生体膜内在性ウイルス様粒子及びその製造方法
【課題】ゲノムＤＮＡを含まない純粋なウイルス様粒子を確実かつ高純度に製造し、かつ、キャプシド内在分子の種類や存在態様、配置等の制御を容易に行い得る方法の確立を目的とする。
【解決手段】生体膜内在性ウイルスを構成するタンパク質のうち、(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を含むことを特徴とするウイルス様粒子。
【解決手段】生体膜内在性ウイルスを構成するタンパク質のうち、(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を含むことを特徴とするウイルス様粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体膜内在性ウイルス様粒子及びその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ウイルス様粒子（ＶＬＰ:Virus-Like Particle）としては、パピローマウイルスキャプシド蛋白コード配列を、バキュロウイルス転移ベクター中にクローニングし、上記バキュロウイルス転移ベクターおよびオートグラフィカ・カリホルニカ核多面体（polyhedrosis）ウイルスゲノムＤＮＡを昆虫細胞に同時形質導入して得られるもの（特許文献１：特表平08-507685）、ヒトポリオーマウイルスをＪＣＶの主要構造タンパク質ＶＰ１を組換えによって昆虫細胞内で発現させたもの（特許文献２：ＷＯ９７／１９１７４）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質、ＨＣＶエンベロープ１（Ｅ１）タンパク質、ＨＣＶエンベロープ２（Ｅ２）タンパク質およびｐ７タンパク質をコードする配列を含むＣ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡを含有するベクターを昆虫細胞内で発現させたもの（特許文献３：特表2001-504337）等が知られている。
【０００３】
しかし、これらのウイルス様粒子は、ゲノムＤＮＡを含む場合には用途が限定される。また、ゲノムＤＮＡを含まない場合もキャプシド内に特定の物質を十分な制御下に封入するのが困難である。さらに、これらのウイルス様粒子の製造方法においては、ウイルス様粒子に含有されるウイルスタンパク質を特異的に認識する免疫試薬を用いて免疫吸着する方法が一般的であるが、こうした手法では精製に多大な手間とコストが掛かる上、ウイルスタンパク質断片も吸着されるため、ウイルス様粒子のみを確実に採取することが困難である。
【０００４】
【特許文献１】特表平０８−５０７６８５
【特許文献２】ＷＯ９７／１９１７４
【特許文献３】特表２００１−５０４３３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ゲノムＤＮＡを含まない純粋なウイルス様粒子を確実かつ高純度に製造し、かつ、キャプシド内在分子の種類や存在態様、配置等の制御を容易に行い得る方法の確立を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ウイルス様粒子を構成するためのウイルスとして生体膜内在性ウイルスに着目した。生体膜内在性ウイルスとは脂質膜をキャプシド内に内包するウイルスであり、その例としてはテクチウイルスファミリーに属する腸内細菌ファージが挙げられる。これらは、大腸菌やサルモネラ菌などのグラム陰性菌を宿主とするウイルスである。
【０００７】
これらのウイルスは、宿主に感染後、菌体内で合成されたキャプシドタンパク質が宿主の脂質膜と結合したウイルス膜タンパク質や他のウイルス構成タンパク質とともにプレカーサー粒子を形成し、最後にＤＮＡをパッケージングして成熟したウイルス粒子となり、溶菌により菌体外に放出されていくといったライフサイクルをもつ。そのため、これらのウイルス粒子は、キャプシドの内側に宿主由来の生体膜を内包する。
【０００８】
一般に生体膜内在性ウイルスは、数十種類のタンパク質を含む大変複雑な構成をしており、従来、ウイルス様粒子を構成するための素材として用いられたことはない。しかし、本発明者らは、これらのウイルスにおいて(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を宿主内で生産させた場合、キャプシドの自己会合が起こり得ること、この場合、膜形成タンパク質は上述のように宿主の生体膜と複合してウイルス様粒子内に存在するため、ウイルス様粒子内への物質の内包を制御して行い得ること、さらに、特にペントンタンパク質のＮ末端にＨｉｓタグを付加することにより、再構成されたウイルス粒子のみを効率的に回収し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のウイルス様粒子、ウイルス様粒子の製造方法並びにウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法を提供する。
〔１〕生体膜内在性ウイルスを構成するタンパク質のうち、(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を含むことを特徴とするウイルス様粒子。
〔２〕生体膜内在性ウイルスがテクチウイルスファミリーに属するウイルスである前記〔１〕に記載のウイルス様粒子。
〔３〕生体膜内在性ウイルスがＰＲ７７２ウイルスまたは上記(1)〜(3)に相当するタンパク質がＰＲ７７２ウイルスと同等のキャプシド再構成挙動を示すウイルスである前記〔１〕または〔２〕に記載のウイルス様粒子。
〔４〕生体膜内在性ウイルスがＰＲ７７２ウイルスであり、(1)キャプシド構成タンパク質がＰ３及びＰ３０、(2)ペントンタンパク質がＰ３１、(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質がＰ１６（但し、これらのタンパク質はこれらとキャプシド再構成挙動が同等である限りにおいて改変されていてもよい。）を含む前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のウイルス様粒子。
〔５〕ペントンタンパク質Ｐ３１がＮ末端にペプチドタグを付加するように改変されたものである前記４に記載のウイルス様粒子。
〔６〕ペプチドタグがＨｉｓタグである前記５に記載のウイルス様粒子。
〔７〕脂質が前記少なくとも一種の膜形成タンパク質との複合体として粒子内に含まれる前記１〜６のいずれかに記載のウイルス様粒子。
〔８〕キャプシド構造の内部に少なくとも一つの作用物質を含有する、前記１〜７のいずれかに記載のウイルス様粒子。
〔９〕作用物質が核酸、ペプチド、脂質、タンパク質および生理学的活性物質からなる群から選択される一種または二種以上の物質である前記８に記載のウイルス様粒子。
〔１０〕作用物質が前記少なくとも一種の膜形成タンパク質と結合してキャプシド構造の内部に存在する前記９に記載のウイルス様粒子。
〔１１〕ウイルス粒子またはウイルス様粒子表面にＮ末端を露出させたタンパク質を含むウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法であって、
(A)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変したウイルス粒子の組み換え体を宿主中で増殖させるか、
(B)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変し、ウイルス様粒子を形成するのに必要な他のタンパク質とともにベクターに組み込み、宿主中で発現させてウイルス様粒子を形成し、
(A)により得られたウイルス粒子または(B)により得られたウイルス様粒子を前記ペプチドタグに親和性のある物質に吸着させて採取することを特徴とする方法。
〔１２〕ペプチドタグがＨｉｓタグであり、ペプチドタグに親和性のある物質がＮｉ含有物質である前記５に記載のウイルス様粒子。
〔１３〕前記Ｎ末端を露出させたタンパク質がペントンタンパク質である前記１１または１２に記載のウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法。
〔１４〕前記１〜１０のいずれかに記載のウイルス様粒子に前記１１〜１３のいずれかに記載の方法を適用することを特徴とする前記１〜１０のいずれかに記載のウイルス様粒子の採取及び／または精製方法。
〔１５〕ＰＲ７７２ウイルスの(1)キャプシド構成タンパク質Ｐ３及びＰ３０、(2)ペントンタンパク質Ｐ３１、(3)膜形成タンパク質Ｐ１６のＮ末端にＨｉｓタグを付加した改変タンパク質を発現ベクター内に組み込み、宿主細胞中で発現させてウイルス様粒子を再構成し、得られた粒子をＮｉアガロースに吸着させて回収精製することを特徴とするＰＲ７７２ウイルス由来のウイルス様粒子の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ウイルス様粒子内への物質の内包を制御して行い得る。また、特にペントンタンパク質のＮ末端にＨｉｓタグを付加することにより、再構成されたウイルス粒子のみを効率的に回収し得る。なお、Ｈｉｓタグ付加による精製方法は組み換えウイルスの精製にも用い得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（Ａ）ウイルス様粒子
はじめに、本発明によるウイルス様粒子について説明する。
本発明によるウイルス様粒子は、生体膜内在性ウイルスを構成するタンパク質のうち、(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を含むことを特徴とする。
【００１２】
ここで、生体膜内在性ウイルスとは、上述の通り、脂質膜をキャプシド内に内包するウイルスであり、一般に数十種類のタンパク質を含むが、本発明のウイルス様粒子では、(1)キャプシド構成タンパク質（主としてキャプシドの面部分を構成するタンパク質）、(2)ペントンタンパク質（主としてキャプシドの頂点部分を構成するタンパク質）、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質のみを含む。従って、キャプシド構成タンパク質が一種類であれば、最少三種類のタンパク質（一般的にはキャプシド構成タンパク質が二種類で、膜形成タンパク質が一種類でよいので四種類のタンパク質）のみでウイルス様粒子を構成できる。
また、キャプシド構成タンパク質はキャプシドの表面を構成するタンパク質であり、ペントンタンパク質はキャプシドの頂点に位置するタンパク質である。
【００１３】
生体膜内在性ウイルスの例としてはテクチウイルスファミリーに属する腸内細菌ファージが挙げられる。例えば、ＰＲＤ１ウイルス粒子は、直径７４ｎｍ、分子量６６ＭＤａで、外側は正二十面体のキャプシドの殻に覆われ、内側に宿主由来の生体膜を内包し、約１５ｋｂｐの二本鎖ＤＮＡをゲノムとして持つ。ＰＲＤ１とゲノムＤＮＡの塩基配列が９７．２％の相同性を有し、ＰＲＤ１と同一のウイルス粒子構造をもつと考えられるＰＲ７７２（ＡＴＣＣ：American Type Culture Collectionにおけるカタログ＃BAA-769-B1）が好適に使用できる。ＰＲ７７２はウイルス用フィルタ評価基準で広く流通しており、ＰＲＤ１よりも汎用性があるためである。なお、生体膜内在性ウイルスはテクチウイルス以外の種でもよい。そのような例としては、コルチコウイルスに属する海洋性細菌ファージＰＭ２(ＡＴＣＣにおけるカタログ＃27025-B1)が挙げられる。ＰＭ２は直径約６０nmの正二十面体構造で、粒子のキャプシドは複数の層状を示し、正二十面体の各頂点には突起構造が見られ、約１０kbpの環状の二本鎖 ＤＮＡをゲノムとして持つ。
【００１４】
以下、ＰＲ７７２ウイルスを例として述べるが、生体膜内在性ウイルスがＰＲ７７２ウイルスまたは上記(1)〜(3)に相当するタンパク質がＰＲ７７２ウイルスと同等のキャプシド再構成挙動を示すウイルスも同様に利用できる。なお、ここで、「ＰＲ７７２ウイルスと同等のキャプシド再構成挙動を示す」とは、必要なコピー数の(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を宿主内で生成させたときにＰＲ７７２ウイルスと同程度以上のキャプシド再構成能力を示すことを言う。
【００１５】
ＰＲ７７２ウイルスにおけるキャプシド構成タンパク質は、メジャーキャプシドタンパク質Ｐ３とマイナーキャプシドタンパク質Ｐ３０である。ペントンタンパク質はＰ３１である。膜形成タンパク質はＰ７，Ｐ１１，Ｐ１４，Ｐ１６，Ｐ１８，Ｐ３２，Ｐ３４が含まれるが、Ｐ１６が好適に用いられる。これらの配列は既知であり、それぞれ配列表の配列番号１〜４のアミノ酸配列を有する。但し、これらのタンパク質はこれらとキャプシド再構成挙動が同等である限りにおいて改変されていてもよい。改変は、タンパク質粒子の基本構造に大きな変更をもたらさない限りにおいてフォールドされたタンパク質粒子の内部に位置するアミノ酸の置換、付加、欠失、タンパク質粒子間の自己会合に大きな変更をもたらさない限りにおいてタンパク質粒子の内部に位置するアミノ酸の置換、付加及び／または欠失を含む。相同性において９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上有するタンパク質でもよい。なお、欠失において相同性９０％以上では欠失後のタンパク質の配列長さはＰ３の配列長さの９０％以上である。
【００１６】
但し、これらのタンパク質はこれらとキャプシド再構成挙動が同等である限りにおいて改変されていてもよい。このような改変の例としては、ペントンタンパク質Ｐ３１Ｎ末端へのペプチドタグの付加が挙げられる。ペプチドタグとしては親水性ペプチド、例えば、Ｈｉｓタグの付加が挙げられる。もっとも、Ｈｉｓタグと同様にアフィニティー精製可能なタグを付加してもよい。このようなタグはキャプシド再構成挙動に大きな影響を与えない限りにおいて特に限定されないが、その例としてはＨｉｓタグの他にＳ−タグ等が挙げられる。
【００１７】
上記の生体膜内在性ウイルスは、宿主に感染後、菌体内で合成されたキャプシドタンパク質が宿主の脂質膜と結合したウイルス膜タンパク質や他のウイルス構成タンパク質とともにプレカーサー粒子を形成し、最後にＤＮＡをパッケージングして成熟したウイルス粒子となり、溶菌により菌体外に放出されていくといったライフサイクルを持つが、上記の各タンパク質から構成されるウイルス様粒子も、脂質膜を前記少なくとも一種の膜形成タンパク質との複合体として粒子内に含む。
【００１８】
本発明のウイルス様粒子はキャプシド内部にゲノムＤＮＡを含まず、種々の作用物質を含み得る。このような作用物質の例としては核酸、ペプチド、脂質、タンパク質および生理学的活性物質等が挙げられる。生理学活性物質の例としては、上記以外の構造を有する医薬やトキシン等が挙げられる。これらの二種以上を含んでもよい。薬剤を含有させた場合は、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に用いることが可能である。また、本発明においては、作用物質を前記少なくとも一種の膜形成タンパク質と結合してキャプシド構造の内部に内包させることができる。従って、膜形成タンパク質と作用物質との結合態様を調整することにより、作用物質をウイルス粒子内で制御された状態で配置することが可能となり、作用物質の解析等にも応用することが可能となる。また、本発明のウイルス様粒子はキャプシド内部に生体膜を内包しているため、前記作用物質を生体膜と接触させたり、前記作用物質が生体膜を貫通したり、膜内に存在するように配置することができる。さらに、外部から薬物を投与し、キャプシドの隙間を通じて薬物を内部に進入させ、生体膜と相互作用させることも可能である。このため、細胞膜システムのバイオセンサーのプラットホームとしても使用可能となり得る。
【００１９】
（Ｂ）ウイルス様粒子の製造方法
ウイルス様粒子の再構成系としては、ウイルス粒子形成に必要なタンパク質（ＰＲ７７２ウイルスでは、メジャーキャプシドタンパク質Ｐ３、膜タンパク質
Ｐ１６、マイナーキャプシドタンパク質 Ｐ３０、ペントンタンパク質 Ｐ３１の４種のタンパク質）を同一の宿主内で発現させ、ウイルスタンパク質の自己会合により菌体内でウイルス粒子を形成させる。宿主としては当該ウイルスが通常宿主としているものであれば特に限定されないが、好ましくは大腸菌が使用できる。
【００２０】
以下、ＰＲ７７２ウイルス−大腸菌系を例として述べるが、他の生体膜内在性ウイルス−宿主系でも当業者であれば適宜修正を加えて同等な操作が可能である。
はじめに、ＰＲ７７２ウイルスのゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐ３、Ｐ１６、Ｐ３０、Ｐ３１の翻訳領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、大腸菌用発現ベクターを用いて、同一の大腸菌でこれら４種のウイルスタンパク質を発現させる。このようなベクターとしては、pDuetcoexpression vectors(Novagen 社)の4種の発現ベクターpETDuet1、pACYCDuet1、pRSFDuet1、pCDFDuet1のうち、pETDuet1（図１）あるいはpCDFDuet1（図２）に２種ずつ挿入して構築した発現用プラスミドが好ましい。pDuetcoexpression vectorsの4種の発現ベクターは、各プラスミドが異なる複製開始点と薬剤耐性遺伝子をもつため、同時に同一の大腸菌に導入することが可能であるとともに、各ベクターは２種の目的タンパク質を大腸菌で発現できるように設計されているので、最大８種の目的タンパク質を同一の大腸菌で発現させることが可能である。各タンパク質はウイルス様粒子を構成するのと同様の量比で生成させることが好ましい。すなわち、これらのタンパク質がウイルス粒子内ではｍｉ個のｎｉ量体として存在する場合は、各タンパク質を概ねｍｉ×ｎｉコピーまたはその整数倍ずつ生成するように発現させる。
【００２１】
ここで、ペントンタンパク質 Ｐ３１（配列番号３）のＮ末端にはヒスチジンタグを付加した組換えウイルスタンパク質（Ｈｉｓ−Ｐ３１）を用いることが好ましい。例えば、上記のpDuetcoexpression vectors （Novagen社）の４種の各ベクターは、６つのＨｉｓをコードする塩基配列（Ｈｉｓタグ）がベクターに組み込まれており、その下流には数種類の制限酵素切断部位があるため、Ｈｉｓタグとフレームが合うように目的タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入すれば、そのＮ末端にＨｉｓタグを付けることが可能である。もっとも、Ｈｉｓタグ以外のアフィニティー精製用タグを付加してもよい。これらのタグの付加は遺伝子組み換え技術により付加が可能である。
【００２２】
大腸菌の菌体内で、ウイルスタンパク質の自己会合によりウイルス様粒子（ＶＬＰ）が再構成されたか否かは、大腸菌を超音波処理により破砕後、適当な平衡密度勾配超遠心（例えば、塩化セシウムの平衡密度勾配超遠心やショ糖の密度勾配超遠心）等によって遠心し、野生型ＰＲ７７２ウイルスを大腸菌に感染させて得た溶菌液をコントロールとしてバンドの確認によって行なうことができる。
【００２３】
本発明ではペプチドタグ等のアフィニティー精製用タグを付加した場合は、対応する親和性（吸着）物質を適当な担体に固定化したもの（Ｈｉｓタグの場合、Ｎｉ−アガロース；Ｓタグの場合、Ｓ-proteinアガロースなど）を用いて精製を行なうことにより、高純度のウイルス様粒子を効率的に回収精製できる。例えば、Ｎｉ−アガロースを用いてアフィニティー精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓを、限外濾過膜で濃縮後、適当な平衡密度勾配超遠心（例えば、塩化セシウムの平衡密度勾配超遠心やショ糖の平衡密度勾配超遠心）にかけてさらに精製を行なうことにより精製度の高い試料を得ることができる。こうした高純度ウイルス様粒子を結晶化させた場合、内包した物質のＸ線構造解析等の解析に利用できる可能性がある。このような物質の例としては、特に生体膜内での構造の解析が大きな課題となっている受容体タンパク質が挙げられる。受容体タンパク質の例には膜貫通型の種々のタンパク質が含まれるが、特にGタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）タンパク質が挙げられる。
【００２４】
（Ｃ）ウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法
上記のウイルス様粒子の製造方法は、ゲノムを内包するウイルス粒子の組み換え体に適用することも可能である。すなわち、本発明は、ウイルス粒子またはウイルス様粒子表面にＮ末端を露出させたタンパク質を含むウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法であって、
(A)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変したウイルス粒子の組み換え体を宿主中で増殖させるか、
(B)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変し、ウイルス様粒子を形成するのに必要な他のタンパク質とともにベクターに組み込み、宿主中で発現させてウイルス様粒子を形成し、
(A)により得られたウイルス粒子または(B)により得られたウイルス様粒子を前記ペプチドタグに親和性のある物質に吸着させて採取することを特徴とする方法全般を含む。ここで、ペプチドタグは、対応する親和性物質が存在する限りにおいて特に限定されないが、上述の通り、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ等が挙げられる。親和性物質は適当な担体、例えば、アガロース分子等に固定して用いることが好ましい。Ｎ末端にペプチドタグを付加したタンパク質としては、上記の通り、ペントンタンパク質が好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
ＰＲ７７２ウイルス（ＡＴＣＣカタログ＃BAA-769-B1）のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐ３、Ｐ１６、Ｐ３０、Ｐ３１の翻訳領域を含むＤＮＡ断片を、それぞれの塩基配列内に制限酵素の認識配列（下線部）を含むように設計した以下に示すプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの条件も以下に示す。
【００２７】
Ｐ３
5’側プライマー（PR772-8582-NdeI-F）：5’-cggagtaattaCatatggcacag-3’ （配列番号５）
3’側プライマー（PR772-9829-BglII-R）：5’-attccgccaGatcTgtgattagct-3’ （配列番号６）
PCRの条件：94℃、5分→60℃、1分→68℃、1.5分（１サイクル）
94℃、30秒→60℃、30秒→68℃、1.5分（29サイクル）
【００２８】
Ｐ１６
5’側プライマー（PR772-11823-NcoI-F）：5’-ttaaggggtaaaCcatggacaaaa-3’（配列番号７）
3’側プライマー（PR772-12278-NotI-R）：5’-gaacaaccGcggccGctaggcgcg-3’ （配列番号８）
PCRの条件：94℃、5分→60℃、1分→68℃、1分（１サイクル）
94℃、30秒→60℃、30秒→68℃、1分（29サイクル）
【００２９】
Ｐ３０
5’側プライマー（PR772-10822-NcoI-F）：5’-taagggggtaCcatggcactgatt-3’ （配列番号９）
3’側プライマー（PR772-11107-EcoRI-R）：5’-aaaatggcggAAttcatccttagc-3’（配列番号１０）PCRの条件：94℃、5分→60℃、1分→68℃、1分（１サイクル）
94℃、30秒→60℃、30秒→68℃、1分（29サイクル）
【００３０】
Ｐ３１
5’側プライマー（PR772-4896-NdeI-F）： 5’-aaggtgtaaCAtatgaatgtgaat-3’（配列番号１１）
3’側プライマー（PR772-5323-KpnI-R）： 5’-cgttaccgtgGtAccgccgatttg-3’ （配列番号１２）
PCRの条件：94℃、5分→60℃、1分→68℃、1分（１サイクル）
94℃、30秒→60℃、30秒→68℃、1分（29サイクル）
【００３１】
なお、上記において（ ）内はプライマー名称で、そのうちの数字は、PR772ゲノムDNAの塩基配列（GenBank ACCESSION No. AY848688）における塩基番号に相当し、プライマーの5’末端の位置を示す。また、その数字の次は制限酵素名を示し、そのプライマーが名称に示した制限酵素で切断されることを示す。プライマーの塩基配列のうち大文字は、もとの塩基からその塩基に置換させたことを示し、その塩基に置換することでプライマー中に下線で示した制限酵素の認識配列を作製した。
【００３２】
次いで、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素で消化し、大腸菌用発現ベクターpDuetcoexpression vectors （Novagen社）の４種の発現ベクター pETDuet1（図１）、pACYCDuet1、pRSFDuet1、pCDFDuet1（図２）のうち、まず、Ｐ３のNdeI-BglII断片（約1.2kbp）とＰ１６のNcoI-NotI断片（約0.4kbp）をpETDuet1のNcoI-NotI部位とNdeI-BglII部位にそれぞれ挿入してＰ１６とＰ３の発現用プラスミドpETDuet1/P16-P3を構築した。一方、Ｐ３０のNcoI-EcoRI断片（約0.3kbp）とＰ３１のNdeI-KpnI断片（約0.4kbp）をpCDFDuet1のNcoI-EcoRI部位とNdeI-KpnI部位にそれぞれ挿入してＰ３０とＰ３１の発現用プラスミドpCDFDuet1/P30-P31を構築した。pETDuet1/P16-P3とpCDFDuet1/P30-P31を同時に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して得た形質転換体をOvernight Express Autoinduction System（Novagen社）のＴＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間培養してウイルス蛋白質の発現を誘導させ、これら４種のウイルス蛋白質を発現させることに成功した。Overnight Express Autoinduction Systemは、IPTGで誘導可能な大腸菌の発現系において、高レベルのタンパク質誘導発現を自動的に行なわれるように設計された培地システムである。
【００３３】
この大腸菌の菌体内で、ウイルスタンパク質の自己会合によりウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）が再構成されたかを調べるため、大腸菌を超音波処理により破砕後、野生型ＰＲ７７２ウイルスを大腸菌に感染させて得た溶菌液をコントロールとして、塩化セシウムの平衡密度勾配超遠心を行った。その結果、野生型（ｗｔ）では、ウイルス粒子を含むと思われる乳白色のバンドが２本（ＵとＬ）検出され、再構成系（ＶＬＰｓ）でも、野性型のＵバンドとほぼ同じ位置とその下方にＶＬＰｓ形成により生じたと思われるバンドが２本検出された。そこで、これらのバンドを回収し、ＳＤＳ−１４％ ＰＡＧＥで解析した結果、野生型でも再構成系でも同様な泳動パターンが観察され、再構成系のＵ及びＬバンドに４種のウイルスタンパク質も検出された。
【００３４】
さらに、原子間力顕微鏡を用いて観察したところ、野生型（ｗｔ）のＵバンドには、ＰＲ７７２ウイルス粒子と考えられる直径約６７ｎｍの球状の粒子が観察された（図３Ａ）。一方、再構成系（ＶＬＰｓ）のＵバンドには直径約５２ｎｍや約７５ｎｍの粒子も混在していたが、野性型とほぼ等しい約６５ｎｍの球状の粒子を確認できた（図３Ｂ）。なお、図には示していないが、再構成系のＬバンドにおいても、約６５ｎｍの球状の粒子を確認できた。
【００３５】
つぎに、再構成させたＶＬＰｓが宿主由来の脂質膜を内包しているかどうかを調べるため、ＶＬＰｓからBligh & Dyer法により総脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィーにより分析した。野性型ＰＲ７７２ウイルスを大腸菌に感染させて得た溶菌液（ｗｔ）と、４種のウイルスタンパク質を共発現させた大腸菌（ＶＬＰｓ）及びネガティブコントロールとして外来タンパク質などを発現させていない宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の超音波破砕液を、塩化セシウムの平衡密度勾配超遠心にかけ、ウイルスタンパク質を含む各分画（上層Ｕ、下層Ｌ１及びＬ２）を回収した。まず回収した分画に含まれるタンパク質をＳＤＳ−１４％ＰＡＧＥにより解析した。野性型（ｗｔ）及び再構成系（ＶＬＰｓ）では、Ｕ及びＬ１分画にウイルスタンパク質が確認された。
【００３６】
ＰＲ７７２ウイルスの脂質成分に関する報告はないが、ＰＲＤ１ウイルスでは、キャプシドの内側に存在する脂質膜の主成分はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、及びカルジオリピン（ＣＬ）である。ＰＲ７７２もこれらの脂質を含んでいることが推測され、再構成ＶＬＰｓが宿主由来の生体膜を内包していれば、これらの脂質が検出されると予想された。これら３種の脂質をスタンダードとして、回収した各分画から抽出した脂質をシリカゲル薄層プレート（silica gel 60 F254、Merck社）にスポットし、クロロホルム／メタノール／酢酸（６５：２５：１０）の溶媒にて展開後、ヨウ素蒸気法により脂質の検出を行った。その結果、野生型（ｗｔ）は予想通りＰＥ、ＰＧ、ＣＬを含んでおり、再構成系（ＶＬＰｓ）の場合にもＵとＬ１分画でこれら３種の脂質が検出された。対応する宿主大腸菌の画分からはこれらの脂質が殆ど検出されなかったことから、再構成ＶＬＰｓは宿主大腸菌由来の生体膜を内包していると考えられた。
【００３７】
さらに、透過型電子顕微鏡を用いネガティブ染色法によりＶＬＰｓの形態観察を行った（図４）。野生型（ｗｔ）のＵバンドでは直径５０〜６３ｎｍの粒子が観察された（図４Ａ）。再構成系（ＶＬＰｓ）では、Ｕ、Ｌバンドとも、直径約４２ｎｍの小さな粒子や約８８ｎｍの大きな粒子も混在していたが、大多数の粒子は直径５４〜６８ｎｍで、粒子の内側には膜と思われる形態も観察された（図４Ｂ）。以上の結果より、４種のウイルスタンパク質Ｐ３、Ｐ１６、Ｐ３０、Ｐ３１を同一の大腸菌で発現させることにより、生体膜内在性のウイルス粒子を再構成させることに成功したと考えられる。
【００３８】
実施例２
塩化セシウムの平衡密度勾配超遠心により精製した実施例１のＶＬＰｓでは、図４の電子顕微鏡写真で観察されるように、膜の凝集体やキャプシドタンパク質と思われる構造体が混在していた。結晶化を行うためには純度の高いＶＬＰｓの調製が必要である。ＶＬＰｓにＨｉｓタグを付け、Ｎｉ−アガロースを用いたアフィニティー精製を試みた。Ｈｉｓタグとしては、Ｈｉｓ×６を用いた。
【００３９】
具体的には、ペントン蛋白質のＮ末端にＨｉｓタグを付けるため、発現用プラスミドを新たに構築した。
＜Ｈｉｓ・Ｐ３１とＰ３０の発現用プラスミドの構築＞
実施例１と同様に、ＰＲ７７２ウイルスのゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐ３０、Ｐ３１の翻訳領域を含むＤＮＡ断片を、それぞれの塩基配列内に制限酵素の認識配列（下線部）を含むように設計した以下に示すプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの条件は実施例１と同じである。
【００４０】
Ｐ３０
5’側プライマー（PR772-10820-NdeI-F）：5’-tttaagggggtCaTatggcactg-3’ （配列番号１３）
3’側プライマー（PR772-11161-XhoI-R）：5’-atgcaatgCtcgAggcctagcca-3’ （配列番号１４）
【００４１】
Ｐ３１
5’側プライマー（PR772-4892-HindIII-F）： 5’-ttcaaaggtgAaGCttatgaatgt-3’（配列番号１５）
3’側プライマー（PR772-5321-NotI-R）：5’-ttaccgtgctgcGgccgCtttgtt-3’ （配列番号１６）
【００４２】
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素で消化し、Ｐ３０のNdeI-XhoI断片（約0.3kbp）とＰ３１のHindIII-NotI断片（約0.4kbp）をpCDFDuet1のHindIII-NotI部位とNdeI-XhoI部位にそれぞれ挿入してＰ３０とＨｉｓ・Ｐ３１の発現用プラスミドpCDFDuet1/His・P31-P30を構築した。ベクターのHindIII部位はヒスチジンタグの下流に位置し、従って、Ｐ３１の翻訳領域はヒスチジンタグとフレームが合うように挿入した。この発現用プラスミドを用いてＰ３１を大腸菌で発現させると、実際は、Ｐ３１のＮ末端に
MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerGlnAspProAsnSerSerSerAlaArgLeuGlnValAspLysLeu
というアミノ酸配列（２６アミノ酸残基）からなるペプチドが付加することになる（下線部Hisタグ；ベクターのマップ参照）。
【００４３】
このように、Ｐ３１に代えてＨｉｓ−Ｐ３１を用いたほかは実施例１と同様にして、Ｐ３、Ｐ１６及びＰ３０とともにＨｉｓ−Ｐ３１を同一の大腸菌で発現させ、超音波処理により破砕後、前述と同様に、超遠心によりＨｉｓ−ＶＬＰｓを含むバンドを回収、以下に示すＮｉ−アガロース及び試薬を用いてＨｉｓ−ＶＬＰｓのアフィニティー精製を行なった。
【００４４】
＜試薬＞
・Ni-NTA-アガロース（QIAGEN 社）
・Binding buffer : 0.5M NaCl、20mM Tris・HCl（pH 8.0）、1mM MgCl2、10mM イミダゾール
・Wash buffer : 0.5M NaCl、20mM Tris・HCl（pH 8.0）、1mM MgCl2、20mM イミダゾール
・Elution buffer : 0.5M NaCl、20mM Tris・HCl（pH 8.0）、1mM MgCl2、1M イミダゾール
・TM buffer : 10mM Tris・HCl（pH 7.5）、1mM MgCl2
【００４５】
すなわち、超遠心により回収したウイルス様粒子を含むフラクションを透析チューブに移して Binding buffer に４℃で一晩透析した後、試料を別のチューブに移した。しかる後、Binding buffer で平衡化した Ni-NTA-アガロース（試料の１／３〜１／４容）を投入し、ローテーターを用いて４℃で二晩撹拌しながら吸着させた。吸着後、遠心（３０００回転 １分、４℃）によりビーズを回収し、Binding buffer（ビーズの５〜１０倍容）を加えてローテーターを用いて４℃で１０分間、撹拌しながら洗浄（３回）した。遠心（３０００回転 １分、４℃）によりビーズを回収し、Wash buffer （ビーズの５〜１０倍容）を加えてローテーターを用いて４℃で３０分間撹拌しながら洗浄（２回）した。遠心（３０００回転 １分、４℃）によりビーズを回収し、Elution buffer（ビーズと等容〜２倍容）を加えてローテーターを用いて４℃で一晩撹拌しながら溶出し、透析チューブに移して TM buffer に４℃で一晩透析した後、別のチューブに移して４℃で保存した。
【００４６】
なお、ネガティブコントロールとして、超遠心によりＶＬＰｓを含むバンドを回収し、Ｈｉｓ−ＶＬＰｓと同条件でアフィニティー精製を行なった。Ｎｉ−アガロースにより精製された試料をＳＤＳ−１４％ＰＡＧＥ解析した結果、Ｈｉｓ−ＶＬＰｓにはＰ３、Ｐ１６、Ｐ３０、Ｈｉｓ−Ｐ３１のバンドが検出されたが、ＶＬＰｓにはＰ３、Ｐ１６、Ｐ３０、Ｐ３１のバンドが検出されなかった。精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓから抽出した総脂質を薄層クロマトグラフィーで分析した結果、野生型と同じ脂質成分を含んでいることを確認できた。さらに、電子顕微鏡を用いた形態観察では、直径６２〜６３ｎｍの均一のＨｉｓ−ＶＬＰｓが観察され（図５Ａ）、内側に膜と思われる形態を示す粒子も観察された（図５Ｂ、図５Ｃ）。よって、粒子の表面にＨｉｓタグの付いた生体膜内在性のウイルス様粒子Ｈｉｓ−ＶＬＰｓを再構成させ、精製することに成功した。
【００４７】
結晶化の試料として、より純度の高い試料を調製するため、前述と同様の方法で大腸菌を大量培養してＮｉ−アガロースを用いてアフィニティー精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓを、限外濾過膜で濃縮後、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心にかけてさらに精製を試みた。その結果、アフィニティー精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓよりも精製度の高い試料を得ることができた（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によれば、わずか数種類のタンパク質だけで野生型と比較してもほぼ同様な粒子径のキャプシドを再構成できる。さらに、このウイルスキャプシドは、野生型と同様に生体膜を内在している。これから、このウイルスキャプシドは、生理活性物質等を内包するための安定なプラットホームとなりうることがわかった。従って、ＤＤＳとして有用である。また、本発明のウイルス様粒子では、これらの内包物質を生体膜内で制御された状態で配置させることが可能であると考えられるので、様々な細胞内情報伝達系の研究や生化学的な機能解析に画期的な影響を与えるものと期待される。さらに、工業的には、様々な種類の酵素タンパク質を適切に再配置させることで、人工的にタンパク質複合体を作り上げることが容易に出来る。そのため、目的の酵素活性を持つ人工的なマシーナリーを作製する基本的な技術となり得る。
なお、本発明は、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（ＮＥＤＯ技術開発機構）の平成１７年度第２回「産業技術研究助成事業」により助成を受けた研究上の発明である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明において発現用ベクターとして用いたpETDuet1の遺伝子地図。
【図２】本発明において発現用ベクターとして用いたpCDFDuet1の遺伝子地図。
【図３Ａ】野生型（ｗｔ）ウイルス粒子の原子間力顕微鏡写真。
【図３Ｂ】本発明により製造したウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の原子間力顕微鏡写真。
【図４Ａ】野生型（ｗｔ）ウイルス粒子の原子間力顕微鏡写真。
【図４Ｂ】本発明により製造したウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の透過型電子顕微鏡。
【図５Ａ】本発明により製造したウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡。
【図５Ｂ】本発明により製造したウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡。
【図５Ｃ】本発明により製造したウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡。
【図６Ａ】本発明により製造したＨｉｓ−タグ付加ウイルス様粒子（Ｈｉｓ−ＶＬＰｓ）及び野生型タンパク質のＳＤＳ−１４％ＰＡＧＥのＣＢＢ染色図、銀染色図、ウエスタンブロット透過型電子顕微鏡（Ａ；図中、１は超遠心後、Ｎｉ−アガロースで精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓ、２は１を限外濾過膜で濃縮後、超遠心で精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓ、ｗｔはＰＲ７７２野生型ウイルス）。
【図６Ｂ】図６Ａにおける２の電子顕微鏡写真。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体膜内在性ウイルス様粒子及びその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ウイルス様粒子（ＶＬＰ:Virus-Like Particle）としては、パピローマウイルスキャプシド蛋白コード配列を、バキュロウイルス転移ベクター中にクローニングし、上記バキュロウイルス転移ベクターおよびオートグラフィカ・カリホルニカ核多面体（polyhedrosis）ウイルスゲノムＤＮＡを昆虫細胞に同時形質導入して得られるもの（特許文献１：特表平08-507685）、ヒトポリオーマウイルスをＪＣＶの主要構造タンパク質ＶＰ１を組換えによって昆虫細胞内で発現させたもの（特許文献２：ＷＯ９７／１９１７４）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質、ＨＣＶエンベロープ１（Ｅ１）タンパク質、ＨＣＶエンベロープ２（Ｅ２）タンパク質およびｐ７タンパク質をコードする配列を含むＣ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡを含有するベクターを昆虫細胞内で発現させたもの（特許文献３：特表2001-504337）等が知られている。
【０００３】
しかし、これらのウイルス様粒子は、ゲノムＤＮＡを含む場合には用途が限定される。また、ゲノムＤＮＡを含まない場合もキャプシド内に特定の物質を十分な制御下に封入するのが困難である。さらに、これらのウイルス様粒子の製造方法においては、ウイルス様粒子に含有されるウイルスタンパク質を特異的に認識する免疫試薬を用いて免疫吸着する方法が一般的であるが、こうした手法では精製に多大な手間とコストが掛かる上、ウイルスタンパク質断片も吸着されるため、ウイルス様粒子のみを確実に採取することが困難である。
【０００４】
【特許文献１】特表平０８−５０７６８５
【特許文献２】ＷＯ９７／１９１７４
【特許文献３】特表２００１−５０４３３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ゲノムＤＮＡを含まない純粋なウイルス様粒子を確実かつ高純度に製造し、かつ、キャプシド内在分子の種類や存在態様、配置等の制御を容易に行い得る方法の確立を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ウイルス様粒子を構成するためのウイルスとして生体膜内在性ウイルスに着目した。生体膜内在性ウイルスとは脂質膜をキャプシド内に内包するウイルスであり、その例としてはテクチウイルスファミリーに属する腸内細菌ファージが挙げられる。これらは、大腸菌やサルモネラ菌などのグラム陰性菌を宿主とするウイルスである。
【０００７】
これらのウイルスは、宿主に感染後、菌体内で合成されたキャプシドタンパク質が宿主の脂質膜と結合したウイルス膜タンパク質や他のウイルス構成タンパク質とともにプレカーサー粒子を形成し、最後にＤＮＡをパッケージングして成熟したウイルス粒子となり、溶菌により菌体外に放出されていくといったライフサイクルをもつ。そのため、これらのウイルス粒子は、キャプシドの内側に宿主由来の生体膜を内包する。
【０００８】
一般に生体膜内在性ウイルスは、数十種類のタンパク質を含む大変複雑な構成をしており、従来、ウイルス様粒子を構成するための素材として用いられたことはない。しかし、本発明者らは、これらのウイルスにおいて(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を宿主内で生産させた場合、キャプシドの自己会合が起こり得ること、この場合、膜形成タンパク質は上述のように宿主の生体膜と複合してウイルス様粒子内に存在するため、ウイルス様粒子内への物質の内包を制御して行い得ること、さらに、特にペントンタンパク質のＮ末端にＨｉｓタグを付加することにより、再構成されたウイルス粒子のみを効率的に回収し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のウイルス様粒子、ウイルス様粒子の製造方法並びにウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法を提供する。
〔１〕生体膜内在性ウイルスを構成するタンパク質のうち、(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を含むことを特徴とするウイルス様粒子。
〔２〕生体膜内在性ウイルスがテクチウイルスファミリーに属するウイルスである前記〔１〕に記載のウイルス様粒子。
〔３〕生体膜内在性ウイルスがＰＲ７７２ウイルスまたは上記(1)〜(3)に相当するタンパク質がＰＲ７７２ウイルスと同等のキャプシド再構成挙動を示すウイルスである前記〔１〕または〔２〕に記載のウイルス様粒子。
〔４〕生体膜内在性ウイルスがＰＲ７７２ウイルスであり、(1)キャプシド構成タンパク質がＰ３及びＰ３０、(2)ペントンタンパク質がＰ３１、(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質がＰ１６（但し、これらのタンパク質はこれらとキャプシド再構成挙動が同等である限りにおいて改変されていてもよい。）を含む前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のウイルス様粒子。
〔５〕ペントンタンパク質Ｐ３１がＮ末端にペプチドタグを付加するように改変されたものである前記４に記載のウイルス様粒子。
〔６〕ペプチドタグがＨｉｓタグである前記５に記載のウイルス様粒子。
〔７〕脂質が前記少なくとも一種の膜形成タンパク質との複合体として粒子内に含まれる前記１〜６のいずれかに記載のウイルス様粒子。
〔８〕キャプシド構造の内部に少なくとも一つの作用物質を含有する、前記１〜７のいずれかに記載のウイルス様粒子。
〔９〕作用物質が核酸、ペプチド、脂質、タンパク質および生理学的活性物質からなる群から選択される一種または二種以上の物質である前記８に記載のウイルス様粒子。
〔１０〕作用物質が前記少なくとも一種の膜形成タンパク質と結合してキャプシド構造の内部に存在する前記９に記載のウイルス様粒子。
〔１１〕ウイルス粒子またはウイルス様粒子表面にＮ末端を露出させたタンパク質を含むウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法であって、
(A)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変したウイルス粒子の組み換え体を宿主中で増殖させるか、
(B)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変し、ウイルス様粒子を形成するのに必要な他のタンパク質とともにベクターに組み込み、宿主中で発現させてウイルス様粒子を形成し、
(A)により得られたウイルス粒子または(B)により得られたウイルス様粒子を前記ペプチドタグに親和性のある物質に吸着させて採取することを特徴とする方法。
〔１２〕ペプチドタグがＨｉｓタグであり、ペプチドタグに親和性のある物質がＮｉ含有物質である前記５に記載のウイルス様粒子。
〔１３〕前記Ｎ末端を露出させたタンパク質がペントンタンパク質である前記１１または１２に記載のウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法。
〔１４〕前記１〜１０のいずれかに記載のウイルス様粒子に前記１１〜１３のいずれかに記載の方法を適用することを特徴とする前記１〜１０のいずれかに記載のウイルス様粒子の採取及び／または精製方法。
〔１５〕ＰＲ７７２ウイルスの(1)キャプシド構成タンパク質Ｐ３及びＰ３０、(2)ペントンタンパク質Ｐ３１、(3)膜形成タンパク質Ｐ１６のＮ末端にＨｉｓタグを付加した改変タンパク質を発現ベクター内に組み込み、宿主細胞中で発現させてウイルス様粒子を再構成し、得られた粒子をＮｉアガロースに吸着させて回収精製することを特徴とするＰＲ７７２ウイルス由来のウイルス様粒子の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ウイルス様粒子内への物質の内包を制御して行い得る。また、特にペントンタンパク質のＮ末端にＨｉｓタグを付加することにより、再構成されたウイルス粒子のみを効率的に回収し得る。なお、Ｈｉｓタグ付加による精製方法は組み換えウイルスの精製にも用い得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（Ａ）ウイルス様粒子
はじめに、本発明によるウイルス様粒子について説明する。
本発明によるウイルス様粒子は、生体膜内在性ウイルスを構成するタンパク質のうち、(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を含むことを特徴とする。
【００１２】
ここで、生体膜内在性ウイルスとは、上述の通り、脂質膜をキャプシド内に内包するウイルスであり、一般に数十種類のタンパク質を含むが、本発明のウイルス様粒子では、(1)キャプシド構成タンパク質（主としてキャプシドの面部分を構成するタンパク質）、(2)ペントンタンパク質（主としてキャプシドの頂点部分を構成するタンパク質）、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質のみを含む。従って、キャプシド構成タンパク質が一種類であれば、最少三種類のタンパク質（一般的にはキャプシド構成タンパク質が二種類で、膜形成タンパク質が一種類でよいので四種類のタンパク質）のみでウイルス様粒子を構成できる。
また、キャプシド構成タンパク質はキャプシドの表面を構成するタンパク質であり、ペントンタンパク質はキャプシドの頂点に位置するタンパク質である。
【００１３】
生体膜内在性ウイルスの例としてはテクチウイルスファミリーに属する腸内細菌ファージが挙げられる。例えば、ＰＲＤ１ウイルス粒子は、直径７４ｎｍ、分子量６６ＭＤａで、外側は正二十面体のキャプシドの殻に覆われ、内側に宿主由来の生体膜を内包し、約１５ｋｂｐの二本鎖ＤＮＡをゲノムとして持つ。ＰＲＤ１とゲノムＤＮＡの塩基配列が９７．２％の相同性を有し、ＰＲＤ１と同一のウイルス粒子構造をもつと考えられるＰＲ７７２（ＡＴＣＣ：American Type Culture Collectionにおけるカタログ＃BAA-769-B1）が好適に使用できる。ＰＲ７７２はウイルス用フィルタ評価基準で広く流通しており、ＰＲＤ１よりも汎用性があるためである。なお、生体膜内在性ウイルスはテクチウイルス以外の種でもよい。そのような例としては、コルチコウイルスに属する海洋性細菌ファージＰＭ２(ＡＴＣＣにおけるカタログ＃27025-B1)が挙げられる。ＰＭ２は直径約６０nmの正二十面体構造で、粒子のキャプシドは複数の層状を示し、正二十面体の各頂点には突起構造が見られ、約１０kbpの環状の二本鎖 ＤＮＡをゲノムとして持つ。
【００１４】
以下、ＰＲ７７２ウイルスを例として述べるが、生体膜内在性ウイルスがＰＲ７７２ウイルスまたは上記(1)〜(3)に相当するタンパク質がＰＲ７７２ウイルスと同等のキャプシド再構成挙動を示すウイルスも同様に利用できる。なお、ここで、「ＰＲ７７２ウイルスと同等のキャプシド再構成挙動を示す」とは、必要なコピー数の(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を宿主内で生成させたときにＰＲ７７２ウイルスと同程度以上のキャプシド再構成能力を示すことを言う。
【００１５】
ＰＲ７７２ウイルスにおけるキャプシド構成タンパク質は、メジャーキャプシドタンパク質Ｐ３とマイナーキャプシドタンパク質Ｐ３０である。ペントンタンパク質はＰ３１である。膜形成タンパク質はＰ７，Ｐ１１，Ｐ１４，Ｐ１６，Ｐ１８，Ｐ３２，Ｐ３４が含まれるが、Ｐ１６が好適に用いられる。これらの配列は既知であり、それぞれ配列表の配列番号１〜４のアミノ酸配列を有する。但し、これらのタンパク質はこれらとキャプシド再構成挙動が同等である限りにおいて改変されていてもよい。改変は、タンパク質粒子の基本構造に大きな変更をもたらさない限りにおいてフォールドされたタンパク質粒子の内部に位置するアミノ酸の置換、付加、欠失、タンパク質粒子間の自己会合に大きな変更をもたらさない限りにおいてタンパク質粒子の内部に位置するアミノ酸の置換、付加及び／または欠失を含む。相同性において９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上有するタンパク質でもよい。なお、欠失において相同性９０％以上では欠失後のタンパク質の配列長さはＰ３の配列長さの９０％以上である。
【００１６】
但し、これらのタンパク質はこれらとキャプシド再構成挙動が同等である限りにおいて改変されていてもよい。このような改変の例としては、ペントンタンパク質Ｐ３１Ｎ末端へのペプチドタグの付加が挙げられる。ペプチドタグとしては親水性ペプチド、例えば、Ｈｉｓタグの付加が挙げられる。もっとも、Ｈｉｓタグと同様にアフィニティー精製可能なタグを付加してもよい。このようなタグはキャプシド再構成挙動に大きな影響を与えない限りにおいて特に限定されないが、その例としてはＨｉｓタグの他にＳ−タグ等が挙げられる。
【００１７】
上記の生体膜内在性ウイルスは、宿主に感染後、菌体内で合成されたキャプシドタンパク質が宿主の脂質膜と結合したウイルス膜タンパク質や他のウイルス構成タンパク質とともにプレカーサー粒子を形成し、最後にＤＮＡをパッケージングして成熟したウイルス粒子となり、溶菌により菌体外に放出されていくといったライフサイクルを持つが、上記の各タンパク質から構成されるウイルス様粒子も、脂質膜を前記少なくとも一種の膜形成タンパク質との複合体として粒子内に含む。
【００１８】
本発明のウイルス様粒子はキャプシド内部にゲノムＤＮＡを含まず、種々の作用物質を含み得る。このような作用物質の例としては核酸、ペプチド、脂質、タンパク質および生理学的活性物質等が挙げられる。生理学活性物質の例としては、上記以外の構造を有する医薬やトキシン等が挙げられる。これらの二種以上を含んでもよい。薬剤を含有させた場合は、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に用いることが可能である。また、本発明においては、作用物質を前記少なくとも一種の膜形成タンパク質と結合してキャプシド構造の内部に内包させることができる。従って、膜形成タンパク質と作用物質との結合態様を調整することにより、作用物質をウイルス粒子内で制御された状態で配置することが可能となり、作用物質の解析等にも応用することが可能となる。また、本発明のウイルス様粒子はキャプシド内部に生体膜を内包しているため、前記作用物質を生体膜と接触させたり、前記作用物質が生体膜を貫通したり、膜内に存在するように配置することができる。さらに、外部から薬物を投与し、キャプシドの隙間を通じて薬物を内部に進入させ、生体膜と相互作用させることも可能である。このため、細胞膜システムのバイオセンサーのプラットホームとしても使用可能となり得る。
【００１９】
（Ｂ）ウイルス様粒子の製造方法
ウイルス様粒子の再構成系としては、ウイルス粒子形成に必要なタンパク質（ＰＲ７７２ウイルスでは、メジャーキャプシドタンパク質Ｐ３、膜タンパク質
Ｐ１６、マイナーキャプシドタンパク質 Ｐ３０、ペントンタンパク質 Ｐ３１の４種のタンパク質）を同一の宿主内で発現させ、ウイルスタンパク質の自己会合により菌体内でウイルス粒子を形成させる。宿主としては当該ウイルスが通常宿主としているものであれば特に限定されないが、好ましくは大腸菌が使用できる。
【００２０】
以下、ＰＲ７７２ウイルス−大腸菌系を例として述べるが、他の生体膜内在性ウイルス−宿主系でも当業者であれば適宜修正を加えて同等な操作が可能である。
はじめに、ＰＲ７７２ウイルスのゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐ３、Ｐ１６、Ｐ３０、Ｐ３１の翻訳領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、大腸菌用発現ベクターを用いて、同一の大腸菌でこれら４種のウイルスタンパク質を発現させる。このようなベクターとしては、pDuetcoexpression vectors(Novagen 社)の4種の発現ベクターpETDuet1、pACYCDuet1、pRSFDuet1、pCDFDuet1のうち、pETDuet1（図１）あるいはpCDFDuet1（図２）に２種ずつ挿入して構築した発現用プラスミドが好ましい。pDuetcoexpression vectorsの4種の発現ベクターは、各プラスミドが異なる複製開始点と薬剤耐性遺伝子をもつため、同時に同一の大腸菌に導入することが可能であるとともに、各ベクターは２種の目的タンパク質を大腸菌で発現できるように設計されているので、最大８種の目的タンパク質を同一の大腸菌で発現させることが可能である。各タンパク質はウイルス様粒子を構成するのと同様の量比で生成させることが好ましい。すなわち、これらのタンパク質がウイルス粒子内ではｍｉ個のｎｉ量体として存在する場合は、各タンパク質を概ねｍｉ×ｎｉコピーまたはその整数倍ずつ生成するように発現させる。
【００２１】
ここで、ペントンタンパク質 Ｐ３１（配列番号３）のＮ末端にはヒスチジンタグを付加した組換えウイルスタンパク質（Ｈｉｓ−Ｐ３１）を用いることが好ましい。例えば、上記のpDuetcoexpression vectors （Novagen社）の４種の各ベクターは、６つのＨｉｓをコードする塩基配列（Ｈｉｓタグ）がベクターに組み込まれており、その下流には数種類の制限酵素切断部位があるため、Ｈｉｓタグとフレームが合うように目的タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入すれば、そのＮ末端にＨｉｓタグを付けることが可能である。もっとも、Ｈｉｓタグ以外のアフィニティー精製用タグを付加してもよい。これらのタグの付加は遺伝子組み換え技術により付加が可能である。
【００２２】
大腸菌の菌体内で、ウイルスタンパク質の自己会合によりウイルス様粒子（ＶＬＰ）が再構成されたか否かは、大腸菌を超音波処理により破砕後、適当な平衡密度勾配超遠心（例えば、塩化セシウムの平衡密度勾配超遠心やショ糖の密度勾配超遠心）等によって遠心し、野生型ＰＲ７７２ウイルスを大腸菌に感染させて得た溶菌液をコントロールとしてバンドの確認によって行なうことができる。
【００２３】
本発明ではペプチドタグ等のアフィニティー精製用タグを付加した場合は、対応する親和性（吸着）物質を適当な担体に固定化したもの（Ｈｉｓタグの場合、Ｎｉ−アガロース；Ｓタグの場合、Ｓ-proteinアガロースなど）を用いて精製を行なうことにより、高純度のウイルス様粒子を効率的に回収精製できる。例えば、Ｎｉ−アガロースを用いてアフィニティー精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓを、限外濾過膜で濃縮後、適当な平衡密度勾配超遠心（例えば、塩化セシウムの平衡密度勾配超遠心やショ糖の平衡密度勾配超遠心）にかけてさらに精製を行なうことにより精製度の高い試料を得ることができる。こうした高純度ウイルス様粒子を結晶化させた場合、内包した物質のＸ線構造解析等の解析に利用できる可能性がある。このような物質の例としては、特に生体膜内での構造の解析が大きな課題となっている受容体タンパク質が挙げられる。受容体タンパク質の例には膜貫通型の種々のタンパク質が含まれるが、特にGタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）タンパク質が挙げられる。
【００２４】
（Ｃ）ウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法
上記のウイルス様粒子の製造方法は、ゲノムを内包するウイルス粒子の組み換え体に適用することも可能である。すなわち、本発明は、ウイルス粒子またはウイルス様粒子表面にＮ末端を露出させたタンパク質を含むウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法であって、
(A)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変したウイルス粒子の組み換え体を宿主中で増殖させるか、
(B)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変し、ウイルス様粒子を形成するのに必要な他のタンパク質とともにベクターに組み込み、宿主中で発現させてウイルス様粒子を形成し、
(A)により得られたウイルス粒子または(B)により得られたウイルス様粒子を前記ペプチドタグに親和性のある物質に吸着させて採取することを特徴とする方法全般を含む。ここで、ペプチドタグは、対応する親和性物質が存在する限りにおいて特に限定されないが、上述の通り、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ等が挙げられる。親和性物質は適当な担体、例えば、アガロース分子等に固定して用いることが好ましい。Ｎ末端にペプチドタグを付加したタンパク質としては、上記の通り、ペントンタンパク質が好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
ＰＲ７７２ウイルス（ＡＴＣＣカタログ＃BAA-769-B1）のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐ３、Ｐ１６、Ｐ３０、Ｐ３１の翻訳領域を含むＤＮＡ断片を、それぞれの塩基配列内に制限酵素の認識配列（下線部）を含むように設計した以下に示すプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの条件も以下に示す。
【００２７】
Ｐ３
5’側プライマー（PR772-8582-NdeI-F）：5’-cggagtaattaCatatggcacag-3’ （配列番号５）
3’側プライマー（PR772-9829-BglII-R）：5’-attccgccaGatcTgtgattagct-3’ （配列番号６）
PCRの条件：94℃、5分→60℃、1分→68℃、1.5分（１サイクル）
94℃、30秒→60℃、30秒→68℃、1.5分（29サイクル）
【００２８】
Ｐ１６
5’側プライマー（PR772-11823-NcoI-F）：5’-ttaaggggtaaaCcatggacaaaa-3’（配列番号７）
3’側プライマー（PR772-12278-NotI-R）：5’-gaacaaccGcggccGctaggcgcg-3’ （配列番号８）
PCRの条件：94℃、5分→60℃、1分→68℃、1分（１サイクル）
94℃、30秒→60℃、30秒→68℃、1分（29サイクル）
【００２９】
Ｐ３０
5’側プライマー（PR772-10822-NcoI-F）：5’-taagggggtaCcatggcactgatt-3’ （配列番号９）
3’側プライマー（PR772-11107-EcoRI-R）：5’-aaaatggcggAAttcatccttagc-3’（配列番号１０）PCRの条件：94℃、5分→60℃、1分→68℃、1分（１サイクル）
94℃、30秒→60℃、30秒→68℃、1分（29サイクル）
【００３０】
Ｐ３１
5’側プライマー（PR772-4896-NdeI-F）： 5’-aaggtgtaaCAtatgaatgtgaat-3’（配列番号１１）
3’側プライマー（PR772-5323-KpnI-R）： 5’-cgttaccgtgGtAccgccgatttg-3’ （配列番号１２）
PCRの条件：94℃、5分→60℃、1分→68℃、1分（１サイクル）
94℃、30秒→60℃、30秒→68℃、1分（29サイクル）
【００３１】
なお、上記において（ ）内はプライマー名称で、そのうちの数字は、PR772ゲノムDNAの塩基配列（GenBank ACCESSION No. AY848688）における塩基番号に相当し、プライマーの5’末端の位置を示す。また、その数字の次は制限酵素名を示し、そのプライマーが名称に示した制限酵素で切断されることを示す。プライマーの塩基配列のうち大文字は、もとの塩基からその塩基に置換させたことを示し、その塩基に置換することでプライマー中に下線で示した制限酵素の認識配列を作製した。
【００３２】
次いで、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素で消化し、大腸菌用発現ベクターpDuetcoexpression vectors （Novagen社）の４種の発現ベクター pETDuet1（図１）、pACYCDuet1、pRSFDuet1、pCDFDuet1（図２）のうち、まず、Ｐ３のNdeI-BglII断片（約1.2kbp）とＰ１６のNcoI-NotI断片（約0.4kbp）をpETDuet1のNcoI-NotI部位とNdeI-BglII部位にそれぞれ挿入してＰ１６とＰ３の発現用プラスミドpETDuet1/P16-P3を構築した。一方、Ｐ３０のNcoI-EcoRI断片（約0.3kbp）とＰ３１のNdeI-KpnI断片（約0.4kbp）をpCDFDuet1のNcoI-EcoRI部位とNdeI-KpnI部位にそれぞれ挿入してＰ３０とＰ３１の発現用プラスミドpCDFDuet1/P30-P31を構築した。pETDuet1/P16-P3とpCDFDuet1/P30-P31を同時に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して得た形質転換体をOvernight Express Autoinduction System（Novagen社）のＴＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間培養してウイルス蛋白質の発現を誘導させ、これら４種のウイルス蛋白質を発現させることに成功した。Overnight Express Autoinduction Systemは、IPTGで誘導可能な大腸菌の発現系において、高レベルのタンパク質誘導発現を自動的に行なわれるように設計された培地システムである。
【００３３】
この大腸菌の菌体内で、ウイルスタンパク質の自己会合によりウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）が再構成されたかを調べるため、大腸菌を超音波処理により破砕後、野生型ＰＲ７７２ウイルスを大腸菌に感染させて得た溶菌液をコントロールとして、塩化セシウムの平衡密度勾配超遠心を行った。その結果、野生型（ｗｔ）では、ウイルス粒子を含むと思われる乳白色のバンドが２本（ＵとＬ）検出され、再構成系（ＶＬＰｓ）でも、野性型のＵバンドとほぼ同じ位置とその下方にＶＬＰｓ形成により生じたと思われるバンドが２本検出された。そこで、これらのバンドを回収し、ＳＤＳ−１４％ ＰＡＧＥで解析した結果、野生型でも再構成系でも同様な泳動パターンが観察され、再構成系のＵ及びＬバンドに４種のウイルスタンパク質も検出された。
【００３４】
さらに、原子間力顕微鏡を用いて観察したところ、野生型（ｗｔ）のＵバンドには、ＰＲ７７２ウイルス粒子と考えられる直径約６７ｎｍの球状の粒子が観察された（図３Ａ）。一方、再構成系（ＶＬＰｓ）のＵバンドには直径約５２ｎｍや約７５ｎｍの粒子も混在していたが、野性型とほぼ等しい約６５ｎｍの球状の粒子を確認できた（図３Ｂ）。なお、図には示していないが、再構成系のＬバンドにおいても、約６５ｎｍの球状の粒子を確認できた。
【００３５】
つぎに、再構成させたＶＬＰｓが宿主由来の脂質膜を内包しているかどうかを調べるため、ＶＬＰｓからBligh & Dyer法により総脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィーにより分析した。野性型ＰＲ７７２ウイルスを大腸菌に感染させて得た溶菌液（ｗｔ）と、４種のウイルスタンパク質を共発現させた大腸菌（ＶＬＰｓ）及びネガティブコントロールとして外来タンパク質などを発現させていない宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の超音波破砕液を、塩化セシウムの平衡密度勾配超遠心にかけ、ウイルスタンパク質を含む各分画（上層Ｕ、下層Ｌ１及びＬ２）を回収した。まず回収した分画に含まれるタンパク質をＳＤＳ−１４％ＰＡＧＥにより解析した。野性型（ｗｔ）及び再構成系（ＶＬＰｓ）では、Ｕ及びＬ１分画にウイルスタンパク質が確認された。
【００３６】
ＰＲ７７２ウイルスの脂質成分に関する報告はないが、ＰＲＤ１ウイルスでは、キャプシドの内側に存在する脂質膜の主成分はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、及びカルジオリピン（ＣＬ）である。ＰＲ７７２もこれらの脂質を含んでいることが推測され、再構成ＶＬＰｓが宿主由来の生体膜を内包していれば、これらの脂質が検出されると予想された。これら３種の脂質をスタンダードとして、回収した各分画から抽出した脂質をシリカゲル薄層プレート（silica gel 60 F254、Merck社）にスポットし、クロロホルム／メタノール／酢酸（６５：２５：１０）の溶媒にて展開後、ヨウ素蒸気法により脂質の検出を行った。その結果、野生型（ｗｔ）は予想通りＰＥ、ＰＧ、ＣＬを含んでおり、再構成系（ＶＬＰｓ）の場合にもＵとＬ１分画でこれら３種の脂質が検出された。対応する宿主大腸菌の画分からはこれらの脂質が殆ど検出されなかったことから、再構成ＶＬＰｓは宿主大腸菌由来の生体膜を内包していると考えられた。
【００３７】
さらに、透過型電子顕微鏡を用いネガティブ染色法によりＶＬＰｓの形態観察を行った（図４）。野生型（ｗｔ）のＵバンドでは直径５０〜６３ｎｍの粒子が観察された（図４Ａ）。再構成系（ＶＬＰｓ）では、Ｕ、Ｌバンドとも、直径約４２ｎｍの小さな粒子や約８８ｎｍの大きな粒子も混在していたが、大多数の粒子は直径５４〜６８ｎｍで、粒子の内側には膜と思われる形態も観察された（図４Ｂ）。以上の結果より、４種のウイルスタンパク質Ｐ３、Ｐ１６、Ｐ３０、Ｐ３１を同一の大腸菌で発現させることにより、生体膜内在性のウイルス粒子を再構成させることに成功したと考えられる。
【００３８】
実施例２
塩化セシウムの平衡密度勾配超遠心により精製した実施例１のＶＬＰｓでは、図４の電子顕微鏡写真で観察されるように、膜の凝集体やキャプシドタンパク質と思われる構造体が混在していた。結晶化を行うためには純度の高いＶＬＰｓの調製が必要である。ＶＬＰｓにＨｉｓタグを付け、Ｎｉ−アガロースを用いたアフィニティー精製を試みた。Ｈｉｓタグとしては、Ｈｉｓ×６を用いた。
【００３９】
具体的には、ペントン蛋白質のＮ末端にＨｉｓタグを付けるため、発現用プラスミドを新たに構築した。
＜Ｈｉｓ・Ｐ３１とＰ３０の発現用プラスミドの構築＞
実施例１と同様に、ＰＲ７７２ウイルスのゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐ３０、Ｐ３１の翻訳領域を含むＤＮＡ断片を、それぞれの塩基配列内に制限酵素の認識配列（下線部）を含むように設計した以下に示すプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの条件は実施例１と同じである。
【００４０】
Ｐ３０
5’側プライマー（PR772-10820-NdeI-F）：5’-tttaagggggtCaTatggcactg-3’ （配列番号１３）
3’側プライマー（PR772-11161-XhoI-R）：5’-atgcaatgCtcgAggcctagcca-3’ （配列番号１４）
【００４１】
Ｐ３１
5’側プライマー（PR772-4892-HindIII-F）： 5’-ttcaaaggtgAaGCttatgaatgt-3’（配列番号１５）
3’側プライマー（PR772-5321-NotI-R）：5’-ttaccgtgctgcGgccgCtttgtt-3’ （配列番号１６）
【００４２】
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素で消化し、Ｐ３０のNdeI-XhoI断片（約0.3kbp）とＰ３１のHindIII-NotI断片（約0.4kbp）をpCDFDuet1のHindIII-NotI部位とNdeI-XhoI部位にそれぞれ挿入してＰ３０とＨｉｓ・Ｐ３１の発現用プラスミドpCDFDuet1/His・P31-P30を構築した。ベクターのHindIII部位はヒスチジンタグの下流に位置し、従って、Ｐ３１の翻訳領域はヒスチジンタグとフレームが合うように挿入した。この発現用プラスミドを用いてＰ３１を大腸菌で発現させると、実際は、Ｐ３１のＮ末端に
MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerGlnAspProAsnSerSerSerAlaArgLeuGlnValAspLysLeu
というアミノ酸配列（２６アミノ酸残基）からなるペプチドが付加することになる（下線部Hisタグ；ベクターのマップ参照）。
【００４３】
このように、Ｐ３１に代えてＨｉｓ−Ｐ３１を用いたほかは実施例１と同様にして、Ｐ３、Ｐ１６及びＰ３０とともにＨｉｓ−Ｐ３１を同一の大腸菌で発現させ、超音波処理により破砕後、前述と同様に、超遠心によりＨｉｓ−ＶＬＰｓを含むバンドを回収、以下に示すＮｉ−アガロース及び試薬を用いてＨｉｓ−ＶＬＰｓのアフィニティー精製を行なった。
【００４４】
＜試薬＞
・Ni-NTA-アガロース（QIAGEN 社）
・Binding buffer : 0.5M NaCl、20mM Tris・HCl（pH 8.0）、1mM MgCl2、10mM イミダゾール
・Wash buffer : 0.5M NaCl、20mM Tris・HCl（pH 8.0）、1mM MgCl2、20mM イミダゾール
・Elution buffer : 0.5M NaCl、20mM Tris・HCl（pH 8.0）、1mM MgCl2、1M イミダゾール
・TM buffer : 10mM Tris・HCl（pH 7.5）、1mM MgCl2
【００４５】
すなわち、超遠心により回収したウイルス様粒子を含むフラクションを透析チューブに移して Binding buffer に４℃で一晩透析した後、試料を別のチューブに移した。しかる後、Binding buffer で平衡化した Ni-NTA-アガロース（試料の１／３〜１／４容）を投入し、ローテーターを用いて４℃で二晩撹拌しながら吸着させた。吸着後、遠心（３０００回転 １分、４℃）によりビーズを回収し、Binding buffer（ビーズの５〜１０倍容）を加えてローテーターを用いて４℃で１０分間、撹拌しながら洗浄（３回）した。遠心（３０００回転 １分、４℃）によりビーズを回収し、Wash buffer （ビーズの５〜１０倍容）を加えてローテーターを用いて４℃で３０分間撹拌しながら洗浄（２回）した。遠心（３０００回転 １分、４℃）によりビーズを回収し、Elution buffer（ビーズと等容〜２倍容）を加えてローテーターを用いて４℃で一晩撹拌しながら溶出し、透析チューブに移して TM buffer に４℃で一晩透析した後、別のチューブに移して４℃で保存した。
【００４６】
なお、ネガティブコントロールとして、超遠心によりＶＬＰｓを含むバンドを回収し、Ｈｉｓ−ＶＬＰｓと同条件でアフィニティー精製を行なった。Ｎｉ−アガロースにより精製された試料をＳＤＳ−１４％ＰＡＧＥ解析した結果、Ｈｉｓ−ＶＬＰｓにはＰ３、Ｐ１６、Ｐ３０、Ｈｉｓ−Ｐ３１のバンドが検出されたが、ＶＬＰｓにはＰ３、Ｐ１６、Ｐ３０、Ｐ３１のバンドが検出されなかった。精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓから抽出した総脂質を薄層クロマトグラフィーで分析した結果、野生型と同じ脂質成分を含んでいることを確認できた。さらに、電子顕微鏡を用いた形態観察では、直径６２〜６３ｎｍの均一のＨｉｓ−ＶＬＰｓが観察され（図５Ａ）、内側に膜と思われる形態を示す粒子も観察された（図５Ｂ、図５Ｃ）。よって、粒子の表面にＨｉｓタグの付いた生体膜内在性のウイルス様粒子Ｈｉｓ−ＶＬＰｓを再構成させ、精製することに成功した。
【００４７】
結晶化の試料として、より純度の高い試料を調製するため、前述と同様の方法で大腸菌を大量培養してＮｉ−アガロースを用いてアフィニティー精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓを、限外濾過膜で濃縮後、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心にかけてさらに精製を試みた。その結果、アフィニティー精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓよりも精製度の高い試料を得ることができた（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によれば、わずか数種類のタンパク質だけで野生型と比較してもほぼ同様な粒子径のキャプシドを再構成できる。さらに、このウイルスキャプシドは、野生型と同様に生体膜を内在している。これから、このウイルスキャプシドは、生理活性物質等を内包するための安定なプラットホームとなりうることがわかった。従って、ＤＤＳとして有用である。また、本発明のウイルス様粒子では、これらの内包物質を生体膜内で制御された状態で配置させることが可能であると考えられるので、様々な細胞内情報伝達系の研究や生化学的な機能解析に画期的な影響を与えるものと期待される。さらに、工業的には、様々な種類の酵素タンパク質を適切に再配置させることで、人工的にタンパク質複合体を作り上げることが容易に出来る。そのため、目的の酵素活性を持つ人工的なマシーナリーを作製する基本的な技術となり得る。
なお、本発明は、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（ＮＥＤＯ技術開発機構）の平成１７年度第２回「産業技術研究助成事業」により助成を受けた研究上の発明である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明において発現用ベクターとして用いたpETDuet1の遺伝子地図。
【図２】本発明において発現用ベクターとして用いたpCDFDuet1の遺伝子地図。
【図３Ａ】野生型（ｗｔ）ウイルス粒子の原子間力顕微鏡写真。
【図３Ｂ】本発明により製造したウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の原子間力顕微鏡写真。
【図４Ａ】野生型（ｗｔ）ウイルス粒子の原子間力顕微鏡写真。
【図４Ｂ】本発明により製造したウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の透過型電子顕微鏡。
【図５Ａ】本発明により製造したウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡。
【図５Ｂ】本発明により製造したウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡。
【図５Ｃ】本発明により製造したウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡。
【図６Ａ】本発明により製造したＨｉｓ−タグ付加ウイルス様粒子（Ｈｉｓ−ＶＬＰｓ）及び野生型タンパク質のＳＤＳ−１４％ＰＡＧＥのＣＢＢ染色図、銀染色図、ウエスタンブロット透過型電子顕微鏡（Ａ；図中、１は超遠心後、Ｎｉ−アガロースで精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓ、２は１を限外濾過膜で濃縮後、超遠心で精製したＨｉｓ−ＶＬＰｓ、ｗｔはＰＲ７７２野生型ウイルス）。
【図６Ｂ】図６Ａにおける２の電子顕微鏡写真。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体膜内在性ウイルスを構成するタンパク質のうち、(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を含むことを特徴とするウイルス様粒子。
【請求項２】
生体膜内在性ウイルスがテクチウイルスファミリーに属するウイルスである請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項３】
生体膜内在性ウイルスがＰＲ７７２ウイルスまたは上記(1)〜(3)に相当するタンパク質がＰＲ７７２ウイルスと同等のキャプシド再構成挙動を示すウイルスである請求項１または２に記載のウイルス様粒子。
【請求項４】
生体膜内在性ウイルスがＰＲ７７２ウイルスであり、(1)キャプシド構成タンパク質がＰ３及びＰ３０、(2)ペントンタンパク質がＰ３１、(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質がＰ１６（但し、これらのタンパク質はこれらとキャプシド再構成挙動が同等である限りにおいて改変されていてもよい。）を含む請求項１〜３のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項５】
ペントンタンパク質Ｐ３１がＮ末端にペプチドタグを付加するように改変されたものである請求項４に記載のウイルス様粒子。
【請求項６】
ペプチドタグがＨｉｓタグである請求項５に記載のウイルス様粒子。
【請求項７】
脂質が前記少なくとも一種の膜形成タンパク質との複合体として粒子内に含まれる請求項１〜６のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項８】
キャプシド構造の内部に少なくとも一つの作用物質を含有する、請求項１〜７のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項９】
作用物質が核酸、ペプチド、脂質、タンパク質および生理学的活性物質からなる群から選択される一種または二種以上の物質である請求項８に記載のウイルス様粒子。
【請求項１０】
作用物質が前記少なくとも一種の膜形成タンパク質と結合してキャプシド構造の内部に存在する請求項９に記載のウイルス様粒子。
【請求項１１】
ウイルス粒子またはウイルス様粒子表面にＮ末端を露出させたタンパク質を含むウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法であって、
(A)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変したウイルス粒子の組み換え体を宿主中で増殖させるか、
(B)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変し、ウイルス様粒子を形成するのに必要な他のタンパク質とともにベクターに組み込み、宿主中で発現させてウイルス様粒子を形成し、
(A)により得られたウイルス粒子または(B)により得られたウイルス様粒子を前記ペプチドタグに親和性のある物質に吸着させて採取することを特徴とする方法。
【請求項１２】
ペプチドタグがＨｉｓタグであり、ペプチドタグに親和性のある物質がＮｉ含有物質である請求項５に記載のウイルス様粒子。
【請求項１３】
前記Ｎ末端を露出させたタンパク質がペントンタンパク質である請求項１１または１２に記載のウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のウイルス様粒子に請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法を適用することを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のウイルス様粒子の採取及び／または精製方法。
【請求項１５】
ＰＲ７７２ウイルスの(1)キャプシド構成タンパク質Ｐ３及びＰ３０、(2)ペントンタンパク質Ｐ３１、(3)膜形成タンパク質Ｐ１６のＮ末端にＨｉｓタグを付加した改変タンパク質を発現ベクター内に組み込み、宿主細胞中で発現させてウイルス様粒子を再構成し、得られた粒子をＮｉアガロースに吸着させて回収精製することを特徴とするＰＲ７７２ウイルス由来のウイルス様粒子の製造方法。
【請求項１】
生体膜内在性ウイルスを構成するタンパク質のうち、(1)キャプシド構成タンパク質、(2)ペントンタンパク質、及び(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質を含むことを特徴とするウイルス様粒子。
【請求項２】
生体膜内在性ウイルスがテクチウイルスファミリーに属するウイルスである請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項３】
生体膜内在性ウイルスがＰＲ７７２ウイルスまたは上記(1)〜(3)に相当するタンパク質がＰＲ７７２ウイルスと同等のキャプシド再構成挙動を示すウイルスである請求項１または２に記載のウイルス様粒子。
【請求項４】
生体膜内在性ウイルスがＰＲ７７２ウイルスであり、(1)キャプシド構成タンパク質がＰ３及びＰ３０、(2)ペントンタンパク質がＰ３１、(3)少なくとも一種の膜形成タンパク質がＰ１６（但し、これらのタンパク質はこれらとキャプシド再構成挙動が同等である限りにおいて改変されていてもよい。）を含む請求項１〜３のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項５】
ペントンタンパク質Ｐ３１がＮ末端にペプチドタグを付加するように改変されたものである請求項４に記載のウイルス様粒子。
【請求項６】
ペプチドタグがＨｉｓタグである請求項５に記載のウイルス様粒子。
【請求項７】
脂質が前記少なくとも一種の膜形成タンパク質との複合体として粒子内に含まれる請求項１〜６のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項８】
キャプシド構造の内部に少なくとも一つの作用物質を含有する、請求項１〜７のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項９】
作用物質が核酸、ペプチド、脂質、タンパク質および生理学的活性物質からなる群から選択される一種または二種以上の物質である請求項８に記載のウイルス様粒子。
【請求項１０】
作用物質が前記少なくとも一種の膜形成タンパク質と結合してキャプシド構造の内部に存在する請求項９に記載のウイルス様粒子。
【請求項１１】
ウイルス粒子またはウイルス様粒子表面にＮ末端を露出させたタンパク質を含むウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法であって、
(A)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変したウイルス粒子の組み換え体を宿主中で増殖させるか、
(B)前記タンパク質をコードする遺伝子をそのＮ末端にペプチドタグを付加したタンパク質をコードするように改変し、ウイルス様粒子を形成するのに必要な他のタンパク質とともにベクターに組み込み、宿主中で発現させてウイルス様粒子を形成し、
(A)により得られたウイルス粒子または(B)により得られたウイルス様粒子を前記ペプチドタグに親和性のある物質に吸着させて採取することを特徴とする方法。
【請求項１２】
ペプチドタグがＨｉｓタグであり、ペプチドタグに親和性のある物質がＮｉ含有物質である請求項５に記載のウイルス様粒子。
【請求項１３】
前記Ｎ末端を露出させたタンパク質がペントンタンパク質である請求項１１または１２に記載のウイルス粒子の組み換え体またはウイルス様粒子の採取及び／または精製方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のウイルス様粒子に請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法を適用することを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のウイルス様粒子の採取及び／または精製方法。
【請求項１５】
ＰＲ７７２ウイルスの(1)キャプシド構成タンパク質Ｐ３及びＰ３０、(2)ペントンタンパク質Ｐ３１、(3)膜形成タンパク質Ｐ１６のＮ末端にＨｉｓタグを付加した改変タンパク質を発現ベクター内に組み込み、宿主細胞中で発現させてウイルス様粒子を再構成し、得られた粒子をＮｉアガロースに吸着させて回収精製することを特徴とするＰＲ７７２ウイルス由来のウイルス様粒子の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【公開番号】特開２００９−１２５００５（Ｐ２００９−１２５００５Ａ）
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３０３８３２（Ｐ２００７−３０３８３２）
【出願日】平成１９年１１月２４日（２００７．１１．２４）
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里研究所 (180)
【出願人】（５９９０３５６２７）学校法人加計学園 (43)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２４日（２００７．１１．２４）
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里研究所 (180)
【出願人】（５９９０３５６２７）学校法人加計学園 (43)
【Ｆターム（参考）】
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