＢＳ樹脂等で構成する。計測デバイスは上記の実施例に記載したデバイスと同様である。
【００３４】
本発明の計測デバイスをケースに収納する場合についての実施例を、さらに図１１および１２により説明する。検出層により化学発光を正確に計測するには、試料導入部２１からの外部光侵入を抑制する手段が必要になる。これに対し、光吸収性の染料をガラスファイバ、ＰＶＦ（ｐｏｌｙ ｖｉｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ｎｙｌｏｎなどの多孔質材料を遮光層２２を試料導入部２１に配置する。これにより、試料導入部２１から進入する光は、試料溶液の流れは妨げられず、試料導入部２１からケースの内側に進入した光が各層（１３、１１、１０、１２）において散乱されて検出層２２に到達して雑音源となることを抑制することができる。図１２は遮光性能を向上するケースの構造を示す。ケース２０の内側に試料導入部２１を囲むように凸部２３を設けることにより、ケース２０と遮光層２２の間隙にそって侵入する光を遮断することができる。また、テーパ形状を有する試料導入部２０を設けることでデバイスに導入する溶液の飛散を防止できる。また、図１１におけるケース２０を図１２のように２４と２５に分割することにより、積層構造部分の収納を容易に行うことが可能になる。
【実施例５】
【００３５】
他の実施例を図１５により説明する。計測デバイスは上記の実施例に記載したデバイスと同様である。図１５（ａ）に示すように、溶液流の制限層１８を設けることにより、１次抗体の固定領域に溶液流を集中して感度を向上することができる。制限層１８は、吸収層の少なくとも一部に面する層状部材である。さらには、抗体固定部１４に接さないように配置される。制限層は液体を浸透しない材料であって、分子吸着の少ない材料あるいは表面処理がなされていることが必要である。このような性質を有する材料としてたとえばポリエステルフィルム、ＰＶＣ（Ｐｏｌｙ ｖｉｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）フィルム等を用いることができる。
【００３６】
微量試料を計測する場合には、ブランク部を設けてブランク部の発光をさらに計測することができる。図１５（ｂ）に示すようにブランク部にも溶液流が集中するように溶液流制限層を設けることによりブランク部の洗浄効果が向上してバックグランド信号を低減することができる。
【実施例６】
【００３７】
図１７に、検出層として光センサだけでなく、温度センサ、ＩＳＦＥＴ（Ｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）センサを組み込んだ検出層を同時に利用する実施例の制御のフローを示す。計測デバイスは上記の実施例に記載したデバイスと同様である。各検出層の制御と信号の読み出しは図９で説明した複数の同種センサを搭載した検出層を用いる場合と同様に、ＵＩＤを用いて各検出層を識別することにより、ひとつのリーダで複数の検出層を制御することができる。本実施例の特徴は異なる物理量・化学量をひとつのリーダによって同時に計測することである。光センサによって免疫反応を使ったタンパク質計測を行いながら、温度およびｐＨを計測してその計測条件を明確にし、タンパク質計測結果を補正することが可能になる。ここで温度センサは半導体のバンドギャップの温度依存性によりダイオード特性が変化することを使って温度を計測する。図８の検出層の構造におけるセンサ６４の部分にｐｎ接合を使った温度計測部を形成することにより、計測した温度をディジタル化して外部に送信することができる。
【００３８】
ＩＳＦＥＴは、通常のＭＯＳトランジスタのゲート電極を試料溶液に接するようにしてここにイオン感応膜を堆積することによって形成する。温度センサの場合と同様に、図８の検出層の構造におけるセンサ６４の部分にＩＳＦＥＴを形成することにより、計測したｐＨをディジタル化して外部に送信することができる。ここで、図２０(ａ)に示すように検出層におけるセンサ、信号処理回路、通信回路の一部または全部を有機半導体で構成される検出層３８を導入する。有機半導体材料としては例えば比較的低分子量のペンタセン（例えば非特許文献７）、あるいは比較的項分量のポリチオフェン（例えば非特許文献８）などを用いることができる。
【００３９】
有機半導体による検出層３８の形成方法と材料構成について以下説明する。ＰＥＴ（poly ethylene terephthalate）やpolyesterなどフィルム５２上に前記半導体材料をグリニヤール法、電解重合、溶液塗布法や化学的気相成長法などによって堆積し、フォトリソグラフィー技術によってセンサ、信号処理回路、通信回路を含む層５１を形成する(図２０(ｂ))。図２０(ａ)の検出層３８は層５１とフィルム５２を合わせたものである。ここで実施例１の試薬層、検出層、反応層、吸収層の一部、あるいはすべてを共通のフィルム５２上の層５１に連続して堆積することにより、簡便かつ安価に検出デバイスを形成できる(図２０（ｃ）)。有機半導体は大面積のフィルム上に回路やセンサを形成できるため、製造コストの点で有利である。しかし、一般に有機半導体が形成されるフィルムには溶液透過性がないので、フィルムには図２１（ａ）のように溶液を透過させるためのスルーホール３９を形成する。上記各層の一部を別々のフィルム上に形成する場合には、同様に吸収層以外の層が形成されたフィルムにスルーホールを形成する。スルーホール３９の間隔d1は前記の基質の拡散長に対して同程度以下とすることが望ましい(図２１（ｂ）)。これにより、発光基質がメンブレンによって捕獲される割合を減らして基質の利用効率を向上し、発光強度を増大することができる。
【実施例７】
【００４０】
本実施例では、計測デバイスを全血試料計測関連に用いる例を記載する。ここでは特に、心筋梗塞のマーカして利用されているtroponinなどを全血試料から計測する例を検討する。
【００４１】
計測デバイスは上記の実施例の構成と同様の構成を基本とする。従来の目視によるイムノクロマトデバイスでは視認性の点から血球を除くことが必須であるが、本実施例では検出層による発光や電位によって免疫反応を計測するため、反応層における免疫反応は酵素反応が阻害されなければ血球除去は必須ではない。しかし、メンブレンの目詰まり防止の観点から本実施例においても血球を除去するフィルタ層を設けることが望ましい。血球フィルタ層４０を導入した計測デバイスの実施例を図２２に示す。血球フィルタ層４０は、試料の流路において試薬層よりも実質的に下流に配置される。ここで血球フィルタ層４０として、例えばＰＡＬＬ社製ＢＴＳを用いることができる（図２２）。前述のとおり計測は目視計測にたよらないため、反応層１０への着色汚染は問題とならず血球フィルタ性能の選定条件は緩和され、血球フィルタコストの点で有利である。
【００４２】
【非特許文献７】Ｙ．Ｙ．Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．：ＩＥＥＥ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．６０６−６０８（１９９７）．
【非特許文献８】Denise M. Wilson, Sean Hoyt, Jiri Janata, Karl Booksh and LouisObando, IEEE Sensors Journal, vol. 1,4, pp. 256-274,（ 2001）
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例１における反応分析キットの構成を示す図。
【図２】従来の反応分析キットの構成の一例を示す図。
【図３】発光試薬の拡散を示す図。
【図４】試薬の供給方法による効果を示す図。
【図５】複数の検出層を導入したときの本発明の実施例を示す図。
【図６】本発明の実施例を示す図。
【図７】本発明の実施例を示す図。
【図８】検出層の構造と通信の原理を示す図。
【図９】複数検出層の駆動と制御シーケンスを説明する図。
【図１０】検出デバイスのケース収納を説明する図。
【図１１】検出デバイスのケース収納を説明する図。
【図１２】検出デバイスのケース収納を説明する図。
【図１３】検出デバイスの構造を示す図。
【図１４】検出デバイスの構造を示す図。
【図１５】溶液の流れを制限する構造を示す図。
【図１６】本発明の実施例を示す図。
【図１７】本発明の制御シーケンスの一実施例を説明する図。
【図１８】本発明の検出層構造の一実施例を説明する図。
【図１９】発光基質CDP-starを使った場合の発光反応。
【図２０】フィルム上に形成した有機半導体を用いた検出層の構造を示す図。
【図２１】フィルム上に形成した有機半導体を用いた検出層の構造を示す図。
【図２２】血球除去フィルタを付加した検出デバイスの構造を示す図。
【符号の説明】
【００４４】
図において、１０：反応層、１１：試薬層、１２：吸収層、１３：フィルタ層、１４：抗体固定部（テスト部）、１５：抗体固定部（テスト部）、１６：試薬・試料の流れ、１７：試薬・試料の流れ、１８：溶液流の制限層、２０：ケース、２１：試料導入口、２２：遮光層、２３：ケース内側に設けられた遮光用の凸部、２４：ケース部品、３０：反応層、３１：試薬層、３３：フィルタ層、３４：抗体固定部（テスト部）、３５：メンブレン中の試薬・試料溶液の流れ、３６：メンブレン中の試薬・試料溶液の流れ、３７：メンブレン中の試薬・試料溶液の流れ、３８：有機半導体検出層、３９：スルーホール、４０：血球フィルタ層、４１：抗原、４２：抗体、４３：酵素、４４：発光基質、４５：試料溶液、４６：発光基質溶液、４７：血球、５０：検出層、５１：検出層を構成する有機半導体で形成された回路やセンサを含む層、５２：フィルム、５３：試薬層、６０：検出層、６１：通信回路、６２：通信処理回路、６３：信号処理回路、６４：センサ、６５：ＵＩＤ格納部、６６：補正データ収納部、７０：リーダ、７１：リーダコイル、７２：検出層からリーダに送信される信号、７３：リーダから検出層に送られる信号、７４：チップコイル：７５：共振用容量、７６：磁力線、８０：制御用PC、８１：ｉｎｖｅｎｔｏｒｙコマンド、８２：ｐｒｅ−ｃｈａｒｇｅコマンド、８３：ｍｅａｓｕｒｅコマンド、８４：readコマンド、85:readコマンド、８６：検出層１に固有のＵＩＤ、８７：検出層１における信号蓄積期間、８８：検出層１におけるＡ−Ｄ変換期間、８９：検出層１から送信される計測データ、９０：検出層２に固有のＵＩＤ、９１：検出層２における信号蓄積期間、９２：検出層２におけるＡ−Ｄ変換期間、９３：検出層２から送信される計測データ、を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象物質と特異的に結合する第1抗体を保持する保持領域を備える第１膜と、
前記保持領域と対面して設置される検出層と、
前記検査対象物質と特異的に結合する第２抗体を一部に保持する第2膜とを有する分析デバイス。
【請求項２】
前記検出層は、前記第１膜と前記第２膜の間に位置する請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項３】
前記第1膜と対面して設置され、液体に対して吸収性を有する第3膜をさらに有し、前記検出層は、前記第２膜と前記第３膜との間に位置する請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項４】
前記第１抗体は、化学発光を触媒する酵素が結合されていることを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項５】
前記第１膜は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリジンフルオライドのいずれかを含むことを特徴とする請求項４に記載の分析デバイス。
【請求項６】
前記検出層は、有機あるいは無機の半導体材料を有することを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項７】
前記検出層は、フォトダイオード、フォトトランジスタ、フォトセル、ＦＥＴのいずれかを含むことを特徴とする請求項１に記載の分析デバイス。
【請求項８】
前記検出層は、液体に対して非浸透性を有することを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項９】
前記第1膜と対面して設置され、液体に対して吸収性を有する第3膜をさらに有することを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項１０】
前記検出層は、フォトダイオード、信号処理回路、及び通信回路を具備する集積回路であることを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項１１】
前記保持領域を複数有しかつ前記検出層を複数有し、複数の前記検出層は、複数の前記保持領域の少なくとも２つに対面して設置されることを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項１２】
複数の前記保持領域は、各々異なる抗体を前記第１抗体として保持することを特徴とする請求項６に記載の分析デバイス。
【請求項１３】
前記第１膜及び前記第２膜とを囲むカバーをさらに有することを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項１４】
前記第３膜の少なくとも一部に対面する層状部材をさらに有することを特徴とする請求項４に記載の分析デバイス。
【請求項１５】
前記層状部材は、液体について非浸透性であることを特徴とする請求項１４に記載の分析デバイス。
【請求項１６】
検査対象物質と特異的に結合する第1抗体を保持する保持領域を備える第１膜と、前記保持領域と対面して設置され、通信回路を備える検出層と、前記検査対象物質と特異的に結合する第２抗体を一部に保持する第2膜とを有するデバイスと、
前記デバイスと情報を送受信するリーダライタと、
前記リーダライタと接続する制御機とを有する分析システム。
【請求項１７】
前記デバイスを囲むカバーをさらに有することを特徴とする請求項１６に記載の分析システム。
【請求項１８】
前記フォトダイオード、信号処理回路、及び通信回路を具備する集積回路の全部または一部が有機半導体で構成されることを特徴とする請求項１０に記載の分析デバイス。
【請求項１９】
前記検査対象物質の流路において、前記第2膜よりも実質的に下流に配置される血球フィルタ層をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の分析デバイス。
【請求項１】
検査対象物質と特異的に結合する第1抗体を保持する保持領域を備える第１膜と、
前記保持領域と対面して設置される検出層と、
前記検査対象物質と特異的に結合する第２抗体を一部に保持する第2膜とを有する分析デバイス。
【請求項２】
前記検出層は、前記第１膜と前記第２膜の間に位置する請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項３】
前記第1膜と対面して設置され、液体に対して吸収性を有する第3膜をさらに有し、前記検出層は、前記第２膜と前記第３膜との間に位置する請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項４】
前記第１抗体は、化学発光を触媒する酵素が結合されていることを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項５】
前記第１膜は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリジンフルオライドのいずれかを含むことを特徴とする請求項４に記載の分析デバイス。
【請求項６】
前記検出層は、有機あるいは無機の半導体材料を有することを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項７】
前記検出層は、フォトダイオード、フォトトランジスタ、フォトセル、ＦＥＴのいずれかを含むことを特徴とする請求項１に記載の分析デバイス。
【請求項８】
前記検出層は、液体に対して非浸透性を有することを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項９】
前記第1膜と対面して設置され、液体に対して吸収性を有する第3膜をさらに有することを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項１０】
前記検出層は、フォトダイオード、信号処理回路、及び通信回路を具備する集積回路であることを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項１１】
前記保持領域を複数有しかつ前記検出層を複数有し、複数の前記検出層は、複数の前記保持領域の少なくとも２つに対面して設置されることを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項１２】
複数の前記保持領域は、各々異なる抗体を前記第１抗体として保持することを特徴とする請求項６に記載の分析デバイス。
【請求項１３】
前記第１膜及び前記第２膜とを囲むカバーをさらに有することを特徴とする請求項1に記載の分析デバイス。
【請求項１４】
前記第３膜の少なくとも一部に対面する層状部材をさらに有することを特徴とする請求項４に記載の分析デバイス。
【請求項１５】
前記層状部材は、液体について非浸透性であることを特徴とする請求項１４に記載の分析デバイス。
【請求項１６】
検査対象物質と特異的に結合する第1抗体を保持する保持領域を備える第１膜と、前記保持領域と対面して設置され、通信回路を備える検出層と、前記検査対象物質と特異的に結合する第２抗体を一部に保持する第2膜とを有するデバイスと、
前記デバイスと情報を送受信するリーダライタと、
前記リーダライタと接続する制御機とを有する分析システム。
【請求項１７】
前記デバイスを囲むカバーをさらに有することを特徴とする請求項１６に記載の分析システム。
【請求項１８】
前記フォトダイオード、信号処理回路、及び通信回路を具備する集積回路の全部または一部が有機半導体で構成されることを特徴とする請求項１０に記載の分析デバイス。
【請求項１９】
前記検査対象物質の流路において、前記第2膜よりも実質的に下流に配置される血球フィルタ層をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の分析デバイス。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２９２３８２（Ｐ２００８−２９２３８２Ａ）
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３９９２２（Ｐ２００７−１３９９２２）
【出願日】平成１９年５月２８日（２００７．５．２８）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２８日（２００７．５．２８）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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