生存性の低い胞子を作る糸状菌の作成方法
【課題】形質転換の宿主となる糸状菌の胞子のストレス抵抗性を低減させることで、管理区域外に飛散した糸状菌胞子を死滅しやすくさせる、生存性の低い胞子を作る糸状菌の作成方法及び生存性の低い胞子を作る糸状菌を提供すること。
【解決手段】糸状菌の胞子の生存性を低減させる方法は、糸状菌の転写制御因子タンパク質をコードするatfA遺伝子のコード領域の全部若しくは一部を欠失させ又は変異させて前記糸状菌の胞子の生存性を低減させることを含む。
【解決手段】糸状菌の胞子の生存性を低減させる方法は、糸状菌の転写制御因子タンパク質をコードするatfA遺伝子のコード領域の全部若しくは一部を欠失させ又は変異させて前記糸状菌の胞子の生存性を低減させることを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胞子（分生子）の生存性を低減せしめた、特にバイオハザード対策に好適な糸状菌の作成に関するものであって、更に詳細には、本発明は遺伝子工学的手法を用いて得られる生存性を低めた分生子を作る糸状菌、及び当該形質転換糸状菌の作出方法、並びに糸状菌分生子の生存性を低める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌はタンパク質の分泌能力が高く、様々な物質を発酵生産する際に利用される。近年これら糸状菌を宿主とした形質転換体を作成してさらなる有用菌株の作成が行われており、一般的に形質転換体の安全性は確認されないままではあるが、定められた管理区域内で厳密に管理されている。
【０００３】
しかし糸状菌の分生子は空気中に飛散しやすく、これらを閉鎖環境中にとどめておくためには多大な労力が必要である。万が一環境中へ出た場合、糸状菌の形質転換体は容易に増殖可能であり、これらの形質転換糸状菌はさらなる胞子を形成することで、繁殖範囲を広げていくと考えられており、バイオハザード対策は、当業界における緊急の課題となっている。（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
【非特許文献１】「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、ｐ．８２２−８２３（１９８６年１０月９日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はバイオハザードをできる限り低減、防止する技術を開発するためになされたものであって、各方面から鋭意検討の結果、管理区域外に飛散した糸状菌胞子を死滅させればよいとの観点に立ち、そのためには形質転換の宿主となる糸状菌の胞子のストレス抵抗性を低減させる必要がある点に着目した。
【０００６】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、形質転換の宿主となる糸状菌の胞子のストレス抵抗性を低減させることで、管理区域外に飛散した糸状菌胞子を死滅しやすくさせることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであって、転写制御因子遺伝子（ＡＴＦ遺伝子群）の解析の過程において、麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のａｔｆＡ遺伝子を欠失させたところ、胞子の生存性が低下することをはじめて見出し、そして更に、このａｔｆＡ遺伝子欠失株は紫外線等のストレスを与えると容易に死滅することもはじめて確認し、これらの有用新知見を基礎に更に研究の結果ついに完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、糸状菌の転写制御因子タンパク質をコードするatfA遺伝子のコード領域の全部若しくは一部を欠失させ又は変異させて前記糸状菌の胞子の生存性を低減させることを含む、糸状菌の胞子の生存性を低減させる方法を提供する。また、本発明は、atfA遺伝子のコード領域よりも上流の領域を含む領域と相同な第１の領域と、前記atfA遺伝子のコード領域よりも下流の領域を含む領域と相同な第２の領域を有し、正常なatfA遺伝子を含まないDNA断片を提供する。さらに、本発明は、前記本発明の方法により胞子の生存性が低減された糸状菌を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、生存性の低い胞子を作る糸状菌を作成することができ、作出された糸状菌は紫外線等に当たると容易に死滅するという特性を有する。したがって、糸状菌を宿主とした各種形質転換体がたとえ管理区域外に飛散したとしても、本発明に係るこれらの形質転換体は短時間に死滅するため、バイオハザードが未然に防止されるという著効が奏される。
【００１０】
そのため、糸状菌を対象とする遺伝子操作技術を各種広範に適用することができ、その際、バイオハザードを過度に心配することなく、研究、製造が可能である。通常、微生物の生存の増進が効果として評価されるためであるが、本発明は、これとは逆の効果、つまり負の効果が著効として評価される点できわめて特徴的であり、本発明は、遺伝子操作技術の分野において、特異的な独特な効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法は、糸状菌ゲノム中のａｔｆＡ遺伝子のコード領域を欠失又は変異させる（ａｔｆＡ遺伝子を破壊する）ことにより行われる。ａｔｆＡ遺伝子の欠失は、全体を完全に欠失させてもよいし、一部を欠失させてもよく、また、ａｔｆＡ遺伝子とその隣接領域を包含する領域を広く欠失させてもよい。一部を欠失させる場合には、特に限定されないが、ａｔｆＡ遺伝子のコード領域の半分以上を欠失させることが好ましい。ａｔｆＡ遺伝子のコード領域を変異させることによりａｔｆＡ遺伝子を破壊する場合は、該コード領域の好ましくは中央よりも上流の部位でナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異を導入して、それよりも下流の領域によりコードされるアミノ酸配列を欠失させ又は全く無関係なアミノ酸配列とすることが好ましい。ａｔｆＡ遺伝子の塩基配列はDDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベースに登録済みである（アクセッション番号AB120719）。ａｔｆＡ遺伝子及びその周辺領域のゲノムＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１に示す通りであり、このうちデータベースに登録されているａｔｆＡ遺伝子配列は726ntから4648ntであり、コード領域は3481ntから4631ntである。本遺伝子は、麹菌に含まれており、例えばアスペルギルス・オリゼRIB40株（Nature, 2005 Dec 22;438(7071):1092-3、独立行政法人製品評価技術基盤機構のゲノム解析部門のデータベースであるDOGAN(Database of the Genomes Analyzed at Nite)に全ゲノム配列が記載)及びその栄養要求性変異株NS4株にも含まれているので、それから切り出したり、そのゲノムDNAを鋳型とした核酸増幅法により増幅断片を調製することによっても入手することができる。
【００１２】
ａｔｆＡ遺伝子を破壊する方法としては、例えば、正常なａｔｆＡ遺伝子を含まない相同ＤＮＡ断片を糸状菌細胞中に導入し、該相同ＤＮＡ断片と、糸状菌のゲノムＤＮＡ間で相同組換えを行わせる方法が挙げられる。ここで、「相同ＤＮＡ断片」とは、相同組換えによりゲノム中の標的領域と組換えられ得るＤＮＡ断片のことを言い、本発明で用いられる相同ＤＮＡ断片は、atfA遺伝子のコード領域よりも上流の領域を含む、糸状菌のゲノムDNA中の領域と相同な第１の領域と、前記atfA遺伝子のコード領域よりも下流の領域を含む前記糸状菌のゲノムDNA中の領域と相同な第２の領域を有する。
【００１３】
ここで、「相同な領域」とは、糸状菌のゲノムDNA中の対応する領域と同一の塩基配列を有するか又は該領域と、糸状菌細胞中で相同組換えが生じる程度の配列同一性を有する領域を意味する。すなわち、前記第１の領域及び第２の領域には、配列番号１に示される塩基配列中の対応する部分と同一の塩基配列を有するもののほか、該塩基配列のうち１若しくは複数の塩基が置換し及び／若しくは欠失し並びに／又は該塩基配列に１若しくは複数の塩基が挿入され及び／若しくは付加されたものであって、それらの数が相同組換えが起きる程度に少数のものも包含される。この場合、該領域中の、配列番号１記載の配列に対応する部分は、配列番号１記載の配列と９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％の同一性を有していることが好ましい。ここで、塩基配列の同一性とは、両者の塩基ができるだけ多く一致するように（必要ならばギャップを挿入する）両塩基配列を整列させ、不一致の塩基数を、全塩基数（両者の配列で全塩基数が異なる場合には短い方の配列の全塩基数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトにより容易に算出することができる。特に、上記した置換、欠失、挿入及び／又は付加する塩基数の合計が１０個未満のものが好ましい。
【００１４】
前記第１及び第２の領域は、短くなりすぎると相同組み換えの効率が低下することがあるため、通常30bp以上であり、好ましくは、1500bp以上である。また、前記第１及び第２の領域のサイズの上限は特に限定されないが、通常、10000bp以下、好ましくは2500bp以下である。従って、前記第１及び第２の領域のサイズは、通常、30bp以上10000bp以下であり、好ましくは1500bp以上2500bp以下である。
【００１５】
前記第１の領域としては、ａｔｆＡ遺伝子のコード領域よりも上流の領域と相同な領域から成るものが好ましく、あるいは、配列番号１に示す塩基配列のうち、１nt〜2115ntに含まれる30bp以上の領域と相同な領域を含むもの、特に、配列番号１に示す塩基配列のうち、１nt〜2115ntに含まれる1500bp以上の領域と相同な領域を含むものが好ましい。また、前記第２の領域としては、ａｔｆＡ遺伝子コード領域よりも下流の領域と相同な領域から成るものが好ましく、あるいは、配列番号１に示す塩基配列のうち、1nt〜1959ntに含まれる30bp以上の領域と相同な領域を含むもの、特に、配列番号１に示す塩基配列のうち、1nt〜1959ntに含まれる1500bp以上の領域と相同な領域を含むものが好ましい。これらの領域は、本明細書において塩基配列が開示されているので、この情報を元に糸状菌の遺伝子から切り出してもよいし、糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型にしてプライマーを用いてＰＣＲを行って合成してもよく、その入手に格別の困難はない。
【００１６】
なお、相同ＤＮＡ断片中では、第１の領域及び第２の領域の方向性を合わせて配置する必要がある。すなわち、相同ＤＮＡ断片中では、第1の領域が上流、第2の領域がその下流となるように、方向性を合わせて配置される。もっとも、相同DNA断片は環状であってもよい。環状の場合には、上流側の前記第１の領域と下流側の前記第２の領域が直接又は他の配列を挟んで間接的に隣接する。
【００１７】
また、相同DNA断片は、通常、二本鎖である。なお、配列表には、規則によりセンス鎖のみを記載することになっているが、糸状菌のゲノムＤＮＡは二本鎖である。従って、上記説明中、「配列番号１に示す塩基配列と相同な領域」のような表現において、「配列番号１に示す塩基配列」は、文脈から明らかにそうでない場合を除き、二本鎖を意味する。
【００１８】
相同ＤＮＡ断片中には、ａｔｆＡ遺伝子のコード領域が含まれていてもよいが、正常なatfA遺伝子は含まれない。相同ＤＮＡ断片としては、ａｔｆＡ遺伝子のコード領域の全部又は過半を含まないものが好ましく、ａｔｆＡ遺伝子のコード領域を全く含まないものがより好ましい。ただし、相同ＤＮＡ断片中にａｔｆＡ遺伝子のコード領域の全体が含まれていても、そのコード領域中に後述のマーカー遺伝子などの外来遺伝子が挿入されていれば、それによってａｔｆＡ遺伝子が破壊されるので、そのような断片を用いて相同組換えを行うことにより糸状菌細胞中の正常なａｔｆＡの機能を失わせることも可能であり、そのような手段によっても本発明の方法を実施することができる。
【００１９】
本発明の方法で用いられる相同ＤＮＡ断片は、第１の領域と第２の領域との間にマーカー遺伝子を含ませたものであってもよい。ここで、第1の領域と第2の領域との間とは、第1の領域の下流で且つ第2の領域の上流に位置するという意味である。マーカー遺伝子を含ませることにより、相同ＤＮＡ断片がゲノム中に導入された糸状菌の単離を容易に行うことができるため好ましい。マーカー遺伝子としては、導入する菌株の栄養要求性に適合した栄養要求性相補遺伝子や、各種薬剤耐性遺伝子等を用いることができる。本発明の実施例においては、硫酸（硫黄源）資化欠損株である麹菌ＮＳ４株を用いているため、マーカー遺伝子として硫酸（硫黄源）資化に関するｓＣ遺伝子（Borges-Walmsley MI, et al., Mol Gen Genet. 1995 May 20;247(4):423-429.）を用いている。ｓＣ遺伝子によりＮＳ４株の栄養要求性が相補されるため、栄養要求性培地上で培養することにより遺伝子導入株を容易に単離することができる。ｓＣ遺伝子配列は、GenBankにアクセッション番号X82541として登録されており、配列表の配列番号１０に示すとおりである。ただし、マーカー遺伝子はｓＣ遺伝子に限定されず、前述のとおり各種の適切な栄養要求性相補遺伝子及び薬剤耐性遺伝子等を用いることができる。なお、相同ＤＮＡ断片中のマーカー遺伝子の方向性は、第１の領域及び第２の領域と合わせる必要はなく、任意でよい。
【００２０】
ただし、糸状菌ゲノム中の目的の位置に相同ＤＮＡが相同組換えにより挿入された場合のみならず、何らかの原因で目的外の位置に挿入された場合にも、マーカー遺伝子による栄養要求性の相補や薬剤耐性が生じてしまう恐れがある。従って、所望のａｔｆＡ破壊株を得るためには、マーカーによる選抜後、適宜サザン解析やPCRにより増幅、さらには増幅産物のダイレクトシーケンシング等を行ない、目的通りの位置に相同ＤＮＡ断片が挿入されていることを確認することが好ましい。
【００２１】
また、相同ＤＮＡ断片中には、第1の領域及び第2の領域、並びに適宜含まれ得るマーカー遺伝子以外の配列が含まれていてもよい。例えば、断片構築の過程で含まれてくる、クローニングベクター由来の配列等が含まれていてもよい。さらに、後述するとおり、相同ＤＮＡ断片中には、形質転換用のプラスミドベクター配列の一部又は全部が含まれていてもよい。
【００２２】
本発明で用いられる相同ＤＮＡ断片を糸状菌細胞中に導入させる方法は、特に限定されないが、例えば、プラスミドベクター中に相同ＤＮＡ断片が含まれるように構築し、このプラスミド（以下「ａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミド」ということがある）を糸状菌細胞中に導入する方法が挙げられる。このようなプラスミドは、あらかじめ相同ＤＮＡ断片を構築し、これをプラスミドベクター中に挿入することによって作製することもできるし、また、相同ＤＮＡ断片の構成要素である第1の領域及び第2の領域、並びに適宜含まれ得るマーカー遺伝子を、方向性に留意しつつ順次プラスミドベクターに挿入することによって作製することもできる。
【００２３】
本願明細書及び特許請求の範囲において、「相同ＤＮＡ断片がプラスミドベクター中に含まれるように構築された形態にある」とは、プラスミドベクター中で、相同ＤＮＡ断片の構成要素である第1の領域及び第2の領域、並びに適宜含まれ得るマーカー遺伝子が、前記したとおりの方向性及び位置関係を保持して配置される形態にあるということを意味する。従って、プラスミドに含まれるように構築された形態にある相同ＤＮＡ断片は、プラスミドベクター配列の一部又は全部を含む場合がある。図1及び2に示すプラスミドは、相同ＤＮＡ断片中にベクター配列が含まれる態様の例である。なお、図2のプラスミド中のAmp（アンピシリン耐性遺伝子）は、糸状菌形質転換体の選択のためのマーカーではなく、大腸菌中でプラスミドを増幅させる際に有用なマーカーとして用いられている。
【００２４】
ａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドの作製に用いるプラスミドベクターは、特に限定されないが、糸状菌細胞内での複製能を有しないものを用いると、プラスミドを糸状菌細胞に導入した後の培養の過程で、特に工夫をしなくとも該糸状菌細胞から自然にプラスミドが脱落するので、後にサザン解析を行なう場合にプラスミド由来のシグナルを検出するおそれを回避できるため有利である。本発明の実施例においては、プラスミドベクターとして染色体組込型ベクターpUSCを用いたが、これに限定されるものではない。pUSCは、０.Yamada, B. R. Lee, K. Gomi. Transformation System for Aspergillus oryzae with Double Auxotrophic Mutations, niaD and sC Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, ６１（８）,１３６７-１３６９,１９９７に記載されており、また、（独）酒類総合研究所においても頒布されているものであって、入手に困難性はない。なお、プラスミドの糸状菌細胞への導入自体は、この分野で公知のいかなる方法によっても行なうことができる。
【００２５】
本発明の実施例で構築されたａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドpUSCΔａｔｆＡの構造を図2に示し、該プラスミドの全塩基配列を配列番号９に示す。配列番号９中、２nt〜９ntがＮｏｔＩ制限酵素サイト、８３８７nt〜１０４７９ntが第1の領域、１９８３nt〜５２４９ntがｓC配列、４２nt〜１９７９ntが第2の領域である。すなわち、プラスミドpUSCΔａｔｆＡ中に含まれる相同ＤＮＡ断片（以下「ΔａｔｆＡ」という）は、配列番号９中の42nt〜10479ntである。なお、配列番号９に示す配列は、第1の領域と第2の領域が相補鎖（アンチセンス鎖）で記載されており、第1の領域が第2の領域の上流であることに変わりはない（なお、配列表にはセンス鎖を記載することになっているが、第１及び第２の領域と、sC配列等のプラスミド由来配列の向きが逆であり、これらのどちらかのセンス鎖を記載すれば他方はアンチセンス鎖となり、両者のセンス鎖を同時に記載することはできないので、配列番号９では、sC配列のセンス鎖、第１及び第２の領域のアンチセンス鎖が記載されている)。第1の領域を作製するために用いた、ａｔｆＡ遺伝子コード領域の上流の領域は、プロモーター領域と概略対応するものであり、麹菌ゲノムからプライマー1及び２を用いてＰＣＲにより増幅して得た。その増幅断片の塩基配列を配列番号３に示す。また、第２の領域を作製するために用いた、ａｔｆＡ遺伝子コード領域の下流の領域は、ターミネーター領域と概略対応するものであり、麹菌ゲノムからプライマー3及び4を用いてＰＣＲにより増幅して得た。その増幅断片の塩基配列を配列番号４に示す。
【００２６】
本発明で用いられる相同ＤＮＡ断片を含んだプラスミドは、麹菌（黄麹菌:Aspergillus oryzae）、黒麹菌（Aspergillus nigerなど）、白麹菌（Aspergillus usamii、Aspergillus kawachiiなど）といったアルペルギルス（Aspergillus）属菌のみならず、ムコール（Mucor）属菌、ペニシリウム（Penicillium）属菌、リゾプス（Rhizopus）属菌といった各種糸状菌のほか、一般的に様々な生物で使用することができる。
【００２７】
本発明の方法により、糸状菌の胞子の生存性が低減され、各種の環境ストレスによる生存率が有意に低下する。胞子の生存性については、耐熱性、耐酸化性又は耐紫外線性等を指標として評価することができる。具体的には、胞子に熱ストレス、酸化ストレス又は紫外線ストレス等のストレスを与え、その後の胞子の生存数を確認することにより評価することができる。具体的な試験方法は下記実施例に記載されている。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明の実施例について記載するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２９】
（実施例：麹菌（アスペルギルス・オリゼ）に存在するａｔｆＡ遺伝子を欠失させることで、紫外線等のストレスに抵抗性が低い分生子を形成する麹菌の作製）
ａｔｆＡ遺伝子破壊株の単離と確認を次のようにして行った。
【００３０】
（１）ａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドの作成
ａｔｆＡ遺伝子コード領域の上流領域約２kbp（ａｔｆＡ ORF上流領域）と、下流領域約２kbp（ａｔｆＡ ORF下流領域）とを染色体組込型ベクターpUSCに導入してａｔｆＡ遺伝子破壊用コンストラクトを作成した（図２）。このベクターを用いて麹菌ＮＳ４株を形質転換（図３）することでａｔｆＡ遺伝子破壊株を得た。
【００３１】
すなわち、下記するように、ａｔｆＡ ORF上流領域（配列番号３）及びａｔｆＡ ORF下流領域（配列番号４）をそれぞれ作成し、ベクターpUSCにこれらの領域を導入して、ａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドpUSC△ａｔｆＡ（その構築を図２に示し、全塩基配列を配列番号９に示す）を作成した。
【００３２】
（導入方法）
（イ）プライマー１及びプライマー２を用いて、麹菌ゲノムDNAからａｔｆＡ ORF上流領域をPCRにより増幅し、得られた断片をpCRBluntベクター（インビトロジェン）にクローニングした。さらに得られたプラスミドを制限酵素NotI及びXbaIで切断してベクター配列と上流域が結合した直鎖状断片を回収した。
（ロ）プライマー３及びプライマー４を用いて、麹菌ゲノムDNAからａｔｆＡ ORF下流領域をPCRにより増幅し、得られた断片をpCRBluntベクターにクローニングした。さらに得られたプラスミドを制限酵素NotI及びXbaIで切断し、ａｔｆＡ ORF下流領域を含むDNA断片を回収した。
（ハ）（イ）の断片の切断部分に（ロ）のDNA断片を結合させて環状プラスミドとし、クローニングした。このプラスミドを制限酵素XbaIとKpnIで切断し、ベクター部分を除去することでａｔｆＡ ORF上流領域及びａｔｆＡ ORF下流領域が結合した断片を得た。
（ニ）sC遺伝子配列を含むプラスミドpUSCを制限酵素PstI及びAatIIで切断し、切断箇所に（ハ）で得られた断片を導入することでpUSC△ａｔｆＡを作成した。
【００３３】
プライマー１は、その塩基配列を配列番号５に示し、プライマー２は、その塩基配列を配列番号６に示し、プライマー３は、その塩基配列を配列番号７に示し、プライマー４は、その塩基配列を配列番号８に示した。
【００３４】
宿主としてはNS４株を使用した。NS４株（Aspergillus oryzae NS４）は、先に示した文献により既知であるうえ、当研究所においても頒布しており、入手に困難性はない。
【００３５】
このようにして作製したａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドpUSC△ａｔｆＡによる形質転換及び形質転換株の選択は、公知の方法（Yamada O., Lee B. R. and Gomi K. Transformation System for Aspergillus oryzae with Double Auxotrophic Mutations, niaD and sC. Biosci．Biotech. Biochem. 61 (8) 1367-1369 (1997)）により行った。
【００３６】
（２）ゲノムサザンによる破壊株の確認
形質転換株からゲノムＤＮＡを調製し、これを制限酵素ＮｃｏＩで切断したものを用いてゲノムサザン解析を行なった。
【００３７】
ａｔｆＡのORFの下流領域（配列番号４に示す配列）をプローブとして用い、ゲノムサザンを行った結果（図４）、遺伝子破壊株において予想通りの１１kbpのバンドが観察された。ORF部分（配列番号２に示す配列）をプローブにしたゲノムサザンにおいてはバンドが検出されなかったことから、ａｔｆＡ遺伝子破壊株であることが確認できた。すなわち、ゲノムDNAは制限酵素ＮｃｏＩで切断後、電気泳動に供した。その結果、ORF部分をプローブに用いた場合、 NS４株では８kbpのバンドが検出されるが、破壊株ではORFが存在しないため、シグナルは検出されないことが確認され（図面左側）、ａｔｆＡ ORF上流領域（配列番号３に示す配列）をブローブとすると、NS４は８kbp、破壊株は１１kbpのバンドが検出された（図面右側）。図5はゲノムサザンの説明図である。なお、プローブの作成は、Roch社のDIG PCR probe作成キットを用いて行った。
【００３８】
（３）各種ストレス耐性の測定（図６）
耐熱性
蒸留水に懸濁した分生子を５０℃で２０分間インキュベートし、寒天培地に塗布して生存数を確認した。なお、分生子の生存数は、寒天培地上に形成されたコロニー数を計数することにより確認した。
【００３９】
耐酸化性
５０mM過酸化水素水溶液に懸濁した分生子を３０℃で２０分間インキュベートし、寒天培地に塗布して生存数を確認した。
【００４０】
耐紫外線性 紫外線照射器により寒天培地に塗布した分生子に紫外線を照射して生存数を確認した。
【００４１】
結果を図６に示す。図６に示す結果から、ａｔｆＡ遺伝子破壊株では各種ストレスによる生存率が野生株よりも有意に低いことから、日光のあたる野外等で死滅しやすくなっていることが証明された。また、本願発明者らはこれまでに、ａｔｆＡの相同遺伝子であるａｔｆＢについて遺伝子破壊を行った結果、ストレスを与えた際に死滅しやすくなることを見出しており、特許出願を行なっているが（特願2005-54021）、ａｔｆＡ遺伝子破壊株の胞子はａｔｆＢ遺伝子破壊株の胞子よりもさらに死滅し易くなっており、本発明の方法の胞子の生存性低減効果の高さが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドの一例を示す。
【図２】本願実施例において作製したpUSC△ａｔｆＡプラスミドを示す。
【図３】遺伝子破壊概略図である。
【図４】破壊株のゲノムサザンの結果を示す電気泳動図である。
【図５】ゲノムサザンの説明図である。
【図６】各種ストレスに対する麹菌分生子の耐性を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胞子（分生子）の生存性を低減せしめた、特にバイオハザード対策に好適な糸状菌の作成に関するものであって、更に詳細には、本発明は遺伝子工学的手法を用いて得られる生存性を低めた分生子を作る糸状菌、及び当該形質転換糸状菌の作出方法、並びに糸状菌分生子の生存性を低める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌はタンパク質の分泌能力が高く、様々な物質を発酵生産する際に利用される。近年これら糸状菌を宿主とした形質転換体を作成してさらなる有用菌株の作成が行われており、一般的に形質転換体の安全性は確認されないままではあるが、定められた管理区域内で厳密に管理されている。
【０００３】
しかし糸状菌の分生子は空気中に飛散しやすく、これらを閉鎖環境中にとどめておくためには多大な労力が必要である。万が一環境中へ出た場合、糸状菌の形質転換体は容易に増殖可能であり、これらの形質転換糸状菌はさらなる胞子を形成することで、繁殖範囲を広げていくと考えられており、バイオハザード対策は、当業界における緊急の課題となっている。（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
【非特許文献１】「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、ｐ．８２２−８２３（１９８６年１０月９日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はバイオハザードをできる限り低減、防止する技術を開発するためになされたものであって、各方面から鋭意検討の結果、管理区域外に飛散した糸状菌胞子を死滅させればよいとの観点に立ち、そのためには形質転換の宿主となる糸状菌の胞子のストレス抵抗性を低減させる必要がある点に着目した。
【０００６】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、形質転換の宿主となる糸状菌の胞子のストレス抵抗性を低減させることで、管理区域外に飛散した糸状菌胞子を死滅しやすくさせることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであって、転写制御因子遺伝子（ＡＴＦ遺伝子群）の解析の過程において、麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のａｔｆＡ遺伝子を欠失させたところ、胞子の生存性が低下することをはじめて見出し、そして更に、このａｔｆＡ遺伝子欠失株は紫外線等のストレスを与えると容易に死滅することもはじめて確認し、これらの有用新知見を基礎に更に研究の結果ついに完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、糸状菌の転写制御因子タンパク質をコードするatfA遺伝子のコード領域の全部若しくは一部を欠失させ又は変異させて前記糸状菌の胞子の生存性を低減させることを含む、糸状菌の胞子の生存性を低減させる方法を提供する。また、本発明は、atfA遺伝子のコード領域よりも上流の領域を含む領域と相同な第１の領域と、前記atfA遺伝子のコード領域よりも下流の領域を含む領域と相同な第２の領域を有し、正常なatfA遺伝子を含まないDNA断片を提供する。さらに、本発明は、前記本発明の方法により胞子の生存性が低減された糸状菌を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、生存性の低い胞子を作る糸状菌を作成することができ、作出された糸状菌は紫外線等に当たると容易に死滅するという特性を有する。したがって、糸状菌を宿主とした各種形質転換体がたとえ管理区域外に飛散したとしても、本発明に係るこれらの形質転換体は短時間に死滅するため、バイオハザードが未然に防止されるという著効が奏される。
【００１０】
そのため、糸状菌を対象とする遺伝子操作技術を各種広範に適用することができ、その際、バイオハザードを過度に心配することなく、研究、製造が可能である。通常、微生物の生存の増進が効果として評価されるためであるが、本発明は、これとは逆の効果、つまり負の効果が著効として評価される点できわめて特徴的であり、本発明は、遺伝子操作技術の分野において、特異的な独特な効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法は、糸状菌ゲノム中のａｔｆＡ遺伝子のコード領域を欠失又は変異させる（ａｔｆＡ遺伝子を破壊する）ことにより行われる。ａｔｆＡ遺伝子の欠失は、全体を完全に欠失させてもよいし、一部を欠失させてもよく、また、ａｔｆＡ遺伝子とその隣接領域を包含する領域を広く欠失させてもよい。一部を欠失させる場合には、特に限定されないが、ａｔｆＡ遺伝子のコード領域の半分以上を欠失させることが好ましい。ａｔｆＡ遺伝子のコード領域を変異させることによりａｔｆＡ遺伝子を破壊する場合は、該コード領域の好ましくは中央よりも上流の部位でナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異を導入して、それよりも下流の領域によりコードされるアミノ酸配列を欠失させ又は全く無関係なアミノ酸配列とすることが好ましい。ａｔｆＡ遺伝子の塩基配列はDDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベースに登録済みである（アクセッション番号AB120719）。ａｔｆＡ遺伝子及びその周辺領域のゲノムＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１に示す通りであり、このうちデータベースに登録されているａｔｆＡ遺伝子配列は726ntから4648ntであり、コード領域は3481ntから4631ntである。本遺伝子は、麹菌に含まれており、例えばアスペルギルス・オリゼRIB40株（Nature, 2005 Dec 22;438(7071):1092-3、独立行政法人製品評価技術基盤機構のゲノム解析部門のデータベースであるDOGAN(Database of the Genomes Analyzed at Nite)に全ゲノム配列が記載)及びその栄養要求性変異株NS4株にも含まれているので、それから切り出したり、そのゲノムDNAを鋳型とした核酸増幅法により増幅断片を調製することによっても入手することができる。
【００１２】
ａｔｆＡ遺伝子を破壊する方法としては、例えば、正常なａｔｆＡ遺伝子を含まない相同ＤＮＡ断片を糸状菌細胞中に導入し、該相同ＤＮＡ断片と、糸状菌のゲノムＤＮＡ間で相同組換えを行わせる方法が挙げられる。ここで、「相同ＤＮＡ断片」とは、相同組換えによりゲノム中の標的領域と組換えられ得るＤＮＡ断片のことを言い、本発明で用いられる相同ＤＮＡ断片は、atfA遺伝子のコード領域よりも上流の領域を含む、糸状菌のゲノムDNA中の領域と相同な第１の領域と、前記atfA遺伝子のコード領域よりも下流の領域を含む前記糸状菌のゲノムDNA中の領域と相同な第２の領域を有する。
【００１３】
ここで、「相同な領域」とは、糸状菌のゲノムDNA中の対応する領域と同一の塩基配列を有するか又は該領域と、糸状菌細胞中で相同組換えが生じる程度の配列同一性を有する領域を意味する。すなわち、前記第１の領域及び第２の領域には、配列番号１に示される塩基配列中の対応する部分と同一の塩基配列を有するもののほか、該塩基配列のうち１若しくは複数の塩基が置換し及び／若しくは欠失し並びに／又は該塩基配列に１若しくは複数の塩基が挿入され及び／若しくは付加されたものであって、それらの数が相同組換えが起きる程度に少数のものも包含される。この場合、該領域中の、配列番号１記載の配列に対応する部分は、配列番号１記載の配列と９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％の同一性を有していることが好ましい。ここで、塩基配列の同一性とは、両者の塩基ができるだけ多く一致するように（必要ならばギャップを挿入する）両塩基配列を整列させ、不一致の塩基数を、全塩基数（両者の配列で全塩基数が異なる場合には短い方の配列の全塩基数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトにより容易に算出することができる。特に、上記した置換、欠失、挿入及び／又は付加する塩基数の合計が１０個未満のものが好ましい。
【００１４】
前記第１及び第２の領域は、短くなりすぎると相同組み換えの効率が低下することがあるため、通常30bp以上であり、好ましくは、1500bp以上である。また、前記第１及び第２の領域のサイズの上限は特に限定されないが、通常、10000bp以下、好ましくは2500bp以下である。従って、前記第１及び第２の領域のサイズは、通常、30bp以上10000bp以下であり、好ましくは1500bp以上2500bp以下である。
【００１５】
前記第１の領域としては、ａｔｆＡ遺伝子のコード領域よりも上流の領域と相同な領域から成るものが好ましく、あるいは、配列番号１に示す塩基配列のうち、１nt〜2115ntに含まれる30bp以上の領域と相同な領域を含むもの、特に、配列番号１に示す塩基配列のうち、１nt〜2115ntに含まれる1500bp以上の領域と相同な領域を含むものが好ましい。また、前記第２の領域としては、ａｔｆＡ遺伝子コード領域よりも下流の領域と相同な領域から成るものが好ましく、あるいは、配列番号１に示す塩基配列のうち、1nt〜1959ntに含まれる30bp以上の領域と相同な領域を含むもの、特に、配列番号１に示す塩基配列のうち、1nt〜1959ntに含まれる1500bp以上の領域と相同な領域を含むものが好ましい。これらの領域は、本明細書において塩基配列が開示されているので、この情報を元に糸状菌の遺伝子から切り出してもよいし、糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型にしてプライマーを用いてＰＣＲを行って合成してもよく、その入手に格別の困難はない。
【００１６】
なお、相同ＤＮＡ断片中では、第１の領域及び第２の領域の方向性を合わせて配置する必要がある。すなわち、相同ＤＮＡ断片中では、第1の領域が上流、第2の領域がその下流となるように、方向性を合わせて配置される。もっとも、相同DNA断片は環状であってもよい。環状の場合には、上流側の前記第１の領域と下流側の前記第２の領域が直接又は他の配列を挟んで間接的に隣接する。
【００１７】
また、相同DNA断片は、通常、二本鎖である。なお、配列表には、規則によりセンス鎖のみを記載することになっているが、糸状菌のゲノムＤＮＡは二本鎖である。従って、上記説明中、「配列番号１に示す塩基配列と相同な領域」のような表現において、「配列番号１に示す塩基配列」は、文脈から明らかにそうでない場合を除き、二本鎖を意味する。
【００１８】
相同ＤＮＡ断片中には、ａｔｆＡ遺伝子のコード領域が含まれていてもよいが、正常なatfA遺伝子は含まれない。相同ＤＮＡ断片としては、ａｔｆＡ遺伝子のコード領域の全部又は過半を含まないものが好ましく、ａｔｆＡ遺伝子のコード領域を全く含まないものがより好ましい。ただし、相同ＤＮＡ断片中にａｔｆＡ遺伝子のコード領域の全体が含まれていても、そのコード領域中に後述のマーカー遺伝子などの外来遺伝子が挿入されていれば、それによってａｔｆＡ遺伝子が破壊されるので、そのような断片を用いて相同組換えを行うことにより糸状菌細胞中の正常なａｔｆＡの機能を失わせることも可能であり、そのような手段によっても本発明の方法を実施することができる。
【００１９】
本発明の方法で用いられる相同ＤＮＡ断片は、第１の領域と第２の領域との間にマーカー遺伝子を含ませたものであってもよい。ここで、第1の領域と第2の領域との間とは、第1の領域の下流で且つ第2の領域の上流に位置するという意味である。マーカー遺伝子を含ませることにより、相同ＤＮＡ断片がゲノム中に導入された糸状菌の単離を容易に行うことができるため好ましい。マーカー遺伝子としては、導入する菌株の栄養要求性に適合した栄養要求性相補遺伝子や、各種薬剤耐性遺伝子等を用いることができる。本発明の実施例においては、硫酸（硫黄源）資化欠損株である麹菌ＮＳ４株を用いているため、マーカー遺伝子として硫酸（硫黄源）資化に関するｓＣ遺伝子（Borges-Walmsley MI, et al., Mol Gen Genet. 1995 May 20;247(4):423-429.）を用いている。ｓＣ遺伝子によりＮＳ４株の栄養要求性が相補されるため、栄養要求性培地上で培養することにより遺伝子導入株を容易に単離することができる。ｓＣ遺伝子配列は、GenBankにアクセッション番号X82541として登録されており、配列表の配列番号１０に示すとおりである。ただし、マーカー遺伝子はｓＣ遺伝子に限定されず、前述のとおり各種の適切な栄養要求性相補遺伝子及び薬剤耐性遺伝子等を用いることができる。なお、相同ＤＮＡ断片中のマーカー遺伝子の方向性は、第１の領域及び第２の領域と合わせる必要はなく、任意でよい。
【００２０】
ただし、糸状菌ゲノム中の目的の位置に相同ＤＮＡが相同組換えにより挿入された場合のみならず、何らかの原因で目的外の位置に挿入された場合にも、マーカー遺伝子による栄養要求性の相補や薬剤耐性が生じてしまう恐れがある。従って、所望のａｔｆＡ破壊株を得るためには、マーカーによる選抜後、適宜サザン解析やPCRにより増幅、さらには増幅産物のダイレクトシーケンシング等を行ない、目的通りの位置に相同ＤＮＡ断片が挿入されていることを確認することが好ましい。
【００２１】
また、相同ＤＮＡ断片中には、第1の領域及び第2の領域、並びに適宜含まれ得るマーカー遺伝子以外の配列が含まれていてもよい。例えば、断片構築の過程で含まれてくる、クローニングベクター由来の配列等が含まれていてもよい。さらに、後述するとおり、相同ＤＮＡ断片中には、形質転換用のプラスミドベクター配列の一部又は全部が含まれていてもよい。
【００２２】
本発明で用いられる相同ＤＮＡ断片を糸状菌細胞中に導入させる方法は、特に限定されないが、例えば、プラスミドベクター中に相同ＤＮＡ断片が含まれるように構築し、このプラスミド（以下「ａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミド」ということがある）を糸状菌細胞中に導入する方法が挙げられる。このようなプラスミドは、あらかじめ相同ＤＮＡ断片を構築し、これをプラスミドベクター中に挿入することによって作製することもできるし、また、相同ＤＮＡ断片の構成要素である第1の領域及び第2の領域、並びに適宜含まれ得るマーカー遺伝子を、方向性に留意しつつ順次プラスミドベクターに挿入することによって作製することもできる。
【００２３】
本願明細書及び特許請求の範囲において、「相同ＤＮＡ断片がプラスミドベクター中に含まれるように構築された形態にある」とは、プラスミドベクター中で、相同ＤＮＡ断片の構成要素である第1の領域及び第2の領域、並びに適宜含まれ得るマーカー遺伝子が、前記したとおりの方向性及び位置関係を保持して配置される形態にあるということを意味する。従って、プラスミドに含まれるように構築された形態にある相同ＤＮＡ断片は、プラスミドベクター配列の一部又は全部を含む場合がある。図1及び2に示すプラスミドは、相同ＤＮＡ断片中にベクター配列が含まれる態様の例である。なお、図2のプラスミド中のAmp（アンピシリン耐性遺伝子）は、糸状菌形質転換体の選択のためのマーカーではなく、大腸菌中でプラスミドを増幅させる際に有用なマーカーとして用いられている。
【００２４】
ａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドの作製に用いるプラスミドベクターは、特に限定されないが、糸状菌細胞内での複製能を有しないものを用いると、プラスミドを糸状菌細胞に導入した後の培養の過程で、特に工夫をしなくとも該糸状菌細胞から自然にプラスミドが脱落するので、後にサザン解析を行なう場合にプラスミド由来のシグナルを検出するおそれを回避できるため有利である。本発明の実施例においては、プラスミドベクターとして染色体組込型ベクターpUSCを用いたが、これに限定されるものではない。pUSCは、０.Yamada, B. R. Lee, K. Gomi. Transformation System for Aspergillus oryzae with Double Auxotrophic Mutations, niaD and sC Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, ６１（８）,１３６７-１３６９,１９９７に記載されており、また、（独）酒類総合研究所においても頒布されているものであって、入手に困難性はない。なお、プラスミドの糸状菌細胞への導入自体は、この分野で公知のいかなる方法によっても行なうことができる。
【００２５】
本発明の実施例で構築されたａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドpUSCΔａｔｆＡの構造を図2に示し、該プラスミドの全塩基配列を配列番号９に示す。配列番号９中、２nt〜９ntがＮｏｔＩ制限酵素サイト、８３８７nt〜１０４７９ntが第1の領域、１９８３nt〜５２４９ntがｓC配列、４２nt〜１９７９ntが第2の領域である。すなわち、プラスミドpUSCΔａｔｆＡ中に含まれる相同ＤＮＡ断片（以下「ΔａｔｆＡ」という）は、配列番号９中の42nt〜10479ntである。なお、配列番号９に示す配列は、第1の領域と第2の領域が相補鎖（アンチセンス鎖）で記載されており、第1の領域が第2の領域の上流であることに変わりはない（なお、配列表にはセンス鎖を記載することになっているが、第１及び第２の領域と、sC配列等のプラスミド由来配列の向きが逆であり、これらのどちらかのセンス鎖を記載すれば他方はアンチセンス鎖となり、両者のセンス鎖を同時に記載することはできないので、配列番号９では、sC配列のセンス鎖、第１及び第２の領域のアンチセンス鎖が記載されている)。第1の領域を作製するために用いた、ａｔｆＡ遺伝子コード領域の上流の領域は、プロモーター領域と概略対応するものであり、麹菌ゲノムからプライマー1及び２を用いてＰＣＲにより増幅して得た。その増幅断片の塩基配列を配列番号３に示す。また、第２の領域を作製するために用いた、ａｔｆＡ遺伝子コード領域の下流の領域は、ターミネーター領域と概略対応するものであり、麹菌ゲノムからプライマー3及び4を用いてＰＣＲにより増幅して得た。その増幅断片の塩基配列を配列番号４に示す。
【００２６】
本発明で用いられる相同ＤＮＡ断片を含んだプラスミドは、麹菌（黄麹菌:Aspergillus oryzae）、黒麹菌（Aspergillus nigerなど）、白麹菌（Aspergillus usamii、Aspergillus kawachiiなど）といったアルペルギルス（Aspergillus）属菌のみならず、ムコール（Mucor）属菌、ペニシリウム（Penicillium）属菌、リゾプス（Rhizopus）属菌といった各種糸状菌のほか、一般的に様々な生物で使用することができる。
【００２７】
本発明の方法により、糸状菌の胞子の生存性が低減され、各種の環境ストレスによる生存率が有意に低下する。胞子の生存性については、耐熱性、耐酸化性又は耐紫外線性等を指標として評価することができる。具体的には、胞子に熱ストレス、酸化ストレス又は紫外線ストレス等のストレスを与え、その後の胞子の生存数を確認することにより評価することができる。具体的な試験方法は下記実施例に記載されている。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明の実施例について記載するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２９】
（実施例：麹菌（アスペルギルス・オリゼ）に存在するａｔｆＡ遺伝子を欠失させることで、紫外線等のストレスに抵抗性が低い分生子を形成する麹菌の作製）
ａｔｆＡ遺伝子破壊株の単離と確認を次のようにして行った。
【００３０】
（１）ａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドの作成
ａｔｆＡ遺伝子コード領域の上流領域約２kbp（ａｔｆＡ ORF上流領域）と、下流領域約２kbp（ａｔｆＡ ORF下流領域）とを染色体組込型ベクターpUSCに導入してａｔｆＡ遺伝子破壊用コンストラクトを作成した（図２）。このベクターを用いて麹菌ＮＳ４株を形質転換（図３）することでａｔｆＡ遺伝子破壊株を得た。
【００３１】
すなわち、下記するように、ａｔｆＡ ORF上流領域（配列番号３）及びａｔｆＡ ORF下流領域（配列番号４）をそれぞれ作成し、ベクターpUSCにこれらの領域を導入して、ａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドpUSC△ａｔｆＡ（その構築を図２に示し、全塩基配列を配列番号９に示す）を作成した。
【００３２】
（導入方法）
（イ）プライマー１及びプライマー２を用いて、麹菌ゲノムDNAからａｔｆＡ ORF上流領域をPCRにより増幅し、得られた断片をpCRBluntベクター（インビトロジェン）にクローニングした。さらに得られたプラスミドを制限酵素NotI及びXbaIで切断してベクター配列と上流域が結合した直鎖状断片を回収した。
（ロ）プライマー３及びプライマー４を用いて、麹菌ゲノムDNAからａｔｆＡ ORF下流領域をPCRにより増幅し、得られた断片をpCRBluntベクターにクローニングした。さらに得られたプラスミドを制限酵素NotI及びXbaIで切断し、ａｔｆＡ ORF下流領域を含むDNA断片を回収した。
（ハ）（イ）の断片の切断部分に（ロ）のDNA断片を結合させて環状プラスミドとし、クローニングした。このプラスミドを制限酵素XbaIとKpnIで切断し、ベクター部分を除去することでａｔｆＡ ORF上流領域及びａｔｆＡ ORF下流領域が結合した断片を得た。
（ニ）sC遺伝子配列を含むプラスミドpUSCを制限酵素PstI及びAatIIで切断し、切断箇所に（ハ）で得られた断片を導入することでpUSC△ａｔｆＡを作成した。
【００３３】
プライマー１は、その塩基配列を配列番号５に示し、プライマー２は、その塩基配列を配列番号６に示し、プライマー３は、その塩基配列を配列番号７に示し、プライマー４は、その塩基配列を配列番号８に示した。
【００３４】
宿主としてはNS４株を使用した。NS４株（Aspergillus oryzae NS４）は、先に示した文献により既知であるうえ、当研究所においても頒布しており、入手に困難性はない。
【００３５】
このようにして作製したａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドpUSC△ａｔｆＡによる形質転換及び形質転換株の選択は、公知の方法（Yamada O., Lee B. R. and Gomi K. Transformation System for Aspergillus oryzae with Double Auxotrophic Mutations, niaD and sC. Biosci．Biotech. Biochem. 61 (8) 1367-1369 (1997)）により行った。
【００３６】
（２）ゲノムサザンによる破壊株の確認
形質転換株からゲノムＤＮＡを調製し、これを制限酵素ＮｃｏＩで切断したものを用いてゲノムサザン解析を行なった。
【００３７】
ａｔｆＡのORFの下流領域（配列番号４に示す配列）をプローブとして用い、ゲノムサザンを行った結果（図４）、遺伝子破壊株において予想通りの１１kbpのバンドが観察された。ORF部分（配列番号２に示す配列）をプローブにしたゲノムサザンにおいてはバンドが検出されなかったことから、ａｔｆＡ遺伝子破壊株であることが確認できた。すなわち、ゲノムDNAは制限酵素ＮｃｏＩで切断後、電気泳動に供した。その結果、ORF部分をプローブに用いた場合、 NS４株では８kbpのバンドが検出されるが、破壊株ではORFが存在しないため、シグナルは検出されないことが確認され（図面左側）、ａｔｆＡ ORF上流領域（配列番号３に示す配列）をブローブとすると、NS４は８kbp、破壊株は１１kbpのバンドが検出された（図面右側）。図5はゲノムサザンの説明図である。なお、プローブの作成は、Roch社のDIG PCR probe作成キットを用いて行った。
【００３８】
（３）各種ストレス耐性の測定（図６）
耐熱性
蒸留水に懸濁した分生子を５０℃で２０分間インキュベートし、寒天培地に塗布して生存数を確認した。なお、分生子の生存数は、寒天培地上に形成されたコロニー数を計数することにより確認した。
【００３９】
耐酸化性
５０mM過酸化水素水溶液に懸濁した分生子を３０℃で２０分間インキュベートし、寒天培地に塗布して生存数を確認した。
【００４０】
耐紫外線性 紫外線照射器により寒天培地に塗布した分生子に紫外線を照射して生存数を確認した。
【００４１】
結果を図６に示す。図６に示す結果から、ａｔｆＡ遺伝子破壊株では各種ストレスによる生存率が野生株よりも有意に低いことから、日光のあたる野外等で死滅しやすくなっていることが証明された。また、本願発明者らはこれまでに、ａｔｆＡの相同遺伝子であるａｔｆＢについて遺伝子破壊を行った結果、ストレスを与えた際に死滅しやすくなることを見出しており、特許出願を行なっているが（特願2005-54021）、ａｔｆＡ遺伝子破壊株の胞子はａｔｆＢ遺伝子破壊株の胞子よりもさらに死滅し易くなっており、本発明の方法の胞子の生存性低減効果の高さが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ａｔｆＡ遺伝子破壊用プラスミドの一例を示す。
【図２】本願実施例において作製したpUSC△ａｔｆＡプラスミドを示す。
【図３】遺伝子破壊概略図である。
【図４】破壊株のゲノムサザンの結果を示す電気泳動図である。
【図５】ゲノムサザンの説明図である。
【図６】各種ストレスに対する麹菌分生子の耐性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌の転写制御因子タンパク質をコードするatfA遺伝子のコード領域の全部若しくは一部を欠失させ又は変異させて前記糸状菌の胞子の生存性を低減させることを含む、糸状菌の胞子の生存性を低減させる方法。
【請求項２】
前記atfA遺伝子のコード領域よりも上流の領域を含む前記糸状菌のゲノムDNA中の領域と相同な第１の領域と、前記atfA遺伝子のコード領域よりも下流の領域を含む前記糸状菌のゲノムDNA中の領域と相同な第２の領域を有し、正常なatfA遺伝子を含まない相同DNA断片を糸状菌細胞に導入し、該相同DNA断片と、糸状菌のゲノム遺伝子の間で相同組換えを行なわせることにより、前記atfA遺伝子のコード領域の全部若しくは一部を欠失させ又は変異させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記相同DNA断片中の前記第１の領域は、前記atfA遺伝子のコード領域よりも上流の領域の相同領域から成り、前記第２の領域は前記atfA遺伝子のコード領域よりも下流の領域の相同領域から成る請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第１及び第２の領域のサイズは、それぞれ30bp〜10000bpである請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記相同DNA断片中の前記第１の領域は、配列番号１に示す塩基配列のうち、1nt〜2115ntに含まれる30bp以上の領域と相同な領域を含み、前記第２の領域は、配列番号２に示す塩基配列のうち、1nt〜1959ntに含まれる30bp以上の領域と相同な領域を含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記相同DNA断片は、atfA遺伝子のコード領域の全部又は過半を含まない請求項２ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記相同DNA断片は、前記第１の領域と前記第２の領域の間にマーカー遺伝子を含む請求項２ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記マーカー遺伝子は、sC遺伝子である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記相同DNA断片は、環状である請求項２ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記相同DNA断片は、プラスミドベクター中に含まれるように構築された形態にある請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記プラスミドベクターは、糸状菌細胞内での複製能を有さないものである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記胞子の生存性は、胞子の耐熱性、耐酸化性及び耐紫外線性から成る群より選ばれる少なくとも１種により評価されるものである請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記糸状菌は麹菌である請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
atfA遺伝子のコード領域よりも上流の領域を含む領域と相同な第１の領域と、前記atfA遺伝子のコード領域よりも下流の領域を含む領域と相同な第２の領域を有し、正常なatfA遺伝子を含まないDNA断片。
【請求項１５】
請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法により胞子の生存性が低減された糸状菌。
【請求項１】
糸状菌の転写制御因子タンパク質をコードするatfA遺伝子のコード領域の全部若しくは一部を欠失させ又は変異させて前記糸状菌の胞子の生存性を低減させることを含む、糸状菌の胞子の生存性を低減させる方法。
【請求項２】
前記atfA遺伝子のコード領域よりも上流の領域を含む前記糸状菌のゲノムDNA中の領域と相同な第１の領域と、前記atfA遺伝子のコード領域よりも下流の領域を含む前記糸状菌のゲノムDNA中の領域と相同な第２の領域を有し、正常なatfA遺伝子を含まない相同DNA断片を糸状菌細胞に導入し、該相同DNA断片と、糸状菌のゲノム遺伝子の間で相同組換えを行なわせることにより、前記atfA遺伝子のコード領域の全部若しくは一部を欠失させ又は変異させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記相同DNA断片中の前記第１の領域は、前記atfA遺伝子のコード領域よりも上流の領域の相同領域から成り、前記第２の領域は前記atfA遺伝子のコード領域よりも下流の領域の相同領域から成る請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第１及び第２の領域のサイズは、それぞれ30bp〜10000bpである請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記相同DNA断片中の前記第１の領域は、配列番号１に示す塩基配列のうち、1nt〜2115ntに含まれる30bp以上の領域と相同な領域を含み、前記第２の領域は、配列番号２に示す塩基配列のうち、1nt〜1959ntに含まれる30bp以上の領域と相同な領域を含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記相同DNA断片は、atfA遺伝子のコード領域の全部又は過半を含まない請求項２ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記相同DNA断片は、前記第１の領域と前記第２の領域の間にマーカー遺伝子を含む請求項２ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記マーカー遺伝子は、sC遺伝子である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記相同DNA断片は、環状である請求項２ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記相同DNA断片は、プラスミドベクター中に含まれるように構築された形態にある請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記プラスミドベクターは、糸状菌細胞内での複製能を有さないものである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記胞子の生存性は、胞子の耐熱性、耐酸化性及び耐紫外線性から成る群より選ばれる少なくとも１種により評価されるものである請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記糸状菌は麹菌である請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
atfA遺伝子のコード領域よりも上流の領域を含む領域と相同な第１の領域と、前記atfA遺伝子のコード領域よりも下流の領域を含む領域と相同な第２の領域を有し、正常なatfA遺伝子を含まないDNA断片。
【請求項１５】
請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法により胞子の生存性が低減された糸状菌。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−５４５４２（Ｐ２００８−５４５４２Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３３０６５（Ｐ２００６−２３３０６５）
【出願日】平成１８年８月３０日（２００６．８．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年３月５日 社団法人 日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度） 大会講演要旨集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年３月２７日 社団法人 日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度）大会」において文書をもって発表
【出願人】（３０１０２５６３４）独立行政法人酒類総合研究所 (55)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月３０日（２００６．８．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年３月５日 社団法人 日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度） 大会講演要旨集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年３月２７日 社団法人 日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度）大会」において文書をもって発表
【出願人】（３０１０２５６３４）独立行政法人酒類総合研究所 (55)
【Ｆターム（参考）】
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