生体内でヒト肝細胞を増大させる方法
フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）がさらに欠損している免疫不全マウスを用いて、生体内でヒト肝細胞を増大させる方法を、本明細書に記載する。該方法は、該免疫不全およびＦａｈ欠損マウスにヒト肝細胞を移植するステップと、該肝細胞を増大させるステップと、増大させた該ヒト肝細胞を採取するステップと、を含む。該方法はまた、二次、または三次、または四次、または追加次のマウスへの、該ヒト肝細胞の連続移植も可能にする。また、Ｆａｈ、Ｒａｇ２、およびＩｌ２ｒｇ遺伝子において、ホモ接合体欠失または点変異を含む、変異体マウスも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許の相互参照
本願は、２００７年６月５日に出願された米国暫定特許出願第６０／９３３，４３２号の利益を主張するものであり、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の声明
本発明は、米国立衛生研究所の国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所からの授与番号ＤＫ０５１５９２に基づいて、米国政府の支援でもってなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、ヒト肝細胞を増大させる方法、具体的には、免疫不全マウスを利用して、ヒト肝細胞を増大させる方法を目的とする。
【背景技術】
【０００４】
肝臓は、医薬を含む生体異物化合物を代謝する主要な部位である。多くの肝酵素が種特異的であるため、培養された一次ヒト肝細胞またはそれらのミクロソーム分画を用いて、候補医薬の代謝を評価することが必要である（非特許文献１、非特許文献２）。ミクロソーム肝細胞分画を用いて、一部の代謝機能を解明することができる一方、他の試験は、生きている肝細胞に依存する。例えば、一部の化合物は、肝酵素を誘導し、ひいては、それらの代謝は、経時的に変化する。酵素誘導を分析するために、肝細胞は、生存能力があるだけでなく、十分に分化し、かつ機能的でなければならない。
【０００５】
薬物代謝および他の研究に関しては、肝細胞は、一般に、死体臓器ドナーから単離し、試験が行われる場所に輸送される。死体源からの肝細胞の状態（生存能力および分化の状態）は、極めて変わりやすく、多くの細胞調製物の品質は、あまり良くない。高品質のヒト肝細胞の利用可能性は、組織培養において有意に増大することができないという事実によりさらに妨げられる（非特許文献３、非特許文献４）。播種した後、該細胞は、生存するが、分裂しない。マウス等のすぐに利用できる哺乳類種からの肝細胞は、代謝酵素の異なる相補体を有し、誘導研究において異なって反応するため、薬物試験には適さない。不死化ヒト肝細胞（肝細胞腫）または胎児肝芽細胞も、十分に分化した成熟細胞の適切な代用物ではない。ヒト肝細胞はまた、微生物学の分野における研究に必要である。肝炎を生じるウイルス等の多くのヒトウイルスは、任意の他の細胞型で複製することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｒａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８９：２３３−２４６，２００３
【非特許文献２】Ｇｏｍｅｚ−Ｌｅｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．４：２９２−３１２，２００３
【非特許文献３】Ｒｕｎｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７４：１−３，２０００
【非特許文献４】Ｃａｓｃｉｏ Ｓ．Ｍ．，Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ ２５：５２９−５３８，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの限界を考えると、一次ヒト肝細胞を増大させる方法が、非常に望ましい。よって、ヒト肝細胞を増大させるための堅牢なシステムを本明細書に提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
生体内でヒト肝細胞を増大させる方法を本明細書に提供する。該方法は、免疫不全マウスに単離したヒト肝細胞を注入するステップと、該肝細胞を増大させるステップと、該ヒト肝細胞を採取するステップと、を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ヒト肝細胞は、免疫不全受容マウスに投与され、該マウスは、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）がさらに欠損している。一部の実施形態において、該マウスは、Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）マウスである。他の実施形態において、該マウスは、Ｆａｈｐｍ／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦｐｍＲＧ）マウスである。該方法の一部の実施形態において、ヒトウロキナーゼをコード化するベクターが、ヒト肝細胞の注入前、マウスに投与される。他の実施形態において、マクロファージは、肝細胞注入前、マウスから減損させる。
【００１０】
一部の実施例において、該ヒト肝細胞は、ＦＲＧマウスまたはＦｐｍＲＧマウスのような受容マウスにおいて、少なくとも約２週間、増大する。その増大させたヒト肝細胞は、該受容マウスから採取される。一実施形態において、その単離されたヒト肝細胞は、該受容マウスの脾臓に注入され、その増大させたヒト肝細胞は、該マウスの肝臓から採取される。その採取された肝細胞は、さらなる増大のために、ＦＲＧマウスまたはＦｐｍＲＧマウスのような別の受容マウスに導入することができる。よって、該方法は、ヒト肝細胞の追加の増大のために繰り返して使用することができる。
【００１１】
本明細書に提供される方法の一実施形態において、Ｆａｈ欠損マウスに、肝細胞注入前、肝臓疾患の発症を阻害、または予防、または遅延する薬剤が投与される。このような一薬剤は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）である。ＮＴＢＣ、または他の適した薬剤は、飲料水内投与、食物内投与、または注入が挙げられるが、これらに限定されない、任意の適した手段により投与することができる。ＮＴＢＣは、任意に、肝細胞注入後、少なくとも約３日間から少なくとも約６日間投与される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ヒト肝細胞は、臓器ドナーから、または外科的切除術の肝臓から得られる。一部の実施形態において、該ヒト肝細胞は、幹細胞に由来する。追加の実施形態において、ヒト肝細胞は、注入前、凍結保存される。さらなる実施形態において、該ヒト肝細胞は、肝細胞の細胞株からのものである。
【００１３】
また、遺伝子組み換えマウスであって、そのゲノムは、欠失または点変異が、機能的ＦＡＨ、ＲＡＧ−２、およびＩＬ−２Ｒγタンパク質の発現の喪失をもたらすような、Ｆａｈ、Ｒａｇ２、およびＩｌ２ｒｇ遺伝子において、該欠失または点変異がホモ抱合体であり、該マウスは、免疫不全であり、肝機能の低下を示し、ヒト肝細胞を、該マウスに増大させることができる、遺伝子組み換えマウスを、本明細書に提供する。一実施形態において、該欠失は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の完全喪失をもたらす。別の実施形態において、該マウスは、ヒトウロキナーゼを発現する。
【００１４】
前述ならびに他の特性および利点は、いくつかの以下の実施形態の発明を実施するための形態からさらに明らかになり、添付の図を参照して進める。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】ヒト肝細胞により生着および再増殖した後、三重変異体ＦＲＧマウス（＃４７１）および２匹のヘテロ接合同腹子（＃４６９、＃４７０）の相対的重量を示すグラフ。該ＦＲＧマウスは、移植後６週間、その体重を維持したが、Ｉｌ２ｒｇ遺伝子のヘテロ接合同腹子は、継続的に減量した。ＮＴＢＣは、第１週目および第４週目にのみ投与され、陰影で示す。
【図１ｂ】肝細胞受容肝臓からのゲノムＤＮＡにおけるヒトＡｌｕ配列のＰＣＲ増幅産物を示すゲルのデジタル画像。ＦＲＧマウスのみが陽性であった。
【図１ｃ】野生型（図１ｃ）のＦＡＨ酵素活性を示すグラフ。ＦＡＨ基質濃度は、野生型マウス肝臓において低下したが、Ｆａｈ−／−マウス肝臓では変化しなかった。ヒト化マウス肝臓は、十分な酵素活性を示した。
【図１ｄ】Ｆａｈ（−／−）（図１ｄ）のＦＡＨ酵素活性を示すグラフ。ＦＡＨ基質濃度は、野生型マウス肝臓において低下したが、Ｆａｈ−／−マウス肝臓では変化しなかった。ヒト化マウス肝臓は、十分な酵素活性を示した。
【図１ｅ】ヒト化マウス肝臓（図１ｅ）のＦＡＨ酵素活性を示すグラフ。ＦＡＨ基質濃度は、野生型マウス肝臓において低下したが、Ｆａｈ−／−マウス肝臓では変化しなかった。ヒト化マウス肝臓は、十分な酵素活性を示した。
【図１ｆ】８０％を超える肝細胞がＦＡＨに対して陽性であることを示す（暗染および大きな矢印により示される）、再増殖したマウス肝臓におけるＦＡＨ免疫染色のデジタル画像。小さい矢印は、ＦＡＨ陰性細胞を画定する。
【図１ｇ】ヒト肝細胞は、好酸性が低いことを示す（矢印により示される）、同一の肝切片のＨ＆Ｅ染色のデジタル画像。原拡大率×２００
【図２ａ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ＦＡＨ陽性ヒト肝細胞は、マウス肝臓組織に統合したが、受容者の肝臓微細構造を阻害しなかったことを示すデジタル画像。
【図２ｂ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。高度に再増殖したキメラ肝臓はまた、正常構造を持つことを示すデジタル画像。
【図２ｃ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ヒト肝細胞クラスターは、好酸性が低いことを示すＨ＆Ｅ染色のデジタル画像。
【図２ｄ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ヒト肝細胞クラスターは、好酸性が低いことを示すＨ＆Ｅ染色のデジタル画像。
【図２ｅ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ＦＡＨの染色した連続切片を示すデジタル画像。
【図２ｆ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ＨｅｐＰａｒの染色した連続切片を示すデジタル画像。
【図２ｇ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。移植してから４ヶ月後でさえ、管状または糸球体の破壊がないことを示す、高度に再増殖したマウスからの腎臓切片のデジタル画像。
【図２ｈ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。脾臓におけるＦＡＨ陽性ヒト肝細胞を示すデジタル画像。原拡大率×１００（図２ｃ）、×２００（図１ａ、２ｂ、２ｅ、２ｆ、および２ｇ）、×４００（図２ｄおよび２ｈ）。
【図３ａ】キメラマウス肝臓からのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す、一連のゲル切片。ヒトＡＬＢ、ＦＡＨ、ＴＡＴ、ＴＦ、ＴＴＲ、およびＵＧＴ１Ａ１遺伝子を、キメラマウス肝臓（＃６９７および＃７８５）において発現させた。ヒト肝細胞およびマウス肝細胞はそれぞれ、陽性および陰性対照として用いた。
【図３ｂ】図３ｂ（正常プロット）は、ＥＬＩＳＡを用いて、一次肝細胞受容者のヒトアルブミン血中濃度を示すグラフである。システムの閾値濃度は、約０．００５μｇ／ｍｌである。
【図３ｃ】図３ｃ（対数プロット）は、ＥＬＩＳＡを用いて、一次肝細胞受容者のヒトアルブミン血中濃度を示すグラフである。システムの閾値濃度は、約０．００５μｇ／ｍｌである。
【図３ｄ】図３ｄ（正常プロット）は、二次受容者のヒトアルブミン濃度を示すグラフである。対数プロットは、アルブミン濃度の倍加時間が約１週間であることを示す。
【図３ｅ】図３ｅ（対数プロット）は、二次受容者のヒトアルブミン濃度を示すグラフである。対数プロットは、アルブミン濃度の倍加時間が約１週間であることを示す。
【図４ａ】一次細胞（極左の暗ボックス）を始めとして連続移植スキームを示す概略図。暗ボックスは、再増殖した連続受容者を示し、白ボックスは、非生着マウスを示す。一次受容者の１／４のみが、再増殖されたが、６匹すべての二次受容者が、生着された。
【図４ｂ】連続的に移植された受容者の肝臓からのＡｌｕ配列のＰＣＲ増幅産物を示すゲルのデジタル画像。
【図４ｃ】三次マウスから培養された７０％を超える肝細胞が、ＦＡＨに対して陽性であったことを実証するＦＡＨ免疫細胞化学により解析された肝細胞のデジタル画像。
【図４ｄ】三次マウスから培養された７０％を超える肝細胞が、ＦＡＨに対して陽性であったことを実証するＦＡＨ免疫細胞化学により解析された肝細胞のデジタル画像。
【図４ｅ】三次マウスから培養された７０％を超える肝細胞が、ＦＡＨに対して陽性であったことを実証するＦＡＨ免疫細胞化学により解析された肝細胞のデジタル画像。
【図４ｆ】連続的に移植されたマウス肝臓のＦＡＨ免疫組織化学を示す、組織切片のデジタル画像。一次（図４ｆ）受容者の肝臓が、ヒト肝細胞により再増殖された。
【図４ｇ】連続的に移植されたマウス肝臓のＦＡＨ免疫組織化学を示す、組織切片のデジタル画像。二次（図４ｇ）受容者の肝臓が、ヒト肝細胞により再増殖された。
【図４ｈ】連続的に移植されたマウス肝臓のＦＡＨ免疫組織化学を示す、組織切片のデジタル画像。三次（図４ｈ）受容者の肝臓が、ヒト肝細胞により再増殖された。
【図５ａ】キメラマウス肝細胞の抗マウスアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。キメラ肝臓からのほとんどの肝細胞は、マウスアルブミンまたはＦＡＨ単一陽性であった。
【図５ｂ】キメラマウス肝細胞の抗マウスアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。キメラ肝臓からのほとんどの肝細胞は、マウスアルブミンまたはＦＡＨ単一陽性であった。
【図５ｃ】キメラマウス肝細胞の抗マウスアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。キメラ肝臓からのほとんどの肝細胞は、マウスアルブミンまたはＦＡＨ単一陽性であった。
【図５ｄ】キメラマウス肝細胞の抗ヒトアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。ほとんどの肝細胞は、ヒトアルブミンおよびＦＡＨ二重陽性であった。原拡大倍率×１００。
【図５ｅ】キメラマウス肝細胞の抗ヒトアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。ほとんどの肝細胞は、ヒトアルブミンおよびＦＡＨ二重陽性であった。原拡大倍率×１００。
【図５ｆ】キメラマウス肝細胞の抗ヒトアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。ほとんどの肝細胞は、ヒトアルブミンおよびＦＡＨ二重陽性であった。原拡大倍率×１００。
【図５ｇ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（図５ｇ）に対する対照ヒト肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｈ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。Ｈ−２Ｋｂ（図５ｈ）に対する対照ヒト肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｉ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（図５ｉ）に対する対照マウス肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｊ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。Ｈ−２Ｋｂ（図５ｊ）に対する対照マウス肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｋ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。高キメラマウス（図５ｋ）からの肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｌ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。高キメラマウス（図５ｌ）からの肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図６ａ】エトキシレソルフィン−Ｏ−デエチラーゼ（ＣＹＰ１Ａ１依存）の代謝（図６ａ）を示すグラフ。ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスから培養された肝細胞を分析した。
【図６ｂ】６−β−ヒドロキシルテストステロン（ＣＹＰ３Ａ４媒介）へのテストステロンの転換（図６ｂ）を示すグラフ。ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスから培養された肝細胞を分析した。
【図６ｃ】定量的ＲＴ−ＰＣＲにより判定される、薬物代謝、薬物移送、および薬物抱合に関する、ヒト特異遺伝子のｍＲＮＡレベルを示すグラフ。ヒト薬物代謝遺伝子の比率は、成熟ヒト肝細胞に特有である。
【図７ａ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。マウスアクチンｍＲＮＡに対して正規化した、３つの試料における肝臓特異的遺伝子の基底発現の棒グラフ。
【図７ｂ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＣＹＰ３Ａ４（図７ｂ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｃ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＣＹＰ２Ｂ６（図７ｃ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｄ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＣＡＲ（核ホルモン受容体）（図７ｄ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｅ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＭＤＲ１（輸送体）（図７ｅ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｆ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＭＲＰ（図７ｆ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｇ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＢＳＥＰ（輸送体）（図７ｇ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｈ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＰＸＲ（核ホルモン受容体）（図７ｈ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ｉ． 略語
ＡＡＶ アデノ随伴ウイルス
ＡＬＢ アルブミン
ＡＬＴ アラニン・アミノトランスフェラーゼ
ＡＳＴ アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
ＢＮＦ ベータナフトフラボン
ＤＡＢ ジアミノベンジジン
ＥＬＩＳＡ 酵素免疫測定法
ＥＲＯＤ エトキシレソルフィン−Ｏ−デエチラーゼ
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞分類
ＦＡＨ フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ
ＦＩＳＨ 蛍光原位置ハイブリダイゼーション
ＦＩＴＣ フルオレセインイソチオシアネート
ＦＲＧ Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−三重変異体マウス
ＨＬＡ ヒト白血球抗原
ＩＬ−２Ｒγ インターロイキン２受容体γ
ＭＨＣ 主要組織適合性複合体
ＮＴＢＣ ２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３ シクロヘキサンジオン
ＰＢ フェノバルビタール
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥ フィコエリトリン
ＰＦＵ プラーク形成単位
ＲＡＧ リコンビナーゼ活性化遺伝子
Ｒｉｆ リファンピシン
ＲＴ−ＰＣＲ 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＴＡＴ チロシンアミノ転移酵素
ＴＦ トランスフェリン
ＴＴＲ トランスサイレチン
ＵＧＴ１Ａ１ ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１
ｕＰＡ ウロキナーゼプラミノーゲン活性化因子
ＩＩ． 用語
別途記載のない限り、技術用語は、従来の用法に準拠して使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓより出版、１９９４（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）、およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．より出版、１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）において見出すことができる。
【００１７】
本発明の種々の実施形態の概説を容易にするために、具体的な用語の以下の説明を提供する。
【００１８】
肝臓疾患の発症を阻害するまたは予防する薬剤：ＦＲＧマウス, またはＦｐｍＲＧマウス、または他の型のＦａｈ欠損マウスに投与される場合、マウスにおける肝臓疾患の発症を予防、または遅延、または阻害する化合物または組成物。肝臓疾患または肝機能障害は、肝組織像の変化（壊死、炎症、異形成、または肝臓癌等）、肝臓特異的酵素および他のタンパク質（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニン・アミノトランスフェラーゼ、ビリルビン、アルカリフォスファターゼ、およびアルブミン等）のレベルの変化、または全身性肝不全が挙げられるが、これらに限定されない、兆候または症状のうちのいずれか１つにより特徴付けられる。一実施形態において、肝臓疾患を阻害する薬剤は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）である。
【００１９】
羊膜細胞：胎児を取り囲む羊水中に見られる細胞。
【００２０】
抗体：免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にコード化された１つもしくは複数のポリペプチドを含むタンパク質（またはタンパク質複合体）。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖はガンマ、またはミュー、またはアルファ、またはデルタ、またはイプシロンに分類され、同様に、各々ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの免疫グロブリンを表す。
【００２１】
基本的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、通常、テトラマーである。各々のテトラマーは、２つの同一のペアのポリペプチド鎖から成り、各々のペアは、１つの「軽い」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重い」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各々の鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を定義する。「可変軽鎖」（ＶＬ）および「可変重鎖」（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００２２】
本明細書に使用される、「抗体」という用語は、完全な免疫グロブリン、ならびによく特徴付けられたフラグメントをいくつか含む。例えば、標的タンパク質（またはタンパク質または融合タンパク質内のエピトープ）に結合するＦａｂｓ、Ｆｖｓ、および一本鎖Ｆｖｓ（ＳＣＦｖｓ）は、そのタンパク質（またはエピトープ）のための特異的結合剤でもある。これらの抗体フラグメントは、以下のように定義される。（１）Ｆａｂ、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部分を産生するために、酵素パパインによる全抗体の消化により生成された抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメント、（２）Ｆａｂ’、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部分を産生するために、ペプチンで全抗体を処理し、次いで、還元することにより得られる、抗体分子のフラグメント、（３）（Ｆａｂ’）２、後続の還元を伴わずに酵素ペプチンで全抗体を処理することにより得られる、抗体のフラグメント、（４）Ｆ（ａｂ’）２、２個のジスルフィド結合により２つのＦａｂ’フラグメントが一緒にされた二量体、（５）Ｆｖ、２本の鎖として発現された軽鎖の可変域および重鎖の可変域を含む遺伝子組み換えフラグメント、および（６）１本鎖抗体、遺伝子融合１本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーにより連結された、軽鎖の可変域、重鎖の可変域を含む遺伝子組み換え分子, として定義される。これらのフラグメントを作製する方法は、日常的である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９を参照）。
【００２３】
本開示の方法に用いられる抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。単に一例として、モノクローナル担体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎの古典的方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７，１９７５）またはその誘導的な方法に従って、ネズミハイブリドーマから調製することができる。モノクローナル抗体生成のための詳細な手順は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。
【００２４】
Ｂ細胞：体液性免疫反応に大きな役割を果たすリンパ球の一型。Ｂ細胞の主要機能は、可溶性抗原に対して抗体を作製することである。Ｂ細胞は、適応免疫系の不可欠な要素である。
【００２５】
採取：本明細書に使用される増大されたヒト肝細胞を「採取する（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ）」とは、単離されたヒト肝細胞を注入されているマウス（または受容マウスとも称される）から増大された肝細胞を除去するプロセスをさす。採取は、任意に、肝細胞を他の細胞型から分離することを含む。一実施形態において、その増大されたヒト肝細胞は、Ｆａｈ欠損マウスの肝臓から採取される。一部の例において、その増大されたヒト肝細胞は、ＦＲＧマウスまたはＦｐｍＲＧマウスの肝臓から採取される。
【００２６】
インターロイキン受容体の一般的なγ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）：インターロイキン受容体の一般的なガンマ鎖をコード化する遺伝子。Ｉｌ２ｒｇは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を含む、いくつかのインターロイキンに対する受容体の構成要素である（Ｄｉ Ｓａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：３７７−３８１，１９９５）。Ｉｌ２ｒｇの欠損した動物は、Ｂ細胞およびＴ細胞の減少を示し、ナチュラルキラー細胞が欠如する。
【００２７】
凍結保存：本明細書に使用される「凍結保存」とは、７７Ｋまたは−１９６℃（液体窒素の沸点）等の低い氷点下の温度まで冷却することにより保存または維持されている細胞または組織を指す。これらの低温度で、細胞死をもたらす生化学的反応を含む、いかなる生物学的活性も、効果的に停止する。
【００２８】
肝機能の低下：肝臓の健康または機能を測定する多くのパラメータのうちのいずれか１つの異常変化。肝機能の低下はまた、本明細書では、「肝機能障害」と称される。肝機能は、肝組織像の検査および肝臓酵素または他のタンパク質の測定等に限定されない、当技術分野で周知のような多くの手段のうちのいずれか１つにより評価することができる。例えば、肝機能障害は、肝臓の壊死、または炎症、または酸化的損傷、または異形成で示され得る。一部の例において、肝機能障害は、肝細胞癌等の肝臓癌で示される。肝機能障害を評価するために試験され得る肝臓酵素およびタンパク質の例としては、アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン、アルカリフォスファターゼ、およびアルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。肝機能障害はまた、全身性肝不全をもたらし得る。肝機能を試験するための手順は、Ｇｒｏｍｐｅら（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）およびＭａｎｎｉｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１１９２８−１１９３３，１９９９）により教示されるもの等、当技術分野で周知であり、それらは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００２９】
欠損：本明細書に使用される「Ｆａｈ欠損」または「Ｆａｈの欠損」とは、Ｆａｈの突然変異を含む、マウス等の動物を指し、それは、Ｆａｈ ｍＲＮＡ発現および／または機能的ＦＡＨタンパク質の実質的減少、またはその欠損をもたらす。一実施形態において、該Ｆａｈ欠損動物は、Ｆａｈ遺伝子のホモ接合体欠失を含む。一例として、該ホモ接合体欠失は、Ｆａｈのエクソン５にある。別の実施形態において、該Ｆａｈ欠損動物は、Ｆａｈ遺伝子の１つもしくは複数の点変異を含む。適切なＦａｈ点変異の例は、当技術分野で知られている（例えば、Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（２）：６４１−６４５，２００１参照、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００３０】
減損する：減じるまたは除去すること。本明細書に使用される「マクロファージ減損」とは、動物におけるマクロファージを消去する、または除去する、または減じる、または殺滅するプロセスを指す。マクロファージが減損している動物は、必ずしもマクロファージが完全に欠如しているとは限らないが、少なくともマクロファージの数または活性の減少を示す。一実施形態において、マクロファージ減損は、機能的マクロファージの少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または１００％の減少をもたらす。
【００３１】
生着する：動物に細胞または組織を移植すること。本明細書に使用される、受容マウスにおいて、ヒト肝細胞の生着とは、注入後、ヒト肝細胞が受容マウスに移植されるプロセスを指す。生着されたヒト肝細胞は、受容マウスにおいて、増大することができる。本明細書に記載される、「有意な生着」とは、肝臓において、少なくとも約１％の肝細胞がヒト肝細胞である、受容マウスを指す。「高度に生着された」マウスは、肝細胞の少なくとも約３０％がヒト肝細胞である、肝臓を有するマウスである。しかしながら、生着効率はさらに高くなり得、マウス肝臓において、例えば、肝細胞の少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％がヒト肝細胞である。
【００３２】
胚幹（ＥＳ）細胞：発達する胚盤胞の内細胞塊から単離された多能性細胞。ＥＳ細胞は、多能性細胞であり、それらが、体内（骨、筋肉、脳細胞等）に存在するすべての細胞を作製することができることを意味する。ネズミＥＳ細胞を産生するための方法は、米国特許第５，６７０，３７２号に見出され得、参照することにより本明細書に組み込まれる。ヒトＥＳ細胞を産生するための方法は、米国特許第６，０９０，６２２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ ００／７００２１号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ ００／２７９９５号に見出され得、これらのそれぞれが、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００３３】
増大させる：量を増加させること。本明細書に使用される、ヒト肝細胞を「増大させる（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」とは、ヒト肝細胞の数が増加するような、細胞分裂を生じることが可能なプロセスを指す。本明細書に記載される、ヒト肝細胞は、受容マウスにおいて、少なくとも約４週間、または少なくとも約６週間、または少なくとも約８週間、または少なくとも約１２週間、または少なくとも約１６週間、または少なくとも約２０週間、または少なくとも約２４週間、または少なくとも約２８週間、増大可能である。一実施形態において、該ヒト肝細胞は、最長約６ヶ月まで増大可能である。増大から結果として生じるヒト肝細胞の数は、変化し得る。一実施形態において、増大は、少なくとも１，０００万、または少なくとも２，０００万、または少なくとも３，０００万、または少なくとも４，０００万、または少なくとも５，０００万の肝細胞をもたらす。１００万の肝細胞が最初に注入され、約１０％生着されると仮定すると、肝細胞の増大は、約１０倍〜約５００倍の範囲であり得る。一部の実施形態において、受容マウスにおいて、ヒト肝細胞の増大は、少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも１５０倍、または少なくとも２００倍、または少なくとも２５０倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも４００倍、または少なくとも５００倍、または少なくとも１，０００倍の増加をもたらす。
【００３４】
ＦＲＧマウス：フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）、リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）、およびインターロイキン受容体の共通γ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子において、ホモ接合体欠失を有する、変異体マウス。また、本明細書では、Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−と称される。本明細書に使用される、Ｆａｈ、Ｒａｇ２、およびＩｌ２ｒｇ遺伝子においてホモ接合体欠失は、機能的ＦＡＨ、ＲＡＧ−２、およびＩＬ−２Ｒγタンパク質が、突然変異を含むマウスに発現しないことを示す。
【００３５】
ＦｐｍＲＧマウス：リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）、およびインターロイキン受容体の共通γ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子のホモ接合体欠失、ならびにフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）のホモ接合体点変異を有する、変異体マウス。ＦｐｍＲＧマウスのＦａｈ遺伝子の点変異は、ｍＲＮＡにおいて、エクソン７のミススプライシングおよび喪失をもたらす（Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６４１−６４５，２００１）。また、本明細書では、Ｆａｈｐｍ／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−と称される。本明細書に使用される、Ｒａｇ２およびＩｌ２ｒｇ遺伝子のホモ接合体欠失は、機能的ＲＡＧ−２およびＩＬ−２Ｒγタンパク質が、該突然変異を含むマウスに発現しないことを示す。さらに、Ｆａｈ遺伝子のホモ接合体の点変異を有するマウスは、機能的ＦＡＨタンパク質を発現しない。
【００３６】
フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）：チロシン異化の最終ステップに触媒作用を及ぼす代謝酵素。Ｆａｈ遺伝子のホモ接合体欠失を有するマウスは、肝ｍＲＮＡ発現の変化および重度の肝機能障害を示す（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３、参照することにより本明細書に組み込まれる）。該Ｆａｈ遺伝子の点変異はまた、肝不全および出生後の致死を生じることも示している（Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（２）：６４１−６４５，２００１、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００３７】
漸減させる：本明細書に使用される、ＮＴＢＣの用量を「漸減する」とは、数日にわたるような時間とともに、Ｆａｈ欠損マウスに投与されるＮＴＢＣの用量を漸減するプロセスを指す。一実施形態において、該ＮＴＢＣ用量は、約６日間にわたり、漸減し、該用量は、約１週間後、ＮＴＢＣがもはや投与されなくなるように、約１または２日間間隔で減少する。ＮＴＢＣの漸減は、短期間または長期間にわたり行うことができ、用量の減少の間の時間間隔もまた、短くする、または長くすることができる。
【００３８】
肝細胞：肝臓の細胞質塊のうちの７０〜８０％まで作製する細胞型。肝細胞は、タンパク質合成、タンパク質保存、および炭水化物の形質転換、コレステロール、胆汁塩、およびホスホリン脂質の合成、ならびに外因性および内因性物質の解毒、修飾、および排出に関与する。該肝細胞はまた、胆汁の形成および分泌も引き起こす。肝細胞は、血清アルブミン、フィブリノゲン、および凝固因子のプロトロンビン基を製造し、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、相補体、および糖タンパク質の合成のための主部位である。さらに、肝細胞は、薬物および殺虫剤のような外因性化合物、およびステロイドのような内因性化合物を代謝する、解毒する、および不活性化する能力を有する。
【００３９】
ホモ接合：１つもしくは複数の遺伝子座で同一の対立遺伝子を有すること。本明細書に使用される、「ホモ接合体欠失」とは、１つの遺伝子の両方の対立遺伝子が同一の欠失を有する生物を指す。
【００４０】
免疫不全：免疫系のうちの少なくとも１つの不可欠な機能を欠如すること。本明細書に使用される、「免疫不全」マウスとは、免疫系の特異成分を欠如する、または免疫系の特異成分の機能を欠如するマウスである。一実施形態において、免疫不全マウスは、機能的Ｂ細胞、Ｔ細胞、および／またはＮＫ細胞を欠如する。別の実施形態において、免疫不全マウスは、さらに、マクロファージを欠如する。
【００４１】
単離された：「単離された」肝細胞とは、臓器ドナー等の特定の源から得られている、および他の細胞型から実質的に分離または精製された、肝細胞を指す。
【００４２】
マクロファージ：単球と呼ばれる特定の白血球から由来する組織内の細胞。単球およびマクロファージは、食細胞であり、脊椎動物の非特異的防御（または先天性免疫）、ならびに特異的防御（または細胞性免疫）の両方において作用する。これらの役割は、細胞残屑、および固定細胞あるいは移動細胞としての病原体を食菌する（飲み込んだ後、消化する）こと、および病原体に対して反応するために、リンパ球および他の免疫細胞を刺激することである。
【００４３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞：内因性免疫系の主成分を構成する細胞傷害性リンパ球型。ＮＫ細胞は、腫瘍およびウイルス感染した細胞の両方の宿主の拒絶反応において大きな役割を果たす。
【００４４】
受容：本明細書に使用される、「受容マウス」とは、本明細書に記載される単離されたヒト肝細胞を注入されているマウスである。一般に、ヒト肝細胞の一部（割合は異なり得る）は、受容マウスに生着する。一実施形態において、該受容マウスは、Ｆａｈがさらに欠損している免疫不全マウスである。別の実施形態において、該受容マウスは、Ｆａｈがさらに欠損しているＲａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスである。別の実施形態において、該受容マウスはＦＲＧマウスである。別の実施形態において、該受容マウスは、ＦｐｍＲＧマウスである。
【００４５】
リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）：免疫グロブリン遺伝子座とＴ細胞受容体遺伝子座の組み換えに関与する遺伝子。Ｒａｇ２遺伝子が欠損する動物は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えを行うことができず、機能的Ｔ細胞およびＢ細胞の完全喪失をもたらす（Ｓｈｉｎｋａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ６８：８５５−８６７，１９９２）。
【００４６】
連続移植：一次マウスにおいて増大された肝細胞が、採取され、さらなる増大のために二次マウスに注入等により移植される、生体内でヒト肝細胞を増大させるためのプロセス。連続移植は、三次、または四次、または追加次のマウスをさらに含むことができる。
【００４７】
幹細胞：不変の娘細胞を生成する（自己再増殖；親細胞と同一である少なくとも１つの娘細胞を生成する細胞分裂）、および特殊化細胞型を形成する（潜在力）ための特異な能力を有する細胞。幹細胞としては、胚幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、生殖系列幹（ＧＳ）細胞、ヒト間充織幹細胞（ｈＭＳＣ）、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、多能性成体幹細胞（ＭＡＰＣ）、多能性成体生殖系列幹細胞（ｍａＧＳＣ）、および非制限体幹細胞（ＵＳＳＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。生体内の幹細胞の役割は、動物の正常な生活中、破壊される細胞を置換することである。通常、幹細胞は、無制限に分裂することができる。分裂後、該幹細胞は、幹細胞として残る、または前駆細胞になる、または末端分化に移り得る。前駆細胞は、少なくとも１つの所与の細胞型の十分に分化した機能細胞を作製することができる細胞である。通常、前駆細胞は、分裂することができる。分裂後、前駆細胞は、前駆細胞のままであり得る、または末端分化に移り得る。一実施形態において、該幹細胞は、肝細胞を形成する。
【００４８】
Ｔ細胞：細胞性免疫において中心的役割を果たす白血球型、またはリンパ球型。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるＢ細胞およびＮＫ細胞の細胞表面上にある特別受容体の存在により、Ｂ細胞およびＮＫ細胞のようなリンパ球の他型と区別される。胸腺は、通常、Ｔ細胞発達のための主要臓器であると考えられる。
【００４９】
導入遺伝子：細胞または生命体のゲノムに導入される外因性核酸配列。
【００５０】
トランスジェニック動物：動物の細胞の一部において染色体外要素として存在するか、または動物の生殖細胞系ＤＮＡに（すなわち、その細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列に）安定的に組み込まれている、非内因性（異種）核酸配列を有する、通常、哺乳類である、ヒト以外の動物。異種核酸は、当技術分野で周知のような方法に従って、例えば、宿主動物の胚または胚幹細胞の遺伝子操作により、このようなトランスジェニック動物の生殖細胞系に導入される。「導入遺伝子」は、このような異種核酸、例えば、（例えば「ノックイン」トランスジェニック動物の作製用の）発現コンストラクトの形状をした異種核酸、または標的遺伝子内またはその近傍に挿入されて、（例えば「ノックアウト」トランスジェニック動物の作製用の）標的遺伝子の発現低下を生じる異種核酸を意味する。遺伝子の「ノックアウト」とは、標的遺伝子の機能低下を生じる遺伝子の配列の変化を意味し、好ましくは、このような標的遺伝子の発現は検出されないか、または有意ではない。トランスジェニックのノックアウト動物は、標的遺伝子についてヘテロ接合のノックアウト、または標的遺伝子についてホモ接合のノックアウトを含むことができる。「ノックアウト」はまた、条件的なノックアウトも含み、標的遺伝子の変化が、例えば、標的遺伝子の変化を促進する物質に動物を曝露した際、標的遺伝子部位における組換えを促進する酵素（例えばＣｒｅ−ｌｏｘ系のＣｒｅ）を導入した際、または標的遺伝子の変化を出生後に指令する他の方法で生じる場合がある。
【００５１】
ベクター：宿主細胞において複製する、および／または挿入するための、ベクターの能力を崩壊することなく、外部の核酸の挿入を可能にする核酸分子。ベクターは、複製の複製起点のような、宿主細胞において、核酸配列の複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、１つもしくは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝要素を含むこともできる。挿入ベクターは、それ自体、宿主核酸に挿入することができる。発現ベクターは、一つまたは複数の挿入遺伝子の転写および翻訳を可能にするのに必要な調節塩基配列を含むベクターである。本明細書に記載される一実施形態において、該ベクターは、ヒトウロキナーゼのような、ウロキナーゼをコード化する配列を含有する。一実施形態において、該ベクターは、プラスミドベクターである。別の実施形態において、該ベクターは、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのような、ウイルスベクターである。
【００５２】
ウロキナーゼ：また、ウロキナーゼ型プラミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）と呼ばれる、ウロキナーゼは、セリンプロテアーゼである。ウロキナーゼは、本来、人尿から分離されたが、血流および細胞外マトリックスのような、いくつかの生理学的位置に存在する。主要な生理学的基質は、プラスミノーゲンであり、これはセリンプロテアーゼプラスミンの不活性な酵素前駆体である。プラスミンの活性化は、生理学的環境によって、血栓溶解または細胞外マトリックスの分解に関与するタンパク質分解カスケードを誘発する。本明細書に提供される方法の一実施形態において、ウロキナーゼは、肝細胞注入前、受容マウスに投与される。一部の実施形態において、ウロキナーゼは、ヒトウロキナーゼである。一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、分泌型のウロキナーゼである。一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、修飾された、非分泌型のウロキナーゼである（米国特許第５，９８０，８８６号参照、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００５３】
別途説明されない限り、本明細書に使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される用語と同じ意味を持つ。文脈で特に指定しない限り、単数形、「一つの（ａ）」「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は複数形の指示物を含む。同様に、文脈で特に指定しない限り、「または（ｏｒ）」という語は、「および（ａｎｄ）」を含むことを意図する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ｏｒ Ｂ）」とは、ＡまたはＢ、あるいはＡおよびＢの両方を含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに対して規定したすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子量値は概算値であり、説明のために提供するものであることがさらに理解されるべきである。本発明の実施または検討のために本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、適した方法および材料は以下に説明する。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、用語の説明を含め、本明細書が優先するものとする。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定を意図したものではない。
【００５４】
ＩＩＩ． いくつかの実施形態の説明
生体内でヒト肝細胞を増大させる着実な方法を本明細書に提供する。該方法は、チロシン異化酵素、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）が欠損している免疫不全マウスに単離されたヒト肝細胞を移植するステップを含む。一実施形態において、該免疫不全マウスは、Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスである。一実施形態において、該Ｆａｈ欠損マウスは、Ｆａｈのホモ接合体欠失を含む。別の実施形態において、該Ｆａｈ欠損マウスは、タンパク質の機能、および／または作製が実質的に低下するように、Ｆａｈにおいて、１つもしくは複数の点変異を含む。本明細書に記載されるように、Ｆａｈ、リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）、およびインターロイキン受容体の共通γ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）が欠損した三重変異体マウスは、生体内でヒト肝細胞を増大させるための十分な生体内系を提供する。一部の実施形態において、該マウスは、Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）マウスである。一部の実施形態において、該マウスは、Ｆａｈｐｍ／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦｐｍＲＧ）マウスである。
【００５５】
生体内でヒト肝細胞を増大させる方法を、本明細書に開示し、単離されたヒト肝細胞を注入等により、免疫不全およびＦａｈ欠損マウス（また、受容マウスと称される）に移植するステップと、少なくとも約２週間ヒト肝細胞を増大させるステップと、増大させたヒト肝細胞をマウスから採取するステップと、を含む。該肝細胞は、当技術分野で知られている任意の適した手段を用いて移植することができる。一実施形態において、該単離されたヒト肝細胞は、注入等により、該受容マウスの脾臓に移植される。別の実施形態において、該増大されたヒト肝細胞は、該受容マウスの肝臓から採取される。該ヒト肝細胞は、受容マウスにおいて、ヒト肝細胞の増大を可能にするのに十分な期間、増大可能である。増大のための正確な期間は、日常の実験を用いて実験的に判定することができる。一実施形態において、該ヒト肝細胞は、最長６ヶ月まで増大可能である。別の実施形態において、該ヒト肝細胞は、少なくとも約４週間、または少なくとも約６週間、または少なくとも約８週間、または少なくとも約１２週間、または少なくとも約１６週間、または少なくとも約２０週間、または少なくとも約２４週間、または少なくとも約２８週間、増大可能である。肝細胞増大の程度は、異なり得る。一部の実施形態において、受容マウスにおいて、ヒト肝細胞の増大は、少なくとも約１０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍、または少なくとも約１５０倍、または少なくとも約２００倍、または少なくとも約２５０倍、または少なくとも約３００倍、または少なくとも約４００倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍の増加をもたらす。
【００５６】
また、生体内でヒト肝細胞を増大させる方法を提供し、受容マウスは、該ヒト肝細胞の注入前、ウロキナーゼ遺伝子をコード化するベクターが投与される。一実施形態において、該ウロキナーゼ遺伝子は、ヒトウロキナーゼである。野生型ウロキナーゼは、分泌タンパク質である。したがって、一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、分泌型のウロキナーゼである（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３６：１８３−１８８，１９８５、参照することにより本明細書に組み込まれる）。ヒトウロキナーゼ（分泌型）の配列は、当技術分野で知られており、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＨ００７０７３（１９９３年８月３日受入）、Ｄ１１１４３（１９９６年５月９日受入）、Ａ１８３９７（１９９４年７月２１日受入）、ＢＣ００２７８８（２００３年８月１９日受入）、Ｘ０２７６０（１９９３年４月２１日受入）、ＢＴ００７３９１（２００３年５月１３日受入）、ＮＭ＿００２６５８（２００４年１０月１日受入）、Ｘ７４０３９（１９９４年２月２０日受入）に限定されず、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５７】
一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、非分泌型のウロキナーゼである。例えば、Ｌｉｅｂｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：６２１０−６２１４，１９９５、参照することにより本明細書に組み込まれる）は、ウロキナーゼのカルボキシル末端で小胞体保留シグナルをコード化する配列を挿入することにより、またはｐｒｅ−ｕＰＡシグナルペプチド（Ｓｔｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４７：６１９−６２５，１９８６、Ｓｃｈｕｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１６９６−１７０５，１９９４、これらの双方は、参照することにより本明細書に組み込まれる）をアミノ末端ＲＲ保留シグナルと置換することにより作製された非分泌型のウロキナーゼ、ならびに細胞膜ＩＩタンパク質Ｉｉｐ３３（Ｓｔｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４７：６１９−６２５，１９８６）からスペーサーペプチドにより引き離された膜貫通アンカーを記載する。非分泌型のウロキナーゼはまた、米国特許第５，９８０，８８６号に記載され、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５８】
ウロキナーゼをコード化するベクターは、マウスへの送達に適している任意の型のベクターであり得、ウロキナーゼ遺伝子を発現することができる。このようなベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターを含む。一実施形態において、該ベクターは、アデノウイルスベクターである。別の実施形態において、該ベクターは、ＡＡＶベクターである。ウロキナーゼをコード化するベクターは、当技術分野で知られている任意の適した手段により投与され得る。一実施形態において、該ベクターは、静脈内投与される。一態様において、該ベクターは、後眼窩注射により投与される。ウロキナーゼをコード化するベクターは、該ヒト肝細胞の注入前、いつでも投与され得る。一般に、該ベクターは、ウロキナーゼが十分な時間で発現できるように、投与される。一実施形態において、該ベクターは、肝細胞注入の２４〜４８時間前に投与される。
【００５９】
生体内でヒト肝細胞を増大させる方法を、本明細書にさらに提供し、該受容マウスは、該ヒト肝細胞の注入前、マクロファージが減損している。一実施形態において、該受容マウスに、マクロファージ減損前、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。別の実施形態において、該受容マウスに、マクロファージ減損後、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。別の実施形態において、該マクロファージ減損受容マウスに、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与されない。マクロファージを、化学物質または抗体を用いるような、当技術分野で周知のようないくつかの方法のうちのいずれか１つを用いて、該受容マウスから減損することができる。例えば、マクロファージを、Ｃ１２ＭＤＰ、またはマクロファージ発達、機能、および／または生存力を変える抗体を含む、有害物質のようなアンタゴニストの投与により減損することができる。アンタゴニストの投与は、周知の技法により行われ、欧州特許第１５５２７４０号に記載されるようなリポソームの使用を含み、参照することにより本明細書に組み込まれる。クロドロネート含有リポソームはまた、ｖａｎ Ｒｉｊｎら（Ｂｌｏｏｄ １０２：２５２２−２５３１，２００３）により記載されるように、マクロファージを減損するために使用することができ、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本明細書に記載される方法の一実施形態において、肝細胞注入前、該Ｆａｈ欠損マウスに、該マウスにおける肝臓疾患の発症を阻害、予防、または遅延する薬剤が投与される。該薬剤は、肝臓疾患を阻害するための当技術分野で知られている任意の化合物または組成物であり得る。このような一薬剤は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）である。ＮＴＢＣは、該Ｆａｈ欠損マウスにおける肝臓疾患の発症を調節するために投与される。用量、投与スケジュール、および投与方法は、該Ｆａｈ欠損マウスにおける肝機能障害を予防するために必要に応じ、調整することができる。一実施形態において、該ＮＴＢＣは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から約０．５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。別の実施形態において、該ＮＴＢＣは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．０６ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．０７ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．０８ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．０９ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日のような、約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。ＮＴＢＣは、ヒト肝細胞の注入前、および／または肝細胞注入後、選択された期間投与することができる。ＮＴＢＣは、肝細胞の増大の期間中、必要に応じ、中止または再投与することができる。一実施形態において、該Ｆａｈ欠損マウスに、肝細胞注入前、および肝細胞注入後、少なくとも約３日間、ＮＴＢＣが投与される。別の実施形態において、該Ｆａｈ欠損マウスに、肝細胞注入前、および肝細胞注入後、少なくとも約６日間、ＮＴＢＣが投与される。一態様において、ＮＴＢＣの用量は、肝細胞注入後、６日間の過程にわたり漸減される。ＮＴＢＣは、飲料水内投与、食物内投与、または注入が挙げられるが、これらに限定されない、任意の適した手段により投与することができる。一実施形態において、肝細胞注入前、飲料水内投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１ｍｇ／Ｌ、または約２ｍｇ／Ｌ、または約３ｍｇ／Ｌ、または約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌ、または約６ｍｇ／Ｌ、または約７ｍｇ／Ｌ、または約８ｍｇ／Ｌのような、約１ｍｇ／Ｌから約８ｍｇ／Ｌである。別の実施形態において、肝細胞注入前、飲料水内投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１．０ｍｇ／Ｌ、または約１．２ｍｇ／Ｌ、または約１．４ｍｇ／Ｌ、または約１．６ｍｇ／Ｌ、または約１．８ｍｇ／Ｌ、または約２．０ｍｇ／Ｌのような、約１ｍｇ／Ｌから約２ｍｇ／Ｌである。
【００６１】
単離されたヒト肝細胞は、多くの異なる源のうちのいずれか１つから得ることができる。一実施形態において、該ヒト肝細胞は、臓器ドナーの肝臓から単離された。別の実施形態において、該ヒト肝細胞は、外科的切除から単離された。別の実施形態において、該ヒト肝細胞は、胚幹細胞、または間葉由来幹細胞、または脂肪組織由来幹細胞、または多能性成体幹細胞、または非制限体幹細胞のような、幹細胞に由来した。別の実施形態において、該ヒト肝細胞は、単球または羊膜細胞に由来し、ひいては、幹細胞または前駆細胞は、肝細胞を産生するために、体外で得られる。別の実施形態において、該ヒト肝細胞は、注入前、凍結保存された。
【００６２】
該Ｆａｈ欠損受容マウスにおけるヒト肝細胞の連続移植の方法を、本明細書にさらに提供する。該方法は、第１の受容マウスからの増大されたヒト肝細胞を採取するステップと、二次、または三次、または四次、または追加次の受容マウスにおいて、肝細胞をさらに増大させるステップを含む。ヒト肝細胞は、いくつかの技法のうちのいずれか１つを用いて、マウスから採取することができる。例えば、該肝細胞は、下述の実施例に記載されるように、マウス肝臓を潅流し、次いで、徐々に細分化することにより採取することができる。さらに、該肝細胞は、ヒト細胞またはヒト肝細胞を特異的に認識する抗体を用いるような、周知の方法を用いて、他の細胞型、組織、および／または、破片から分離することができる。このような抗体としては、抗ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのような、クラスＩ主要組織適合性抗原に特異的に結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない（Ｍａｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６：４５５−４６２，１９９７）。抗体結合肝細胞は、その後、パンニング（固体マトリックスに付着したモノクローナル抗体を利用する）、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、磁気ビーズ分離等により、分離することができる。肝細胞を採取する代替的な方法は、当技術分野で周知である。
【００６３】
また、遺伝子組み換えマウスであって、そのゲノムは、欠失または点変異が、機能的ＦＡＨ、ＲＡＧ−２、およびＩＬ−２Ｒγタンパク質の発現の喪失をもたらすような、Ｆａｈ、Ｒａｇ２、およびＩｌ２ｒｇ遺伝子において、該欠失または点変異がホモ抱合体であり、該マウスは、免疫不全であり、肝機能の低下を示し、ヒト肝細胞を、該マウスに増大させることができる、遺伝子組み換えマウスを、本明細書に提供する。一実施形態において、該欠失は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮ細胞の完全喪失をもたらす。別の実施形態において、該マウスは、ウロキナーゼを発現する。一実施形態において、ウロキナーゼは、ヒトウロキナーゼである。一態様において、ウロキナーゼの発現は、ウロキナーゼをコード化する導入遺伝子の取り込みに起因する。別の態様において、ウロキナーゼの発現は、分泌型または非分泌型のウロキナーゼのような、ウロキナーゼをコード化するベクターの投与に起因する。ウロキナーゼをコード化するベクターは、マウスへの送達に適している任意の型のベクターであり得、ウロキナーゼ遺伝子を発現することができる。一実施形態において、該ベクターは、アデノウイルスベクターである。別の実施形態において、該ベクターは、ＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、該マウスは、ＦＲＧマウスである。一部の実施形態において、該マウスは、ＦｐｍＲＧマウスである。
【００６４】
ＩＶ． ヒト肝細胞の増大のための遺伝子組み換えマウス株
いくつかのグループは、齧歯動物において、一次ヒト肝細胞を生着および増大しようとした（米国特許第６，５０９，５１４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／０７３３８号、米国公開第２００５−０２５５５９１号）。Ｄａｎｄｒｉら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３３：９８１−９８８，２００１）が、ヒト肝細胞を用いてマウス肝臓の再増殖の成功を初めて報告した。その後、他のグループは、マウスにおいて、成功を収めたヒト肝臓細胞の生着を報告している。これらの研究のすべてにおいて、使用された動物は、アルブミンプロモータの転写制御下で、ウロキナーゼプラミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を発現する、トランスジェニック動物であった（Ｓａｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ６６：２４５−２５６，１９９１）。ｕＰＡの過剰発現は、代謝破壊を引き起こし、移植されたヒト肝細胞に影響を及ぼすことなく、マウス肝細胞の細胞死をもたらし、それは導入遺伝子を発現しない。該ａｌｂ−ｕＰＡ導入遺伝子は、様々な免疫不全のバックグラウンドと交錯し、ヒト細胞の拒絶を阻止した（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：９０１−９１２，２００４、Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９６：４２８−４３７，２００７、Ｔｕｒｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３８：１１８１−１１８４，２００６）。
【００６５】
最大７０％の生着レベルが、これらのモデルにおいて報告されているが、該系は、広範な使用を阻止しているいくつかの主要な不利点がある。第１に、該ａｌｂ−ｕＰＡ導入遺伝子は、若年期に、不活性化または喪失する。この理由のため、非常に初期（１４日齢）にヒト細胞を移植し、導入遺伝子がホモ接合体であるマウスを使用することが必須である。この狭い移植の時間窓が、モデルの柔軟性を著しく制限する。第２に、該導入遺伝子の自発的不活性化は、導入遺伝子陰性の健康なマウス肝細胞のプールを作成する。これらの復帰突然変異体マウス肝細胞は、再増殖中、ヒト細胞と効率的に競合する。したがって、該ヒト細胞を連続移植すると同時に二次受容者を再増殖することは不可能である。第３に、肝臓疾患は、このモデルにおいて、非常に早発型であり、ひいては、トランスジェニックマウスの生存力を低下させる。したがって、十分な数の実験動物を繁殖することが困難である。さらに、該トランスジェニックマウスには、手術中、死亡率を増加する出血傾向がある。最後に、ａｌｂ−ｕＰＡトランスジェニック動物は、一旦ヒト細胞を用いる再増殖が５０％を超えると、腎疾患を発症する。これは、腎臓上皮上のヒト補体によるためであると考えられる。ヒト生着の非常に高いレベルを得るために、抗相補性プロテアーゼ阻害剤で移植されたマウスを処理することが必要である（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：９０１−９１２，２００４）。これらの多くの限定のため、ヒト肝細胞を増大させるためのさらに堅牢なシステムが非常に望ましい。遺伝子欠失の独自の組み合わせを有する遺伝子組み換えマウスを用いて、生体内でヒト肝細胞を増大させるための高効率な方法を、本明細書に記載する。マウス肝臓においてヒト肝細胞の成功を収めた生着および増大は、ある程度の肝機能障害がある免疫不全マウスを必要とする。マウス肝臓は、様々な異なる型の免疫不全マウスにおいて、ヒト肝細胞を用いて再増殖し、ＲＡＧ−２ノックアウトまたはＳＣＩＤマウスを含み、これらの両方は、Ｂ細胞およびＴ細胞を欠如する（米国特許第６，５０９，５１４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／０７３３８号、米国公開第２００５−０２５５５９１号）。肝機能障害に達するために、免疫不全マウスを、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）トランスジェニックマウスと交配させた。マウス肝臓において、ｕＰＡの発現は、マウス肝細胞の成長の不利点を生じ、移植したヒト肝細胞の増大を促進する（ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／０７３３８号）。該ｕＰＡ導入遺伝子の限界を避けるために、Ｆａｈ欠損マウスは、ヒト肝細胞の増大を可能にさせる能力について分析された。ＦＡＨは、チロシン異化の最後のステップを触媒する代謝酵素である。Ｆａｈ遺伝子のホモ接合体欠失を有するマウスは、肝ｍＲＮＡ発現の変化および重度の肝機能障害を示す（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）。該Ｆａｈ突然変異体が、ヌードまたはＲａｇ１−／−（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ６８：８６９−８７７，１９９２）バックグラウンドと交錯した場合、ヒト肝細胞を有するマウス肝臓の再増殖は、免疫拒絶による可能性が最も高いため、成功しなかった。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスとのＦａｈ欠損マウスの交配（Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５：１９９−２０３，１９９７）は、ヒト肝細胞の副次的な生着が観察されるマウスを産生したが、これらの動物は、ＳＣＩＤマウスに存在する二本鎖切断ＤＮＡ修復の欠陥の可能性があるため、急速な肝不全を発症した。Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）三重変異体マウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞を欠如することを、本明細書に開示する。Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスは、当技術分野で知られている（Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：１０４−１０７，２００４、Ｇｏｒａｎｔｌａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２７００−２７１２，２００７）。
【００６６】
以下の実施例に記載されるように、ヒト肝細胞の生着および増大は、驚くべきことに、ＦＲＧマウスにおいて、高効率である。例えば、ＦＲＧマウスに、１００万の単離されたヒト肝細胞を注入できる。１０％の効率を仮定すると、１００，０００のヒト肝細胞が、受容マウスに生着される。増大後のＦＲＧマウスからの平均収量は、その後、約３，０００万から約４，５００万のヒト肝細胞であり、ヒト肝細胞の３００倍から４５０倍の増加と同じである。ＦＲＧマウスはまた、ヒト肝細胞の連続移植にも使用することができる。連続移植は、多重マウスを含み得、マウスあたりヒト肝細胞の少なくとも約１５０倍の増大をもたらし得る。
【００６７】
Ｆａｈ欠損を含む任意の免疫不全マウスは、本明細書に記載される諸方法に適している。一実施形態において、該マウスは、Ｆａｈが欠損しているＲａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスでもある。該Ｆａｈ欠損マウスは、例えば、Ｆａｈのホモ接合体欠失、またはＦａｈの１つもしくは複数の点変異を含むことができる。Ｆａｈ欠損（点変異またはホモ接合体欠失等による）は、Ｆａｈ ｍＲＮＡ発現および／または機能的ＦＡＨタンパク質の実質的減少、またはその欠損をもたらす。該ＦＲＧマウスに加えて、Ｆａｈ遺伝子において、点変異がホモ抱合体である免疫不全マウス（Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−）（本明細書では、ＦｐｍＲＧマウスと称される）はまた、生体内でヒト肝細胞の生着および増大に適したマウスでもあることを、本明細書に記載する。
【００６８】
Ｖ． ヒト肝細胞の単離および送達
ヒト肝細胞の生体内の増大のためにＦａｈ欠損マウスを用いることの有意な利点は、様々な源から採取したヒト肝細胞を該マウスに生着する能力である。下述の実施例に記載されるように、ヒト肝細胞は、死体ドナーまたは肝臓切除術から採取し得る、または市販の源から得ることができる。さらに、本明細書に示されるように、ＦＲＧマウスに、すべての年齢のドナーからのヒト肝細胞、または凍結保存された肝細胞を、うまく移植することができる。多くの場合、ヒト肝細胞の単離と移植との間の遅延（一般に、１〜２日）があり、これは該肝細胞の生存能力の低下をもたらし得る。しかしながら、該ＦＲＧマウス系は、限定された生存能力がある肝細胞を生着した場合でさえ、ヒト肝細胞を増大させることができる。
【００６９】
ヒト肝細胞を単離する方法は、当技術分野で周知である。例えば、臓器ドナーまたは肝臓切除術からのヒト肝細胞を単離する諸方法が、ＰＣＴ公開第ＷＯ ２００４／００９７６６号および第ＷＯ ２００５／０２８６４０号、ならびに米国特許第６，９９５，２９９号および第６，５０９，５１４号に記載され、それらのすべては、参照することにより本明細書に組み込まれる。肝細胞は、経皮的に、または開腹手術を介して採取された肝生検から得ることができる。ＦＲＧマウスのような、受容動物への移植手術のためのヒト肝細胞は、当技術分野で知られている任意の従来の方法によりヒト肝臓組織から単離される。肝臓組織は、機械的に、または酵素的に分離し、単一細胞の懸濁液に供給することができる、さもなければ完全なヒト肝組織のフラグメントを使用してもよい。例えば、該肝細胞は、所定のコラゲナーゼ潅流によりドナー組織から摘出し（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：２９，１９７６）、次いで、低速遠心分離を行う。肝細胞は、その後、ステンレス製のメッシュで濾過することにより精製し、次いで、密度勾配遠心分離法を行うことができる。あるいは、肝細胞を濃縮するための他の諸方法、例えば、蛍光活性化細胞分類、またはパンニング、または磁気ビーズ分離、または遠心力場内の水簸、または当技術分野で周知のような任意の他の方法を使用することができる。類似の肝細胞単離法が、受容マウスの肝臓から増大されたヒト肝細胞を採取するために使用することができる。
【００７０】
あるいは、ヒト肝細胞は、Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏら（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．Ｒｅｐ．６：６２５−６２８，１９８２）により記載される技法を用いて調製され得、これは参照することにより組み込まれる。簡潔に述べると、肝臓またはその一部は、単離され、カニューレは、門脈または門脈管に導入される。該肝臓組織は、その後、３７℃で、１分間あたり３０から７０ミリリットルの流量で、無カルシウム緩衝液、次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で、塩化カルシウム溶液（約０．０７５％塩化カルシウム等）のコラゲナーゼ（約０．０２５％コラゲナーゼ）を含有する酵素溶液で、該カニューレを介して潅流される。潅流された該肝臓組織は、小部分（約１立法ミリメートル等）に細分化される。該酵素消化を、上記に記載されるように、同一の緩衝液で、３７℃で約１０〜２０分間、徐々に撹拌しながら行い、細胞懸濁液を生成する。放出した肝細胞は、該細胞懸濁液を６０〜８０マイクロメーターのナイロン製のメッシュで濾過することにより採取する。採取した肝細胞は、その後、ｐＨ７．０で、低温ＨＥＰＥＳ緩衝液中で洗浄し、低速遠心分離を用いて、コラゲナーゼおよび細胞残屑を除去することができる。非実質細胞は、メトリザミド勾配遠心法により除去してもよい（米国特許第６，９９５，２９９号参照）。
【００７１】
ヒト肝細胞は、新鮮組織（死亡してから数時間内に得られた組織等）、または新鮮冷凍された組織（約０℃以下で、冷凍保存された新鮮組織等）から得ることができる。好ましくは、該ヒト組織は、検出可能な病原体がなく、形態学および組織学において正常であり、原則的に無病である。生着に使用される肝細胞は、最近、例えば、数時間以内に単離され得る、または細胞が適切な保存培地で保存される場合、より長期間後でも移植することができる。下述の実施例に記載されるこのような一培地は、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）（腹腔内臓器の保存用の汎用大動脈洗浄および保冷液、ウィスコンシン大学液、またはＵＷとも称される）である。肝細胞はまた、移植手術前に、凍結保存することができる。肝細胞を凍結保存する諸方法は、当技術分野で周知であり、米国特許第６，１３６，５２５号に記載され、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００７２】
臓器提供者または肝臓切除術からヒト肝細胞を得るステップに加えて、生着のために使用される該細胞は、ヒト幹細胞または、受容動物への移植手術後、増大可能なヒト肝細胞に発達または分化する肝細胞前駆細胞であり得る。ＥＳ細胞の性質を有するヒト細胞は、内胚盤胞細胞塊（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７，１９９８）、および成長中の生殖細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６−１３７３１，１９９８）から単離され、ヒト胚幹細胞を産生している（米国特許第６，２００，８０６号参照、参照することにより本明細書に組み込まれる）。米国特許第６，２００，８０６号に開示されるように、ＥＳ細胞は、ヒトおよび非ヒト霊長類から産生することができる。通常、霊長類ＥＳ細胞は、ＥＳ細胞培地の存在下で、マウス胎児線維芽細胞の融合層上に単離される。ＥＳ培地は、通常、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を有する、８０％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ピルビン酸塩なし、高グルコース、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）からなる。ＥＳ細胞の際立った特徴は、成人に存在する前駆「多分化能性」幹細胞と比較して、培養中に無制限に分化されない状態を維持するＥＳ細胞の能力、およびＥＳ細胞があらゆる異なる細胞型に発達する必要がある潜在能力を含む。ヒトＥＳ（ｈＥＳ）は、特異的なモノクローナル抗体により認識される糖脂質細胞表面抗原であるＳＳＥＡ−４、を発現する（例えば、Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：２７１−２７８，２０００を参照）。
【００７３】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）に由来したヒト肝細胞もまた、本明細書に記載される諸方法に使用することができる。骨髄由来ｈＭＳＣの肝性因子への順次暴露は、肝細胞の性質を有する細胞への、幹細胞の分化をもたらす（Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．７：２４，２００７、Ａｕｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ．５６（３）：４０５−１５，２００７、これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。骨髄由来間充織幹細胞と脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の肝細胞の分化もまた、記載されている（Ｔａｌｅｎｓ−Ｖｉｓｃｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２（３６）：５８３４−４５，２００６参照、参照することにより本明細書に組み込まれる）。ヒト肝細胞はまた、単球から作製することができる。Ｒｕｈｎｋｅら（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７９（９）：１０９７−１０３，２００５、参照することにより本明細書に組み込まれる）は、最終分化した末梢血単球からの肝細胞様（ＮｅｏＨｅｐ）細胞の生成を記載する。該ＮｅｏＨｅｐ細胞は、形態、肝細胞マーカーの発現、様々な分泌および代謝機能、ならびに薬物解毒活性に関して主要なヒト肝細胞と類似している。さらに、羊膜細胞に由来したヒト肝細胞もまた、本明細書に記載される諸方法に使用することができる。
【００７４】
ヒトＥＳ細胞株は、存在し、本明細書に開示される諸方法に使用することができる。ヒトＥＳ細胞はまた、体外受精した（ＩＶＦ）胚からの着床前の胚から採取し得る。未使用のヒトＩＶＦから産生した胚は、該胚が１４日齢未満である場合、シンガポールおよび英国のような多くの国で許可される。高品質の胚のみが、ＥＳ単離に適している。増大された胚盤胞への１つの細胞ヒト胚を培養するための現在の明確な培地条件が、記載されている（Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ．４：７０６−７１３，１９８９参照）。ヒト卵管細胞とのヒト胚の共培養は、高品質の胚盤胞の産生をもたらす。細胞共培養、または改善された合成培地において成長したＩＶＦ由来の増大されたヒト胚盤胞は、ヒトＥＳ細胞の単離を可能にする（米国特許第６，２００，８０６号参照）。
【００７５】
一実施形態において、ヒト肝細胞は、脾臓への注入等の、移植手術により受容マウスに送達される。肝細胞は、肝臓柔組織または門脈への注入等の、他の手段により送達され得る。受容マウスに注入されたヒト肝細胞の数は、異なり得る。一実施形態において、約１０５〜約１０７のヒト肝細胞が、注入される。別の実施形態において、約５×１０５〜約５×１０６のヒト肝細胞が、注入される。例示的な一実施形態において、約１０６のヒト肝細胞が、注入される。
【００７６】
ＶＩ． Ｆａｈ欠損マウスにおいて増大されたヒト肝細胞の使用
ヒト肝細胞は、当技術分野で知られているいくつかの技法のうちのいずれかを用いて、受容マウスから採取することができる。例えば、マウスは、麻酔することができ、門脈または下大静脈に、カテーテルを用いてカニューレを挿入した。該肝臓は、その後、適切な緩衝液（０．５ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳが追加された無カルシウムおよび無マグネシウムＥＢＳＳ）で潅流し、次いで、該肝臓にコラゲナーゼ処理（例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼＸＩおよび０．０５ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉが追加されたＥＢＳＳからなる溶液を用いて）を行うことができる。該肝臓は、徐々に細分化し、ナイロン製のメッシュで濾過（７０μｍと４０μｍのナイロン製のメッシュでの連続等）し、次いで、遠心分離し、該細胞の洗浄を行った。受容マウスから採取したヒト肝細胞は、当技術分野で周知の任意の技法を用いて、非ヒト細胞または他の混入物質（組織または細胞残屑等）から分離することができる。例えば、このような方法は、ヒト肝細胞に選択的に結合する抗体を用いるステップを含む。このような抗体としては、抗ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのような、クラスＩ主要組織適合性抗原に特異的に結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない（Ｍａｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６：４５５−４６２，１９９７）。ヒト細胞またはヒト肝細胞に対して特異的な抗体は、ＦＡＣＳ、またはパンニング、または磁気ビーズ分離を含む、様々な異なる技法に使用することができる。ＦＡＣＳは、他のさらに高度な検出レベルのうちで、複数の色チャネル、ローアングルかつ鈍角の光散乱検出チャネル、およびインピーダンスチャネルを利用して、抗体が結合した細胞を分離または分類する（米国特許第５，０６１，６２０号参照）。磁気分離は、１）ヒト特異抗体と接合する、または２）ヒト特異抗体と結合することができる検出抗体と接合する、または３）ビオチン化抗体と結合することができるアビジンと接合する、常磁性粒子の使用を含む。パンニングは、アガロースビーズ、またはポリスチレンビーズ、または中空糸膜、またはプラスチック製のペトリ皿のような、固体マトリックスに結合したモノクローナル抗体を含む。該抗体で結合した細胞は、試料から固体支持体を単に物理的に分離することにより試料から単離させることができる。
【００７７】
下述の実施例に記載されるように、いくつかの肝細胞輸送タンパク質を含む、薬物抱合および解毒に関与する遺伝子の発現を、受容マウスから採取した増大されたヒト肝細胞において検出した。最近の研究では、薬物毒性を予測する際に、これらの抱合経路（Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８：１１９２−１１９７，２０００）、および肝細胞輸送タンパク質（Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．９０：４５１−４５９，２００６）が、重要な役割を果たすことを示している。リファンピシンもしくはＰＢ、またはＢＮＦのような外因性薬物によるＣＹＰ誘導に対する正常ヒト反応に加えて、核ホルモン受容体転写因子の発現、抱合経路、およびＦＲＧマウスにおいて増大されたヒト肝細胞による主要な輸送タンパク質は、生体内で、ヒト薬物代謝および毒性において、これらの遺伝子産物の役割の評価を可能にする。単離された肝細胞において、化合物の毒性を試験する諸方法は、当技術分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ ２００７／０２２４１９号に記載され、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００７８】
本開示は、肝臓再構成の治療を必要とする対象体において、肝臓再構成のためにヒト肝細胞の源として、受容マウスにおいて増大され、採取したヒト肝細胞の使用をさらに考慮する。肝細胞の導入による患者における肝臓組織の再構成は、肝臓移植の想定における応急処置として、あるいは単離された代謝低下に罹患する患者に対する最終的治療として、急性肝不全に罹患する患者に対する潜在的な治療法の選択肢である（Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５：５３−６１，１９９８）。肝細胞の再構成は、例えば、遺伝子治療のために遺伝子組み換え肝細胞を導入するために、または疾患、物理的損傷もしくは化学的損傷、または悪性腫瘍によって喪失した肝細胞を交換するために、使用してもよい（米国特許第６，９９５，２９９号、参照することにより本明細書に組み込まれる）。例えば、家族性高コレステロール血症を患っている患者の遺伝子治療において、導入された肝細胞の使用が、報告されている（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．６：３３５，１９９４）。さらに、増大されたヒト肝細胞は、人工肝臓補助装置を装着するために使用することができる。
【００７９】
ＦＲＧマウスにおいて増大され、採取したヒト肝細胞はまた、様々な微生物学的研究のためにも有用である。Ｃ型肝炎ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスを含む、いくつかの病原性ウイルスは、ヒト宿主、またはヒトの初代肝細胞において、唯一複製することができる。したがって、ヒトの初代肝細胞の十分な源を有することは、これらの病原体の研究にとって重要である。増大されたヒト肝細胞は、ウイルス感染および複製の研究および肝臓のウイルスの感染を調整する化合物を同定するための研究に使用することができる。肝臓のウイルスの研究のためにヒトの初代肝細胞を使用する諸方法が、欧州特許第１５５２７４０号、米国特許第６，５０９，５１４号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ ００／１７３３８号に記載され、これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８０】
ＶＩＩ． ヒト肝臓疾患に対するモデル系としてのＦａｈ欠損マウスの使用
免疫不全、かつＦａｈ欠損マウスはまた、ヒト肝臓疾患に対するモデル系として使用することもできる。ヒト肝細胞を生着したＦａｈ欠損をさらに含む、Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスを含む、これらのマウス（例えば、ＦＲＧまたはＦｐｍＲＧマウス等）は、例えば、毒素への暴露、感染症、遺伝病、または悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない、様々な異なる病因に起因する肝臓疾患のモデルを作製するために使用することができる。ヒト肝細胞を生着し、再構成したＦａｈ欠損マウスは、これらの疾患の理解をより深め、疾患経過を予防、または遅延、または逆行し得る薬剤を同定するために、使用することができる。例えば、該Ｆａｈ欠損マウスは、遺伝子治療ベクターを試験するために使用することができる。着目遺伝子治療用ベクターは、Ｆａｈ欠損マウスに投与することができ、生着されたヒト肝細胞におけるベクターの効果を評価することができる。
【００８１】
同様に、ヒト肝細胞を含むＦａｈ欠損マウスは、生体内の設定において、ヒト肝細胞におけるそれらの効果に対して、毒素または医薬品のような、化合物をスクリーニングするために使用することができる。肝疾患を引き起こす、または寄与する疑いがある薬剤は、Ｆａｈ欠損マウスに対する薬剤の有効量を投与する、および生着されたヒト細胞の機能における薬剤効果を評価することにより、スクリーニングすることができる。一実施例として、Ｆａｈ欠損マウスは、ヒト向肝性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）病原体により感染を阻害する、または予防する薬剤を同定するために使用することができる。薬剤等を同定するために、試験薬剤を投与後、または投与前に、Ｆａｈ欠損マウスを病原体に暴露させる、あるいは該マウスに病原体を接種することができる。該マウスは、その後、感染の兆候に対して評価することができ、任意に、該薬剤で処理されていない、および／または、該病原体により感染させられていない、対照マウスと比較することができる。
【００８２】
Ｆａｈ欠損マウスが、毒素により引き起こされる肝臓疾患のモデルとして使用される場合には、注入されたヒト肝細胞を生着し、該毒剤への暴露前に、好適な期間、増大させる必要がある。肝細胞の増大のために必要とされる時間量は、経験的に判定され得、当業者の能力範囲内である。対応するヒト条件を最も厳密に模倣する成果物を産生するために必要とされる毒剤量は、毒剤の増分量に対して暴露されるいくつかのＦａｈ欠損マウスを用いることにより判定されてもよい。毒剤の例としては、アルコール、アセトアミノフェン、フェニトイン、メチルドパ、イソニアジド、四塩化炭素、黄リン、およびファロイジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
Ｆａｈ欠損マウスが悪性肝臓疾患のモデルとして使用される場合の実施形態において、該悪性腫瘍は、形質転換剤への暴露により、または、悪性細胞の導入により生成されてもよい。形質転換剤または悪性細胞は、ヒト肝細胞の初期のコロナイジング導入とともに、または好ましくは、ヒト肝細胞が宿主動物において増殖開始後、導入されてもよい。形質転換剤の場合、ヒト肝細胞が活発に増殖する時に、該薬剤を投与することが好ましい場合がある。このような形質転換剤は、動物に全身的に、あるいは、肝臓自体に局所的に、投与されてもよい。悪性細胞は、肝臓へ直接接種することができる。一実施例として、Ｆａｈ欠損マウスに、ヒト肝細胞が移植される。該ヒト肝細胞の生着後、該マウスは、形質転換剤が投与される、または悪性細胞が接種される。あるいは、該形質転換剤または該悪性細胞は、ヒト肝細胞とともに投与することができる。悪性腫瘍が該マウスに発症した後、当技術分野で知られているいくつの方法のうちのいずれか１つにより投与することができ、Ｆａｈ欠損マウスは、ヒト肝臓癌のモデルとして使用することができる。
【００８４】
ＶＩＩＩ． ウロキナーゼをコード化するベクター
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損マウスに、ヒト肝細胞の移植手術前、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。一実施形態において、該ウロキナーゼ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）としても知られる）は、分泌型のヒトウロキナーゼである。別の実施形態において、該ウロキナーゼは、修飾された、非分泌型のウロキナーゼである（米国特許第５，９８０，８８６号参照、参照することにより本明細書に組み込まれる）。マウスにおけるウロキナーゼの発現に適した任意の型のベクターが企図される。このようなベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターを含む。適したベクターとしては、ＤＮＡベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、テナガザル白血病のベクター、ＶＳＶ−Ｇ、ＶＬ３０ベクター、リポソーム媒介ベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、該ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。該アデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルス血清型を含む、任意の適したアデノウイルスに由来し得る（Ａｄ２およびＡｄ５等であるが、これらに限定されない）。アデノウイルスベクターは、第１、第２、第３、および／または第４世代のアデノウイルスベクター、またはアデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクターであり得る。非ウイルスベクターは、プラスミド、ホスホリン脂質、異なる構造のリポソーム（陽イオンおよび陰イオン）により構成することができる。別の実施形態において、該ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。該ＡＡＶベクターは、当技術分野で知られている任意の適したＡＡＶベクターであり得る。
【００８５】
ウロキナーゼをコード化するウイルスおよび非ウイルスベクターは、当技術分野で周知である。例えば、ヒトウロキナーゼをコード化するアデノウイルスベクターは、米国特許第５，９８０，８８６号、およびＬｉｅｂｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（１３）：６２１０−４，１９９５）に記載される。米国特許出願公開第２００５−１７６１２９号および米国特許第５，５８５，３６２号は、組み換えアデノウイルスベクターを記載し、米国特許第６，０２５，１９５号は、肝臓特的な発現のアデノウイルスベクターを開示する。米国特許出願公開第２００３−０１６６２８４号は、ウロキナーゼを含む、着目遺伝子の肝臓特異的な発現のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを記載する。米国特許第６，５２１，２２５号および第５，５８９，３７７号は、組み換えＡＡＶベクターを記載する。ＰＣＴ公開第ＷＯ ０２４４３９３号は、ヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子遺伝子を含む、ウイルスおよび非ウイルスベクターを記載する。該ヒトウロキナーゼ遺伝子の高レベルの発現が可能である発現ベクターは、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０３０８７３９３号に開示される。前述の特許出願および刊行物のそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８６】
ウロキナーゼをコード化するベクターは、任意に、適切なプロモータ、エンハンサ、転写ターミネータ、タンパク質をコード化する遺伝子の前にある開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および終止コドンを含む、発現調節配列を含むことができる。通常、発現調節配列は、転写を指示するのに十分な最小配列である、プロモータを含む。
【００８７】
該発現ベクターは、複製起点、プロモータ、ならびに形質転換細胞の表現型選抜を可能にする特異的遺伝子（抗生物質耐性カセット等）を含むことができる。通常、該発現ベクターは、プロモータを含み得る。該プロモータは、誘導性または構成的であり得る。該プロモータは、組織特異的であり得る。適したプロモータとしては、チミジンキナーゼプロモータ（ＴＫ）プロモータ、またはメタロチオネインＩプロモータ、またはポリヒドロンプロモータ、またはニューロン特異的エノラーゼプロモータ、またはチロシンヒドロキシラーゼプロモータ、またはベータアクチンプロモータ、または他のプロモータが挙げられる。一実施形態において、該プロモータは、異種プロモータである。
【００８８】
一実施例において、ウロキナーゼをコード化する配列は、所望のプロモータの下流にある。任意に、エンハンサ要素もまた、含まれ、通常、該ベクター上のどこかにあり得、増強効果も有する。しかしながら、増大した活性量は、通常、距離とともに減少する。
【００８９】
ウロキナーゼをコード化する該ベクターは、静脈内投与、または腹腔内投与、または門脈を介して血管内注入が挙げられるが、これらに限定されない、様々な経路により投与することができる。投与されたベクター量は、異なり、日常の実験を用いて決定され得る。一実施形態において、ＦＲＧマウスに、約１×１０８〜約１×１０１０のプラーク形成単位の用量で、アデノウイルスウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。好ましい一実施形態において、該用量は、約５×１０９のプラーク形成単位である。
【００９０】
例示的な一実施形態において、ＦＲＧマウスに、ヒトウロキナーゼをコード化するアデノウイルスベクターが投与される。アデノウイルスベクターは、非常に高い力価のある感染粒子に作製され得る、多種多様の細胞に感染する、分裂してない細胞へ遺伝子を効率的に転送する、およびゲストゲノムにほとんど組み込まれない（これは挿入突然変異により細胞形質転換のリスクを避ける）等の、他の型のウイルスベクターに優るいくつかの利点がある（Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９７，ｐａｇｅｓ ４４−５３、Ｚｅｒｎ ａｎｄ Ｋｒｅｓｉｎａｍ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ：２５（２），４８４−４９１，１９９７）。ウロキナーゼをコード化するために使用することができる代表的なアデノウイルスベクターは、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９２）、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ（Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７：１０９−１２８，１９９１）、およびＢａｒｒら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２：１５１−１５５，１９９５）に記載され、これらは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００９１】
以下の実施例を提供し、ある特定の特性、および／または実施形態を説明する。これらの実施例は、本発明を、記載される特定の特性または実施形態に制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９２】
以下の実施例に記載されるように、ヒト肝細胞の生着および増大は、ＦＲＧマウスにおいて、高効率である。ＦＲＧマウスの肝臓は、大きさおよび形において、肉眼的に正常であり、組織学的検査は、免疫補体Ｆａｈ−／−マウスとの間で有意な差異を示さなかった。さらに、ＦＲＧマウスは、ＮＴＢＣを投与した場合、よく生育し、十分に繁殖力があった。
【００９３】
一実施形態において、ＦＲＧマウスにおける肝臓疾患および選択圧の限度は、ＮＴＢＣを投与および中止することにより制御することができる（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４５３−４６０，１９９５）。ＮＴＢＣの中止は、移植したヒト肝細胞に対する選択的な利点を与える。肝臓疾患の程度を容易に制御することができることは、畜産および手術をさらに容易にする。さらに、該Ｆａｈ欠損突然変異体は、欠失であり、導入遺伝子の不活性化により野生型に戻すことができない。したがって、内因性復帰マウス細胞からの競合は、Ｆａｈノックアウト肝臓には存在しない。これは、ＦＲＧマウスは、年齢を問わず、ヒト肝細胞を生着することができ、連続移植は、実現可能であることを意味する。また、重要なことに、ＦＲＧマウスは、ヒト細胞を用いた再増殖が５０％を超える場合、腎疾患を予防するために必要とされることが前述の研究によって示されている（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：９０１−９１２，２００４）、補体阻害剤の投与なく、高度に再増殖することができる。これは、畜産において実質的に重要だけでなく、薬理学的干渉の潜在源を除去する。
【００９４】
ＦＲＧマウスにおいて、ヒト肝細胞の再増殖率は、約７０％を超えることができる（マウス肝臓において、７０％以上の肝細胞がヒト肝細胞である）。単一の再増殖したＦＲＧマウスからの平均収量は、約３，０００万から約４，５００万のヒト肝細胞である。単一ＦＲＧマウスから増大された肝細胞を、その後、連続移植と称されるプロセスにおいて、最高１００匹の二次ＦＲＧ受容マウスで再増殖するために使用することができる。
【００９５】
連続移植は、本明細書に記載される新規のシステムにおいて達成することができる。連続移植は、ヒト肝細胞を大規模に増大できるだけでなく、受容マウスのいくつかの世代を通して同一の遺伝子型のヒト細胞を増大させるための手段を提供する。また、さらなる移植手術のために高品質の源のヒト肝細胞を所有することは、重要である。少なくとも４回の肝細胞移植手術が実現可能であることを本明細書に実証している。さらに、連続移植から単離されたヒト肝細胞の生存能力は、約８０％を超えることができ、該肝細胞は、コラーゲンで被覆したプレートに容易に結合する。１０％の生着効率（１００，０００の細胞）、および再増殖後の約１，５００万の増大されたヒト肝細胞の最終採取の概算に基づいて、少なくとも１５０倍の生体内での増大を毎回達成することができる。したがって、ＦＲＧマウスにおいて、ヒト肝細胞の全増大は、５億倍を超え得る。
【００９６】
ヒト肝細胞の生着および増大は、様々な源および可変品質からの単離されたヒト肝細胞を用いて、ＦＲＧマウスにおいて、可能である。ヒト肝細胞の源としては、死体ドナー、肝臓切除術、および商業的に入手可能な源が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に示されるように、ヒト肝細胞の生着および増大は、あらゆる年齢のドナーを用いて、成功した。さらに、ヒト肝細胞を、該肝細胞があらかじめ凍結保存された場合でさえ、ＦＲＧマウスにおいてうまく増大させることが、本明細書に実証される。これは、肝細胞単離後、直ちに移植手術を必要とするシステムに優る重要な利点である。
【００９７】
実施例１：Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）マウスの作製
免疫不全Ｆａｈノックアウトマウスのいくつかの株を作製した。Ｆａｈ突然変異体をヌード、ｎｏｄ／ｓｃｉｄまたはＲａｇ１−／−バックグラウンドと交錯することは、不成功であった。Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞が完全に欠如するが、ＤＮＡ修復欠損のない、免疫不全Ｆａｈ−／−マウス株を作製するために、Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）マウスを作製した。オスＦａｈ−／−１２９Ｓ４マウス（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）を、メスＲａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）と交配させた。すべての動物に、１．６ｍｇ／Ｌの濃度で、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３ シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を含有する飲料水を与えてすべての動物を維持した（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４５３−４６０，１９９５）。各動物の遺伝子型を確認するために、ＰＣＲベースの遺伝子タイピングを、足指組織から単離した２００ｎｇのゲノムＤＮＡに実行した（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ７：２２９８−２３０７，１９９３、Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：１０４−１０７，２００４）。
【００９８】
飲料水内にＮＴＢＣを継続して与えた場合、ＦＲＧマウスはよく生育し、十分な繁殖力があった。ＦＲＧマウス肝臓は、大きさおよび形において、肉眼的に正常であり、組織学的検査は、従来のＦａｈ−／−マウスと該ＦＲＧマウスとの間で差異を示さなかった。従来のＦａｈ−／−マウスの場合のように、ＮＴＢＣの中止は、ＦＲＧマウスにおいて、漸次の肝臓細胞損傷をもたらし、４〜８週間後、ＦＲＧマウスは最終的に死亡した（Ｏｖｅｒｔｕｒｆ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２：２６６−２７３，１９９６）。
【００９９】
実施例２：組織学および生着検出アッセイ
組織学および免疫細胞化学
ＦＡＨ免疫組織化学を、前述のように行った（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６１：５６５−５７４，２００２）。簡潔に述べると、ｐＨ７．４で、１０％リン酸緩衝ホルマリン中で固定された肝臓組織および腎臓組織は、１００％エタノール中で脱水され、５８℃で、パラフィンワックスに包埋された。脱パラフィン処理した４μｍの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学のために、切片は、３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールで、内因性ペルオキシダーゼのブロッキングのために処理した。また、アビジンおよびビオチンブロッキングは、一次抗体でインキュベーションする前に、行なった。切片は、室温で２時間、抗ＦＡＨウサギ抗体またはＨｅｐＰａｒ抗体（ＤＡＫＯ）でインキュベートし、次いで、ＨＲＰに接合した二次抗体でインキュベートした。シグナルは、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）により検出した。
【０１００】
ＦＡＨ酵素アッセイ
フマリルアセト酢酸は、受容者の肝臓からの細胞質の肝臓分画とともにインキュベートし、消失速度を、３３０ｎｍで分光学的に測定した。野生型およびＦａｈ−／−肝臓はそれぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。フマリルアセト酢酸は、ホモゲンチジン酸から酵素的に調製した（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２：２８７−３００，１９５５）。
【０１０１】
Ａｌｕ配列のためのゲノムＰＣＲ
ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、肝臓から単離した。ヒトＡｌｕ配列は、以下のプライマー５’−ＧＧＣＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＧ−３’（配列番号１）および５’−ＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号２）を用いた標準手順に従って、ＰＣＲにより増幅した。
【０１０２】
肝細胞特異遺伝子発現のためのＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、Ｒｎｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、肝臓から単離した。相補的ＤＮＡは、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素により合成した。表１に示されるプライマーは、ヒトまたはマウス特異的ｃＤＮＡ増幅のために使用した。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
ヒトアルブミンの測定
少量の血液を、ヘパリン化された毛細血管を有する左側の伏在静脈から１週間に１回採取した。トリス緩衝食塩水で１，０００倍または１０，０００倍希釈した後、ヒトアルブミン濃度は、製造業者のプロトコルに従って、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ）を用いて測定した。
【０１０５】
蛍光免疫細胞化学
ヒト化マウス肝臓からの肝細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で懸濁し、コラーゲン型１被覆６ウェルプレート上に播種した。付着した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで、１５分間固定し、５％スキムミルクでブロックした。ウサギ抗ＦＡＨ、ヤギ抗ヒトアルブミン（Ｂｅｔｈｙｌ）、ヤギ抗マウスアルブミン（Ｂｅｔｈｙｌ）を、１／２００の希釈で、一次抗体として使用した。ＡＬＥＸＡ（登録商標）フルオロ４８８抗ヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＡＬＥＸＡ（登録商標）フルオロ５５５抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、二次抗体として使用した。該画像は、Ｎｉｋｏｎのデジタルカメラを用いることによりＡＸＩＯＶＥＲＴ（登録商標）２００顕微鏡で捕捉した。
【０１０６】
ＦＡＣＳ解析
受容者の肝臓の解離後、実質細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合した抗ヒトヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ、Ｂ、Ｃ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびフィコエリトリン（ＰＥ）を接合した抗マウスＨ２−Ｋ（ｂ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートした。その後、これらをＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＣＡＬＩＢＵＲ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターで解析した。ＦＩＴＣを接合したＩｇＧおよびＰＥを接合したＩｇＧを、負の対照として使用した。
【０１０７】
蛍光原位置ハイブリダイゼーション
全ゲノムＤＮＡプローブは、全マウスゲノムＤＮＡおよび全ヒトゲノムＤＮＡのニックトランスレーション法により作製した。Ｃｙ３−ｄＵＴＰの取り込みは、製造業者の推奨（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って実行した。最終プローブ濃度は、２００ｎｇ／μｌであった。付着した細胞のあるスライドを、３７℃で１時間、１００ｍｇ／ｍｌのＲｎａｓｅで処理し、２Ｘ ＳＳＣ中で３回（１回３分間）洗浄した。洗浄ステップ後、スライドを、７０％、９０％、および１００％エタノール中で、３分間、それぞれ脱水した。染色体を、７５℃で３分間、７０％ホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣ中で変性し、次いで、冷７０％、９０％、および１００％エタノールで３分間、それぞれ脱水した。プローブカクテルを、７５℃で１０分間変性し、３７℃で３０分間あらかじめハイブリダイズした。プローブを、スライドに適用し、湿潤チャンバ中で、３７℃で一晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、５０％ホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣ中で３回の３分洗浄、ＰＮ緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、２．５％ ＮＯＮＩＤＥＴ（登録商標）Ｐ−４０）中で３回の３分洗浄において、すべて４５℃で行われた。スライドは、その後、紫外線蛍光（Ｚｅｉｓｓ）下で、ヘキスト（０．２ｕｇ／ｍｌ）で対比染色し、カバースリップをかぶせ、観察した。
【０１０８】
実施例３：ヒト肝細胞の単離および凍結保存
ヒト肝細胞は、前述の手順に従って、肝臓移植手術のために使用されないドナー肝臓から単離した（Ｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１５：Ｓ１０５−１１０，２００６）。簡潔に述べると、肝臓組織を、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ（Ｓｉｇｍａ）およびＨＥＰＥＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）が追加された無カルシウムおよび無マグネシウムのハンクス液（Ｃａｍｂｒｅｘ）で潅流し、次いで、既存の脈管構造を通してイーグル最小必須培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で、１００ｍｇ／ＬのコラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ）および５０ｍｇ／ＬのデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて消化した。該細胞を、イーグル最小必須培地と７％小ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で、５０ｘｇで２分間、３回洗浄した。ペレット化された肝細胞は、冷ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）（腹腔内臓器の保存用の汎用大動脈洗浄および保冷液、ウィスコンシン大学液、またはＵＷとも称される）に移した。
【０１０９】
輸送された肝細胞は、１ｍｌあたり５×１０６の肝細胞で、１０％ウシ胎仔血清および１０％ジメチルスルホキシドが追加されたＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）溶液に移した。該クリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）を、紙タオルで厚く覆い、−８０℃で１日間保存し、液体窒素に最終的に移した。解凍のために、細胞を、３７℃の水浴中で急速に再加熱し、ＤＭＥＭを徐々に加え、ＤＭＳＯ濃度の変化速度を最小化した。
【０１１０】
実施例４：ヒト肝細胞を用いたＦＲＧマウス肝臓の再増殖
ウロキナーゼの過剰発現は、いくつかの系において、肝細胞生着を強化することが示されている（Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１０２９−１０３７，１９９５）。したがって、実験を行い、ヒト肝細胞の移植手術前、ウロキナーゼを発現するアデノウイルスの投与が有益であるかどうかを判定した。分泌型のヒトウロキナーゼ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子；ｕＰＡ）を発現するアデノウイルスベクターは、先に説明されている（Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：６２１０−６２１４，１９９５および米国特許第５，９８０，８８６号参照、参照することによって本明細書に組み込まれる）。
【０１１１】
ドナー肝細胞は、単離し、単離してから２４〜３６時間後に、移植した。大抵の場合、細胞は、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）溶液中に保存し、輸送中、４℃に保った。しかしながら、２つの実験において、凍結保存した肝細胞を移植した。ドナー肝細胞の生存能力および品質は、１０％〜６０％の範囲の平板効率を伴い、大いに変化した。
【０１１２】
移植手術のために、以下の汎用プロトコルを使用した。成熟（６〜１５週齢）オスまたはメスＦＲＧマウスに、移植手術する２４〜４８時間前に、ｕＰＡアデノウイルス（マウスあたり５×１０９のプラーク形成単位（ＰＦＵ））の静脈注射（後眼窩注射）をした。１００μｌのダルベッコ改変イーグル培地中で、１００万の生存能力のあるヒト肝細胞（トリパンブルー色素排除試験法により判定された）を、２７ゲージ針で脾臓内に注入した。ＮＴＢＣの投与を、次の６日間（１．６ｍｇ／Ｌ ０〜２日目、０．８ｍｇ／Ｌ ３〜４日目、０．４ｍｇ／Ｌ ５〜６日目）にわたり徐々に中止し、移植手術から１週間後、完全に中止した。ＮＴＢＣの投与を停止してから２週間後、動物は、５日間薬物の投与を再開した後、再度中止した。
【０１１３】
３つの別個の移植手術において、ヒト肝細胞の一次生着は、最初にｕＰＡアデノウイルスを受けた受容者であるＦＲＧマウスにおいて観察した。したがって、ｕＰＡの前処理レジメンを、ほとんどのその後の移植手術実験において使用した。
【０１１４】
全体で、９つの異なるドナーからのヒト肝細胞をうまく使用して、ｕＰＡアデノウイルスレジメンの導入後、生着の失敗は生じなかった。これらのうち、７つは、脳死ドナーの肝臓から単離し、２つは、外科的肝臓切除術から単離した。ドナーの年齢は、１．２歳から６４歳の範囲で異なった（表２）。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】
すべての実験において、少なくとも１つの受容者に、細胞バッチの使用にかかわらず、本プロトコルを用いて、ヒト肝細胞が有意に生着された（＞１％ヒト細胞）。生着は、組織学、ＤＮＡ解析、酵素アッセイ、および後の実験である、ヒト血清アルブミンを含む、異なる方法により実証された。アルブミンレベルによりモニターされた移植手術において、４３のうちの１７（３９．５％；１２〜６７％）の一次受容者は再増殖した（表２および図３）。これらのうち、７つは、高度に再増殖し（３０〜９０％）、アルブミンレベル＞１ｍｇ／ｍｌに達した。死体肝臓からの肝細胞だけでなく、肝臓切除術からの肝細胞も生着した。さらに、凍結保存細胞も、無事に生着された。
【０１１７】
高度に生着されたマウス（＞３０％再増殖）において、移植されたＦＲＧマウスの体重は、第２のＮＴＢＣ中止中に、安定したのに対して、同一の細胞を与えたＩｌ２ｒｇ（Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ＋／−）のヘテロ接合型である免疫不全同腹仔のうち減量し続けたものは少なかった（図１ａ）。三重変異体マウスにおいて、この体重の安定は、移植されたヒト肝細胞が、罹患Ｆａｈ−／−受容肝細胞の機能を置換していることを示唆した。完全に体重が安定化するや否や（初期移植手術から２〜３ヶ月後）、受容者の肝臓は、その後、採取された。肉眼的に、ＦＲＧ肝臓は、大きさおよび形において、正常であり、肉眼的結節はなかった。ヒト特異的Ａｌｕ ＤＮＡ配列のゲノムＰＣＲは、ＦＲＧ受容者の肝臓において陽性であったのに対して、Ｉｌ２ｒｇヘテロ接合体は、すべて陰性であった（図１ｂ）。再増殖細胞の肝細胞機能を直接確認するために、ＦＡＨ酵素活性を、アッセイした（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２：２８７−３００，１９５５）。
【０１１８】
受容マウスの肝臓は、正常マウス肝臓と同等またはそれを超える、多量のＦＡＨ酵素活性があった（図１ｃ〜ｅ）。ＦＡＨは、十分に分化した肝細胞において、単独に発現するため、移植されたヒト肝細胞は、マウス肝臓に生着された場合、脱分化または異常がないことを示唆した。ＦＡＨ免疫染色により、７０％以上の肝実質が、ＦＡＨ陽性ヒト肝細胞によって再増殖されたことが確認された（図１ｆおよび図１ｇ）。
【０１１９】
組織学的および免疫組織化学的試験は、追加の受容者の肝臓を用いて行った（図２ａおよび図２ｂ）。ＦＡＨ陽性ヒト肝細胞は、受容者の肝臓の構造に完全に統合されたようであった。いくつかの受容者において、生着された肝細胞は、受容者の肝臓組織を阻害することなく、８０％以上の柔組織を占めた（図２ｂ、２ｅ、および２ｆ）。クローン的に増加しているヒト肝細胞は、形態学的に、大きさにより、およびそれらの蒼白の細胞質により、マウス肝細胞とは明らかに区別することができた（図２ｃおよび図２ｄ）。ヒト肝細胞のその大きさは、恐らく、上述に報告されるようにグリコーゲン蓄積のため、比較的大きく、それらの細胞質は、鮮明であった（Ｍｅｕｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１：８４７−８５６，２００５）。ＦＡＨ陽性肝細胞はまた、ＨｅｐＰａｒ抗体に対しても陽性であり、この抗体はヒト肝細胞を特異的に標識化するが、マウス肝細胞は、標識化しない（図２ｅおよび図２ｆ）。対照的に、ＦＡＨ陰性領域は、ＮＴＢＣ投与の中止後、従来のＦａｈ−／−マウスにおいて所見と一致する、壊死炎症（ｎｅｃｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を示し、異形成肝細胞を含んだ。
【０１２０】
再増殖したヒト肝細胞が、成熟肝細胞特異遺伝子を発現するかどうかを検査するために、ＲＴ−ＰＣＲを、受容者の肝臓から抽出されたメッセンジャーＲＮＡに行った。ヒトアルブミン（ＡＬＢ）遺伝子、ＦＡＨ遺伝子、トランスフェリン（ＴＦ）遺伝子、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子、チロシンアミノ転移酵素（ＴＡＴ）遺伝子、およびＵＧＴ１Ａ１遺伝子が、受容者の肝臓において、多量に発現した（図３ａ、図６ｃ、および図７）。肝細胞の機能性をまた、ヒトアルブミンの血中濃度を測定することにより評価した。ヒトアルブミンに対して特異的なＥＬＩＳＡキットを使用し、検出の閾値は、１：１００に希釈した試料を用いて、０．０５μｇ／ｍｌであった。ヒトアルブミンは、まず、一次受容者において、移植手術から４〜１０週間後に検出された。当初は、ヒトアルブミンレベルに変動があったが、その後、ヒトアルブミンの濃度は、さらに数週間、相対的に漸増した（図３ｂおよび図３ｃ）。
【０１２１】
薬理作用のアルプロティナーゼ阻害剤は、高度に再増殖したマウスの生存能力を長期間維持するために必要であり得、該ドナー肝細胞により産生されたヒト補体は、受容者の腎臓に損害を与える可能性がある（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ． Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：９０１−９１２，２００４参照）。したがって、いくつかの（ｎ＝３）高度に再増殖したマウスを、長期間観察した。これらのマウスは、ＮＴＢＣの投与を中止した４ヶ月間減量しなくて、マウスのヒトアルブミン濃度は、安定していた。さらに、該マウスの腎臓は、採取時に、肉眼的かつ組織学的に正常であった（図２ｇ）。
【０１２２】
実施例５：ヒト肝細胞の連続移植
前述の肝臓異種再増殖モデルの限界のうちの１つは、生着されたヒト肝細胞をさらに増大させる能力の低下である。該ＦＲＧマウス系において、連続移植の実行可能性を試験するために、高度に再増殖した一次受容者の肝臓（約７０％ヒト細胞）を潅流し、実質肝細胞を、標準コラゲナーゼ消化プロトコルを用いて採取した。
【０１２３】
ヒト細胞で再増殖したマウスに麻酔をかけ、門脈または下大静脈に、２４ゲージのカテーテルを用いてカニューレを挿入した。該肝臓を、０．５ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳが追加された無カルシウムおよび無マグネシウムのＥＢＳＳで５分間潅流した。該溶液は、０．１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＸＩ（ｓｉｇｍａ）および０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（ｓｉｇｍａ）が追加されたＥＢＳＳに１０分間変更した。該肝臓は、第２の溶液中で徐々に細分化し、７０μｍおよび４０μｍのナイロン製のメッシュで連続して濾過した。５分間、１５０ｘｇで遠心分離した後、該ペレットを、５０ｘｇで２分間、さらに２回洗浄した。細胞の数および生存能力は、トリパンブルー色素排除試験法により評価した。
【０１２４】
１００μｌのＤＭＥＭ中に懸濁された１００万の生存能力のある細胞を、２７ゲージ針で受容者の脾臓に注入した。Ｆａｈ陽性ヒト肝細胞とＦａｈ陰性マウス肝細胞に分離することなく、二次ＦＲＧ受容者への肝細胞の移植手術を行った。一次生着のために使用した該細胞と対照的に、本方法において採取されたヒト肝細胞の生存能力は、＞８０％であり、それらは、コラーゲンで被覆した培養プレートに容易に付着した（図４ｃ〜ｅ）。二次受容者の生着後、該連続移植は、類似の方法において、三次および四次受容者に対して継続された。各世代において、すべてではないが、一部の受容マウスのヒト血清アルブミンは、高度に陽性になった（図４ａ）。高度に再増殖したマウスの割合は、順次移植受容者においてさらに高く（７／４３と比較して１７／２８）、アルブミンの増加率は、さらに一貫していた（図３ｅ）。これは、連続継代の肝細胞が、最も移植可能なヒト肝細胞の質を高めることを表す可能性がある、あるいは、ドナーマウスから新たに採取した細胞のさらなる高品質および生存能力を単に反映する可能性がある。アルブミン陽性マウスからの肝臓試料のゲノムＰＣＲは、各世代において、ヒトＤＮＡの存在を示した（図４ｂ）。ヒト肝細胞による肝臓再増殖はまた、ＦＡＨに対する蛍光免疫染色により確認された（図４ｃ〜ｅ）。組織学的検査は、生着されたヒト肝細胞が、各世代において、形態学的に類似し、明らかにＦＡＨ陽性であることを示した（図４ｆ〜ｈ）。
【０１２５】
実施例６：肝細胞再増殖は、細胞融合の結果ではない。
【０１２６】
ウロキナーゼトランスジェニックマウスにおいて、一次細胞を用いた肝臓再増殖の最新報告は、細胞融合が、明らかな「肝細胞再増殖」を潜在的に明らかにすることを実証した（Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２５：２４７−２５７，２００６）。ｕＰＡトランスジェニックマウスが、その研究に使用されたため、これらの所見は、細胞融合がまた、他の報告において、マウス肝臓ヒト化のメカニズムでもあることの可能性を高めた。造血細胞と肝細胞との間の細胞融合はまた、Ｆａｈ欠損マウスにおいても観察されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４２２：８９７−９０１，２００３）。マウス細胞とヒト細胞との間の細胞融合は、薬学的応用のために、ヒト化マウス肝臓の価値を大幅に減退し得る。該再増殖した肝細胞が、元来は真にヒト肝細胞であったことを確認するために、ヒトまたはマウス特異的アルブミン、およびＦＡＨに対して二重免疫染色を行った。ほとんど（＞９５％）のマウスアルブミン陽性肝細胞は、実際には、ＦＡＨ陰性であり、ほとんどのＦＡＨ陽性肝細胞は、マウスアルブミン陰性であった（図５ａ〜ｃ）。他方では、ほとんどすべて（＞９０％）のヒトアルブミン陽性肝細胞はまた、ＦＡＨ陽性であるが、一方残りの肝細胞は、二重陰性であった（図５ｄ〜ｆ）。
【０１２７】
アルブミンは、分泌タンパク質であり、故に、細胞は、他の細胞から異種アルブミンを得ることにより抗体陽性を示すことができた。細胞融合の欠如をさらに確認するために、ヒトおよびマウス抗主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗体を、フローサイトメトリーのために使用した。各抗体は、種特異であることが確認された（図５ｇ〜ｊ）。両方の種の表面マーカーとも肝細胞陽性でないことが、高度に再増殖した肝臓に認められた（図５ｋおよび図５ｌ）。
【０１２８】
最終的に、蛍光原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、高度に再増殖した移植受容者から得た肝細胞に、ヒトおよびマウス全ゲノムプローブを用いて行った。高度に再増殖した一次（キメラマウス＃５３１）および三次（キメラマウス＃６３１）マウスから得た肝細胞を、ヒト全ゲノムＤＮＡあるいはマウス全ゲノムＤＮＡを用いてハイブリダイズした。該ヒトプローブまたは該マウスプローブに対して陽性である細胞の割合を記録した（表３）。対照は、純ヒトおよびマウス肝細胞、またはヒト肝細胞とマウス肝細胞の等混合であった。キメラ肝臓において見出されたヒト細胞が、細胞融合の産物であった場合、多くの肝細胞は、ヒトプローブとマウスプローブの両方に対して二重陽性であり、故に、マウスＤＮＡおよびヒトＤＮＡが陽性である細胞の割合は、１００％を超え得る。それどころか、割合合計は、ヒト肝細胞とマウス肝細胞の混合の場合と同じように、ほぼ１００％であると概算された。さらに、ヒト肝細胞は、脾臓が、ヒト細胞の融合パートナーとしての役割をし得るマウス肝細胞を欠如するという事実にもかかわらず、高度に再増殖したマウスの脾臓に検出された（図２ｈ）。したがって、二重陽性細胞（融合産物）は、ヒト細胞の大部分を占めることができなかった。
【０１２９】
【表３】
総合すれば、これらの結果は、融合事象が生じる場合、融合事象は、まれであり、再増殖する細胞の大部分は、連続移植を行う場合でさえ、純ヒト由来からなることを示す。したがって、ＦＲＧマウスにおいて増大されるヒト肝細胞は、ヒトの遺伝的および生化学的性質のみ有する。
【０１３０】
実施例７：ヒト化マウスにおける薬物代謝の機能的特性
キメラマウスにおける、ヒト肝臓特異的遺伝子の基底の発現および誘導を、検査した。培養された肝細胞におけるテストステロン代謝およびエトキシレソルフィン−Ｏ−デエチラーゼ（ＥＲＯＤ）活性の評価を、それぞれ、Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙら（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ．２７：８８７−８９４，１９９９）、およびＷｅｎら（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３０：９７７−９８４，２００２）に記載されるように実行した。ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲを、Ｋｏｍｏｒｏｓｋｉら（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３２：５１２−５１８，２００４）に記載されるように実行した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られたプライマーは、ヒトＣＹＰ１Ａ１（Ｈｓ００１５３１２０＿ｍ１）、ＣＹＰ１Ａ２（Ｈｓ００１６７９２７＿ｍ１）、ＣＹＰ３Ａ４（Ｈｓ００４３００２１＿ｍ１）、ＣＹＰ３Ａ７（Ｈｓ００４２６３６１＿ａ１）、ＣＹＰ２Ｂ６（Ｈｓ００１６７９３７＿ｇ１）、ＣＹＰ２Ｄ６（Ｈｓ００１６４３８５＿ａ１）、多剤体制関連タンパク質ＭＲＰ２（Ｈｓ００１６６１２３＿ｍ１）、胆汁塩輸出ポンプＢＳＥＰ、（Ｈｓ００１８４８２９＿ｍ１）、ＣＡＲ（Ｈｓ００２３１９５９＿ｍ１）アルブミン（Ｈｓ００６０９４１１＿ｍ１）、ＨＮＦ４α（Ｈｓ００２３０８５３＿ｍ１）、シクロフィリン（Ｈｓ９９９９９９０４＿ｍ１）、およびマウスアクチン（Ｍａ００６０７９３９＿ｓ１）に対して特異的であった。
単離された肝細胞の培養物を、構築し、シトクロムＰ４５０遺伝子の原型誘導物質に暴露した。該結果は、シトクロム（ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７）、輸送（ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２）、および薬物抱合酵素（ＵＧＴ１Ａ１）の基底遺伝子発現レベルは、培養された正常成熟ヒト肝細胞に見られる、まさにそのものであった（図６ｃ、図７）。さらに、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）のような化合物により誘発された遺伝子型は、正常ヒト細胞から予期されたとおりであった。ヒト薬物代謝遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに加えて、ヒトＣＹＰ１Ａおよび３Ａファミリーメンバーの酵素活性を測定した。エトキシレソルフィン−Ｏ−デエチラーゼ活性（ＥＲＯＤ）は、ヒト肝臓において、ＣＹＰ１Ａ１および１Ａ２により媒介されることが知られている。該結果は、ＥＲＯＤ活性が、ヒト化マウス肝臓細胞において、ＢＮＦへの事前暴露により特異的かつ堅牢的に誘導されたことを示す（図６ａ）。逆に、ＰＢまたはリファンピシンへの事前暴露は、ＣＹＰ３Ａ４を介した代謝の特異的測定である６−ベータ−ヒドロキシルテストステロンへのテストステロンの転換を特異的に誘導した（図６ｂ）。したがって、再増殖したＦＲＧ肝臓からの肝細胞は、これらの標準薬物代謝アッセイにおいて、正常成熟ヒト肝細胞との区別がつかなかった。
【０１３１】
実施例８：肝細胞再増殖前のマクロファージの減損
一次生着は、ウロキナーゼアデノウイルスの事前投与を行っても、１００％のＦＲＧ受容マウスで生じなかった。ＦＲＧマウスにおいて、正常数存在する肝臓マクロファージは、先天性免疫反応を促進することにより、ヒト細胞生着を限定することが可能である。
【０１３２】
潜在的なマクロファージにより惹起される免疫反応を中止するために、ＦＲＧマウスから、ヒト肝細胞の移植手術前に、マクロファージを減損させる。マクロファージ減損は、化学的減損（Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：３５−４３，２００３）、または抗体（ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０６：１２５９−１２６１，２００５）を用いることを含む、当技術分野で周知のいくつかの方法のうちのいずれか１つを用いて達成され得る。マクロファージはまた、クロドロネート含有リポソームを用いて減損され得る（ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０２：２５２２−２５３１，２００３）。マクロファージを減損するための追加の化合物および組成物は、米国特許公開第２００４−０１４１９６７号およびＰＣＴ公開第ＷＯ ０２／０８７４２４号に記載され、参照することにより本明細書に組み込まれる。マクロファージ減損後、ＦＲＧマウスに、本明細書の前述の実施例に記載される方法に従って、ヒト肝細胞を移植する、または連続移植する。
【０１３３】
実施例９：ＦｐｍＲＧマウスにおけるヒト肝細胞の生着
ＦＲＧマウスは、Ｆａｈ遺伝子のエクソン５（ＦａｈΔｅｘｏｎ５）に欠失を含む。ヒト肝細胞を、Ｆａｈ欠損の他のモデルにおいて、生着および増大し得ることを確認するために、Ｆａｈ遺伝子に点変異を含むマウス株を作製した。Ｆａｈ点変異（Ｆａｈｐｍ）マウスと呼ばれる、これらのマウスは、ミススプライシングを起させＦａｈ ｍＲＮＡにおいて、エクソン７の喪失を生じさせる該Ｆａｈ遺伝子に点変異を有する（Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６４１−６４５，２００１、参照することにより本明細書に組み込まれる）。表現型における差異は、ＦａｈｐｍマウスとＦａｈΔｅｘｏｎ５マウスとの間で検出されなかった。
【０１３４】
ＦａｈｐｍマウスをＲａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウス（実施例１に記載されるような）と交配させて、ホモ接合性Ｆａｈｐｍ／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦｐｍＲＧ）三重変異体マウスを作製した。ＦｐｍＲＧマウスの２つのコホートに、実施例４に記載される方法に従って、ヒト肝細胞を移植した。肝細胞移植手術の約２４〜４８時間前、マウスは、ｕＰＡアデノウイルスの静脈注射（後眼窩注射）を受けた。比較するために、同時に、ＦＲＧマウスに、ヒト肝細胞を移植した。ヒト血清アルブミンを、移植手術から２ヶ月および３ヶ月後に、極めて有意なレベル（２３μｇ／ｍｌ）で、ＦｐｍＲＧマウスの末梢血に検出した。ヒト血清アルブミンのこれらの血中濃度は、同時に移植されたＦＲＧマウスに見られる濃度と似ていた。
【０１３５】
これらの結果は、ＦｐｍＲＧマウスが、ＦＲＧマウスと同程度に、ヒト肝細胞で再増殖することができることを示す。したがって、ヒト化肝臓再増殖は、ＦａｈΔｅｘｏｎ５変異を有するＦＲＧマウスに特有ではないが、Ｆａｈ欠損マウスの任意の株で達成することができる。
【０１３６】
本開示は、生体内でヒト肝細胞を増大させるための方法を提供する。本開示は、生体内でヒト肝細胞を増大させるのに有用な遺伝子組み換え型免疫不全マウスをさらに提供する。記載される方法の正確な詳細は、本発明の趣旨から逸脱することなく、変更または修正することができることは明らかであろう。下記の特許請求の範囲および趣旨に入る範囲内ですべてのこのような修正および変更を請求する。
【０１３７】
配列表
添付の配列表に記載される核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語、およびアミノ酸の三文字コードを示す。各核酸配列の１本鎖のみを示すが、該相補鎖は、表示された該鎖に言及するときは常にそれに含まれるものとして理解する。添付の配列表において、
配列番号１および２は、ヒトＡｌｕ配列を増幅するためのＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１３８】
配列番号３は、ヒトＡＬＢ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１３９】
配列番号４は、ヒトＡＬＢ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４０】
配列番号５は、マウスＡｌｂ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４１】
配列番号６は、マウスＡｌｂ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４２】
配列番号７は、ヒトＴＡＴ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４３】
配列番号８は、ヒトＴＡＴ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である
配列番号９は、ヒトＴＦ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４４】
配列番号１０は、ヒトＴＦ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４５】
配列番号１１は、ヒトＦＡＨ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４６】
配列番号１２は、ヒトＦＡＨ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４７】
配列番号１３は、ヒトＴＴＲ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４８】
配列番号１４は、ヒトＴＴＲ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４９】
配列番号１５は、ヒトＵＧＴ１Ａ１順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１５０】
配列番号１６は、ヒトＵＧＴ１Ａ１逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【技術分野】
【０００１】
関連特許の相互参照
本願は、２００７年６月５日に出願された米国暫定特許出願第６０／９３３，４３２号の利益を主張するものであり、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の声明
本発明は、米国立衛生研究所の国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所からの授与番号ＤＫ０５１５９２に基づいて、米国政府の支援でもってなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、ヒト肝細胞を増大させる方法、具体的には、免疫不全マウスを利用して、ヒト肝細胞を増大させる方法を目的とする。
【背景技術】
【０００４】
肝臓は、医薬を含む生体異物化合物を代謝する主要な部位である。多くの肝酵素が種特異的であるため、培養された一次ヒト肝細胞またはそれらのミクロソーム分画を用いて、候補医薬の代謝を評価することが必要である（非特許文献１、非特許文献２）。ミクロソーム肝細胞分画を用いて、一部の代謝機能を解明することができる一方、他の試験は、生きている肝細胞に依存する。例えば、一部の化合物は、肝酵素を誘導し、ひいては、それらの代謝は、経時的に変化する。酵素誘導を分析するために、肝細胞は、生存能力があるだけでなく、十分に分化し、かつ機能的でなければならない。
【０００５】
薬物代謝および他の研究に関しては、肝細胞は、一般に、死体臓器ドナーから単離し、試験が行われる場所に輸送される。死体源からの肝細胞の状態（生存能力および分化の状態）は、極めて変わりやすく、多くの細胞調製物の品質は、あまり良くない。高品質のヒト肝細胞の利用可能性は、組織培養において有意に増大することができないという事実によりさらに妨げられる（非特許文献３、非特許文献４）。播種した後、該細胞は、生存するが、分裂しない。マウス等のすぐに利用できる哺乳類種からの肝細胞は、代謝酵素の異なる相補体を有し、誘導研究において異なって反応するため、薬物試験には適さない。不死化ヒト肝細胞（肝細胞腫）または胎児肝芽細胞も、十分に分化した成熟細胞の適切な代用物ではない。ヒト肝細胞はまた、微生物学の分野における研究に必要である。肝炎を生じるウイルス等の多くのヒトウイルスは、任意の他の細胞型で複製することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｒａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８９：２３３−２４６，２００３
【非特許文献２】Ｇｏｍｅｚ−Ｌｅｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．４：２９２−３１２，２００３
【非特許文献３】Ｒｕｎｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７４：１−３，２０００
【非特許文献４】Ｃａｓｃｉｏ Ｓ．Ｍ．，Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ ２５：５２９−５３８，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの限界を考えると、一次ヒト肝細胞を増大させる方法が、非常に望ましい。よって、ヒト肝細胞を増大させるための堅牢なシステムを本明細書に提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
生体内でヒト肝細胞を増大させる方法を本明細書に提供する。該方法は、免疫不全マウスに単離したヒト肝細胞を注入するステップと、該肝細胞を増大させるステップと、該ヒト肝細胞を採取するステップと、を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ヒト肝細胞は、免疫不全受容マウスに投与され、該マウスは、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）がさらに欠損している。一部の実施形態において、該マウスは、Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）マウスである。他の実施形態において、該マウスは、Ｆａｈｐｍ／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦｐｍＲＧ）マウスである。該方法の一部の実施形態において、ヒトウロキナーゼをコード化するベクターが、ヒト肝細胞の注入前、マウスに投与される。他の実施形態において、マクロファージは、肝細胞注入前、マウスから減損させる。
【００１０】
一部の実施例において、該ヒト肝細胞は、ＦＲＧマウスまたはＦｐｍＲＧマウスのような受容マウスにおいて、少なくとも約２週間、増大する。その増大させたヒト肝細胞は、該受容マウスから採取される。一実施形態において、その単離されたヒト肝細胞は、該受容マウスの脾臓に注入され、その増大させたヒト肝細胞は、該マウスの肝臓から採取される。その採取された肝細胞は、さらなる増大のために、ＦＲＧマウスまたはＦｐｍＲＧマウスのような別の受容マウスに導入することができる。よって、該方法は、ヒト肝細胞の追加の増大のために繰り返して使用することができる。
【００１１】
本明細書に提供される方法の一実施形態において、Ｆａｈ欠損マウスに、肝細胞注入前、肝臓疾患の発症を阻害、または予防、または遅延する薬剤が投与される。このような一薬剤は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）である。ＮＴＢＣ、または他の適した薬剤は、飲料水内投与、食物内投与、または注入が挙げられるが、これらに限定されない、任意の適した手段により投与することができる。ＮＴＢＣは、任意に、肝細胞注入後、少なくとも約３日間から少なくとも約６日間投与される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ヒト肝細胞は、臓器ドナーから、または外科的切除術の肝臓から得られる。一部の実施形態において、該ヒト肝細胞は、幹細胞に由来する。追加の実施形態において、ヒト肝細胞は、注入前、凍結保存される。さらなる実施形態において、該ヒト肝細胞は、肝細胞の細胞株からのものである。
【００１３】
また、遺伝子組み換えマウスであって、そのゲノムは、欠失または点変異が、機能的ＦＡＨ、ＲＡＧ−２、およびＩＬ−２Ｒγタンパク質の発現の喪失をもたらすような、Ｆａｈ、Ｒａｇ２、およびＩｌ２ｒｇ遺伝子において、該欠失または点変異がホモ抱合体であり、該マウスは、免疫不全であり、肝機能の低下を示し、ヒト肝細胞を、該マウスに増大させることができる、遺伝子組み換えマウスを、本明細書に提供する。一実施形態において、該欠失は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の完全喪失をもたらす。別の実施形態において、該マウスは、ヒトウロキナーゼを発現する。
【００１４】
前述ならびに他の特性および利点は、いくつかの以下の実施形態の発明を実施するための形態からさらに明らかになり、添付の図を参照して進める。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】ヒト肝細胞により生着および再増殖した後、三重変異体ＦＲＧマウス（＃４７１）および２匹のヘテロ接合同腹子（＃４６９、＃４７０）の相対的重量を示すグラフ。該ＦＲＧマウスは、移植後６週間、その体重を維持したが、Ｉｌ２ｒｇ遺伝子のヘテロ接合同腹子は、継続的に減量した。ＮＴＢＣは、第１週目および第４週目にのみ投与され、陰影で示す。
【図１ｂ】肝細胞受容肝臓からのゲノムＤＮＡにおけるヒトＡｌｕ配列のＰＣＲ増幅産物を示すゲルのデジタル画像。ＦＲＧマウスのみが陽性であった。
【図１ｃ】野生型（図１ｃ）のＦＡＨ酵素活性を示すグラフ。ＦＡＨ基質濃度は、野生型マウス肝臓において低下したが、Ｆａｈ−／−マウス肝臓では変化しなかった。ヒト化マウス肝臓は、十分な酵素活性を示した。
【図１ｄ】Ｆａｈ（−／−）（図１ｄ）のＦＡＨ酵素活性を示すグラフ。ＦＡＨ基質濃度は、野生型マウス肝臓において低下したが、Ｆａｈ−／−マウス肝臓では変化しなかった。ヒト化マウス肝臓は、十分な酵素活性を示した。
【図１ｅ】ヒト化マウス肝臓（図１ｅ）のＦＡＨ酵素活性を示すグラフ。ＦＡＨ基質濃度は、野生型マウス肝臓において低下したが、Ｆａｈ−／−マウス肝臓では変化しなかった。ヒト化マウス肝臓は、十分な酵素活性を示した。
【図１ｆ】８０％を超える肝細胞がＦＡＨに対して陽性であることを示す（暗染および大きな矢印により示される）、再増殖したマウス肝臓におけるＦＡＨ免疫染色のデジタル画像。小さい矢印は、ＦＡＨ陰性細胞を画定する。
【図１ｇ】ヒト肝細胞は、好酸性が低いことを示す（矢印により示される）、同一の肝切片のＨ＆Ｅ染色のデジタル画像。原拡大率×２００
【図２ａ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ＦＡＨ陽性ヒト肝細胞は、マウス肝臓組織に統合したが、受容者の肝臓微細構造を阻害しなかったことを示すデジタル画像。
【図２ｂ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。高度に再増殖したキメラ肝臓はまた、正常構造を持つことを示すデジタル画像。
【図２ｃ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ヒト肝細胞クラスターは、好酸性が低いことを示すＨ＆Ｅ染色のデジタル画像。
【図２ｄ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ヒト肝細胞クラスターは、好酸性が低いことを示すＨ＆Ｅ染色のデジタル画像。
【図２ｅ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ＦＡＨの染色した連続切片を示すデジタル画像。
【図２ｆ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。ＨｅｐＰａｒの染色した連続切片を示すデジタル画像。
【図２ｇ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。移植してから４ヶ月後でさえ、管状または糸球体の破壊がないことを示す、高度に再増殖したマウスからの腎臓切片のデジタル画像。
【図２ｈ】キメラマウスからの組織学的および免疫組織化学的組織切片のデジタル画像。脾臓におけるＦＡＨ陽性ヒト肝細胞を示すデジタル画像。原拡大率×１００（図２ｃ）、×２００（図１ａ、２ｂ、２ｅ、２ｆ、および２ｇ）、×４００（図２ｄおよび２ｈ）。
【図３ａ】キメラマウス肝臓からのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す、一連のゲル切片。ヒトＡＬＢ、ＦＡＨ、ＴＡＴ、ＴＦ、ＴＴＲ、およびＵＧＴ１Ａ１遺伝子を、キメラマウス肝臓（＃６９７および＃７８５）において発現させた。ヒト肝細胞およびマウス肝細胞はそれぞれ、陽性および陰性対照として用いた。
【図３ｂ】図３ｂ（正常プロット）は、ＥＬＩＳＡを用いて、一次肝細胞受容者のヒトアルブミン血中濃度を示すグラフである。システムの閾値濃度は、約０．００５μｇ／ｍｌである。
【図３ｃ】図３ｃ（対数プロット）は、ＥＬＩＳＡを用いて、一次肝細胞受容者のヒトアルブミン血中濃度を示すグラフである。システムの閾値濃度は、約０．００５μｇ／ｍｌである。
【図３ｄ】図３ｄ（正常プロット）は、二次受容者のヒトアルブミン濃度を示すグラフである。対数プロットは、アルブミン濃度の倍加時間が約１週間であることを示す。
【図３ｅ】図３ｅ（対数プロット）は、二次受容者のヒトアルブミン濃度を示すグラフである。対数プロットは、アルブミン濃度の倍加時間が約１週間であることを示す。
【図４ａ】一次細胞（極左の暗ボックス）を始めとして連続移植スキームを示す概略図。暗ボックスは、再増殖した連続受容者を示し、白ボックスは、非生着マウスを示す。一次受容者の１／４のみが、再増殖されたが、６匹すべての二次受容者が、生着された。
【図４ｂ】連続的に移植された受容者の肝臓からのＡｌｕ配列のＰＣＲ増幅産物を示すゲルのデジタル画像。
【図４ｃ】三次マウスから培養された７０％を超える肝細胞が、ＦＡＨに対して陽性であったことを実証するＦＡＨ免疫細胞化学により解析された肝細胞のデジタル画像。
【図４ｄ】三次マウスから培養された７０％を超える肝細胞が、ＦＡＨに対して陽性であったことを実証するＦＡＨ免疫細胞化学により解析された肝細胞のデジタル画像。
【図４ｅ】三次マウスから培養された７０％を超える肝細胞が、ＦＡＨに対して陽性であったことを実証するＦＡＨ免疫細胞化学により解析された肝細胞のデジタル画像。
【図４ｆ】連続的に移植されたマウス肝臓のＦＡＨ免疫組織化学を示す、組織切片のデジタル画像。一次（図４ｆ）受容者の肝臓が、ヒト肝細胞により再増殖された。
【図４ｇ】連続的に移植されたマウス肝臓のＦＡＨ免疫組織化学を示す、組織切片のデジタル画像。二次（図４ｇ）受容者の肝臓が、ヒト肝細胞により再増殖された。
【図４ｈ】連続的に移植されたマウス肝臓のＦＡＨ免疫組織化学を示す、組織切片のデジタル画像。三次（図４ｈ）受容者の肝臓が、ヒト肝細胞により再増殖された。
【図５ａ】キメラマウス肝細胞の抗マウスアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。キメラ肝臓からのほとんどの肝細胞は、マウスアルブミンまたはＦＡＨ単一陽性であった。
【図５ｂ】キメラマウス肝細胞の抗マウスアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。キメラ肝臓からのほとんどの肝細胞は、マウスアルブミンまたはＦＡＨ単一陽性であった。
【図５ｃ】キメラマウス肝細胞の抗マウスアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。キメラ肝臓からのほとんどの肝細胞は、マウスアルブミンまたはＦＡＨ単一陽性であった。
【図５ｄ】キメラマウス肝細胞の抗ヒトアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。ほとんどの肝細胞は、ヒトアルブミンおよびＦＡＨ二重陽性であった。原拡大倍率×１００。
【図５ｅ】キメラマウス肝細胞の抗ヒトアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。ほとんどの肝細胞は、ヒトアルブミンおよびＦＡＨ二重陽性であった。原拡大倍率×１００。
【図５ｆ】キメラマウス肝細胞の抗ヒトアルブミンおよび抗ＦＡＨ免疫細胞化学のデジタル画像。ほとんどの肝細胞は、ヒトアルブミンおよびＦＡＨ二重陽性であった。原拡大倍率×１００。
【図５ｇ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（図５ｇ）に対する対照ヒト肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｈ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。Ｈ−２Ｋｂ（図５ｈ）に対する対照ヒト肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｉ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（図５ｉ）に対する対照マウス肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｊ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。Ｈ−２Ｋｂ（図５ｊ）に対する対照マウス肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｋ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。高キメラマウス（図５ｋ）からの肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図５ｌ】キメラマウス肝細胞のフローサイトメトリー解析を示すグラフ。ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、ＣおよびＰＥ結合抗Ｈ−２Ｋｂを用いた。高キメラマウス（図５ｌ）からの肝細胞を示し、それらは、ＨＬＡまたはＨ−２Ｋｂのいずれか一つに対して単一に陽性であった。
【図６ａ】エトキシレソルフィン−Ｏ−デエチラーゼ（ＣＹＰ１Ａ１依存）の代謝（図６ａ）を示すグラフ。ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスから培養された肝細胞を分析した。
【図６ｂ】６−β−ヒドロキシルテストステロン（ＣＹＰ３Ａ４媒介）へのテストステロンの転換（図６ｂ）を示すグラフ。ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスから培養された肝細胞を分析した。
【図６ｃ】定量的ＲＴ−ＰＣＲにより判定される、薬物代謝、薬物移送、および薬物抱合に関する、ヒト特異遺伝子のｍＲＮＡレベルを示すグラフ。ヒト薬物代謝遺伝子の比率は、成熟ヒト肝細胞に特有である。
【図７ａ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。マウスアクチンｍＲＮＡに対して正規化した、３つの試料における肝臓特異的遺伝子の基底発現の棒グラフ。
【図７ｂ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＣＹＰ３Ａ４（図７ｂ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｃ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＣＹＰ２Ｂ６（図７ｃ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｄ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＣＡＲ（核ホルモン受容体）（図７ｄ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｅ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＭＤＲ１（輸送体）（図７ｅ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｆ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＭＲＰ（図７ｆ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｇ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＢＳＥＰ（輸送体）（図７ｇ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【図７ｈ】ヒト肝細胞ヒト肝細胞の再増殖の異なるレベル（Ｍ７９０ １０％、Ｍ６９７ ３０％、およびＭ７８５ ６０％）を有する３匹のマウスからの肝細胞における、肝臓特異的遺伝子および薬物代謝と関連する遺伝子の遺伝子発現の基底レベルを示すグラフ。非誘導培養物中の誘導と比較した、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）に反応する薬物代謝に関連するｍＲＮＡの誘導の棒グラフ。ＰＸＲ（核ホルモン受容体）（図７ｈ）を示す。フェノバルビタールによるＣＹＰ３Ａ４の誘導は、酵素量における誘導よりもさらになお著しかった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ｉ． 略語
ＡＡＶ アデノ随伴ウイルス
ＡＬＢ アルブミン
ＡＬＴ アラニン・アミノトランスフェラーゼ
ＡＳＴ アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
ＢＮＦ ベータナフトフラボン
ＤＡＢ ジアミノベンジジン
ＥＬＩＳＡ 酵素免疫測定法
ＥＲＯＤ エトキシレソルフィン−Ｏ−デエチラーゼ
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞分類
ＦＡＨ フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ
ＦＩＳＨ 蛍光原位置ハイブリダイゼーション
ＦＩＴＣ フルオレセインイソチオシアネート
ＦＲＧ Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−三重変異体マウス
ＨＬＡ ヒト白血球抗原
ＩＬ−２Ｒγ インターロイキン２受容体γ
ＭＨＣ 主要組織適合性複合体
ＮＴＢＣ ２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３ シクロヘキサンジオン
ＰＢ フェノバルビタール
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥ フィコエリトリン
ＰＦＵ プラーク形成単位
ＲＡＧ リコンビナーゼ活性化遺伝子
Ｒｉｆ リファンピシン
ＲＴ−ＰＣＲ 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＴＡＴ チロシンアミノ転移酵素
ＴＦ トランスフェリン
ＴＴＲ トランスサイレチン
ＵＧＴ１Ａ１ ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１
ｕＰＡ ウロキナーゼプラミノーゲン活性化因子
ＩＩ． 用語
別途記載のない限り、技術用語は、従来の用法に準拠して使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓより出版、１９９４（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）、およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．より出版、１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）において見出すことができる。
【００１７】
本発明の種々の実施形態の概説を容易にするために、具体的な用語の以下の説明を提供する。
【００１８】
肝臓疾患の発症を阻害するまたは予防する薬剤：ＦＲＧマウス, またはＦｐｍＲＧマウス、または他の型のＦａｈ欠損マウスに投与される場合、マウスにおける肝臓疾患の発症を予防、または遅延、または阻害する化合物または組成物。肝臓疾患または肝機能障害は、肝組織像の変化（壊死、炎症、異形成、または肝臓癌等）、肝臓特異的酵素および他のタンパク質（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニン・アミノトランスフェラーゼ、ビリルビン、アルカリフォスファターゼ、およびアルブミン等）のレベルの変化、または全身性肝不全が挙げられるが、これらに限定されない、兆候または症状のうちのいずれか１つにより特徴付けられる。一実施形態において、肝臓疾患を阻害する薬剤は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）である。
【００１９】
羊膜細胞：胎児を取り囲む羊水中に見られる細胞。
【００２０】
抗体：免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にコード化された１つもしくは複数のポリペプチドを含むタンパク質（またはタンパク質複合体）。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖はガンマ、またはミュー、またはアルファ、またはデルタ、またはイプシロンに分類され、同様に、各々ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの免疫グロブリンを表す。
【００２１】
基本的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、通常、テトラマーである。各々のテトラマーは、２つの同一のペアのポリペプチド鎖から成り、各々のペアは、１つの「軽い」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重い」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各々の鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を定義する。「可変軽鎖」（ＶＬ）および「可変重鎖」（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００２２】
本明細書に使用される、「抗体」という用語は、完全な免疫グロブリン、ならびによく特徴付けられたフラグメントをいくつか含む。例えば、標的タンパク質（またはタンパク質または融合タンパク質内のエピトープ）に結合するＦａｂｓ、Ｆｖｓ、および一本鎖Ｆｖｓ（ＳＣＦｖｓ）は、そのタンパク質（またはエピトープ）のための特異的結合剤でもある。これらの抗体フラグメントは、以下のように定義される。（１）Ｆａｂ、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部分を産生するために、酵素パパインによる全抗体の消化により生成された抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメント、（２）Ｆａｂ’、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部分を産生するために、ペプチンで全抗体を処理し、次いで、還元することにより得られる、抗体分子のフラグメント、（３）（Ｆａｂ’）２、後続の還元を伴わずに酵素ペプチンで全抗体を処理することにより得られる、抗体のフラグメント、（４）Ｆ（ａｂ’）２、２個のジスルフィド結合により２つのＦａｂ’フラグメントが一緒にされた二量体、（５）Ｆｖ、２本の鎖として発現された軽鎖の可変域および重鎖の可変域を含む遺伝子組み換えフラグメント、および（６）１本鎖抗体、遺伝子融合１本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーにより連結された、軽鎖の可変域、重鎖の可変域を含む遺伝子組み換え分子, として定義される。これらのフラグメントを作製する方法は、日常的である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９を参照）。
【００２３】
本開示の方法に用いられる抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。単に一例として、モノクローナル担体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎの古典的方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７，１９７５）またはその誘導的な方法に従って、ネズミハイブリドーマから調製することができる。モノクローナル抗体生成のための詳細な手順は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。
【００２４】
Ｂ細胞：体液性免疫反応に大きな役割を果たすリンパ球の一型。Ｂ細胞の主要機能は、可溶性抗原に対して抗体を作製することである。Ｂ細胞は、適応免疫系の不可欠な要素である。
【００２５】
採取：本明細書に使用される増大されたヒト肝細胞を「採取する（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ）」とは、単離されたヒト肝細胞を注入されているマウス（または受容マウスとも称される）から増大された肝細胞を除去するプロセスをさす。採取は、任意に、肝細胞を他の細胞型から分離することを含む。一実施形態において、その増大されたヒト肝細胞は、Ｆａｈ欠損マウスの肝臓から採取される。一部の例において、その増大されたヒト肝細胞は、ＦＲＧマウスまたはＦｐｍＲＧマウスの肝臓から採取される。
【００２６】
インターロイキン受容体の一般的なγ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）：インターロイキン受容体の一般的なガンマ鎖をコード化する遺伝子。Ｉｌ２ｒｇは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を含む、いくつかのインターロイキンに対する受容体の構成要素である（Ｄｉ Ｓａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：３７７−３８１，１９９５）。Ｉｌ２ｒｇの欠損した動物は、Ｂ細胞およびＴ細胞の減少を示し、ナチュラルキラー細胞が欠如する。
【００２７】
凍結保存：本明細書に使用される「凍結保存」とは、７７Ｋまたは−１９６℃（液体窒素の沸点）等の低い氷点下の温度まで冷却することにより保存または維持されている細胞または組織を指す。これらの低温度で、細胞死をもたらす生化学的反応を含む、いかなる生物学的活性も、効果的に停止する。
【００２８】
肝機能の低下：肝臓の健康または機能を測定する多くのパラメータのうちのいずれか１つの異常変化。肝機能の低下はまた、本明細書では、「肝機能障害」と称される。肝機能は、肝組織像の検査および肝臓酵素または他のタンパク質の測定等に限定されない、当技術分野で周知のような多くの手段のうちのいずれか１つにより評価することができる。例えば、肝機能障害は、肝臓の壊死、または炎症、または酸化的損傷、または異形成で示され得る。一部の例において、肝機能障害は、肝細胞癌等の肝臓癌で示される。肝機能障害を評価するために試験され得る肝臓酵素およびタンパク質の例としては、アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン、アルカリフォスファターゼ、およびアルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。肝機能障害はまた、全身性肝不全をもたらし得る。肝機能を試験するための手順は、Ｇｒｏｍｐｅら（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）およびＭａｎｎｉｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１１９２８−１１９３３，１９９９）により教示されるもの等、当技術分野で周知であり、それらは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００２９】
欠損：本明細書に使用される「Ｆａｈ欠損」または「Ｆａｈの欠損」とは、Ｆａｈの突然変異を含む、マウス等の動物を指し、それは、Ｆａｈ ｍＲＮＡ発現および／または機能的ＦＡＨタンパク質の実質的減少、またはその欠損をもたらす。一実施形態において、該Ｆａｈ欠損動物は、Ｆａｈ遺伝子のホモ接合体欠失を含む。一例として、該ホモ接合体欠失は、Ｆａｈのエクソン５にある。別の実施形態において、該Ｆａｈ欠損動物は、Ｆａｈ遺伝子の１つもしくは複数の点変異を含む。適切なＦａｈ点変異の例は、当技術分野で知られている（例えば、Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（２）：６４１−６４５，２００１参照、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００３０】
減損する：減じるまたは除去すること。本明細書に使用される「マクロファージ減損」とは、動物におけるマクロファージを消去する、または除去する、または減じる、または殺滅するプロセスを指す。マクロファージが減損している動物は、必ずしもマクロファージが完全に欠如しているとは限らないが、少なくともマクロファージの数または活性の減少を示す。一実施形態において、マクロファージ減損は、機能的マクロファージの少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または１００％の減少をもたらす。
【００３１】
生着する：動物に細胞または組織を移植すること。本明細書に使用される、受容マウスにおいて、ヒト肝細胞の生着とは、注入後、ヒト肝細胞が受容マウスに移植されるプロセスを指す。生着されたヒト肝細胞は、受容マウスにおいて、増大することができる。本明細書に記載される、「有意な生着」とは、肝臓において、少なくとも約１％の肝細胞がヒト肝細胞である、受容マウスを指す。「高度に生着された」マウスは、肝細胞の少なくとも約３０％がヒト肝細胞である、肝臓を有するマウスである。しかしながら、生着効率はさらに高くなり得、マウス肝臓において、例えば、肝細胞の少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％がヒト肝細胞である。
【００３２】
胚幹（ＥＳ）細胞：発達する胚盤胞の内細胞塊から単離された多能性細胞。ＥＳ細胞は、多能性細胞であり、それらが、体内（骨、筋肉、脳細胞等）に存在するすべての細胞を作製することができることを意味する。ネズミＥＳ細胞を産生するための方法は、米国特許第５，６７０，３７２号に見出され得、参照することにより本明細書に組み込まれる。ヒトＥＳ細胞を産生するための方法は、米国特許第６，０９０，６２２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ ００／７００２１号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ ００／２７９９５号に見出され得、これらのそれぞれが、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００３３】
増大させる：量を増加させること。本明細書に使用される、ヒト肝細胞を「増大させる（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」とは、ヒト肝細胞の数が増加するような、細胞分裂を生じることが可能なプロセスを指す。本明細書に記載される、ヒト肝細胞は、受容マウスにおいて、少なくとも約４週間、または少なくとも約６週間、または少なくとも約８週間、または少なくとも約１２週間、または少なくとも約１６週間、または少なくとも約２０週間、または少なくとも約２４週間、または少なくとも約２８週間、増大可能である。一実施形態において、該ヒト肝細胞は、最長約６ヶ月まで増大可能である。増大から結果として生じるヒト肝細胞の数は、変化し得る。一実施形態において、増大は、少なくとも１，０００万、または少なくとも２，０００万、または少なくとも３，０００万、または少なくとも４，０００万、または少なくとも５，０００万の肝細胞をもたらす。１００万の肝細胞が最初に注入され、約１０％生着されると仮定すると、肝細胞の増大は、約１０倍〜約５００倍の範囲であり得る。一部の実施形態において、受容マウスにおいて、ヒト肝細胞の増大は、少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも１５０倍、または少なくとも２００倍、または少なくとも２５０倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも４００倍、または少なくとも５００倍、または少なくとも１，０００倍の増加をもたらす。
【００３４】
ＦＲＧマウス：フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）、リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）、およびインターロイキン受容体の共通γ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子において、ホモ接合体欠失を有する、変異体マウス。また、本明細書では、Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−と称される。本明細書に使用される、Ｆａｈ、Ｒａｇ２、およびＩｌ２ｒｇ遺伝子においてホモ接合体欠失は、機能的ＦＡＨ、ＲＡＧ−２、およびＩＬ−２Ｒγタンパク質が、突然変異を含むマウスに発現しないことを示す。
【００３５】
ＦｐｍＲＧマウス：リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）、およびインターロイキン受容体の共通γ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子のホモ接合体欠失、ならびにフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）のホモ接合体点変異を有する、変異体マウス。ＦｐｍＲＧマウスのＦａｈ遺伝子の点変異は、ｍＲＮＡにおいて、エクソン７のミススプライシングおよび喪失をもたらす（Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６４１−６４５，２００１）。また、本明細書では、Ｆａｈｐｍ／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−と称される。本明細書に使用される、Ｒａｇ２およびＩｌ２ｒｇ遺伝子のホモ接合体欠失は、機能的ＲＡＧ−２およびＩＬ−２Ｒγタンパク質が、該突然変異を含むマウスに発現しないことを示す。さらに、Ｆａｈ遺伝子のホモ接合体の点変異を有するマウスは、機能的ＦＡＨタンパク質を発現しない。
【００３６】
フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）：チロシン異化の最終ステップに触媒作用を及ぼす代謝酵素。Ｆａｈ遺伝子のホモ接合体欠失を有するマウスは、肝ｍＲＮＡ発現の変化および重度の肝機能障害を示す（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３、参照することにより本明細書に組み込まれる）。該Ｆａｈ遺伝子の点変異はまた、肝不全および出生後の致死を生じることも示している（Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（２）：６４１−６４５，２００１、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００３７】
漸減させる：本明細書に使用される、ＮＴＢＣの用量を「漸減する」とは、数日にわたるような時間とともに、Ｆａｈ欠損マウスに投与されるＮＴＢＣの用量を漸減するプロセスを指す。一実施形態において、該ＮＴＢＣ用量は、約６日間にわたり、漸減し、該用量は、約１週間後、ＮＴＢＣがもはや投与されなくなるように、約１または２日間間隔で減少する。ＮＴＢＣの漸減は、短期間または長期間にわたり行うことができ、用量の減少の間の時間間隔もまた、短くする、または長くすることができる。
【００３８】
肝細胞：肝臓の細胞質塊のうちの７０〜８０％まで作製する細胞型。肝細胞は、タンパク質合成、タンパク質保存、および炭水化物の形質転換、コレステロール、胆汁塩、およびホスホリン脂質の合成、ならびに外因性および内因性物質の解毒、修飾、および排出に関与する。該肝細胞はまた、胆汁の形成および分泌も引き起こす。肝細胞は、血清アルブミン、フィブリノゲン、および凝固因子のプロトロンビン基を製造し、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、相補体、および糖タンパク質の合成のための主部位である。さらに、肝細胞は、薬物および殺虫剤のような外因性化合物、およびステロイドのような内因性化合物を代謝する、解毒する、および不活性化する能力を有する。
【００３９】
ホモ接合：１つもしくは複数の遺伝子座で同一の対立遺伝子を有すること。本明細書に使用される、「ホモ接合体欠失」とは、１つの遺伝子の両方の対立遺伝子が同一の欠失を有する生物を指す。
【００４０】
免疫不全：免疫系のうちの少なくとも１つの不可欠な機能を欠如すること。本明細書に使用される、「免疫不全」マウスとは、免疫系の特異成分を欠如する、または免疫系の特異成分の機能を欠如するマウスである。一実施形態において、免疫不全マウスは、機能的Ｂ細胞、Ｔ細胞、および／またはＮＫ細胞を欠如する。別の実施形態において、免疫不全マウスは、さらに、マクロファージを欠如する。
【００４１】
単離された：「単離された」肝細胞とは、臓器ドナー等の特定の源から得られている、および他の細胞型から実質的に分離または精製された、肝細胞を指す。
【００４２】
マクロファージ：単球と呼ばれる特定の白血球から由来する組織内の細胞。単球およびマクロファージは、食細胞であり、脊椎動物の非特異的防御（または先天性免疫）、ならびに特異的防御（または細胞性免疫）の両方において作用する。これらの役割は、細胞残屑、および固定細胞あるいは移動細胞としての病原体を食菌する（飲み込んだ後、消化する）こと、および病原体に対して反応するために、リンパ球および他の免疫細胞を刺激することである。
【００４３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞：内因性免疫系の主成分を構成する細胞傷害性リンパ球型。ＮＫ細胞は、腫瘍およびウイルス感染した細胞の両方の宿主の拒絶反応において大きな役割を果たす。
【００４４】
受容：本明細書に使用される、「受容マウス」とは、本明細書に記載される単離されたヒト肝細胞を注入されているマウスである。一般に、ヒト肝細胞の一部（割合は異なり得る）は、受容マウスに生着する。一実施形態において、該受容マウスは、Ｆａｈがさらに欠損している免疫不全マウスである。別の実施形態において、該受容マウスは、Ｆａｈがさらに欠損しているＲａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスである。別の実施形態において、該受容マウスはＦＲＧマウスである。別の実施形態において、該受容マウスは、ＦｐｍＲＧマウスである。
【００４５】
リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）：免疫グロブリン遺伝子座とＴ細胞受容体遺伝子座の組み換えに関与する遺伝子。Ｒａｇ２遺伝子が欠損する動物は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えを行うことができず、機能的Ｔ細胞およびＢ細胞の完全喪失をもたらす（Ｓｈｉｎｋａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ６８：８５５−８６７，１９９２）。
【００４６】
連続移植：一次マウスにおいて増大された肝細胞が、採取され、さらなる増大のために二次マウスに注入等により移植される、生体内でヒト肝細胞を増大させるためのプロセス。連続移植は、三次、または四次、または追加次のマウスをさらに含むことができる。
【００４７】
幹細胞：不変の娘細胞を生成する（自己再増殖；親細胞と同一である少なくとも１つの娘細胞を生成する細胞分裂）、および特殊化細胞型を形成する（潜在力）ための特異な能力を有する細胞。幹細胞としては、胚幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、生殖系列幹（ＧＳ）細胞、ヒト間充織幹細胞（ｈＭＳＣ）、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、多能性成体幹細胞（ＭＡＰＣ）、多能性成体生殖系列幹細胞（ｍａＧＳＣ）、および非制限体幹細胞（ＵＳＳＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。生体内の幹細胞の役割は、動物の正常な生活中、破壊される細胞を置換することである。通常、幹細胞は、無制限に分裂することができる。分裂後、該幹細胞は、幹細胞として残る、または前駆細胞になる、または末端分化に移り得る。前駆細胞は、少なくとも１つの所与の細胞型の十分に分化した機能細胞を作製することができる細胞である。通常、前駆細胞は、分裂することができる。分裂後、前駆細胞は、前駆細胞のままであり得る、または末端分化に移り得る。一実施形態において、該幹細胞は、肝細胞を形成する。
【００４８】
Ｔ細胞：細胞性免疫において中心的役割を果たす白血球型、またはリンパ球型。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるＢ細胞およびＮＫ細胞の細胞表面上にある特別受容体の存在により、Ｂ細胞およびＮＫ細胞のようなリンパ球の他型と区別される。胸腺は、通常、Ｔ細胞発達のための主要臓器であると考えられる。
【００４９】
導入遺伝子：細胞または生命体のゲノムに導入される外因性核酸配列。
【００５０】
トランスジェニック動物：動物の細胞の一部において染色体外要素として存在するか、または動物の生殖細胞系ＤＮＡに（すなわち、その細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列に）安定的に組み込まれている、非内因性（異種）核酸配列を有する、通常、哺乳類である、ヒト以外の動物。異種核酸は、当技術分野で周知のような方法に従って、例えば、宿主動物の胚または胚幹細胞の遺伝子操作により、このようなトランスジェニック動物の生殖細胞系に導入される。「導入遺伝子」は、このような異種核酸、例えば、（例えば「ノックイン」トランスジェニック動物の作製用の）発現コンストラクトの形状をした異種核酸、または標的遺伝子内またはその近傍に挿入されて、（例えば「ノックアウト」トランスジェニック動物の作製用の）標的遺伝子の発現低下を生じる異種核酸を意味する。遺伝子の「ノックアウト」とは、標的遺伝子の機能低下を生じる遺伝子の配列の変化を意味し、好ましくは、このような標的遺伝子の発現は検出されないか、または有意ではない。トランスジェニックのノックアウト動物は、標的遺伝子についてヘテロ接合のノックアウト、または標的遺伝子についてホモ接合のノックアウトを含むことができる。「ノックアウト」はまた、条件的なノックアウトも含み、標的遺伝子の変化が、例えば、標的遺伝子の変化を促進する物質に動物を曝露した際、標的遺伝子部位における組換えを促進する酵素（例えばＣｒｅ−ｌｏｘ系のＣｒｅ）を導入した際、または標的遺伝子の変化を出生後に指令する他の方法で生じる場合がある。
【００５１】
ベクター：宿主細胞において複製する、および／または挿入するための、ベクターの能力を崩壊することなく、外部の核酸の挿入を可能にする核酸分子。ベクターは、複製の複製起点のような、宿主細胞において、核酸配列の複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、１つもしくは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝要素を含むこともできる。挿入ベクターは、それ自体、宿主核酸に挿入することができる。発現ベクターは、一つまたは複数の挿入遺伝子の転写および翻訳を可能にするのに必要な調節塩基配列を含むベクターである。本明細書に記載される一実施形態において、該ベクターは、ヒトウロキナーゼのような、ウロキナーゼをコード化する配列を含有する。一実施形態において、該ベクターは、プラスミドベクターである。別の実施形態において、該ベクターは、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのような、ウイルスベクターである。
【００５２】
ウロキナーゼ：また、ウロキナーゼ型プラミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）と呼ばれる、ウロキナーゼは、セリンプロテアーゼである。ウロキナーゼは、本来、人尿から分離されたが、血流および細胞外マトリックスのような、いくつかの生理学的位置に存在する。主要な生理学的基質は、プラスミノーゲンであり、これはセリンプロテアーゼプラスミンの不活性な酵素前駆体である。プラスミンの活性化は、生理学的環境によって、血栓溶解または細胞外マトリックスの分解に関与するタンパク質分解カスケードを誘発する。本明細書に提供される方法の一実施形態において、ウロキナーゼは、肝細胞注入前、受容マウスに投与される。一部の実施形態において、ウロキナーゼは、ヒトウロキナーゼである。一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、分泌型のウロキナーゼである。一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、修飾された、非分泌型のウロキナーゼである（米国特許第５，９８０，８８６号参照、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００５３】
別途説明されない限り、本明細書に使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される用語と同じ意味を持つ。文脈で特に指定しない限り、単数形、「一つの（ａ）」「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は複数形の指示物を含む。同様に、文脈で特に指定しない限り、「または（ｏｒ）」という語は、「および（ａｎｄ）」を含むことを意図する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ｏｒ Ｂ）」とは、ＡまたはＢ、あるいはＡおよびＢの両方を含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに対して規定したすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子量値は概算値であり、説明のために提供するものであることがさらに理解されるべきである。本発明の実施または検討のために本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、適した方法および材料は以下に説明する。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、用語の説明を含め、本明細書が優先するものとする。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定を意図したものではない。
【００５４】
ＩＩＩ． いくつかの実施形態の説明
生体内でヒト肝細胞を増大させる着実な方法を本明細書に提供する。該方法は、チロシン異化酵素、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）が欠損している免疫不全マウスに単離されたヒト肝細胞を移植するステップを含む。一実施形態において、該免疫不全マウスは、Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスである。一実施形態において、該Ｆａｈ欠損マウスは、Ｆａｈのホモ接合体欠失を含む。別の実施形態において、該Ｆａｈ欠損マウスは、タンパク質の機能、および／または作製が実質的に低下するように、Ｆａｈにおいて、１つもしくは複数の点変異を含む。本明細書に記載されるように、Ｆａｈ、リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）、およびインターロイキン受容体の共通γ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）が欠損した三重変異体マウスは、生体内でヒト肝細胞を増大させるための十分な生体内系を提供する。一部の実施形態において、該マウスは、Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）マウスである。一部の実施形態において、該マウスは、Ｆａｈｐｍ／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦｐｍＲＧ）マウスである。
【００５５】
生体内でヒト肝細胞を増大させる方法を、本明細書に開示し、単離されたヒト肝細胞を注入等により、免疫不全およびＦａｈ欠損マウス（また、受容マウスと称される）に移植するステップと、少なくとも約２週間ヒト肝細胞を増大させるステップと、増大させたヒト肝細胞をマウスから採取するステップと、を含む。該肝細胞は、当技術分野で知られている任意の適した手段を用いて移植することができる。一実施形態において、該単離されたヒト肝細胞は、注入等により、該受容マウスの脾臓に移植される。別の実施形態において、該増大されたヒト肝細胞は、該受容マウスの肝臓から採取される。該ヒト肝細胞は、受容マウスにおいて、ヒト肝細胞の増大を可能にするのに十分な期間、増大可能である。増大のための正確な期間は、日常の実験を用いて実験的に判定することができる。一実施形態において、該ヒト肝細胞は、最長６ヶ月まで増大可能である。別の実施形態において、該ヒト肝細胞は、少なくとも約４週間、または少なくとも約６週間、または少なくとも約８週間、または少なくとも約１２週間、または少なくとも約１６週間、または少なくとも約２０週間、または少なくとも約２４週間、または少なくとも約２８週間、増大可能である。肝細胞増大の程度は、異なり得る。一部の実施形態において、受容マウスにおいて、ヒト肝細胞の増大は、少なくとも約１０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍、または少なくとも約１５０倍、または少なくとも約２００倍、または少なくとも約２５０倍、または少なくとも約３００倍、または少なくとも約４００倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍の増加をもたらす。
【００５６】
また、生体内でヒト肝細胞を増大させる方法を提供し、受容マウスは、該ヒト肝細胞の注入前、ウロキナーゼ遺伝子をコード化するベクターが投与される。一実施形態において、該ウロキナーゼ遺伝子は、ヒトウロキナーゼである。野生型ウロキナーゼは、分泌タンパク質である。したがって、一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、分泌型のウロキナーゼである（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３６：１８３−１８８，１９８５、参照することにより本明細書に組み込まれる）。ヒトウロキナーゼ（分泌型）の配列は、当技術分野で知られており、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＨ００７０７３（１９９３年８月３日受入）、Ｄ１１１４３（１９９６年５月９日受入）、Ａ１８３９７（１９９４年７月２１日受入）、ＢＣ００２７８８（２００３年８月１９日受入）、Ｘ０２７６０（１９９３年４月２１日受入）、ＢＴ００７３９１（２００３年５月１３日受入）、ＮＭ＿００２６５８（２００４年１０月１日受入）、Ｘ７４０３９（１９９４年２月２０日受入）に限定されず、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５７】
一部の実施形態において、該ヒトウロキナーゼは、非分泌型のウロキナーゼである。例えば、Ｌｉｅｂｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：６２１０−６２１４，１９９５、参照することにより本明細書に組み込まれる）は、ウロキナーゼのカルボキシル末端で小胞体保留シグナルをコード化する配列を挿入することにより、またはｐｒｅ−ｕＰＡシグナルペプチド（Ｓｔｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４７：６１９−６２５，１９８６、Ｓｃｈｕｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１６９６−１７０５，１９９４、これらの双方は、参照することにより本明細書に組み込まれる）をアミノ末端ＲＲ保留シグナルと置換することにより作製された非分泌型のウロキナーゼ、ならびに細胞膜ＩＩタンパク質Ｉｉｐ３３（Ｓｔｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４７：６１９−６２５，１９８６）からスペーサーペプチドにより引き離された膜貫通アンカーを記載する。非分泌型のウロキナーゼはまた、米国特許第５，９８０，８８６号に記載され、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５８】
ウロキナーゼをコード化するベクターは、マウスへの送達に適している任意の型のベクターであり得、ウロキナーゼ遺伝子を発現することができる。このようなベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターを含む。一実施形態において、該ベクターは、アデノウイルスベクターである。別の実施形態において、該ベクターは、ＡＡＶベクターである。ウロキナーゼをコード化するベクターは、当技術分野で知られている任意の適した手段により投与され得る。一実施形態において、該ベクターは、静脈内投与される。一態様において、該ベクターは、後眼窩注射により投与される。ウロキナーゼをコード化するベクターは、該ヒト肝細胞の注入前、いつでも投与され得る。一般に、該ベクターは、ウロキナーゼが十分な時間で発現できるように、投与される。一実施形態において、該ベクターは、肝細胞注入の２４〜４８時間前に投与される。
【００５９】
生体内でヒト肝細胞を増大させる方法を、本明細書にさらに提供し、該受容マウスは、該ヒト肝細胞の注入前、マクロファージが減損している。一実施形態において、該受容マウスに、マクロファージ減損前、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。別の実施形態において、該受容マウスに、マクロファージ減損後、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。別の実施形態において、該マクロファージ減損受容マウスに、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与されない。マクロファージを、化学物質または抗体を用いるような、当技術分野で周知のようないくつかの方法のうちのいずれか１つを用いて、該受容マウスから減損することができる。例えば、マクロファージを、Ｃ１２ＭＤＰ、またはマクロファージ発達、機能、および／または生存力を変える抗体を含む、有害物質のようなアンタゴニストの投与により減損することができる。アンタゴニストの投与は、周知の技法により行われ、欧州特許第１５５２７４０号に記載されるようなリポソームの使用を含み、参照することにより本明細書に組み込まれる。クロドロネート含有リポソームはまた、ｖａｎ Ｒｉｊｎら（Ｂｌｏｏｄ １０２：２５２２−２５３１，２００３）により記載されるように、マクロファージを減損するために使用することができ、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本明細書に記載される方法の一実施形態において、肝細胞注入前、該Ｆａｈ欠損マウスに、該マウスにおける肝臓疾患の発症を阻害、予防、または遅延する薬剤が投与される。該薬剤は、肝臓疾患を阻害するための当技術分野で知られている任意の化合物または組成物であり得る。このような一薬剤は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）である。ＮＴＢＣは、該Ｆａｈ欠損マウスにおける肝臓疾患の発症を調節するために投与される。用量、投与スケジュール、および投与方法は、該Ｆａｈ欠損マウスにおける肝機能障害を予防するために必要に応じ、調整することができる。一実施形態において、該ＮＴＢＣは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から約０．５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。別の実施形態において、該ＮＴＢＣは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．０６ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．０７ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．０８ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．０９ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日のような、約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。ＮＴＢＣは、ヒト肝細胞の注入前、および／または肝細胞注入後、選択された期間投与することができる。ＮＴＢＣは、肝細胞の増大の期間中、必要に応じ、中止または再投与することができる。一実施形態において、該Ｆａｈ欠損マウスに、肝細胞注入前、および肝細胞注入後、少なくとも約３日間、ＮＴＢＣが投与される。別の実施形態において、該Ｆａｈ欠損マウスに、肝細胞注入前、および肝細胞注入後、少なくとも約６日間、ＮＴＢＣが投与される。一態様において、ＮＴＢＣの用量は、肝細胞注入後、６日間の過程にわたり漸減される。ＮＴＢＣは、飲料水内投与、食物内投与、または注入が挙げられるが、これらに限定されない、任意の適した手段により投与することができる。一実施形態において、肝細胞注入前、飲料水内投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１ｍｇ／Ｌ、または約２ｍｇ／Ｌ、または約３ｍｇ／Ｌ、または約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌ、または約６ｍｇ／Ｌ、または約７ｍｇ／Ｌ、または約８ｍｇ／Ｌのような、約１ｍｇ／Ｌから約８ｍｇ／Ｌである。別の実施形態において、肝細胞注入前、飲料水内投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１．０ｍｇ／Ｌ、または約１．２ｍｇ／Ｌ、または約１．４ｍｇ／Ｌ、または約１．６ｍｇ／Ｌ、または約１．８ｍｇ／Ｌ、または約２．０ｍｇ／Ｌのような、約１ｍｇ／Ｌから約２ｍｇ／Ｌである。
【００６１】
単離されたヒト肝細胞は、多くの異なる源のうちのいずれか１つから得ることができる。一実施形態において、該ヒト肝細胞は、臓器ドナーの肝臓から単離された。別の実施形態において、該ヒト肝細胞は、外科的切除から単離された。別の実施形態において、該ヒト肝細胞は、胚幹細胞、または間葉由来幹細胞、または脂肪組織由来幹細胞、または多能性成体幹細胞、または非制限体幹細胞のような、幹細胞に由来した。別の実施形態において、該ヒト肝細胞は、単球または羊膜細胞に由来し、ひいては、幹細胞または前駆細胞は、肝細胞を産生するために、体外で得られる。別の実施形態において、該ヒト肝細胞は、注入前、凍結保存された。
【００６２】
該Ｆａｈ欠損受容マウスにおけるヒト肝細胞の連続移植の方法を、本明細書にさらに提供する。該方法は、第１の受容マウスからの増大されたヒト肝細胞を採取するステップと、二次、または三次、または四次、または追加次の受容マウスにおいて、肝細胞をさらに増大させるステップを含む。ヒト肝細胞は、いくつかの技法のうちのいずれか１つを用いて、マウスから採取することができる。例えば、該肝細胞は、下述の実施例に記載されるように、マウス肝臓を潅流し、次いで、徐々に細分化することにより採取することができる。さらに、該肝細胞は、ヒト細胞またはヒト肝細胞を特異的に認識する抗体を用いるような、周知の方法を用いて、他の細胞型、組織、および／または、破片から分離することができる。このような抗体としては、抗ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのような、クラスＩ主要組織適合性抗原に特異的に結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない（Ｍａｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６：４５５−４６２，１９９７）。抗体結合肝細胞は、その後、パンニング（固体マトリックスに付着したモノクローナル抗体を利用する）、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、磁気ビーズ分離等により、分離することができる。肝細胞を採取する代替的な方法は、当技術分野で周知である。
【００６３】
また、遺伝子組み換えマウスであって、そのゲノムは、欠失または点変異が、機能的ＦＡＨ、ＲＡＧ−２、およびＩＬ−２Ｒγタンパク質の発現の喪失をもたらすような、Ｆａｈ、Ｒａｇ２、およびＩｌ２ｒｇ遺伝子において、該欠失または点変異がホモ抱合体であり、該マウスは、免疫不全であり、肝機能の低下を示し、ヒト肝細胞を、該マウスに増大させることができる、遺伝子組み換えマウスを、本明細書に提供する。一実施形態において、該欠失は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮ細胞の完全喪失をもたらす。別の実施形態において、該マウスは、ウロキナーゼを発現する。一実施形態において、ウロキナーゼは、ヒトウロキナーゼである。一態様において、ウロキナーゼの発現は、ウロキナーゼをコード化する導入遺伝子の取り込みに起因する。別の態様において、ウロキナーゼの発現は、分泌型または非分泌型のウロキナーゼのような、ウロキナーゼをコード化するベクターの投与に起因する。ウロキナーゼをコード化するベクターは、マウスへの送達に適している任意の型のベクターであり得、ウロキナーゼ遺伝子を発現することができる。一実施形態において、該ベクターは、アデノウイルスベクターである。別の実施形態において、該ベクターは、ＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、該マウスは、ＦＲＧマウスである。一部の実施形態において、該マウスは、ＦｐｍＲＧマウスである。
【００６４】
ＩＶ． ヒト肝細胞の増大のための遺伝子組み換えマウス株
いくつかのグループは、齧歯動物において、一次ヒト肝細胞を生着および増大しようとした（米国特許第６，５０９，５１４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／０７３３８号、米国公開第２００５−０２５５５９１号）。Ｄａｎｄｒｉら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３３：９８１−９８８，２００１）が、ヒト肝細胞を用いてマウス肝臓の再増殖の成功を初めて報告した。その後、他のグループは、マウスにおいて、成功を収めたヒト肝臓細胞の生着を報告している。これらの研究のすべてにおいて、使用された動物は、アルブミンプロモータの転写制御下で、ウロキナーゼプラミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を発現する、トランスジェニック動物であった（Ｓａｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ６６：２４５−２５６，１９９１）。ｕＰＡの過剰発現は、代謝破壊を引き起こし、移植されたヒト肝細胞に影響を及ぼすことなく、マウス肝細胞の細胞死をもたらし、それは導入遺伝子を発現しない。該ａｌｂ−ｕＰＡ導入遺伝子は、様々な免疫不全のバックグラウンドと交錯し、ヒト細胞の拒絶を阻止した（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：９０１−９１２，２００４、Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９６：４２８−４３７，２００７、Ｔｕｒｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３８：１１８１−１１８４，２００６）。
【００６５】
最大７０％の生着レベルが、これらのモデルにおいて報告されているが、該系は、広範な使用を阻止しているいくつかの主要な不利点がある。第１に、該ａｌｂ−ｕＰＡ導入遺伝子は、若年期に、不活性化または喪失する。この理由のため、非常に初期（１４日齢）にヒト細胞を移植し、導入遺伝子がホモ接合体であるマウスを使用することが必須である。この狭い移植の時間窓が、モデルの柔軟性を著しく制限する。第２に、該導入遺伝子の自発的不活性化は、導入遺伝子陰性の健康なマウス肝細胞のプールを作成する。これらの復帰突然変異体マウス肝細胞は、再増殖中、ヒト細胞と効率的に競合する。したがって、該ヒト細胞を連続移植すると同時に二次受容者を再増殖することは不可能である。第３に、肝臓疾患は、このモデルにおいて、非常に早発型であり、ひいては、トランスジェニックマウスの生存力を低下させる。したがって、十分な数の実験動物を繁殖することが困難である。さらに、該トランスジェニックマウスには、手術中、死亡率を増加する出血傾向がある。最後に、ａｌｂ−ｕＰＡトランスジェニック動物は、一旦ヒト細胞を用いる再増殖が５０％を超えると、腎疾患を発症する。これは、腎臓上皮上のヒト補体によるためであると考えられる。ヒト生着の非常に高いレベルを得るために、抗相補性プロテアーゼ阻害剤で移植されたマウスを処理することが必要である（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：９０１−９１２，２００４）。これらの多くの限定のため、ヒト肝細胞を増大させるためのさらに堅牢なシステムが非常に望ましい。遺伝子欠失の独自の組み合わせを有する遺伝子組み換えマウスを用いて、生体内でヒト肝細胞を増大させるための高効率な方法を、本明細書に記載する。マウス肝臓においてヒト肝細胞の成功を収めた生着および増大は、ある程度の肝機能障害がある免疫不全マウスを必要とする。マウス肝臓は、様々な異なる型の免疫不全マウスにおいて、ヒト肝細胞を用いて再増殖し、ＲＡＧ−２ノックアウトまたはＳＣＩＤマウスを含み、これらの両方は、Ｂ細胞およびＴ細胞を欠如する（米国特許第６，５０９，５１４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／０７３３８号、米国公開第２００５−０２５５５９１号）。肝機能障害に達するために、免疫不全マウスを、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）トランスジェニックマウスと交配させた。マウス肝臓において、ｕＰＡの発現は、マウス肝細胞の成長の不利点を生じ、移植したヒト肝細胞の増大を促進する（ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／０７３３８号）。該ｕＰＡ導入遺伝子の限界を避けるために、Ｆａｈ欠損マウスは、ヒト肝細胞の増大を可能にさせる能力について分析された。ＦＡＨは、チロシン異化の最後のステップを触媒する代謝酵素である。Ｆａｈ遺伝子のホモ接合体欠失を有するマウスは、肝ｍＲＮＡ発現の変化および重度の肝機能障害を示す（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）。該Ｆａｈ突然変異体が、ヌードまたはＲａｇ１−／−（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ６８：８６９−８７７，１９９２）バックグラウンドと交錯した場合、ヒト肝細胞を有するマウス肝臓の再増殖は、免疫拒絶による可能性が最も高いため、成功しなかった。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスとのＦａｈ欠損マウスの交配（Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５：１９９−２０３，１９９７）は、ヒト肝細胞の副次的な生着が観察されるマウスを産生したが、これらの動物は、ＳＣＩＤマウスに存在する二本鎖切断ＤＮＡ修復の欠陥の可能性があるため、急速な肝不全を発症した。Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）三重変異体マウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞を欠如することを、本明細書に開示する。Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスは、当技術分野で知られている（Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：１０４−１０７，２００４、Ｇｏｒａｎｔｌａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２７００−２７１２，２００７）。
【００６６】
以下の実施例に記載されるように、ヒト肝細胞の生着および増大は、驚くべきことに、ＦＲＧマウスにおいて、高効率である。例えば、ＦＲＧマウスに、１００万の単離されたヒト肝細胞を注入できる。１０％の効率を仮定すると、１００，０００のヒト肝細胞が、受容マウスに生着される。増大後のＦＲＧマウスからの平均収量は、その後、約３，０００万から約４，５００万のヒト肝細胞であり、ヒト肝細胞の３００倍から４５０倍の増加と同じである。ＦＲＧマウスはまた、ヒト肝細胞の連続移植にも使用することができる。連続移植は、多重マウスを含み得、マウスあたりヒト肝細胞の少なくとも約１５０倍の増大をもたらし得る。
【００６７】
Ｆａｈ欠損を含む任意の免疫不全マウスは、本明細書に記載される諸方法に適している。一実施形態において、該マウスは、Ｆａｈが欠損しているＲａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスでもある。該Ｆａｈ欠損マウスは、例えば、Ｆａｈのホモ接合体欠失、またはＦａｈの１つもしくは複数の点変異を含むことができる。Ｆａｈ欠損（点変異またはホモ接合体欠失等による）は、Ｆａｈ ｍＲＮＡ発現および／または機能的ＦＡＨタンパク質の実質的減少、またはその欠損をもたらす。該ＦＲＧマウスに加えて、Ｆａｈ遺伝子において、点変異がホモ抱合体である免疫不全マウス（Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−）（本明細書では、ＦｐｍＲＧマウスと称される）はまた、生体内でヒト肝細胞の生着および増大に適したマウスでもあることを、本明細書に記載する。
【００６８】
Ｖ． ヒト肝細胞の単離および送達
ヒト肝細胞の生体内の増大のためにＦａｈ欠損マウスを用いることの有意な利点は、様々な源から採取したヒト肝細胞を該マウスに生着する能力である。下述の実施例に記載されるように、ヒト肝細胞は、死体ドナーまたは肝臓切除術から採取し得る、または市販の源から得ることができる。さらに、本明細書に示されるように、ＦＲＧマウスに、すべての年齢のドナーからのヒト肝細胞、または凍結保存された肝細胞を、うまく移植することができる。多くの場合、ヒト肝細胞の単離と移植との間の遅延（一般に、１〜２日）があり、これは該肝細胞の生存能力の低下をもたらし得る。しかしながら、該ＦＲＧマウス系は、限定された生存能力がある肝細胞を生着した場合でさえ、ヒト肝細胞を増大させることができる。
【００６９】
ヒト肝細胞を単離する方法は、当技術分野で周知である。例えば、臓器ドナーまたは肝臓切除術からのヒト肝細胞を単離する諸方法が、ＰＣＴ公開第ＷＯ ２００４／００９７６６号および第ＷＯ ２００５／０２８６４０号、ならびに米国特許第６，９９５，２９９号および第６，５０９，５１４号に記載され、それらのすべては、参照することにより本明細書に組み込まれる。肝細胞は、経皮的に、または開腹手術を介して採取された肝生検から得ることができる。ＦＲＧマウスのような、受容動物への移植手術のためのヒト肝細胞は、当技術分野で知られている任意の従来の方法によりヒト肝臓組織から単離される。肝臓組織は、機械的に、または酵素的に分離し、単一細胞の懸濁液に供給することができる、さもなければ完全なヒト肝組織のフラグメントを使用してもよい。例えば、該肝細胞は、所定のコラゲナーゼ潅流によりドナー組織から摘出し（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：２９，１９７６）、次いで、低速遠心分離を行う。肝細胞は、その後、ステンレス製のメッシュで濾過することにより精製し、次いで、密度勾配遠心分離法を行うことができる。あるいは、肝細胞を濃縮するための他の諸方法、例えば、蛍光活性化細胞分類、またはパンニング、または磁気ビーズ分離、または遠心力場内の水簸、または当技術分野で周知のような任意の他の方法を使用することができる。類似の肝細胞単離法が、受容マウスの肝臓から増大されたヒト肝細胞を採取するために使用することができる。
【００７０】
あるいは、ヒト肝細胞は、Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏら（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．Ｒｅｐ．６：６２５−６２８，１９８２）により記載される技法を用いて調製され得、これは参照することにより組み込まれる。簡潔に述べると、肝臓またはその一部は、単離され、カニューレは、門脈または門脈管に導入される。該肝臓組織は、その後、３７℃で、１分間あたり３０から７０ミリリットルの流量で、無カルシウム緩衝液、次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で、塩化カルシウム溶液（約０．０７５％塩化カルシウム等）のコラゲナーゼ（約０．０２５％コラゲナーゼ）を含有する酵素溶液で、該カニューレを介して潅流される。潅流された該肝臓組織は、小部分（約１立法ミリメートル等）に細分化される。該酵素消化を、上記に記載されるように、同一の緩衝液で、３７℃で約１０〜２０分間、徐々に撹拌しながら行い、細胞懸濁液を生成する。放出した肝細胞は、該細胞懸濁液を６０〜８０マイクロメーターのナイロン製のメッシュで濾過することにより採取する。採取した肝細胞は、その後、ｐＨ７．０で、低温ＨＥＰＥＳ緩衝液中で洗浄し、低速遠心分離を用いて、コラゲナーゼおよび細胞残屑を除去することができる。非実質細胞は、メトリザミド勾配遠心法により除去してもよい（米国特許第６，９９５，２９９号参照）。
【００７１】
ヒト肝細胞は、新鮮組織（死亡してから数時間内に得られた組織等）、または新鮮冷凍された組織（約０℃以下で、冷凍保存された新鮮組織等）から得ることができる。好ましくは、該ヒト組織は、検出可能な病原体がなく、形態学および組織学において正常であり、原則的に無病である。生着に使用される肝細胞は、最近、例えば、数時間以内に単離され得る、または細胞が適切な保存培地で保存される場合、より長期間後でも移植することができる。下述の実施例に記載されるこのような一培地は、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）（腹腔内臓器の保存用の汎用大動脈洗浄および保冷液、ウィスコンシン大学液、またはＵＷとも称される）である。肝細胞はまた、移植手術前に、凍結保存することができる。肝細胞を凍結保存する諸方法は、当技術分野で周知であり、米国特許第６，１３６，５２５号に記載され、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００７２】
臓器提供者または肝臓切除術からヒト肝細胞を得るステップに加えて、生着のために使用される該細胞は、ヒト幹細胞または、受容動物への移植手術後、増大可能なヒト肝細胞に発達または分化する肝細胞前駆細胞であり得る。ＥＳ細胞の性質を有するヒト細胞は、内胚盤胞細胞塊（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７，１９９８）、および成長中の生殖細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６−１３７３１，１９９８）から単離され、ヒト胚幹細胞を産生している（米国特許第６，２００，８０６号参照、参照することにより本明細書に組み込まれる）。米国特許第６，２００，８０６号に開示されるように、ＥＳ細胞は、ヒトおよび非ヒト霊長類から産生することができる。通常、霊長類ＥＳ細胞は、ＥＳ細胞培地の存在下で、マウス胎児線維芽細胞の融合層上に単離される。ＥＳ培地は、通常、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を有する、８０％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ピルビン酸塩なし、高グルコース、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）からなる。ＥＳ細胞の際立った特徴は、成人に存在する前駆「多分化能性」幹細胞と比較して、培養中に無制限に分化されない状態を維持するＥＳ細胞の能力、およびＥＳ細胞があらゆる異なる細胞型に発達する必要がある潜在能力を含む。ヒトＥＳ（ｈＥＳ）は、特異的なモノクローナル抗体により認識される糖脂質細胞表面抗原であるＳＳＥＡ−４、を発現する（例えば、Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：２７１−２７８，２０００を参照）。
【００７３】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）に由来したヒト肝細胞もまた、本明細書に記載される諸方法に使用することができる。骨髄由来ｈＭＳＣの肝性因子への順次暴露は、肝細胞の性質を有する細胞への、幹細胞の分化をもたらす（Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．７：２４，２００７、Ａｕｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ．５６（３）：４０５−１５，２００７、これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。骨髄由来間充織幹細胞と脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の肝細胞の分化もまた、記載されている（Ｔａｌｅｎｓ−Ｖｉｓｃｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２（３６）：５８３４−４５，２００６参照、参照することにより本明細書に組み込まれる）。ヒト肝細胞はまた、単球から作製することができる。Ｒｕｈｎｋｅら（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７９（９）：１０９７−１０３，２００５、参照することにより本明細書に組み込まれる）は、最終分化した末梢血単球からの肝細胞様（ＮｅｏＨｅｐ）細胞の生成を記載する。該ＮｅｏＨｅｐ細胞は、形態、肝細胞マーカーの発現、様々な分泌および代謝機能、ならびに薬物解毒活性に関して主要なヒト肝細胞と類似している。さらに、羊膜細胞に由来したヒト肝細胞もまた、本明細書に記載される諸方法に使用することができる。
【００７４】
ヒトＥＳ細胞株は、存在し、本明細書に開示される諸方法に使用することができる。ヒトＥＳ細胞はまた、体外受精した（ＩＶＦ）胚からの着床前の胚から採取し得る。未使用のヒトＩＶＦから産生した胚は、該胚が１４日齢未満である場合、シンガポールおよび英国のような多くの国で許可される。高品質の胚のみが、ＥＳ単離に適している。増大された胚盤胞への１つの細胞ヒト胚を培養するための現在の明確な培地条件が、記載されている（Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ．４：７０６−７１３，１９８９参照）。ヒト卵管細胞とのヒト胚の共培養は、高品質の胚盤胞の産生をもたらす。細胞共培養、または改善された合成培地において成長したＩＶＦ由来の増大されたヒト胚盤胞は、ヒトＥＳ細胞の単離を可能にする（米国特許第６，２００，８０６号参照）。
【００７５】
一実施形態において、ヒト肝細胞は、脾臓への注入等の、移植手術により受容マウスに送達される。肝細胞は、肝臓柔組織または門脈への注入等の、他の手段により送達され得る。受容マウスに注入されたヒト肝細胞の数は、異なり得る。一実施形態において、約１０５〜約１０７のヒト肝細胞が、注入される。別の実施形態において、約５×１０５〜約５×１０６のヒト肝細胞が、注入される。例示的な一実施形態において、約１０６のヒト肝細胞が、注入される。
【００７６】
ＶＩ． Ｆａｈ欠損マウスにおいて増大されたヒト肝細胞の使用
ヒト肝細胞は、当技術分野で知られているいくつかの技法のうちのいずれかを用いて、受容マウスから採取することができる。例えば、マウスは、麻酔することができ、門脈または下大静脈に、カテーテルを用いてカニューレを挿入した。該肝臓は、その後、適切な緩衝液（０．５ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳが追加された無カルシウムおよび無マグネシウムＥＢＳＳ）で潅流し、次いで、該肝臓にコラゲナーゼ処理（例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼＸＩおよび０．０５ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉが追加されたＥＢＳＳからなる溶液を用いて）を行うことができる。該肝臓は、徐々に細分化し、ナイロン製のメッシュで濾過（７０μｍと４０μｍのナイロン製のメッシュでの連続等）し、次いで、遠心分離し、該細胞の洗浄を行った。受容マウスから採取したヒト肝細胞は、当技術分野で周知の任意の技法を用いて、非ヒト細胞または他の混入物質（組織または細胞残屑等）から分離することができる。例えば、このような方法は、ヒト肝細胞に選択的に結合する抗体を用いるステップを含む。このような抗体としては、抗ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのような、クラスＩ主要組織適合性抗原に特異的に結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない（Ｍａｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６：４５５−４６２，１９９７）。ヒト細胞またはヒト肝細胞に対して特異的な抗体は、ＦＡＣＳ、またはパンニング、または磁気ビーズ分離を含む、様々な異なる技法に使用することができる。ＦＡＣＳは、他のさらに高度な検出レベルのうちで、複数の色チャネル、ローアングルかつ鈍角の光散乱検出チャネル、およびインピーダンスチャネルを利用して、抗体が結合した細胞を分離または分類する（米国特許第５，０６１，６２０号参照）。磁気分離は、１）ヒト特異抗体と接合する、または２）ヒト特異抗体と結合することができる検出抗体と接合する、または３）ビオチン化抗体と結合することができるアビジンと接合する、常磁性粒子の使用を含む。パンニングは、アガロースビーズ、またはポリスチレンビーズ、または中空糸膜、またはプラスチック製のペトリ皿のような、固体マトリックスに結合したモノクローナル抗体を含む。該抗体で結合した細胞は、試料から固体支持体を単に物理的に分離することにより試料から単離させることができる。
【００７７】
下述の実施例に記載されるように、いくつかの肝細胞輸送タンパク質を含む、薬物抱合および解毒に関与する遺伝子の発現を、受容マウスから採取した増大されたヒト肝細胞において検出した。最近の研究では、薬物毒性を予測する際に、これらの抱合経路（Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８：１１９２−１１９７，２０００）、および肝細胞輸送タンパク質（Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．９０：４５１−４５９，２００６）が、重要な役割を果たすことを示している。リファンピシンもしくはＰＢ、またはＢＮＦのような外因性薬物によるＣＹＰ誘導に対する正常ヒト反応に加えて、核ホルモン受容体転写因子の発現、抱合経路、およびＦＲＧマウスにおいて増大されたヒト肝細胞による主要な輸送タンパク質は、生体内で、ヒト薬物代謝および毒性において、これらの遺伝子産物の役割の評価を可能にする。単離された肝細胞において、化合物の毒性を試験する諸方法は、当技術分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ ２００７／０２２４１９号に記載され、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００７８】
本開示は、肝臓再構成の治療を必要とする対象体において、肝臓再構成のためにヒト肝細胞の源として、受容マウスにおいて増大され、採取したヒト肝細胞の使用をさらに考慮する。肝細胞の導入による患者における肝臓組織の再構成は、肝臓移植の想定における応急処置として、あるいは単離された代謝低下に罹患する患者に対する最終的治療として、急性肝不全に罹患する患者に対する潜在的な治療法の選択肢である（Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５：５３−６１，１９９８）。肝細胞の再構成は、例えば、遺伝子治療のために遺伝子組み換え肝細胞を導入するために、または疾患、物理的損傷もしくは化学的損傷、または悪性腫瘍によって喪失した肝細胞を交換するために、使用してもよい（米国特許第６，９９５，２９９号、参照することにより本明細書に組み込まれる）。例えば、家族性高コレステロール血症を患っている患者の遺伝子治療において、導入された肝細胞の使用が、報告されている（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．６：３３５，１９９４）。さらに、増大されたヒト肝細胞は、人工肝臓補助装置を装着するために使用することができる。
【００７９】
ＦＲＧマウスにおいて増大され、採取したヒト肝細胞はまた、様々な微生物学的研究のためにも有用である。Ｃ型肝炎ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスを含む、いくつかの病原性ウイルスは、ヒト宿主、またはヒトの初代肝細胞において、唯一複製することができる。したがって、ヒトの初代肝細胞の十分な源を有することは、これらの病原体の研究にとって重要である。増大されたヒト肝細胞は、ウイルス感染および複製の研究および肝臓のウイルスの感染を調整する化合物を同定するための研究に使用することができる。肝臓のウイルスの研究のためにヒトの初代肝細胞を使用する諸方法が、欧州特許第１５５２７４０号、米国特許第６，５０９，５１４号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ ００／１７３３８号に記載され、これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８０】
ＶＩＩ． ヒト肝臓疾患に対するモデル系としてのＦａｈ欠損マウスの使用
免疫不全、かつＦａｈ欠損マウスはまた、ヒト肝臓疾患に対するモデル系として使用することもできる。ヒト肝細胞を生着したＦａｈ欠損をさらに含む、Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスを含む、これらのマウス（例えば、ＦＲＧまたはＦｐｍＲＧマウス等）は、例えば、毒素への暴露、感染症、遺伝病、または悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない、様々な異なる病因に起因する肝臓疾患のモデルを作製するために使用することができる。ヒト肝細胞を生着し、再構成したＦａｈ欠損マウスは、これらの疾患の理解をより深め、疾患経過を予防、または遅延、または逆行し得る薬剤を同定するために、使用することができる。例えば、該Ｆａｈ欠損マウスは、遺伝子治療ベクターを試験するために使用することができる。着目遺伝子治療用ベクターは、Ｆａｈ欠損マウスに投与することができ、生着されたヒト肝細胞におけるベクターの効果を評価することができる。
【００８１】
同様に、ヒト肝細胞を含むＦａｈ欠損マウスは、生体内の設定において、ヒト肝細胞におけるそれらの効果に対して、毒素または医薬品のような、化合物をスクリーニングするために使用することができる。肝疾患を引き起こす、または寄与する疑いがある薬剤は、Ｆａｈ欠損マウスに対する薬剤の有効量を投与する、および生着されたヒト細胞の機能における薬剤効果を評価することにより、スクリーニングすることができる。一実施例として、Ｆａｈ欠損マウスは、ヒト向肝性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）病原体により感染を阻害する、または予防する薬剤を同定するために使用することができる。薬剤等を同定するために、試験薬剤を投与後、または投与前に、Ｆａｈ欠損マウスを病原体に暴露させる、あるいは該マウスに病原体を接種することができる。該マウスは、その後、感染の兆候に対して評価することができ、任意に、該薬剤で処理されていない、および／または、該病原体により感染させられていない、対照マウスと比較することができる。
【００８２】
Ｆａｈ欠損マウスが、毒素により引き起こされる肝臓疾患のモデルとして使用される場合には、注入されたヒト肝細胞を生着し、該毒剤への暴露前に、好適な期間、増大させる必要がある。肝細胞の増大のために必要とされる時間量は、経験的に判定され得、当業者の能力範囲内である。対応するヒト条件を最も厳密に模倣する成果物を産生するために必要とされる毒剤量は、毒剤の増分量に対して暴露されるいくつかのＦａｈ欠損マウスを用いることにより判定されてもよい。毒剤の例としては、アルコール、アセトアミノフェン、フェニトイン、メチルドパ、イソニアジド、四塩化炭素、黄リン、およびファロイジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
Ｆａｈ欠損マウスが悪性肝臓疾患のモデルとして使用される場合の実施形態において、該悪性腫瘍は、形質転換剤への暴露により、または、悪性細胞の導入により生成されてもよい。形質転換剤または悪性細胞は、ヒト肝細胞の初期のコロナイジング導入とともに、または好ましくは、ヒト肝細胞が宿主動物において増殖開始後、導入されてもよい。形質転換剤の場合、ヒト肝細胞が活発に増殖する時に、該薬剤を投与することが好ましい場合がある。このような形質転換剤は、動物に全身的に、あるいは、肝臓自体に局所的に、投与されてもよい。悪性細胞は、肝臓へ直接接種することができる。一実施例として、Ｆａｈ欠損マウスに、ヒト肝細胞が移植される。該ヒト肝細胞の生着後、該マウスは、形質転換剤が投与される、または悪性細胞が接種される。あるいは、該形質転換剤または該悪性細胞は、ヒト肝細胞とともに投与することができる。悪性腫瘍が該マウスに発症した後、当技術分野で知られているいくつの方法のうちのいずれか１つにより投与することができ、Ｆａｈ欠損マウスは、ヒト肝臓癌のモデルとして使用することができる。
【００８４】
ＶＩＩＩ． ウロキナーゼをコード化するベクター
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損マウスに、ヒト肝細胞の移植手術前、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。一実施形態において、該ウロキナーゼ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）としても知られる）は、分泌型のヒトウロキナーゼである。別の実施形態において、該ウロキナーゼは、修飾された、非分泌型のウロキナーゼである（米国特許第５，９８０，８８６号参照、参照することにより本明細書に組み込まれる）。マウスにおけるウロキナーゼの発現に適した任意の型のベクターが企図される。このようなベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターを含む。適したベクターとしては、ＤＮＡベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、テナガザル白血病のベクター、ＶＳＶ−Ｇ、ＶＬ３０ベクター、リポソーム媒介ベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、該ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。該アデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルス血清型を含む、任意の適したアデノウイルスに由来し得る（Ａｄ２およびＡｄ５等であるが、これらに限定されない）。アデノウイルスベクターは、第１、第２、第３、および／または第４世代のアデノウイルスベクター、またはアデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクターであり得る。非ウイルスベクターは、プラスミド、ホスホリン脂質、異なる構造のリポソーム（陽イオンおよび陰イオン）により構成することができる。別の実施形態において、該ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。該ＡＡＶベクターは、当技術分野で知られている任意の適したＡＡＶベクターであり得る。
【００８５】
ウロキナーゼをコード化するウイルスおよび非ウイルスベクターは、当技術分野で周知である。例えば、ヒトウロキナーゼをコード化するアデノウイルスベクターは、米国特許第５，９８０，８８６号、およびＬｉｅｂｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（１３）：６２１０−４，１９９５）に記載される。米国特許出願公開第２００５−１７６１２９号および米国特許第５，５８５，３６２号は、組み換えアデノウイルスベクターを記載し、米国特許第６，０２５，１９５号は、肝臓特的な発現のアデノウイルスベクターを開示する。米国特許出願公開第２００３−０１６６２８４号は、ウロキナーゼを含む、着目遺伝子の肝臓特異的な発現のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを記載する。米国特許第６，５２１，２２５号および第５，５８９，３７７号は、組み換えＡＡＶベクターを記載する。ＰＣＴ公開第ＷＯ ０２４４３９３号は、ヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子遺伝子を含む、ウイルスおよび非ウイルスベクターを記載する。該ヒトウロキナーゼ遺伝子の高レベルの発現が可能である発現ベクターは、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０３０８７３９３号に開示される。前述の特許出願および刊行物のそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８６】
ウロキナーゼをコード化するベクターは、任意に、適切なプロモータ、エンハンサ、転写ターミネータ、タンパク質をコード化する遺伝子の前にある開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および終止コドンを含む、発現調節配列を含むことができる。通常、発現調節配列は、転写を指示するのに十分な最小配列である、プロモータを含む。
【００８７】
該発現ベクターは、複製起点、プロモータ、ならびに形質転換細胞の表現型選抜を可能にする特異的遺伝子（抗生物質耐性カセット等）を含むことができる。通常、該発現ベクターは、プロモータを含み得る。該プロモータは、誘導性または構成的であり得る。該プロモータは、組織特異的であり得る。適したプロモータとしては、チミジンキナーゼプロモータ（ＴＫ）プロモータ、またはメタロチオネインＩプロモータ、またはポリヒドロンプロモータ、またはニューロン特異的エノラーゼプロモータ、またはチロシンヒドロキシラーゼプロモータ、またはベータアクチンプロモータ、または他のプロモータが挙げられる。一実施形態において、該プロモータは、異種プロモータである。
【００８８】
一実施例において、ウロキナーゼをコード化する配列は、所望のプロモータの下流にある。任意に、エンハンサ要素もまた、含まれ、通常、該ベクター上のどこかにあり得、増強効果も有する。しかしながら、増大した活性量は、通常、距離とともに減少する。
【００８９】
ウロキナーゼをコード化する該ベクターは、静脈内投与、または腹腔内投与、または門脈を介して血管内注入が挙げられるが、これらに限定されない、様々な経路により投与することができる。投与されたベクター量は、異なり、日常の実験を用いて決定され得る。一実施形態において、ＦＲＧマウスに、約１×１０８〜約１×１０１０のプラーク形成単位の用量で、アデノウイルスウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。好ましい一実施形態において、該用量は、約５×１０９のプラーク形成単位である。
【００９０】
例示的な一実施形態において、ＦＲＧマウスに、ヒトウロキナーゼをコード化するアデノウイルスベクターが投与される。アデノウイルスベクターは、非常に高い力価のある感染粒子に作製され得る、多種多様の細胞に感染する、分裂してない細胞へ遺伝子を効率的に転送する、およびゲストゲノムにほとんど組み込まれない（これは挿入突然変異により細胞形質転換のリスクを避ける）等の、他の型のウイルスベクターに優るいくつかの利点がある（Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９７，ｐａｇｅｓ ４４−５３、Ｚｅｒｎ ａｎｄ Ｋｒｅｓｉｎａｍ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ：２５（２），４８４−４９１，１９９７）。ウロキナーゼをコード化するために使用することができる代表的なアデノウイルスベクターは、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９２）、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ（Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７：１０９−１２８，１９９１）、およびＢａｒｒら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２：１５１−１５５，１９９５）に記載され、これらは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００９１】
以下の実施例を提供し、ある特定の特性、および／または実施形態を説明する。これらの実施例は、本発明を、記載される特定の特性または実施形態に制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９２】
以下の実施例に記載されるように、ヒト肝細胞の生着および増大は、ＦＲＧマウスにおいて、高効率である。ＦＲＧマウスの肝臓は、大きさおよび形において、肉眼的に正常であり、組織学的検査は、免疫補体Ｆａｈ−／−マウスとの間で有意な差異を示さなかった。さらに、ＦＲＧマウスは、ＮＴＢＣを投与した場合、よく生育し、十分に繁殖力があった。
【００９３】
一実施形態において、ＦＲＧマウスにおける肝臓疾患および選択圧の限度は、ＮＴＢＣを投与および中止することにより制御することができる（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４５３−４６０，１９９５）。ＮＴＢＣの中止は、移植したヒト肝細胞に対する選択的な利点を与える。肝臓疾患の程度を容易に制御することができることは、畜産および手術をさらに容易にする。さらに、該Ｆａｈ欠損突然変異体は、欠失であり、導入遺伝子の不活性化により野生型に戻すことができない。したがって、内因性復帰マウス細胞からの競合は、Ｆａｈノックアウト肝臓には存在しない。これは、ＦＲＧマウスは、年齢を問わず、ヒト肝細胞を生着することができ、連続移植は、実現可能であることを意味する。また、重要なことに、ＦＲＧマウスは、ヒト細胞を用いた再増殖が５０％を超える場合、腎疾患を予防するために必要とされることが前述の研究によって示されている（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：９０１−９１２，２００４）、補体阻害剤の投与なく、高度に再増殖することができる。これは、畜産において実質的に重要だけでなく、薬理学的干渉の潜在源を除去する。
【００９４】
ＦＲＧマウスにおいて、ヒト肝細胞の再増殖率は、約７０％を超えることができる（マウス肝臓において、７０％以上の肝細胞がヒト肝細胞である）。単一の再増殖したＦＲＧマウスからの平均収量は、約３，０００万から約４，５００万のヒト肝細胞である。単一ＦＲＧマウスから増大された肝細胞を、その後、連続移植と称されるプロセスにおいて、最高１００匹の二次ＦＲＧ受容マウスで再増殖するために使用することができる。
【００９５】
連続移植は、本明細書に記載される新規のシステムにおいて達成することができる。連続移植は、ヒト肝細胞を大規模に増大できるだけでなく、受容マウスのいくつかの世代を通して同一の遺伝子型のヒト細胞を増大させるための手段を提供する。また、さらなる移植手術のために高品質の源のヒト肝細胞を所有することは、重要である。少なくとも４回の肝細胞移植手術が実現可能であることを本明細書に実証している。さらに、連続移植から単離されたヒト肝細胞の生存能力は、約８０％を超えることができ、該肝細胞は、コラーゲンで被覆したプレートに容易に結合する。１０％の生着効率（１００，０００の細胞）、および再増殖後の約１，５００万の増大されたヒト肝細胞の最終採取の概算に基づいて、少なくとも１５０倍の生体内での増大を毎回達成することができる。したがって、ＦＲＧマウスにおいて、ヒト肝細胞の全増大は、５億倍を超え得る。
【００９６】
ヒト肝細胞の生着および増大は、様々な源および可変品質からの単離されたヒト肝細胞を用いて、ＦＲＧマウスにおいて、可能である。ヒト肝細胞の源としては、死体ドナー、肝臓切除術、および商業的に入手可能な源が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に示されるように、ヒト肝細胞の生着および増大は、あらゆる年齢のドナーを用いて、成功した。さらに、ヒト肝細胞を、該肝細胞があらかじめ凍結保存された場合でさえ、ＦＲＧマウスにおいてうまく増大させることが、本明細書に実証される。これは、肝細胞単離後、直ちに移植手術を必要とするシステムに優る重要な利点である。
【００９７】
実施例１：Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）マウスの作製
免疫不全Ｆａｈノックアウトマウスのいくつかの株を作製した。Ｆａｈ突然変異体をヌード、ｎｏｄ／ｓｃｉｄまたはＲａｇ１−／−バックグラウンドと交錯することは、不成功であった。Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞が完全に欠如するが、ＤＮＡ修復欠損のない、免疫不全Ｆａｈ−／−マウス株を作製するために、Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）マウスを作製した。オスＦａｈ−／−１２９Ｓ４マウス（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）を、メスＲａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）と交配させた。すべての動物に、１．６ｍｇ／Ｌの濃度で、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３ シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を含有する飲料水を与えてすべての動物を維持した（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４５３−４６０，１９９５）。各動物の遺伝子型を確認するために、ＰＣＲベースの遺伝子タイピングを、足指組織から単離した２００ｎｇのゲノムＤＮＡに実行した（Ｇｒｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ７：２２９８−２３０７，１９９３、Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：１０４−１０７，２００４）。
【００９８】
飲料水内にＮＴＢＣを継続して与えた場合、ＦＲＧマウスはよく生育し、十分な繁殖力があった。ＦＲＧマウス肝臓は、大きさおよび形において、肉眼的に正常であり、組織学的検査は、従来のＦａｈ−／−マウスと該ＦＲＧマウスとの間で差異を示さなかった。従来のＦａｈ−／−マウスの場合のように、ＮＴＢＣの中止は、ＦＲＧマウスにおいて、漸次の肝臓細胞損傷をもたらし、４〜８週間後、ＦＲＧマウスは最終的に死亡した（Ｏｖｅｒｔｕｒｆ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２：２６６−２７３，１９９６）。
【００９９】
実施例２：組織学および生着検出アッセイ
組織学および免疫細胞化学
ＦＡＨ免疫組織化学を、前述のように行った（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６１：５６５−５７４，２００２）。簡潔に述べると、ｐＨ７．４で、１０％リン酸緩衝ホルマリン中で固定された肝臓組織および腎臓組織は、１００％エタノール中で脱水され、５８℃で、パラフィンワックスに包埋された。脱パラフィン処理した４μｍの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学のために、切片は、３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールで、内因性ペルオキシダーゼのブロッキングのために処理した。また、アビジンおよびビオチンブロッキングは、一次抗体でインキュベーションする前に、行なった。切片は、室温で２時間、抗ＦＡＨウサギ抗体またはＨｅｐＰａｒ抗体（ＤＡＫＯ）でインキュベートし、次いで、ＨＲＰに接合した二次抗体でインキュベートした。シグナルは、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）により検出した。
【０１００】
ＦＡＨ酵素アッセイ
フマリルアセト酢酸は、受容者の肝臓からの細胞質の肝臓分画とともにインキュベートし、消失速度を、３３０ｎｍで分光学的に測定した。野生型およびＦａｈ−／−肝臓はそれぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。フマリルアセト酢酸は、ホモゲンチジン酸から酵素的に調製した（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２：２８７−３００，１９５５）。
【０１０１】
Ａｌｕ配列のためのゲノムＰＣＲ
ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、肝臓から単離した。ヒトＡｌｕ配列は、以下のプライマー５’−ＧＧＣＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＧ−３’（配列番号１）および５’−ＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号２）を用いた標準手順に従って、ＰＣＲにより増幅した。
【０１０２】
肝細胞特異遺伝子発現のためのＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、Ｒｎｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、肝臓から単離した。相補的ＤＮＡは、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素により合成した。表１に示されるプライマーは、ヒトまたはマウス特異的ｃＤＮＡ増幅のために使用した。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
ヒトアルブミンの測定
少量の血液を、ヘパリン化された毛細血管を有する左側の伏在静脈から１週間に１回採取した。トリス緩衝食塩水で１，０００倍または１０，０００倍希釈した後、ヒトアルブミン濃度は、製造業者のプロトコルに従って、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ）を用いて測定した。
【０１０５】
蛍光免疫細胞化学
ヒト化マウス肝臓からの肝細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で懸濁し、コラーゲン型１被覆６ウェルプレート上に播種した。付着した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで、１５分間固定し、５％スキムミルクでブロックした。ウサギ抗ＦＡＨ、ヤギ抗ヒトアルブミン（Ｂｅｔｈｙｌ）、ヤギ抗マウスアルブミン（Ｂｅｔｈｙｌ）を、１／２００の希釈で、一次抗体として使用した。ＡＬＥＸＡ（登録商標）フルオロ４８８抗ヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＡＬＥＸＡ（登録商標）フルオロ５５５抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、二次抗体として使用した。該画像は、Ｎｉｋｏｎのデジタルカメラを用いることによりＡＸＩＯＶＥＲＴ（登録商標）２００顕微鏡で捕捉した。
【０１０６】
ＦＡＣＳ解析
受容者の肝臓の解離後、実質細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合した抗ヒトヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ、Ｂ、Ｃ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびフィコエリトリン（ＰＥ）を接合した抗マウスＨ２−Ｋ（ｂ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートした。その後、これらをＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＣＡＬＩＢＵＲ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターで解析した。ＦＩＴＣを接合したＩｇＧおよびＰＥを接合したＩｇＧを、負の対照として使用した。
【０１０７】
蛍光原位置ハイブリダイゼーション
全ゲノムＤＮＡプローブは、全マウスゲノムＤＮＡおよび全ヒトゲノムＤＮＡのニックトランスレーション法により作製した。Ｃｙ３−ｄＵＴＰの取り込みは、製造業者の推奨（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って実行した。最終プローブ濃度は、２００ｎｇ／μｌであった。付着した細胞のあるスライドを、３７℃で１時間、１００ｍｇ／ｍｌのＲｎａｓｅで処理し、２Ｘ ＳＳＣ中で３回（１回３分間）洗浄した。洗浄ステップ後、スライドを、７０％、９０％、および１００％エタノール中で、３分間、それぞれ脱水した。染色体を、７５℃で３分間、７０％ホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣ中で変性し、次いで、冷７０％、９０％、および１００％エタノールで３分間、それぞれ脱水した。プローブカクテルを、７５℃で１０分間変性し、３７℃で３０分間あらかじめハイブリダイズした。プローブを、スライドに適用し、湿潤チャンバ中で、３７℃で一晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、５０％ホルムアミド／２Ｘ ＳＳＣ中で３回の３分洗浄、ＰＮ緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、２．５％ ＮＯＮＩＤＥＴ（登録商標）Ｐ−４０）中で３回の３分洗浄において、すべて４５℃で行われた。スライドは、その後、紫外線蛍光（Ｚｅｉｓｓ）下で、ヘキスト（０．２ｕｇ／ｍｌ）で対比染色し、カバースリップをかぶせ、観察した。
【０１０８】
実施例３：ヒト肝細胞の単離および凍結保存
ヒト肝細胞は、前述の手順に従って、肝臓移植手術のために使用されないドナー肝臓から単離した（Ｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１５：Ｓ１０５−１１０，２００６）。簡潔に述べると、肝臓組織を、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ（Ｓｉｇｍａ）およびＨＥＰＥＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）が追加された無カルシウムおよび無マグネシウムのハンクス液（Ｃａｍｂｒｅｘ）で潅流し、次いで、既存の脈管構造を通してイーグル最小必須培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で、１００ｍｇ／ＬのコラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ）および５０ｍｇ／ＬのデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて消化した。該細胞を、イーグル最小必須培地と７％小ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で、５０ｘｇで２分間、３回洗浄した。ペレット化された肝細胞は、冷ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）（腹腔内臓器の保存用の汎用大動脈洗浄および保冷液、ウィスコンシン大学液、またはＵＷとも称される）に移した。
【０１０９】
輸送された肝細胞は、１ｍｌあたり５×１０６の肝細胞で、１０％ウシ胎仔血清および１０％ジメチルスルホキシドが追加されたＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）溶液に移した。該クリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）を、紙タオルで厚く覆い、−８０℃で１日間保存し、液体窒素に最終的に移した。解凍のために、細胞を、３７℃の水浴中で急速に再加熱し、ＤＭＥＭを徐々に加え、ＤＭＳＯ濃度の変化速度を最小化した。
【０１１０】
実施例４：ヒト肝細胞を用いたＦＲＧマウス肝臓の再増殖
ウロキナーゼの過剰発現は、いくつかの系において、肝細胞生着を強化することが示されている（Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１０２９−１０３７，１９９５）。したがって、実験を行い、ヒト肝細胞の移植手術前、ウロキナーゼを発現するアデノウイルスの投与が有益であるかどうかを判定した。分泌型のヒトウロキナーゼ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子；ｕＰＡ）を発現するアデノウイルスベクターは、先に説明されている（Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：６２１０−６２１４，１９９５および米国特許第５，９８０，８８６号参照、参照することによって本明細書に組み込まれる）。
【０１１１】
ドナー肝細胞は、単離し、単離してから２４〜３６時間後に、移植した。大抵の場合、細胞は、ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）溶液中に保存し、輸送中、４℃に保った。しかしながら、２つの実験において、凍結保存した肝細胞を移植した。ドナー肝細胞の生存能力および品質は、１０％〜６０％の範囲の平板効率を伴い、大いに変化した。
【０１１２】
移植手術のために、以下の汎用プロトコルを使用した。成熟（６〜１５週齢）オスまたはメスＦＲＧマウスに、移植手術する２４〜４８時間前に、ｕＰＡアデノウイルス（マウスあたり５×１０９のプラーク形成単位（ＰＦＵ））の静脈注射（後眼窩注射）をした。１００μｌのダルベッコ改変イーグル培地中で、１００万の生存能力のあるヒト肝細胞（トリパンブルー色素排除試験法により判定された）を、２７ゲージ針で脾臓内に注入した。ＮＴＢＣの投与を、次の６日間（１．６ｍｇ／Ｌ ０〜２日目、０．８ｍｇ／Ｌ ３〜４日目、０．４ｍｇ／Ｌ ５〜６日目）にわたり徐々に中止し、移植手術から１週間後、完全に中止した。ＮＴＢＣの投与を停止してから２週間後、動物は、５日間薬物の投与を再開した後、再度中止した。
【０１１３】
３つの別個の移植手術において、ヒト肝細胞の一次生着は、最初にｕＰＡアデノウイルスを受けた受容者であるＦＲＧマウスにおいて観察した。したがって、ｕＰＡの前処理レジメンを、ほとんどのその後の移植手術実験において使用した。
【０１１４】
全体で、９つの異なるドナーからのヒト肝細胞をうまく使用して、ｕＰＡアデノウイルスレジメンの導入後、生着の失敗は生じなかった。これらのうち、７つは、脳死ドナーの肝臓から単離し、２つは、外科的肝臓切除術から単離した。ドナーの年齢は、１．２歳から６４歳の範囲で異なった（表２）。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】
すべての実験において、少なくとも１つの受容者に、細胞バッチの使用にかかわらず、本プロトコルを用いて、ヒト肝細胞が有意に生着された（＞１％ヒト細胞）。生着は、組織学、ＤＮＡ解析、酵素アッセイ、および後の実験である、ヒト血清アルブミンを含む、異なる方法により実証された。アルブミンレベルによりモニターされた移植手術において、４３のうちの１７（３９．５％；１２〜６７％）の一次受容者は再増殖した（表２および図３）。これらのうち、７つは、高度に再増殖し（３０〜９０％）、アルブミンレベル＞１ｍｇ／ｍｌに達した。死体肝臓からの肝細胞だけでなく、肝臓切除術からの肝細胞も生着した。さらに、凍結保存細胞も、無事に生着された。
【０１１７】
高度に生着されたマウス（＞３０％再増殖）において、移植されたＦＲＧマウスの体重は、第２のＮＴＢＣ中止中に、安定したのに対して、同一の細胞を与えたＩｌ２ｒｇ（Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ＋／−）のヘテロ接合型である免疫不全同腹仔のうち減量し続けたものは少なかった（図１ａ）。三重変異体マウスにおいて、この体重の安定は、移植されたヒト肝細胞が、罹患Ｆａｈ−／−受容肝細胞の機能を置換していることを示唆した。完全に体重が安定化するや否や（初期移植手術から２〜３ヶ月後）、受容者の肝臓は、その後、採取された。肉眼的に、ＦＲＧ肝臓は、大きさおよび形において、正常であり、肉眼的結節はなかった。ヒト特異的Ａｌｕ ＤＮＡ配列のゲノムＰＣＲは、ＦＲＧ受容者の肝臓において陽性であったのに対して、Ｉｌ２ｒｇヘテロ接合体は、すべて陰性であった（図１ｂ）。再増殖細胞の肝細胞機能を直接確認するために、ＦＡＨ酵素活性を、アッセイした（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２：２８７−３００，１９５５）。
【０１１８】
受容マウスの肝臓は、正常マウス肝臓と同等またはそれを超える、多量のＦＡＨ酵素活性があった（図１ｃ〜ｅ）。ＦＡＨは、十分に分化した肝細胞において、単独に発現するため、移植されたヒト肝細胞は、マウス肝臓に生着された場合、脱分化または異常がないことを示唆した。ＦＡＨ免疫染色により、７０％以上の肝実質が、ＦＡＨ陽性ヒト肝細胞によって再増殖されたことが確認された（図１ｆおよび図１ｇ）。
【０１１９】
組織学的および免疫組織化学的試験は、追加の受容者の肝臓を用いて行った（図２ａおよび図２ｂ）。ＦＡＨ陽性ヒト肝細胞は、受容者の肝臓の構造に完全に統合されたようであった。いくつかの受容者において、生着された肝細胞は、受容者の肝臓組織を阻害することなく、８０％以上の柔組織を占めた（図２ｂ、２ｅ、および２ｆ）。クローン的に増加しているヒト肝細胞は、形態学的に、大きさにより、およびそれらの蒼白の細胞質により、マウス肝細胞とは明らかに区別することができた（図２ｃおよび図２ｄ）。ヒト肝細胞のその大きさは、恐らく、上述に報告されるようにグリコーゲン蓄積のため、比較的大きく、それらの細胞質は、鮮明であった（Ｍｅｕｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１：８４７−８５６，２００５）。ＦＡＨ陽性肝細胞はまた、ＨｅｐＰａｒ抗体に対しても陽性であり、この抗体はヒト肝細胞を特異的に標識化するが、マウス肝細胞は、標識化しない（図２ｅおよび図２ｆ）。対照的に、ＦＡＨ陰性領域は、ＮＴＢＣ投与の中止後、従来のＦａｈ−／−マウスにおいて所見と一致する、壊死炎症（ｎｅｃｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を示し、異形成肝細胞を含んだ。
【０１２０】
再増殖したヒト肝細胞が、成熟肝細胞特異遺伝子を発現するかどうかを検査するために、ＲＴ−ＰＣＲを、受容者の肝臓から抽出されたメッセンジャーＲＮＡに行った。ヒトアルブミン（ＡＬＢ）遺伝子、ＦＡＨ遺伝子、トランスフェリン（ＴＦ）遺伝子、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子、チロシンアミノ転移酵素（ＴＡＴ）遺伝子、およびＵＧＴ１Ａ１遺伝子が、受容者の肝臓において、多量に発現した（図３ａ、図６ｃ、および図７）。肝細胞の機能性をまた、ヒトアルブミンの血中濃度を測定することにより評価した。ヒトアルブミンに対して特異的なＥＬＩＳＡキットを使用し、検出の閾値は、１：１００に希釈した試料を用いて、０．０５μｇ／ｍｌであった。ヒトアルブミンは、まず、一次受容者において、移植手術から４〜１０週間後に検出された。当初は、ヒトアルブミンレベルに変動があったが、その後、ヒトアルブミンの濃度は、さらに数週間、相対的に漸増した（図３ｂおよび図３ｃ）。
【０１２１】
薬理作用のアルプロティナーゼ阻害剤は、高度に再増殖したマウスの生存能力を長期間維持するために必要であり得、該ドナー肝細胞により産生されたヒト補体は、受容者の腎臓に損害を与える可能性がある（Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ． Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：９０１−９１２，２００４参照）。したがって、いくつかの（ｎ＝３）高度に再増殖したマウスを、長期間観察した。これらのマウスは、ＮＴＢＣの投与を中止した４ヶ月間減量しなくて、マウスのヒトアルブミン濃度は、安定していた。さらに、該マウスの腎臓は、採取時に、肉眼的かつ組織学的に正常であった（図２ｇ）。
【０１２２】
実施例５：ヒト肝細胞の連続移植
前述の肝臓異種再増殖モデルの限界のうちの１つは、生着されたヒト肝細胞をさらに増大させる能力の低下である。該ＦＲＧマウス系において、連続移植の実行可能性を試験するために、高度に再増殖した一次受容者の肝臓（約７０％ヒト細胞）を潅流し、実質肝細胞を、標準コラゲナーゼ消化プロトコルを用いて採取した。
【０１２３】
ヒト細胞で再増殖したマウスに麻酔をかけ、門脈または下大静脈に、２４ゲージのカテーテルを用いてカニューレを挿入した。該肝臓を、０．５ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳが追加された無カルシウムおよび無マグネシウムのＥＢＳＳで５分間潅流した。該溶液は、０．１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＸＩ（ｓｉｇｍａ）および０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（ｓｉｇｍａ）が追加されたＥＢＳＳに１０分間変更した。該肝臓は、第２の溶液中で徐々に細分化し、７０μｍおよび４０μｍのナイロン製のメッシュで連続して濾過した。５分間、１５０ｘｇで遠心分離した後、該ペレットを、５０ｘｇで２分間、さらに２回洗浄した。細胞の数および生存能力は、トリパンブルー色素排除試験法により評価した。
【０１２４】
１００μｌのＤＭＥＭ中に懸濁された１００万の生存能力のある細胞を、２７ゲージ針で受容者の脾臓に注入した。Ｆａｈ陽性ヒト肝細胞とＦａｈ陰性マウス肝細胞に分離することなく、二次ＦＲＧ受容者への肝細胞の移植手術を行った。一次生着のために使用した該細胞と対照的に、本方法において採取されたヒト肝細胞の生存能力は、＞８０％であり、それらは、コラーゲンで被覆した培養プレートに容易に付着した（図４ｃ〜ｅ）。二次受容者の生着後、該連続移植は、類似の方法において、三次および四次受容者に対して継続された。各世代において、すべてではないが、一部の受容マウスのヒト血清アルブミンは、高度に陽性になった（図４ａ）。高度に再増殖したマウスの割合は、順次移植受容者においてさらに高く（７／４３と比較して１７／２８）、アルブミンの増加率は、さらに一貫していた（図３ｅ）。これは、連続継代の肝細胞が、最も移植可能なヒト肝細胞の質を高めることを表す可能性がある、あるいは、ドナーマウスから新たに採取した細胞のさらなる高品質および生存能力を単に反映する可能性がある。アルブミン陽性マウスからの肝臓試料のゲノムＰＣＲは、各世代において、ヒトＤＮＡの存在を示した（図４ｂ）。ヒト肝細胞による肝臓再増殖はまた、ＦＡＨに対する蛍光免疫染色により確認された（図４ｃ〜ｅ）。組織学的検査は、生着されたヒト肝細胞が、各世代において、形態学的に類似し、明らかにＦＡＨ陽性であることを示した（図４ｆ〜ｈ）。
【０１２５】
実施例６：肝細胞再増殖は、細胞融合の結果ではない。
【０１２６】
ウロキナーゼトランスジェニックマウスにおいて、一次細胞を用いた肝臓再増殖の最新報告は、細胞融合が、明らかな「肝細胞再増殖」を潜在的に明らかにすることを実証した（Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２５：２４７−２５７，２００６）。ｕＰＡトランスジェニックマウスが、その研究に使用されたため、これらの所見は、細胞融合がまた、他の報告において、マウス肝臓ヒト化のメカニズムでもあることの可能性を高めた。造血細胞と肝細胞との間の細胞融合はまた、Ｆａｈ欠損マウスにおいても観察されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４２２：８９７−９０１，２００３）。マウス細胞とヒト細胞との間の細胞融合は、薬学的応用のために、ヒト化マウス肝臓の価値を大幅に減退し得る。該再増殖した肝細胞が、元来は真にヒト肝細胞であったことを確認するために、ヒトまたはマウス特異的アルブミン、およびＦＡＨに対して二重免疫染色を行った。ほとんど（＞９５％）のマウスアルブミン陽性肝細胞は、実際には、ＦＡＨ陰性であり、ほとんどのＦＡＨ陽性肝細胞は、マウスアルブミン陰性であった（図５ａ〜ｃ）。他方では、ほとんどすべて（＞９０％）のヒトアルブミン陽性肝細胞はまた、ＦＡＨ陽性であるが、一方残りの肝細胞は、二重陰性であった（図５ｄ〜ｆ）。
【０１２７】
アルブミンは、分泌タンパク質であり、故に、細胞は、他の細胞から異種アルブミンを得ることにより抗体陽性を示すことができた。細胞融合の欠如をさらに確認するために、ヒトおよびマウス抗主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗体を、フローサイトメトリーのために使用した。各抗体は、種特異であることが確認された（図５ｇ〜ｊ）。両方の種の表面マーカーとも肝細胞陽性でないことが、高度に再増殖した肝臓に認められた（図５ｋおよび図５ｌ）。
【０１２８】
最終的に、蛍光原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、高度に再増殖した移植受容者から得た肝細胞に、ヒトおよびマウス全ゲノムプローブを用いて行った。高度に再増殖した一次（キメラマウス＃５３１）および三次（キメラマウス＃６３１）マウスから得た肝細胞を、ヒト全ゲノムＤＮＡあるいはマウス全ゲノムＤＮＡを用いてハイブリダイズした。該ヒトプローブまたは該マウスプローブに対して陽性である細胞の割合を記録した（表３）。対照は、純ヒトおよびマウス肝細胞、またはヒト肝細胞とマウス肝細胞の等混合であった。キメラ肝臓において見出されたヒト細胞が、細胞融合の産物であった場合、多くの肝細胞は、ヒトプローブとマウスプローブの両方に対して二重陽性であり、故に、マウスＤＮＡおよびヒトＤＮＡが陽性である細胞の割合は、１００％を超え得る。それどころか、割合合計は、ヒト肝細胞とマウス肝細胞の混合の場合と同じように、ほぼ１００％であると概算された。さらに、ヒト肝細胞は、脾臓が、ヒト細胞の融合パートナーとしての役割をし得るマウス肝細胞を欠如するという事実にもかかわらず、高度に再増殖したマウスの脾臓に検出された（図２ｈ）。したがって、二重陽性細胞（融合産物）は、ヒト細胞の大部分を占めることができなかった。
【０１２９】
【表３】
総合すれば、これらの結果は、融合事象が生じる場合、融合事象は、まれであり、再増殖する細胞の大部分は、連続移植を行う場合でさえ、純ヒト由来からなることを示す。したがって、ＦＲＧマウスにおいて増大されるヒト肝細胞は、ヒトの遺伝的および生化学的性質のみ有する。
【０１３０】
実施例７：ヒト化マウスにおける薬物代謝の機能的特性
キメラマウスにおける、ヒト肝臓特異的遺伝子の基底の発現および誘導を、検査した。培養された肝細胞におけるテストステロン代謝およびエトキシレソルフィン−Ｏ−デエチラーゼ（ＥＲＯＤ）活性の評価を、それぞれ、Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙら（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ．２７：８８７−８９４，１９９９）、およびＷｅｎら（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３０：９７７−９８４，２００２）に記載されるように実行した。ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲを、Ｋｏｍｏｒｏｓｋｉら（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３２：５１２−５１８，２００４）に記載されるように実行した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られたプライマーは、ヒトＣＹＰ１Ａ１（Ｈｓ００１５３１２０＿ｍ１）、ＣＹＰ１Ａ２（Ｈｓ００１６７９２７＿ｍ１）、ＣＹＰ３Ａ４（Ｈｓ００４３００２１＿ｍ１）、ＣＹＰ３Ａ７（Ｈｓ００４２６３６１＿ａ１）、ＣＹＰ２Ｂ６（Ｈｓ００１６７９３７＿ｇ１）、ＣＹＰ２Ｄ６（Ｈｓ００１６４３８５＿ａ１）、多剤体制関連タンパク質ＭＲＰ２（Ｈｓ００１６６１２３＿ｍ１）、胆汁塩輸出ポンプＢＳＥＰ、（Ｈｓ００１８４８２９＿ｍ１）、ＣＡＲ（Ｈｓ００２３１９５９＿ｍ１）アルブミン（Ｈｓ００６０９４１１＿ｍ１）、ＨＮＦ４α（Ｈｓ００２３０８５３＿ｍ１）、シクロフィリン（Ｈｓ９９９９９９０４＿ｍ１）、およびマウスアクチン（Ｍａ００６０７９３９＿ｓ１）に対して特異的であった。
単離された肝細胞の培養物を、構築し、シトクロムＰ４５０遺伝子の原型誘導物質に暴露した。該結果は、シトクロム（ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７）、輸送（ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２）、および薬物抱合酵素（ＵＧＴ１Ａ１）の基底遺伝子発現レベルは、培養された正常成熟ヒト肝細胞に見られる、まさにそのものであった（図６ｃ、図７）。さらに、ベータナフトフラボン（ＢＮＦ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびリファンピシン（Ｒｉｆ）のような化合物により誘発された遺伝子型は、正常ヒト細胞から予期されたとおりであった。ヒト薬物代謝遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに加えて、ヒトＣＹＰ１Ａおよび３Ａファミリーメンバーの酵素活性を測定した。エトキシレソルフィン−Ｏ−デエチラーゼ活性（ＥＲＯＤ）は、ヒト肝臓において、ＣＹＰ１Ａ１および１Ａ２により媒介されることが知られている。該結果は、ＥＲＯＤ活性が、ヒト化マウス肝臓細胞において、ＢＮＦへの事前暴露により特異的かつ堅牢的に誘導されたことを示す（図６ａ）。逆に、ＰＢまたはリファンピシンへの事前暴露は、ＣＹＰ３Ａ４を介した代謝の特異的測定である６−ベータ−ヒドロキシルテストステロンへのテストステロンの転換を特異的に誘導した（図６ｂ）。したがって、再増殖したＦＲＧ肝臓からの肝細胞は、これらの標準薬物代謝アッセイにおいて、正常成熟ヒト肝細胞との区別がつかなかった。
【０１３１】
実施例８：肝細胞再増殖前のマクロファージの減損
一次生着は、ウロキナーゼアデノウイルスの事前投与を行っても、１００％のＦＲＧ受容マウスで生じなかった。ＦＲＧマウスにおいて、正常数存在する肝臓マクロファージは、先天性免疫反応を促進することにより、ヒト細胞生着を限定することが可能である。
【０１３２】
潜在的なマクロファージにより惹起される免疫反応を中止するために、ＦＲＧマウスから、ヒト肝細胞の移植手術前に、マクロファージを減損させる。マクロファージ減損は、化学的減損（Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：３５−４３，２００３）、または抗体（ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０６：１２５９−１２６１，２００５）を用いることを含む、当技術分野で周知のいくつかの方法のうちのいずれか１つを用いて達成され得る。マクロファージはまた、クロドロネート含有リポソームを用いて減損され得る（ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０２：２５２２−２５３１，２００３）。マクロファージを減損するための追加の化合物および組成物は、米国特許公開第２００４−０１４１９６７号およびＰＣＴ公開第ＷＯ ０２／０８７４２４号に記載され、参照することにより本明細書に組み込まれる。マクロファージ減損後、ＦＲＧマウスに、本明細書の前述の実施例に記載される方法に従って、ヒト肝細胞を移植する、または連続移植する。
【０１３３】
実施例９：ＦｐｍＲＧマウスにおけるヒト肝細胞の生着
ＦＲＧマウスは、Ｆａｈ遺伝子のエクソン５（ＦａｈΔｅｘｏｎ５）に欠失を含む。ヒト肝細胞を、Ｆａｈ欠損の他のモデルにおいて、生着および増大し得ることを確認するために、Ｆａｈ遺伝子に点変異を含むマウス株を作製した。Ｆａｈ点変異（Ｆａｈｐｍ）マウスと呼ばれる、これらのマウスは、ミススプライシングを起させＦａｈ ｍＲＮＡにおいて、エクソン７の喪失を生じさせる該Ｆａｈ遺伝子に点変異を有する（Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６４１−６４５，２００１、参照することにより本明細書に組み込まれる）。表現型における差異は、ＦａｈｐｍマウスとＦａｈΔｅｘｏｎ５マウスとの間で検出されなかった。
【０１３４】
ＦａｈｐｍマウスをＲａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウス（実施例１に記載されるような）と交配させて、ホモ接合性Ｆａｈｐｍ／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦｐｍＲＧ）三重変異体マウスを作製した。ＦｐｍＲＧマウスの２つのコホートに、実施例４に記載される方法に従って、ヒト肝細胞を移植した。肝細胞移植手術の約２４〜４８時間前、マウスは、ｕＰＡアデノウイルスの静脈注射（後眼窩注射）を受けた。比較するために、同時に、ＦＲＧマウスに、ヒト肝細胞を移植した。ヒト血清アルブミンを、移植手術から２ヶ月および３ヶ月後に、極めて有意なレベル（２３μｇ／ｍｌ）で、ＦｐｍＲＧマウスの末梢血に検出した。ヒト血清アルブミンのこれらの血中濃度は、同時に移植されたＦＲＧマウスに見られる濃度と似ていた。
【０１３５】
これらの結果は、ＦｐｍＲＧマウスが、ＦＲＧマウスと同程度に、ヒト肝細胞で再増殖することができることを示す。したがって、ヒト化肝臓再増殖は、ＦａｈΔｅｘｏｎ５変異を有するＦＲＧマウスに特有ではないが、Ｆａｈ欠損マウスの任意の株で達成することができる。
【０１３６】
本開示は、生体内でヒト肝細胞を増大させるための方法を提供する。本開示は、生体内でヒト肝細胞を増大させるのに有用な遺伝子組み換え型免疫不全マウスをさらに提供する。記載される方法の正確な詳細は、本発明の趣旨から逸脱することなく、変更または修正することができることは明らかであろう。下記の特許請求の範囲および趣旨に入る範囲内ですべてのこのような修正および変更を請求する。
【０１３７】
配列表
添付の配列表に記載される核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語、およびアミノ酸の三文字コードを示す。各核酸配列の１本鎖のみを示すが、該相補鎖は、表示された該鎖に言及するときは常にそれに含まれるものとして理解する。添付の配列表において、
配列番号１および２は、ヒトＡｌｕ配列を増幅するためのＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１３８】
配列番号３は、ヒトＡＬＢ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１３９】
配列番号４は、ヒトＡＬＢ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４０】
配列番号５は、マウスＡｌｂ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４１】
配列番号６は、マウスＡｌｂ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４２】
配列番号７は、ヒトＴＡＴ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４３】
配列番号８は、ヒトＴＡＴ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である
配列番号９は、ヒトＴＦ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４４】
配列番号１０は、ヒトＴＦ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４５】
配列番号１１は、ヒトＦＡＨ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４６】
配列番号１２は、ヒトＦＡＨ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４７】
配列番号１３は、ヒトＴＴＲ順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４８】
配列番号１４は、ヒトＴＴＲ逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１４９】
配列番号１５は、ヒトＵＧＴ１Ａ１順方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【０１５０】
配列番号１６は、ヒトＵＧＴ１Ａ１逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内でヒト肝細胞を増大させる方法であって、
ｉ）単離されたヒト肝細胞をＲａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスに移植するステップであって、前記マウスが、Ｆａｈの発現が欠損している、ステップと、
ｉｉ）前記ヒト肝細胞を、少なくとも約２週間増大させるステップと、
ｉｉｉ）前記マウスからヒト肝細胞を採取するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記マウスが、前記Ｆａｈ遺伝子において、欠失に対してホモ接合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マウスが、Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）マウスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マウスが、前記Ｆａｈ遺伝子において、点変異に対してホモ接合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マウスが、Ｆａｈｐｍ／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦｐｍＲＧ）マウスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒトウロキナーゼをコード化するベクターが、前記ヒト肝細胞を注入する前に、前記マウスに投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ウロキナーゼが、分泌型のウロキナーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ウロキナーゼが、非分泌型のウロキナーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターが、静脈内投与される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターが、肝細胞注入の約２４〜４８時間前に投与される、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記マウスに、肝細胞注入前に、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３ シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）が投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＴＢＣが、約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マウスに、肝細胞注入後、少なくとも約３日間、ＮＴＢＣがさらに投与される、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記マウスに、肝細胞注入後、少なくとも約６日間、ＮＴＢＣがさらに投与される、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＮＴＢＣの前記用量が、肝細胞注入後、６日間の過程にわたり漸減される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＮＴＢＣが、飲料水内投与される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
肝細胞注入前、飲料水内投与されるＮＴＢＣの濃度が、約１ｍｇ／Ｌから約８ｍｇ／Ｌである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＮＴＢＣが、食物内投与される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＴＢＣが、注入することにより投与される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒト肝細胞が、少なくとも約６週間、増大可能である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒト肝細胞が、最長約６ヶ月間、増大可能である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記単離されたヒト肝細胞が、前記マウスの脾臓または門脈に注入される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記増大されたヒト肝細胞は、前記マウスの肝臓から採取される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヒト肝細胞が、臓器ドナーの肝臓から単離された、または外科的切除術から単離された、または幹細胞もしくは単球もしくは羊膜細胞に由来した、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記肝細胞は、注入前、凍結保存された、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
肝細胞注入前、前記ＦＲＧマウスからマクロファージを減損させるステップをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
マクロファージを減損させるステップが、化学的減損を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
マクロファージを減損させるステップが、マクロファージに特異的に結合する抗体の使用を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
連続移植により採取されたヒト肝細胞を増大させるステップをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子組み換えマウスであって、そのゲノムは、欠失または点変異が、機能的ＦＡＨ、ＲＡＧ−２、およびＩＬ−２Ｒγタンパク質の発現の喪失をもたらすような、Ｆａｈ、Ｒａｇ２、およびＩｌ２ｒｇ遺伝子において、前記欠失または１つもしくは複数の点変異に対して、ホモ接合体であり、前記マウスは、免疫不全であり、肝機能の低下を示し、ヒト肝細胞は、前記マウスにおいて、増大させることができる、遺伝子組み換えマウス。
【請求項３３】
前記欠失または点変異が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の完全喪失をもたらす、請求項３２に記載のマウス。
【請求項３４】
前記マウスが、ＦＲＧマウスである、請求項３２または３３に記載のマウス。
【請求項３５】
前記マウスが、ＦｐｍＲＧマウスである、請求項３２または３３に記載のマウス。
【請求項３６】
前記マウスが、ヒトウロキナーゼを発現する、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項３７】
前記ウロキナーゼが、分泌型のウロキナーゼである、請求項３６に記載のマウス。
【請求項３８】
前記ウロキナーゼが、非分泌型のウロキナーゼである、請求項３６に記載のマウス。
【請求項３９】
ヒトウロキナーゼの発現が、ヒトウロキナーゼをコード化する導入遺伝子の取り込みに起因する、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項４０】
ヒトウロキナーゼの発現が、ヒトウロキナーゼをコード化するベクターの投与に起因する、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項４１】
前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項４０に記載のマウス。
【請求項４２】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４０に記載のマウス。
【請求項１】
生体内でヒト肝細胞を増大させる方法であって、
ｉ）単離されたヒト肝細胞をＲａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスに移植するステップであって、前記マウスが、Ｆａｈの発現が欠損している、ステップと、
ｉｉ）前記ヒト肝細胞を、少なくとも約２週間増大させるステップと、
ｉｉｉ）前記マウスからヒト肝細胞を採取するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記マウスが、前記Ｆａｈ遺伝子において、欠失に対してホモ接合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マウスが、Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦＲＧ）マウスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マウスが、前記Ｆａｈ遺伝子において、点変異に対してホモ接合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マウスが、Ｆａｈｐｍ／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＦｐｍＲＧ）マウスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒトウロキナーゼをコード化するベクターが、前記ヒト肝細胞を注入する前に、前記マウスに投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ウロキナーゼが、分泌型のウロキナーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ウロキナーゼが、非分泌型のウロキナーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターが、静脈内投与される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターが、肝細胞注入の約２４〜４８時間前に投与される、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記マウスに、肝細胞注入前に、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３ シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）が投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＴＢＣが、約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マウスに、肝細胞注入後、少なくとも約３日間、ＮＴＢＣがさらに投与される、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記マウスに、肝細胞注入後、少なくとも約６日間、ＮＴＢＣがさらに投与される、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＮＴＢＣの前記用量が、肝細胞注入後、６日間の過程にわたり漸減される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＮＴＢＣが、飲料水内投与される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
肝細胞注入前、飲料水内投与されるＮＴＢＣの濃度が、約１ｍｇ／Ｌから約８ｍｇ／Ｌである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＮＴＢＣが、食物内投与される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＴＢＣが、注入することにより投与される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒト肝細胞が、少なくとも約６週間、増大可能である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒト肝細胞が、最長約６ヶ月間、増大可能である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記単離されたヒト肝細胞が、前記マウスの脾臓または門脈に注入される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記増大されたヒト肝細胞は、前記マウスの肝臓から採取される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヒト肝細胞が、臓器ドナーの肝臓から単離された、または外科的切除術から単離された、または幹細胞もしくは単球もしくは羊膜細胞に由来した、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記肝細胞は、注入前、凍結保存された、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
肝細胞注入前、前記ＦＲＧマウスからマクロファージを減損させるステップをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
マクロファージを減損させるステップが、化学的減損を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
マクロファージを減損させるステップが、マクロファージに特異的に結合する抗体の使用を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
連続移植により採取されたヒト肝細胞を増大させるステップをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子組み換えマウスであって、そのゲノムは、欠失または点変異が、機能的ＦＡＨ、ＲＡＧ−２、およびＩＬ−２Ｒγタンパク質の発現の喪失をもたらすような、Ｆａｈ、Ｒａｇ２、およびＩｌ２ｒｇ遺伝子において、前記欠失または１つもしくは複数の点変異に対して、ホモ接合体であり、前記マウスは、免疫不全であり、肝機能の低下を示し、ヒト肝細胞は、前記マウスにおいて、増大させることができる、遺伝子組み換えマウス。
【請求項３３】
前記欠失または点変異が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の完全喪失をもたらす、請求項３２に記載のマウス。
【請求項３４】
前記マウスが、ＦＲＧマウスである、請求項３２または３３に記載のマウス。
【請求項３５】
前記マウスが、ＦｐｍＲＧマウスである、請求項３２または３３に記載のマウス。
【請求項３６】
前記マウスが、ヒトウロキナーゼを発現する、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項３７】
前記ウロキナーゼが、分泌型のウロキナーゼである、請求項３６に記載のマウス。
【請求項３８】
前記ウロキナーゼが、非分泌型のウロキナーゼである、請求項３６に記載のマウス。
【請求項３９】
ヒトウロキナーゼの発現が、ヒトウロキナーゼをコード化する導入遺伝子の取り込みに起因する、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項４０】
ヒトウロキナーゼの発現が、ヒトウロキナーゼをコード化するベクターの投与に起因する、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項４１】
前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項４０に記載のマウス。
【請求項４２】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４０に記載のマウス。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図１ｇ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【図４ｆ】
【図４ｇ】
【図４ｈ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図５ｅ】
【図５ｆ】
【図５ｇ】
【図５ｈ】
【図５ｉ】
【図５ｊ】
【図５ｋ】
【図５ｌ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図７ｄ】
【図７ｅ】
【図７ｆ】
【図７ｇ】
【図７ｈ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図１ｇ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【図４ｆ】
【図４ｇ】
【図４ｈ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図５ｅ】
【図５ｆ】
【図５ｇ】
【図５ｈ】
【図５ｉ】
【図５ｊ】
【図５ｋ】
【図５ｌ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図７ｄ】
【図７ｅ】
【図７ｆ】
【図７ｇ】
【図７ｈ】
【公表番号】特表２０１０−５２８６６１（Ｐ２０１０−５２８６６１Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１３２７（Ｐ２０１０−５１１３２７）
【出願日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５９３７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５１２８３
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０６１２４２３９）オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティ (8)
【出願人】（５０３１１５２０５）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リランド スタンフォード ジュニア ユニヴァーシティ (69)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５９３７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５１２８３
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０６１２４２３９）オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティ (8)
【出願人】（５０３１１５２０５）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リランド スタンフォード ジュニア ユニヴァーシティ (69)
【Ｆターム（参考）】
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