生体分子を接合するための新規な試薬及び方法
【課題】生体分子を接合するための新規な試薬及び方法の提供。
【解決手段】
ポリマーにチオール基又はアミノ基を含んでいる分子を接合する方法であって、
該分子を一般式：
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｑは連結基を表し；
Ｗはケト基又はエステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；そして
ｍは１乃至８の整数を表す。）で表される化合物と反応させることを含む方法。
【解決手段】
ポリマーにチオール基又はアミノ基を含んでいる分子を接合する方法であって、
該分子を一般式：
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｑは連結基を表し；
Ｗはケト基又はエステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；そして
ｍは１乃至８の整数を表す。）で表される化合物と反応させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子、特にタンパク質及びペプチドを接合するための新規な試薬及び新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの治療効果のある分子、例えばタンパク質は、臨床医学的用途において、効力を発揮するために必要とされる特性を有していない。例えば、多くの天然タンパク質は、良い薬にはならない。その理由は、患者への投与時に、（１）タンパク質が血液又は組織中に存在する多くのエンド−及びエキソ−ペプチターゼによって消化される；（２）多くのタンパク質はある程度免疫原性である；並びに（３）タンパク質は腎臓限外ろ過及びエンドサイトーシスにより迅速に排出され得る等を含んだいくつかの固有の欠点があるからである。医学の分野で有効な治療薬としての有用性を発見するかもしれない、いくつかの分子は組織的に有毒であるか又は最適な生物学的利用態及び薬物動態を欠いている。タンパク質がすぐに血液循環から消えてなくなる場合は、タンパク質は一般的に頻繁に患者に投与されなければならない。頻繁な投与はさらに、毒性の危険性、特に免疫学的に生成された毒性を増加する。
【０００３】
水溶性、合成ポリマー、特にポリアルキレングルコースは、タンパク質、ペプチド及び低分子薬物のような治療効果のある分子を接合するために幅広く使用される。これらの治療的な接合体は、循環時間を引き延ばすこと及び除去率を減少させること、組織的毒性を減少させること、並びにいくつかの場合では、さらなる臨床的有用性を発揮することにより、薬物動態を優位に変えることが示されている。ポリエチレングリコール、ＰＥＧをタンパク質に共有結合する方法は、“ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）”として一般的に知られている。
【０００４】
最適化された効力にとってタンパク質ごとに複合ポリマー分子の数は各分子に対して同じである用量一貫性のための投与量を確保すること、及び各タンパク質分子は各タンパク質分子中の同じアミノ酸残基と特に共有結合することは重要である。タンパク質分子に沿った部分での非特異的接合は接合生成物の配分及び頻繁に、非複合タンパク質をもたらして精製するのに難しく且つ費用がかかる複雑な混合物を生み出す。
【０００５】
チオール特異的接合に対し、マレイミド基で一端を終端されたＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ化試薬が一般的に使用される。そのような試薬は多くの出版物、例えば国際公開第２００４／０６０９６５号パンフレットに記述されている。マレイミド末端試薬は市販されている。しかしながら、多くのＰＥＧ−マレイミドは保管及び薬剤候補接合の間加水分解的に不安定である。特に、マレイミド環の相当な程度の加水分解が抱合前も抱合後も、起こる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０６０９６５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
我々は今、ＰＥＧ化試薬群であって、単一の求核残基、例えばチオール基を介してポリマーにタンパク質及びペプチドを組み込んでいる接合分子に使用され得、そしてそのような市販試薬より有利であるものを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明はポリマーにチオール基又はアミノ基を含んでいる分子の接合方法を提供するものであって、該方法は一般式：
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｌ］m （Ｉ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｑは連結基を表し；
Ｗは電子求引基を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；
Ｌは脱離基を表し；そして
ｍは１乃至８の整数を表す。）で表される化合物と前記分子の反応を含む。
【０００９】
発明の方法による直接的な生成物は一般式：
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｚ］m （ＩＩａ）
（式中、
Ｘ、Ｑ、Ｗ、ｎ及びｍは上述した意味であり、そして
Ｚはチオール基又はアミノ基を介して接合された前記分子を表す。）によって一般的に表され得る。必要に応じて、この式（ＩＩａ）で表される得られる化合物は他の望ましい生成物に変換され得る。
特に、一般式（ＩＩａ）で表される得られる化合物は一般式ＩＩ
Ｘ−［Ｑ−Ｗ’−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｚ］m （ＩＩ）
（式中、Ｗ‘は電子求引性部分又は電子求引性部分の還元によって調製できる部分を表す。）
で表される化合物に変換され得る。
また、本発明は、第１観点として、ポリマーにチオール基又はアミノ基を含んでいる分子を接合する方法であって、
該分子を一般式：
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｑは連結基を表し；
Ｗはケト基又はエステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；そして
ｍは１乃至８の整数を表す。）で表される化合物を反応させることを含む方法、に関する。
第２観点として、前記Ｑは直接結合、アルキレン基又は随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基であって、これらのうちどれでも１つ以上の酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ基（Ｒはハロゲン原子又はアルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）、ケト基、−Ｏ−ＣＯ−基、−ＣＯ−Ｏ−基及び／又は−ＮＲ．ＣＯ−基によって終端又は中断され得る、第１観点に記載の方法に関する。
第３観点として、前記Ｑは随意に置換されたヘテロアリール基又はアリール基であって、−ＮＲ．ＣＯ−基によって隣接した前記ポリマーＸが終端されている、第２観点に記載の方法に関する。
第４観点として、前記Ｘはポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ＨＰＭＡコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリアミド、ジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸のコポリマー、多糖、又はタンパク質である、第一観点乃至第３観点のいずれか１つに記載の方法に関す
る。
第５観点として、前記Ｘはポリアルキレングリコールである、第４観点に記載の方法に関する。
第６観点として、前記Ｘはポリエチレングリコールである、第５観点に記載の方法に関する。
第７観点として、前記ｎは０である、第１観点乃至第６観点のいずれか１つに記載の方法に関する。
第８観点として、前記式Ｖで表される化合物は、一般式：
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖａ）
（式中、
Ａｒは未置換の又は置換アリール基を表す。）である、第１観点乃至第８観点のいずれか１つに記載の方法に関する。
第９観点として、前記Ａｒはアルキル基、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ．ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ．ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ．ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び−Ｃ＝ＣＨＲ（各Ｒは独立してハロゲン原子又アルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）から選ばれる１つ以上の同一又は異なった置換基によって随意に置換されたフェニル基を表す、第８観点に記載の方法に関する。
第１０観点として、前記Ａｒはフェニル基を表す、第９観点に記載の方法に関する。
第１１観点として、前記分子はペプチド又はタンパク質である、第１観点乃至第１０観点のいずれか１つに記載の方法に関する。
第１２観点として、一般式：
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖａ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｗはケト基又はエステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；
ｍは１乃至８の整数を表し；そして
Ａｒは未置換の又は置換されたアリール基を表す。）で表される化合物に関する。
第１３観点として、前記Ａｒはアルキル基、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ．ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ．ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ．ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び−Ｃ＝ＣＨＲ（各Ｒは独立してハロゲン原子又アルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）から選ばれる１つ以上の同一又は異なった置換基によって随意に置換されたフェニル基を表す、第１２観点に記載の化合物に関する。
第１４観点として、前記Ａｒはフェニル基を表す、第１３観点に記載の化合物に関する。
第１５観点として、前記Ｘはポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ＨＰＭＡコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリアミド、ジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸のコポリマー、多糖、又はタンパク質である、第１２観点乃至第１４観点のいずれか１項に記載の化合物に関する。
第１６観点として、前記Ｘはポリアルキレングリコールである、第１５観点に記載の化合物に関する。
第１７観点として、前記Ｘはポリエチレングリコールである、請求項１７に記載の化合物に関する。
第１８観点として、前記ｎは０である、第１２観点乃至第１７観点のいずれか１つに記載の化合物に関する。
第１９観点として、前記Ｗはケト基を表す、第１２乃至第１８観点のいずれか１つに記載の化合物に関する。
第２０観点として、
式：
【化１】
で表される、第１２観点に記載の化合物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は実施例１の第一工程の反応スキームを示す図である。
【図２】図２は実施例１の第二工程の反応スキームを示す図である。
【図３】図３は実施例１の第三工程の反応スキームを示す図である。
【図４】図４は実施例１の第四工程の反応スキームを示す図である。
【図５】図５は実施例２の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図６】図６は実施例３の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図７】図７は実施例５の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図８】図８は実施例６において反応からの逆相クロマトグラフィー分析を示す図である。
【図９】図９は実施例７の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図１０】図１０は実施例８において反応からの陽イオン交換クロマトグラフィー分析を示す図である。
【図１１】図１１は実施例８のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
【図１２】図１２は実施例９の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図１３】図１３は実施例１１の経時的ＰＥＧ化のクロマトグラムを示す図である。
【図１４】図１４は実施例１０及び１１にあるように化合物９、１０及び１１の相互変換を示す図である。
【図１５】図１５は実施例１１の変換結果を示す図である。
【図１６】図１６は実施例１２の逆相クロマトグラフィー結果を示す図である。
【図１７】図１７は実施例１３の安定性結果を示す図である。
【図１８】図１８は実施例１７の中間生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図１９】図１９は実施例１７の最終生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図２０】図２０は実施例１７の吸光度結果を示す図である。
【図２１】図２１は実施例１９の反応スキームを示す図である。
【図２２】図２２は実施例２０の反応スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一般式（Ｉ）で表される化合物は新規であり、それ故に本発明もまたこれらの化合物自
体を提供する。特に好ましい式（Ｉ）で表される新規な化合物は下記に定義された式（Ｉａ）で表されるものである。
【００１２】
一般式（ＩＩ）で表される化合物もまた新規であり、それ故に本発明もまたこれらの化合物自体を提供する。特に好ましい式（ＩＩ）で表される新規な化合物は下記に定義された式（ＩＩｂ）で表されるものである。
【００１３】
ｍは１乃至８の整数、例えば１乃至６、好ましくは１乃至４、例えば１を表す。ｍが１の場合、単一の分子がポリマーに接合される。ｍが１より大きい場合、ポリマーに対し二つ以上の分子の接合が得られ得る。２乃至８の基−Ｑ−Ｗ’−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｚ又は−Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｌはポリマーに結合し、変数Ｑ、Ｗ、Ｗ’、ｎ、Ｌ及びＺは各そのような基に対して同一又は異なっていても良い。多官能ポリマー化合物は利用でき、例えば、多数の基は、出発物質として登録商標“サンブライト（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ）” ：例えば、４−アーム（４−ａｒｍ）製品は、式Ｃ［ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｙ］4（式中、Ｙは多数の異なった末端基の一つでもよい）の下、ＮＯＦから入手可能なマルチアーム（ｍｕｌｔｉ−ａｒｍ）化合物を使用しながら結合され得る。多量体接合体は相乗的かつ追加的な便益をもたらすことができる。例えば、ｍが１の場合、得られる接合体は複合分子から離れたＰＥＧ鎖の末端上に末端基を有する必要がある。これは一般に、アルコキシ基又はよく似た基であり、そして薬学的応用に利用されるとき、そのような基は望ましくない免疫効果を導き得ることが示唆される。ｍが１より大きい場合、アルコキシ基のような末端基を必要とせずに、複合分子はＰＥＧ鎖の両末端に結合される。
【００１４】
ポリマーＸは、例えばポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、例えばポリアクリロイルモルホリン、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド又はポリメタクリルアミド、例えばポリカルボキシメタクリルアミド、又はＨＰＭＡコポリマーであってもよい。さらに、Ｘは酵素又は加水分解の影響を受けやすいポリマーである。そのようなポリマーとしては、例えば、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、及びポリ（アミノ酸）のような、ポリアミドが挙げられる。ポリマーＸはホモポリマー、ランダムコポリマー又はブロックコポリマーのような構造的に明確なコポリマーであってもよい。例えばＸは二種以上のアルキレンオキシド、又はポリ（アルキレンオキシド）及びポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、又はポリ（アミノ酸）のいずれかから誘導されるブロックコポリマーであってもよい。使用され得る多官能性ポリマーはジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸のコポリマーである。
【００１５】
天然高分子、例えばキチン、デキストラン、デキストリン、キトサン、でんぷん、セルロース、グリコーゲン、ポリ（シアル酸）及びその誘導体のような多糖もまた使用され得る。タンパク質はポリマーとして使用され得る。これは第二のタンパク質、例えば酵素又は他の活性タンパク質に、１つのタンパク質、例えば抗体又は抗体フラグメントの接合を可能にする。また、触媒配列を含んでいるペプチド、例えばグリコシルトランスフェラーゼのＯ−グリカンレセプター部位が使用される場合、次の酵素反応の基質又はターゲットの取り込みを可能にする。ポリグルタミン酸又はポリグリシンのようなポリ（アミノ酸）もまた、サッカリド又はアミノ酸のような天然モノマー及びエチレンオキシド又はメタクリル酸のような合成モノマーから誘導されるハイブリッドポリマーとして使用され得る。
【００１６】
ポリマーがポリアルキレングリコールである場合、これは好ましくはＣ2及び／又はＣ3単位を含んでいるものであり、特にポリエチレングリコールである。ポリマー、特にポリアルキレングリコールは、単一の線状鎖を含んでいてもよく、または多くの鎖−小さい或
いは大きな多くの鎖−により構成された分岐形態を有していてもよい。いわゆるプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）はＰＥＧブロックコポリマーの重要な種類である。これらはエチレンオキシド及びプロピレンオキシドブロックから誘導される。置換ポリアルキレングリコール、例えばメトキシポリエチレングリコールは使用され得る。発明の好ましい実施態様では、単一鎖のポリエチレングリコールは適切な基、例えばアルコキシ基、例を挙げるとメトキシ基、アリールオキシ基、カルボキシキ基又はヒドロキシ基によって開始され、そして鎖の反対側でリンカー基Ｑに結合される。
【００１７】
ポリマーＸはいくつかの所望の方法で誘導体化又は機能化され得る。反応基はポリマー末端又は末端基で、またはペンダントリンカーを介してポリマー鎖に沿って結合され得る；そのような場合、ポリマーは例えばポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、又は無水マレイン酸コポリマーである。そのような機能性ポリマーは多量体接合体（例を挙げると、ポリマーが二つ以上の分子に接合される接合体）を調製するさらなる機会をもたらすのにより一層の機会をもたらす。必要に応じて、ポリマーは従来の方法を用いて担体に結合され得る。
【００１８】
ポリマーの最適分子量はもちろん対象としている用途次第である。好ましくは、数平均分子量は２５０ｇ／ｍｏｌｅ乃至およそ７５，０００ｇ／ｍｏｌｅの範囲内である。一般式ＩＩで表される化合物が医学的用途に用いられ、そして血液循環を離れて組織に浸透することを目的としている、例えば悪性腫瘍に起因する炎症、感染又は自己免疫疾患、又はトラウマの治療用の場合、２０００−３０，０００ｇ／ｍｏｌｅの範囲内にある低分子量ポリマーを使用することが有用である。一般式ＩＩで表される化合物を血液循環中に残存させることを目的としている用途に対しては、例えば２０，０００−７５，０００ｇ／ｍｏｌｅの範囲内にある高分子量ポリマーを使用することが有用である。
【００１９】
接合体がその使用目的のために溶剤に溶解できるように使用されるポリマーを選ばなければならない。生物学的適用、特に診断的適用及び哺乳類への臨床治療的投与に対する治療への応用に対して、接合体は水媒体に溶解できる。しかしながら、多くの生物学的分子、例えば酵素のようなタンパク質は、例えば化学反応を触媒するために、産業での有用性がある。そのような用途で使用されるための接合体に対し、接合体は水媒体及び有機媒体の一方又は両方に溶解できる必要がある。ポリマーはもちろん接合される分子の所望の機能を不当に損なうべきではない。
【００２０】
好ましくはポリマーは合成ポリマーであり、好ましくは水溶性ポリマーである。水溶性ポリエチレングリコールの使用は多くの用途に対して特に好まれる。
【００２１】
連結基Ｑは、例えば直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ1-10アルキレン基）、または随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基であって、これらのうちどれでも１つ以上の酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ基（Ｒは水素原子又はアルキル基（好ましくはＣ1-6アルキル基）、アリール基（好ましくはフェニル基）、又はアルキル−アリール基（好
ましくはＣ1-6アルキル−フェニル基）を表す。）、ケト基、−Ｏ−ＣＯ−基、−ＣＯ−
Ｏ−基、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲ−、−ＮＲ−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＲ−及び／又は−ＮＲ．ＣＯ−基によって終端又は中断され得るものある。そのようなアリール基及びヘテロアリール基Ｑは発明の１つの好ましい実施形態を形成する。適切なアリール基としてはフェニル基及びナフチル基が挙げられ、一方、適切なヘテロアリール基としては、ピリジン基、ピロール基、フラン基、ピラン基、イミダゾール基、ピラゾール基、オキサゾール基、ピリダジン基、ピリミジン基及びプリン基が挙げられる。特に適切な連結基Ｑはヘテロアリール基又は、特に、アリール基、特にフェニル基であって、−ＮＲ．ＣＯ−基によって隣接したポリマーＸを終端化したものである。ポリマーへの結合は加水分解に不安定な結合、又は非不安定な結合を介してでもよい。
【００２２】
随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基に存在し得る置換基としては、例えばアルキル基（好ましくはＯＨ又はＣＯ2Ｈによって随意に置換されたＣ1-4アルキル基、特にメチル基）、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯ2Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＯＲ、−
ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ2Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ2Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、ＮＨＣＯ2Ｒ、−ＮＲ．ＣＯ2Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ．ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ．ＣＯＲ、−Ｎ+Ｒ3、−Ｎ+Ｈ3、−Ｎ+ＨＲ2、−Ｎ+Ｈ2Ｒ、ハロゲン原子、例えばフッ素原子又は塩素原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ2及び−Ｃ＝
ＣＨＲ（ここで、各Ｒは独立してハロゲン原子又はアルキル基（好ましくはＣ1-6アルキ
ル基）、アリール基（好ましくはフェニル基）、又はアルキル−アリール基（好ましくはＣ1-6アルキル−フェニル基）を表す。）から選ばれる１つ以上の同一又は異なった置換
基が挙げられる。電子求引置換基の存在が特に好ましい。好ましい置換基は例えばＣＮ、ＮＯ2、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲ．ＣＯＲ、−ＮＨＯＨ及び
−ＮＲ．ＣＯＲ．が挙げられる。
【００２３】
Ｗは、例えばケト基ＣＯ、エステル基−Ｏ−ＣＯ−又はスルホン基−ＳＯ2−を表し、
そしてＷ’はそのような基又は例えばＣＨ．ＯＨ基、エーテル基ＣＨ．ＯＲ、エステル基ＣＨ．Ｏ．Ｃ（Ｏ）Ｒ、アミン基ＣＨ．ＮＨ2、ＣＨ．ＮＨＲ又はＣＨ．ＮＲ2、またはアミドＣＨ．ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ又はＣＨ．Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）2の還元によって得られる基を表
す。
【００２４】
好ましくは、ｎは０である。
【００２５】
脱離基Ｌは例えば、−ＳＲ、−ＳＯ2Ｒ、−ＯＳＯ2Ｒ、−Ｎ+Ｒ3、−Ｎ+ＨＲ2、−Ｎ+
Ｈ2Ｒ、ハロゲン原子、又は−Ｏθを表す（ここで、Ｒは上述した意味であり、そしてθ
は置換アリール基、特に少なくとも１つの電子求引置換基を含むフェニル基を表すものであって、該電子求引置換基としては、例えば、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯ2Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ2Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ2Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ2Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ2Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨ
ＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ+Ｒ3、−Ｎ+ＨＲ2、−Ｎ+Ｈ2Ｒ、ハロゲン原子、特に塩素原子、又は特にフッ素原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ2及び−Ｃ＝ＣＨＲであり、各Ｒは独立して上述した意味の一つである。）。
【００２６】
ｍが２乃至８の整数を表す場合、必要に応じて異なったＬ基が存在し得る。これは異なった反応性のＬ基を選ぶことによって、逐次反応中のポリマーＸに異なった分子を接合するための有利な条件をもたらす。
【００２７】
好ましくは本発明による方法は一般式
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−ＳＯ2Ｒ’］m （Ｉａ）
（式中、
Ａｒは未置換の又は置換アリール基、特にフェニル基を表すものであって、任意の置換基は連結基Ｑに含まれるアリール基に対する上記のものから選ばれ；
Ｒ’は水素原子又は随意に置換されたアルキル基（好ましくはＣ1-6アルキル基）、ア
リール基（好ましくはフェニル基）、又はアルキル−アリール基（好ましくはＣ1-6アル
キル−フェニル基）を表し；そして
Ｗ及びｍは上述した意味を有する。）で表される試薬を使用して、
一般式
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ’−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｚ］m （ＩＩｂ）
で表される新規な接合体を製造する。
これらの好ましい化合物Ｉａ及びＩＩｂでは、好ましくはｎは０であり、そして好まし
くはｍは１乃至４の整数、特に１を表す。好ましくはそれぞれのＷはＣＯ基を表し、そしてＷ’はＣＯ基又はＣＨ．ＯＨ基を表す。好ましくはＲ’は随意に置換されたアルキル基、例えば−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨのような随意にヒドロキシ置換されたＣ1-4アルキル基、又は
、特に、Ｃ1-4アルキル−アリール基、特にｐ−トルイル基を表す。好ましくはＡｒは未
置換のフェニル基である。好ましくはＸはポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコールである。
【００２８】
式Ｉで表される化合物、及び特に式Ｉａで表される化合物は、驚くほど安定であり、そしてまたチオール基又はアミノ基を含んでいる分子に対して高反応性であると考えられる。本発明による接合方法は一般式
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−ＣＨ＝ＣＨ2］m Ｖ
（式中、Ｘ、Ｑ、Ｗ、ｎ、及びｍは上述した意味を有する。）
で表される中間化合物の形成を介して進行すると考えられる。
【００２９】
本発明の方法によって接合される分子は任意の所望の分子であり得る。それは例えば天然分子又は天然分子から誘導される分子であり得、またはチオール基（−ＳＨ）又はアミノ基（−ＮＨＲ）を含むという条件で、生物活性、例えば任意のドラッグを有している任意の分子であり得る。例えば、それはタンパク質又はペプチドであり得る：本明細書中、用語“タンパク質”は便宜上使用され、そして文脈上他の意味に解すべき場合を除き、“タンパク質”への言及は“タンパク質又はペプチド”への言及を意味していると理解すべきである。
【００３０】
分子が結合されているチオール基又はアミノ基は、脱離基Ｌの脱離と同時に試薬Ｉと反応する能力がある求核試薬である。そのような基は天然生体分子中に存在し得る、または接合前に生体分子に導入され得る。
【００３１】
２つのチオール基は天然又は人工ジスルフィド（システイン）架橋の還元によって発生し、それは鎖内又は鎖間であり得る。生体分子は１つ又は非常に多数のジスルフィド架橋を含むことができ、遊離スルフヒドリル部分を生じさせるための還元は１つ又は非常に多数のジスルフィド架橋を還元するために行われ得る。ジスルフィド還元の程度及び使用されるポリマー接合試薬の化学量論次第で、１つ又は非常に多数のポリマー分子を生体分子に接合させることができる。異なった反応条件又は変性剤の添加を使用して部分的な還元のように、ジスルフィド総数未満に減らすことを望む場合、固定化還元剤が使用され得る。
【００３２】
また、チオール基は単一のシステイン残基又はもともとジスルフィド架橋から誘導されていない他のチオール基であり得る。単一のシステインは合成手段によって導入され得、付着の適切なポイントをもたらす。そのような手段はペプチドの接合に非常に有用である。
【００３３】
アミノ基は例えばリシン又はヒスチジン残基であり得る。これらは天然生体分子中に存在し得る、または合成的に導入され得る。例えば、ヒスチジン残基は隣接するヒスチジン残基の短鎖、例えばタンパク質への合成方法により付着されるヒスチジン残基を最高で１２個、ただし一般的には５又は６個の残基を含んでいる、ｈｉｓ−タグ（ｈｉｓ−ｔａｇ）の方法によって導入され得る。Ｈｉｓ−タグはニッケル及びコバルトと強く結合し、Ｈｉｓ−タグを固定化金属アフィニティークロマトグラフィーとして知られている分離方法に使用されるニッケル−又はコバルト−含有カラムと結合させることを可能とする。ポリヒスチジンタグは幅広く使用され、広範囲のタンパク質及びペプチドに付着して、タンパク質及びペプチド又はそれらから誘導される生成物が、将来、混合物から分離されるようにする。
【００３４】
分子がタンパク質の場合には、それは例えばペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、酵素、サイトカイン、ケモカイン、レセプター、血液因子、ペプチド・ホルモン、毒素、転写タンパク質、又は多量体タンパク質であってもよい。
【００３５】
所望の用途に応じて、本発明における有用性を有し得るいくつかの具体的なタンパク質を次に示す。酵素は炭水化物−特異的酵素、タンパク質分解酵素などが挙げられる。興味のある酵素としては、一般的適用や治療への応用において産業上（有機系の反応）及び生物学的応用に対して、米国特許第４，１７９，３３７号に開示されているオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼが特に挙げられる。興味のある特異的酵素としては、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、及びグルタミナーゼが挙げられる。
【００３６】
一般式Ｉで表される化合物に使用されるタンパク質としては、例えばアルブミンのような血漿タンパク質、転送、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子、フォン・ヴィレブランド因子、インスリン、ＡＣＴＨ、グルカゴン（ｇｌｕｃａｇｅｎ）、ソマトスタチン、ソマトトロピン、サイモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、黄体形成ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、ヘモグロビン、サイトカイン、抗体、抗体フラグメント、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン及び組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。
【００３７】
インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子のような特定の前記タンパク質もまた非グリコシル化形態で存在し、通常組み換えタンパク質技術による調製の結果に存在する。非グリコシル化型は本発明に使用され得る。
【００３８】
興味のある他のタンパク質は、ポリ（アルキレンオキシド）のようなポリマーと接合させ、その結果寛容誘導物質（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｅｒｓ）としての使用に適する場合、低下したアレルギー誘発性を有するとしてＤｒｅｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９９０） ６
３１５−３６５によって開示されたアレルゲンタンパク質である。アレルゲンのうち、開示されたものはブタクサ抗原Ｅ、ミツバチ毒、ダニ・アレルゲンなどである。
【００３９】
ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びフラグメントのような免疫グロブリンがそうであるように、免疫グロブリン、オボアルブミン、リパーゼ、グルコセレブロシダーゼ、レクチン、組織プラスミノゲン活性化因子及びグルコシル化インターロイキンのような糖ポリペプチド、インターフェロンやコロニー刺激因子には興味がある。
【００４０】
特に興味深いのは、レセプターやリガンド結合タンパク質及び抗体や抗体フラグメントであって、それらは診断及び治療目的で臨床医学において使用される。抗体は単独で使用され得又は放射性同位体又は細胞毒性／抗感染症薬のような別の原子又は分子と共有結合(投入“ｌｏａｄｅｄ”)され得る。エピトープは予防接種のために使用され得、免疫原性ポリマー―タンパク質接合体を生産する。
【００４１】
必要に応じて生体分子は誘導体化又は機能化され得る。特に、接合前に、分子、例えば天然タンパク質は様々な保護基と反応され得、鋭敏基（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｇｒｕｏｐ）表面を保護する；または本発明の方法を使用して或いは別の方法を使用して、１つ以上
のポリマー又は他の分子と前もって接合され得る。
【００４２】
分子は相対的に低分子量の合成分子であり得る。これは、例えば、接合が利点をもたらす任意の薬になり得る。多くのこのような分子に対し、発明による試薬に接合させるためにチオール基又はアミノ基を持っている適切なリンカーを挿入する必要がある。代表的な薬としては、例えばカプトプリル、アムホテリシンＢ、カンプトテシン、タクソール、イリノテカン及びＳＮ３８のようなその誘導体、ドセタキセル、及びリバビリンが挙げられる。
【００４３】
発明の方法を使用して接合され得る興味がある別の分子としては国際公開第２００４／０６０９６５号パンフレットに記載されているものが挙げられる。
【００４４】
本発明による方法はすべての反応物が溶解できる溶媒又は溶媒混合液中で行われ得る。接合される分子、例えばタンパク質は、水性反応媒体中一般式Ｉで表される化合物と直接反応してもよい。求核試薬（チオール又はアミン）のｐＨ所要値次第で、この反応媒体はまた緩衝され得る。反応に対する最適なｐＨはほとんどの場合少なくとも６．０、一般的に約６．８から約８．５の間、例えば約７．０乃至８．０、好ましくは約７．５−８．０であるが、別の場合では４．０という低いｐＨが使用され得、特にポリヒスチジンタグへの接合が要求されるとき、４．０乃至８．５の範囲にある有効なｐＨとなる。接合される分子の存在下、系中で上記式Ｖで表される化合物を生成することが好ましい場合、相対的に高いｐＨが全体に始めから終わりまで適切に使用される。また、分離工程において上記式Ｖで表される化合物を生じ、続いて分子を加えて接合体にすることが好ましい場合、第一工程は相対的に高いｐＨ（例えば７．５−８．０）で適切に行われ、一方それに続く工程はより低いｐＨ（例えば６．０乃至６．５）で最適に行われる。相対的に広範囲のｐＨ条件でうまく使用され得ることが本発明の試薬の利点である。
【００４５】
３−３７℃間の反応温度が一般的に適切である：これらの方法が起こり得る温度で抱合反応が行われる場合、タンパク質は分解し、凝縮し又は障害機能及び／又は反応効率を変性し得る。有機媒体（例えばＴＨＦ、酢酸エチル、アセトン）中で行われる反応は一般的に外界までの温度で行われる。
【００４６】
多くの他の試薬と違って、化学量論的当量又はわずかに過剰な試薬を使用することで分子は所望の試薬と効果的に抱合される。しかしながら、試薬は溶媒和物、例えばタンパク質に使用される水性媒体と競争反応を起こさないので、過剰な化学量論の試薬と抱合反応を行うことが可能である。過剰な試薬及び生成物は通常の精製中にイオン交換クロマトグラフィーによって、又はｈｉｓ−タグが存在する場合はニッケルを使用する分離によって容易に分離され得る。
【００４７】
分子が接合される基がチオール基である場合には、発明による方法は還元された生成物が式（Ｉ）で表される化合物と反応した後に、系中で生体分子中の二つのシステインアミノ酸から誘導されるジスルフィド結合を部分的に還元することによって行われ得る。ジスルフィドは、従来の方法を使用して、例えばジチオスレイトール、メルカプトエタノール、又はトリス―カルボキシエチルホスフィンで還元され得る。
【００４８】
発明による方法の即時生成物は一般式（ＩＩ）（式中、Ｗ’は電子求引基である。）で表される化合物である。そのような化合物はそれ自体に有用性がある：発明の方法は適切な条件下可逆的であるので、式（ＩＩ）（式中、Ｗ’は電子求引部分である。）で表される化合物は接合体からの分子の除去が求められる用途、例えば直接的な臨床的応用において有用性がある。しかしながら、電子求引部分Ｗ’は還元されて分子の除去を妨げる部分を生じさせ、そしてそのような化合物もまた多くの臨床的、産業的及び診断的適用におい
て有効性がある。
【００４９】
それ故、例えば、ケト基を含んでいる部分Ｗ’はＣＨ（ＯＨ）基を含んでいる部分Ｗ’に還元され得る；エーテル基ＣＨ．ＯＲはエーテル化剤によるヒドロキシ基の還元によって得られ得る；エステル基ＣＨ．Ｏ．Ｃ（Ｏ）Ｒはアシル化剤のよるヒドロキシ基の反応によって得られ得る；アミン基ＣＨ．ＮＨ2、ＣＨ．ＮＨＲ又はＣＨ．ＮＲ2は還元的アミノ化によってケトン又はアルデヒドから調製され得る；またはアミドＣＨ．ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ又はＣＨ．Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）2はアミンのアシル化によって形成され得る。還元剤とし
ての、ホウ化水素、例えばホウ化水素ナトリウム、シアノホウ化水素ナトリウム、ホウ化水素カリウム又はトリアセトキシホウ化水素ナトリウムの使用は特に好ましい。使用され得る他の還元剤としては、例えば塩化スズ（ＩＩ）、アルミニウムアルコキシドのようなアルコキシド、及び水素化リチウムアルミニウムが挙げられる。
【００５０】
一般式（Ｉ）で表される化合物は
一般式
Ａ−Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｌ （ＩＩＩ）
（式中、Ｑ、Ｗ、ｎ及びＬは上述した意味を有する。）で表される化合物を、
一般式
Ｘ−Ｂｍ （ＩＶ）
（式中、Ｘはポリマーを表す。）で表される化合物
と反応させることによって調製され得る；Ａ及びＢは（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で表される化合物が共に反応して、式（Ｉ）で表される所望の化合物を生じるように選ばれた基である。
【００５１】
一般式ＩＩで表される化合物は多くの用途がある。それらは例えば患者への直接的な臨床的応用に使用され得、また結果的に、本発明は薬学的に許容されるキャリヤーと共に一般式ＩＩで表される新規な化合物を含む医薬組成物をさらに提供する。発明は治療用に一般式ＩＩで表される新規な化合物、及び患者に対して本発明による一般式ＩＩで表される新規な化合物の薬学的有効量又は発明による医薬組成物を投与することを含む患者を治療する方法をさらに提供する。任意の所望の薬学的効果、例えば外傷治療、酵素補充、タンパク製剤の補給、創傷管理、毒素除去、抗炎症薬、抗感染薬、免疫調節、ワクチン接種又は制癌は、生体分子の適切な選択によって得られ得る。一般式ＩＩで表される化合物は造影剤、例えば放射性ヌクレオチドを含んでいてもよく、生体内で化合物を追跡することが可能である。
【００５２】
一般式ＩＩで表される化合物もまた非臨床的応用に使用され得る。例えば、酵素のような多くの生理的に活性な化合物は有機溶媒中で反応を触媒することが可能であり、そして一般式ＩＩで表される化合物はそのような用途に使用され得る。さらに、一般式ＩＩで表される化合物は診断ツールとしても使用され得る。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は発明を説明する。
【００５４】
実施例１：ＰＥＧ試薬合成：１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９の合成
第一工程：ｐ−カルボキシ−３−ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロリド２の合成
本工程に対する反応スキームを図１に示す。
２５０ｍＬの丸底フラスコにｐ−アセチル安息香酸（１５．０ｇ，１）、ピペリジンヒ
ドロクロリド１１．１１ｇ及びパラホルムアルデヒド８．２３ｇを入れた。無水エタノール（９０ｍＬ）及び濃塩酸（１ｍＬ）をその後加え、そして得られた懸濁液をアルゴン雰囲気下撹拌しながら１０時間加熱還流した。還流終了後、アセトン（１５０ｍＬ）を加え、そして反応混合物を室温まで冷却した。得られた白色の沈殿物をガラスフィルター（Ｇ３）で単離し、そして冷やしたアセトンで２回洗浄した。固形物をその後真空下で乾燥し、白色の結晶粉末（２，９．７２ｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．７９，２．９６，３．４５（ｂｒｍ，ピペリジン部分のＣＨ2），３．３６（ｔ，２Ｈ，ＣＯＣＨ2），３．７４（ｔ，２Ｈ，ＮＣＨ2），８．０９（ｍ，４Ｈ，ＡｒＨ）。
【００５５】
第二工程：４−（３−（ｐ−トリルチオ）プロパノイル）安息香酸５の合成
本工程に対する反応スキームを図２に示す。
ｐ−カルボキシ−３−ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロリド２（１．０ｇ）及び４−メチルベンゼンチオール（４１７ｍｇ，３）を無水エタノール（７．５ｍＬ）及びメタノール（５ｍＬ）の混合液で懸濁した。ピペリジン（５０μＬ）をその後加え、そして懸濁液をアルゴン雰囲気中で６時間撹拌しながら加熱還流した。室温まで冷却後得られた白色の沈殿物をガラスフィルター（Ｇ３）でろ過し、冷やしたアセトンで注意深く洗浄し、そして真空中で乾燥させて５（６１４ｍｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．２７（ｓ，３Ｈ，フェニル−ＣＨ3），３．２４，３．３９（ｔ，２×２Ｈ，ＣＨ2），７．１４，７．２６（ｄ，２×２Ｈ，トリル部分のＡｒＨ），８．０３（ｍ，４Ｈ，カルボン酸部分のＡｒＨ）。
【００５６】
第三工程：４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸６の合成
本工程に対する反応スキームを図３に示す。
４−（３−（ｐ−トリルチオ）プロパノイル）安息香酸５（１６０ｍｇ）を水（１０ｍＬ）及びメタノール（１０ｍＬ）の混合液で懸濁した。氷浴で冷却後、オキソン（７２０ｍｇ、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））を加え、そして反応混合物を一晩（１５時間）撹拌しながら室温まで温めた。得られた懸濁液を追加の水（４０ｍＬ）で希釈して懸濁液をほぼ均一にし、混合物をその後クロロホルム（合計１００ｍＬ）で３回抽出した。溜まったクロロホルム抽出物を塩水で洗浄しその後ＭｇＳＯ4で乾燥した。３０℃、真空下で
の揮発性物質の蒸発により白色の固形物６（１４９ｍｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．４１（ｓ，３Ｈ，フェニル−ＣＨ3），３．４２（ｔ，２Ｈ，ＣＯ−ＣＨ2），３．６４（ｔ，２Ｈ，ＳＯ2−ＣＨ2），７．４６，７．８２（ｄ，２×２Ｈ，トリル部分のＡｒＨ），８．０３（ｍ，４Ｈ，カルボン酸部分のＡｒＨ）。
【００５７】
第四工程：ＰＥＧ化４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸、ＰＥＧ試薬９の合成
本工程に対する反応スキームを図４に示す。
４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸６（１３３ｍｇ）及びО−（２−アミノエチル）−Ｏ’−メチル―ＰＥＧ８（ＭＷ １０ｋＤａ，５０２ｍｇ，バイオベクトラ（ＢｉｏＶｅｃｔｒａ））を乾燥トルエン（５ｍＬ）に溶解した。溶媒を加熱しないで真空下で除去し、乾燥固形残渣をその後アルゴン雰囲気下、乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）に再溶解した。氷浴で冷却した、得られた溶液に、アルゴン雰囲気下、ゆっくりとジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ，６０ｍｇ）を加えた。反応混合物をその後室温で一晩（
１５時間）撹拌し続けた。揮発性物質をその後真空下（３０℃、水浴）で除去し、アセトン（２０ｍＬ）中微温（３５℃）で再溶解した固体残渣を得た。溶液を非吸収性コットンウールでろ過し、不溶性物質を除去した。溶液をその後乾燥氷浴で冷却し、遠心分離（４６００ｒｐｍ、３０分間）によって分離された白色の沈殿物を得た。液相をデカントし、この沈殿操作を３回繰り返した。その後得られた灰色がかった白色の固形物を真空下で乾燥し、ＰＥＧ試薬９（４３７ｍｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ２．４６（ｓ，３Ｈ，フェニル−ＣＨ3）
，３．３８（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧ−ＯＣＨ3），３．４４−３．８２（ｂｒ ｍ，ＰＥＧ）
，７．３８，７．８３（ｄ，２×２Ｈ，トリル部分のＡｒＨ），７．９５（ｍ，４Ｈ，カルボン酸部分のＡｒＨ）。
【００５８】
異なったＰＥＧ分子量の類似したＰＥＧ試薬を同様の一般的な操作によって調製した。したがって、２０ｋＤａ ＰＥＧを乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）中スルホン６（２０．８ｍｇ）、Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−メチル−ＰＥＧ（２０ｋＤａ，２５０ｍｇ，フルカ（Ｆｌｕｋａ））及びＤＩＰＣ（８．７ｍｇ，７）の反応によって調製し、アセトン沈殿精製操作後、灰色がかった白色の固形物（２４５ｍｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ２．４６（ｓ，３Ｈ，フェニル−ＣＨ3）
，３．３８（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧ−ＯＣＨ3），３．４４−３．８２（ｂｒ ｍ，ＰＥＧ）
，７．３８，７．８３（ｄ，２×２Ｈ，トリル部分のＡｒＨ），７．９５（ｍ，４Ｈ，カルボン酸部分のＡｒＨ）。
【００５９】
実施例２：分子量５、１０及び２０ｋＤａのＰＥＧ試薬９を用いた単一のヒンジジスルフィド（２つのチオール）を有するＦａｂ抗体フラグメントのＰＥＧ化
Ｆａｂ溶液（アブカム（Ａｂｃａｍ）ｃａｔ．ｎｏ．ＡＢ６５２０、１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬにＤＴＴ原液（脱イオン水中１００ｍＭ）５μＬを加え、そして得られた溶液を３０分間、室温で放置した。溶液をｐＨ７．８，５０ｍＭリン酸緩衝液９５μＬ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡで２００μＬに希釈し、そしてその後ｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ−５ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０８５４−０１）に投入し、ｐＨ７．８，５０ｍＭリン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡで前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）した。ＮＡＰ−５ ｃｏｌｕｍｎは未乾燥のｐＨ７．８リン酸緩衝液の５×３００μＬで溶離される。還元Ｆａｂは主に画分３で特定され、タンパク質濃度は０．２３ｍｇ／ｍＬであると推定されるとすぐ、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を全ての画分用に測定した。
【００６０】
分子量５ｋＤａ、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａを有する３つのＰＥＧ試薬をｐＨ７．８リン酸緩衝液に溶解して、それぞれ溶液濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬを得た。
【００６１】
各ＰＥＧ化反応に対して、還元Ｆａｂ溶液（０．２３ｍｇ／ｍＬ）５．０μＬ及びＰＥＧ溶液０．４２μＬ（還元ヒンジジスルフィドチオールに対して１モル当量）を使用した。Ｆａｂ反応溶液もまたｐＨ７．８リン酸緩衝液４．６μＬで希釈され、最終容積１０μＬを得た。反応溶液を１２時間、４℃でインキュベートした。
【００６２】
ニューページ［登録商標］ ノーべックス ４−１２％ ビス−トリスゲル （ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ）（インビトロジェン（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０３２１ＢＯＸ）及びニューページ ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（ＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ００２）を使用しながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をその後反応溶液で行った。ゲルはインスタン
トブルー（イクスぺドン（Ｅｘｐｅｄｏｎ）ｃａｔ．ＮｏＩＳＢ１Ｌ）で染色した。以下の図５に結果を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のＰＥＧは、タンパク質マーカーに対してその本当の大きさのおよそ２倍になったので、５ｋＤａは１０ｋＤａのようになった。Ｆａｂはおよそ５０ｋＤａのタンパク質であり、非還元或いは還元形態に対する約２５ｋＤａでのバンド又は２つのバンドのような場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において約５０ｋＤａでのいずれかの単一バンドのようになった。これらは重くて明るい鎖であり、該鎖はＳＤＳを用いた還元及びインキュベーション時にヒンジジスルフィドによってもはや結合していない。それ故、Ｆａｂはジ−ＰＥＧ化されるが、それによって単一のＰＥＧを溶液中還元ヒンジジスルフィドの２つのシステインのそれぞれに付着し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は２５ｋＤａの重くて明るい鎖のモノＰＥＧ化を示す。標識１が付されたレーンはタンパク質マーカーである（ノヴェックス シャープ タンパク質スタンダード（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄｓ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＣ５８００）。レーン２はＦａｂを示す。標識４が付されたレーンはＤＴＴ（約２５ｋＤａ）で還元されたＦａｂを示す。レーン５はＰＥＧ化Ｆａｂに相当する３５ｋＤａにおいて一次生成物であるバンドと５ｋＤａ ＰＥＧ化結果を示す。少量の還元Ｆａｂは２５ｋＤａにとどまり、ＦａｂがほとんどＰＥＧ化されたことを示している。レーン６は１０ｋＤａ ＰＥＧ化Ｆａｂに相当する４０ｋＤａマーカーを超えた一次生成物であるバンドと１０ｋＤａ ＰＥＧ化結果を示す。レーン７は２０ｋＤａ ＰＥＧ化Ｆａｂに相当する６０ｋＤａマーカーを超えた一次生成物であるバンドと２０ｋＤａ ＰＥＧ化結果を示す。レーン３は事前の還元工程なしで試みられたＰＥＧ化結果を示す：ＰＥＧ化の反応部位が還元ジスルフィド結合であるということをＰＥＧ化生成物は示さないという事実。
【００６３】
実施例３：５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を用いたアスパラギナーゼのＰＥＧ化
ｐＨ７．８において１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる２０ｍＭリン酸ナトリム緩衝液中でアスパラギナーゼの１ｍｇ／ｍＬ溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）ｃａｔ．ｎｏ Ａ３８０９）１ｍＬを、ＤＴＴ（１５．４ｍｇ）に加えそして数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、得られた溶液を４０分間、室温で放置した。ロード画分（ｌｏａｄ ｆｒａｃｔｉｏｎ）として溶離液を集めながら、溶液１ｍＬをその後ｐＨ７．８ ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）されたＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０８５１−０１）に加え、該緩衝液は１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる。カラムはその後未乾燥のリン酸緩衝液の５×１ｍＬで溶離された。画分３及び４を混ぜ合わせて、２ｍＬとした。
５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９の溶液１０ｍｇ／ｍＬを脱イオン水で調製し、２．０μＬ（遊離チオールに対して１．５当量のＰＥＧ）を還元アスパラギナーゼ１００μＬに加えた。その溶液を数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、その次に一晩４℃で置き、その後サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。その結果を図６に示す。レーン１はＭＷを推定するために使用したタンパク質マーカーであり、レーン２はＰＥＧ化前のアスパラギナーゼでありそしてレーン３は５ｋＤａ ＰＥＧ試薬による還元アスパラギナーゼの反応溶液を示す。両方のシステインのＰＥＧ化に相当する強いバンドが６０ｋＤａタンパク質マーカーの真上に一次生成物として見られた。第二のより低いＭＷバンドは５０ｋＤａタンパク質マーカーの真上に存在し、該マーカーは２つのシステインの１つのみのＰＥＧ化に相当する。３０と４０ｋＤａの間には還元アスパラギナーゼに相当するごくかすかなバンドのみがあり、ほとんど全てのタンパク質はＰＥＧ試薬９でＰＥＧ化されていることを示す。
【００６４】
実施例４：５、１０及び２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ試薬９を用いた遊離した単一のシステインを持つＧ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、顆粒球コロニー刺激因子）のＰＥＧ化並びにマレイミド官能
基を持つ５ｋＤａ ＰＥＧとの比較
ＧＣＳＦ原液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中０．６６ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む）を各々１００μＬの５つの画分（ＰＥＧ化反応に対して天然Ｇ−ＣＳＦ及び４つの画分）に分けた。その画分をＧ−ＣＳＦに対して１モル当量のＰＥＧ試薬と共に４℃で一晩インキュベートした。５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９及び５ｋＤａ ＰＥＧマレイミド（フルカ（Ｆｌｕｋａ）ｃａｔ．ｎｏ．６３１８７）に対して、脱イオン水中で５ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ試薬３．５μＬを加えた。１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９に対して、脱イオン水中で５ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ溶液７μＬを加えた。２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９に対して脱イオン水中で５ｍｇ／ｍＬ 溶液１４．０μＬを加えた。ＰＥＧ化反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ニューページ［登録商標］ ノーべックス ４−１２％ ビス−トリスゲル、ＭＥＳバッファー（全てインビトロジェン）（ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ，ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ，
ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びインスタントブルーステイン（イクスペデオン（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＳＢ１Ｌ））によって分析した。添加されたＰＥＧ試薬を用いていないＧ−ＣＳＦは１５と２０ｋＤａタンパク質マーカーの間にバンドとして現れた。９による５ｋＤａ ＰＥＧ化に対し、５ｋＤａ モノＰＥＧ化ＧＣＳＦに相当する約３０ｋＤａにおいてバンドは可視的である。９による１０ｋＤａ ＰＥＧ化に対し、４０ｋＤａより下のバンドは１０ｋＤａ モノＰＥＧ化ＧＣＳＦに相当して可視的である。２０ｋＤａ ＰＥＧ結果に対し、２０ｋＤａ モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦに相当する５０と６０ｋＤａの間のバンドは可視的である。５ｋＤａ ＰＥＧマレイミド反応に対し、未反応のＧ−ＣＳＦ以外にバンドは見られなく、反応は本試薬とでは起きなかったことを示す。
【００６５】
実施例５：１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を用いたＣ末端上の８個のヒスチジン配列を有するインターフェロン（ＩＦＮ） α−２ｂにおけるヒスチジン上のＰＥＧ化
ＩＦＮ α―２ｂ（２ｍＭ ＥＤＴＡ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液中１．１３ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５）の２０μＬ溶液に１モル当量の１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９（脱イオン水中６ｍｇ／ｍＬ溶液の１．８μＬ）を加え、得られた溶液を室温で一晩インキュベートした。１モル当量の２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９（脱イオン水中６．６ｍｇ／ｍＬ溶液の３．３μＬ）でも繰り返し行った。両サンプルをその後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ニューページ［登録商標］ ノーべックス ４−１２％ ビス−トリスゲル、ＭＥＳランニングバッファー（全てインビトロジェン）（ＮｕＰＡＧＥ
Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ，ＭＥＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂ
ｕｆｆｅｒ，ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びインスタントブルーステイン（イクスペデオン（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＳＢ１Ｌ）によって分析した。その結果を図７に示す。標識１が付されたレーンはタンパク質マーカーである。レーン２は出発ＩＦＮのみである。レーン３は１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９反応の結果を示す。接合された１乃至５個のＰＥＧ鎖を有するＩＦＮに相当する３０と１６０ｋＤａ タンパク質マーカーの間に５つのはっきりと区別できるバンドがある。レーン４は２０ｋＤａ
ＰＥＧ試薬９反応の結果を示す。接合された１乃至３つのＰＥＧ鎖を有するＩＦＮに相当する６０から１１０ｋＤａ タンパク質マーカーの間に３つのはっきりと区別できるバンドがある。標識５が付されたレーンは染色していない２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬であり、そのためどのバンドも可視的ではない。標識６が付されたレーンは染色していない１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬であり、そのためどのバンドも可視的ではない。
【００６６】
実施例６：５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９用いたペプチド（構造中単一の遊離システインを持つ、レプチンフラグメント）のＰＥＧ化
レプチンフラグメント１１６−１３０アミドマウス（シグマ（Ｓｉｇｍａ）ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ６７８８）１ｍｇをｐＨ７．８で１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬに溶解した。５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９の５ｍｇ／ｍＬ溶液をｐＨ７．８で同じ緩衝液で調製した。レプチンフラグメント溶液５０μＬを５０μＬ緩衝液及びＰＥＧ溶液（システイン上の遊離チオールに対して３モル当量のＰＥＧ）９６．１μＬに加えた。溶液を数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、その次に一晩４℃で置いた、その後サンプルをＲＰ−ＨＰＬＣ分析した。ＲＰ−ＨＰＬＣはＪＡＳＣＯ ＨＰＬＣシステムに取り付けられた分析カラム Ｓｏｕｒｃｅ ５ＲＰＣ
４．６／１５０（アマシャム バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ｃａｔ．ｎｏ．１７５１１６０１）から構成した。緩衝液Ａは水＋０．０５％トリフルオロ酢酸（フィッシャーサイエンティフィック ＨＰＬＣグレード（Ｆｉｓｈｅｒ
ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＰＬＣ ｇｒａｄｅ）であり、また緩衝液Ｂはアセトニトリル（フィッシャーサイエンティフィック ＨＰＬＣグレード（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＰＬＣ ｇｒａｄｅ））であった。この方法は１ｍＬ／ｍｉｎの流速で３０分以上かけて緩衝液Ａの１００％緩衝液を０％にしたものである。ＨＰＬＣプロファイルを２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの下で観察した。レプチンフラグメント、ＰＥＧ試薬及び反応溶液に対する結果を図８に示す。
レプチンフラグメントは１１．４分の保持時間である。反応混合液ではこのピークは消失して１６．５分におけるピークに置き換わり、これはフラグメントがうまく誘導体化されたことを示している。
【００６７】
実施例７：分子量２０ｋＤａのＰＥＧ試薬９を用いたポリヒスチジンタグドメイン抗体フラグメントのＰＥＧ化及び生物活性
抗ＴＮＦアルファドメイン抗体フラグメント溶液（図１２においてＴＡＲ１−５−１９に記載された配列のように特許国際公開２００５／０３５５７２号パンフレットから抜粋され、そしてタンパク質のＣ末端上の６個のヒスチジンタグで表わされるタンパク質配列、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍ塩化ナトリウム及び３５０ｍＭイミダゾール中１．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５）２．７ｍＬを脱イオン水（４０ｍｇ／ｍＬ、タンパク質に対して１．９モル当量）中でＰＥＧ試薬の溶液０．３ｍＬに加えた。この溶液をＤ−Ｔｕｂｅ ｄｉａｌｙｚｅｒ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ），ｃａｔ．Ｎｏ．７１５０８−３）に移し、１６時間以上４℃で１Ｌ ｐＨ６．２緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析した。直線的濃度勾配法（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）（３０分以上かけて、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５を、７００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５へとする）を用いながらこの反応溶液をＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１１７８−０１）で精製した。
【００６８】
画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用しながら分析し、そしてその結果を図９に示した。ニューページ［登録商標］ ノーべックス ４−１２％ ビス−トリスゲル （ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ）（インビトロジェン（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０３２１ＢＯＸ）及びニューページ ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（ＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ００２）を使用し、ゲルをインスタントブルー（イクスぺドン（Ｅｘｐｅｄｏｎ）ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＳＢ１Ｌ）で染色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のＰＥＧは、タンパク質マーカーに対してその本当の大きさのほぼ２倍になったので、２０ｋＤａ ＰＥＧは４０ｋＤａタンパク質のようになった。ドメイン抗体フラグメントはおそよ１２．７ｋＤａのタンパク質である。標識１が付されたレーンはタンパク質マーカーである（ノヴェックス シャープ タンパク質スタンダード（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ
ｓ）、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＣ５８００）。レーン２はタンパク質のみを示す。標識３が付されたレーンは反応溶液である。５３ｋＤａにおけるバンドはモノＰＥＧ化タンパク質に相当する。ジＰＥＧ−タンパク質が約８０ｋＤａのバンド付近に現れ、レーンの上部に少量のマルチＰＥＧ化されたタンパク質が存在する。レーン４は未ＰＥＧ化タンパク質からの混入がない単一のバンドとして精製されたモノＰＥＧ化ドメイン抗体フラグメントを示す。
【００６９】
実施例８：２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を用いた抗−ＴＮＦ アルファ アフィボディ（ａｎｔｉ−ＴＮＦ ａｌｐｈａ Ａｆｆｉｂｏｄｙ）（１つの遊離チオールシステイン）のＰＥＧ化及びＥＬＩＳＡ結合（ＥＬＩＳＡ ｂｉｎｄｉｎｇ）
ｐＨ７．８において１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる５０ｍＭリン酸緩衝液中で抗−ＴＮＦ アルファ アフィボディ（アフィボディ ＡＢ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ）ｃａｔ．ｎｏ １０．０８４１．０１）の１ｍｇ／ｍＬ溶液１ｍＬを、ＤＴＴ（３．０ｍｇ）に加えて任意のジスルフィド結合を還元し、数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、得られた溶液を３０分間室温で放置した。この溶液１ｍＬをその後ｐＨ６．２リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ＥＤＴＡ）で前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）されたＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ｃａｔ．ｎｏ．１７−０８５１−０１）に投入した。カラムはその後未乾燥のｐＨ６．２ リン酸緩衝液の５×１ｍＬで溶離される。Ａ２８０ｎｍ測定は画分３及び４が還元タンパク質を含むこと、また混ぜ合わせて２ｍＬとなることを示した。このタンパク質溶液に飽和水溶性ヒドロキノン溶液１０μＬを加え、そしてよくかき混ぜた。２０ＫＤａ ＰＥＧ試薬９の２０ｍｇ／ｍＬ溶液を脱イオン水で調製し、７３μＬ（遊離システインチオールに対して１モル当量のＰＥＧ）をＤＴＴ処理されたアフィボディに加えた。この溶液を数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、そしてその次に３時間室温で置き、その後サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。
【００７０】
３時間後、かなりの量のＰＥＧ化タンパク質が既に形成されたので、反応を終了させずにＰＥＧ化反応を精製した。精製は直線的塩濃度勾配法（０−７００ｍＭ ＮａＣｌ）（ｌｉｎｅａｒ ｓａｌｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ）（３０分以上かけて、ｐＨ４．５、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム移動相で）と共にＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ 陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１１７８−０１）を使用して行った。この結果を図１０に示す。図１０において標識１が付されたレーンはＭＷを推定するために使用したタンパク質マーカーである。標識２が付されたレーンはＤＴＴによる処理前のアフィボディ溶液を示す。ＤＴＴ存在下におけるアフィボディは標識３が付されたレーンに示される。レーン４はＰＤ−１０カラムによってＤＴＴを除去した後のアフィボディを示し、２つのバンドは単量体アフィボディ（ＰＥＧ化に使用可能な遊離チオールシステイン）及び二量体アフィボディ（ＰＥＧ化に使用不可能なシステイン）に相当して可視的である。レーン５はＰＥＧ化反応溶液を示す。５０ｋＤａ タンパク質マーカーの真上のバンドにモノＰＥＧ化アフィボディを見ることができる。陽イオン交換クロマトグラフィー精製されたモノＰＥＧ化アフィボディは未ＰＥＧ化タンパク質からの混入がない単一のバンドとしてレーン６に示される。
【００７１】
ＴＮＦ−αへの精製されたモノＰＥＧ化生成物の結合活性をＥＬＳＡ法によって分析した；
ＴＮＦ−α（１５ｍＭ Ｎａ2ＣＯ3、３４．９ｍＭ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．６中１０
μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート（９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅ）（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に加え、一晩４℃でインキュベートした。ＴＮＦ−αをその後取り除き、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡを１００μＬ／
ｗｅｌｌで加え、そして室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／１％ ＢＳＡをその後取り除き、ＰＥＧ化抗ＴＮＦ−α アフィボディ（ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ中０．０２６、０．１３、０．６５、３．２５ｕｇ／ｍＬ）を加え、そして室温で１時間インキュベートした。ＰＥＧ化アフィボディを対照穴に加えなかった。このプレートをその後ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ／Ｔ） ３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。抗ＰＥＧウサギ抗体（エピトミクス（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ），ｃａｔ．ｎｏ．２０６１−１；１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：１０００）をその後１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、そして室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ−接合抗ウサギ抗体（アブカム（Ａｂｃａｍ），ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ６７２１；ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中１：１０００）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、そして室温で１時間インキュベートした。穴をその後ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ０４４０）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加えた。暗闇において１５分間のインキュベート後、停止試薬（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），ｃａｔ．ｎｏ．Ｓ５６８９）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、６５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【００７２】
図１１に示されたＥＬＩＳＡ結果はＰＥＧ化アフィボディによるＴＮＦ−αへの特異結合を示し、タンパク質がポスト−ＰＥＧ化後の活性をも保持することを裏付ける。ＴＮＦ−αがない場合は、抗ＰＥＧ抗体の結合は存在しない。
【００７３】
実施例９：２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を使用したＮ−末端上に８個のヒスチジン配列を有するインターフェロン アルファ−２ｂ（ＩＦＮ α−２ｂ）のヒスチジン配列上のＰＥＧ化。水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元をした場合としなかった場合における２０ｋＤａ ＰＥＧ化ＩＦＮの抗ウイルス活性。
Ｎ−末端上に８個のヒスチジン配列を持つＩＦＮ α−２ｂの溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中１．０７ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）４．６７ｍＬを２．６モル当量の２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９（脱イオン水中６０ｍｇ／ｍＬ溶液２１７μＬ）に加え、得られた溶液を室温で一晩インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ニューページ［登録商標］ノーべックス ４−１２％ ビス−トリスゲル、ＭＥＳランニングバッファー（全てインビトロジェン）（ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１
２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ，ＭＥＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ，ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びインスタントブルー（イクスぺドン（Ｅｘｐｅｄｏｎ）ｃａｔ．ＮｏＩＳＢ１Ｌ）染色による分析後、反応サンプルを高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｊａｓｃｏ ＨＰＬＣシステムに接続された、東ソー ＤＥＡＥカラム、Ｓ ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＳＥ−５ＰＷ、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）ｃａｔ ｎｏ．８−０７１６４）にかけて、モノＰＥＧ化ＩＦＮ α−２ｂを精製した。イオン交換カラムから得られた画分（各１ｍＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。主にモノＰＥＧ化ＩＦＮを含んでいる画分を凍結乾燥した。凍結乾燥後に得られた残渣を１５０ｍＭ
ＮａＣｌ及び２ｍＭ ホウ化水素ナトリウムを含んでいる５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、室温で１時間放置した。得られた溶液をその後サイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、溶離液として５０ｍＭ
ＰＢＳ、１．６ｍＬ／ｍｉｎ 流速及び２１５ｎｍでの検出）にかけて、モノＰＥＧ化ＩＦＮを単離した。単離されたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その結果を図１２に示す。図１２の標識１が付されたレーンはタンパク質マーカーである。標識２が付されたレーンは出発ＩＦＮのみを示す。レーン３は精製された２０ｋＤａモノＰＥＧ化ＩＦＮ α−２ｂに相当する５０と６０ｋＤａタンパク質マーカー間の単一のバンドを示す。
【００７４】
抗ウイルス活性：抗ウイルス試験をペニシリン及びストレプトマイシンを含んでいるＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で培養されたＡ５４９細胞で実施した。Ａ５４９細胞を０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度においてＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中で再懸濁し、５０μＬ／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレートの中にアリコートした。次の日に、ＰＥＧ化及び天然ＩＦＮサンプルを倍数希釈で調製し、各希釈液５０μＬを穴に加えた。プレートをその後２４時間インキュベートした。媒体をその後取り除き、細胞にＤＭＥＭ／５％ ＦＣＳ（５０μＬ／ｗｅｌｌ）中で調製された脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を接種した。細胞をさらに２４時間インキュベートし、その後ＰＢＳ ３００μＬ／ｗｅｌｌで洗浄し、そして３０分間４％ ホルムアルデヒド／０．１％ メチルバイオレット（５０μＬ／ｗｅｌｌ；シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），ｃａｔ
ｎｏ．１９８０９９）で染色した。プレートをその後ＰＢＳ ３００μＬ／ｗｅｌｌで２回洗浄し、空気乾燥させた。染料を２％ ＳＤＳ溶液（５０μＬ／ｗｅｌｌ）で可溶化し、吸光度を５７０ｎｍで測定した。（Ａ）ホウ化水素ナトリウムで処理されていない、又は（Ｂ）処理された２０ｋＤａ ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２ｂはそれぞれ、６４ｐｇ／ｍＬ及び６８ｐｇ／ｍＬの活性を示した。
【００７５】
実施例１０：マレイミド官能基を有する市販のＰＥＧ試薬と比較したＰＥＧ試薬９の安定性
ＰＥＧ試薬９（５ｋＤａ及び２０ｋＤａ試料）の安定性をｐＨ７．４における核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学によってメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミドプロピオンアミド（カイロテックテクノロジーリミテッド（Ｃｈｉｒｏｔｅｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ），ｃａｔ．ｎｏ．００８−００８，ｌｏｔ ｎｏ．２２３１２６００１）及びα−メトキシ−ω−エチル−マレイミドポリエチレングリコール（アイリスバイオテック（Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）ｃａｔ．ｎｏ．ＰＥＧ１１４６，ｌｏｔ ｎｏ．１２８５１２）と比較した。ｐＨ７．４において１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる５０ｍＭ リン酸ナトリウム水溶液を最初に凍結乾燥し、そして酸化ジュウテリウムで同体積にもどすことでｐＨ７．４ Ｄ2Ｏ溶液を製造した。基準としてアセ
トンを３ｍＬにつき１．０μＬで緩衝液に加えた。ＰＥＧ試薬のサンプルを緩衝液０．７５ｍＬ中１μモルで溶解し、４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光学によって４時間後及び２５．５時間後分析した。ＰＥＧマレイミドサンプルの安定性を２．１７ｐｐｍにおけるアセトン基準に対する積分を使用して標準化した後、６．８６ｐｐｍにおける積分を比較することによって決定した。ＰＥＧ試薬９の安定性は２．２１ｐｐｍにおけるアセトン基準に対する積分を使用して標準化した後、７．３１、７．４０、７．４７、７．７３、及び８．０３ｐｐｍにおけるシグナルに対する全積分を比較して決定した。７．３１、７．４７及び８．０３ｐｐｍにおけるピークはＰＥＧ試薬９から予想通りに形成されたタンパク質活性ＰＥＧ試薬１０（図１４）からのものである。実験中、９の１０に対する比率は両方のサンプル１及び２に対し１．４６から１．７７乃至１までの幅がある。安定性研究結果を表１に示す。ＰＥＧマレイミドサンプルはｐＨ７．４において２１．５時間以上で１９から５５％まで分解したが、一方ＰＥＧ試薬９サンプルは同じ条件下では分解しなかった。
【００７６】
【表１】
【００７７】
実施例１１：様々なｐＨでの単一の遊離システインチオールを含んでいるラミニンフラグメント９２５−９８３（Ｌａｍβ１925-933）のＰＥＧ化
Ｌａｍβ１925-933は合成直鎖非ペプチド（Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ
０６６８）であり、それはラミニンＢ１鎖の残基９２５−９３３に相当し、単一のシステインチオールを含む。
様々なｐＨでのＰＥＧ試薬９を用いたＰＥＧ化：凍結乾燥されたＬａｍβ１925-933ペ
プチド（１ｍｇ）を脱イオン水５００μＬに溶解し、２ｍｇ／ｍＬ原液を得た。ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、ペプチド原液を未乾燥で使用し又はアリコートし、そして使用するまで−８０℃で保存した。Ｌａｍβ１925-933原液を２倍に希釈し、ＰＥＧ化反
応混合液中で最終濃度１ｍｇ／ｍＬ（１ｍＭ）を得た。５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９（５ｍｇ）を脱イオン水２００μＬに溶解し、２５ｍｇ／ｍＬ原液を得た。ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、ペプチド原液を未乾燥で使用し又はアリコートし、そして使用するまで−８０℃で保存した。ＰＥＧ原液を５倍に希釈し、ＰＥＧ化反応混合液中で最終濃度５ｍｇ／ｍＬ（１ｍＭ）を得た。緩衝原液はｐＨ６．０−８．０の範囲に対し１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液及びｐＨ８．５−１０．０の範囲に対し０．１ｍＭ 炭酸―重炭酸ソーダを含む。全てのｐＨ値に対し、緩衝原液もまた１０ｍＭ ＥＤＴＡ及びヒドロキノン３８１μＭを含む。緩衝原液を１０倍に希釈し、最終濃度が１００ｍＭの緩衝剤（リン酸ナトリウム又は炭酸―重炭酸ソーダ）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び３８μＭのヒドロキノンを得た。
【００７８】
各ＰＥＧ化反応混合液は５μＬ Ｌａｍβ１925-933原液、１μＬ緩衝液、ＰＥＧ試薬
溶液（ＰＥＧ試薬対Ｌａｍβ１925-933型ペプチドのモル比率１：１に相当）２μＬ及び
脱イオン水２μＬを含み、全反応容積を１０μＬとした。数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、続けて簡潔な遠心分離（５，０００×ｇで３０秒）を行い、チューブの底に溶液を集め、この反応混合液を室温のまま０．２５、０．５、１、２、４、１６及び２４時間インキュベートした。室温でのインキュベート後、反応混合液を含んでいるチューブを−８０℃に置き、逆相クロマトグラフィーによって分析するまで保存した。
【００７９】
逆相クロマトグラフィー分析では、Ｓｏｕｒｃｅ ５ＲＰＣ ＳＴ ４．６／１５０（
ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），ｃａｔ．ｎｏ．１７−５１１６−０１）カラムを使用した。ＰＣ及びレオダイン７７２５ｉマニュアルインジェクターバルブ（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ ７７２５ｉ ｍａｎｕａｌ ｉｎｊｅｃｔｏｒ ｖａｌｖｅ）に接続するため、カラムをＪａｓｃｏ ＰＵ−９８０ インテリジェントポンプ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｐｕｍｐ）、Ｊａｓｃｏ ＬＧ−９８０−０２ ターナリ―グラジエントユニット（Ｔｅｒｎａｒｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｕｎｉｔ）、Ｊａｓｃｏ デガッシ ポピュライレ デガッシング ユニット（Ｄｅｇａｓｓｙｓ Ｐｏｐｕｌａｉｒｅ Ｄｅｇａｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、Ｊａｓｃｏ ＵＶ−９７０ ４−λ インテリジェント（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ） ＵＶ ディテクター（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、Ｊａｓｃｏ ＬＣ−ＮｅｔＩＩ／ＡＤＣ インターフェース（Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）からなるＪａｓｃｏ ＨＰＬＣシステムに接続した。ＥＺｃｈｒｏｍ ＳＩ バージョン３．２．１ ビルド３．２．１．３４ クロマトグラフィーソフトウエアパッケージ（アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用しながら、コンピュータによってＨＰＬＣシステムを制御した。クロマトグラム分析及びデータのエクスポートもまたＥＺｃｈｒｏｍ ＳＩクロマトグラフィーデータシステムを使用しながら行った。
【００８０】
３つの溶離液方式を使用した。溶離液Ａは脱イオン水中に５％アセトニトリル（Ｆａｒ
ＵＶ、ＨＰＬＣグレード、フィッシャー ｃａｔ．ｎｏ．Ａ／０６２７／１７）及び０．０６５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（アクロス（Ａｃｒｏｓ）ｃａｔ．ｎｏ．１３９７２１０００）を含む。溶離液Ｂはアセトニトリル中に０．０７５％ ＴＦＡを含むが一方、溶離液Ｃは１００％アセトニトリルである。溶離液を使用前に超音波処理によって脱気した。溶離プログラムは２０分間の、０−６４％ Ｂ勾配を含み、続いて１００％アセトニトリルで洗浄し、溶離液Ａで前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）した（表２）。実行中、一定の流速１ｍＬ／ｍｉｎを保持した。２１５、２５０、２８０及び３５０ｎｍにおける吸光度を実行中記録した。各サンプル（１０μＬ）を解凍し、上澄み５μＬを逆相クロマトグラフィーカラムに注入する前に速やかに簡潔に遠心分離機にかけた（１４，０００ｇで1分）。
【００８１】
【表２】
【００８２】
クロマトグラムにおける各ピークの同定を標準試料（ＰＥＧ試薬、還元及び酸化された未反応のペプチド）を実行すること及び（ＰＥＧ化生成物：ペプチド−ＰＥＧ接合体に関して）相対的な寸法推定に対する分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって確認した。分析用ＳＥＣに用いられたカラムはＢｉｏ−Ｓｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ３０００（３００×７．８ｍｍ）分析用カラム（フェノメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ），ｃａｔ．ｎｏ００Ｈ−２１４６−ＫＯ）であった。用いられた実行中の溶離液は１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含んでいる１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）であり、流速は実行中２ｍＬ／ｍｉｎで一定に保った。
【００８３】
図１３に１モル当量の５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を用いた、ｐＨ６．５における経時的ＰＥＧ化実験のクロマトグラムを示す。室温で１５分のインキュベーション後、５つのピー
クが現れた：ＰＥＧ反応性ペプチドＬａｍβ１925-933（ピーク１）；ジスルフィド形成
を経て形成された未反応のペプチド二量体（ピーク２）；ＰＥＧ試薬９スルホン酸脱離基（ピーク３、図１４中の化合物１１）；ＰＥＧ化ペプチド生成物（５ｋＤａ ＰＥＧ−Ｌａｍβ１925-933接合体）に相当するピーク（ピーク４）及びＰＥＧ試薬９（ピーク６、
未反応形態）。
【００８４】
４時間のインキュベーション後、すべての遊離ペプチド（ピーク１）はＰＥＧ化が終了するにつれて消費された。一部の過剰ペプチドが未反応の二量体（ピーク２、ＰＥＧ試薬は当量濃度においてペプチドより強く吸収することに留意する）を形成したので、やや過剰な活性ＰＥＧ試薬ピーク（ピーク５、図１４における化合物１０）もまた存在する。酸化Ｌａｍβ１925-933（ピーク２）は遊離チオールを持たないので、ＰＥＧ化されなかっ
た、それ故対応するピーク（ピーク２）は実験中、未変化のままであった。この結果は還元ペプチドを発生しながらシステインチオールＰＥＧ化と一致する。
【００８５】
ｐＨ６．０とｐＨ８．０間のＬａｍβ１925-933に対するＰＥＧ試薬１の反応性をペプ
チド（ピーク１）から５ｋＤａ ＰＥＧ化Ｌａｍβ１925-933生成物（ピーク４）への変
換を測定することによって推定した。ペプチドピーク結果を１００の値を各ＰＥＧ化反応に使用されたペプチドの全量に相当する較正されたピークエリアに割り当てることによって標準化した、一方生成物ピーク結果をペプチドの生成物への全変換に相当する推定される最大生成物ピークエリアを用いて標準化した。変換（％）を反応に用いられたペプチドの初期量と比較してＰＥＧ化ペプチドの割合として定義した。その結果を図１５に示す。ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５及び８．０において、全てのペプチドがＰＥＧ化された。終了速度はｐＨによって左右され、より高いｐＨ程より速い速度であり、異なったｐＨにおいて反応性構造１０（図１４）の形成の異なった速度を示す。
【００８６】
実施例１２：様々なｐＨでのＰＥＧ試薬９と商業的に入手可能なＰＥＧマレイミドの反応性の比較
実施例１１のＬａｍβ１925-933ペプチドに対するＰＥＧ試薬９の反応性を商業的に入
手可能なチオール反応性ＰＥＧ試薬、ＰＥＧマレイミド（Ｏ−（２−マレイミドエチル）−Ω’−メチル−ポリエチレングリコール５，０００、フルカ（Ｆｌｕｋａ）ｃａｔ．ｎｏ．６３１８７）と比較した。ＰＥＧ試薬９が実験時間スケールにおいて反応に速やかに使用できるようにするため、試薬をｐＨ７．５でインキュベートすること（２時間、４℃）によってチオール反応性形態（試薬１０、図１４）を最初に形成し、そして試薬１０をペプチド接合する前にＲＰクロマトグラフィーにより単離した。全てのペプチド反応は新規に溶解したＰＥＧ試薬を用いて行った。一時的に、ＰＥＧ化反応溶液（反応スケール１０μＬ）は１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０）又は１００ｍＭ炭酸―重炭酸ソーダ（ｐＨ８．５−１０．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ中で１０μｇ Ｌａｍβ１925-933、ＰＥＧ（５ｋＤａ）試薬５０μｇ（ＰＥＧ試薬対Ｌａｍβ１925-933型ペプチドのモル比率１：１に相当）を含んでいた。室温でのインキュベーション後、反応混合液を実施例１１で述べたように逆相クロマトグラフィーによって分析した。その結果を図１６に示す。ＰＥＧ試薬９（ｐＨ９．０乃至１０）及び１０（ｐＨ６．０乃至８．０）に対し、ペプチドのＰＥＧ化形態への完全な変換は１５分以内にｐＨ６．０とｐＨ１０の間で達成された。
【００８７】
ＰＥＧマレイミド試薬に対し、変換は１５分後単に最大で７８．９％に達するもののみであった。より高いｐＨにおいて、変換はさらに低かった（ｐＨ１０で５１．２）。ｐＨ８．５におけるＰＥＧマレイミド反応を１６時間後再びサンプル採取し、全てのペプチドは消費された。
【００８８】
したがってテストされた全てのｐＨ値において、ＰＥＧ試薬９及び１０はＰＥＧマレイミド試薬より有効である。
【００８９】
実施例１３：ＰＥＧ試薬９ペプチド接合体の安定性及びＰＥＧマレイミド誘導ペプチド接合体の比較
ＰＥＧ試薬９から製造された精製Ｌａｍβ１925-933ペプチド接合体及び実施例１２か
らのＰＥＧマレイミドの安定性を１２日間以上比較した。接合体の安定性は実施例１１で述べたように逆相クロマトグラフィーを用いてＰＥＧ−ペプチドピークの領域を測定することによって決定した。
ＰＥＧ試薬９を用いたＰＥＧ化Ｌａｍβ１925-933の合成：接合体は実施例１１の修正
法を用いて調製した（最終ペプチド濃度１．６ｍｇ／ｍＬ及びペプチド０．４ｍｇを用いてｐＨ６．０）。生成物をＲＰ−クロマトグラフィーで単離した。Ｌａｍβ１925-933−
ＰＥＧ接合体に相当する溶離ピークを集め、凍結乾燥しそしてその後脱イオン水中で再懸濁した。最終的に、２ｍＭ水素化ホウ素ナトリウム（アクロスオルガニクス（Ａｃｒｏｓ
Ｏｒｇａｎｉｃｓ），ｃａｔ．ｎｏ．２０００５０２５０）を加え、サンプルを室温で３０分間インキュベートした後、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加えた。
ＰＥＧマレイミドを用いたＰＥＧ化Ｌａｍβ１925-933の合成：Ｌａｍβ１925-933（０．４ｍｇ）を５ｋＤａ ＰＥＧマレイミド（５ｋＤａ、フルカ（Ｆｌｕｋａ）ｃａｔ．ｎｏ．６３１８７）試薬と共にＰＥＧ化用に使用した。一時的に、１０×緩衝原液（１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる）２０μＬ及びＰＥＧ試薬原液（脱イオン水中２５ｍｇ／ｍＬ）４０μＬをペプチド原液（脱イオン水中２ｍｇ／ｍＬ）２００μＬに加えた。室温での１．５時間のインキュベーション後、生成物を実施例１１で述べたようにＲＰ−クロマトグラフィーを用いて精製した。溶離ピークサンプルを乾燥凍結し、そしてその次に脱イオン水で再懸濁しその後５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液をｐＨを８．０に調節するために加えた。両方のＰＥＧ−ペプチド溶液の濃度がおおよそ等しいことを確認するためにＲＰ−クロマトグラフィーを使用した。
【００９０】
両方の安定性サンプルを室温でインキュベートした。１２日後、サンプルを分析用ＲＰＣによって分析し、安定性を図１７に示されるように接合体ピークに対する積分領域の変化によって決定した。ＰＥＧ試薬９から誘導された接合体は１２日以上安定した状態を保っていた。ＰＥＧマレイミドから誘導された接合体に対し、たったの６３％がクロマトグラム中にとどまり、このことはＰＥＧ試薬９はより安定した生成物をもたらすことを示す。
【００９１】
実施例１４：両末端で官能化されたＰＥＧを使用したＰＥＧ化−ＰＥＧ試薬１２
【化２】
ＰＥＧ試薬１２をＯ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）ポリエチレングリコール６０００（フルカ（Ｆｌｕｋａ）ｃａｔ．ｎｏ．１４５０４）を使用してＰＥＧ試薬９と同様に調製し、実施例１１（Ｌａｍβ１925-933）からのモデルペプチドと反応させた。水（６
μＬ）、１０×緩衝原液（１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、３８１μＭヒドロキノン及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる）２μＬ及びＰＥＧ試薬１２（２５ｍｇ／ｍＬ）２μＬをＬａｍβ１925-933原液（脱イオン水中２ｍｇ／ｍＬ）１０μＬに加えた
。これは１：０．３７５モデルペプチド対ＰＥＧ試薬のモル比率に相当する。反応溶液（５μＬ）を室温で２．５時間インキュベーションした後に（実施例１１で述べたように）分析用ＲＰＣによって分析した。反応溶液の全ての成分が別個のピークとして溶出した：Ｌａｍβ１925-933単量体は８．１分で溶出した、酸化Ｌａｍβ１925-933二量体は８．９分で溶出した、不活性ＰＥＧ試薬は１７．３分で溶出した、活性ＰＥＧ試薬は１５．７分で溶出しそして脱離基１１は１０．１分であった。生成物ピークは１４．２分で溶出した。２．５時間後、反応溶液中に存在（試薬１２に対する８６％反応）する遊離Ｌａｍβ１925-933の６５％は接合され、ＰＥＧ試薬１２の両方の反応性末端が反応すること及びこ
の二官能性試薬はＰＥＧ分子の両末端で１つのペプチド分子に付着するのにうまく使用され得ることを示す。
【００９２】
実施例１５：ポリマー成分としてのポリ（１−ビニル−２−ピロリドン）（ＰＶＰ）の使用：Ｌａｍβ１925-933モデルペプチドを用いたＰＶＰの接合
ＰＶＰ試薬の調製（３工程）：
工程１：末端アミノ基を有するＰＶＰ：
圧力管にシステアミン（０．０２８ｇ）、ジオキサン（８ｍＬ）及びマグネチック撹拌子を入れた。溶液を形成するために穏やかな加熱後、この溶液をアルゴンと共に５分間室温でパージした。パージしながら、１−ビニル−２−ピロリドン（２．０ｇ）をその後加え、さらに５分後次にこれに２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）を加えた（０．０８９ｇ）。さらに２分後、圧力管をアルゴン雰囲気下スクリューキャップで封をし、撹拌しながら１７時間６０℃のオイルバス中に置いた。管及び内容物を室温まで冷却した後、ポリマー生成物の沈殿物を得るためにジエチルエーテル（１５ｍＬ）を加えた。液相をデカントし固形残渣をアセトン（３ｍＬ）に再溶解した。得られたアセトン溶液をその後迅速に撹拌されているジエチルエーテル（２５ｍＬ）に滴下し沈殿物を真空のほんの僅かなバーストと共にｎｏ．２ 焼結ガラス漏斗で単離した。固形物を未乾燥のジエチルエーテル（１０ｍＬ）で洗浄し、その後室温で真空下乾燥させた（質量＝１．４４ｇ、白色の固体）。
工程２：ＰＶＰ−アミンへのタンパク質反応末端基の接合：
ＰＶＰ−アミン（５００ｍｇ）、４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸（図３中の構造６、１６６ｍｇ）、及び４−ジメチルアミノピリジン（６ｍｇ）をアルゴン雰囲気下、無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）で混合し、その後撹拌しながら、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（１５５μＬ）を加えた。得られた混合物を室温で週末を通して撹拌した。週末の間揮発性物質は蒸発したので、固形残渣をジクロロメタン（１０ｍＬ）中に再溶解し、そして非吸収性コットン−ウールを通してろ過した。その後ろ液にジエチルエーテル（３０ｍＬ）を加え、得られた沈殿物を遠心分離（４，６００ｒｐｍ、−９℃、１０分）によって単離した。液相をデカントし、残りの残渣をジクロロメタン（１０ｍＬ）中に再溶解した。ジエチルエーテル沈殿精製方法を２回以上繰り返し、残渣を真空下乾燥させた（５１３ｍｇ）。リンカー基を接合させたＰＶＰに対する特徴的なＮＭＲシグナルはＣＤＣｌ3において７．９７、７．８２、７．５９及び７．３８に現れた。
工程３：ＰＶＰ試薬の分別：
上述の段階で得られた固形物の一部（１２０ｍｇ）を水溶性の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ４．０で混合し、その後澄明な液が可視的になるまで１３，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけ、そして液相０．４５μｍをろ過した。ろ液をその後溶出ピークの間１分ごとに留分を集めることにより１ｍＬ／ｍｉｎにおいて２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ、ｐＨ４．０を稼動させながら、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で分別した（１．９ｍＬ加えた）。７３．９乃至７４．９分の間に溶出している画分を凍結乾燥後にタンパク質接合用に使用した。ペプチド反応を１ｍＭ ＥＤＴＡ、３８μＭヒドロキノン、１．０３ｍＭ Ｌａｍβ１925-933及び過剰のＰＶＰ試薬を含んでいる１００ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で行った。反応混合液を実施例１１で述べたように分析用ＲＰＣによって分析した。室温での１時間のインキュベーション後、反応混合液中に存在する遊離Ｌａｍβ１925-933モデルペプチドのおよそ６０％がＬａｍβ１925-933−ＰＶＰ接合体（１１．３分のＲＰＣ保持時間）に変換され、これはＰＥＧ以外のポリマーが使用され得ることをうまく証明している。
【００９３】
実施例１６：アミン性脱離基Ｌを有するＰＥＧ試薬の合成及び使用
【化３】
ＰＥＧ試薬１３の合成：ＰＥＧ試薬１３（図１９）は実施例１と類似した操作でＤＩＰＣ（１１ｍｇ）を使用しながらＤＭＳＯ（５ｍＬ）中で５ｋＤａ ｍＰＥＧ−ＮＨ２と化合物２（２６ｍｇ）の直接的な接合により調製し、灰色がかった白色の固形物（３１ｍｇ）を得た。（ＣＤＣｌ3における）この生成物のＮＭＲスペクトルは８．０２及び７．５
９に特徴的なシグナルがあった。
実施例１１のＬａｍβ１925-933モデルペプチドとの反応：反応を１ｍＭ ＥＤＴＡ、
３８μＭヒドロキノン、１．０３ｍＭ Ｌａｍβ１925-933及び３モル当量のＰＥＧ試薬
１３を含んでいる１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で行った。反応混合液を実施例１１で述べたように分析用ＲＰＣによって分析した。単量体Ｌａｍβ１925-933は８．１分で溶出し、二量化Ｌａｍβ１925-933は８．９分で溶出し、アミン脱離基は９．３分で溶出し、アミン脱離基を有さないＰＥＧ試薬１３は１５．２分、ＰＥＧ試薬１３は１５．７５分、そして生成物のピークは１４．２分であった。室温での１時間のインキュベーション後、反応混合液中に存在する遊離Ｌａｍβ１925-933モデルペプチドのお
よそ１０％がＬａｍβ１925-933−ＰＥＧ接合体に変換した。
【００９４】
実施例１７：ＰＥＧ試薬９を使用したＩＬ−１−ＲａのチオールＰＥＧ化及び活性
ヒトインターロイキン−１−レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１−Ｒａ）の組み換え非グルコシル化形態をモデルタンパク質として使用した。ＩＬ−１−Ｒａは１５３アミノ酸、２つのジスルフィド結合（Ｃｙｓ６９／Ｃｙｓ１１６及びＣｙｓ６６／Ｃｙｓ１２２）からなり、１７．３ｋＤａの分子量を有しそしてＮ−末端のヘキサヒスチジンタグを含む。
一連のチオールＰＥＧ化は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０及び７．５）中で１−４モル当量の１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を使用して行った。発現されたタンパク質は還元したので、ＰＥＧ化前にジスルフィドの還元は必要ではなかった。タンパク質濃度は０．１ｍｇ／ｍＬであった。４℃での１時間のインキュベーション後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、その結果を図１８に示した。ｐＨ６．０のみならず７．５においても、１モル当量のＰＥＧ試薬を使用した場合、ＰＥＧ化反応の主な生成物はモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−１−Ｒａであった。ジ−ＰＥＧ化生成物に相当するかすかなバンドもまた見られ、同様に未ＰＥＧ化ＩＬ１−Ｒａに相当するバンドも見られた。反応に使用されたＰＥＧのモル当量を増加させるとジ−、トリ−及びテトラ−ＰＥＧ化された種が増加した。ｐＨ６．０でのより大きなスケールのＰＥＧ化をその後２０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる５０ｍＭリン酸ナトリム緩衝液ｐＨ６．０中でＩＲ−１−Ｒａ（０．２ｍｇ／ｍＬ）１．５ｍｇ及び１．５モル当量の２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を使用して行った。溶液を少しの間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、２時間４℃で置いた。ＰＥＧ化ＩＬ−１−Ｒａを固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＩＭＡＣ前に、アミコウルトラ−４（Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ−４） ３，０００Ｄａ ＭＷＣＯ 限外ろ過遠心装置（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｄｅｖｉｃｅ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ｃａｔ．ｎｏ．ＵＦＣ８００３２４）を使用しながら、ＥＤＴＡを未乾燥のリン酸緩衝液ｐＨ７．４を用いて濃縮と希釈の繰り返しサイクルによって取り除いた。最終的に、サンプルを４ｍＬに濃縮し室温で３０分間、２ｍＭホウ化水素ナトリウムで処理し、続けてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）させたＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（１ｍＬ）カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），ｃａｔ．ｎｏ．１７−５２４７−０１）に投入した。カラムを２０ｍＬ ＰＢＳで洗浄し、溶離は４０分かけてＰＢＳを５００ｍＭイミダゾールを含んでいるＰＢＳにする勾配を含む。溶出液の画分（１ｍＬ）を集め、各画分のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、ＰＥＧ化生成物を含んでいる画分を特定した。その後、ＰＥＧ化生成物を含んでいる画分を溜めて限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ−４ ３，０００Ｄａ ＭＷＣＯ）によって最終容積０．６ｍＬに濃縮した。濃縮されたＩＭＡＣ画分をＰＢＳ ｐＨ７．４で前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）させたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），ｃａｔ．ｎｏ．１７−１０６９−０１）に投入した。流速は実行中１ｍＬ／ｍｉｎに保ち、モノ−ＰＥＧ化生成物は約６２分で溶出した。画分（１ｍＬ）を溶出ピーク周辺で集め、各画分のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。純粋なモノ−ＰＥＧ化生成
物を含んでいる画分を限外ろ過によって濃縮しそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって再分析して、純度を確認した。その結果を図１９のレーン２に示した。ゲルはモノ−ＰＥＧ化タンパク質に相当する単一のバンドを示し、遊離タンパク質は可視的ではなかった。
【００９５】
紫外分光光度法によって定量化した後、ＭＧ−６３細胞中のＩＬ−１β−依存的ＩＬ−６放出（ＩＬ−１β−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＩＬ−６ ｒｅｌｅａｓｅ）の抑制を評価することによってインビトロ生物活性に関してサンプルを分析した。ＭＧ−６３細胞をＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ １００μＬ中２０，０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで加えた。次の日に、媒体を取り除き未乾燥の媒体５０μＬ／ｗｅｌｌを加えた。サンプルを５倍希釈で２サンプル（２５μＬ／ｗｅｌｌ）に加え、１時間予備インキュベートし、その後ＩＬ−１βを最終濃度０．３ｎｇ／ｍＬ（２５μＬ／ｍＬ）で加えた。プレートをさらに２４時間インキュベートした。細胞の生存可能性を評価するために、１０μＬのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ；ＤＭＥＭ中５ｍｇ／ｍＬ；シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ｃａｔ ｎｏ．Ｍ５６５５）を各穴に加え、３時間インキュベートした。プレートをその後５分間１，５００ｇで遠心分離機にかけ、媒体を注意深く吸引した。代謝的に活発な細胞中のホルマザン生成物をその後ＤＭＳＯ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で溶解し５７０ｎｍでの吸光度を測定した。その結果を図２０に示し、試薬９を用いたＰＥＧ化後のＰＥＧ化ＩＬ−１Ｒａは阻害活性を保持することを示す。
【００９６】
実施例１８：ＰＥＧ試薬９を使用したＩＬ−１Ｒａのポリヒスチジン配列上のＰＥＧ化、及びＰＥＧ化タンパク質の活性
以下のようなＰＥＧ化反応前に硫酸銅を用いてタンパク質遊離システインを酸化してジスルフィドにした後、実施例１７のＩＬ−１Ｒａをポリヒスチジンタグ上でＰＥＧ化した；硫酸銅（１ｍＭ）を２００ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）においてＩＬ−１Ｒａ（０．６ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ ＩＬ−１−Ｒａ）の２．５ｍＬ溶液に加えた。４℃で１６時間のインキュベーション後、２５ｍＭ ＥＤＴＡを加え、サンプルを２０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５で前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）されたＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に投入した。カラムをその後未乾燥のリン酸緩衝液３．５μＬで溶出した。ＰＥＧ化に使用されたタンパク質濃度は０．４３ｍｇ／ｍＬ及びｐＨ７．４でありそして４℃で１６時間インキュベートした。ＰＥＧ試薬９（２０ｋＤａ）はタンパク質に対して１．５モル当量である。反応は４℃で１６時間インキュベートした。モノＰＥＧ化種をホウ化水素ナトリウム処理と共に実施例１７で述べたように同じクロマトグラフィーを使用しながら単離した。生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図１９のレーン２に示した、レーン２には遊離タンパク質は見ることができなかった。生成物の生物活性は実施例１７で述べたようにＭＧ−６３細胞中のＩＬ−１β−依存的ＩＬ−６放出の抑制を測定することによって評価し、その結果を図２０に示した。ＰＥＧ化ＩＬ−１Ｒａは分析結果において阻害活性を有していた。
【００９７】
実施例１９：ＰＥＧ試薬合成：１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬１５の合成
ＰＥＧ化４−（３−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）プロパノイル）安息香酸試薬１５を図２１に示されているように、実施例１中のＰＥＧ化４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸９の合成で記載されたのと類似の方法で４−（３−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）プロパノイル）安息香酸１４から調製した。最初に、４−（３−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）プロパノイル）安息香酸１４を４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸と類似の方法で４−メチルベンゼンチオールの替わりにメルカプトエタノールを使用して調製した（工程２、実施例１）。
ＮＭＲ １４（４００ＭＨｚ）δ３．３５（ｔ，２Ｈ，ＣＯＣＨ2），３．５（重なり
ｍ，４Ｈ，ＣＨ2ＳＯ2ＣＨ2），３．８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2ＯＨ），５．２（ｂｒ ｓ，ＣＨ2ＯＨ），８．０５（ｍ，４Ｈ，芳香族ＣＨ），１３．４（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＣＯＯ
Ｈ）。
ＰＥＧ接合工程に対し、スルホン１４（１４３ｍｇ）及びＯ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−メチル−ＰＥＧ（ＭＷ １０ｋＤａ，１ｇ，バイオべクトラ（ＢｉｏＶｅｃｔｒａ））を乾燥トルエン（５ｍＬ）に溶解した。溶媒を加熱しないで真空下で取り除き、乾燥固形残渣をその後アルゴン雰囲気下、乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）に再溶解した。氷浴で冷却した、得られた溶液にアルゴン雰囲気下でジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ，８７ｍｇ）をゆっくりと加えた。反応混合液をその後一晩（１５時間）、室温で撹拌し続けた。揮発性物質をその後真空下（３０℃、水浴）で取り除いて、アセトン中（４５ｍＬ）で微温（３５℃）で再溶解させた固形残渣を得た。溶液を非吸収性コットンウールでろ過して不溶性物質を取り除いた。この溶液をその後、ドライアイス浴で冷却して、遠心分離（４６００ｒｐｍ、３０分間）により分離された白色の沈殿物を得た。液相をデカントし、この沈殿操作を３回繰り返した。その後、得られた灰色がかった白色の固体を真空下で乾燥して、ＰＥＧ試薬１５（１ｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ３．３０（ｔ，２Ｈ，ＣＯＣＨ2），δ
３．４０（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧ−ＯＣＨ3），δ３．４０−３．８５（ｂｒ ｍ，ＰＥＧ）
，δ３．５０（重なり ｍ，２×２Ｈ，ＣＨ2ＳＯ2ＣＨ2），δ３．８０（ｔ，２Ｈ，Ｃ
Ｈ2ＯＨ），δ７．９５，δ８．０５（２×ｄ，２×２Ｈ，カルボン酸部位のＡｒＨ）。
【００９８】
異なったＰＥＧ分子量の類似したＰＥＧ試薬を同じ基本操作によって調製した。それ故、５ｋＤａ ＰＥＧを乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）においてスルホン１４（２５６ｍｇ）、Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−メチル−ＰＥＧ（５ｋＤａ，１ｇ，バイオべクトラ（ＢｉｏＶｅｃｔｒａ））及びＤＩＰＣ（１７４ｍｇ）の反応によって調製し、アセトン沈殿精製操作後灰色がかった白色の固体１５（１ｇ）を得た。
【００９９】
実施例２０：ＰＥＧ試薬合成：１０ ｋＤａ ＰＥＧ試薬１７の合成
ＰＥＧ試薬１７を次のようにＰＥＧ試薬９から調製した（図２２）：ＰＥＧ試薬９（１０ｋＤａ，７５ｍｇ）をおよそ１８時間、脱イオン水中でメルカプトコハク酸（６ｍｇ）及び炭酸水素ナトリウム（２０ｍｇ）と一緒にかき混ぜた。揮発性物質をその後ロータリーエバポレーターで取り除き、非吸収性コットン−ウールを通してろ過により取り除いた不溶物と共に固形残渣を温めたアセトン（４ｍＬ）に再溶解した。その後溶液をドライアイス浴で冷却することによって生成物をアセトンから沈殿させ、そして液相をデカントすることによって単離し続いて遠心分離した。アセトン沈殿物をさらに３回繰り返し、固形物をその後真空下で乾燥して１６（５１ｍｇ）を得た。化合物１６をおよそ１８時間、１：１ メタノール：水（１ｍＬ）中でオキソンと混合することによってその後スルホン形態１７に酸化した。この混合液をアセトン（１０ｍＬ）で希釈し、不溶物をその後非吸収性コットン−ウールを通して重力ろ過によって取り除いた。均一なろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固しそして添加された１ＮＨＣｌ ２滴を含むアセトン（２ｍＬ）に再溶解し、その後１６（ ｍｇ）に対して述べられたように同一のアセトン沈殿によって単離した。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ３．２４−３．０８（重なり ｍ，ＣＨ2
ＣＨ、ＣＯＣＨ2），３．３８（ｓ、ＰＥＧ−ＯＣＨ3），３．４４−３．８４（ｂｒ ｓ，重なり ｍ，ＰＥＧ ＆ ＣＨ2ＳＯ2），４．４４（ｄｄ，ＳＯ2ＣＨ），７．４５（
ｂｒ ｓ，ＮＨ），７．９８ ＆ ８．０６（２×ｄ，４Ｈ，カルボン酸部位のＡｒＨ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子、特にタンパク質及びペプチドを接合するための新規な試薬及び新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの治療効果のある分子、例えばタンパク質は、臨床医学的用途において、効力を発揮するために必要とされる特性を有していない。例えば、多くの天然タンパク質は、良い薬にはならない。その理由は、患者への投与時に、（１）タンパク質が血液又は組織中に存在する多くのエンド−及びエキソ−ペプチターゼによって消化される；（２）多くのタンパク質はある程度免疫原性である；並びに（３）タンパク質は腎臓限外ろ過及びエンドサイトーシスにより迅速に排出され得る等を含んだいくつかの固有の欠点があるからである。医学の分野で有効な治療薬としての有用性を発見するかもしれない、いくつかの分子は組織的に有毒であるか又は最適な生物学的利用態及び薬物動態を欠いている。タンパク質がすぐに血液循環から消えてなくなる場合は、タンパク質は一般的に頻繁に患者に投与されなければならない。頻繁な投与はさらに、毒性の危険性、特に免疫学的に生成された毒性を増加する。
【０００３】
水溶性、合成ポリマー、特にポリアルキレングルコースは、タンパク質、ペプチド及び低分子薬物のような治療効果のある分子を接合するために幅広く使用される。これらの治療的な接合体は、循環時間を引き延ばすこと及び除去率を減少させること、組織的毒性を減少させること、並びにいくつかの場合では、さらなる臨床的有用性を発揮することにより、薬物動態を優位に変えることが示されている。ポリエチレングリコール、ＰＥＧをタンパク質に共有結合する方法は、“ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）”として一般的に知られている。
【０００４】
最適化された効力にとってタンパク質ごとに複合ポリマー分子の数は各分子に対して同じである用量一貫性のための投与量を確保すること、及び各タンパク質分子は各タンパク質分子中の同じアミノ酸残基と特に共有結合することは重要である。タンパク質分子に沿った部分での非特異的接合は接合生成物の配分及び頻繁に、非複合タンパク質をもたらして精製するのに難しく且つ費用がかかる複雑な混合物を生み出す。
【０００５】
チオール特異的接合に対し、マレイミド基で一端を終端されたＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ化試薬が一般的に使用される。そのような試薬は多くの出版物、例えば国際公開第２００４／０６０９６５号パンフレットに記述されている。マレイミド末端試薬は市販されている。しかしながら、多くのＰＥＧ−マレイミドは保管及び薬剤候補接合の間加水分解的に不安定である。特に、マレイミド環の相当な程度の加水分解が抱合前も抱合後も、起こる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０６０９６５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
我々は今、ＰＥＧ化試薬群であって、単一の求核残基、例えばチオール基を介してポリマーにタンパク質及びペプチドを組み込んでいる接合分子に使用され得、そしてそのような市販試薬より有利であるものを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明はポリマーにチオール基又はアミノ基を含んでいる分子の接合方法を提供するものであって、該方法は一般式：
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｌ］m （Ｉ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｑは連結基を表し；
Ｗは電子求引基を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；
Ｌは脱離基を表し；そして
ｍは１乃至８の整数を表す。）で表される化合物と前記分子の反応を含む。
【０００９】
発明の方法による直接的な生成物は一般式：
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｚ］m （ＩＩａ）
（式中、
Ｘ、Ｑ、Ｗ、ｎ及びｍは上述した意味であり、そして
Ｚはチオール基又はアミノ基を介して接合された前記分子を表す。）によって一般的に表され得る。必要に応じて、この式（ＩＩａ）で表される得られる化合物は他の望ましい生成物に変換され得る。
特に、一般式（ＩＩａ）で表される得られる化合物は一般式ＩＩ
Ｘ−［Ｑ−Ｗ’−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｚ］m （ＩＩ）
（式中、Ｗ‘は電子求引性部分又は電子求引性部分の還元によって調製できる部分を表す。）
で表される化合物に変換され得る。
また、本発明は、第１観点として、ポリマーにチオール基又はアミノ基を含んでいる分子を接合する方法であって、
該分子を一般式：
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｑは連結基を表し；
Ｗはケト基又はエステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；そして
ｍは１乃至８の整数を表す。）で表される化合物を反応させることを含む方法、に関する。
第２観点として、前記Ｑは直接結合、アルキレン基又は随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基であって、これらのうちどれでも１つ以上の酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ基（Ｒはハロゲン原子又はアルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）、ケト基、−Ｏ−ＣＯ−基、−ＣＯ−Ｏ−基及び／又は−ＮＲ．ＣＯ−基によって終端又は中断され得る、第１観点に記載の方法に関する。
第３観点として、前記Ｑは随意に置換されたヘテロアリール基又はアリール基であって、−ＮＲ．ＣＯ−基によって隣接した前記ポリマーＸが終端されている、第２観点に記載の方法に関する。
第４観点として、前記Ｘはポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ＨＰＭＡコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリアミド、ジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸のコポリマー、多糖、又はタンパク質である、第一観点乃至第３観点のいずれか１つに記載の方法に関す
る。
第５観点として、前記Ｘはポリアルキレングリコールである、第４観点に記載の方法に関する。
第６観点として、前記Ｘはポリエチレングリコールである、第５観点に記載の方法に関する。
第７観点として、前記ｎは０である、第１観点乃至第６観点のいずれか１つに記載の方法に関する。
第８観点として、前記式Ｖで表される化合物は、一般式：
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖａ）
（式中、
Ａｒは未置換の又は置換アリール基を表す。）である、第１観点乃至第８観点のいずれか１つに記載の方法に関する。
第９観点として、前記Ａｒはアルキル基、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ．ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ．ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ．ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び−Ｃ＝ＣＨＲ（各Ｒは独立してハロゲン原子又アルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）から選ばれる１つ以上の同一又は異なった置換基によって随意に置換されたフェニル基を表す、第８観点に記載の方法に関する。
第１０観点として、前記Ａｒはフェニル基を表す、第９観点に記載の方法に関する。
第１１観点として、前記分子はペプチド又はタンパク質である、第１観点乃至第１０観点のいずれか１つに記載の方法に関する。
第１２観点として、一般式：
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖａ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｗはケト基又はエステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；
ｍは１乃至８の整数を表し；そして
Ａｒは未置換の又は置換されたアリール基を表す。）で表される化合物に関する。
第１３観点として、前記Ａｒはアルキル基、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ．ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ．ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ．ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び−Ｃ＝ＣＨＲ（各Ｒは独立してハロゲン原子又アルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）から選ばれる１つ以上の同一又は異なった置換基によって随意に置換されたフェニル基を表す、第１２観点に記載の化合物に関する。
第１４観点として、前記Ａｒはフェニル基を表す、第１３観点に記載の化合物に関する。
第１５観点として、前記Ｘはポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ＨＰＭＡコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリアミド、ジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸のコポリマー、多糖、又はタンパク質である、第１２観点乃至第１４観点のいずれか１項に記載の化合物に関する。
第１６観点として、前記Ｘはポリアルキレングリコールである、第１５観点に記載の化合物に関する。
第１７観点として、前記Ｘはポリエチレングリコールである、請求項１７に記載の化合物に関する。
第１８観点として、前記ｎは０である、第１２観点乃至第１７観点のいずれか１つに記載の化合物に関する。
第１９観点として、前記Ｗはケト基を表す、第１２乃至第１８観点のいずれか１つに記載の化合物に関する。
第２０観点として、
式：
【化１】
で表される、第１２観点に記載の化合物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は実施例１の第一工程の反応スキームを示す図である。
【図２】図２は実施例１の第二工程の反応スキームを示す図である。
【図３】図３は実施例１の第三工程の反応スキームを示す図である。
【図４】図４は実施例１の第四工程の反応スキームを示す図である。
【図５】図５は実施例２の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図６】図６は実施例３の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図７】図７は実施例５の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図８】図８は実施例６において反応からの逆相クロマトグラフィー分析を示す図である。
【図９】図９は実施例７の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図１０】図１０は実施例８において反応からの陽イオン交換クロマトグラフィー分析を示す図である。
【図１１】図１１は実施例８のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
【図１２】図１２は実施例９の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図１３】図１３は実施例１１の経時的ＰＥＧ化のクロマトグラムを示す図である。
【図１４】図１４は実施例１０及び１１にあるように化合物９、１０及び１１の相互変換を示す図である。
【図１５】図１５は実施例１１の変換結果を示す図である。
【図１６】図１６は実施例１２の逆相クロマトグラフィー結果を示す図である。
【図１７】図１７は実施例１３の安定性結果を示す図である。
【図１８】図１８は実施例１７の中間生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図１９】図１９は実施例１７の最終生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図２０】図２０は実施例１７の吸光度結果を示す図である。
【図２１】図２１は実施例１９の反応スキームを示す図である。
【図２２】図２２は実施例２０の反応スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一般式（Ｉ）で表される化合物は新規であり、それ故に本発明もまたこれらの化合物自
体を提供する。特に好ましい式（Ｉ）で表される新規な化合物は下記に定義された式（Ｉａ）で表されるものである。
【００１２】
一般式（ＩＩ）で表される化合物もまた新規であり、それ故に本発明もまたこれらの化合物自体を提供する。特に好ましい式（ＩＩ）で表される新規な化合物は下記に定義された式（ＩＩｂ）で表されるものである。
【００１３】
ｍは１乃至８の整数、例えば１乃至６、好ましくは１乃至４、例えば１を表す。ｍが１の場合、単一の分子がポリマーに接合される。ｍが１より大きい場合、ポリマーに対し二つ以上の分子の接合が得られ得る。２乃至８の基−Ｑ−Ｗ’−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｚ又は−Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｌはポリマーに結合し、変数Ｑ、Ｗ、Ｗ’、ｎ、Ｌ及びＺは各そのような基に対して同一又は異なっていても良い。多官能ポリマー化合物は利用でき、例えば、多数の基は、出発物質として登録商標“サンブライト（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ）” ：例えば、４−アーム（４−ａｒｍ）製品は、式Ｃ［ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｙ］4（式中、Ｙは多数の異なった末端基の一つでもよい）の下、ＮＯＦから入手可能なマルチアーム（ｍｕｌｔｉ−ａｒｍ）化合物を使用しながら結合され得る。多量体接合体は相乗的かつ追加的な便益をもたらすことができる。例えば、ｍが１の場合、得られる接合体は複合分子から離れたＰＥＧ鎖の末端上に末端基を有する必要がある。これは一般に、アルコキシ基又はよく似た基であり、そして薬学的応用に利用されるとき、そのような基は望ましくない免疫効果を導き得ることが示唆される。ｍが１より大きい場合、アルコキシ基のような末端基を必要とせずに、複合分子はＰＥＧ鎖の両末端に結合される。
【００１４】
ポリマーＸは、例えばポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、例えばポリアクリロイルモルホリン、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド又はポリメタクリルアミド、例えばポリカルボキシメタクリルアミド、又はＨＰＭＡコポリマーであってもよい。さらに、Ｘは酵素又は加水分解の影響を受けやすいポリマーである。そのようなポリマーとしては、例えば、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、及びポリ（アミノ酸）のような、ポリアミドが挙げられる。ポリマーＸはホモポリマー、ランダムコポリマー又はブロックコポリマーのような構造的に明確なコポリマーであってもよい。例えばＸは二種以上のアルキレンオキシド、又はポリ（アルキレンオキシド）及びポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、又はポリ（アミノ酸）のいずれかから誘導されるブロックコポリマーであってもよい。使用され得る多官能性ポリマーはジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸のコポリマーである。
【００１５】
天然高分子、例えばキチン、デキストラン、デキストリン、キトサン、でんぷん、セルロース、グリコーゲン、ポリ（シアル酸）及びその誘導体のような多糖もまた使用され得る。タンパク質はポリマーとして使用され得る。これは第二のタンパク質、例えば酵素又は他の活性タンパク質に、１つのタンパク質、例えば抗体又は抗体フラグメントの接合を可能にする。また、触媒配列を含んでいるペプチド、例えばグリコシルトランスフェラーゼのＯ−グリカンレセプター部位が使用される場合、次の酵素反応の基質又はターゲットの取り込みを可能にする。ポリグルタミン酸又はポリグリシンのようなポリ（アミノ酸）もまた、サッカリド又はアミノ酸のような天然モノマー及びエチレンオキシド又はメタクリル酸のような合成モノマーから誘導されるハイブリッドポリマーとして使用され得る。
【００１６】
ポリマーがポリアルキレングリコールである場合、これは好ましくはＣ2及び／又はＣ3単位を含んでいるものであり、特にポリエチレングリコールである。ポリマー、特にポリアルキレングリコールは、単一の線状鎖を含んでいてもよく、または多くの鎖−小さい或
いは大きな多くの鎖−により構成された分岐形態を有していてもよい。いわゆるプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）はＰＥＧブロックコポリマーの重要な種類である。これらはエチレンオキシド及びプロピレンオキシドブロックから誘導される。置換ポリアルキレングリコール、例えばメトキシポリエチレングリコールは使用され得る。発明の好ましい実施態様では、単一鎖のポリエチレングリコールは適切な基、例えばアルコキシ基、例を挙げるとメトキシ基、アリールオキシ基、カルボキシキ基又はヒドロキシ基によって開始され、そして鎖の反対側でリンカー基Ｑに結合される。
【００１７】
ポリマーＸはいくつかの所望の方法で誘導体化又は機能化され得る。反応基はポリマー末端又は末端基で、またはペンダントリンカーを介してポリマー鎖に沿って結合され得る；そのような場合、ポリマーは例えばポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、又は無水マレイン酸コポリマーである。そのような機能性ポリマーは多量体接合体（例を挙げると、ポリマーが二つ以上の分子に接合される接合体）を調製するさらなる機会をもたらすのにより一層の機会をもたらす。必要に応じて、ポリマーは従来の方法を用いて担体に結合され得る。
【００１８】
ポリマーの最適分子量はもちろん対象としている用途次第である。好ましくは、数平均分子量は２５０ｇ／ｍｏｌｅ乃至およそ７５，０００ｇ／ｍｏｌｅの範囲内である。一般式ＩＩで表される化合物が医学的用途に用いられ、そして血液循環を離れて組織に浸透することを目的としている、例えば悪性腫瘍に起因する炎症、感染又は自己免疫疾患、又はトラウマの治療用の場合、２０００−３０，０００ｇ／ｍｏｌｅの範囲内にある低分子量ポリマーを使用することが有用である。一般式ＩＩで表される化合物を血液循環中に残存させることを目的としている用途に対しては、例えば２０，０００−７５，０００ｇ／ｍｏｌｅの範囲内にある高分子量ポリマーを使用することが有用である。
【００１９】
接合体がその使用目的のために溶剤に溶解できるように使用されるポリマーを選ばなければならない。生物学的適用、特に診断的適用及び哺乳類への臨床治療的投与に対する治療への応用に対して、接合体は水媒体に溶解できる。しかしながら、多くの生物学的分子、例えば酵素のようなタンパク質は、例えば化学反応を触媒するために、産業での有用性がある。そのような用途で使用されるための接合体に対し、接合体は水媒体及び有機媒体の一方又は両方に溶解できる必要がある。ポリマーはもちろん接合される分子の所望の機能を不当に損なうべきではない。
【００２０】
好ましくはポリマーは合成ポリマーであり、好ましくは水溶性ポリマーである。水溶性ポリエチレングリコールの使用は多くの用途に対して特に好まれる。
【００２１】
連結基Ｑは、例えば直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ1-10アルキレン基）、または随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基であって、これらのうちどれでも１つ以上の酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ基（Ｒは水素原子又はアルキル基（好ましくはＣ1-6アルキル基）、アリール基（好ましくはフェニル基）、又はアルキル−アリール基（好
ましくはＣ1-6アルキル−フェニル基）を表す。）、ケト基、−Ｏ−ＣＯ−基、−ＣＯ−
Ｏ−基、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲ−、−ＮＲ−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＲ−及び／又は−ＮＲ．ＣＯ−基によって終端又は中断され得るものある。そのようなアリール基及びヘテロアリール基Ｑは発明の１つの好ましい実施形態を形成する。適切なアリール基としてはフェニル基及びナフチル基が挙げられ、一方、適切なヘテロアリール基としては、ピリジン基、ピロール基、フラン基、ピラン基、イミダゾール基、ピラゾール基、オキサゾール基、ピリダジン基、ピリミジン基及びプリン基が挙げられる。特に適切な連結基Ｑはヘテロアリール基又は、特に、アリール基、特にフェニル基であって、−ＮＲ．ＣＯ−基によって隣接したポリマーＸを終端化したものである。ポリマーへの結合は加水分解に不安定な結合、又は非不安定な結合を介してでもよい。
【００２２】
随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基に存在し得る置換基としては、例えばアルキル基（好ましくはＯＨ又はＣＯ2Ｈによって随意に置換されたＣ1-4アルキル基、特にメチル基）、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯ2Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＯＲ、−
ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ2Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ2Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、ＮＨＣＯ2Ｒ、−ＮＲ．ＣＯ2Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ．ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ．ＣＯＲ、−Ｎ+Ｒ3、−Ｎ+Ｈ3、−Ｎ+ＨＲ2、−Ｎ+Ｈ2Ｒ、ハロゲン原子、例えばフッ素原子又は塩素原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ2及び−Ｃ＝
ＣＨＲ（ここで、各Ｒは独立してハロゲン原子又はアルキル基（好ましくはＣ1-6アルキ
ル基）、アリール基（好ましくはフェニル基）、又はアルキル−アリール基（好ましくはＣ1-6アルキル−フェニル基）を表す。）から選ばれる１つ以上の同一又は異なった置換
基が挙げられる。電子求引置換基の存在が特に好ましい。好ましい置換基は例えばＣＮ、ＮＯ2、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲ．ＣＯＲ、−ＮＨＯＨ及び
−ＮＲ．ＣＯＲ．が挙げられる。
【００２３】
Ｗは、例えばケト基ＣＯ、エステル基−Ｏ−ＣＯ−又はスルホン基−ＳＯ2−を表し、
そしてＷ’はそのような基又は例えばＣＨ．ＯＨ基、エーテル基ＣＨ．ＯＲ、エステル基ＣＨ．Ｏ．Ｃ（Ｏ）Ｒ、アミン基ＣＨ．ＮＨ2、ＣＨ．ＮＨＲ又はＣＨ．ＮＲ2、またはアミドＣＨ．ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ又はＣＨ．Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）2の還元によって得られる基を表
す。
【００２４】
好ましくは、ｎは０である。
【００２５】
脱離基Ｌは例えば、−ＳＲ、−ＳＯ2Ｒ、−ＯＳＯ2Ｒ、−Ｎ+Ｒ3、−Ｎ+ＨＲ2、−Ｎ+
Ｈ2Ｒ、ハロゲン原子、又は−Ｏθを表す（ここで、Ｒは上述した意味であり、そしてθ
は置換アリール基、特に少なくとも１つの電子求引置換基を含むフェニル基を表すものであって、該電子求引置換基としては、例えば、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯ2Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ2Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ2Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ2Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ2Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨ
ＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ+Ｒ3、−Ｎ+ＨＲ2、−Ｎ+Ｈ2Ｒ、ハロゲン原子、特に塩素原子、又は特にフッ素原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ2及び−Ｃ＝ＣＨＲであり、各Ｒは独立して上述した意味の一つである。）。
【００２６】
ｍが２乃至８の整数を表す場合、必要に応じて異なったＬ基が存在し得る。これは異なった反応性のＬ基を選ぶことによって、逐次反応中のポリマーＸに異なった分子を接合するための有利な条件をもたらす。
【００２７】
好ましくは本発明による方法は一般式
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−ＳＯ2Ｒ’］m （Ｉａ）
（式中、
Ａｒは未置換の又は置換アリール基、特にフェニル基を表すものであって、任意の置換基は連結基Ｑに含まれるアリール基に対する上記のものから選ばれ；
Ｒ’は水素原子又は随意に置換されたアルキル基（好ましくはＣ1-6アルキル基）、ア
リール基（好ましくはフェニル基）、又はアルキル−アリール基（好ましくはＣ1-6アル
キル−フェニル基）を表し；そして
Ｗ及びｍは上述した意味を有する。）で表される試薬を使用して、
一般式
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ’−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｚ］m （ＩＩｂ）
で表される新規な接合体を製造する。
これらの好ましい化合物Ｉａ及びＩＩｂでは、好ましくはｎは０であり、そして好まし
くはｍは１乃至４の整数、特に１を表す。好ましくはそれぞれのＷはＣＯ基を表し、そしてＷ’はＣＯ基又はＣＨ．ＯＨ基を表す。好ましくはＲ’は随意に置換されたアルキル基、例えば−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨのような随意にヒドロキシ置換されたＣ1-4アルキル基、又は
、特に、Ｃ1-4アルキル−アリール基、特にｐ−トルイル基を表す。好ましくはＡｒは未
置換のフェニル基である。好ましくはＸはポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコールである。
【００２８】
式Ｉで表される化合物、及び特に式Ｉａで表される化合物は、驚くほど安定であり、そしてまたチオール基又はアミノ基を含んでいる分子に対して高反応性であると考えられる。本発明による接合方法は一般式
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−ＣＨ＝ＣＨ2］m Ｖ
（式中、Ｘ、Ｑ、Ｗ、ｎ、及びｍは上述した意味を有する。）
で表される中間化合物の形成を介して進行すると考えられる。
【００２９】
本発明の方法によって接合される分子は任意の所望の分子であり得る。それは例えば天然分子又は天然分子から誘導される分子であり得、またはチオール基（−ＳＨ）又はアミノ基（−ＮＨＲ）を含むという条件で、生物活性、例えば任意のドラッグを有している任意の分子であり得る。例えば、それはタンパク質又はペプチドであり得る：本明細書中、用語“タンパク質”は便宜上使用され、そして文脈上他の意味に解すべき場合を除き、“タンパク質”への言及は“タンパク質又はペプチド”への言及を意味していると理解すべきである。
【００３０】
分子が結合されているチオール基又はアミノ基は、脱離基Ｌの脱離と同時に試薬Ｉと反応する能力がある求核試薬である。そのような基は天然生体分子中に存在し得る、または接合前に生体分子に導入され得る。
【００３１】
２つのチオール基は天然又は人工ジスルフィド（システイン）架橋の還元によって発生し、それは鎖内又は鎖間であり得る。生体分子は１つ又は非常に多数のジスルフィド架橋を含むことができ、遊離スルフヒドリル部分を生じさせるための還元は１つ又は非常に多数のジスルフィド架橋を還元するために行われ得る。ジスルフィド還元の程度及び使用されるポリマー接合試薬の化学量論次第で、１つ又は非常に多数のポリマー分子を生体分子に接合させることができる。異なった反応条件又は変性剤の添加を使用して部分的な還元のように、ジスルフィド総数未満に減らすことを望む場合、固定化還元剤が使用され得る。
【００３２】
また、チオール基は単一のシステイン残基又はもともとジスルフィド架橋から誘導されていない他のチオール基であり得る。単一のシステインは合成手段によって導入され得、付着の適切なポイントをもたらす。そのような手段はペプチドの接合に非常に有用である。
【００３３】
アミノ基は例えばリシン又はヒスチジン残基であり得る。これらは天然生体分子中に存在し得る、または合成的に導入され得る。例えば、ヒスチジン残基は隣接するヒスチジン残基の短鎖、例えばタンパク質への合成方法により付着されるヒスチジン残基を最高で１２個、ただし一般的には５又は６個の残基を含んでいる、ｈｉｓ−タグ（ｈｉｓ−ｔａｇ）の方法によって導入され得る。Ｈｉｓ−タグはニッケル及びコバルトと強く結合し、Ｈｉｓ−タグを固定化金属アフィニティークロマトグラフィーとして知られている分離方法に使用されるニッケル−又はコバルト−含有カラムと結合させることを可能とする。ポリヒスチジンタグは幅広く使用され、広範囲のタンパク質及びペプチドに付着して、タンパク質及びペプチド又はそれらから誘導される生成物が、将来、混合物から分離されるようにする。
【００３４】
分子がタンパク質の場合には、それは例えばペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、酵素、サイトカイン、ケモカイン、レセプター、血液因子、ペプチド・ホルモン、毒素、転写タンパク質、又は多量体タンパク質であってもよい。
【００３５】
所望の用途に応じて、本発明における有用性を有し得るいくつかの具体的なタンパク質を次に示す。酵素は炭水化物−特異的酵素、タンパク質分解酵素などが挙げられる。興味のある酵素としては、一般的適用や治療への応用において産業上（有機系の反応）及び生物学的応用に対して、米国特許第４，１７９，３３７号に開示されているオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼが特に挙げられる。興味のある特異的酵素としては、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、及びグルタミナーゼが挙げられる。
【００３６】
一般式Ｉで表される化合物に使用されるタンパク質としては、例えばアルブミンのような血漿タンパク質、転送、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子、フォン・ヴィレブランド因子、インスリン、ＡＣＴＨ、グルカゴン（ｇｌｕｃａｇｅｎ）、ソマトスタチン、ソマトトロピン、サイモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、黄体形成ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、ヘモグロビン、サイトカイン、抗体、抗体フラグメント、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン及び組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。
【００３７】
インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子のような特定の前記タンパク質もまた非グリコシル化形態で存在し、通常組み換えタンパク質技術による調製の結果に存在する。非グリコシル化型は本発明に使用され得る。
【００３８】
興味のある他のタンパク質は、ポリ（アルキレンオキシド）のようなポリマーと接合させ、その結果寛容誘導物質（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｅｒｓ）としての使用に適する場合、低下したアレルギー誘発性を有するとしてＤｒｅｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９９０） ６
３１５−３６５によって開示されたアレルゲンタンパク質である。アレルゲンのうち、開示されたものはブタクサ抗原Ｅ、ミツバチ毒、ダニ・アレルゲンなどである。
【００３９】
ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びフラグメントのような免疫グロブリンがそうであるように、免疫グロブリン、オボアルブミン、リパーゼ、グルコセレブロシダーゼ、レクチン、組織プラスミノゲン活性化因子及びグルコシル化インターロイキンのような糖ポリペプチド、インターフェロンやコロニー刺激因子には興味がある。
【００４０】
特に興味深いのは、レセプターやリガンド結合タンパク質及び抗体や抗体フラグメントであって、それらは診断及び治療目的で臨床医学において使用される。抗体は単独で使用され得又は放射性同位体又は細胞毒性／抗感染症薬のような別の原子又は分子と共有結合(投入“ｌｏａｄｅｄ”)され得る。エピトープは予防接種のために使用され得、免疫原性ポリマー―タンパク質接合体を生産する。
【００４１】
必要に応じて生体分子は誘導体化又は機能化され得る。特に、接合前に、分子、例えば天然タンパク質は様々な保護基と反応され得、鋭敏基（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｇｒｕｏｐ）表面を保護する；または本発明の方法を使用して或いは別の方法を使用して、１つ以上
のポリマー又は他の分子と前もって接合され得る。
【００４２】
分子は相対的に低分子量の合成分子であり得る。これは、例えば、接合が利点をもたらす任意の薬になり得る。多くのこのような分子に対し、発明による試薬に接合させるためにチオール基又はアミノ基を持っている適切なリンカーを挿入する必要がある。代表的な薬としては、例えばカプトプリル、アムホテリシンＢ、カンプトテシン、タクソール、イリノテカン及びＳＮ３８のようなその誘導体、ドセタキセル、及びリバビリンが挙げられる。
【００４３】
発明の方法を使用して接合され得る興味がある別の分子としては国際公開第２００４／０６０９６５号パンフレットに記載されているものが挙げられる。
【００４４】
本発明による方法はすべての反応物が溶解できる溶媒又は溶媒混合液中で行われ得る。接合される分子、例えばタンパク質は、水性反応媒体中一般式Ｉで表される化合物と直接反応してもよい。求核試薬（チオール又はアミン）のｐＨ所要値次第で、この反応媒体はまた緩衝され得る。反応に対する最適なｐＨはほとんどの場合少なくとも６．０、一般的に約６．８から約８．５の間、例えば約７．０乃至８．０、好ましくは約７．５−８．０であるが、別の場合では４．０という低いｐＨが使用され得、特にポリヒスチジンタグへの接合が要求されるとき、４．０乃至８．５の範囲にある有効なｐＨとなる。接合される分子の存在下、系中で上記式Ｖで表される化合物を生成することが好ましい場合、相対的に高いｐＨが全体に始めから終わりまで適切に使用される。また、分離工程において上記式Ｖで表される化合物を生じ、続いて分子を加えて接合体にすることが好ましい場合、第一工程は相対的に高いｐＨ（例えば７．５−８．０）で適切に行われ、一方それに続く工程はより低いｐＨ（例えば６．０乃至６．５）で最適に行われる。相対的に広範囲のｐＨ条件でうまく使用され得ることが本発明の試薬の利点である。
【００４５】
３−３７℃間の反応温度が一般的に適切である：これらの方法が起こり得る温度で抱合反応が行われる場合、タンパク質は分解し、凝縮し又は障害機能及び／又は反応効率を変性し得る。有機媒体（例えばＴＨＦ、酢酸エチル、アセトン）中で行われる反応は一般的に外界までの温度で行われる。
【００４６】
多くの他の試薬と違って、化学量論的当量又はわずかに過剰な試薬を使用することで分子は所望の試薬と効果的に抱合される。しかしながら、試薬は溶媒和物、例えばタンパク質に使用される水性媒体と競争反応を起こさないので、過剰な化学量論の試薬と抱合反応を行うことが可能である。過剰な試薬及び生成物は通常の精製中にイオン交換クロマトグラフィーによって、又はｈｉｓ−タグが存在する場合はニッケルを使用する分離によって容易に分離され得る。
【００４７】
分子が接合される基がチオール基である場合には、発明による方法は還元された生成物が式（Ｉ）で表される化合物と反応した後に、系中で生体分子中の二つのシステインアミノ酸から誘導されるジスルフィド結合を部分的に還元することによって行われ得る。ジスルフィドは、従来の方法を使用して、例えばジチオスレイトール、メルカプトエタノール、又はトリス―カルボキシエチルホスフィンで還元され得る。
【００４８】
発明による方法の即時生成物は一般式（ＩＩ）（式中、Ｗ’は電子求引基である。）で表される化合物である。そのような化合物はそれ自体に有用性がある：発明の方法は適切な条件下可逆的であるので、式（ＩＩ）（式中、Ｗ’は電子求引部分である。）で表される化合物は接合体からの分子の除去が求められる用途、例えば直接的な臨床的応用において有用性がある。しかしながら、電子求引部分Ｗ’は還元されて分子の除去を妨げる部分を生じさせ、そしてそのような化合物もまた多くの臨床的、産業的及び診断的適用におい
て有効性がある。
【００４９】
それ故、例えば、ケト基を含んでいる部分Ｗ’はＣＨ（ＯＨ）基を含んでいる部分Ｗ’に還元され得る；エーテル基ＣＨ．ＯＲはエーテル化剤によるヒドロキシ基の還元によって得られ得る；エステル基ＣＨ．Ｏ．Ｃ（Ｏ）Ｒはアシル化剤のよるヒドロキシ基の反応によって得られ得る；アミン基ＣＨ．ＮＨ2、ＣＨ．ＮＨＲ又はＣＨ．ＮＲ2は還元的アミノ化によってケトン又はアルデヒドから調製され得る；またはアミドＣＨ．ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ又はＣＨ．Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）2はアミンのアシル化によって形成され得る。還元剤とし
ての、ホウ化水素、例えばホウ化水素ナトリウム、シアノホウ化水素ナトリウム、ホウ化水素カリウム又はトリアセトキシホウ化水素ナトリウムの使用は特に好ましい。使用され得る他の還元剤としては、例えば塩化スズ（ＩＩ）、アルミニウムアルコキシドのようなアルコキシド、及び水素化リチウムアルミニウムが挙げられる。
【００５０】
一般式（Ｉ）で表される化合物は
一般式
Ａ−Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）n−（ＣＨ2）2−Ｌ （ＩＩＩ）
（式中、Ｑ、Ｗ、ｎ及びＬは上述した意味を有する。）で表される化合物を、
一般式
Ｘ−Ｂｍ （ＩＶ）
（式中、Ｘはポリマーを表す。）で表される化合物
と反応させることによって調製され得る；Ａ及びＢは（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）で表される化合物が共に反応して、式（Ｉ）で表される所望の化合物を生じるように選ばれた基である。
【００５１】
一般式ＩＩで表される化合物は多くの用途がある。それらは例えば患者への直接的な臨床的応用に使用され得、また結果的に、本発明は薬学的に許容されるキャリヤーと共に一般式ＩＩで表される新規な化合物を含む医薬組成物をさらに提供する。発明は治療用に一般式ＩＩで表される新規な化合物、及び患者に対して本発明による一般式ＩＩで表される新規な化合物の薬学的有効量又は発明による医薬組成物を投与することを含む患者を治療する方法をさらに提供する。任意の所望の薬学的効果、例えば外傷治療、酵素補充、タンパク製剤の補給、創傷管理、毒素除去、抗炎症薬、抗感染薬、免疫調節、ワクチン接種又は制癌は、生体分子の適切な選択によって得られ得る。一般式ＩＩで表される化合物は造影剤、例えば放射性ヌクレオチドを含んでいてもよく、生体内で化合物を追跡することが可能である。
【００５２】
一般式ＩＩで表される化合物もまた非臨床的応用に使用され得る。例えば、酵素のような多くの生理的に活性な化合物は有機溶媒中で反応を触媒することが可能であり、そして一般式ＩＩで表される化合物はそのような用途に使用され得る。さらに、一般式ＩＩで表される化合物は診断ツールとしても使用され得る。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は発明を説明する。
【００５４】
実施例１：ＰＥＧ試薬合成：１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９の合成
第一工程：ｐ−カルボキシ−３−ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロリド２の合成
本工程に対する反応スキームを図１に示す。
２５０ｍＬの丸底フラスコにｐ−アセチル安息香酸（１５．０ｇ，１）、ピペリジンヒ
ドロクロリド１１．１１ｇ及びパラホルムアルデヒド８．２３ｇを入れた。無水エタノール（９０ｍＬ）及び濃塩酸（１ｍＬ）をその後加え、そして得られた懸濁液をアルゴン雰囲気下撹拌しながら１０時間加熱還流した。還流終了後、アセトン（１５０ｍＬ）を加え、そして反応混合物を室温まで冷却した。得られた白色の沈殿物をガラスフィルター（Ｇ３）で単離し、そして冷やしたアセトンで２回洗浄した。固形物をその後真空下で乾燥し、白色の結晶粉末（２，９．７２ｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．７９，２．９６，３．４５（ｂｒｍ，ピペリジン部分のＣＨ2），３．３６（ｔ，２Ｈ，ＣＯＣＨ2），３．７４（ｔ，２Ｈ，ＮＣＨ2），８．０９（ｍ，４Ｈ，ＡｒＨ）。
【００５５】
第二工程：４−（３−（ｐ−トリルチオ）プロパノイル）安息香酸５の合成
本工程に対する反応スキームを図２に示す。
ｐ−カルボキシ−３−ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロリド２（１．０ｇ）及び４−メチルベンゼンチオール（４１７ｍｇ，３）を無水エタノール（７．５ｍＬ）及びメタノール（５ｍＬ）の混合液で懸濁した。ピペリジン（５０μＬ）をその後加え、そして懸濁液をアルゴン雰囲気中で６時間撹拌しながら加熱還流した。室温まで冷却後得られた白色の沈殿物をガラスフィルター（Ｇ３）でろ過し、冷やしたアセトンで注意深く洗浄し、そして真空中で乾燥させて５（６１４ｍｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．２７（ｓ，３Ｈ，フェニル−ＣＨ3），３．２４，３．３９（ｔ，２×２Ｈ，ＣＨ2），７．１４，７．２６（ｄ，２×２Ｈ，トリル部分のＡｒＨ），８．０３（ｍ，４Ｈ，カルボン酸部分のＡｒＨ）。
【００５６】
第三工程：４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸６の合成
本工程に対する反応スキームを図３に示す。
４−（３−（ｐ−トリルチオ）プロパノイル）安息香酸５（１６０ｍｇ）を水（１０ｍＬ）及びメタノール（１０ｍＬ）の混合液で懸濁した。氷浴で冷却後、オキソン（７２０ｍｇ、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））を加え、そして反応混合物を一晩（１５時間）撹拌しながら室温まで温めた。得られた懸濁液を追加の水（４０ｍＬ）で希釈して懸濁液をほぼ均一にし、混合物をその後クロロホルム（合計１００ｍＬ）で３回抽出した。溜まったクロロホルム抽出物を塩水で洗浄しその後ＭｇＳＯ4で乾燥した。３０℃、真空下で
の揮発性物質の蒸発により白色の固形物６（１４９ｍｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．４１（ｓ，３Ｈ，フェニル−ＣＨ3），３．４２（ｔ，２Ｈ，ＣＯ−ＣＨ2），３．６４（ｔ，２Ｈ，ＳＯ2−ＣＨ2），７．４６，７．８２（ｄ，２×２Ｈ，トリル部分のＡｒＨ），８．０３（ｍ，４Ｈ，カルボン酸部分のＡｒＨ）。
【００５７】
第四工程：ＰＥＧ化４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸、ＰＥＧ試薬９の合成
本工程に対する反応スキームを図４に示す。
４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸６（１３３ｍｇ）及びО−（２−アミノエチル）−Ｏ’−メチル―ＰＥＧ８（ＭＷ １０ｋＤａ，５０２ｍｇ，バイオベクトラ（ＢｉｏＶｅｃｔｒａ））を乾燥トルエン（５ｍＬ）に溶解した。溶媒を加熱しないで真空下で除去し、乾燥固形残渣をその後アルゴン雰囲気下、乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）に再溶解した。氷浴で冷却した、得られた溶液に、アルゴン雰囲気下、ゆっくりとジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ，６０ｍｇ）を加えた。反応混合物をその後室温で一晩（
１５時間）撹拌し続けた。揮発性物質をその後真空下（３０℃、水浴）で除去し、アセトン（２０ｍＬ）中微温（３５℃）で再溶解した固体残渣を得た。溶液を非吸収性コットンウールでろ過し、不溶性物質を除去した。溶液をその後乾燥氷浴で冷却し、遠心分離（４６００ｒｐｍ、３０分間）によって分離された白色の沈殿物を得た。液相をデカントし、この沈殿操作を３回繰り返した。その後得られた灰色がかった白色の固形物を真空下で乾燥し、ＰＥＧ試薬９（４３７ｍｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ２．４６（ｓ，３Ｈ，フェニル−ＣＨ3）
，３．３８（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧ−ＯＣＨ3），３．４４−３．８２（ｂｒ ｍ，ＰＥＧ）
，７．３８，７．８３（ｄ，２×２Ｈ，トリル部分のＡｒＨ），７．９５（ｍ，４Ｈ，カルボン酸部分のＡｒＨ）。
【００５８】
異なったＰＥＧ分子量の類似したＰＥＧ試薬を同様の一般的な操作によって調製した。したがって、２０ｋＤａ ＰＥＧを乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）中スルホン６（２０．８ｍｇ）、Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−メチル−ＰＥＧ（２０ｋＤａ，２５０ｍｇ，フルカ（Ｆｌｕｋａ））及びＤＩＰＣ（８．７ｍｇ，７）の反応によって調製し、アセトン沈殿精製操作後、灰色がかった白色の固形物（２４５ｍｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ２．４６（ｓ，３Ｈ，フェニル−ＣＨ3）
，３．３８（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧ−ＯＣＨ3），３．４４−３．８２（ｂｒ ｍ，ＰＥＧ）
，７．３８，７．８３（ｄ，２×２Ｈ，トリル部分のＡｒＨ），７．９５（ｍ，４Ｈ，カルボン酸部分のＡｒＨ）。
【００５９】
実施例２：分子量５、１０及び２０ｋＤａのＰＥＧ試薬９を用いた単一のヒンジジスルフィド（２つのチオール）を有するＦａｂ抗体フラグメントのＰＥＧ化
Ｆａｂ溶液（アブカム（Ａｂｃａｍ）ｃａｔ．ｎｏ．ＡＢ６５２０、１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬにＤＴＴ原液（脱イオン水中１００ｍＭ）５μＬを加え、そして得られた溶液を３０分間、室温で放置した。溶液をｐＨ７．８，５０ｍＭリン酸緩衝液９５μＬ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡで２００μＬに希釈し、そしてその後ｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ−５ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０８５４−０１）に投入し、ｐＨ７．８，５０ｍＭリン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡで前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）した。ＮＡＰ−５ ｃｏｌｕｍｎは未乾燥のｐＨ７．８リン酸緩衝液の５×３００μＬで溶離される。還元Ｆａｂは主に画分３で特定され、タンパク質濃度は０．２３ｍｇ／ｍＬであると推定されるとすぐ、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を全ての画分用に測定した。
【００６０】
分子量５ｋＤａ、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａを有する３つのＰＥＧ試薬をｐＨ７．８リン酸緩衝液に溶解して、それぞれ溶液濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬを得た。
【００６１】
各ＰＥＧ化反応に対して、還元Ｆａｂ溶液（０．２３ｍｇ／ｍＬ）５．０μＬ及びＰＥＧ溶液０．４２μＬ（還元ヒンジジスルフィドチオールに対して１モル当量）を使用した。Ｆａｂ反応溶液もまたｐＨ７．８リン酸緩衝液４．６μＬで希釈され、最終容積１０μＬを得た。反応溶液を１２時間、４℃でインキュベートした。
【００６２】
ニューページ［登録商標］ ノーべックス ４−１２％ ビス−トリスゲル （ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ）（インビトロジェン（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０３２１ＢＯＸ）及びニューページ ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（ＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ００２）を使用しながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をその後反応溶液で行った。ゲルはインスタン
トブルー（イクスぺドン（Ｅｘｐｅｄｏｎ）ｃａｔ．ＮｏＩＳＢ１Ｌ）で染色した。以下の図５に結果を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のＰＥＧは、タンパク質マーカーに対してその本当の大きさのおよそ２倍になったので、５ｋＤａは１０ｋＤａのようになった。Ｆａｂはおよそ５０ｋＤａのタンパク質であり、非還元或いは還元形態に対する約２５ｋＤａでのバンド又は２つのバンドのような場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において約５０ｋＤａでのいずれかの単一バンドのようになった。これらは重くて明るい鎖であり、該鎖はＳＤＳを用いた還元及びインキュベーション時にヒンジジスルフィドによってもはや結合していない。それ故、Ｆａｂはジ−ＰＥＧ化されるが、それによって単一のＰＥＧを溶液中還元ヒンジジスルフィドの２つのシステインのそれぞれに付着し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は２５ｋＤａの重くて明るい鎖のモノＰＥＧ化を示す。標識１が付されたレーンはタンパク質マーカーである（ノヴェックス シャープ タンパク質スタンダード（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄｓ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＣ５８００）。レーン２はＦａｂを示す。標識４が付されたレーンはＤＴＴ（約２５ｋＤａ）で還元されたＦａｂを示す。レーン５はＰＥＧ化Ｆａｂに相当する３５ｋＤａにおいて一次生成物であるバンドと５ｋＤａ ＰＥＧ化結果を示す。少量の還元Ｆａｂは２５ｋＤａにとどまり、ＦａｂがほとんどＰＥＧ化されたことを示している。レーン６は１０ｋＤａ ＰＥＧ化Ｆａｂに相当する４０ｋＤａマーカーを超えた一次生成物であるバンドと１０ｋＤａ ＰＥＧ化結果を示す。レーン７は２０ｋＤａ ＰＥＧ化Ｆａｂに相当する６０ｋＤａマーカーを超えた一次生成物であるバンドと２０ｋＤａ ＰＥＧ化結果を示す。レーン３は事前の還元工程なしで試みられたＰＥＧ化結果を示す：ＰＥＧ化の反応部位が還元ジスルフィド結合であるということをＰＥＧ化生成物は示さないという事実。
【００６３】
実施例３：５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を用いたアスパラギナーゼのＰＥＧ化
ｐＨ７．８において１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる２０ｍＭリン酸ナトリム緩衝液中でアスパラギナーゼの１ｍｇ／ｍＬ溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）ｃａｔ．ｎｏ Ａ３８０９）１ｍＬを、ＤＴＴ（１５．４ｍｇ）に加えそして数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、得られた溶液を４０分間、室温で放置した。ロード画分（ｌｏａｄ ｆｒａｃｔｉｏｎ）として溶離液を集めながら、溶液１ｍＬをその後ｐＨ７．８ ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）されたＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０８５１−０１）に加え、該緩衝液は１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる。カラムはその後未乾燥のリン酸緩衝液の５×１ｍＬで溶離された。画分３及び４を混ぜ合わせて、２ｍＬとした。
５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９の溶液１０ｍｇ／ｍＬを脱イオン水で調製し、２．０μＬ（遊離チオールに対して１．５当量のＰＥＧ）を還元アスパラギナーゼ１００μＬに加えた。その溶液を数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、その次に一晩４℃で置き、その後サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。その結果を図６に示す。レーン１はＭＷを推定するために使用したタンパク質マーカーであり、レーン２はＰＥＧ化前のアスパラギナーゼでありそしてレーン３は５ｋＤａ ＰＥＧ試薬による還元アスパラギナーゼの反応溶液を示す。両方のシステインのＰＥＧ化に相当する強いバンドが６０ｋＤａタンパク質マーカーの真上に一次生成物として見られた。第二のより低いＭＷバンドは５０ｋＤａタンパク質マーカーの真上に存在し、該マーカーは２つのシステインの１つのみのＰＥＧ化に相当する。３０と４０ｋＤａの間には還元アスパラギナーゼに相当するごくかすかなバンドのみがあり、ほとんど全てのタンパク質はＰＥＧ試薬９でＰＥＧ化されていることを示す。
【００６４】
実施例４：５、１０及び２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ試薬９を用いた遊離した単一のシステインを持つＧ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、顆粒球コロニー刺激因子）のＰＥＧ化並びにマレイミド官能
基を持つ５ｋＤａ ＰＥＧとの比較
ＧＣＳＦ原液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中０．６６ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む）を各々１００μＬの５つの画分（ＰＥＧ化反応に対して天然Ｇ−ＣＳＦ及び４つの画分）に分けた。その画分をＧ−ＣＳＦに対して１モル当量のＰＥＧ試薬と共に４℃で一晩インキュベートした。５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９及び５ｋＤａ ＰＥＧマレイミド（フルカ（Ｆｌｕｋａ）ｃａｔ．ｎｏ．６３１８７）に対して、脱イオン水中で５ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ試薬３．５μＬを加えた。１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９に対して、脱イオン水中で５ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ溶液７μＬを加えた。２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９に対して脱イオン水中で５ｍｇ／ｍＬ 溶液１４．０μＬを加えた。ＰＥＧ化反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ニューページ［登録商標］ ノーべックス ４−１２％ ビス−トリスゲル、ＭＥＳバッファー（全てインビトロジェン）（ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ，ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ，
ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びインスタントブルーステイン（イクスペデオン（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＳＢ１Ｌ））によって分析した。添加されたＰＥＧ試薬を用いていないＧ−ＣＳＦは１５と２０ｋＤａタンパク質マーカーの間にバンドとして現れた。９による５ｋＤａ ＰＥＧ化に対し、５ｋＤａ モノＰＥＧ化ＧＣＳＦに相当する約３０ｋＤａにおいてバンドは可視的である。９による１０ｋＤａ ＰＥＧ化に対し、４０ｋＤａより下のバンドは１０ｋＤａ モノＰＥＧ化ＧＣＳＦに相当して可視的である。２０ｋＤａ ＰＥＧ結果に対し、２０ｋＤａ モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦに相当する５０と６０ｋＤａの間のバンドは可視的である。５ｋＤａ ＰＥＧマレイミド反応に対し、未反応のＧ−ＣＳＦ以外にバンドは見られなく、反応は本試薬とでは起きなかったことを示す。
【００６５】
実施例５：１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を用いたＣ末端上の８個のヒスチジン配列を有するインターフェロン（ＩＦＮ） α−２ｂにおけるヒスチジン上のＰＥＧ化
ＩＦＮ α―２ｂ（２ｍＭ ＥＤＴＡ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液中１．１３ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５）の２０μＬ溶液に１モル当量の１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９（脱イオン水中６ｍｇ／ｍＬ溶液の１．８μＬ）を加え、得られた溶液を室温で一晩インキュベートした。１モル当量の２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９（脱イオン水中６．６ｍｇ／ｍＬ溶液の３．３μＬ）でも繰り返し行った。両サンプルをその後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ニューページ［登録商標］ ノーべックス ４−１２％ ビス−トリスゲル、ＭＥＳランニングバッファー（全てインビトロジェン）（ＮｕＰＡＧＥ
Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ，ＭＥＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂ
ｕｆｆｅｒ，ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びインスタントブルーステイン（イクスペデオン（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＳＢ１Ｌ）によって分析した。その結果を図７に示す。標識１が付されたレーンはタンパク質マーカーである。レーン２は出発ＩＦＮのみである。レーン３は１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９反応の結果を示す。接合された１乃至５個のＰＥＧ鎖を有するＩＦＮに相当する３０と１６０ｋＤａ タンパク質マーカーの間に５つのはっきりと区別できるバンドがある。レーン４は２０ｋＤａ
ＰＥＧ試薬９反応の結果を示す。接合された１乃至３つのＰＥＧ鎖を有するＩＦＮに相当する６０から１１０ｋＤａ タンパク質マーカーの間に３つのはっきりと区別できるバンドがある。標識５が付されたレーンは染色していない２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬であり、そのためどのバンドも可視的ではない。標識６が付されたレーンは染色していない１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬であり、そのためどのバンドも可視的ではない。
【００６６】
実施例６：５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９用いたペプチド（構造中単一の遊離システインを持つ、レプチンフラグメント）のＰＥＧ化
レプチンフラグメント１１６−１３０アミドマウス（シグマ（Ｓｉｇｍａ）ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ６７８８）１ｍｇをｐＨ７．８で１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬに溶解した。５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９の５ｍｇ／ｍＬ溶液をｐＨ７．８で同じ緩衝液で調製した。レプチンフラグメント溶液５０μＬを５０μＬ緩衝液及びＰＥＧ溶液（システイン上の遊離チオールに対して３モル当量のＰＥＧ）９６．１μＬに加えた。溶液を数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、その次に一晩４℃で置いた、その後サンプルをＲＰ−ＨＰＬＣ分析した。ＲＰ−ＨＰＬＣはＪＡＳＣＯ ＨＰＬＣシステムに取り付けられた分析カラム Ｓｏｕｒｃｅ ５ＲＰＣ
４．６／１５０（アマシャム バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ｃａｔ．ｎｏ．１７５１１６０１）から構成した。緩衝液Ａは水＋０．０５％トリフルオロ酢酸（フィッシャーサイエンティフィック ＨＰＬＣグレード（Ｆｉｓｈｅｒ
ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＰＬＣ ｇｒａｄｅ）であり、また緩衝液Ｂはアセトニトリル（フィッシャーサイエンティフィック ＨＰＬＣグレード（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＰＬＣ ｇｒａｄｅ））であった。この方法は１ｍＬ／ｍｉｎの流速で３０分以上かけて緩衝液Ａの１００％緩衝液を０％にしたものである。ＨＰＬＣプロファイルを２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの下で観察した。レプチンフラグメント、ＰＥＧ試薬及び反応溶液に対する結果を図８に示す。
レプチンフラグメントは１１．４分の保持時間である。反応混合液ではこのピークは消失して１６．５分におけるピークに置き換わり、これはフラグメントがうまく誘導体化されたことを示している。
【００６７】
実施例７：分子量２０ｋＤａのＰＥＧ試薬９を用いたポリヒスチジンタグドメイン抗体フラグメントのＰＥＧ化及び生物活性
抗ＴＮＦアルファドメイン抗体フラグメント溶液（図１２においてＴＡＲ１−５−１９に記載された配列のように特許国際公開２００５／０３５５７２号パンフレットから抜粋され、そしてタンパク質のＣ末端上の６個のヒスチジンタグで表わされるタンパク質配列、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍ塩化ナトリウム及び３５０ｍＭイミダゾール中１．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５）２．７ｍＬを脱イオン水（４０ｍｇ／ｍＬ、タンパク質に対して１．９モル当量）中でＰＥＧ試薬の溶液０．３ｍＬに加えた。この溶液をＤ−Ｔｕｂｅ ｄｉａｌｙｚｅｒ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ），ｃａｔ．Ｎｏ．７１５０８−３）に移し、１６時間以上４℃で１Ｌ ｐＨ６．２緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析した。直線的濃度勾配法（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）（３０分以上かけて、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５を、７００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５へとする）を用いながらこの反応溶液をＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１１７８−０１）で精製した。
【００６８】
画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用しながら分析し、そしてその結果を図９に示した。ニューページ［登録商標］ ノーべックス ４−１２％ ビス−トリスゲル （ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ）（インビトロジェン（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０３２１ＢＯＸ）及びニューページ ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（ＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ００２）を使用し、ゲルをインスタントブルー（イクスぺドン（Ｅｘｐｅｄｏｎ）ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＳＢ１Ｌ）で染色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のＰＥＧは、タンパク質マーカーに対してその本当の大きさのほぼ２倍になったので、２０ｋＤａ ＰＥＧは４０ｋＤａタンパク質のようになった。ドメイン抗体フラグメントはおそよ１２．７ｋＤａのタンパク質である。標識１が付されたレーンはタンパク質マーカーである（ノヴェックス シャープ タンパク質スタンダード（Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ
ｓ）、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＣ５８００）。レーン２はタンパク質のみを示す。標識３が付されたレーンは反応溶液である。５３ｋＤａにおけるバンドはモノＰＥＧ化タンパク質に相当する。ジＰＥＧ−タンパク質が約８０ｋＤａのバンド付近に現れ、レーンの上部に少量のマルチＰＥＧ化されたタンパク質が存在する。レーン４は未ＰＥＧ化タンパク質からの混入がない単一のバンドとして精製されたモノＰＥＧ化ドメイン抗体フラグメントを示す。
【００６９】
実施例８：２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を用いた抗−ＴＮＦ アルファ アフィボディ（ａｎｔｉ−ＴＮＦ ａｌｐｈａ Ａｆｆｉｂｏｄｙ）（１つの遊離チオールシステイン）のＰＥＧ化及びＥＬＩＳＡ結合（ＥＬＩＳＡ ｂｉｎｄｉｎｇ）
ｐＨ７．８において１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる５０ｍＭリン酸緩衝液中で抗−ＴＮＦ アルファ アフィボディ（アフィボディ ＡＢ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ）ｃａｔ．ｎｏ １０．０８４１．０１）の１ｍｇ／ｍＬ溶液１ｍＬを、ＤＴＴ（３．０ｍｇ）に加えて任意のジスルフィド結合を還元し、数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、得られた溶液を３０分間室温で放置した。この溶液１ｍＬをその後ｐＨ６．２リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ＥＤＴＡ）で前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）されたＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ｃａｔ．ｎｏ．１７−０８５１−０１）に投入した。カラムはその後未乾燥のｐＨ６．２ リン酸緩衝液の５×１ｍＬで溶離される。Ａ２８０ｎｍ測定は画分３及び４が還元タンパク質を含むこと、また混ぜ合わせて２ｍＬとなることを示した。このタンパク質溶液に飽和水溶性ヒドロキノン溶液１０μＬを加え、そしてよくかき混ぜた。２０ＫＤａ ＰＥＧ試薬９の２０ｍｇ／ｍＬ溶液を脱イオン水で調製し、７３μＬ（遊離システインチオールに対して１モル当量のＰＥＧ）をＤＴＴ処理されたアフィボディに加えた。この溶液を数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、そしてその次に３時間室温で置き、その後サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。
【００７０】
３時間後、かなりの量のＰＥＧ化タンパク質が既に形成されたので、反応を終了させずにＰＥＧ化反応を精製した。精製は直線的塩濃度勾配法（０−７００ｍＭ ＮａＣｌ）（ｌｉｎｅａｒ ｓａｌｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ）（３０分以上かけて、ｐＨ４．５、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム移動相で）と共にＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ 陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１１７８−０１）を使用して行った。この結果を図１０に示す。図１０において標識１が付されたレーンはＭＷを推定するために使用したタンパク質マーカーである。標識２が付されたレーンはＤＴＴによる処理前のアフィボディ溶液を示す。ＤＴＴ存在下におけるアフィボディは標識３が付されたレーンに示される。レーン４はＰＤ−１０カラムによってＤＴＴを除去した後のアフィボディを示し、２つのバンドは単量体アフィボディ（ＰＥＧ化に使用可能な遊離チオールシステイン）及び二量体アフィボディ（ＰＥＧ化に使用不可能なシステイン）に相当して可視的である。レーン５はＰＥＧ化反応溶液を示す。５０ｋＤａ タンパク質マーカーの真上のバンドにモノＰＥＧ化アフィボディを見ることができる。陽イオン交換クロマトグラフィー精製されたモノＰＥＧ化アフィボディは未ＰＥＧ化タンパク質からの混入がない単一のバンドとしてレーン６に示される。
【００７１】
ＴＮＦ−αへの精製されたモノＰＥＧ化生成物の結合活性をＥＬＳＡ法によって分析した；
ＴＮＦ−α（１５ｍＭ Ｎａ2ＣＯ3、３４．９ｍＭ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．６中１０
μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート（９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅ）（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に加え、一晩４℃でインキュベートした。ＴＮＦ−αをその後取り除き、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡを１００μＬ／
ｗｅｌｌで加え、そして室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／１％ ＢＳＡをその後取り除き、ＰＥＧ化抗ＴＮＦ−α アフィボディ（ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ中０．０２６、０．１３、０．６５、３．２５ｕｇ／ｍＬ）を加え、そして室温で１時間インキュベートした。ＰＥＧ化アフィボディを対照穴に加えなかった。このプレートをその後ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ／Ｔ） ３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。抗ＰＥＧウサギ抗体（エピトミクス（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ），ｃａｔ．ｎｏ．２０６１−１；１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：１０００）をその後１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、そして室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ−接合抗ウサギ抗体（アブカム（Ａｂｃａｍ），ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ６７２１；ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中１：１０００）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、そして室温で１時間インキュベートした。穴をその後ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ０４４０）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加えた。暗闇において１５分間のインキュベート後、停止試薬（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），ｃａｔ．ｎｏ．Ｓ５６８９）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、６５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【００７２】
図１１に示されたＥＬＩＳＡ結果はＰＥＧ化アフィボディによるＴＮＦ−αへの特異結合を示し、タンパク質がポスト−ＰＥＧ化後の活性をも保持することを裏付ける。ＴＮＦ−αがない場合は、抗ＰＥＧ抗体の結合は存在しない。
【００７３】
実施例９：２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を使用したＮ−末端上に８個のヒスチジン配列を有するインターフェロン アルファ−２ｂ（ＩＦＮ α−２ｂ）のヒスチジン配列上のＰＥＧ化。水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元をした場合としなかった場合における２０ｋＤａ ＰＥＧ化ＩＦＮの抗ウイルス活性。
Ｎ−末端上に８個のヒスチジン配列を持つＩＦＮ α−２ｂの溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中１．０７ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）４．６７ｍＬを２．６モル当量の２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９（脱イオン水中６０ｍｇ／ｍＬ溶液２１７μＬ）に加え、得られた溶液を室温で一晩インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ニューページ［登録商標］ノーべックス ４−１２％ ビス−トリスゲル、ＭＥＳランニングバッファー（全てインビトロジェン）（ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１
２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ，ＭＥＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ，ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びインスタントブルー（イクスぺドン（Ｅｘｐｅｄｏｎ）ｃａｔ．ＮｏＩＳＢ１Ｌ）染色による分析後、反応サンプルを高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｊａｓｃｏ ＨＰＬＣシステムに接続された、東ソー ＤＥＡＥカラム、Ｓ ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＳＥ−５ＰＷ、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）ｃａｔ ｎｏ．８−０７１６４）にかけて、モノＰＥＧ化ＩＦＮ α−２ｂを精製した。イオン交換カラムから得られた画分（各１ｍＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。主にモノＰＥＧ化ＩＦＮを含んでいる画分を凍結乾燥した。凍結乾燥後に得られた残渣を１５０ｍＭ
ＮａＣｌ及び２ｍＭ ホウ化水素ナトリウムを含んでいる５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、室温で１時間放置した。得られた溶液をその後サイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、溶離液として５０ｍＭ
ＰＢＳ、１．６ｍＬ／ｍｉｎ 流速及び２１５ｎｍでの検出）にかけて、モノＰＥＧ化ＩＦＮを単離した。単離されたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その結果を図１２に示す。図１２の標識１が付されたレーンはタンパク質マーカーである。標識２が付されたレーンは出発ＩＦＮのみを示す。レーン３は精製された２０ｋＤａモノＰＥＧ化ＩＦＮ α−２ｂに相当する５０と６０ｋＤａタンパク質マーカー間の単一のバンドを示す。
【００７４】
抗ウイルス活性：抗ウイルス試験をペニシリン及びストレプトマイシンを含んでいるＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で培養されたＡ５４９細胞で実施した。Ａ５４９細胞を０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度においてＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中で再懸濁し、５０μＬ／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレートの中にアリコートした。次の日に、ＰＥＧ化及び天然ＩＦＮサンプルを倍数希釈で調製し、各希釈液５０μＬを穴に加えた。プレートをその後２４時間インキュベートした。媒体をその後取り除き、細胞にＤＭＥＭ／５％ ＦＣＳ（５０μＬ／ｗｅｌｌ）中で調製された脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を接種した。細胞をさらに２４時間インキュベートし、その後ＰＢＳ ３００μＬ／ｗｅｌｌで洗浄し、そして３０分間４％ ホルムアルデヒド／０．１％ メチルバイオレット（５０μＬ／ｗｅｌｌ；シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），ｃａｔ
ｎｏ．１９８０９９）で染色した。プレートをその後ＰＢＳ ３００μＬ／ｗｅｌｌで２回洗浄し、空気乾燥させた。染料を２％ ＳＤＳ溶液（５０μＬ／ｗｅｌｌ）で可溶化し、吸光度を５７０ｎｍで測定した。（Ａ）ホウ化水素ナトリウムで処理されていない、又は（Ｂ）処理された２０ｋＤａ ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２ｂはそれぞれ、６４ｐｇ／ｍＬ及び６８ｐｇ／ｍＬの活性を示した。
【００７５】
実施例１０：マレイミド官能基を有する市販のＰＥＧ試薬と比較したＰＥＧ試薬９の安定性
ＰＥＧ試薬９（５ｋＤａ及び２０ｋＤａ試料）の安定性をｐＨ７．４における核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学によってメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミドプロピオンアミド（カイロテックテクノロジーリミテッド（Ｃｈｉｒｏｔｅｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ），ｃａｔ．ｎｏ．００８−００８，ｌｏｔ ｎｏ．２２３１２６００１）及びα−メトキシ−ω−エチル−マレイミドポリエチレングリコール（アイリスバイオテック（Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）ｃａｔ．ｎｏ．ＰＥＧ１１４６，ｌｏｔ ｎｏ．１２８５１２）と比較した。ｐＨ７．４において１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる５０ｍＭ リン酸ナトリウム水溶液を最初に凍結乾燥し、そして酸化ジュウテリウムで同体積にもどすことでｐＨ７．４ Ｄ2Ｏ溶液を製造した。基準としてアセ
トンを３ｍＬにつき１．０μＬで緩衝液に加えた。ＰＥＧ試薬のサンプルを緩衝液０．７５ｍＬ中１μモルで溶解し、４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光学によって４時間後及び２５．５時間後分析した。ＰＥＧマレイミドサンプルの安定性を２．１７ｐｐｍにおけるアセトン基準に対する積分を使用して標準化した後、６．８６ｐｐｍにおける積分を比較することによって決定した。ＰＥＧ試薬９の安定性は２．２１ｐｐｍにおけるアセトン基準に対する積分を使用して標準化した後、７．３１、７．４０、７．４７、７．７３、及び８．０３ｐｐｍにおけるシグナルに対する全積分を比較して決定した。７．３１、７．４７及び８．０３ｐｐｍにおけるピークはＰＥＧ試薬９から予想通りに形成されたタンパク質活性ＰＥＧ試薬１０（図１４）からのものである。実験中、９の１０に対する比率は両方のサンプル１及び２に対し１．４６から１．７７乃至１までの幅がある。安定性研究結果を表１に示す。ＰＥＧマレイミドサンプルはｐＨ７．４において２１．５時間以上で１９から５５％まで分解したが、一方ＰＥＧ試薬９サンプルは同じ条件下では分解しなかった。
【００７６】
【表１】
【００７７】
実施例１１：様々なｐＨでの単一の遊離システインチオールを含んでいるラミニンフラグメント９２５−９８３（Ｌａｍβ１925-933）のＰＥＧ化
Ｌａｍβ１925-933は合成直鎖非ペプチド（Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ
０６６８）であり、それはラミニンＢ１鎖の残基９２５−９３３に相当し、単一のシステインチオールを含む。
様々なｐＨでのＰＥＧ試薬９を用いたＰＥＧ化：凍結乾燥されたＬａｍβ１925-933ペ
プチド（１ｍｇ）を脱イオン水５００μＬに溶解し、２ｍｇ／ｍＬ原液を得た。ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、ペプチド原液を未乾燥で使用し又はアリコートし、そして使用するまで−８０℃で保存した。Ｌａｍβ１925-933原液を２倍に希釈し、ＰＥＧ化反
応混合液中で最終濃度１ｍｇ／ｍＬ（１ｍＭ）を得た。５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９（５ｍｇ）を脱イオン水２００μＬに溶解し、２５ｍｇ／ｍＬ原液を得た。ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、ペプチド原液を未乾燥で使用し又はアリコートし、そして使用するまで−８０℃で保存した。ＰＥＧ原液を５倍に希釈し、ＰＥＧ化反応混合液中で最終濃度５ｍｇ／ｍＬ（１ｍＭ）を得た。緩衝原液はｐＨ６．０−８．０の範囲に対し１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液及びｐＨ８．５−１０．０の範囲に対し０．１ｍＭ 炭酸―重炭酸ソーダを含む。全てのｐＨ値に対し、緩衝原液もまた１０ｍＭ ＥＤＴＡ及びヒドロキノン３８１μＭを含む。緩衝原液を１０倍に希釈し、最終濃度が１００ｍＭの緩衝剤（リン酸ナトリウム又は炭酸―重炭酸ソーダ）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び３８μＭのヒドロキノンを得た。
【００７８】
各ＰＥＧ化反応混合液は５μＬ Ｌａｍβ１925-933原液、１μＬ緩衝液、ＰＥＧ試薬
溶液（ＰＥＧ試薬対Ｌａｍβ１925-933型ペプチドのモル比率１：１に相当）２μＬ及び
脱イオン水２μＬを含み、全反応容積を１０μＬとした。数秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した後、続けて簡潔な遠心分離（５，０００×ｇで３０秒）を行い、チューブの底に溶液を集め、この反応混合液を室温のまま０．２５、０．５、１、２、４、１６及び２４時間インキュベートした。室温でのインキュベート後、反応混合液を含んでいるチューブを−８０℃に置き、逆相クロマトグラフィーによって分析するまで保存した。
【００７９】
逆相クロマトグラフィー分析では、Ｓｏｕｒｃｅ ５ＲＰＣ ＳＴ ４．６／１５０（
ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），ｃａｔ．ｎｏ．１７−５１１６−０１）カラムを使用した。ＰＣ及びレオダイン７７２５ｉマニュアルインジェクターバルブ（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ ７７２５ｉ ｍａｎｕａｌ ｉｎｊｅｃｔｏｒ ｖａｌｖｅ）に接続するため、カラムをＪａｓｃｏ ＰＵ−９８０ インテリジェントポンプ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｐｕｍｐ）、Ｊａｓｃｏ ＬＧ−９８０−０２ ターナリ―グラジエントユニット（Ｔｅｒｎａｒｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｕｎｉｔ）、Ｊａｓｃｏ デガッシ ポピュライレ デガッシング ユニット（Ｄｅｇａｓｓｙｓ Ｐｏｐｕｌａｉｒｅ Ｄｅｇａｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、Ｊａｓｃｏ ＵＶ−９７０ ４−λ インテリジェント（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ） ＵＶ ディテクター（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、Ｊａｓｃｏ ＬＣ−ＮｅｔＩＩ／ＡＤＣ インターフェース（Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）からなるＪａｓｃｏ ＨＰＬＣシステムに接続した。ＥＺｃｈｒｏｍ ＳＩ バージョン３．２．１ ビルド３．２．１．３４ クロマトグラフィーソフトウエアパッケージ（アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用しながら、コンピュータによってＨＰＬＣシステムを制御した。クロマトグラム分析及びデータのエクスポートもまたＥＺｃｈｒｏｍ ＳＩクロマトグラフィーデータシステムを使用しながら行った。
【００８０】
３つの溶離液方式を使用した。溶離液Ａは脱イオン水中に５％アセトニトリル（Ｆａｒ
ＵＶ、ＨＰＬＣグレード、フィッシャー ｃａｔ．ｎｏ．Ａ／０６２７／１７）及び０．０６５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（アクロス（Ａｃｒｏｓ）ｃａｔ．ｎｏ．１３９７２１０００）を含む。溶離液Ｂはアセトニトリル中に０．０７５％ ＴＦＡを含むが一方、溶離液Ｃは１００％アセトニトリルである。溶離液を使用前に超音波処理によって脱気した。溶離プログラムは２０分間の、０−６４％ Ｂ勾配を含み、続いて１００％アセトニトリルで洗浄し、溶離液Ａで前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）した（表２）。実行中、一定の流速１ｍＬ／ｍｉｎを保持した。２１５、２５０、２８０及び３５０ｎｍにおける吸光度を実行中記録した。各サンプル（１０μＬ）を解凍し、上澄み５μＬを逆相クロマトグラフィーカラムに注入する前に速やかに簡潔に遠心分離機にかけた（１４，０００ｇで1分）。
【００８１】
【表２】
【００８２】
クロマトグラムにおける各ピークの同定を標準試料（ＰＥＧ試薬、還元及び酸化された未反応のペプチド）を実行すること及び（ＰＥＧ化生成物：ペプチド−ＰＥＧ接合体に関して）相対的な寸法推定に対する分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって確認した。分析用ＳＥＣに用いられたカラムはＢｉｏ−Ｓｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ３０００（３００×７．８ｍｍ）分析用カラム（フェノメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ），ｃａｔ．ｎｏ００Ｈ−２１４６−ＫＯ）であった。用いられた実行中の溶離液は１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含んでいる１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）であり、流速は実行中２ｍＬ／ｍｉｎで一定に保った。
【００８３】
図１３に１モル当量の５ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を用いた、ｐＨ６．５における経時的ＰＥＧ化実験のクロマトグラムを示す。室温で１５分のインキュベーション後、５つのピー
クが現れた：ＰＥＧ反応性ペプチドＬａｍβ１925-933（ピーク１）；ジスルフィド形成
を経て形成された未反応のペプチド二量体（ピーク２）；ＰＥＧ試薬９スルホン酸脱離基（ピーク３、図１４中の化合物１１）；ＰＥＧ化ペプチド生成物（５ｋＤａ ＰＥＧ−Ｌａｍβ１925-933接合体）に相当するピーク（ピーク４）及びＰＥＧ試薬９（ピーク６、
未反応形態）。
【００８４】
４時間のインキュベーション後、すべての遊離ペプチド（ピーク１）はＰＥＧ化が終了するにつれて消費された。一部の過剰ペプチドが未反応の二量体（ピーク２、ＰＥＧ試薬は当量濃度においてペプチドより強く吸収することに留意する）を形成したので、やや過剰な活性ＰＥＧ試薬ピーク（ピーク５、図１４における化合物１０）もまた存在する。酸化Ｌａｍβ１925-933（ピーク２）は遊離チオールを持たないので、ＰＥＧ化されなかっ
た、それ故対応するピーク（ピーク２）は実験中、未変化のままであった。この結果は還元ペプチドを発生しながらシステインチオールＰＥＧ化と一致する。
【００８５】
ｐＨ６．０とｐＨ８．０間のＬａｍβ１925-933に対するＰＥＧ試薬１の反応性をペプ
チド（ピーク１）から５ｋＤａ ＰＥＧ化Ｌａｍβ１925-933生成物（ピーク４）への変
換を測定することによって推定した。ペプチドピーク結果を１００の値を各ＰＥＧ化反応に使用されたペプチドの全量に相当する較正されたピークエリアに割り当てることによって標準化した、一方生成物ピーク結果をペプチドの生成物への全変換に相当する推定される最大生成物ピークエリアを用いて標準化した。変換（％）を反応に用いられたペプチドの初期量と比較してＰＥＧ化ペプチドの割合として定義した。その結果を図１５に示す。ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５及び８．０において、全てのペプチドがＰＥＧ化された。終了速度はｐＨによって左右され、より高いｐＨ程より速い速度であり、異なったｐＨにおいて反応性構造１０（図１４）の形成の異なった速度を示す。
【００８６】
実施例１２：様々なｐＨでのＰＥＧ試薬９と商業的に入手可能なＰＥＧマレイミドの反応性の比較
実施例１１のＬａｍβ１925-933ペプチドに対するＰＥＧ試薬９の反応性を商業的に入
手可能なチオール反応性ＰＥＧ試薬、ＰＥＧマレイミド（Ｏ−（２−マレイミドエチル）−Ω’−メチル−ポリエチレングリコール５，０００、フルカ（Ｆｌｕｋａ）ｃａｔ．ｎｏ．６３１８７）と比較した。ＰＥＧ試薬９が実験時間スケールにおいて反応に速やかに使用できるようにするため、試薬をｐＨ７．５でインキュベートすること（２時間、４℃）によってチオール反応性形態（試薬１０、図１４）を最初に形成し、そして試薬１０をペプチド接合する前にＲＰクロマトグラフィーにより単離した。全てのペプチド反応は新規に溶解したＰＥＧ試薬を用いて行った。一時的に、ＰＥＧ化反応溶液（反応スケール１０μＬ）は１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０）又は１００ｍＭ炭酸―重炭酸ソーダ（ｐＨ８．５−１０．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ中で１０μｇ Ｌａｍβ１925-933、ＰＥＧ（５ｋＤａ）試薬５０μｇ（ＰＥＧ試薬対Ｌａｍβ１925-933型ペプチドのモル比率１：１に相当）を含んでいた。室温でのインキュベーション後、反応混合液を実施例１１で述べたように逆相クロマトグラフィーによって分析した。その結果を図１６に示す。ＰＥＧ試薬９（ｐＨ９．０乃至１０）及び１０（ｐＨ６．０乃至８．０）に対し、ペプチドのＰＥＧ化形態への完全な変換は１５分以内にｐＨ６．０とｐＨ１０の間で達成された。
【００８７】
ＰＥＧマレイミド試薬に対し、変換は１５分後単に最大で７８．９％に達するもののみであった。より高いｐＨにおいて、変換はさらに低かった（ｐＨ１０で５１．２）。ｐＨ８．５におけるＰＥＧマレイミド反応を１６時間後再びサンプル採取し、全てのペプチドは消費された。
【００８８】
したがってテストされた全てのｐＨ値において、ＰＥＧ試薬９及び１０はＰＥＧマレイミド試薬より有効である。
【００８９】
実施例１３：ＰＥＧ試薬９ペプチド接合体の安定性及びＰＥＧマレイミド誘導ペプチド接合体の比較
ＰＥＧ試薬９から製造された精製Ｌａｍβ１925-933ペプチド接合体及び実施例１２か
らのＰＥＧマレイミドの安定性を１２日間以上比較した。接合体の安定性は実施例１１で述べたように逆相クロマトグラフィーを用いてＰＥＧ−ペプチドピークの領域を測定することによって決定した。
ＰＥＧ試薬９を用いたＰＥＧ化Ｌａｍβ１925-933の合成：接合体は実施例１１の修正
法を用いて調製した（最終ペプチド濃度１．６ｍｇ／ｍＬ及びペプチド０．４ｍｇを用いてｐＨ６．０）。生成物をＲＰ−クロマトグラフィーで単離した。Ｌａｍβ１925-933−
ＰＥＧ接合体に相当する溶離ピークを集め、凍結乾燥しそしてその後脱イオン水中で再懸濁した。最終的に、２ｍＭ水素化ホウ素ナトリウム（アクロスオルガニクス（Ａｃｒｏｓ
Ｏｒｇａｎｉｃｓ），ｃａｔ．ｎｏ．２０００５０２５０）を加え、サンプルを室温で３０分間インキュベートした後、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加えた。
ＰＥＧマレイミドを用いたＰＥＧ化Ｌａｍβ１925-933の合成：Ｌａｍβ１925-933（０．４ｍｇ）を５ｋＤａ ＰＥＧマレイミド（５ｋＤａ、フルカ（Ｆｌｕｋａ）ｃａｔ．ｎｏ．６３１８７）試薬と共にＰＥＧ化用に使用した。一時的に、１０×緩衝原液（１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる）２０μＬ及びＰＥＧ試薬原液（脱イオン水中２５ｍｇ／ｍＬ）４０μＬをペプチド原液（脱イオン水中２ｍｇ／ｍＬ）２００μＬに加えた。室温での１．５時間のインキュベーション後、生成物を実施例１１で述べたようにＲＰ−クロマトグラフィーを用いて精製した。溶離ピークサンプルを乾燥凍結し、そしてその次に脱イオン水で再懸濁しその後５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液をｐＨを８．０に調節するために加えた。両方のＰＥＧ−ペプチド溶液の濃度がおおよそ等しいことを確認するためにＲＰ−クロマトグラフィーを使用した。
【００９０】
両方の安定性サンプルを室温でインキュベートした。１２日後、サンプルを分析用ＲＰＣによって分析し、安定性を図１７に示されるように接合体ピークに対する積分領域の変化によって決定した。ＰＥＧ試薬９から誘導された接合体は１２日以上安定した状態を保っていた。ＰＥＧマレイミドから誘導された接合体に対し、たったの６３％がクロマトグラム中にとどまり、このことはＰＥＧ試薬９はより安定した生成物をもたらすことを示す。
【００９１】
実施例１４：両末端で官能化されたＰＥＧを使用したＰＥＧ化−ＰＥＧ試薬１２
【化２】
ＰＥＧ試薬１２をＯ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）ポリエチレングリコール６０００（フルカ（Ｆｌｕｋａ）ｃａｔ．ｎｏ．１４５０４）を使用してＰＥＧ試薬９と同様に調製し、実施例１１（Ｌａｍβ１925-933）からのモデルペプチドと反応させた。水（６
μＬ）、１０×緩衝原液（１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、３８１μＭヒドロキノン及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる）２μＬ及びＰＥＧ試薬１２（２５ｍｇ／ｍＬ）２μＬをＬａｍβ１925-933原液（脱イオン水中２ｍｇ／ｍＬ）１０μＬに加えた
。これは１：０．３７５モデルペプチド対ＰＥＧ試薬のモル比率に相当する。反応溶液（５μＬ）を室温で２．５時間インキュベーションした後に（実施例１１で述べたように）分析用ＲＰＣによって分析した。反応溶液の全ての成分が別個のピークとして溶出した：Ｌａｍβ１925-933単量体は８．１分で溶出した、酸化Ｌａｍβ１925-933二量体は８．９分で溶出した、不活性ＰＥＧ試薬は１７．３分で溶出した、活性ＰＥＧ試薬は１５．７分で溶出しそして脱離基１１は１０．１分であった。生成物ピークは１４．２分で溶出した。２．５時間後、反応溶液中に存在（試薬１２に対する８６％反応）する遊離Ｌａｍβ１925-933の６５％は接合され、ＰＥＧ試薬１２の両方の反応性末端が反応すること及びこ
の二官能性試薬はＰＥＧ分子の両末端で１つのペプチド分子に付着するのにうまく使用され得ることを示す。
【００９２】
実施例１５：ポリマー成分としてのポリ（１−ビニル−２−ピロリドン）（ＰＶＰ）の使用：Ｌａｍβ１925-933モデルペプチドを用いたＰＶＰの接合
ＰＶＰ試薬の調製（３工程）：
工程１：末端アミノ基を有するＰＶＰ：
圧力管にシステアミン（０．０２８ｇ）、ジオキサン（８ｍＬ）及びマグネチック撹拌子を入れた。溶液を形成するために穏やかな加熱後、この溶液をアルゴンと共に５分間室温でパージした。パージしながら、１−ビニル−２−ピロリドン（２．０ｇ）をその後加え、さらに５分後次にこれに２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）を加えた（０．０８９ｇ）。さらに２分後、圧力管をアルゴン雰囲気下スクリューキャップで封をし、撹拌しながら１７時間６０℃のオイルバス中に置いた。管及び内容物を室温まで冷却した後、ポリマー生成物の沈殿物を得るためにジエチルエーテル（１５ｍＬ）を加えた。液相をデカントし固形残渣をアセトン（３ｍＬ）に再溶解した。得られたアセトン溶液をその後迅速に撹拌されているジエチルエーテル（２５ｍＬ）に滴下し沈殿物を真空のほんの僅かなバーストと共にｎｏ．２ 焼結ガラス漏斗で単離した。固形物を未乾燥のジエチルエーテル（１０ｍＬ）で洗浄し、その後室温で真空下乾燥させた（質量＝１．４４ｇ、白色の固体）。
工程２：ＰＶＰ−アミンへのタンパク質反応末端基の接合：
ＰＶＰ−アミン（５００ｍｇ）、４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸（図３中の構造６、１６６ｍｇ）、及び４−ジメチルアミノピリジン（６ｍｇ）をアルゴン雰囲気下、無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）で混合し、その後撹拌しながら、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（１５５μＬ）を加えた。得られた混合物を室温で週末を通して撹拌した。週末の間揮発性物質は蒸発したので、固形残渣をジクロロメタン（１０ｍＬ）中に再溶解し、そして非吸収性コットン−ウールを通してろ過した。その後ろ液にジエチルエーテル（３０ｍＬ）を加え、得られた沈殿物を遠心分離（４，６００ｒｐｍ、−９℃、１０分）によって単離した。液相をデカントし、残りの残渣をジクロロメタン（１０ｍＬ）中に再溶解した。ジエチルエーテル沈殿精製方法を２回以上繰り返し、残渣を真空下乾燥させた（５１３ｍｇ）。リンカー基を接合させたＰＶＰに対する特徴的なＮＭＲシグナルはＣＤＣｌ3において７．９７、７．８２、７．５９及び７．３８に現れた。
工程３：ＰＶＰ試薬の分別：
上述の段階で得られた固形物の一部（１２０ｍｇ）を水溶性の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ４．０で混合し、その後澄明な液が可視的になるまで１３，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけ、そして液相０．４５μｍをろ過した。ろ液をその後溶出ピークの間１分ごとに留分を集めることにより１ｍＬ／ｍｉｎにおいて２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ、ｐＨ４．０を稼動させながら、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で分別した（１．９ｍＬ加えた）。７３．９乃至７４．９分の間に溶出している画分を凍結乾燥後にタンパク質接合用に使用した。ペプチド反応を１ｍＭ ＥＤＴＡ、３８μＭヒドロキノン、１．０３ｍＭ Ｌａｍβ１925-933及び過剰のＰＶＰ試薬を含んでいる１００ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で行った。反応混合液を実施例１１で述べたように分析用ＲＰＣによって分析した。室温での１時間のインキュベーション後、反応混合液中に存在する遊離Ｌａｍβ１925-933モデルペプチドのおよそ６０％がＬａｍβ１925-933−ＰＶＰ接合体（１１．３分のＲＰＣ保持時間）に変換され、これはＰＥＧ以外のポリマーが使用され得ることをうまく証明している。
【００９３】
実施例１６：アミン性脱離基Ｌを有するＰＥＧ試薬の合成及び使用
【化３】
ＰＥＧ試薬１３の合成：ＰＥＧ試薬１３（図１９）は実施例１と類似した操作でＤＩＰＣ（１１ｍｇ）を使用しながらＤＭＳＯ（５ｍＬ）中で５ｋＤａ ｍＰＥＧ−ＮＨ２と化合物２（２６ｍｇ）の直接的な接合により調製し、灰色がかった白色の固形物（３１ｍｇ）を得た。（ＣＤＣｌ3における）この生成物のＮＭＲスペクトルは８．０２及び７．５
９に特徴的なシグナルがあった。
実施例１１のＬａｍβ１925-933モデルペプチドとの反応：反応を１ｍＭ ＥＤＴＡ、
３８μＭヒドロキノン、１．０３ｍＭ Ｌａｍβ１925-933及び３モル当量のＰＥＧ試薬
１３を含んでいる１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で行った。反応混合液を実施例１１で述べたように分析用ＲＰＣによって分析した。単量体Ｌａｍβ１925-933は８．１分で溶出し、二量化Ｌａｍβ１925-933は８．９分で溶出し、アミン脱離基は９．３分で溶出し、アミン脱離基を有さないＰＥＧ試薬１３は１５．２分、ＰＥＧ試薬１３は１５．７５分、そして生成物のピークは１４．２分であった。室温での１時間のインキュベーション後、反応混合液中に存在する遊離Ｌａｍβ１925-933モデルペプチドのお
よそ１０％がＬａｍβ１925-933−ＰＥＧ接合体に変換した。
【００９４】
実施例１７：ＰＥＧ試薬９を使用したＩＬ−１−ＲａのチオールＰＥＧ化及び活性
ヒトインターロイキン−１−レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１−Ｒａ）の組み換え非グルコシル化形態をモデルタンパク質として使用した。ＩＬ−１−Ｒａは１５３アミノ酸、２つのジスルフィド結合（Ｃｙｓ６９／Ｃｙｓ１１６及びＣｙｓ６６／Ｃｙｓ１２２）からなり、１７．３ｋＤａの分子量を有しそしてＮ−末端のヘキサヒスチジンタグを含む。
一連のチオールＰＥＧ化は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０及び７．５）中で１−４モル当量の１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を使用して行った。発現されたタンパク質は還元したので、ＰＥＧ化前にジスルフィドの還元は必要ではなかった。タンパク質濃度は０．１ｍｇ／ｍＬであった。４℃での１時間のインキュベーション後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、その結果を図１８に示した。ｐＨ６．０のみならず７．５においても、１モル当量のＰＥＧ試薬を使用した場合、ＰＥＧ化反応の主な生成物はモノ−ＰＥＧ化ＩＬ−１−Ｒａであった。ジ−ＰＥＧ化生成物に相当するかすかなバンドもまた見られ、同様に未ＰＥＧ化ＩＬ１−Ｒａに相当するバンドも見られた。反応に使用されたＰＥＧのモル当量を増加させるとジ−、トリ−及びテトラ−ＰＥＧ化された種が増加した。ｐＨ６．０でのより大きなスケールのＰＥＧ化をその後２０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる５０ｍＭリン酸ナトリム緩衝液ｐＨ６．０中でＩＲ−１−Ｒａ（０．２ｍｇ／ｍＬ）１．５ｍｇ及び１．５モル当量の２０ｋＤａ ＰＥＧ試薬９を使用して行った。溶液を少しの間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、２時間４℃で置いた。ＰＥＧ化ＩＬ−１−Ｒａを固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＩＭＡＣ前に、アミコウルトラ−４（Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ−４） ３，０００Ｄａ ＭＷＣＯ 限外ろ過遠心装置（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｄｅｖｉｃｅ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ｃａｔ．ｎｏ．ＵＦＣ８００３２４）を使用しながら、ＥＤＴＡを未乾燥のリン酸緩衝液ｐＨ７．４を用いて濃縮と希釈の繰り返しサイクルによって取り除いた。最終的に、サンプルを４ｍＬに濃縮し室温で３０分間、２ｍＭホウ化水素ナトリウムで処理し、続けてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）させたＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（１ｍＬ）カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），ｃａｔ．ｎｏ．１７−５２４７−０１）に投入した。カラムを２０ｍＬ ＰＢＳで洗浄し、溶離は４０分かけてＰＢＳを５００ｍＭイミダゾールを含んでいるＰＢＳにする勾配を含む。溶出液の画分（１ｍＬ）を集め、各画分のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、ＰＥＧ化生成物を含んでいる画分を特定した。その後、ＰＥＧ化生成物を含んでいる画分を溜めて限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ−４ ３，０００Ｄａ ＭＷＣＯ）によって最終容積０．６ｍＬに濃縮した。濃縮されたＩＭＡＣ画分をＰＢＳ ｐＨ７．４で前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）させたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），ｃａｔ．ｎｏ．１７−１０６９−０１）に投入した。流速は実行中１ｍＬ／ｍｉｎに保ち、モノ−ＰＥＧ化生成物は約６２分で溶出した。画分（１ｍＬ）を溶出ピーク周辺で集め、各画分のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。純粋なモノ−ＰＥＧ化生成
物を含んでいる画分を限外ろ過によって濃縮しそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって再分析して、純度を確認した。その結果を図１９のレーン２に示した。ゲルはモノ−ＰＥＧ化タンパク質に相当する単一のバンドを示し、遊離タンパク質は可視的ではなかった。
【００９５】
紫外分光光度法によって定量化した後、ＭＧ−６３細胞中のＩＬ−１β−依存的ＩＬ−６放出（ＩＬ−１β−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＩＬ−６ ｒｅｌｅａｓｅ）の抑制を評価することによってインビトロ生物活性に関してサンプルを分析した。ＭＧ−６３細胞をＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ １００μＬ中２０，０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで加えた。次の日に、媒体を取り除き未乾燥の媒体５０μＬ／ｗｅｌｌを加えた。サンプルを５倍希釈で２サンプル（２５μＬ／ｗｅｌｌ）に加え、１時間予備インキュベートし、その後ＩＬ−１βを最終濃度０．３ｎｇ／ｍＬ（２５μＬ／ｍＬ）で加えた。プレートをさらに２４時間インキュベートした。細胞の生存可能性を評価するために、１０μＬのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ；ＤＭＥＭ中５ｍｇ／ｍＬ；シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ｃａｔ ｎｏ．Ｍ５６５５）を各穴に加え、３時間インキュベートした。プレートをその後５分間１，５００ｇで遠心分離機にかけ、媒体を注意深く吸引した。代謝的に活発な細胞中のホルマザン生成物をその後ＤＭＳＯ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で溶解し５７０ｎｍでの吸光度を測定した。その結果を図２０に示し、試薬９を用いたＰＥＧ化後のＰＥＧ化ＩＬ−１Ｒａは阻害活性を保持することを示す。
【００９６】
実施例１８：ＰＥＧ試薬９を使用したＩＬ−１Ｒａのポリヒスチジン配列上のＰＥＧ化、及びＰＥＧ化タンパク質の活性
以下のようなＰＥＧ化反応前に硫酸銅を用いてタンパク質遊離システインを酸化してジスルフィドにした後、実施例１７のＩＬ−１Ｒａをポリヒスチジンタグ上でＰＥＧ化した；硫酸銅（１ｍＭ）を２００ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）においてＩＬ−１Ｒａ（０．６ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ ＩＬ−１−Ｒａ）の２．５ｍＬ溶液に加えた。４℃で１６時間のインキュベーション後、２５ｍＭ ＥＤＴＡを加え、サンプルを２０ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５で前平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）されたＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に投入した。カラムをその後未乾燥のリン酸緩衝液３．５μＬで溶出した。ＰＥＧ化に使用されたタンパク質濃度は０．４３ｍｇ／ｍＬ及びｐＨ７．４でありそして４℃で１６時間インキュベートした。ＰＥＧ試薬９（２０ｋＤａ）はタンパク質に対して１．５モル当量である。反応は４℃で１６時間インキュベートした。モノＰＥＧ化種をホウ化水素ナトリウム処理と共に実施例１７で述べたように同じクロマトグラフィーを使用しながら単離した。生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図１９のレーン２に示した、レーン２には遊離タンパク質は見ることができなかった。生成物の生物活性は実施例１７で述べたようにＭＧ−６３細胞中のＩＬ−１β−依存的ＩＬ−６放出の抑制を測定することによって評価し、その結果を図２０に示した。ＰＥＧ化ＩＬ−１Ｒａは分析結果において阻害活性を有していた。
【００９７】
実施例１９：ＰＥＧ試薬合成：１０ｋＤａ ＰＥＧ試薬１５の合成
ＰＥＧ化４−（３−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）プロパノイル）安息香酸試薬１５を図２１に示されているように、実施例１中のＰＥＧ化４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸９の合成で記載されたのと類似の方法で４−（３−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）プロパノイル）安息香酸１４から調製した。最初に、４−（３−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）プロパノイル）安息香酸１４を４−（３−トシルプロパノイル）安息香酸と類似の方法で４−メチルベンゼンチオールの替わりにメルカプトエタノールを使用して調製した（工程２、実施例１）。
ＮＭＲ １４（４００ＭＨｚ）δ３．３５（ｔ，２Ｈ，ＣＯＣＨ2），３．５（重なり
ｍ，４Ｈ，ＣＨ2ＳＯ2ＣＨ2），３．８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2ＯＨ），５．２（ｂｒ ｓ，ＣＨ2ＯＨ），８．０５（ｍ，４Ｈ，芳香族ＣＨ），１３．４（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＣＯＯ
Ｈ）。
ＰＥＧ接合工程に対し、スルホン１４（１４３ｍｇ）及びＯ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−メチル−ＰＥＧ（ＭＷ １０ｋＤａ，１ｇ，バイオべクトラ（ＢｉｏＶｅｃｔｒａ））を乾燥トルエン（５ｍＬ）に溶解した。溶媒を加熱しないで真空下で取り除き、乾燥固形残渣をその後アルゴン雰囲気下、乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）に再溶解した。氷浴で冷却した、得られた溶液にアルゴン雰囲気下でジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ，８７ｍｇ）をゆっくりと加えた。反応混合液をその後一晩（１５時間）、室温で撹拌し続けた。揮発性物質をその後真空下（３０℃、水浴）で取り除いて、アセトン中（４５ｍＬ）で微温（３５℃）で再溶解させた固形残渣を得た。溶液を非吸収性コットンウールでろ過して不溶性物質を取り除いた。この溶液をその後、ドライアイス浴で冷却して、遠心分離（４６００ｒｐｍ、３０分間）により分離された白色の沈殿物を得た。液相をデカントし、この沈殿操作を３回繰り返した。その後、得られた灰色がかった白色の固体を真空下で乾燥して、ＰＥＧ試薬１５（１ｇ）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ３．３０（ｔ，２Ｈ，ＣＯＣＨ2），δ
３．４０（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧ−ＯＣＨ3），δ３．４０−３．８５（ｂｒ ｍ，ＰＥＧ）
，δ３．５０（重なり ｍ，２×２Ｈ，ＣＨ2ＳＯ2ＣＨ2），δ３．８０（ｔ，２Ｈ，Ｃ
Ｈ2ＯＨ），δ７．９５，δ８．０５（２×ｄ，２×２Ｈ，カルボン酸部位のＡｒＨ）。
【００９８】
異なったＰＥＧ分子量の類似したＰＥＧ試薬を同じ基本操作によって調製した。それ故、５ｋＤａ ＰＥＧを乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）においてスルホン１４（２５６ｍｇ）、Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−メチル−ＰＥＧ（５ｋＤａ，１ｇ，バイオべクトラ（ＢｉｏＶｅｃｔｒａ））及びＤＩＰＣ（１７４ｍｇ）の反応によって調製し、アセトン沈殿精製操作後灰色がかった白色の固体１５（１ｇ）を得た。
【００９９】
実施例２０：ＰＥＧ試薬合成：１０ ｋＤａ ＰＥＧ試薬１７の合成
ＰＥＧ試薬１７を次のようにＰＥＧ試薬９から調製した（図２２）：ＰＥＧ試薬９（１０ｋＤａ，７５ｍｇ）をおよそ１８時間、脱イオン水中でメルカプトコハク酸（６ｍｇ）及び炭酸水素ナトリウム（２０ｍｇ）と一緒にかき混ぜた。揮発性物質をその後ロータリーエバポレーターで取り除き、非吸収性コットン−ウールを通してろ過により取り除いた不溶物と共に固形残渣を温めたアセトン（４ｍＬ）に再溶解した。その後溶液をドライアイス浴で冷却することによって生成物をアセトンから沈殿させ、そして液相をデカントすることによって単離し続いて遠心分離した。アセトン沈殿物をさらに３回繰り返し、固形物をその後真空下で乾燥して１６（５１ｍｇ）を得た。化合物１６をおよそ１８時間、１：１ メタノール：水（１ｍＬ）中でオキソンと混合することによってその後スルホン形態１７に酸化した。この混合液をアセトン（１０ｍＬ）で希釈し、不溶物をその後非吸収性コットン−ウールを通して重力ろ過によって取り除いた。均一なろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固しそして添加された１ＮＨＣｌ ２滴を含むアセトン（２ｍＬ）に再溶解し、その後１６（ ｍｇ）に対して述べられたように同一のアセトン沈殿によって単離した。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ３．２４−３．０８（重なり ｍ，ＣＨ2
ＣＨ、ＣＯＣＨ2），３．３８（ｓ、ＰＥＧ−ＯＣＨ3），３．４４−３．８４（ｂｒ ｓ，重なり ｍ，ＰＥＧ ＆ ＣＨ2ＳＯ2），４．４４（ｄｄ，ＳＯ2ＣＨ），７．４５（
ｂｒ ｓ，ＮＨ），７．９８ ＆ ８．０６（２×ｄ，４Ｈ，カルボン酸部位のＡｒＨ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーにチオール基又はアミノ基を含んでいる分子を接合する方法であって、
該分子を一般式：
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｑは連結基を表し；
Ｗはケト基又はエステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；そして
ｍは１乃至８の整数を表す。）で表される化合物と反応させることを含む方法。
【請求項２】
前記Ｑは直接結合、アルキレン基又は随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基であって、これらのうちどれでも１つ以上の酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ基（Ｒはハロゲン原子又はアルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）、ケト基、−Ｏ−ＣＯ−基、−ＣＯ−Ｏ−基及び／又は−ＮＲ．ＣＯ−基によって終端又は中断され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｑは随意に置換されたヘテロアリール基又はアリール基であって、−ＮＲ．ＣＯ−基によって隣接した前記ポリマーＸが終端されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｘはポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ＨＰＭＡコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリアミド、ジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸のコポリマー、多糖、又はタンパク質である、前記いずれかの請求項のうち１項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｘはポリアルキレングリコールである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｘはポリエチレングリコールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｎは０である、前記いずれかの請求項のうち１項に記載の方法。
【請求項８】
前記式Ｖで表される化合物は、一般式：
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖａ）
（式中、
Ａｒは未置換の又は置換アリール基を表す。）である、前記いずれかの請求項のうち１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ａｒはアルキル基、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ．ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ．ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ．ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び−Ｃ＝ＣＨＲ（各Ｒは独立してハロゲン原子又アルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）から選ばれる１つ以上の同一又は異なった置換基によって随意に置換されたフェニル基を表す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ａｒはフェニル基を表す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分子はペプチド又はタンパク質である、前記いずれかの請求項のうち１項に記載の方法。
【請求項１２】
一般式：
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖａ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｗはケト基又はエステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；
ｍは１乃至８の整数を表し；そして
Ａｒは未置換の又は置換されたアリール基を表す。）で表される化合物。
【請求項１３】
前記Ａｒはアルキル基、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ．ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ．ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ．ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び−Ｃ＝ＣＨＲ（各Ｒは独立してハロゲン原子又アルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）から選ばれる１つ以上の同一又は異なった置換基によって随意に置換されたフェニル基を表す、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記Ａｒはフェニル基を表す、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記Ｘはポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ＨＰＭＡコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリアミド、ジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸のコポリマー、多糖、又はタンパク質である、請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記Ｘはポリアルキレングリコールである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記Ｘはポリエチレングリコールである、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記ｎは０である、請求項１２乃至請求項１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記Ｗはケト基を表す、請求項１２乃至請求項１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
式：
【化１】
で表される、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１】
ポリマーにチオール基又はアミノ基を含んでいる分子を接合する方法であって、
該分子を一般式：
Ｘ−［Ｑ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｑは連結基を表し；
Ｗはケト基又はエステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；そして
ｍは１乃至８の整数を表す。）で表される化合物と反応させることを含む方法。
【請求項２】
前記Ｑは直接結合、アルキレン基又は随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基であって、これらのうちどれでも１つ以上の酸素原子、硫黄原子、−ＮＲ基（Ｒはハロゲン原子又はアルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）、ケト基、−Ｏ−ＣＯ−基、−ＣＯ−Ｏ−基及び／又は−ＮＲ．ＣＯ−基によって終端又は中断され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｑは随意に置換されたヘテロアリール基又はアリール基であって、−ＮＲ．ＣＯ−基によって隣接した前記ポリマーＸが終端されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｘはポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ＨＰＭＡコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリアミド、ジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸のコポリマー、多糖、又はタンパク質である、前記いずれかの請求項のうち１項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｘはポリアルキレングリコールである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｘはポリエチレングリコールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｎは０である、前記いずれかの請求項のうち１項に記載の方法。
【請求項８】
前記式Ｖで表される化合物は、一般式：
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖａ）
（式中、
Ａｒは未置換の又は置換アリール基を表す。）である、前記いずれかの請求項のうち１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ａｒはアルキル基、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ．ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ．ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ．ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び−Ｃ＝ＣＨＲ（各Ｒは独立してハロゲン原子又アルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）から選ばれる１つ以上の同一又は異なった置換基によって随意に置換されたフェニル基を表す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ａｒはフェニル基を表す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分子はペプチド又はタンパク質である、前記いずれかの請求項のうち１項に記載の方法。
【請求項１２】
一般式：
Ｘ−［ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ−Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝ＣＨ２］ｍ （Ｖａ）
（式中、
Ｘはポリマーを表し；
Ｗはケト基又はエステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
ｎは０又は１乃至４の整数を表し；
ｍは１乃至８の整数を表し；そして
Ａｒは未置換の又は置換されたアリール基を表す。）で表される化合物。
【請求項１３】
前記Ａｒはアルキル基、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ．ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ．ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＲ．ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン原子、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び−Ｃ＝ＣＨＲ（各Ｒは独立してハロゲン原子又アルキル基、アリール基又はアルキル−アリール基を表す。）から選ばれる１つ以上の同一又は異なった置換基によって随意に置換されたフェニル基を表す、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記Ａｒはフェニル基を表す、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記Ｘはポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ＨＰＭＡコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、ポリアミド、ジビニルエーテル−無水マレイン酸及びスチレン−無水マレイン酸のコポリマー、多糖、又はタンパク質である、請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記Ｘはポリアルキレングリコールである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記Ｘはポリエチレングリコールである、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記ｎは０である、請求項１２乃至請求項１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記Ｗはケト基を表す、請求項１２乃至請求項１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
式：
【化１】
で表される、請求項１２に記載の化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２０１１−２５２１６７（Ｐ２０１１−２５２１６７Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８０５３０（Ｐ２０１１−１８０５３０）
【出願日】平成２３年８月２２日（２０１１．８．２２）
【分割の表示】特願２０１１−５１９２２８（Ｐ２０１１−５１９２２８）の分割
【原出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【出願人】（５１００９９７７４）ポリテリクス リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月２２日（２０１１．８．２２）
【分割の表示】特願２０１１−５１９２２８（Ｐ２０１１−５１９２２８）の分割
【原出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【出願人】（５１００９９７７４）ポリテリクス リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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