生体材料の保存方法
【課題】保存による十分な酸化の抑制や、細胞障害の十分な軽減を達成する生体材料の保存方法を提供する。
【解決手段】生体材料の保存方法は、生体材料に対して直流電圧と交流電圧とを同時にかける電圧同時印加ステップを含むことを特徴とする。この電圧同時印加ステップは、生体材料の少なくとも周囲を囲む収容器に生体材料を収容し、前記収容器の外部の一面に、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板上を沿わせることで、生体材料を間接的に電圧印加するものであることが好ましい。
【解決手段】生体材料の保存方法は、生体材料に対して直流電圧と交流電圧とを同時にかける電圧同時印加ステップを含むことを特徴とする。この電圧同時印加ステップは、生体材料の少なくとも周囲を囲む収容器に生体材料を収容し、前記収容器の外部の一面に、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板上を沿わせることで、生体材料を間接的に電圧印加するものであることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、血液、細胞、組織、及び臓器を含む、生体材料の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物及び動物由来物の保存方法として、１００Ｖないし５０００Ｖの交流又は直流電圧を電極に印加して静電場雰囲気を形成し、−２０℃〜−４０℃でこの静電場雰囲気内におくことによる保存方法が開示されていた。これは、１００Ｖ〜５０００Ｖ、好ましくは１００Ｖ〜３０００Ｖの交流又は直流電圧の静電場雰囲気に保存することにより、微生物又は動物由来物が有する活性を不活化若しくは不活性化させることなく、又は死滅化させることなく保存することができる、とされるものである（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１１２８３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の保存方法では、電流電圧のかけ方について、電流は交流、直流のいずれであってもよいとされ、１００Ｖ、５００Ｖ、１０００Ｖ等といった各電圧値の他に、有効な電圧印加方法の特定はされていなかった。また上記従来の保存方法では、長期間の間自然に近い状態で、微生物又は動物由来物が有する活性を不活化若しくは不活性化させることなく、又は死滅化させることなく保存することに主眼を置いたものであった。このため、保存による酸化の抑制や細胞障害の軽減が十分にできるものとはいいきれなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決すべく、本発明では下記（１）ないし（３）の手段を採用するものとしている。すなわち、
（１）本発明の生体材料Ｏの保存方法は、生体材料Ｏに対して直流電圧と交流電圧とを同時にかける電圧同時印加ステップを含むことを特徴とする。
特に、直流電圧、交流電圧いずれも５０００Ｖを越えない電圧であることが好ましい。
【０００６】
（２）また、前記生体材料Ｏの保存方法において、電圧同時印加ステップが、生体材料Ｏの少なくとも周囲を囲む収容器１に生体材料Ｏを収容し、前記収容器１の外部の一面に、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板２上を（直接又は間接的に）沿わせることで、生体材料Ｏを間接的に電圧印加するものであることが好ましい。
【０００７】
（３）また、前記いずれかの生体材料Ｏの保存方法において、電圧同時印加ステップが、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板２上に、生体材料Ｏを入れた厚さ１０ｍｍ以上（少なくとも底厚１０ｍｍ、壁厚１５ｍｍ以上、好ましくは底厚、壁厚共に１５ｍｍ程度）の導電性金属からなる収容器１を積置することによるものであることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
上記構成を採用することで、保存中の生体材料Ｏの溶存酸素を不活性化させることで、より効果的な保存による酸化の抑制や細胞障害の軽減が達成される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１の生体材料の保存方法における、印加板、収容器及び電極の保存時の状態例を示す斜視説明図である。
【図２】図１に示す実施例１の状態例に、更に保存庫を含めた保存時の全体構成を示す正面視断面説明図である。
【図３】実施例２の生体材料の保存方法における、印加板、収容器及び電極の保存時の状態例を示す斜視説明図である。
【図４】図３に示す実施例２の状態例に、更に保存庫を含めた保存時の全体構成を示す正面視断面説明図である。
【図５】実施例３の生体材料の保存方法における保存時の（保存庫を含む）全体構成を示す概念説明図である。
【図６】実験１の、室温保存によるラット血清脂質過酸化反応の抑制に関するデータを示す図である。
【図７】実験２の、ヒト赤血球凍結における直流交流同時印加の優位性に関するデータを示す図である。
【図８】実験３の、ヒト赤血球凍結における電圧印加の至適条件に関するデータを示す図である。
【図９】実験４の、細胞培養による酸化ストレス下での細胞死の比較に関するデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。図１は、実施例１の生体材料Ｏの保存方法における、印加板２、収容器１及び電極の保存時の状態例を示す斜視説明図である。図２は、図１に示す実施例１の状態例に、更に保存庫４を含めた保存時の全体構成を示す正面視断面説明図である。図３は、実施例２の生体材料Ｏの保存方法における、印加板２、収容器１及び電極の保存時の状態例を示す斜視説明図である。図４は、図３に示す実施例２の状態例に、更に保存庫４を含めた保存時の全体構成を示す正面視断面説明図である。図５は、実施例３の生体材料Ｏの保存方法における保存時の（保存庫４を含む）全体構成を示す概念説明図である。図６ないし図９はそれぞれ、実験１ないし実験４によるデータを示す図である。具体的には、図６が、室温保存によるラット血清脂質過酸化反応の抑制に関する実験１のデータである。また、図７が、ヒト赤血球凍結における直流交流同時印加の優位性に関する実験２のデータであり、図８が、ヒト赤血球凍結における電圧印加の至適条件に関する実験３のデータであり、図９が、細胞培養による酸化ストレス下での細胞死の比較に関する実験４のデータである。
【００１１】
（「血液、細胞、組織、及び臓器の保存」という言葉の及ぶ範囲について）
「生体材料Ｏの保存」という言葉の及ぶ範囲に関し、本発明の「生体材料Ｏ」には、血液、細胞、組織、及び臓器のいずれもが含まれる。また、「生体材料Ｏの保存」という言葉の及ぶ範囲に関し、本発明の「保存」には次の３つの意味が含まれる。
（１）室温保存（４℃から２０℃（室温））
（２）凍結保存（−２０℃から−１９６℃（液体窒素の温度））
（３）細胞の培養保存（３７℃）
後述する実験１（図６）は、ラットの血清を上記１）室温保存したものである。また実験２（図７）及び３（図８）は、ヒト赤血球の凍結保存である。なお、（実験２）と（実験３）は同じ実験であるが、（実験２）の方はα（交流）単独とβ（直流）単独及びαβ併用とを比較したもので、（実験３）は同時印加の至適条件を調べたものである。実験４（図９）は（３）の培養保存である。
【実施例１】
【００１２】
本発明の実施例１の生体材料Ｏの保存方法は、生体材料Ｏに対して図1及び図２に示す保存装置によって、直流電圧と交流電圧とを同時に、すなわち重畳的にかける電圧同時印加ステップを含むことを特徴とする。この電圧同時印加ステップは、収容器１たるチューブスタンド型保持器に生体材料Ｏを収容し、前記収容器１の外部の一面に、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板２上を直接接触させて沿わせることで、生体材料Ｏを間接的に電圧印加するものである。なお、収容器１と印加板２とを接触させず、印加板２を間接的に沿わせる保存状態でも良い。
【００１３】
本発明の同時電圧印加を行う場合、例えば収容器１に直接電極を繋ぐことによる電圧印加や、生体材料Ｏを印加板２に直接載置することによる電圧印加よりも、前記のような間接的な電圧印加のほうが、効率的に、均等な電圧印加効果を得られることが判った。
【００１４】
具体的には、電圧同時印加ステップは、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板２上に、生体材料Ｏを入れた収容器１（実施例１の収容器１はチューブスタンド型保持器）を積置することによる。
【００１５】
（収容器１）
収容器１は、生体材料Ｏの少なくとも周囲を囲むようにして生体材料Ｏを収容する容器であり、導電性金属、特に高伝導性の金属を主成分としてなる。実施例１では、純度８０％以上のアルミニウムを主成分とする金属からなる。具体的には、６０ｍｍ厚さのアルミニウム板に、生体材料Ｏを収容するための収容穴１ｈを８個、所定の穴間隔を開けてくりぬいた、チューブスタンド型保持器である。
【００１６】
（収容穴１ｈ）
収容穴１ｈは、収容器１の少なくとも壁及び底（好ましくは更に蓋）に覆われて、収容した生体材料Ｏの、少なくとも周囲四方向及び下面方向（好ましくは更に上面）を囲うように構成される。但し、ここでいう底（或いは生体材料Ｏからみた下面方向）とは、電圧印加される印加板２をそわせる構成板をいう。
【００１７】
収容穴１ｈ内の生体材料Ｏからみたとき、間接的な電圧印加の作用する方向（下面方向）を導電板（底板）で覆い、かつ、少なくとも、同方向と逆の方向（上面方向）を除いた、すべての側面方）を導電板（四方に連なる壁板）で覆うこととなる。
【００１８】
実施例１の収容穴１ｈは、円柱状にくりぬいた円柱穴からなる。生体材料Ｏが血液の場合、この収容穴１ｈに、試験管に入れた血液を収容するか、或いは血液を直接収容する。収容穴１ｈは穴のいずれの深さにおける断面も等しいことが好ましい。
【００１９】
（壁厚及び底厚）
同時印加による効果のために、収容器１の構成材料の厚さは、１０ｍｍ以上（少なくとも底厚１０ｍｍ、壁厚１５ｍｍ以上、好ましくは底厚、壁厚共に１５ｍｍ程度）であることが好ましい。
【００２０】
実施例１では、平面視縦方向の最小壁厚１ａ（収容穴１ｈ側端から収容器１の正面側面（又は背面側面）までの水平方向最小距離）が１５ｍｍ、
平面視横方向の最小壁厚１ｂ（収容穴１ｈ側端から収容器１の右側面（又は左側面）までの水平方向最小距離）が３０ｍｍ、
高さ方向の最小底厚１ｃ（収容穴１ｈ底から収容器１の底面までの鉛直方向最小距離）が１５ｍｍ、
収容穴１ｈ断面の代表長１ｄ（円形の収容穴１ｈ断面の径、方形の収容穴１ｈ断面の長辺）が１４ｍｍ、
収容穴１ｈ間の最小壁厚１ｅ（隣り合う第一の収容穴１ｈ側端から、隣り合う第二の収容穴１ｈ側端までの水平方向最小距離）が１５ｍｍである。
【００２１】
（印加板２）
印加板２は、導電性材料からなる板であり、一対の電気配線３による電極をそれぞれ対称位置に配してなる。電気配線３は、直流及び交流共に共通配線３としてなり、電極もまた直流及び交流を共有するものとして配される。これにより、同時印加によって、交流電圧の一部が直流電圧に重畳的に変換され、交流電圧の設定値よりも実際の（生体材料Ｏへの）交流電圧の実効値が低くなり、その分、直流電圧の設定値よりも実際の（生体材料Ｏへの）直流電圧の実効値が高くなる。
【００２２】
印加電圧は、直流、交流いずれも５０００Ｖを超えないことが好ましい。さらにいえば、交流電圧の設定値が５００ないし２５００Ｖ、直流電圧の設定値が２００ないし１０００Ｖであることが好ましい。また、直流電圧はマイナスであることが好ましく、さらに交流電圧の設定値よりも、直流電圧の設定値（の絶対値）のほうが大きいことが好ましい。
【００２３】
また、交流と直流の各電圧値の組合せについて好ましくは、直流電圧の設定値が１０００Ｖ程度又は３０００Ｖ程度のとき、交流電圧の設定値が５００ないし５５０Ｖ程度であることが好ましい。
【００２４】
但し、上記及び本発明にいう設定値とは、交流又は直流いずれか単独で電圧をかけたときの、実際の生体材料Ｏへの実効値をいう。
【００２５】
（保存庫４）
印加板２は、図２に示すような、保存棚月の保存庫４のうえに載置し、この状態で生体材料Ｏを保存する。
【実施例２】
【００２６】
実施例２では、電圧同時印加ステップとして、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板２上に、生体材料Ｏを入れた底厚、壁厚共に１５ｍｍの収容器１（実施例２の収容器１は升型保持器）を積置することによる。実施例２の収容器１を用いた電圧の同時印加保存によれば、容積の比較的大きな生体材料Ｏであっても、その他の構成は実施例１と同様である。
【実施例３】
【００２７】
実施例３では、実施例１と比較して、収容器１の代わりに所定の袋材厚以上の収容袋を用いている。但し収容袋の内面には、導電性材料が塗布或いはラミネートされており、生体材料Ｏとほぼ全方向で接触することで、同時印加による効果を効率的に得るものとしている。生体材料Ｏには、図のＡで示す直流電圧によるイオン誘引方向と、Ｂの矢印で示す交流電圧によるイオン誘引方向とが重畳的にかかる。
【００２８】
上記各実施例は、本発明の保存方法を達成するための例に過ぎず、必ずしも上記構成に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能である。
【００２９】
（実験１「電圧印加によるラット血清脂質過酸化反応の抑制」（図６））
実験1として、ラットの血清を室温保存し、過酸化脂質量を測定した。
【００３０】
（実験１の実験方法）
ラット末梢血より血清を分離し、試料とした。試料をチューブに分注し、室温（２０度）にて１２時間静置、保存した。この際に印加板にα（交流）２０２０Ｖ、β（直流）３０００Ｖの電圧を印加し、試料を印加板の上で印加しつつ保存した。12時間の保存の後、ＴＢＡＲＳ法（チオバルビツール酸反応物質法）を用いて過酸化脂質量を測定し、印加していない試料と比較した。ＴＢＡＲＳ法での測定では、試料中の過酸化脂質が分解してできるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）がチオバルビツール酸と反応して赤色反応物をつくることを利用し、分光光度計にてその吸光度（５２５ｎｍ）を測定する。測定ではＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３０００を用いて吸光度を測定し、その吸光度をもってそれぞれの群間で比較した。
【００３１】
（実験１の結果）
交流直流の電圧を印加した試料中の過酸化脂質量は、印加していない試料と比較して有意に吸光度が低く、過酸化脂質の産生が抑制されていることが示された。
【００３２】
このことは、電圧印加によって、血清中の脂質の酸化が抑制されていることを示している。
【００３３】
（実験２）「ヒト赤血球凍結における交流直流同時印加の優位性」（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＮＩＣＥ０１ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｏｎ ＲＢＣ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ（ＮＩＣＥ０１とは、本願発明の実施例１の保存装置を示す）と題された図７参照）
（実験２の実験方法）
ボランティアより採血して得られたヒト末梢血洗浄赤血球に凍結保存液（アルブミン加ＣＰ−１、極東製薬社）を等量添加した後に、−２０度で３時間かけて凍結した。この際に冷凍庫内にアルミニウム製印加板を設置し、本発明の実施例１の電圧印加保存装置を用い、交流電圧（α５：９８０V）のみの単独印加、直流電圧（β８：３０００V）のみの単独印加、交流直流同時（重畳）印加（α５β８）の３群それぞれについて電場を作製し、印加板の上で凍結を行なった。
【００３４】
凍結サンプルはその後−８０度のフリーザー内で２週間保存し、３７度恒温槽にて解凍の後、遠心分離を行い、その上清中のＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）量を測定した。ＬＤＨ測定はＰｒｏｍｅｇａ社製のＬＤＨ ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて測定し、吸光度はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製のＴＥＲＭＯ ＭＡＸ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて測定した。測定結果を、交流電圧（α５：９８０V）単独印加、直流電圧（β８：３０００V）単独印加、及び交流直流同時（重畳）印加（α５β８）の３群間で比較した。
【００３５】
（実験２の結果）
凍結解凍後に末梢血赤血球より逸脱したＬＤＨは、交流単独、直流単独また交流直流併用群のいずれの群においても電圧印加（−）よりも減少しており、細胞障害が少ないことが示された。また、交流直流併用において、交流単独、また直流単独よりも有意に細胞障害の低下が認められた。
この結果より、電圧印加凍結における細胞障害の軽減はα及びβの両者を同時印加した際に、より顕著にみられることが確認された。
【００３６】
（実験３：「ヒト赤血球凍結における電圧印加の至適条件」（図８））
（実験３の実験方法）
実験２と同様、ボランティアより採血して得られたヒト末梢血洗浄赤血球に凍結保存液（アルブミン加ＣＰ−１、極東製薬社）を等量添加した後に、−２０度で３時間かけて凍結した。この際に冷凍庫内にアルミニウム製印加板を設置し、本発明の実施例１の電圧印加保存装置を用い、表１に示す交流電圧（α）と、表２に示す直流電圧（β）の両者を印加し電場を作製し、印加板の上で凍結を行なった。電圧印加はαとβをそれぞれ、図８に示す組合せで行った。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
凍結サンプルはその後−８０度のフリーザー内で２週間保存し、３７度恒温槽にて解凍の後、遠心分離を行い、その上清中のＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）量を測定した。ＬＤＨ測定はＰｒｏｍｅｇａ社製のＬＤＨ ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて測定し、吸光度はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製のＴＥＲＭＯ ＭＡＸ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて測定した。このとき、吸光度自体は、測定時の温度条件などで実験ごとに値は変わるため、必ずコントロールすなわち電圧印加していないもの（図８の２本の各並列グラフの左側）と、電圧印加したもの（図８の２本の各並列グラフの右側）との二つを各実験ごとに同時に行い、それを比較することで印加の効果があるかどうかを検討した。
【００３９】
（実験３の結果）図８に実験３の結果を示す。図８では、各α（交流電圧）β（直流電圧）の組合せにおけるＬＤＨ量を、電圧印加していないもの（左側の色の薄いグラフ）と、電圧印加したもの（右側の色の濃いグラフ）とをそれぞれ並べて２本ずつ示す。図８では、Ｙ軸（縦軸）の目盛りは吸光度の実測値を示す。値が大きいほど、壊れた赤血球の細胞内から遊離される酵素（ＬＤＨ）の量が増えていて、細胞障害の程度が大きいということになる。吸光度自体は、測定時の温度条件などで実験ごとに値は変わるため、必ずコントロールすなわち電圧印加していないもの（図８の２本の各並列グラフの左側）と、電圧印加したもの（図８の２本の各並列グラフの右側）との二つを各実験ごとに同時に行い、それを比較することで印加の効果があるかどうかを検討した。図８のそれぞれの２本並列グラフでみるとＮＩＣＥ（−）（電圧印加していないもの）とＮＩＣＥ（＋）（電圧印加したもの）の差が大きいほど印加の効果が大きいということになる。
【００４０】
凍結解凍後に末梢血赤血球より逸脱したＬＤＨは、α（交流）、β（直流）の、いずれの組合せにおいても印加をかけない群に比較して減少しており、凍結時の赤血球傷害が印加によって抑制されていることが示された。また特に、α５（９８０Ｖ）β８（３０００Ｖ）、α５（９８０Ｖ）β３（９５０Ｖ）、α３（５３０Ｖ）β８（３０００Ｖ）の組合せにて、より強い遊離ＬＤＨの減少が認められた。
【００４１】
（実験４「電圧印加による酸化ストレス下での細胞障害抑制」（図９））
実験４として、過酸化水素を細胞培養に添加して細胞障害を誘導し、これによる細胞死の比較実験を行った。
【００４２】
（実験目的）
ナイスゼロワンでの電圧同時印加が、生きた細胞に与える影響及び参加ストレス軽減に及ぼす影響を調べるため、培養細胞に過酸化水素による酸化ストレスを与えた状態での電圧印加の効果について検証した。
【００４３】
（実験方法）
ヒトマクロファージ細胞株であるＴＨＰ−１細胞を、９６穴培養プレートを用いて、ＲＰＭＩ１６４０培養液中で３７℃、５％ＣＯ２存在下で１２時間培養し、その際に０ｕＭから２５０ｕＭの過酸化水素を添加し、酸化ストレスによる細胞障害を誘導した。培養器はナプコ社製インキュベーターを用い、この培養庫内にアルミニウム製印加板を設置し、この印加板の上に９６穴培養プレートを静置し、交流電圧及び直流電圧の同時印加（α５β８）の下に培養を行った。細胞傷害の評価はＭＴＴ法を用いた。細胞培養開始１２時間後にＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍｌ）を培養プレートの各ウェルに２０ｕｌ／ウェルずつ添加し、さらに４時間培養。全培養終了後ＳＤＳ試薬を各ウェルに加えて細胞を溶解させた後に、ミトコンドリア内の脱水素酵素にて還元されて生成したフォルマザンを吸光度プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製のＴＥＲＭＯ ＭＡＸ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を用いて波長４９０ｎｍにて吸光度を測定した。
【００４４】
（実験４の結果（図９））過酸化水素添加による細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙへの影響は、１００ｕＭまでの低い濃度では細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙを上げ、逆に高い濃度では細胞死を誘導する。本実験でもMTT法での吸光度値は低濃度にてやや上昇し、高濃度にて低下していた。電圧印加群では印加（−）に比べて、いずれの過酸化水素濃度においても吸光度値が高く、細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙが上昇または維持されていた。
【００４５】
実験ではＭＴＴ法をもちいて細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙを測定しているが、吸光度の値が大きいほどｖｉａｂｉｌｉｔｙが高く、逆に値が低いと生きた細胞は少ないということになる。ここで、一般的に細胞は、低い濃度の酸化ストレスを細胞増殖等の刺激として活用するが、病的な高いレベルの酸化ストレスは細胞障害また細胞死を誘導する。このため、１００ｕＭまでの低い濃度では細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙは逆に少し上がる一方、２５０ｕＭの高い濃度では細胞は傷害を受けて吸光度は下がる。結果として、電圧印加を行うと高い濃度の酸化ストレスでも細胞が死ににくくなるということがいえる。
【００４６】
この現象の説明としては、実験１（図６）にあるように電圧印加による酸化反応の中和、抑制が挙げらるが、それ以外にも電気エネルギーが生物エネルギーに変換されているという新たなメカニズムがあると思われる。すなわち、細胞が死なないようにするためには、細胞内のエネルギー（ＡＴＰ）を増やしてやることが大事であるが、電圧印加をかけることで細胞が死ににくくなると考えられる。
【００４７】
（血液の冷凍保存の具体的な手順例）
血液の冷凍保存の具体的な手順例は、次のようなものである。供血者の肘静脈穿刺にて約４００ｍｌの末梢血を採血し、貯血バッグに保存する。遠心機にて血漿成分と血球成分とに分離後、血漿成分を除去し、生理食塩水および凍結保護液（ＣＰ−1、極東製薬工業社製）を加え凍結保存する。この際にα（交流）、β（直流）の同時印加を行いつつ凍結する。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
医療産業で考えられる本発明の同時印加技術の利用可能性には下記のものがある。先ず電圧印加での凍結保存として、輸血用同種末梢血凍結保存、自己血液凍結保存、骨髄移植用骨髄細胞凍結保存、臍帯血凍結保存、膵島細胞凍結保存、各種培養細胞凍結保存、ES細胞凍結保存、移植用各種臓器の凍結保存、そして、骨、大動脈、気管、心臓弁、角膜、皮膚等の組織移植片の凍結保存が挙げられる。
【００４９】
次に、電圧印加での冷保存として、輸血用同種末梢血保存、自己血液保存、移植用各種臓器の冷保存が挙げられる。
【符号の説明】
【００５０】
１ 収容器
１１ チューブスタンド型収容器
１２ 升型収容器
１ｈ 収容穴
１ａ 平面視縦方向の最小壁厚（収容穴側端から収容器の正面側面（又は背面側面）までの水平方向最小距離）
１ｂ 平面視横方向の最小壁厚（収容穴側端から収容器の右側面（又は左側面）までの水平方向最小距離）
１ｃ 高さ方向の最小底厚（収容穴底から収容器の底面までの鉛直方向最小距離）
１ｄ 収容穴断面の代表長（円形の収容穴断面の径、方形の収容穴断面の長辺）
１ｅ 収容穴間の最小壁厚（隣り合う第一の収容穴側端から、隣り合う第二の収容穴側端までの水平方向最小距離）
２ 電圧印加板
３ 電気配線
４ 保存庫
４１ 保存棚
５ 収容袋
Ｏ 生体材料
【技術分野】
【０００１】
この発明は、血液、細胞、組織、及び臓器を含む、生体材料の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物及び動物由来物の保存方法として、１００Ｖないし５０００Ｖの交流又は直流電圧を電極に印加して静電場雰囲気を形成し、−２０℃〜−４０℃でこの静電場雰囲気内におくことによる保存方法が開示されていた。これは、１００Ｖ〜５０００Ｖ、好ましくは１００Ｖ〜３０００Ｖの交流又は直流電圧の静電場雰囲気に保存することにより、微生物又は動物由来物が有する活性を不活化若しくは不活性化させることなく、又は死滅化させることなく保存することができる、とされるものである（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１１２８３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の保存方法では、電流電圧のかけ方について、電流は交流、直流のいずれであってもよいとされ、１００Ｖ、５００Ｖ、１０００Ｖ等といった各電圧値の他に、有効な電圧印加方法の特定はされていなかった。また上記従来の保存方法では、長期間の間自然に近い状態で、微生物又は動物由来物が有する活性を不活化若しくは不活性化させることなく、又は死滅化させることなく保存することに主眼を置いたものであった。このため、保存による酸化の抑制や細胞障害の軽減が十分にできるものとはいいきれなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決すべく、本発明では下記（１）ないし（３）の手段を採用するものとしている。すなわち、
（１）本発明の生体材料Ｏの保存方法は、生体材料Ｏに対して直流電圧と交流電圧とを同時にかける電圧同時印加ステップを含むことを特徴とする。
特に、直流電圧、交流電圧いずれも５０００Ｖを越えない電圧であることが好ましい。
【０００６】
（２）また、前記生体材料Ｏの保存方法において、電圧同時印加ステップが、生体材料Ｏの少なくとも周囲を囲む収容器１に生体材料Ｏを収容し、前記収容器１の外部の一面に、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板２上を（直接又は間接的に）沿わせることで、生体材料Ｏを間接的に電圧印加するものであることが好ましい。
【０００７】
（３）また、前記いずれかの生体材料Ｏの保存方法において、電圧同時印加ステップが、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板２上に、生体材料Ｏを入れた厚さ１０ｍｍ以上（少なくとも底厚１０ｍｍ、壁厚１５ｍｍ以上、好ましくは底厚、壁厚共に１５ｍｍ程度）の導電性金属からなる収容器１を積置することによるものであることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
上記構成を採用することで、保存中の生体材料Ｏの溶存酸素を不活性化させることで、より効果的な保存による酸化の抑制や細胞障害の軽減が達成される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１の生体材料の保存方法における、印加板、収容器及び電極の保存時の状態例を示す斜視説明図である。
【図２】図１に示す実施例１の状態例に、更に保存庫を含めた保存時の全体構成を示す正面視断面説明図である。
【図３】実施例２の生体材料の保存方法における、印加板、収容器及び電極の保存時の状態例を示す斜視説明図である。
【図４】図３に示す実施例２の状態例に、更に保存庫を含めた保存時の全体構成を示す正面視断面説明図である。
【図５】実施例３の生体材料の保存方法における保存時の（保存庫を含む）全体構成を示す概念説明図である。
【図６】実験１の、室温保存によるラット血清脂質過酸化反応の抑制に関するデータを示す図である。
【図７】実験２の、ヒト赤血球凍結における直流交流同時印加の優位性に関するデータを示す図である。
【図８】実験３の、ヒト赤血球凍結における電圧印加の至適条件に関するデータを示す図である。
【図９】実験４の、細胞培養による酸化ストレス下での細胞死の比較に関するデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。図１は、実施例１の生体材料Ｏの保存方法における、印加板２、収容器１及び電極の保存時の状態例を示す斜視説明図である。図２は、図１に示す実施例１の状態例に、更に保存庫４を含めた保存時の全体構成を示す正面視断面説明図である。図３は、実施例２の生体材料Ｏの保存方法における、印加板２、収容器１及び電極の保存時の状態例を示す斜視説明図である。図４は、図３に示す実施例２の状態例に、更に保存庫４を含めた保存時の全体構成を示す正面視断面説明図である。図５は、実施例３の生体材料Ｏの保存方法における保存時の（保存庫４を含む）全体構成を示す概念説明図である。図６ないし図９はそれぞれ、実験１ないし実験４によるデータを示す図である。具体的には、図６が、室温保存によるラット血清脂質過酸化反応の抑制に関する実験１のデータである。また、図７が、ヒト赤血球凍結における直流交流同時印加の優位性に関する実験２のデータであり、図８が、ヒト赤血球凍結における電圧印加の至適条件に関する実験３のデータであり、図９が、細胞培養による酸化ストレス下での細胞死の比較に関する実験４のデータである。
【００１１】
（「血液、細胞、組織、及び臓器の保存」という言葉の及ぶ範囲について）
「生体材料Ｏの保存」という言葉の及ぶ範囲に関し、本発明の「生体材料Ｏ」には、血液、細胞、組織、及び臓器のいずれもが含まれる。また、「生体材料Ｏの保存」という言葉の及ぶ範囲に関し、本発明の「保存」には次の３つの意味が含まれる。
（１）室温保存（４℃から２０℃（室温））
（２）凍結保存（−２０℃から−１９６℃（液体窒素の温度））
（３）細胞の培養保存（３７℃）
後述する実験１（図６）は、ラットの血清を上記１）室温保存したものである。また実験２（図７）及び３（図８）は、ヒト赤血球の凍結保存である。なお、（実験２）と（実験３）は同じ実験であるが、（実験２）の方はα（交流）単独とβ（直流）単独及びαβ併用とを比較したもので、（実験３）は同時印加の至適条件を調べたものである。実験４（図９）は（３）の培養保存である。
【実施例１】
【００１２】
本発明の実施例１の生体材料Ｏの保存方法は、生体材料Ｏに対して図1及び図２に示す保存装置によって、直流電圧と交流電圧とを同時に、すなわち重畳的にかける電圧同時印加ステップを含むことを特徴とする。この電圧同時印加ステップは、収容器１たるチューブスタンド型保持器に生体材料Ｏを収容し、前記収容器１の外部の一面に、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板２上を直接接触させて沿わせることで、生体材料Ｏを間接的に電圧印加するものである。なお、収容器１と印加板２とを接触させず、印加板２を間接的に沿わせる保存状態でも良い。
【００１３】
本発明の同時電圧印加を行う場合、例えば収容器１に直接電極を繋ぐことによる電圧印加や、生体材料Ｏを印加板２に直接載置することによる電圧印加よりも、前記のような間接的な電圧印加のほうが、効率的に、均等な電圧印加効果を得られることが判った。
【００１４】
具体的には、電圧同時印加ステップは、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板２上に、生体材料Ｏを入れた収容器１（実施例１の収容器１はチューブスタンド型保持器）を積置することによる。
【００１５】
（収容器１）
収容器１は、生体材料Ｏの少なくとも周囲を囲むようにして生体材料Ｏを収容する容器であり、導電性金属、特に高伝導性の金属を主成分としてなる。実施例１では、純度８０％以上のアルミニウムを主成分とする金属からなる。具体的には、６０ｍｍ厚さのアルミニウム板に、生体材料Ｏを収容するための収容穴１ｈを８個、所定の穴間隔を開けてくりぬいた、チューブスタンド型保持器である。
【００１６】
（収容穴１ｈ）
収容穴１ｈは、収容器１の少なくとも壁及び底（好ましくは更に蓋）に覆われて、収容した生体材料Ｏの、少なくとも周囲四方向及び下面方向（好ましくは更に上面）を囲うように構成される。但し、ここでいう底（或いは生体材料Ｏからみた下面方向）とは、電圧印加される印加板２をそわせる構成板をいう。
【００１７】
収容穴１ｈ内の生体材料Ｏからみたとき、間接的な電圧印加の作用する方向（下面方向）を導電板（底板）で覆い、かつ、少なくとも、同方向と逆の方向（上面方向）を除いた、すべての側面方）を導電板（四方に連なる壁板）で覆うこととなる。
【００１８】
実施例１の収容穴１ｈは、円柱状にくりぬいた円柱穴からなる。生体材料Ｏが血液の場合、この収容穴１ｈに、試験管に入れた血液を収容するか、或いは血液を直接収容する。収容穴１ｈは穴のいずれの深さにおける断面も等しいことが好ましい。
【００１９】
（壁厚及び底厚）
同時印加による効果のために、収容器１の構成材料の厚さは、１０ｍｍ以上（少なくとも底厚１０ｍｍ、壁厚１５ｍｍ以上、好ましくは底厚、壁厚共に１５ｍｍ程度）であることが好ましい。
【００２０】
実施例１では、平面視縦方向の最小壁厚１ａ（収容穴１ｈ側端から収容器１の正面側面（又は背面側面）までの水平方向最小距離）が１５ｍｍ、
平面視横方向の最小壁厚１ｂ（収容穴１ｈ側端から収容器１の右側面（又は左側面）までの水平方向最小距離）が３０ｍｍ、
高さ方向の最小底厚１ｃ（収容穴１ｈ底から収容器１の底面までの鉛直方向最小距離）が１５ｍｍ、
収容穴１ｈ断面の代表長１ｄ（円形の収容穴１ｈ断面の径、方形の収容穴１ｈ断面の長辺）が１４ｍｍ、
収容穴１ｈ間の最小壁厚１ｅ（隣り合う第一の収容穴１ｈ側端から、隣り合う第二の収容穴１ｈ側端までの水平方向最小距離）が１５ｍｍである。
【００２１】
（印加板２）
印加板２は、導電性材料からなる板であり、一対の電気配線３による電極をそれぞれ対称位置に配してなる。電気配線３は、直流及び交流共に共通配線３としてなり、電極もまた直流及び交流を共有するものとして配される。これにより、同時印加によって、交流電圧の一部が直流電圧に重畳的に変換され、交流電圧の設定値よりも実際の（生体材料Ｏへの）交流電圧の実効値が低くなり、その分、直流電圧の設定値よりも実際の（生体材料Ｏへの）直流電圧の実効値が高くなる。
【００２２】
印加電圧は、直流、交流いずれも５０００Ｖを超えないことが好ましい。さらにいえば、交流電圧の設定値が５００ないし２５００Ｖ、直流電圧の設定値が２００ないし１０００Ｖであることが好ましい。また、直流電圧はマイナスであることが好ましく、さらに交流電圧の設定値よりも、直流電圧の設定値（の絶対値）のほうが大きいことが好ましい。
【００２３】
また、交流と直流の各電圧値の組合せについて好ましくは、直流電圧の設定値が１０００Ｖ程度又は３０００Ｖ程度のとき、交流電圧の設定値が５００ないし５５０Ｖ程度であることが好ましい。
【００２４】
但し、上記及び本発明にいう設定値とは、交流又は直流いずれか単独で電圧をかけたときの、実際の生体材料Ｏへの実効値をいう。
【００２５】
（保存庫４）
印加板２は、図２に示すような、保存棚月の保存庫４のうえに載置し、この状態で生体材料Ｏを保存する。
【実施例２】
【００２６】
実施例２では、電圧同時印加ステップとして、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板２上に、生体材料Ｏを入れた底厚、壁厚共に１５ｍｍの収容器１（実施例２の収容器１は升型保持器）を積置することによる。実施例２の収容器１を用いた電圧の同時印加保存によれば、容積の比較的大きな生体材料Ｏであっても、その他の構成は実施例１と同様である。
【実施例３】
【００２７】
実施例３では、実施例１と比較して、収容器１の代わりに所定の袋材厚以上の収容袋を用いている。但し収容袋の内面には、導電性材料が塗布或いはラミネートされており、生体材料Ｏとほぼ全方向で接触することで、同時印加による効果を効率的に得るものとしている。生体材料Ｏには、図のＡで示す直流電圧によるイオン誘引方向と、Ｂの矢印で示す交流電圧によるイオン誘引方向とが重畳的にかかる。
【００２８】
上記各実施例は、本発明の保存方法を達成するための例に過ぎず、必ずしも上記構成に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能である。
【００２９】
（実験１「電圧印加によるラット血清脂質過酸化反応の抑制」（図６））
実験1として、ラットの血清を室温保存し、過酸化脂質量を測定した。
【００３０】
（実験１の実験方法）
ラット末梢血より血清を分離し、試料とした。試料をチューブに分注し、室温（２０度）にて１２時間静置、保存した。この際に印加板にα（交流）２０２０Ｖ、β（直流）３０００Ｖの電圧を印加し、試料を印加板の上で印加しつつ保存した。12時間の保存の後、ＴＢＡＲＳ法（チオバルビツール酸反応物質法）を用いて過酸化脂質量を測定し、印加していない試料と比較した。ＴＢＡＲＳ法での測定では、試料中の過酸化脂質が分解してできるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）がチオバルビツール酸と反応して赤色反応物をつくることを利用し、分光光度計にてその吸光度（５２５ｎｍ）を測定する。測定ではＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３０００を用いて吸光度を測定し、その吸光度をもってそれぞれの群間で比較した。
【００３１】
（実験１の結果）
交流直流の電圧を印加した試料中の過酸化脂質量は、印加していない試料と比較して有意に吸光度が低く、過酸化脂質の産生が抑制されていることが示された。
【００３２】
このことは、電圧印加によって、血清中の脂質の酸化が抑制されていることを示している。
【００３３】
（実験２）「ヒト赤血球凍結における交流直流同時印加の優位性」（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＮＩＣＥ０１ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｏｎ ＲＢＣ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ（ＮＩＣＥ０１とは、本願発明の実施例１の保存装置を示す）と題された図７参照）
（実験２の実験方法）
ボランティアより採血して得られたヒト末梢血洗浄赤血球に凍結保存液（アルブミン加ＣＰ−１、極東製薬社）を等量添加した後に、−２０度で３時間かけて凍結した。この際に冷凍庫内にアルミニウム製印加板を設置し、本発明の実施例１の電圧印加保存装置を用い、交流電圧（α５：９８０V）のみの単独印加、直流電圧（β８：３０００V）のみの単独印加、交流直流同時（重畳）印加（α５β８）の３群それぞれについて電場を作製し、印加板の上で凍結を行なった。
【００３４】
凍結サンプルはその後−８０度のフリーザー内で２週間保存し、３７度恒温槽にて解凍の後、遠心分離を行い、その上清中のＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）量を測定した。ＬＤＨ測定はＰｒｏｍｅｇａ社製のＬＤＨ ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて測定し、吸光度はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製のＴＥＲＭＯ ＭＡＸ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて測定した。測定結果を、交流電圧（α５：９８０V）単独印加、直流電圧（β８：３０００V）単独印加、及び交流直流同時（重畳）印加（α５β８）の３群間で比較した。
【００３５】
（実験２の結果）
凍結解凍後に末梢血赤血球より逸脱したＬＤＨは、交流単独、直流単独また交流直流併用群のいずれの群においても電圧印加（−）よりも減少しており、細胞障害が少ないことが示された。また、交流直流併用において、交流単独、また直流単独よりも有意に細胞障害の低下が認められた。
この結果より、電圧印加凍結における細胞障害の軽減はα及びβの両者を同時印加した際に、より顕著にみられることが確認された。
【００３６】
（実験３：「ヒト赤血球凍結における電圧印加の至適条件」（図８））
（実験３の実験方法）
実験２と同様、ボランティアより採血して得られたヒト末梢血洗浄赤血球に凍結保存液（アルブミン加ＣＰ−１、極東製薬社）を等量添加した後に、−２０度で３時間かけて凍結した。この際に冷凍庫内にアルミニウム製印加板を設置し、本発明の実施例１の電圧印加保存装置を用い、表１に示す交流電圧（α）と、表２に示す直流電圧（β）の両者を印加し電場を作製し、印加板の上で凍結を行なった。電圧印加はαとβをそれぞれ、図８に示す組合せで行った。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
凍結サンプルはその後−８０度のフリーザー内で２週間保存し、３７度恒温槽にて解凍の後、遠心分離を行い、その上清中のＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）量を測定した。ＬＤＨ測定はＰｒｏｍｅｇａ社製のＬＤＨ ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて測定し、吸光度はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製のＴＥＲＭＯ ＭＡＸ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて測定した。このとき、吸光度自体は、測定時の温度条件などで実験ごとに値は変わるため、必ずコントロールすなわち電圧印加していないもの（図８の２本の各並列グラフの左側）と、電圧印加したもの（図８の２本の各並列グラフの右側）との二つを各実験ごとに同時に行い、それを比較することで印加の効果があるかどうかを検討した。
【００３９】
（実験３の結果）図８に実験３の結果を示す。図８では、各α（交流電圧）β（直流電圧）の組合せにおけるＬＤＨ量を、電圧印加していないもの（左側の色の薄いグラフ）と、電圧印加したもの（右側の色の濃いグラフ）とをそれぞれ並べて２本ずつ示す。図８では、Ｙ軸（縦軸）の目盛りは吸光度の実測値を示す。値が大きいほど、壊れた赤血球の細胞内から遊離される酵素（ＬＤＨ）の量が増えていて、細胞障害の程度が大きいということになる。吸光度自体は、測定時の温度条件などで実験ごとに値は変わるため、必ずコントロールすなわち電圧印加していないもの（図８の２本の各並列グラフの左側）と、電圧印加したもの（図８の２本の各並列グラフの右側）との二つを各実験ごとに同時に行い、それを比較することで印加の効果があるかどうかを検討した。図８のそれぞれの２本並列グラフでみるとＮＩＣＥ（−）（電圧印加していないもの）とＮＩＣＥ（＋）（電圧印加したもの）の差が大きいほど印加の効果が大きいということになる。
【００４０】
凍結解凍後に末梢血赤血球より逸脱したＬＤＨは、α（交流）、β（直流）の、いずれの組合せにおいても印加をかけない群に比較して減少しており、凍結時の赤血球傷害が印加によって抑制されていることが示された。また特に、α５（９８０Ｖ）β８（３０００Ｖ）、α５（９８０Ｖ）β３（９５０Ｖ）、α３（５３０Ｖ）β８（３０００Ｖ）の組合せにて、より強い遊離ＬＤＨの減少が認められた。
【００４１】
（実験４「電圧印加による酸化ストレス下での細胞障害抑制」（図９））
実験４として、過酸化水素を細胞培養に添加して細胞障害を誘導し、これによる細胞死の比較実験を行った。
【００４２】
（実験目的）
ナイスゼロワンでの電圧同時印加が、生きた細胞に与える影響及び参加ストレス軽減に及ぼす影響を調べるため、培養細胞に過酸化水素による酸化ストレスを与えた状態での電圧印加の効果について検証した。
【００４３】
（実験方法）
ヒトマクロファージ細胞株であるＴＨＰ−１細胞を、９６穴培養プレートを用いて、ＲＰＭＩ１６４０培養液中で３７℃、５％ＣＯ２存在下で１２時間培養し、その際に０ｕＭから２５０ｕＭの過酸化水素を添加し、酸化ストレスによる細胞障害を誘導した。培養器はナプコ社製インキュベーターを用い、この培養庫内にアルミニウム製印加板を設置し、この印加板の上に９６穴培養プレートを静置し、交流電圧及び直流電圧の同時印加（α５β８）の下に培養を行った。細胞傷害の評価はＭＴＴ法を用いた。細胞培養開始１２時間後にＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍｌ）を培養プレートの各ウェルに２０ｕｌ／ウェルずつ添加し、さらに４時間培養。全培養終了後ＳＤＳ試薬を各ウェルに加えて細胞を溶解させた後に、ミトコンドリア内の脱水素酵素にて還元されて生成したフォルマザンを吸光度プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製のＴＥＲＭＯ ＭＡＸ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を用いて波長４９０ｎｍにて吸光度を測定した。
【００４４】
（実験４の結果（図９））過酸化水素添加による細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙへの影響は、１００ｕＭまでの低い濃度では細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙを上げ、逆に高い濃度では細胞死を誘導する。本実験でもMTT法での吸光度値は低濃度にてやや上昇し、高濃度にて低下していた。電圧印加群では印加（−）に比べて、いずれの過酸化水素濃度においても吸光度値が高く、細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙが上昇または維持されていた。
【００４５】
実験ではＭＴＴ法をもちいて細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙを測定しているが、吸光度の値が大きいほどｖｉａｂｉｌｉｔｙが高く、逆に値が低いと生きた細胞は少ないということになる。ここで、一般的に細胞は、低い濃度の酸化ストレスを細胞増殖等の刺激として活用するが、病的な高いレベルの酸化ストレスは細胞障害また細胞死を誘導する。このため、１００ｕＭまでの低い濃度では細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙは逆に少し上がる一方、２５０ｕＭの高い濃度では細胞は傷害を受けて吸光度は下がる。結果として、電圧印加を行うと高い濃度の酸化ストレスでも細胞が死ににくくなるということがいえる。
【００４６】
この現象の説明としては、実験１（図６）にあるように電圧印加による酸化反応の中和、抑制が挙げらるが、それ以外にも電気エネルギーが生物エネルギーに変換されているという新たなメカニズムがあると思われる。すなわち、細胞が死なないようにするためには、細胞内のエネルギー（ＡＴＰ）を増やしてやることが大事であるが、電圧印加をかけることで細胞が死ににくくなると考えられる。
【００４７】
（血液の冷凍保存の具体的な手順例）
血液の冷凍保存の具体的な手順例は、次のようなものである。供血者の肘静脈穿刺にて約４００ｍｌの末梢血を採血し、貯血バッグに保存する。遠心機にて血漿成分と血球成分とに分離後、血漿成分を除去し、生理食塩水および凍結保護液（ＣＰ−1、極東製薬工業社製）を加え凍結保存する。この際にα（交流）、β（直流）の同時印加を行いつつ凍結する。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
医療産業で考えられる本発明の同時印加技術の利用可能性には下記のものがある。先ず電圧印加での凍結保存として、輸血用同種末梢血凍結保存、自己血液凍結保存、骨髄移植用骨髄細胞凍結保存、臍帯血凍結保存、膵島細胞凍結保存、各種培養細胞凍結保存、ES細胞凍結保存、移植用各種臓器の凍結保存、そして、骨、大動脈、気管、心臓弁、角膜、皮膚等の組織移植片の凍結保存が挙げられる。
【００４９】
次に、電圧印加での冷保存として、輸血用同種末梢血保存、自己血液保存、移植用各種臓器の冷保存が挙げられる。
【符号の説明】
【００５０】
１ 収容器
１１ チューブスタンド型収容器
１２ 升型収容器
１ｈ 収容穴
１ａ 平面視縦方向の最小壁厚（収容穴側端から収容器の正面側面（又は背面側面）までの水平方向最小距離）
１ｂ 平面視横方向の最小壁厚（収容穴側端から収容器の右側面（又は左側面）までの水平方向最小距離）
１ｃ 高さ方向の最小底厚（収容穴底から収容器の底面までの鉛直方向最小距離）
１ｄ 収容穴断面の代表長（円形の収容穴断面の径、方形の収容穴断面の長辺）
１ｅ 収容穴間の最小壁厚（隣り合う第一の収容穴側端から、隣り合う第二の収容穴側端までの水平方向最小距離）
２ 電圧印加板
３ 電気配線
４ 保存庫
４１ 保存棚
５ 収容袋
Ｏ 生体材料
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体材料に対して直流電圧と交流電圧とを同時にかける電圧同時印加ステップを含むことを特徴とする生体材料の保存方法。
【請求項２】
電圧同時印加ステップが、生体材料の少なくとも周囲を囲む収容器に生体材料を収容し、前記収容器の外部の一面に、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板上を直接又は間接的に沿わせることで、生体材料を間接的に電圧印加するものである請求項１記載の生体材料の保存方法。
【請求項３】
電圧同時印加ステップが、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板上に、生体材料を入れた厚さ１０ｍｍ以上の導電性金属からなる収容器を積置することによるものである請求項１又は２記載の生体材料の保存方法。
【請求項１】
生体材料に対して直流電圧と交流電圧とを同時にかける電圧同時印加ステップを含むことを特徴とする生体材料の保存方法。
【請求項２】
電圧同時印加ステップが、生体材料の少なくとも周囲を囲む収容器に生体材料を収容し、前記収容器の外部の一面に、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板上を直接又は間接的に沿わせることで、生体材料を間接的に電圧印加するものである請求項１記載の生体材料の保存方法。
【請求項３】
電圧同時印加ステップが、直流電圧と交流電圧とを重畳印加した電圧印加板上に、生体材料を入れた厚さ１０ｍｍ以上の導電性金属からなる収容器を積置することによるものである請求項１又は２記載の生体材料の保存方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−７７０９６（Ｐ２０１２−７７０９６Ａ）
【公開日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５４４９（Ｐ２０１２−１５４４９）
【出願日】平成２４年１月２７日（２０１２．１．２７）
【分割の表示】特願２００５−３８０７１５（Ｐ２００５−３８０７１５）の分割
【原出願日】平成１７年１２月３１日（２００５．１２．３１）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【出願人】（５０２３９４１６２）有限会社 サンワールド川村 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１月２７日（２０１２．１．２７）
【分割の表示】特願２００５−３８０７１５（Ｐ２００５−３８０７１５）の分割
【原出願日】平成１７年１２月３１日（２００５．１２．３１）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【出願人】（５０２３９４１６２）有限会社 サンワールド川村 (7)
【Ｆターム（参考）】
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