生体成分測定用試薬及び測定方法
【課題】本発明は、生体試料中の特定成分を測定する方法において、ビリルビン、溶血などの還元物質の影響を回避して測定する試薬及び測定方法を提供することを目的とする。
【解決手段】生体試料中の成分を測定する方法において、前処理工程で過酸化物を０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上存在させることを特徴とする生体成分の測定方法。
【解決手段】生体試料中の成分を測定する方法において、前処理工程で過酸化物を０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上存在させることを特徴とする生体成分の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清、尿、血漿等の生体試料中の特定成分を測定する方法において、ビリルビン、溶血ヘモグロビンによりもたらされる（１）劣化して着色することにより比色法測定に与える影響、（２）酸化還元反応に与える影響、の両方を回避して測定する試薬及び測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野において吸光度測定による成分分析が広く行なわれている。方法としては脱水素酵素を用い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを指示物質として用いる方法（脱水素酵素法）、酸化酵素を用い生成した過酸化水素と、ペルオキシダーゼにより発色剤を色素に導き比色定量する方法（酸化酵素法）、発色基を導入した基質を用い、酵素の反応により生成した発色体の増加速度を測定する方法（合成基質法）などがある。これらの方法では生体試料中に多量に存在する可能性のあるビリルビン、溶血の影響により測定値に誤差を生じるため問題となっている。影響の原因となる要因としては、（１）ビリルビン、溶血のもつ還元作用、（２）ビリルビン、溶血の吸収極大付近である４００〜４５０ｎｍ付近を測定波長または２波長測定における副波長とする測定においてビリルビン、溶血に起因する吸光度変化、が挙げられる。
【０００３】
これに対し、ビリルビン、溶血の影響を回避する方法がこれまで種々報告されている。ビリルビンの影響回避法としては、フェロシアン化物イオンを用いる方法（特許文献１参照。）、ビリルビン酸化酵素を用いてビリルビンを分解する方法（特許文献２参照。）、主反応の前に多量の過酸化水素を発生させペルオキシダーゼの酸化反応を利用してビリルビンを分解する方法（特許文献３、４参照。）、特定の界面活性剤を用いる方法（特許文献５〜８参照。）などが報告されている。溶血の影響回避法としては、チオ尿素を用いる方法（特許文献９参照。）、ピリジン類、イミダゾール類、ヒスタミン類を用いる方法（特許文献１０参照。）、アルキルスルホン酸塩を用いる方法（特許文献１１参照。）、特定の界面活性剤を用いる方法（特許文献１２参照。）などが報告されている。しかし、これらの方法では、ビリルビン、溶血の影響を一挙に回避することができないこと、また測定系に対する阻害作用があること、また、測定試薬の保存安定性を低下させるなどの問題があるため不十分であった。
【特許文献１】特開昭５５−２５８４０号公報
【特許文献２】特開昭５７−７１３９８号公報
【特許文献３】特開平２−４９６００号公報
【特許文献４】特開平６−３３９３９７号公報
【特許文献５】特開平３−１０６９６号公報
【特許文献６】特公平７−１１５１９号公報
【特許文献７】特開平９−２２４６９７号公報
【特許文献８】特開平１１−２４３９９３号公報
【特許文献９】特公平６−１２９９８号公報
【特許文献１０】特公平３−５６４２５号公報
【特許文献１１】特公平３−５８４６７号公報
【特許文献１２】特開２０００−１８９１９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は生体試料中の特定成分を測定する方法において、ビリルビン、溶血などの還元物質の影響を回避して測定する試薬及び測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明は、生体試料中の成分を測定する方法において、前処理工程で過酸化物を０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上存在させることによる生体成分の測定方法に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ビリルビン、溶血ヘモグロビンなどの影響を回避して測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、生体試料としては、還元性の夾雑物質（以下、還元物質という）を含み、該還元物質が測定対象成分の測定を妨害するものである。このような生体試料としては、血清、尿、血漿等が挙げられる。
【０００８】
生体試料中の測定対象となる成分としては、酸化酵素とペルオキシダーゼを共役させる過酸化水素測定系、すなわち、分析対象物またはその反応生成物に酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼと色原体により、例えばキノンイミン色素に変え、該色素を吸光度測定して比色定量する方法により測定される成分が挙げられる。具体的には中性脂肪、クレアチニン、カルシウム、クレアチン、遊離コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、無機リン、アミラーゼ、GOT，GPT、シアル酸、グアナーゼ等が挙げられる。なお、分析対象物を検出する場合、その分析対象物に直接酸化酵素を作用させる場合もあるが、多くの場合は、酸化酵素及びペルオキシダーゼの他に、更に１種類以上の他の酵素を必要とする。
【０００９】
上記分析対象を測定するための基本原理は、それぞれ種々の方法が知られており、本発明は特に制約なくそれらに適用することが可能である。以下に中性脂肪、クレアチニン及びカルシウムの測定原理を例示する。
【００１０】
【化１】
【００１１】
これらの分析対象を測定するための試薬についても、それぞれ種々の方法が知られている。例えば、上記測定原理に基づくクレアチニン測定試薬として、下記組成を有するものが挙げられる。
第一試薬R1:クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、カタラーゼ、
第二試薬R2: クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体。
【００１２】
つまり、試薬Ｒ１に用いる第１酵素反応で、試料中のクレアチンをクレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、カタラーゼの反応により無色の物質に変換して消去する。次いで第２酵素反応として試薬Ｒ２を試料及び試薬Ｒ１の系に添加して、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、色原体およびペルオキシダーゼの反応により試料中のクレアチニンから有色物質を生成し、該物質を比色定量する。第２酵素反応に共存するカタラーゼは、そのカタラーゼ阻害剤を添加することにより該酵素反応をブロックできる。クレアチニンと同様に中性脂肪の検出においても同様に分析対象物以外に由来する過酸化水素の消去が必要である。
【００１３】
本発明では、前処理液（前処理試薬）と検出開始液（検出試薬）を使用する。
【００１４】
前処理液は、過酸化物を含有し、生体試料に前処理液を加えて還元物質（例えばビリルビン、溶血ヘモグロビン）を測定に影響しないように処理する。
本発明の前処理工程とは、生体試料と前処理液を混合した状態でインキュベーションされる工程を意味し、測定対象物質はそのまま維持されるかまたは検出物質の前段階まで変換され、ビリルビンなどの還元物質はこの工程で分解等されて、測定対象物質の測定に対する影響を低減される。本前処理工程においては試料中の還元物質以外の妨害物質を除去する工程を含んでいてもよい。例えば妨害物質であるアスコルビン酸をアスコルビン酸オキシダーゼを用いて分解する工程が挙げられる。
該前処理液には、過酸化物を含む。過酸化物の量はビリルビン、溶血の還元性、色調変化を低減する濃度であればよく、通常、前処理工程において０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上あればよいが、試薬ブランク反応を低減することを考慮すると０．４ｎｍｏｌ／Ｌ〜５ｎｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、更には０．５〜２ｎｍｏｌ／Ｌとすることがより好ましい。測定対象物質の濃度により試薬ブランクの上昇が懸念される場合は、抗酸化剤を試薬に共存させることで、前処理工程における還元物質（ビリルビン、溶血など）との未反応の過酸化物を不活化することができ、試薬ブランクの上昇を抑制することができる。還元物質（ビリルビン、溶血など）と未反応の残存過酸化物の不活化は、検出開始試薬の添加までに実施されることが好ましく、また検出開始試薬中には過酸化物を含まないことが試薬ブランクの上昇を抑制する観点において望ましい。検出開始試薬中の過酸化物濃度は通常１．５ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは１．０ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００１５】
前処理は、過酸化物を生体試料に加え、２０〜４０℃程度で２〜１０分間程度処理することで行うことができる。
【００１６】
本発明の検出開始試薬とは、ＮＡＤＨ、ＣＮＰ、ＰＮＰ、キノン色素などの検出物質の生成に導く試薬のことを意味する。
【００１７】
本発明に用いられる過酸化物は、過酸化水素を除く過酸化物であれば特に限定されず、有機過酸化物が好ましく例示される。
【００１８】
有機過酸化物（有機過酸化物は、一般に過酸化水素の誘導体、すなわちＨ−Ｏ−Ｏ−Ｈの水素原子を有機原子団で置換した化合物であり、その化学的特徴は −Ｏ−Ｏ−結合に起因している。）としては、例えば化学構造で次のように分類される。ハイドロパーオキサイド（Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｈ）、ジアルキルパーオキサイド（Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｒ）、パーオキシエステル（ＲＣＯ−Ｏ−Ｏ−Ｒ’）、ジアシルパーオキサイド（ＲＣＯ−Ｏ−Ｏ−ＣＯＲ）、パーオキシジカーボネート（ＲＯＣＯ−Ｏ−Ｏ−ＣＯＯＲ）、パーオキシケタール（Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（−Ｒ’）（−Ｒ’’）−Ｏ−Ｏ−Ｒ）、ケトンパーオキサイド（Ｈ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（−Ｒ’）（−Ｒ’’）−Ｏ−Ｏ−Ｈ）。本発明には過酸化脂質が好適に用いられる。
【００１９】
また、界面活性剤には、本来過酸化物は含まれず、適切な流通・保管の下では化学的に変化することもない。しかしながら、意図的に環境を変化させることにより化学反応を起こして過酸化物を生じうるものがあり、例えば微量金属と共存させたり、光を照射することなどの処理を行うことにより、過酸化物を生じさせることができる。微量金属による処理の場合、処理後の金属の除去が困難であることから、光照射処理がより好ましい。このような界面活性剤から得られた過酸化物も本願発明に用いることができる。
【００２０】
なお、界面活性剤がメーカー及び流通業者の品質管理の及ぶ範囲を離れた場合、例えばユーザーにおいて保存条件が適当でない場合は、微量の過酸化物が生じていることがあるが、本発明ではそのような界面活性剤に更に過酸化物を生じさせたものを用いることもできる。
【００２１】
光による具体的な処理の方法は、以下の通りである。例えば、界面活性剤１０ｇを市販の透明試験管に入れ密封し、５００ルクスの光を１０℃で２週間照射する照射するときの条件として、被照射試料の容器、光源、照度、温度、時間等が過酸化物の生成量に影響することから、これらの条件を管理することで過酸化物量の管理が可能である。容器は、不純物の混入を考慮し、蓋付きで透明ガラス材質の容器が好ましく、被処理物質が固形状、フレーク状、のものは特に水溶液状態にして照射するのが望ましい。光源は、蛍光ランプが望ましく白色またはＤ−６５昼光色が用いられる。照度は約３００〜１０００ルクス、温度は２〜３０℃、時間は３日から３週間程度が望ましい。これらの条件は、被処理物質を過酸化物が生成する程度にマイルドに処理することを目的とし、被処理物質を本来の作用を完全に消失させることは想定していない。
【００２２】
これらの方法により得られた過酸化物は物質としての特定は難しいが、後述する方法により過酸化物量の測定が可能であり、処理後、目的の過酸化物量になるように調整して用いればよい。用いる界面活性剤の種類は特に限定されない。
【００２３】
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤または／および両性イオン界面活性剤が好適に用いられる。
【００２４】
本発明で用いる非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００２５】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０等が挙げられる。ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００２６】
本発明で用いる両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらの具体例としては、アンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、等が挙げられる。
【００２７】
過酸化物の測定は、例えば非特許文献１に記載の方法で行なうことができる。
【非特許文献１】Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｊ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ３６５巻、４４８−４５１ページ（１９９９） あるいは、市販の過酸化物測定試薬を使用することにより行なうことができる。（例えば、非特許文献２を参照。）
【非特許文献２】体外診断用医薬品 デタミナーＬＰＯ（協和メデックス社、承認番号（６２ＡＭ）０６６９）の添付文書、平成１４年３月改訂 本発明に用いられる抗酸化剤は、特に限定されないが、測定原理の特性により選択される必要があり、例えばα-トコフェロール、チオグリセロール、ブチルヒドロキシトルエン、メチオニン、酸化酵素として、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ、アルキルハイドロペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどが挙げられる。
【００２８】
抗酸化剤の使用量は、０．００１〜１重量％程度、好ましくは０．００１〜０．１重量％程度である。
【００２９】
尚、本発明の生体成分測定試薬には、防腐剤、キレート剤、フェロシアン化物などの鉄錯体を含んでよい。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１〜４および比較例５〜６）
下記のクレアチニン測定試薬に、過酸化物を濃度を変えて添加した。過酸化物はトリトンＸ−１００ １０ｇを透明試験管に入れ密封し、５００ルクスの光を１０℃、２週間照射して生成させた。トリトンＸ−１００中の過酸化物濃度は、本操作前に０．０７μｍｏｌ／ｇであったが操作後には５μｍｏｌ／ｇとなった。操作前後のトリトンＸ−１００を混合調製して過酸化物濃度水準を作製し、下記クレアチニン測定試薬の第一試薬または第二試薬にトリトンＸ−１００濃度として１ｇ／Ｌになるように添加した。調製後、各試薬の第一試薬、第二試薬の過酸化物の終濃度を測定した。尚、過酸化物濃度は市販の過酸化脂質測定試薬「デタミナーＬＰＯ」（協和メデックス社製）を用い測定は本キットの用法用量のとおり実施した。
【００３１】
このようにして調製されたクレアチニン測定試薬を用い、試料としては精製水、及びビリルビンＣ（抱合型）、ビリルビンＦ（遊離型）、溶血（いずれもシスメックス社・干渉チェックＡプラス）を各々４０ｍｇ／ｄＬ、４０ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬになるように添加したプール血清、及びその対照としてビリルビンＣ、ビリルビンＦ、溶血を添加しないプール血清を用いた。これらの試料の測定結果を、精製水測定吸光度を試薬ブランクとし、ビリルビンＣ、ビリルビンＦ、溶血添加血清の測定値から無添加血清測定値を差引いた値を無添加血清の測定値を１００％として相対％を算出しこれを各還元物質の影響度とした。
（試薬の調製）
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ８０ｍＭ ｐＨ７．５
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製ＳＡＯ−３５１） １０Ｕ／ｍＬ
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＲＨ−２２１） ３０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １００Ｕ／ｍＬ
ＴＯＯＳ ０．２ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ８０ｍＭ ｐＨ７．５
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１） ３００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ５０ｍｇ／Ｌ
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料４μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を６０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
【００３２】
【表１】
【００３３】
結果 表１に示す。比較例では試薬ブランクの上昇、ビリルビン、溶血の影響が大きくなるのに対し、実施例では試薬ブランクは低く、ビリルビン、溶血の影響が低減した。
（実施例７〜１０および比較例１１〜１２）
下記の中性脂肪測定試薬に過酸化物を濃度を変えて添加した。過酸化物は、エマルゲン１０８を用い、実施例１の手順で生成させた。その結果、エマルゲン１０８中の過酸化物濃度は、本操作前に０．０６μｍｏｌ／ｇであったが操作後には３．４μｍｏｌ／ｇとなった。操作前後のエマルゲン１０８を混合調製して過酸化物濃度水準を作製し、下記中性脂肪測定試薬の第一試薬または第二試薬にエマルゲン１０８濃度として１ｇ／Ｌになるように添加した。調製後、各試薬の第一試薬、第二試薬の過酸化物の終濃度を測定した。
【００３４】
このようにして調製された中性脂肪測定試薬を用い、実施例１と同様の試料を測定し、試薬ブランク、ビリルビンＣ、ビリルビンＦ、溶血の影響を検討した。
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 １．２ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
塩化マグネシウム・６水和物 ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｇ／Ｌ
ＡＤＰＳ ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２．９Ｕ／ｍＬ
リパーゼ（東洋紡社製ＬＰＬ−３１４） ２Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ５ｍｇ／Ｌ
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求めた。
【００３５】
【表２】
【００３６】
結果 表２に示す。比較例では試薬ブランクの上昇傾向、溶血の影響の増大がみられるのに対し、実施例では試薬ブランクは低く、溶血の影響はほとんどみられなかった。。
実施例１３〜１６及び比較例１７〜１８
下記のカルシウム測定試薬に過酸化物を濃度を変えて添加した。過酸化物は、ポリオキシエチレンオレイルエーテルを用い、実施例１の手順で生成させた。その結果、ポリオキシエチレンオレイルエーテル中の過酸化物濃度は、本操作前に０．０μｍｏｌ／ｇであったが操作後には２．２μｍｏｌ／ｇとなった。操作前後のポリオキシエチレンオレイルエーテルを混合調製して過酸化物濃度水準を作製し、下記カルシウム測定試薬の第一試薬または第二試薬にポリオキシエチレンオレイルエーテル濃度として１ｇ／Ｌになるように添加した。調製後、各試薬の第一試薬、第二試薬の過酸化物の終濃度を測定した。
このようにして調製されたカルシウム測定試薬を用い、実施例１と同様の試料を測定し、試薬ブランク、ビリルビンＣ、ビリルビンＦ、溶血の影響を検討した。
第一試薬
トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．１） ５０ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ
ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル-α-マルトシド ０．９ｍＭ
第二試薬
グッド緩衝液（ｐＨ６．０） ３００ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ
不活性化型α−アミラーゼ（ヒト唾液由来） ２０ＩＵ／ｍＬ
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料量３．５μｌに第一試薬１８０μｌ加え、５分間予備加温した後、さらに第二試薬９０μｌを加えて反応を開始させ、該基質試液添加後２分後からの３分間における１分あたりの吸光度変化を求め、精製水およびカルシウム１０ｍｇ／ｄｌ標準液での２点検量線に基づき試料中のカルシウム量を求めた。測定波長は、主波長４０５ｎｍ、副波長５４６ｎｍとし、測定温度は３７℃で実施した。
【００３７】
【表３】
【００３８】
結果 表３に示す。比較例では溶血の影響が大きいのに対し、実施例ではほとんど影響はみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の生体成分測定用試薬及び測定方法は、体外診断用医薬品などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清、尿、血漿等の生体試料中の特定成分を測定する方法において、ビリルビン、溶血ヘモグロビンによりもたらされる（１）劣化して着色することにより比色法測定に与える影響、（２）酸化還元反応に与える影響、の両方を回避して測定する試薬及び測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野において吸光度測定による成分分析が広く行なわれている。方法としては脱水素酵素を用い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを指示物質として用いる方法（脱水素酵素法）、酸化酵素を用い生成した過酸化水素と、ペルオキシダーゼにより発色剤を色素に導き比色定量する方法（酸化酵素法）、発色基を導入した基質を用い、酵素の反応により生成した発色体の増加速度を測定する方法（合成基質法）などがある。これらの方法では生体試料中に多量に存在する可能性のあるビリルビン、溶血の影響により測定値に誤差を生じるため問題となっている。影響の原因となる要因としては、（１）ビリルビン、溶血のもつ還元作用、（２）ビリルビン、溶血の吸収極大付近である４００〜４５０ｎｍ付近を測定波長または２波長測定における副波長とする測定においてビリルビン、溶血に起因する吸光度変化、が挙げられる。
【０００３】
これに対し、ビリルビン、溶血の影響を回避する方法がこれまで種々報告されている。ビリルビンの影響回避法としては、フェロシアン化物イオンを用いる方法（特許文献１参照。）、ビリルビン酸化酵素を用いてビリルビンを分解する方法（特許文献２参照。）、主反応の前に多量の過酸化水素を発生させペルオキシダーゼの酸化反応を利用してビリルビンを分解する方法（特許文献３、４参照。）、特定の界面活性剤を用いる方法（特許文献５〜８参照。）などが報告されている。溶血の影響回避法としては、チオ尿素を用いる方法（特許文献９参照。）、ピリジン類、イミダゾール類、ヒスタミン類を用いる方法（特許文献１０参照。）、アルキルスルホン酸塩を用いる方法（特許文献１１参照。）、特定の界面活性剤を用いる方法（特許文献１２参照。）などが報告されている。しかし、これらの方法では、ビリルビン、溶血の影響を一挙に回避することができないこと、また測定系に対する阻害作用があること、また、測定試薬の保存安定性を低下させるなどの問題があるため不十分であった。
【特許文献１】特開昭５５−２５８４０号公報
【特許文献２】特開昭５７−７１３９８号公報
【特許文献３】特開平２−４９６００号公報
【特許文献４】特開平６−３３９３９７号公報
【特許文献５】特開平３−１０６９６号公報
【特許文献６】特公平７−１１５１９号公報
【特許文献７】特開平９−２２４６９７号公報
【特許文献８】特開平１１−２４３９９３号公報
【特許文献９】特公平６−１２９９８号公報
【特許文献１０】特公平３−５６４２５号公報
【特許文献１１】特公平３−５８４６７号公報
【特許文献１２】特開２０００−１８９１９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は生体試料中の特定成分を測定する方法において、ビリルビン、溶血などの還元物質の影響を回避して測定する試薬及び測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明は、生体試料中の成分を測定する方法において、前処理工程で過酸化物を０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上存在させることによる生体成分の測定方法に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ビリルビン、溶血ヘモグロビンなどの影響を回避して測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、生体試料としては、還元性の夾雑物質（以下、還元物質という）を含み、該還元物質が測定対象成分の測定を妨害するものである。このような生体試料としては、血清、尿、血漿等が挙げられる。
【０００８】
生体試料中の測定対象となる成分としては、酸化酵素とペルオキシダーゼを共役させる過酸化水素測定系、すなわち、分析対象物またはその反応生成物に酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼと色原体により、例えばキノンイミン色素に変え、該色素を吸光度測定して比色定量する方法により測定される成分が挙げられる。具体的には中性脂肪、クレアチニン、カルシウム、クレアチン、遊離コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、無機リン、アミラーゼ、GOT，GPT、シアル酸、グアナーゼ等が挙げられる。なお、分析対象物を検出する場合、その分析対象物に直接酸化酵素を作用させる場合もあるが、多くの場合は、酸化酵素及びペルオキシダーゼの他に、更に１種類以上の他の酵素を必要とする。
【０００９】
上記分析対象を測定するための基本原理は、それぞれ種々の方法が知られており、本発明は特に制約なくそれらに適用することが可能である。以下に中性脂肪、クレアチニン及びカルシウムの測定原理を例示する。
【００１０】
【化１】
【００１１】
これらの分析対象を測定するための試薬についても、それぞれ種々の方法が知られている。例えば、上記測定原理に基づくクレアチニン測定試薬として、下記組成を有するものが挙げられる。
第一試薬R1:クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、カタラーゼ、
第二試薬R2: クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体。
【００１２】
つまり、試薬Ｒ１に用いる第１酵素反応で、試料中のクレアチンをクレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、カタラーゼの反応により無色の物質に変換して消去する。次いで第２酵素反応として試薬Ｒ２を試料及び試薬Ｒ１の系に添加して、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、色原体およびペルオキシダーゼの反応により試料中のクレアチニンから有色物質を生成し、該物質を比色定量する。第２酵素反応に共存するカタラーゼは、そのカタラーゼ阻害剤を添加することにより該酵素反応をブロックできる。クレアチニンと同様に中性脂肪の検出においても同様に分析対象物以外に由来する過酸化水素の消去が必要である。
【００１３】
本発明では、前処理液（前処理試薬）と検出開始液（検出試薬）を使用する。
【００１４】
前処理液は、過酸化物を含有し、生体試料に前処理液を加えて還元物質（例えばビリルビン、溶血ヘモグロビン）を測定に影響しないように処理する。
本発明の前処理工程とは、生体試料と前処理液を混合した状態でインキュベーションされる工程を意味し、測定対象物質はそのまま維持されるかまたは検出物質の前段階まで変換され、ビリルビンなどの還元物質はこの工程で分解等されて、測定対象物質の測定に対する影響を低減される。本前処理工程においては試料中の還元物質以外の妨害物質を除去する工程を含んでいてもよい。例えば妨害物質であるアスコルビン酸をアスコルビン酸オキシダーゼを用いて分解する工程が挙げられる。
該前処理液には、過酸化物を含む。過酸化物の量はビリルビン、溶血の還元性、色調変化を低減する濃度であればよく、通常、前処理工程において０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上あればよいが、試薬ブランク反応を低減することを考慮すると０．４ｎｍｏｌ／Ｌ〜５ｎｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、更には０．５〜２ｎｍｏｌ／Ｌとすることがより好ましい。測定対象物質の濃度により試薬ブランクの上昇が懸念される場合は、抗酸化剤を試薬に共存させることで、前処理工程における還元物質（ビリルビン、溶血など）との未反応の過酸化物を不活化することができ、試薬ブランクの上昇を抑制することができる。還元物質（ビリルビン、溶血など）と未反応の残存過酸化物の不活化は、検出開始試薬の添加までに実施されることが好ましく、また検出開始試薬中には過酸化物を含まないことが試薬ブランクの上昇を抑制する観点において望ましい。検出開始試薬中の過酸化物濃度は通常１．５ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは１．０ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００１５】
前処理は、過酸化物を生体試料に加え、２０〜４０℃程度で２〜１０分間程度処理することで行うことができる。
【００１６】
本発明の検出開始試薬とは、ＮＡＤＨ、ＣＮＰ、ＰＮＰ、キノン色素などの検出物質の生成に導く試薬のことを意味する。
【００１７】
本発明に用いられる過酸化物は、過酸化水素を除く過酸化物であれば特に限定されず、有機過酸化物が好ましく例示される。
【００１８】
有機過酸化物（有機過酸化物は、一般に過酸化水素の誘導体、すなわちＨ−Ｏ−Ｏ−Ｈの水素原子を有機原子団で置換した化合物であり、その化学的特徴は −Ｏ−Ｏ−結合に起因している。）としては、例えば化学構造で次のように分類される。ハイドロパーオキサイド（Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｈ）、ジアルキルパーオキサイド（Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｒ）、パーオキシエステル（ＲＣＯ−Ｏ−Ｏ−Ｒ’）、ジアシルパーオキサイド（ＲＣＯ−Ｏ−Ｏ−ＣＯＲ）、パーオキシジカーボネート（ＲＯＣＯ−Ｏ−Ｏ−ＣＯＯＲ）、パーオキシケタール（Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（−Ｒ’）（−Ｒ’’）−Ｏ−Ｏ−Ｒ）、ケトンパーオキサイド（Ｈ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（−Ｒ’）（−Ｒ’’）−Ｏ−Ｏ−Ｈ）。本発明には過酸化脂質が好適に用いられる。
【００１９】
また、界面活性剤には、本来過酸化物は含まれず、適切な流通・保管の下では化学的に変化することもない。しかしながら、意図的に環境を変化させることにより化学反応を起こして過酸化物を生じうるものがあり、例えば微量金属と共存させたり、光を照射することなどの処理を行うことにより、過酸化物を生じさせることができる。微量金属による処理の場合、処理後の金属の除去が困難であることから、光照射処理がより好ましい。このような界面活性剤から得られた過酸化物も本願発明に用いることができる。
【００２０】
なお、界面活性剤がメーカー及び流通業者の品質管理の及ぶ範囲を離れた場合、例えばユーザーにおいて保存条件が適当でない場合は、微量の過酸化物が生じていることがあるが、本発明ではそのような界面活性剤に更に過酸化物を生じさせたものを用いることもできる。
【００２１】
光による具体的な処理の方法は、以下の通りである。例えば、界面活性剤１０ｇを市販の透明試験管に入れ密封し、５００ルクスの光を１０℃で２週間照射する照射するときの条件として、被照射試料の容器、光源、照度、温度、時間等が過酸化物の生成量に影響することから、これらの条件を管理することで過酸化物量の管理が可能である。容器は、不純物の混入を考慮し、蓋付きで透明ガラス材質の容器が好ましく、被処理物質が固形状、フレーク状、のものは特に水溶液状態にして照射するのが望ましい。光源は、蛍光ランプが望ましく白色またはＤ−６５昼光色が用いられる。照度は約３００〜１０００ルクス、温度は２〜３０℃、時間は３日から３週間程度が望ましい。これらの条件は、被処理物質を過酸化物が生成する程度にマイルドに処理することを目的とし、被処理物質を本来の作用を完全に消失させることは想定していない。
【００２２】
これらの方法により得られた過酸化物は物質としての特定は難しいが、後述する方法により過酸化物量の測定が可能であり、処理後、目的の過酸化物量になるように調整して用いればよい。用いる界面活性剤の種類は特に限定されない。
【００２３】
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤または／および両性イオン界面活性剤が好適に用いられる。
【００２４】
本発明で用いる非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００２５】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０等が挙げられる。ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００２６】
本発明で用いる両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらの具体例としては、アンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、等が挙げられる。
【００２７】
過酸化物の測定は、例えば非特許文献１に記載の方法で行なうことができる。
【非特許文献１】Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｊ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ３６５巻、４４８−４５１ページ（１９９９） あるいは、市販の過酸化物測定試薬を使用することにより行なうことができる。（例えば、非特許文献２を参照。）
【非特許文献２】体外診断用医薬品 デタミナーＬＰＯ（協和メデックス社、承認番号（６２ＡＭ）０６６９）の添付文書、平成１４年３月改訂 本発明に用いられる抗酸化剤は、特に限定されないが、測定原理の特性により選択される必要があり、例えばα-トコフェロール、チオグリセロール、ブチルヒドロキシトルエン、メチオニン、酸化酵素として、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ、アルキルハイドロペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどが挙げられる。
【００２８】
抗酸化剤の使用量は、０．００１〜１重量％程度、好ましくは０．００１〜０．１重量％程度である。
【００２９】
尚、本発明の生体成分測定試薬には、防腐剤、キレート剤、フェロシアン化物などの鉄錯体を含んでよい。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１〜４および比較例５〜６）
下記のクレアチニン測定試薬に、過酸化物を濃度を変えて添加した。過酸化物はトリトンＸ−１００ １０ｇを透明試験管に入れ密封し、５００ルクスの光を１０℃、２週間照射して生成させた。トリトンＸ−１００中の過酸化物濃度は、本操作前に０．０７μｍｏｌ／ｇであったが操作後には５μｍｏｌ／ｇとなった。操作前後のトリトンＸ−１００を混合調製して過酸化物濃度水準を作製し、下記クレアチニン測定試薬の第一試薬または第二試薬にトリトンＸ−１００濃度として１ｇ／Ｌになるように添加した。調製後、各試薬の第一試薬、第二試薬の過酸化物の終濃度を測定した。尚、過酸化物濃度は市販の過酸化脂質測定試薬「デタミナーＬＰＯ」（協和メデックス社製）を用い測定は本キットの用法用量のとおり実施した。
【００３１】
このようにして調製されたクレアチニン測定試薬を用い、試料としては精製水、及びビリルビンＣ（抱合型）、ビリルビンＦ（遊離型）、溶血（いずれもシスメックス社・干渉チェックＡプラス）を各々４０ｍｇ／ｄＬ、４０ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬになるように添加したプール血清、及びその対照としてビリルビンＣ、ビリルビンＦ、溶血を添加しないプール血清を用いた。これらの試料の測定結果を、精製水測定吸光度を試薬ブランクとし、ビリルビンＣ、ビリルビンＦ、溶血添加血清の測定値から無添加血清測定値を差引いた値を無添加血清の測定値を１００％として相対％を算出しこれを各還元物質の影響度とした。
（試薬の調製）
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ８０ｍＭ ｐＨ７．５
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製ＳＡＯ−３５１） １０Ｕ／ｍＬ
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＲＨ−２２１） ３０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） １００Ｕ／ｍＬ
ＴＯＯＳ ０．２ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ８０ｍＭ ｐＨ７．５
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１） ３００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ５０ｍｇ／Ｌ
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料４μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を６０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
【００３２】
【表１】
【００３３】
結果 表１に示す。比較例では試薬ブランクの上昇、ビリルビン、溶血の影響が大きくなるのに対し、実施例では試薬ブランクは低く、ビリルビン、溶血の影響が低減した。
（実施例７〜１０および比較例１１〜１２）
下記の中性脂肪測定試薬に過酸化物を濃度を変えて添加した。過酸化物は、エマルゲン１０８を用い、実施例１の手順で生成させた。その結果、エマルゲン１０８中の過酸化物濃度は、本操作前に０．０６μｍｏｌ／ｇであったが操作後には３．４μｍｏｌ／ｇとなった。操作前後のエマルゲン１０８を混合調製して過酸化物濃度水準を作製し、下記中性脂肪測定試薬の第一試薬または第二試薬にエマルゲン１０８濃度として１ｇ／Ｌになるように添加した。調製後、各試薬の第一試薬、第二試薬の過酸化物の終濃度を測定した。
【００３４】
このようにして調製された中性脂肪測定試薬を用い、実施例１と同様の試料を測定し、試薬ブランク、ビリルビンＣ、ビリルビンＦ、溶血の影響を検討した。
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ／Ｌ
アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 １．２ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
塩化マグネシウム・６水和物 ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｇ／Ｌ
ＡＤＰＳ ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２．９Ｕ／ｍＬ
リパーゼ（東洋紡社製ＬＰＬ−３１４） ２Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ５ｍｇ／Ｌ
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求めた。
【００３５】
【表２】
【００３６】
結果 表２に示す。比較例では試薬ブランクの上昇傾向、溶血の影響の増大がみられるのに対し、実施例では試薬ブランクは低く、溶血の影響はほとんどみられなかった。。
実施例１３〜１６及び比較例１７〜１８
下記のカルシウム測定試薬に過酸化物を濃度を変えて添加した。過酸化物は、ポリオキシエチレンオレイルエーテルを用い、実施例１の手順で生成させた。その結果、ポリオキシエチレンオレイルエーテル中の過酸化物濃度は、本操作前に０．０μｍｏｌ／ｇであったが操作後には２．２μｍｏｌ／ｇとなった。操作前後のポリオキシエチレンオレイルエーテルを混合調製して過酸化物濃度水準を作製し、下記カルシウム測定試薬の第一試薬または第二試薬にポリオキシエチレンオレイルエーテル濃度として１ｇ／Ｌになるように添加した。調製後、各試薬の第一試薬、第二試薬の過酸化物の終濃度を測定した。
このようにして調製されたカルシウム測定試薬を用い、実施例１と同様の試料を測定し、試薬ブランク、ビリルビンＣ、ビリルビンＦ、溶血の影響を検討した。
第一試薬
トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．１） ５０ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ
ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル-α-マルトシド ０．９ｍＭ
第二試薬
グッド緩衝液（ｐＨ６．０） ３００ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ
不活性化型α−アミラーゼ（ヒト唾液由来） ２０ＩＵ／ｍＬ
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料量３．５μｌに第一試薬１８０μｌ加え、５分間予備加温した後、さらに第二試薬９０μｌを加えて反応を開始させ、該基質試液添加後２分後からの３分間における１分あたりの吸光度変化を求め、精製水およびカルシウム１０ｍｇ／ｄｌ標準液での２点検量線に基づき試料中のカルシウム量を求めた。測定波長は、主波長４０５ｎｍ、副波長５４６ｎｍとし、測定温度は３７℃で実施した。
【００３７】
【表３】
【００３８】
結果 表３に示す。比較例では溶血の影響が大きいのに対し、実施例ではほとんど影響はみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の生体成分測定用試薬及び測定方法は、体外診断用医薬品などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の成分を測定する方法において、
（１）０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上の過酸化物の存在下に生体試料を前処理する工程；及び
（２）１．５ｎｍｏｌ／Ｌ以下の過酸化物の存在下に工程（１）で前処理された生体試料中の成分を測定する工程
を包含する方法。
【請求項２】
０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上の過酸化物と抗酸化剤を共存させて前処理工程（１）を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上の過酸化物を含む生体試料の前処理液と、１．５ｎｍｏｌ／Ｌ以下の過酸化物を含む生体成分の検出開始液を含む生体成分の測定試薬。
【請求項４】
前処理液がさらに抗酸化剤を含むことを特徴とする請求項３に記載の測定試薬。
【請求項１】
生体試料中の成分を測定する方法において、
（１）０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上の過酸化物の存在下に生体試料を前処理する工程；及び
（２）１．５ｎｍｏｌ／Ｌ以下の過酸化物の存在下に工程（１）で前処理された生体試料中の成分を測定する工程
を包含する方法。
【請求項２】
０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上の過酸化物と抗酸化剤を共存させて前処理工程（１）を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
０．４ｎｍｏｌ／Ｌ以上の過酸化物を含む生体試料の前処理液と、１．５ｎｍｏｌ／Ｌ以下の過酸化物を含む生体成分の検出開始液を含む生体成分の測定試薬。
【請求項４】
前処理液がさらに抗酸化剤を含むことを特徴とする請求項３に記載の測定試薬。
【公開番号】特開２００６−８１４７１（Ｐ２００６−８１４７１Ａ）
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２６９７２４（Ｐ２００４−２６９７２４）
【出願日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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