生物学的活性が増加したキメラ脂肪体プロＧＲＦ類似体
本発明は、生物学的活性が上昇したキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体、それらの同化作用性（ａｎａｂｏｌｉｃ）薬剤としての応用、そして成長ホルモン欠損症の診断および治療における応用に関する。キメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体は、疎水性部分（末端）を含み、ＧＲＦに対して１またはいくつかの疎水性末端を結合することによるかあるいはＧＲＦの化学合成において１またはいくつかのアミノ酸をシュードミセル残基により置換することによるかどちらかにより、調製することができる。本発明のＧＲＦ類似体は、生物分解性であり、非免疫原性であり、そして濃度が低い場合においても高い同化作用活性を示し、活性が延長していることを示す。
【発明の詳細な説明】
生物学的活性が増加したキメラ脂肪体プロＧＲＦ類似体 発明の背景 （ａ）発明の属する技術分野 本発明は、生物学的活性が増加しそして活性が延長したキメラ脂肪体ブロＧＲＦ類似体、それらの同化作用性（ａｎａｂｏｌｉｃ）薬剤としての応用、そして成長ホルモン欠損症の治療に関する。
（ｂ）従来の技術の記述 脳下垂体から分泌される成長ホルモン（ＧＨ）あるいはソマトトロピンは、生物学的活性が若齢の生物の直線的成長に重要であるが、成熟した状態においても本来の姿（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を維持するために重要である、ホルモンのファミリーを構成する。ＧＨは末梢器官に対して成長因子(インスリン様成長因子−１あるいはＩＧＦ−１)、あるいはその受容体（上皮増殖因子あるいはＥＧＦ）の合成を刺激することにより、直接的にあるいは間接的に作用する。ＧＨの直接的な作用は、抗インスリン性と呼ばれるタイプのものであり、その作用は脂肪組織のレベルでの脂肪融解に有利である。ＩＧＦ−１（ソマトメジンｃ）の合成および分泌に対するその作用を介して、ＧＨは軟骨および骨の成長（構造的成長）を刺激し、筋肉および皮膚を含む複数の末梢器官においてタンパク質合成および細胞増殖を刺激する。その生物学的活性を介して、ＧＨは成人においてタンパク質同化作用状態を維持する際に関与し、そして傷害の後の組織再生現象において主要な働きをする。
加齢とともに起こるＧＨ分泌の減少は、ヒト、および動物で示されており、生物の加齢を開始するあるいは加齢に関与する同化作用から異化作用へのシフトを引き起こしやすい。筋肉量の減少、脂肪組織の蓄積、骨の脱イオン化、加齢とともに見られる傷害後の組織再生能力の減少がＧＨの分泌の減少と相関している。
このようにＧＨは子供の直線的な成長のために絶対的に必要な、そして成人においてタンパク質の代謝を調節するための生理学的同化作用性薬剤である。
脳下垂体からのＧＨの分泌は、２種の視床下部性のペプチドであるソマトスタチンおよび成長ホルモン放出ホルモン（ＧＲＦ）が主に調節している。ソマトスタチンはＧＨの分泌を阻害し、一方でＧＲＦは促進する。
ヒトＧＨは、遺伝子工学により約１０年間製造されてきた。最近までＧＨの使用法のほとんどは、子供の成長遅延に関するものであったが、現在では成人に対するＧＨの使用について研究されている。ＧＨおよびＧＲＦの薬理学的使用は以下の３種の主要なカテゴリーに分類することができる。
子供の成長 組換えヒト成長ホルモンでの治療は、下垂体性小人症、腎臓機能不全症、ターナー症候群そしてこびと症の子供において成長を刺激することが示された。組換えヒトＧＨは現在ではヨーロッパおよびアメリカ合衆国で、ＧＨ欠損症により引き起こされる子供の成長遅延のために、そして子供の腎臓機能不全症のために、“みなしご薬物”として販売されている。その他の使用に関しては、臨床的な試験研究が行われている。
成人および初老の患者に対する長期的治療 ＧＨの分泌の減少により、加齢の際の体構造における変化が起こる。組換えヒトＧＨで１年間治療する予備的研究で、筋肉量の増加そして皮膚の厚さの増加、高齢の患者集団における骨密度の若干の増加を伴う脂肪量の減少が報告された。骨粗鬆症に関しては、最近の研究は組換えヒトＧＨが骨のイオン化を増加しないことを示唆し、閉経後の女性において骨の脱イオン化を阻害しうることを示唆する。さらにこの理論を示すための研究が現在進行中である。
成人および初老の患者に対する短期的治療 前臨床的研究および臨床的研究において、成長ホルモンは、タンパク質の同化作用や火傷の治癒、エイズや癌の治癒、けがの癒合および骨の癒合を刺激することが知られてきた。
ＧＨおよびＧＲＦについては、獣医薬理学的な使用についても企図している。ＧＨおよびＧＲＦの両方とも、脂肪組織の代わりに筋肉組織が蓄積しやすいことにより肥育期の間のブタの成長を刺激し、ウシにおいては乳の産生を増加し、そして動物の健康を危険にさらし得るような望ましくない副作用はいかなるものもなく、そして産生する肉あるいは乳にいかなる残存も見られない。ウシソマトトロピン（ＢＳＴ）は現在ではアメリカ合衆国において販売されている。
現在行われている臨床的研究のほとんどは、組換えＧＨで行っている。ＧＲＦは、ほとんどの事例において近い将来ＧＨの使用に変わる運命にある第二世代の産物であると考えられている。これにより、ＧＨそれ自体の使用を越えるの多数の利点がＧＲＦの使用には存在する。
生理学的利点 成長ホルモン（ＧＨ）は、脳下垂体からパルス状に分泌され、この分泌のリズムは最適の生物学的作用のために不可欠なものである。分泌の本来の形式に対応したＧＨの投与を成功させることは困難である。ＧＲＦを遅速放出調製物として、あるいは点滴として持続的様式により投与した場合、ＧＨの分泌が増加しその間そのパルス性は保たれる。
現在販売されている組換えＧＨは、２２ｋＤａの形であるが、一方でＧＲＦは脳下垂体からより幅広い生物学的作用に関わるあらゆる化学的異性体の合成および分泌を誘導する。
ＧＨによる治療により、結果として脳下垂体の内在性成長ホルモンの分泌の能力は減少し、そしてＧＲＦに対するＧＨの反応は、このような治療の後微弱になる。一方、ＧＲＦによる治療ではこの欠点は存在せず、脳下垂体に対するその亢進作用は、通常の動物においてそして成長ホルモン細胞機能不全を伴う患者において脳下垂体の分泌能力を増加する。
経済的利点 遺伝子工学によるＧＨの産生は、臨床的に使用するためには非常に高価なものである。特に、使用した細菌株からの物質によるこれら商業的調製物のコンタミネーションについての危険性がある。これら細菌性のコンタミネーション物質は、患者において発熱性物質となり、そして結果として免疫誘起反応を起こしうる。組換え産物の精製は、以下に示す多数の連続的なクロマトグラフィー工程をにより効果的なものとなる。徹底的な純度の基準を設ければ、複数回の品質管理工程を行うことになる。
ＧＲＦの合成は、化学的な性格によるものである。その合成は固層中で効果的であり、そしてその精製は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して一回工程で行う。同様に結果として同一の生物学的作用を得るために投与すべきＧＲＦの量はＧＨの量と比較してずっと少ない。
これらすべての利点にも関わらず、化学的に不安定であることを主要な理由として、ＧＲＦは未だに療法薬剤としては現在までのところ商業的になっていない。ヒトＧＲＦは、以下の配列である４４アミノ酸のペプチドである。
最小活性コア部分は、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2である。
多くのペプチドに関して、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は血清中で急速に分解し、そしてその代謝物には残存する生物学的活性はない。酵素の作用、すなわちジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ型の作用は、血液中で結果としてＧＲＦのＡｌａ2−Ａｓｐ3のペプチド結合を加水分解することがよく知られている。この加水分解は、文献で報告されている多くの研究の主題であった多数のネガティブな結果を引き起こしている。本質的にはこの加水分解により、生物学的活性が１／１０００以下に減少する、特異的な活性を持つ切断したペプチドを形成することを誘導する。
子供および成人での臨床的研究から、天然のｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2あるいは活性のあるｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2断片は、組換えＧＨの活性に相当する効果を引き起こすほど活性はない。
多くのＧＲＦ類似体が記述されたが、しかしそれらはすべて異なるアミノ酸配列を有するかあるいは合成アミノ酸（Ｄ体）を含む改変ＧＲＦであるという欠点が存在する。これらＧＲＦ類似体は、潜在的には免疫原性を有し、そしてそれらをヒトに投与することにより免疫傷害性の問題や潜在的な副作用を引き起こすことができる。
ペプチド配列のＣ末端に疎水性の基、たとえば−ＮＥｔ2で結合をすることにより、結果として特異的な活性を顕著に増加することができることはよく知られている。疎水性という用語においては、これらの結果はたとえば疎水基として小ペプチド類似体を合成する際に使用するラウロイル基の無効用を力説するＭｕｒａｎｉｃｈｉ（Ｓ．Ｍｕｒａｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ.，１９９１，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ.，８：６４９−６５２）の研究など、最近の研究により否定される。このように、先行技術の否定的な研究からは、疎水性残基を使用することにより効果的なＧＲＦ類似体を見いだすという問題を処理することができない。
Ｇａｕｄｒｅａｕら（Ｐ．Ｇａｕｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ.，１９９２，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ.，３５(１０),：１８６４−１８６９）は、ラット脳下垂体受容体に対するアセチル−ＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、６−アミノヘキサノイル−ＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、そして８−アミノオクタノイル−ＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の親和性を記述している。この報告において、試験した脂肪酸−ＧＲＦ組成物のどれも、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2それ自体よりも高い親和性を示さず、そして筆者らは“・・・ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2のＮ末端の疎水性特性を増加するための改変は、受容体親和性を増加するためには適切なアプローチを構成しない。”と結論づけた。
Ｃｏｙら（Ｄ.Ｈ.Ｃｏｙ ｅｔ ａｌ.，１９８７，Ｊ.Ｍｅｄ.Ｃｈｅｍ.，３０：２１９−２２２）は、ラットモデルにおける、より特定的にはペントバルビタールナトリウムにより麻酔をしたラットにおける生物学的活性の増加を伴うアセチル−ＧＲＦペプチドについて記述している。培養ラット脳下垂体細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧｈの反応を同様に解析した。しかしながら、これらの著者らは、ＧＲＦのＮ末端領域に追加した２よりも長い炭素鎖（アセチル）を持つ脂肪酸−ＧＲＦ類似体を合成しそして試験することはなかった。
今までに、記述されたＧＲＦ類似体のほとんどは、(Ｇａｕｄｒｅａｕらの類似体やＣｏｙらの類似体を含め)ラットのモデルでｉｎ ｖｉｔｒｏかｉｎ ｖｉｖｏのどちらかで試験されてきた。ヒトとラットのＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2ははっきりと異なっているため、ＧＲＦの構造−活性関係は両方の種において異なる。そのため、ラットで得られた結果をヒトに対して外挿することはできない。
それゆえ、同化作用活性を増進し、そして活性が延長するようなＧＲＦ類似体を設計することが必要である。この活性の増加は、血清分解に対する抵抗性からおよび／または高アゴニストの特徴から結果として得られる。
ヒトおよび動物に持続的に注射する場合に免疫反応を阻害するために、同化作用活性を増加し、一方で生物分解性を残し、そして天然のＧＲＦと構造的に近似するＧＲＦ類似体を提供することが非常に望ましい。
発明の概要 本発明の一つの目的は、生物分解性を有し、そして非免疫原性の新規のプロＧＲＦ類似体であって、生物学的活性が増加し活性が延長したものを提供することである。
本発明の別の目的は、ヒトおよび動物に持続的に投与したときにたとえばインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）の濃度を実質的には上昇することができる、同化作用活性が増加しおよび活性が延長した、プロＧＲＦ類似体を提供することである。
本発明の別の目的は、さらなる生物学的な活性と、延長された活性をいずれかのプロＧＲＦ類似体に付与する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、同化作用の活性が増加しそして活性が延長した活性化プロＧＲＦ類似体を精製する方法を提供することである。
本発明は、キメラ脂肪体−ＧＲＦ類似体を調製することに関する。これらのキメラ類似体は、疎水性部分（末端）を含み、１またはいくつかの疎水性末端をＧＲＦに結合することによるかあるいは１またはいくつかのアミノ酸をシュードミセル残基により置換することによるかどちらかにより、プロＧＲＦの化学合成において調製することができる。本発明によるプロＧＲＦ類似体は、以下において特徴づけられる： ａ）これらの類似体は亢進した生物学的活性を有している；特にそれらはヒトに非常に関連する動物モデルにおいて投与した場合に、ＧＨおよびＩＧＦ−１の血中濃度を顕著に増加することができる。この特徴は、結果として患者に投与する活性亢進組成物の濃度を減少させることができるという点で特に有利であり、その結果治療効率を増進し、そして治療コストを減少することができる。
ｂ）天然のアミノ酸および疎水性の代謝可能基質の両方を(たとえば脂肪酸など)、プロＧＲＦ類似体の化学合成のために使用する。完全に代謝可能な天然の基質のこのような使用は、潜在的な第二の効果、すなわち複数回の投与をする場合における効果を提供することを意図している。
ｃ）それらの類似体は、限られた少ない濃度で高い生物学的活性を示す。
ｄ）それらの類似体は、延長された長期間にわたって、高い生物学的活性を伴う活性を持ち続ける。
本発明による脂肪体の使用により、結果として先行技術の欠点すべてを克服するプロＧＲＦ類似体となる。本発明のプロＧＲＦ類似体は、生物分解性であり、非免疫原性であり、そして用量を減少しても同化作用活性が増加した状態を示し、そして活性が延長した状態である。さらに本発明は、ＧＲＦおよびその短縮されたまたは置換されたいずれかの類似体に関する。
予期しなかったことであるが、成長期ブタにおいて持続的に投与した場合に、Ｎ−ブチリルＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2あるいはＮ−オクタノイルＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2ではなくＮ−ヘキサノイルＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2が統計的に見てＩＧＦ−１の濃度を上昇させることを本発明の結果は示した。ＧＲＦのＮ末端領域にＣ4あるいはＣ8鎖の付加によりＮ−ヘキサノイル−ＧＲＦ（Ｃ6−ＧＲＦ）
と比較したときに生物学的活性の低い化合物しか得られなかったことを、本発明は示している。そのため、ＧＲＦの生物学的活性を増加するためにＧＲＦに対して結合するための炭素鎖の最適な長さは、Ｃ5からＣ7であることが、本発明からわかる。ＧＲＦのＮ−アセチル化（Ｃ2鎖の付加）によりラットにおいて生物学的活性が増加することを示しそしてＣ2より長い炭素鎖を持つ化合物の活性を記載していないＣｏｙらによる研究報告に基づいては、この結果は予期しなかった。
本発明の方法によれば、ＧＲＦあるいはその類似体のＮ末端部分あるいはＣ末端部分に１またはいくつかの疎水性末端を結合することによるか、あるいはＧＲＦまたはその類似体の化学合成のいずれかの工程において１またはいくつかのシュードミセル残基を導入することによるかどちらかにより、これらの類似体を作成することができる。切断および精製の後、結果として得られた改変ペプチドは、非常に低い濃度で投与した場合に、高い生物学的な活性を有することが示される。
本発明によれば、生物学的活性が増加し、以下の一般式：Ａ１−Ａ２−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａ８−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａ１５−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ１８−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ２４−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａ２７−Ａ２８−Ａｒｇ−Ａ３０を有する生物学的活性が増加したキメラ脂肪体−ＧＲＦ類似体を提供し、 式中で、Ａ２はＶａｌまたはＡｌａであり Ａ１５はＡｌａまたはＧｌｙであり Ａ２４はＧｌｎまたはＨｉｓであり Ａ２７はＭｅｔ、ＩｌｅまたはＮｌｅであり Ａ２８はＳｅｒまたはＡｓｐであり Ａ３０はいずれかのアミノアルキルカルボキシアミド−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ−であって、ｎ＝１から１２までか、あるいは１から１５残基のいずれかのアミノ酸配列であり、 Ａ１はＴｙｒまたはＨｉｓであり、Ａ８はＡｓｎまたはＳｅｒであり、そしてＡ１８はＳｅｒまたはＴｈｒであり、その中でＡ１は以下の一般式Ｉの疎水性末端によるＮ−またはＯ−で結合されており：
式中で、Ｇはカルボニル、フォスフォニル、スルフリルあるいはスルフィニル基であってａ＝０または１であり、 Ｘは、酸素原子、イオウ原子、あるいはアミノ基（−ＮＨ−）であって、ｂ＝０または１であり、 Ｒ1、Ｒ2およびＲ3基は、同一あるいは別個のものであり、そしてヒドロキシル基、水素原子、そして低級直鎖アルキル基あるいは分岐アルキル基から選択され、 −（Ｗ＝Ｙ）−および−（Ｗ'＝Ｙ'）−は、Ｒ5およびＲ6がＨまたはＣ1−Ｃ4アルキルであるシスまたはトランスの二重結合−（ＣＨ＝ＣＲ5）−および−（ＣＨ＝ＣＲ6）−であって、ｄおよびｆ＝０または１であり、 Ｒ4はヒドロキシル基、水素原子またはＣ5−Ｃ9アルキルであり、そして Ｚは酸素原子またはイオウ原子であって、ｈ＝０または１であり、 ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈは、同一または別個のものであり、そしてＲ4が水素であるときそれらはすべてが０ということはなく、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈの和は、式Ｉの疎水性末端が５から８原子の（Ｃ、Ｏおよび／またはＳ）直鎖状の主鎖を有する様になる。
本発明の好ましいキメラ脂肪体プロＧＲＦ類似体は、以下の群から選択される： ａ）式中でＡ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａおよびｂの両方が１であり、ｄ、ｆおよびｈのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｘは酸素原子であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が３、４、５または６である。
ｂ）式中でＡ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂ、ｄ、ｆおよびｈのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はヒドロキシル基であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である。
ｃ）式中でＡ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、ｄ＋ｆの和が１であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が２、３、４または５である。
ｄ）式中でＡ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、ｄ＋ｆの和が２であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が０、１、２または３である。
そして ｅ）式中でＡ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂ、ｈ、ｄおよびｆのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である。
本発明の目的において、“疎水性末端”あるいは“Ｈｔ”という用語は、脂肪酸、脂肪アミン、脂肪アルコール、コレステロール誘導体などのいずれかの機能化された脂肪体を意味することを意図している。“シュードミセル残基”あるいは“Ｐｒ”という用語は、残基がスウィッターイオニック型(ｓｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｆｏｒｍ)のミセル構造を形成しまたは取り入れうる様に設計された、側鎖を有するいずれかのαアミノ酸を意味することを意図している。
本発明により、活性成分として本発明のＧＲＦ類似体を、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて、成長ホルモンの放出を誘導するための薬学的処方を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者における成長ホルモン濃度を増加する方法を提供する。
本発明により、患者に対して本発明のＧＲＦ類似体を投与し成長ホルモンの反応を測定することを含む、前記患者における成長ホルモン欠損症の診断のための方法を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者における脳下垂体萎縮症または成長遅延の治療方法を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者における傷害の癒合または骨の癒合についての治療方法を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者における骨粗鬆症の治療方法を提供する。
本発明により、ヒトまたは動物に対して効果的な量の本発明のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記ヒトまたは動物におけるタンパク質同化作用（タンパク質節約効果を含む）を増進する方法を提供する。
本発明において、アミノ酸を、生化学命名法においてＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会により推奨されている様にペプチド技術分野において一般的に受け入れられている慣習的な３文字省略表記により以下に示すように同定する。
アラニン Ａｌａ アルギニン Ａｒｇ アスパラギン Ａｓｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ システイン Ｃｙｓ グルタミン酸 Ｇｌｕ グリシン Ｇｌｙ ヒスチジン Ｈｉｓ ロイシン Ｌｅｕ リジン Ｌｙｓ メチオニン Ｍｅｔ オルニチン Ｏｒｎ フェニルアラニン Ｐｈｅ プロリン Ｐｒｏ セリン Ｓｅｒ スレオニン Ｔｈｒ トリプトファン Ｔｒｐ チロシ Ｔｙｒ Ｄ−チロシン ｔｙｒ バリン Ｖａｌ “天然アミノ酸”という用語は、天然において生じ、または天然に生じるペプチドにおいてアミノ酸残基として取り込まれるアミノ酸を意味する。さらに省略形Ｎｌｅは、ノルロイシンを意味することを意図している。
使用するその他の省略形は、ＴＦＡ トリフルオロ酢酸ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾールＤＩＣ ジイソプロピルカルボジイミドＤＭＦ ジメチルフォルムアミドＰｉｐ ピペリジンＤＭＡＰ ４−ジメチルアミノピリジンＢｏｃ ｔ−ブチルオキシカルボニルＦｍｏｃ フルオレニルメチルオキシカルボニルＢＯＰ ベンゾトリアゾ−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェートＭｅ メチルＨＦ フッ化水素酸ＮＥｔ3トリエチルアミン、そしてＴＥＡＰ トリエチルアンモニウムリン酸（緩衝液）
本明細書中で記述するすべてのペプチド配列は、一般的に受け入れられている慣習に従って記載し、その際Ｎ末端アミノ酸は左に、Ｃ末端アミノ酸は右に記載する。
図面の簡単な説明 図１は、皮下に注射したｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2類似体のブタ血清ＩＧＦ−１に対する効果についてのグラフである。
図２は、静脈注射をした４μｇ／ｋｇのｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2および４μｇ／ｋｇの（ヘキセノイルトランス−３）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（ＴＴ−０１０２４）＋類似体のブタ血清ＧＨに対する効果の曲線である。
図３は、様々な濃度のｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2対［ヘキセノイルトランス−３］0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（ＴＴ−０１０２４）の、Ｉ．Ｖ．投与後３００分を通じてのＧＨの曲線下領域に対する効果を示すグラフである。（基礎的期間である−６０分から０分までとの比較をした場合、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）
図４は、５μｇ／ｋｇのｈＧＲＦ(１−２９)ＮＨ2および５μｇ／ｋｇの(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2類似体のブタ血清ＧＨに対する効果の曲線である。
図５は、様々な濃度のｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2対［ヘキセノイルトランス−３］0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（ＴＴ−０１０２４）の、Ｓ．Ｃ．投与後４２０分を通じてのＧＨの曲線下領域に対する効果を示すグラフである。（基礎的期間である−６０分から０分までとの比較をした場合、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）
発明の詳細な説明 本発明は、高活性であるが生物分解性であり非免疫原性であるキメラ脂肪体プロＧＲＦ類似体の新規なファミリーを生成するための、脂肪体、すなわちシュードミセル残基および／または疎水性末端を使用することに関する。
本発明により、脂肪体プロＧＲＦ類似体を： ＧＲＦまたはその類似体の一つのＣ末端および／またはＮ末端部分において、１またはいくつかの疎水性末端で結合することにより、または ＧＲＦまたはその類似体の一つを化学的に合成する際に、１またはいくつかのシュードミセルαアミノ酸誘導体（“シュードミセル残基”）を取り込むことにより、 化学的に合成することができる。
本発明により、ＧＲＦおよびその類似体を合成する際に架橋として使用するシュードミセル残基（Ｐｒ）の構造は、以下のように表すことができる：
式中、Ｗは−ＣＯ2Ｑ3、−ＰＯ3Ｑ3および−ＳＯ3Ｑ3からなる群から選択される基であり、 Ｑ3は、水素原子、アンモニウムイオン、メンデレーエフの周期表の１Ａ群の要素を含む群から選択される要素、あるいは以下の脂肪体、すなわちペンテン酸、ヘキセン酸、ヘプテン酸、またはそれらの飽和型から由来する機能的な基であり、 Ｑ1は、アルケニル、アラルキル、アリールおよびアルキル(Ｃn1Ｈ2n1+1)(ここでｎ１は１から８までの数である)からなる群から選択される基である。Ｑ1は、発明の範囲を限定するのではなく発明を説明するために提供する以下のリストから選択することができる：
式中、Ｐ1からＰ9は水素原子；メチル基；主要な脂肪族鎖、脂環式鎖または芳香族鎖を伴う機能的な疎水性末端を表し、以下のリスト、すなわち一般式（ＣmＨ2mＯ2）で表される飽和脂肪酸であって、ｍが４から１２までの数である直鎖あるいは分岐鎖；あるいはＧｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（１９８１，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｖｏｌ．３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：１−３４１）により記述されている、側鎖保護基、たとえばＰ1がベンジル基、ブロモ−２ベンジル、ジクロロ−２，６−ベンジルまたはｔ−ブチルであり、Ｐ2がベンジル基またはｔ−ブチルであり、Ｐ3がベンジル基、ｔ−ブチル、トリチル、アセトアミドメチルあるいはベンズアミドメチルであり、Ｐ4がトリフルオロアセチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル(Ｂｏｃ)、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）あるいはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）であり、Ｐ5はニトロ基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、メシチレンスルホニルあるいはペンタメチルクロマン（ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｃｒｏｍａｎｅ）であり、Ｐ6が水素という条件付きでＰ5およびＰ6がアダマンチルオキシカルボニルであり、Ｐ7がフェナシル基、ベンジルオキシメチルあるいはｔ−ブトキシメチルであり、Ｐ8がベンズヒドリル基、ジメトキシベンズヒドリル、トリチルあるいはキサンテニルでありうる、 ｎは０から６までの整数であり、 Ｙは以下の一般式で表され： Ｙ＝−Ａ−Ｐｚ 式中、Ａは二価のヘテロ原子であり、好ましくは酸素、イオウ、−ＮＨ−基あるいは−Ｎ（Ｍｅ）−基であり、 Ｐｚは、ｚが１から４までの整数である、前に定義したＰ1からＰ4までと同一であり、そして Ｑ2が水素原子である。Ｑ1がＨまたは低級アルキルである場合、Ｑ2はアルキル、、アルコキシ、アルケニル、アラルキルあるいはアリール基のいずれでもよい。これらの条件において、Ｑ1として上記に定義したものと化学的同一性を有する。
（Ｑ1）および（Ｑ2）が結合している炭素原子は、Ｌ体またはＤ体である。
それらは不斉であるが、しかし（Ｑ1）＝（Ｑ2）あるいは（Ｗ）＝（Ｙ）である場合には不斉ではない。
結合が１またはそれ以上の疎水性末端（Ｈｔ）非シュードミセルで構成されている場合においては、前記末端の構造全体は以下の様に表すことができる： (Ｈｔ)：Ｒ−ＸＯｆＱ5 式中、Ｒは分岐鎖または直鎖のアルキル基、アルケニル基、アリール基あるいはアラルキル基であり、そして一般式ＣmＨ2mＯ2で表される飽和脂肪酸を含む代謝可能な脂肪体の群から由来することができ、好ましくはｍが４から６までの整数であり、１不飽和あるいは多不飽和の脂肪酸、脂肪アミンおよびアルコールであり、 Ｘはリン原子、炭素原子あるいはイオウ原子であり、 ｆは１から３までの整数であり、 Ｑ5は水素原子、アンモニウムイオンあるいはアルカリ金属イオンを表し、ｆが１から２の整数である場合にはＱ5は以下の機能、すなわちＸおよびｆは上記で定義した通りであるアミノ(−ＮＨ−)、アルコール(−ＯＨ)、チオ(−ＳＨ)、あるいは酸（−ＸＯｆＨ）のうち少なくとも１つを有するという条件下で上記Ｒと同様に定義することができる。
化学的結合反応をよりよく行うために、酸型のもとで機能化された疎水性末端あるいはシュードミセル残基を使用することが好ましい。これらの条件下においては、結合反応は好ましくは固層中で(Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ.，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈeｍ．Ｓｏｃ.，８５：２１４９；１９６４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ.，８６：３０４)、たとえば先行技術において既知の、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）フォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート（Ｂ．Ｃａｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ.，１９７５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４：１２１９）などの完全に活性な試薬を使用することにより行われる。
結合するべきシュードミセル残基は一般的にはマロン酸塩(ｍａｌｏｎｉｃ ｓａｌｔ)、好ましくはジエチルアセトアミドメチルマロン酸のナトリウム塩と、アルキルハロゲン化物、アルケニルハロゲン化物、アリールハロゲン化物あるいはアラルキルハロゲン化物とを、たとえばジメチルフォルムアミドなどの極性溶媒中で、直接作用することにより調製する。この反応は通常は、続いて酸またはアルカリ加水分解を行い、そして結果として得られたラセミ混合物を分解(好ましくは酵素的に)する。
特定の条件においては、シュードミセル残基の調製物は、以下より構成される： ａ）第一の工程；すなわち、リジン、グルタミン酸あるいはアスパラギン酸などの機能化された側鎖を有するアミノ酸を直交する様式で保護すること、そしてサスリン型（ｓａｓｒｉｎ ｔｙｐｅ）の固体支持体上に接着すること(Ｍ．
Ｍｅｒｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ.，１９８８，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ｐ．
２５９，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｅｄ.，Ｅｓｃｏｍ，ｌｅｉｄｅｎ)、 ｂ）第二の工程；すなわち、側鎖を特異的に脱保護すること、そして上述したように代謝可能な疎水性末端（Ｈｔ）を自由部位に結合すること。シュードミセル残基（Ｐｒ）は支持体−残基結合の切断（ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2）の後、精製工程を行うことにより得られる。
三機能性の遊離アミノ酸のαにおいて機能する酸とアミンを選択的に配合することにより、たとえば酢酸銅などの鉱物性起源を持つ薬剤を配合することにより、シュードミセル残基を調整することができる。これらの条件において、形成された複合体および前記末端をそのアシルハロゲン化物中であるいはその酸型またはアミン型中で直接作用することにより、凝縮薬剤の存在下で、代謝可能な疎水性末端の結合を行う。
結合をすべき疎水性末端が脂肪酸を含む場合には、結合をするという観点での活性化がｉｎ ｓｉｔｕで起こりうる。使用した合成ストラテジーにより、伝統的な脱保護条件下において、結合する直前にペプチド結合部位を遊離する(Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，１９８１，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｖｏｌ．３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：１−３４１)。ついで疎水性末端（Ｈｔ）あるいはシュードミセル残基（Ｐｒ）は、有機溶媒、たとえばエーテル(テトラヒドロフラン)、脂肪族ハロゲン化溶媒(ジクロロメタン)、ニトリル（アセトニトリル）あるいはアミド（ジメチルフォルムアミド）中で、結合試薬で濃縮する。
結合の動力学の観点では、好ましい反応温度は２０から６０℃である。使用した疎水性末端の疎水性が高ければ高いほど、結合反応時間は温度とは反比例して変化するがしかし０．１から２４時間までの間でのみ変化する。
例示することができる実施例として、以下に記述するトリアシルリジン合成について疎水性脂肪酸末端の結合原理の全体を、概略的に説明する。
一般的なＧＲＦ類似体の合成工程は９０５０ＴＭとペプチド合成機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で、ＦｍｏｃストラテジーとＭｉｌｌｉｐｏｒｅにより供給された合成回路を使用して、固層方法により行った。Ｆｍｏｃアミノ酸は、Ｂａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａおよびその他の商業的供給源から購入した。カップリング方法としてＢＯＰ／ＨＯＢｔを使用する連続的Ｆｍｏｃ化学は、はじめにＦｍｏｃ−Ｐａｌ−ＰＥＧ樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＧＥＮ ９１３３８３）にＣ末端カルボキシアミドを産生するために適用する。Ｆｍｏｃの脱保護反応は、ＤＭＦ中２０％のピペリジン溶液中で行った。合成が終了した後、樹脂をＤＭＦとエーテルでよく洗浄し、乾燥させる。最終的な側鎖保護基およびペプチド−樹脂結合の切断は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅが供給している以下の混合物、すなわちＴＦＡ、水、フェノール、トリイソプロピルシラン（８８：５：５：２）を含む手順を使用して行った。ついでペプチドを沈殿し、エーテルで洗浄し、乾燥する。逆相ＨＰＬＣ精製（バッファーＡ：ＴＥＡＰ２．５；バッファーＢ：Ａ中で８０％のＣＨ3ＣＮ、ウォーターペップ４０００、吸光度２１４ｎｍ、検出器モデル４８６、流速５０ｍｌ／分、一般的な１０５分かけてＢを２５％から６０％にする直線的密度勾配を使用する）に続き、脱塩工程（バッファーＣ：水中０．１％ＴＦＡ、バッファーＤ：ＣＨ3ＣＨ／Ｈ2Ｏ（８０：２０）中で０．１％ＴＦＡ）を行うことで、ＨＰＬＣ（ミレニウム／光ダイオードの連続検出）により概算すると単一性が９７％以上であり、回収率が１０−３０％であるペプチドを得ることができる。
本発明により、ＧＲＦ類似体の産生についての前臨床的モデルとして価値のあるため、試験動物種としてブタを選択した。実際ヒトおよびブタのＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は構造的に１００％の相同性を有し、そして生理学的なＧＨ分泌のパターンも両種でほとんど同一である。
さらに、ＧＲＦ類似体の活性は、その急性的なＧＨ放出の活性よりもＩＧＦ−１の血中濃度を顕著に増加することができることにより測定した。実際、ＧＨまたはＧＲＦに誘導されたＧＨの同化作用活性および治癒効果がＩＧＦ−１の合成および分泌が増加することにより媒介されていることが知られている。そのため、ＧＲＦに誘導されたＩＧＦ−１の増加を測定することは、治療効率のもっともよい指標となる。
本発明は、発明の範囲を限定するのではなく発明を説明するために提供する以下の実施例を参照することにより、より容易に理解することができる。
実施例Ｉ [ブチリル0]、[オクタノイル0]−、[ヘキサノイル0]−、[ヘキサノイル30]、 [ヘキサノイル0,30]、ＨＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2および［ヘキサノイル0］
ＨＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2対ＨＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の反復投与の、 ブタ血清ＩＧＦ−１濃度に対する効果 これらの実験の目的は、ＧＲＦ類似体の同化作用性薬剤としての可能性を評価することである。ＧＨの分泌あるいはＧＲＦで誘導されたＧＨの分泌は、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）の合成と分泌を増加することを介して、同化作用活性を発揮し、結果として循環血中ＩＧＦ−１濃度を増加させることが知られている。ＧＲＦ類似体処置に対する同化作用性反応の強度は、ブタにおいてＩＧＦ−１の濃度の上昇と比例していることが、以前に示された(Ｄｕｂｒｅｕｉｌ Ｐ．ｅｔ ａｌ.，１９９０，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ.，６８：１２５４−１２６８)。
それゆえ、脂肪酸プロＧＲＦ類似体の同化作用活性を研究するためには、ブタにおいて反復皮下投与により引き起こされるＩＧＦ−１濃度を増加させる能力を評価した。
実験１ ２６頭のランドレース種×ヨークシャー種の去勢オスブタ（体重４０−４５ｋｇ）を、４実験群にランダムに分けた： １−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝７）
２−［オクタノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝６）
３−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝６）
４−［ブチリル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝７）
それぞれの動物は、４日間連続してＢＩＤを皮下に投与した(１日２回)。それぞれの日の朝のその日の最初の注射の前に、そしてその日の最後の注射の後に血液サンプルを採取し、ＩＧＦ−１の測定に供した。
実験２ ４０頭のランドレース種×ヨークシャー種の去勢オスブタ（体重４０−４５ｋｇ）を、５実験群にランダムに分けた： １−塩類溶液（ｎ＝８）
２−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（４０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
３−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（１０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
４−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
５−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（４０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
それぞれの動物は、５日間連続してＢＩＤを皮下に投与した(１日２回)。それぞれの日の朝のその日の最初の注射の前に、そしてその日の最後の注射の後に血液サンプルを採取し、ＩＧＦ−１の測定に供した。
実験３ ４８頭のランドレース種×ヨークシャー種の去勢オスブタ（体重４０−４５ｋｇ）を、６実験群にランダムに分けた： １−塩類溶液（ｎ＝８）
２−ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2（３０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
３−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2（３０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
４−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
５−［ヘキサノイル30］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
６−［ヘキサノイル0,30］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
選択した濃度は、ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2類似体については３０μｇ／ｋｇ、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2類似体については２０μｇ／ｋｇであり、それら濃度はモル数を基準とすると同一の濃度を示す。それぞれの動物は、５日間連続してＢＩＤを皮下に投与した(１日２回)。それぞれの日の朝のその日の最初の注射の前に、そしてその日の最後の注射の後に血液サンプルを採取し、ＩＧＦ−１の測定に供した。
ＩＧＦ−Ｉ測定 ブタ血清中のＩＧＦ−１濃度は、以前に記載されているように（Ａｂｒｉｂａｔ Ｔ．ｅｔ ａｌ.，１９９３，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ.，３９：５８３−５８９）ギ酸−アセトン抽出をした後、二抗体放射免疫アッセイを行うことで測定した。放射免疫アッセイの前に行う抽出は、内在性ＩＧＦ−１結合タンパク質を除去するための必要な工程である。
統計的解析 どちらの実験においても、ＩＧＦ−１のデータは変動の源として日数と処置（ＧＲＦ類似体）を用いて、分散の二方向反復測定解析（ｔｗｏ ｗａｙ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）により解析した。複数比較法（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）を行った(スチューデント−ニューマンケウルス法(Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ ｍｅｔｈｏｄ))。Ｐ＜０．０５を統計的に有意として判断した。
結果 実験１ 日数の顕著な効果（Ｐ＝０．０００４）および顕著な処置×日数相互作用（Ｐ＝０．０１１）の両方とも存在し、これよりＩＧＦ−１濃度の増加は、試験した類似体に依存していることを示している（表１）。ＩＧＦ−１の測定のための血液サンプルは、化合物をその日に最初に注射する前に毎日採取する。データは一群あたり６から７の値の平均±ＳＥＭとして示している。
複数の比較から、[ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2がＩＧＦ−１濃度の上昇を誘起していることが示され、それは第４日目（２９％、Ｐ＜０．０５）および第５日目（３８％、Ｐ＜０．０５）で顕著であった。ヒトＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は試験した濃度ではＩＧＦ−１濃度に対して効果を示さなかった。
実験２ 日数の顕著な効果（Ｐ＜０．０００１）および顕著な処置×日数相互作用（Ｐ＜０．０００１）の両方とも存在し、これよりＩＧＦ−１濃度の増加は、試験した類似体に依存していることを示している（表２）。ＩＧＦ−１の測定のための血液サンプルは、その日の最初の注射の前に毎日採取する。データは一群あたり８の値の平均±ＳＥＭとして示している。
複数の比較から、[ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の試験したすべての濃度でＩＧＦ−１濃度が上昇することが示された。１０μｇ／ｋｇの時には、ＩＧＦ−１濃度は第５日目および第６日目（１６から２１％、Ｐ＜０．０５）で顕著に増加した。２０μｇ／ｋｇの時には、ＩＧＦ−１濃度は第３、４、５、および第６日目（２０から２２％、Ｐ＜０．０５）で顕著に増加した。４０μｇ／ｋｇの時には、ＩＧＦ−１濃度は第３、４、５、および第６日目（２７から４８％、Ｐ＜０．０５）で顕著に増加した。ＩＧＦ−１濃度は塩類溶液で処置したブタ、およびｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2で処置したブタにおいて一定のままであった。
最後に、第１日目から第６日目までのＩＧＦ−１濃度の増加は、[ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2(△ＩＧＦ−１＝１１．９＋（２．７７＊濃度）；ｒ＝０．６８、Ｐ＜０．０００１)の濃度に依存していた。
実験３ 日数の顕著な効果（Ｐ＜０．０００１）および顕著な処置×日数相互作用（Ｐ＜０．０００１）の両方とも存在し、これよりＩＧＦ−１濃度の増加は、試験した類似体に依存していることを示している(表３)。複数の比較から、ヘキサノイルの機能を有するＧＲＦのＮ末端領域が分岐している類似体の活性が高いことが示された： [ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は、第５日目および第６日目に（２８％および３１％、Ｐ＜０．０５）ＩＧＦ−１濃度が顕著に増加した。
[ヘキサノイル0,30]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は、第４、５および第６日目に（３２％、３５％および４３％、Ｐ＜０．０５）ＩＧＦ−１濃度が顕著に増加した。
[ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2は、第３、４、５および第６日目に（４１％、５４％、５０％および６１％、Ｐ＜０．０５）ＩＧＦ−１濃度が顕著に増加した。
先にｈＧＲＦ(１−２９)ＮＨ2について示したように(実験１および実験２)、完全長のｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2はＩＧＦ−１濃度に対してわずかしかまたは全く効果を示さなかった(第６日目には維持できなかった第５日目の顕著な効果を除く)。最後に、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2のＣ末端領域にヘキサノイル機能を結合することにより、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2と比較したときに活性が増加した類似体（第６日目でＩＧＦ−１濃度が２１％増加した、Ｐ＜０．０５）を回収したが、[ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2よりは活性が低かった。
ヒトＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2およびｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2は、等モル濃度にするために、それぞれ２０μｇ／ｋｇおよび３０μｇ／ｋｇを注射した。
データは一群あたり８の値の平均±ＳＥＭとして示している。
結論 ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2およびｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2のどちらも、２０から４０μｇ／ｋｇの範囲の濃度では、ＩＧＦ−１濃度を修飾することができない。しかしながら、脂肪酸の結合により、ＧＲＦはより活性が高まり、そしてＩＧＦ−１分泌に対する活性が顕著に増加した類似体が得られた。脂肪酸の結合は、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2およびｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2のどちらともの同化作用の活性を増進する効果があった。上記の結果から、使用する理想的な脂肪酸はヘキサン酸あるいは任意のＣ6脂肪誘導体であり、そして好ましくは最大限に活性の高い類似体を回収するためにＧＲＦのＮ末端領域に結合すべきことが結論づけられた。
実施例ＩＩ プロＧＲＦ類似体のブタＩＧＦ−１濃度に対する相対的効果 これは、単一の濃度のそれぞれの試験物質対塩類溶液を、５日間、１日２回皮下投与する処置である。この実験は、(アミノヘキサノイル)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、(ヘキシルフォルミエート(Ｈｅｘｙｌｆｏｒｍｉａｔｅ))0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、（ヘキセノイルトランス−２）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、（ヘキセノイルトランス−３）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2および（ムコノイル）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の効率を、(ヘキサノイル)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の効率と比較するために行われた。
試験した化合物すべては、ＧＲＦ類似体の同一のファミリーに属している：それらは、分子の活性を増進するために設計された、天然のＧＲＦおよび天然の脂肪酸との組み合わせである。
試験類似体の特定 ＴＴ−０１０１５：(ヘキサノイル)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２１：(アミノヘキサノイル)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２２：(ヘキシルフォルミエート(Ｈｅｘｙｌｆｏｒｍｉａｔｅ))0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２３：(ヘキセノイルトランス−２)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２５：(ムコノイル)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ 試験物質の経路および頻度 投与：１日２回の皮下注射 試験系：ランドレース×ヨークシャーのブタ 動物の記載：購入時に体重が３５ｋｇの発育期去勢オスブタ５６頭 食餌：商業的濃縮飼料（タンパク質含量１８％）を、随意に給餌した。
実験計画：５６頭のブタを、７実験群（１実験群あたりブタｎ＝８）にランダムに分けた。それぞれの群は、１日２回以下の処置で皮下注射した(用量：３ｍｌ、皮下注射)。
群１：塩類溶液 ２回／日 群２：ＴＴ−０１０１５ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 群３：ＴＴ−０１０２１ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 群４：ＴＴ−０１０２２ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 群５：ＴＴ−０１０２３ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 群６：ＴＴ−０１０２４ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 群７：ＴＴ−０１０２５ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 処置として第１日目から第５日目まで投与した。注射の直前にそれぞれの動物から血液サンプルを回収し、さらに第６日目にもう一度血液サンプルを採取した。
血液サンプルは凝固させ、血清を遠心分離で回収し、そしてＩＧＦ−１アッセイに供した。
結果は、第１日目（処置前濃度）から第６日目（５日間のＧＲＦの投与後）
までのＩＧＦ−１濃度の上昇として定義される、Ｄ−ＩＧＦ−１として図１に示した。試験した類似体すべての中で、ヘキサノイル−、ヘキシルフォルミエート−、ヘキセノイルトランス−２−、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2だけが６日間の実験期間を通じてＩＧＦ−１濃度を顕著に増加させ、一方でアミノヘキサノイル−およびムコノイル−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は顕著には増加させなかった。ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は先のアッセイ（実施例１）と同一濃度、同一条件において、効果がないことを示したため、ＧＲＦのＮ末端領域にさらに様々なＣ6炭素鎖を付加することによりその生物活性を増加することが、これらの結果から示された。
実施例ＩＩＩ (ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2対 ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の、ブタにおける血管内ＧＨ放出活性。
この実験は、プロＧＲＦ類似体である（ヘキセノイルトランス−３）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2による静脈内（Ｉ．Ｖ.）の急性ＧＨ放出活性をテストするために、ヒトに生理学的に近似したモデルにおいて、そしてｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の効果と比較することにより行われた。
(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は、天然のｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2および天然の脂肪酸と組合わさる。この研究は、複数の濃度で、１回の静脈内（Ｉ．Ｖ.）注射を行う研究であった。
試験類似体の特定 ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、０．２５μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、１μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、４μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、０．２５μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、１μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、４μｇ／ｋｇ 試験物質の経路および頻度 投与：静脈内の短時間注射 試験系：ランドレース×ヨークシャーのブタ 動物の記載：購入時に体重が３５ｋｇの発育期去勢オスブタ５６頭 食餌：商業的濃縮飼料（タンパク質含量１８％）を、随意に給餌した。
実験計画：５６頭のブタ（４頭の予備のブタ）を、実験の前１週間以内にカニュレーション（カテーテルを頸静脈中に外科的に移植）した。第１日目と第７日目に、カニュレーションした動物は、７実験群（１実験群あたりブタｎ＝４）
にランダムに分けた。
群１：塩類溶液 群２：ＴＴ−０１０２４、 ０．２５μｇ／ｋｇ 群３：ＴＴ−０１０２４、 １μｇ／ｋｇ 群４：ＴＴ−０１０２４、 ４μｇ／ｋｇ 群５：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 ０．２５μｇ／ｋｇ 群６：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 １μｇ／ｋｇ 群７：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 ４μｇ／ｋｇ ｐＧＨアッセイのための血液サンプルはＧＲＦの注射の１時間前から５時間後まで、２０分ごとに採取し、さらに追加的に注射の１０分後と３０分後にも採取した(ｎ＝２１サンプル)。血液サンプルは＋４℃で凝固させた。血清は遠心分離により回収し、−２０℃で保存しそしてｐＧＨのアッセイに供した。
結果を図２および図３に示す。図２に示したように、ｈＧＲＦ（１−２９）
ＮＨ2（４μｇ／ｋｇ）は、注射後およそ６０分間継続する急速なＧＨ放出を誘導した。対照的に、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2により同一の濃度でもっと長い時間、およそ２６０分間にわたってＧＨ濃度が上昇した。さらに、最初の６０分間のＧＨ反応は穏やかであり、このことからこの類似体がプロＧＲＦとして機能し、注射後数分間あるいは数時間のうちに血清中で切断されて天然のＧＲＦに変化することが示唆される。様々な濃度のＧＲＦおよびその類似体の、ＧＨの曲線下領域（注射後０−３００分）に対する効果を示した図３に示したように、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は０．２５あるいは１μｇ／ｋｇの時には顕著な効果を示さなかったが、４μｇ／ｋｇの時にはＧＨの分泌に対して顕著な効果を示した。一方、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は試験した３濃度すべてにおいて顕著な反応を示した。まとめると、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は、ＧＨ分泌に対して効果が増加したＧＲＦ類似体であることをこれらの結果は示しており、プロＧＲＦとして機能することができ、血清中で酵素的分解から保護されていることを示唆している。
実施例ＩＶ (ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2対 ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の、ブタ皮下におけるＧＨ放出活性。
この実験は、プロＧＲＦ類似体である（ヘキセノイルトランス−３）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2による皮下（Ｓ．Ｃ.）の急性ＧＨ放出活性をテストするために、ヒトに生理学的に近似したモデルにおいて、そしてｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の効果と比較することにより行われた。
試験類似体の特定 ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、０．３１μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、１．２５μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、５μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、２０μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、１．２５μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、５μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、２０μｇ／ｋｇ 試験物質の経路および頻度 投与：皮下の短時間注射 試験系：ランドレース×ヨークシャーのブタ 動物の記載：購入時に体重が３５ｋｇの発育期去勢オスブタ６４頭 食餌：商業的濃縮飼料（タンパク質含量１８％）を、随意に給餌した。
実験計画：３６頭のブタ（４頭の予備のブタ）を、実験の前１週間以内にカニュレーション（カテーテルを頸静脈中に外科的に移植）した。第１日目と第７日目に、カニュレーションした動物は、８実験群（１実験群あたりブタｎ＝４）
にランダムに分けた。
群１：塩類溶液 群２：ＴＴ−０１０２４、 ０．３１μｇ／ｋｇ 群３：ＴＴ−０１０２４、 １．２５μｇ／ｋｇ 群４：ＴＴ−０１０２４、 ５μｇ／ｋｇ 群５：ＴＴ−０１０２４、 ２０μｇ／ｋｇ 群６：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 １．２５μｇ／ｋｇ 群７：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 ５μｇ／ｋｇ 群８：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 ２０μｇ／ｋｇ ｐＧＨアッセイのための血液サンプルはＧＲＦの注射の１時間前から７時間後まで、２０分ごとに採取した(ｎ＝２５サンプル)。血液サンプルは＋４℃で凝固させた。血清は遠心分離により回収し、−２０℃で保存しそしてｐＧＨのアッセイに供した。
結果を図４および図５に示す。図４に示したように、ｈＧＲＦ（１−２９）
ＮＨ2（５μｇ／ｋｇ）は、注射後の最初の６０分間にＧＨ放出を誘導した。一方、同一の濃度のヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の注射により２４０分間持続したＧＨ反応を誘導した。図５では、様々な濃度の試験したＧＲＦの、実験時間を通じてのＧＨの曲線下領域（注射後０−４２０分）に対する効果を示した。この期間を通じて、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2はいずれかの試験した濃度においても顕著なＧＨ反応を示さなかったが、一方、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2では５および２０μｇ／ｋｇの時にＧＨ ＡＵＣの顕著な増加を示した。全体的に見ると、皮下に投与した場合でも、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は、ＧＨ分泌に対して非常に効果的であることをこれらの結果は示唆している。
本発明はその特定の態様と組み合わせて記述されている一方、本発明はさらに改変することができることを理解すべきであり、そしてこの応用は発明の原理に従った発明のいずれかの変化、使用あるいは適用も一般的には含むことを意味し、本発明を含む技術分野内において既知のあるいは慣習的な実施において生ずるようなそしてこれまでに述べた、そして添付した請求の範囲に続く本質的な特徴に適用することができるような本発明の開示からの新しい方針などを含むものである。
生物学的活性が増加したキメラ脂肪体プロＧＲＦ類似体 発明の背景 （ａ）発明の属する技術分野 本発明は、生物学的活性が増加しそして活性が延長したキメラ脂肪体ブロＧＲＦ類似体、それらの同化作用性（ａｎａｂｏｌｉｃ）薬剤としての応用、そして成長ホルモン欠損症の治療に関する。
（ｂ）従来の技術の記述 脳下垂体から分泌される成長ホルモン（ＧＨ）あるいはソマトトロピンは、生物学的活性が若齢の生物の直線的成長に重要であるが、成熟した状態においても本来の姿（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を維持するために重要である、ホルモンのファミリーを構成する。ＧＨは末梢器官に対して成長因子(インスリン様成長因子−１あるいはＩＧＦ−１)、あるいはその受容体（上皮増殖因子あるいはＥＧＦ）の合成を刺激することにより、直接的にあるいは間接的に作用する。ＧＨの直接的な作用は、抗インスリン性と呼ばれるタイプのものであり、その作用は脂肪組織のレベルでの脂肪融解に有利である。ＩＧＦ−１（ソマトメジンｃ）の合成および分泌に対するその作用を介して、ＧＨは軟骨および骨の成長（構造的成長）を刺激し、筋肉および皮膚を含む複数の末梢器官においてタンパク質合成および細胞増殖を刺激する。その生物学的活性を介して、ＧＨは成人においてタンパク質同化作用状態を維持する際に関与し、そして傷害の後の組織再生現象において主要な働きをする。
加齢とともに起こるＧＨ分泌の減少は、ヒト、および動物で示されており、生物の加齢を開始するあるいは加齢に関与する同化作用から異化作用へのシフトを引き起こしやすい。筋肉量の減少、脂肪組織の蓄積、骨の脱イオン化、加齢とともに見られる傷害後の組織再生能力の減少がＧＨの分泌の減少と相関している。
このようにＧＨは子供の直線的な成長のために絶対的に必要な、そして成人においてタンパク質の代謝を調節するための生理学的同化作用性薬剤である。
脳下垂体からのＧＨの分泌は、２種の視床下部性のペプチドであるソマトスタチンおよび成長ホルモン放出ホルモン（ＧＲＦ）が主に調節している。ソマトスタチンはＧＨの分泌を阻害し、一方でＧＲＦは促進する。
ヒトＧＨは、遺伝子工学により約１０年間製造されてきた。最近までＧＨの使用法のほとんどは、子供の成長遅延に関するものであったが、現在では成人に対するＧＨの使用について研究されている。ＧＨおよびＧＲＦの薬理学的使用は以下の３種の主要なカテゴリーに分類することができる。
子供の成長 組換えヒト成長ホルモンでの治療は、下垂体性小人症、腎臓機能不全症、ターナー症候群そしてこびと症の子供において成長を刺激することが示された。組換えヒトＧＨは現在ではヨーロッパおよびアメリカ合衆国で、ＧＨ欠損症により引き起こされる子供の成長遅延のために、そして子供の腎臓機能不全症のために、“みなしご薬物”として販売されている。その他の使用に関しては、臨床的な試験研究が行われている。
成人および初老の患者に対する長期的治療 ＧＨの分泌の減少により、加齢の際の体構造における変化が起こる。組換えヒトＧＨで１年間治療する予備的研究で、筋肉量の増加そして皮膚の厚さの増加、高齢の患者集団における骨密度の若干の増加を伴う脂肪量の減少が報告された。骨粗鬆症に関しては、最近の研究は組換えヒトＧＨが骨のイオン化を増加しないことを示唆し、閉経後の女性において骨の脱イオン化を阻害しうることを示唆する。さらにこの理論を示すための研究が現在進行中である。
成人および初老の患者に対する短期的治療 前臨床的研究および臨床的研究において、成長ホルモンは、タンパク質の同化作用や火傷の治癒、エイズや癌の治癒、けがの癒合および骨の癒合を刺激することが知られてきた。
ＧＨおよびＧＲＦについては、獣医薬理学的な使用についても企図している。ＧＨおよびＧＲＦの両方とも、脂肪組織の代わりに筋肉組織が蓄積しやすいことにより肥育期の間のブタの成長を刺激し、ウシにおいては乳の産生を増加し、そして動物の健康を危険にさらし得るような望ましくない副作用はいかなるものもなく、そして産生する肉あるいは乳にいかなる残存も見られない。ウシソマトトロピン（ＢＳＴ）は現在ではアメリカ合衆国において販売されている。
現在行われている臨床的研究のほとんどは、組換えＧＨで行っている。ＧＲＦは、ほとんどの事例において近い将来ＧＨの使用に変わる運命にある第二世代の産物であると考えられている。これにより、ＧＨそれ自体の使用を越えるの多数の利点がＧＲＦの使用には存在する。
生理学的利点 成長ホルモン（ＧＨ）は、脳下垂体からパルス状に分泌され、この分泌のリズムは最適の生物学的作用のために不可欠なものである。分泌の本来の形式に対応したＧＨの投与を成功させることは困難である。ＧＲＦを遅速放出調製物として、あるいは点滴として持続的様式により投与した場合、ＧＨの分泌が増加しその間そのパルス性は保たれる。
現在販売されている組換えＧＨは、２２ｋＤａの形であるが、一方でＧＲＦは脳下垂体からより幅広い生物学的作用に関わるあらゆる化学的異性体の合成および分泌を誘導する。
ＧＨによる治療により、結果として脳下垂体の内在性成長ホルモンの分泌の能力は減少し、そしてＧＲＦに対するＧＨの反応は、このような治療の後微弱になる。一方、ＧＲＦによる治療ではこの欠点は存在せず、脳下垂体に対するその亢進作用は、通常の動物においてそして成長ホルモン細胞機能不全を伴う患者において脳下垂体の分泌能力を増加する。
経済的利点 遺伝子工学によるＧＨの産生は、臨床的に使用するためには非常に高価なものである。特に、使用した細菌株からの物質によるこれら商業的調製物のコンタミネーションについての危険性がある。これら細菌性のコンタミネーション物質は、患者において発熱性物質となり、そして結果として免疫誘起反応を起こしうる。組換え産物の精製は、以下に示す多数の連続的なクロマトグラフィー工程をにより効果的なものとなる。徹底的な純度の基準を設ければ、複数回の品質管理工程を行うことになる。
ＧＲＦの合成は、化学的な性格によるものである。その合成は固層中で効果的であり、そしてその精製は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して一回工程で行う。同様に結果として同一の生物学的作用を得るために投与すべきＧＲＦの量はＧＨの量と比較してずっと少ない。
これらすべての利点にも関わらず、化学的に不安定であることを主要な理由として、ＧＲＦは未だに療法薬剤としては現在までのところ商業的になっていない。ヒトＧＲＦは、以下の配列である４４アミノ酸のペプチドである。
最小活性コア部分は、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2である。
多くのペプチドに関して、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は血清中で急速に分解し、そしてその代謝物には残存する生物学的活性はない。酵素の作用、すなわちジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ型の作用は、血液中で結果としてＧＲＦのＡｌａ2−Ａｓｐ3のペプチド結合を加水分解することがよく知られている。この加水分解は、文献で報告されている多くの研究の主題であった多数のネガティブな結果を引き起こしている。本質的にはこの加水分解により、生物学的活性が１／１０００以下に減少する、特異的な活性を持つ切断したペプチドを形成することを誘導する。
子供および成人での臨床的研究から、天然のｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2あるいは活性のあるｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2断片は、組換えＧＨの活性に相当する効果を引き起こすほど活性はない。
多くのＧＲＦ類似体が記述されたが、しかしそれらはすべて異なるアミノ酸配列を有するかあるいは合成アミノ酸（Ｄ体）を含む改変ＧＲＦであるという欠点が存在する。これらＧＲＦ類似体は、潜在的には免疫原性を有し、そしてそれらをヒトに投与することにより免疫傷害性の問題や潜在的な副作用を引き起こすことができる。
ペプチド配列のＣ末端に疎水性の基、たとえば−ＮＥｔ2で結合をすることにより、結果として特異的な活性を顕著に増加することができることはよく知られている。疎水性という用語においては、これらの結果はたとえば疎水基として小ペプチド類似体を合成する際に使用するラウロイル基の無効用を力説するＭｕｒａｎｉｃｈｉ（Ｓ．Ｍｕｒａｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ.，１９９１，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ.，８：６４９−６５２）の研究など、最近の研究により否定される。このように、先行技術の否定的な研究からは、疎水性残基を使用することにより効果的なＧＲＦ類似体を見いだすという問題を処理することができない。
Ｇａｕｄｒｅａｕら（Ｐ．Ｇａｕｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ.，１９９２，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ.，３５(１０),：１８６４−１８６９）は、ラット脳下垂体受容体に対するアセチル−ＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、６−アミノヘキサノイル−ＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、そして８−アミノオクタノイル−ＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の親和性を記述している。この報告において、試験した脂肪酸−ＧＲＦ組成物のどれも、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2それ自体よりも高い親和性を示さず、そして筆者らは“・・・ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2のＮ末端の疎水性特性を増加するための改変は、受容体親和性を増加するためには適切なアプローチを構成しない。”と結論づけた。
Ｃｏｙら（Ｄ.Ｈ.Ｃｏｙ ｅｔ ａｌ.，１９８７，Ｊ.Ｍｅｄ.Ｃｈｅｍ.，３０：２１９−２２２）は、ラットモデルにおける、より特定的にはペントバルビタールナトリウムにより麻酔をしたラットにおける生物学的活性の増加を伴うアセチル−ＧＲＦペプチドについて記述している。培養ラット脳下垂体細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧｈの反応を同様に解析した。しかしながら、これらの著者らは、ＧＲＦのＮ末端領域に追加した２よりも長い炭素鎖（アセチル）を持つ脂肪酸−ＧＲＦ類似体を合成しそして試験することはなかった。
今までに、記述されたＧＲＦ類似体のほとんどは、(Ｇａｕｄｒｅａｕらの類似体やＣｏｙらの類似体を含め)ラットのモデルでｉｎ ｖｉｔｒｏかｉｎ ｖｉｖｏのどちらかで試験されてきた。ヒトとラットのＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2ははっきりと異なっているため、ＧＲＦの構造−活性関係は両方の種において異なる。そのため、ラットで得られた結果をヒトに対して外挿することはできない。
それゆえ、同化作用活性を増進し、そして活性が延長するようなＧＲＦ類似体を設計することが必要である。この活性の増加は、血清分解に対する抵抗性からおよび／または高アゴニストの特徴から結果として得られる。
ヒトおよび動物に持続的に注射する場合に免疫反応を阻害するために、同化作用活性を増加し、一方で生物分解性を残し、そして天然のＧＲＦと構造的に近似するＧＲＦ類似体を提供することが非常に望ましい。
発明の概要 本発明の一つの目的は、生物分解性を有し、そして非免疫原性の新規のプロＧＲＦ類似体であって、生物学的活性が増加し活性が延長したものを提供することである。
本発明の別の目的は、ヒトおよび動物に持続的に投与したときにたとえばインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）の濃度を実質的には上昇することができる、同化作用活性が増加しおよび活性が延長した、プロＧＲＦ類似体を提供することである。
本発明の別の目的は、さらなる生物学的な活性と、延長された活性をいずれかのプロＧＲＦ類似体に付与する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、同化作用の活性が増加しそして活性が延長した活性化プロＧＲＦ類似体を精製する方法を提供することである。
本発明は、キメラ脂肪体−ＧＲＦ類似体を調製することに関する。これらのキメラ類似体は、疎水性部分（末端）を含み、１またはいくつかの疎水性末端をＧＲＦに結合することによるかあるいは１またはいくつかのアミノ酸をシュードミセル残基により置換することによるかどちらかにより、プロＧＲＦの化学合成において調製することができる。本発明によるプロＧＲＦ類似体は、以下において特徴づけられる： ａ）これらの類似体は亢進した生物学的活性を有している；特にそれらはヒトに非常に関連する動物モデルにおいて投与した場合に、ＧＨおよびＩＧＦ−１の血中濃度を顕著に増加することができる。この特徴は、結果として患者に投与する活性亢進組成物の濃度を減少させることができるという点で特に有利であり、その結果治療効率を増進し、そして治療コストを減少することができる。
ｂ）天然のアミノ酸および疎水性の代謝可能基質の両方を(たとえば脂肪酸など)、プロＧＲＦ類似体の化学合成のために使用する。完全に代謝可能な天然の基質のこのような使用は、潜在的な第二の効果、すなわち複数回の投与をする場合における効果を提供することを意図している。
ｃ）それらの類似体は、限られた少ない濃度で高い生物学的活性を示す。
ｄ）それらの類似体は、延長された長期間にわたって、高い生物学的活性を伴う活性を持ち続ける。
本発明による脂肪体の使用により、結果として先行技術の欠点すべてを克服するプロＧＲＦ類似体となる。本発明のプロＧＲＦ類似体は、生物分解性であり、非免疫原性であり、そして用量を減少しても同化作用活性が増加した状態を示し、そして活性が延長した状態である。さらに本発明は、ＧＲＦおよびその短縮されたまたは置換されたいずれかの類似体に関する。
予期しなかったことであるが、成長期ブタにおいて持続的に投与した場合に、Ｎ−ブチリルＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2あるいはＮ−オクタノイルＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2ではなくＮ−ヘキサノイルＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2が統計的に見てＩＧＦ−１の濃度を上昇させることを本発明の結果は示した。ＧＲＦのＮ末端領域にＣ4あるいはＣ8鎖の付加によりＮ−ヘキサノイル−ＧＲＦ（Ｃ6−ＧＲＦ）
と比較したときに生物学的活性の低い化合物しか得られなかったことを、本発明は示している。そのため、ＧＲＦの生物学的活性を増加するためにＧＲＦに対して結合するための炭素鎖の最適な長さは、Ｃ5からＣ7であることが、本発明からわかる。ＧＲＦのＮ−アセチル化（Ｃ2鎖の付加）によりラットにおいて生物学的活性が増加することを示しそしてＣ2より長い炭素鎖を持つ化合物の活性を記載していないＣｏｙらによる研究報告に基づいては、この結果は予期しなかった。
本発明の方法によれば、ＧＲＦあるいはその類似体のＮ末端部分あるいはＣ末端部分に１またはいくつかの疎水性末端を結合することによるか、あるいはＧＲＦまたはその類似体の化学合成のいずれかの工程において１またはいくつかのシュードミセル残基を導入することによるかどちらかにより、これらの類似体を作成することができる。切断および精製の後、結果として得られた改変ペプチドは、非常に低い濃度で投与した場合に、高い生物学的な活性を有することが示される。
本発明によれば、生物学的活性が増加し、以下の一般式：Ａ１−Ａ２−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａ８−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａ１５−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ１８−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ２４−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａ２７−Ａ２８−Ａｒｇ−Ａ３０を有する生物学的活性が増加したキメラ脂肪体−ＧＲＦ類似体を提供し、 式中で、Ａ２はＶａｌまたはＡｌａであり Ａ１５はＡｌａまたはＧｌｙであり Ａ２４はＧｌｎまたはＨｉｓであり Ａ２７はＭｅｔ、ＩｌｅまたはＮｌｅであり Ａ２８はＳｅｒまたはＡｓｐであり Ａ３０はいずれかのアミノアルキルカルボキシアミド−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ−であって、ｎ＝１から１２までか、あるいは１から１５残基のいずれかのアミノ酸配列であり、 Ａ１はＴｙｒまたはＨｉｓであり、Ａ８はＡｓｎまたはＳｅｒであり、そしてＡ１８はＳｅｒまたはＴｈｒであり、その中でＡ１は以下の一般式Ｉの疎水性末端によるＮ−またはＯ−で結合されており：
式中で、Ｇはカルボニル、フォスフォニル、スルフリルあるいはスルフィニル基であってａ＝０または１であり、 Ｘは、酸素原子、イオウ原子、あるいはアミノ基（−ＮＨ−）であって、ｂ＝０または１であり、 Ｒ1、Ｒ2およびＲ3基は、同一あるいは別個のものであり、そしてヒドロキシル基、水素原子、そして低級直鎖アルキル基あるいは分岐アルキル基から選択され、 −（Ｗ＝Ｙ）−および−（Ｗ'＝Ｙ'）−は、Ｒ5およびＲ6がＨまたはＣ1−Ｃ4アルキルであるシスまたはトランスの二重結合−（ＣＨ＝ＣＲ5）−および−（ＣＨ＝ＣＲ6）−であって、ｄおよびｆ＝０または１であり、 Ｒ4はヒドロキシル基、水素原子またはＣ5−Ｃ9アルキルであり、そして Ｚは酸素原子またはイオウ原子であって、ｈ＝０または１であり、 ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈは、同一または別個のものであり、そしてＲ4が水素であるときそれらはすべてが０ということはなく、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈの和は、式Ｉの疎水性末端が５から８原子の（Ｃ、Ｏおよび／またはＳ）直鎖状の主鎖を有する様になる。
本発明の好ましいキメラ脂肪体プロＧＲＦ類似体は、以下の群から選択される： ａ）式中でＡ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａおよびｂの両方が１であり、ｄ、ｆおよびｈのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｘは酸素原子であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が３、４、５または６である。
ｂ）式中でＡ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂ、ｄ、ｆおよびｈのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はヒドロキシル基であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である。
ｃ）式中でＡ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、ｄ＋ｆの和が１であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が２、３、４または５である。
ｄ）式中でＡ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、ｄ＋ｆの和が２であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が０、１、２または３である。
そして ｅ）式中でＡ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂ、ｈ、ｄおよびｆのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である。
本発明の目的において、“疎水性末端”あるいは“Ｈｔ”という用語は、脂肪酸、脂肪アミン、脂肪アルコール、コレステロール誘導体などのいずれかの機能化された脂肪体を意味することを意図している。“シュードミセル残基”あるいは“Ｐｒ”という用語は、残基がスウィッターイオニック型(ｓｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｆｏｒｍ)のミセル構造を形成しまたは取り入れうる様に設計された、側鎖を有するいずれかのαアミノ酸を意味することを意図している。
本発明により、活性成分として本発明のＧＲＦ類似体を、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて、成長ホルモンの放出を誘導するための薬学的処方を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者における成長ホルモン濃度を増加する方法を提供する。
本発明により、患者に対して本発明のＧＲＦ類似体を投与し成長ホルモンの反応を測定することを含む、前記患者における成長ホルモン欠損症の診断のための方法を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者における脳下垂体萎縮症または成長遅延の治療方法を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者における傷害の癒合または骨の癒合についての治療方法を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者における骨粗鬆症の治療方法を提供する。
本発明により、ヒトまたは動物に対して効果的な量の本発明のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記ヒトまたは動物におけるタンパク質同化作用（タンパク質節約効果を含む）を増進する方法を提供する。
本発明において、アミノ酸を、生化学命名法においてＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会により推奨されている様にペプチド技術分野において一般的に受け入れられている慣習的な３文字省略表記により以下に示すように同定する。
アラニン Ａｌａ アルギニン Ａｒｇ アスパラギン Ａｓｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ システイン Ｃｙｓ グルタミン酸 Ｇｌｕ グリシン Ｇｌｙ ヒスチジン Ｈｉｓ ロイシン Ｌｅｕ リジン Ｌｙｓ メチオニン Ｍｅｔ オルニチン Ｏｒｎ フェニルアラニン Ｐｈｅ プロリン Ｐｒｏ セリン Ｓｅｒ スレオニン Ｔｈｒ トリプトファン Ｔｒｐ チロシ Ｔｙｒ Ｄ−チロシン ｔｙｒ バリン Ｖａｌ “天然アミノ酸”という用語は、天然において生じ、または天然に生じるペプチドにおいてアミノ酸残基として取り込まれるアミノ酸を意味する。さらに省略形Ｎｌｅは、ノルロイシンを意味することを意図している。
使用するその他の省略形は、ＴＦＡ トリフルオロ酢酸ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾールＤＩＣ ジイソプロピルカルボジイミドＤＭＦ ジメチルフォルムアミドＰｉｐ ピペリジンＤＭＡＰ ４−ジメチルアミノピリジンＢｏｃ ｔ−ブチルオキシカルボニルＦｍｏｃ フルオレニルメチルオキシカルボニルＢＯＰ ベンゾトリアゾ−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェートＭｅ メチルＨＦ フッ化水素酸ＮＥｔ3トリエチルアミン、そしてＴＥＡＰ トリエチルアンモニウムリン酸（緩衝液）
本明細書中で記述するすべてのペプチド配列は、一般的に受け入れられている慣習に従って記載し、その際Ｎ末端アミノ酸は左に、Ｃ末端アミノ酸は右に記載する。
図面の簡単な説明 図１は、皮下に注射したｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2類似体のブタ血清ＩＧＦ−１に対する効果についてのグラフである。
図２は、静脈注射をした４μｇ／ｋｇのｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2および４μｇ／ｋｇの（ヘキセノイルトランス−３）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（ＴＴ−０１０２４）＋類似体のブタ血清ＧＨに対する効果の曲線である。
図３は、様々な濃度のｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2対［ヘキセノイルトランス−３］0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（ＴＴ−０１０２４）の、Ｉ．Ｖ．投与後３００分を通じてのＧＨの曲線下領域に対する効果を示すグラフである。（基礎的期間である−６０分から０分までとの比較をした場合、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）
図４は、５μｇ／ｋｇのｈＧＲＦ(１−２９)ＮＨ2および５μｇ／ｋｇの(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2類似体のブタ血清ＧＨに対する効果の曲線である。
図５は、様々な濃度のｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2対［ヘキセノイルトランス−３］0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（ＴＴ−０１０２４）の、Ｓ．Ｃ．投与後４２０分を通じてのＧＨの曲線下領域に対する効果を示すグラフである。（基礎的期間である−６０分から０分までとの比較をした場合、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）
発明の詳細な説明 本発明は、高活性であるが生物分解性であり非免疫原性であるキメラ脂肪体プロＧＲＦ類似体の新規なファミリーを生成するための、脂肪体、すなわちシュードミセル残基および／または疎水性末端を使用することに関する。
本発明により、脂肪体プロＧＲＦ類似体を： ＧＲＦまたはその類似体の一つのＣ末端および／またはＮ末端部分において、１またはいくつかの疎水性末端で結合することにより、または ＧＲＦまたはその類似体の一つを化学的に合成する際に、１またはいくつかのシュードミセルαアミノ酸誘導体（“シュードミセル残基”）を取り込むことにより、 化学的に合成することができる。
本発明により、ＧＲＦおよびその類似体を合成する際に架橋として使用するシュードミセル残基（Ｐｒ）の構造は、以下のように表すことができる：
式中、Ｗは−ＣＯ2Ｑ3、−ＰＯ3Ｑ3および−ＳＯ3Ｑ3からなる群から選択される基であり、 Ｑ3は、水素原子、アンモニウムイオン、メンデレーエフの周期表の１Ａ群の要素を含む群から選択される要素、あるいは以下の脂肪体、すなわちペンテン酸、ヘキセン酸、ヘプテン酸、またはそれらの飽和型から由来する機能的な基であり、 Ｑ1は、アルケニル、アラルキル、アリールおよびアルキル(Ｃn1Ｈ2n1+1)(ここでｎ１は１から８までの数である)からなる群から選択される基である。Ｑ1は、発明の範囲を限定するのではなく発明を説明するために提供する以下のリストから選択することができる：
式中、Ｐ1からＰ9は水素原子；メチル基；主要な脂肪族鎖、脂環式鎖または芳香族鎖を伴う機能的な疎水性末端を表し、以下のリスト、すなわち一般式（ＣmＨ2mＯ2）で表される飽和脂肪酸であって、ｍが４から１２までの数である直鎖あるいは分岐鎖；あるいはＧｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（１９８１，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｖｏｌ．３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：１−３４１）により記述されている、側鎖保護基、たとえばＰ1がベンジル基、ブロモ−２ベンジル、ジクロロ−２，６−ベンジルまたはｔ−ブチルであり、Ｐ2がベンジル基またはｔ−ブチルであり、Ｐ3がベンジル基、ｔ−ブチル、トリチル、アセトアミドメチルあるいはベンズアミドメチルであり、Ｐ4がトリフルオロアセチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル(Ｂｏｃ)、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）あるいはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）であり、Ｐ5はニトロ基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、メシチレンスルホニルあるいはペンタメチルクロマン（ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｃｒｏｍａｎｅ）であり、Ｐ6が水素という条件付きでＰ5およびＰ6がアダマンチルオキシカルボニルであり、Ｐ7がフェナシル基、ベンジルオキシメチルあるいはｔ−ブトキシメチルであり、Ｐ8がベンズヒドリル基、ジメトキシベンズヒドリル、トリチルあるいはキサンテニルでありうる、 ｎは０から６までの整数であり、 Ｙは以下の一般式で表され： Ｙ＝−Ａ−Ｐｚ 式中、Ａは二価のヘテロ原子であり、好ましくは酸素、イオウ、−ＮＨ−基あるいは−Ｎ（Ｍｅ）−基であり、 Ｐｚは、ｚが１から４までの整数である、前に定義したＰ1からＰ4までと同一であり、そして Ｑ2が水素原子である。Ｑ1がＨまたは低級アルキルである場合、Ｑ2はアルキル、、アルコキシ、アルケニル、アラルキルあるいはアリール基のいずれでもよい。これらの条件において、Ｑ1として上記に定義したものと化学的同一性を有する。
（Ｑ1）および（Ｑ2）が結合している炭素原子は、Ｌ体またはＤ体である。
それらは不斉であるが、しかし（Ｑ1）＝（Ｑ2）あるいは（Ｗ）＝（Ｙ）である場合には不斉ではない。
結合が１またはそれ以上の疎水性末端（Ｈｔ）非シュードミセルで構成されている場合においては、前記末端の構造全体は以下の様に表すことができる： (Ｈｔ)：Ｒ−ＸＯｆＱ5 式中、Ｒは分岐鎖または直鎖のアルキル基、アルケニル基、アリール基あるいはアラルキル基であり、そして一般式ＣmＨ2mＯ2で表される飽和脂肪酸を含む代謝可能な脂肪体の群から由来することができ、好ましくはｍが４から６までの整数であり、１不飽和あるいは多不飽和の脂肪酸、脂肪アミンおよびアルコールであり、 Ｘはリン原子、炭素原子あるいはイオウ原子であり、 ｆは１から３までの整数であり、 Ｑ5は水素原子、アンモニウムイオンあるいはアルカリ金属イオンを表し、ｆが１から２の整数である場合にはＱ5は以下の機能、すなわちＸおよびｆは上記で定義した通りであるアミノ(−ＮＨ−)、アルコール(−ＯＨ)、チオ(−ＳＨ)、あるいは酸（−ＸＯｆＨ）のうち少なくとも１つを有するという条件下で上記Ｒと同様に定義することができる。
化学的結合反応をよりよく行うために、酸型のもとで機能化された疎水性末端あるいはシュードミセル残基を使用することが好ましい。これらの条件下においては、結合反応は好ましくは固層中で(Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ.，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈeｍ．Ｓｏｃ.，８５：２１４９；１９６４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ.，８６：３０４)、たとえば先行技術において既知の、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）フォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート（Ｂ．Ｃａｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ.，１９７５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４：１２１９）などの完全に活性な試薬を使用することにより行われる。
結合するべきシュードミセル残基は一般的にはマロン酸塩(ｍａｌｏｎｉｃ ｓａｌｔ)、好ましくはジエチルアセトアミドメチルマロン酸のナトリウム塩と、アルキルハロゲン化物、アルケニルハロゲン化物、アリールハロゲン化物あるいはアラルキルハロゲン化物とを、たとえばジメチルフォルムアミドなどの極性溶媒中で、直接作用することにより調製する。この反応は通常は、続いて酸またはアルカリ加水分解を行い、そして結果として得られたラセミ混合物を分解(好ましくは酵素的に)する。
特定の条件においては、シュードミセル残基の調製物は、以下より構成される： ａ）第一の工程；すなわち、リジン、グルタミン酸あるいはアスパラギン酸などの機能化された側鎖を有するアミノ酸を直交する様式で保護すること、そしてサスリン型（ｓａｓｒｉｎ ｔｙｐｅ）の固体支持体上に接着すること(Ｍ．
Ｍｅｒｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ.，１９８８，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ｐ．
２５９，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｅｄ.，Ｅｓｃｏｍ，ｌｅｉｄｅｎ)、 ｂ）第二の工程；すなわち、側鎖を特異的に脱保護すること、そして上述したように代謝可能な疎水性末端（Ｈｔ）を自由部位に結合すること。シュードミセル残基（Ｐｒ）は支持体−残基結合の切断（ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2）の後、精製工程を行うことにより得られる。
三機能性の遊離アミノ酸のαにおいて機能する酸とアミンを選択的に配合することにより、たとえば酢酸銅などの鉱物性起源を持つ薬剤を配合することにより、シュードミセル残基を調整することができる。これらの条件において、形成された複合体および前記末端をそのアシルハロゲン化物中であるいはその酸型またはアミン型中で直接作用することにより、凝縮薬剤の存在下で、代謝可能な疎水性末端の結合を行う。
結合をすべき疎水性末端が脂肪酸を含む場合には、結合をするという観点での活性化がｉｎ ｓｉｔｕで起こりうる。使用した合成ストラテジーにより、伝統的な脱保護条件下において、結合する直前にペプチド結合部位を遊離する(Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，１９８１，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｖｏｌ．３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：１−３４１)。ついで疎水性末端（Ｈｔ）あるいはシュードミセル残基（Ｐｒ）は、有機溶媒、たとえばエーテル(テトラヒドロフラン)、脂肪族ハロゲン化溶媒(ジクロロメタン)、ニトリル（アセトニトリル）あるいはアミド（ジメチルフォルムアミド）中で、結合試薬で濃縮する。
結合の動力学の観点では、好ましい反応温度は２０から６０℃である。使用した疎水性末端の疎水性が高ければ高いほど、結合反応時間は温度とは反比例して変化するがしかし０．１から２４時間までの間でのみ変化する。
例示することができる実施例として、以下に記述するトリアシルリジン合成について疎水性脂肪酸末端の結合原理の全体を、概略的に説明する。
一般的なＧＲＦ類似体の合成工程は９０５０ＴＭとペプチド合成機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で、ＦｍｏｃストラテジーとＭｉｌｌｉｐｏｒｅにより供給された合成回路を使用して、固層方法により行った。Ｆｍｏｃアミノ酸は、Ｂａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａおよびその他の商業的供給源から購入した。カップリング方法としてＢＯＰ／ＨＯＢｔを使用する連続的Ｆｍｏｃ化学は、はじめにＦｍｏｃ−Ｐａｌ−ＰＥＧ樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＧＥＮ ９１３３８３）にＣ末端カルボキシアミドを産生するために適用する。Ｆｍｏｃの脱保護反応は、ＤＭＦ中２０％のピペリジン溶液中で行った。合成が終了した後、樹脂をＤＭＦとエーテルでよく洗浄し、乾燥させる。最終的な側鎖保護基およびペプチド−樹脂結合の切断は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅが供給している以下の混合物、すなわちＴＦＡ、水、フェノール、トリイソプロピルシラン（８８：５：５：２）を含む手順を使用して行った。ついでペプチドを沈殿し、エーテルで洗浄し、乾燥する。逆相ＨＰＬＣ精製（バッファーＡ：ＴＥＡＰ２．５；バッファーＢ：Ａ中で８０％のＣＨ3ＣＮ、ウォーターペップ４０００、吸光度２１４ｎｍ、検出器モデル４８６、流速５０ｍｌ／分、一般的な１０５分かけてＢを２５％から６０％にする直線的密度勾配を使用する）に続き、脱塩工程（バッファーＣ：水中０．１％ＴＦＡ、バッファーＤ：ＣＨ3ＣＨ／Ｈ2Ｏ（８０：２０）中で０．１％ＴＦＡ）を行うことで、ＨＰＬＣ（ミレニウム／光ダイオードの連続検出）により概算すると単一性が９７％以上であり、回収率が１０−３０％であるペプチドを得ることができる。
本発明により、ＧＲＦ類似体の産生についての前臨床的モデルとして価値のあるため、試験動物種としてブタを選択した。実際ヒトおよびブタのＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は構造的に１００％の相同性を有し、そして生理学的なＧＨ分泌のパターンも両種でほとんど同一である。
さらに、ＧＲＦ類似体の活性は、その急性的なＧＨ放出の活性よりもＩＧＦ−１の血中濃度を顕著に増加することができることにより測定した。実際、ＧＨまたはＧＲＦに誘導されたＧＨの同化作用活性および治癒効果がＩＧＦ−１の合成および分泌が増加することにより媒介されていることが知られている。そのため、ＧＲＦに誘導されたＩＧＦ−１の増加を測定することは、治療効率のもっともよい指標となる。
本発明は、発明の範囲を限定するのではなく発明を説明するために提供する以下の実施例を参照することにより、より容易に理解することができる。
実施例Ｉ [ブチリル0]、[オクタノイル0]−、[ヘキサノイル0]−、[ヘキサノイル30]、 [ヘキサノイル0,30]、ＨＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2および［ヘキサノイル0］
ＨＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2対ＨＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の反復投与の、 ブタ血清ＩＧＦ−１濃度に対する効果 これらの実験の目的は、ＧＲＦ類似体の同化作用性薬剤としての可能性を評価することである。ＧＨの分泌あるいはＧＲＦで誘導されたＧＨの分泌は、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）の合成と分泌を増加することを介して、同化作用活性を発揮し、結果として循環血中ＩＧＦ−１濃度を増加させることが知られている。ＧＲＦ類似体処置に対する同化作用性反応の強度は、ブタにおいてＩＧＦ−１の濃度の上昇と比例していることが、以前に示された(Ｄｕｂｒｅｕｉｌ Ｐ．ｅｔ ａｌ.，１９９０，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ.，６８：１２５４−１２６８)。
それゆえ、脂肪酸プロＧＲＦ類似体の同化作用活性を研究するためには、ブタにおいて反復皮下投与により引き起こされるＩＧＦ−１濃度を増加させる能力を評価した。
実験１ ２６頭のランドレース種×ヨークシャー種の去勢オスブタ（体重４０−４５ｋｇ）を、４実験群にランダムに分けた： １−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝７）
２−［オクタノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝６）
３−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝６）
４−［ブチリル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝７）
それぞれの動物は、４日間連続してＢＩＤを皮下に投与した(１日２回)。それぞれの日の朝のその日の最初の注射の前に、そしてその日の最後の注射の後に血液サンプルを採取し、ＩＧＦ−１の測定に供した。
実験２ ４０頭のランドレース種×ヨークシャー種の去勢オスブタ（体重４０−４５ｋｇ）を、５実験群にランダムに分けた： １−塩類溶液（ｎ＝８）
２−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（４０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
３−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（１０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
４−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
５−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（４０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
それぞれの動物は、５日間連続してＢＩＤを皮下に投与した(１日２回)。それぞれの日の朝のその日の最初の注射の前に、そしてその日の最後の注射の後に血液サンプルを採取し、ＩＧＦ−１の測定に供した。
実験３ ４８頭のランドレース種×ヨークシャー種の去勢オスブタ（体重４０−４５ｋｇ）を、６実験群にランダムに分けた： １−塩類溶液（ｎ＝８）
２−ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2（３０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
３−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2（３０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
４−［ヘキサノイル0］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
５−［ヘキサノイル30］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
６−［ヘキサノイル0,30］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８）
選択した濃度は、ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2類似体については３０μｇ／ｋｇ、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2類似体については２０μｇ／ｋｇであり、それら濃度はモル数を基準とすると同一の濃度を示す。それぞれの動物は、５日間連続してＢＩＤを皮下に投与した(１日２回)。それぞれの日の朝のその日の最初の注射の前に、そしてその日の最後の注射の後に血液サンプルを採取し、ＩＧＦ−１の測定に供した。
ＩＧＦ−Ｉ測定 ブタ血清中のＩＧＦ−１濃度は、以前に記載されているように（Ａｂｒｉｂａｔ Ｔ．ｅｔ ａｌ.，１９９３，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ.，３９：５８３−５８９）ギ酸−アセトン抽出をした後、二抗体放射免疫アッセイを行うことで測定した。放射免疫アッセイの前に行う抽出は、内在性ＩＧＦ−１結合タンパク質を除去するための必要な工程である。
統計的解析 どちらの実験においても、ＩＧＦ−１のデータは変動の源として日数と処置（ＧＲＦ類似体）を用いて、分散の二方向反復測定解析（ｔｗｏ ｗａｙ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）により解析した。複数比較法（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）を行った(スチューデント−ニューマンケウルス法(Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ ｍｅｔｈｏｄ))。Ｐ＜０．０５を統計的に有意として判断した。
結果 実験１ 日数の顕著な効果（Ｐ＝０．０００４）および顕著な処置×日数相互作用（Ｐ＝０．０１１）の両方とも存在し、これよりＩＧＦ−１濃度の増加は、試験した類似体に依存していることを示している（表１）。ＩＧＦ−１の測定のための血液サンプルは、化合物をその日に最初に注射する前に毎日採取する。データは一群あたり６から７の値の平均±ＳＥＭとして示している。
複数の比較から、[ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2がＩＧＦ−１濃度の上昇を誘起していることが示され、それは第４日目（２９％、Ｐ＜０．０５）および第５日目（３８％、Ｐ＜０．０５）で顕著であった。ヒトＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は試験した濃度ではＩＧＦ−１濃度に対して効果を示さなかった。
実験２ 日数の顕著な効果（Ｐ＜０．０００１）および顕著な処置×日数相互作用（Ｐ＜０．０００１）の両方とも存在し、これよりＩＧＦ−１濃度の増加は、試験した類似体に依存していることを示している（表２）。ＩＧＦ−１の測定のための血液サンプルは、その日の最初の注射の前に毎日採取する。データは一群あたり８の値の平均±ＳＥＭとして示している。
複数の比較から、[ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の試験したすべての濃度でＩＧＦ−１濃度が上昇することが示された。１０μｇ／ｋｇの時には、ＩＧＦ−１濃度は第５日目および第６日目（１６から２１％、Ｐ＜０．０５）で顕著に増加した。２０μｇ／ｋｇの時には、ＩＧＦ−１濃度は第３、４、５、および第６日目（２０から２２％、Ｐ＜０．０５）で顕著に増加した。４０μｇ／ｋｇの時には、ＩＧＦ−１濃度は第３、４、５、および第６日目（２７から４８％、Ｐ＜０．０５）で顕著に増加した。ＩＧＦ−１濃度は塩類溶液で処置したブタ、およびｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2で処置したブタにおいて一定のままであった。
最後に、第１日目から第６日目までのＩＧＦ−１濃度の増加は、[ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2(△ＩＧＦ−１＝１１．９＋（２．７７＊濃度）；ｒ＝０．６８、Ｐ＜０．０００１)の濃度に依存していた。
実験３ 日数の顕著な効果（Ｐ＜０．０００１）および顕著な処置×日数相互作用（Ｐ＜０．０００１）の両方とも存在し、これよりＩＧＦ−１濃度の増加は、試験した類似体に依存していることを示している(表３)。複数の比較から、ヘキサノイルの機能を有するＧＲＦのＮ末端領域が分岐している類似体の活性が高いことが示された： [ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は、第５日目および第６日目に（２８％および３１％、Ｐ＜０．０５）ＩＧＦ−１濃度が顕著に増加した。
[ヘキサノイル0,30]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は、第４、５および第６日目に（３２％、３５％および４３％、Ｐ＜０．０５）ＩＧＦ−１濃度が顕著に増加した。
[ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2は、第３、４、５および第６日目に（４１％、５４％、５０％および６１％、Ｐ＜０．０５）ＩＧＦ−１濃度が顕著に増加した。
先にｈＧＲＦ(１−２９)ＮＨ2について示したように(実験１および実験２)、完全長のｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2はＩＧＦ−１濃度に対してわずかしかまたは全く効果を示さなかった(第６日目には維持できなかった第５日目の顕著な効果を除く)。最後に、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2のＣ末端領域にヘキサノイル機能を結合することにより、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2と比較したときに活性が増加した類似体（第６日目でＩＧＦ−１濃度が２１％増加した、Ｐ＜０．０５）を回収したが、[ヘキサノイル0]ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2よりは活性が低かった。
ヒトＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2およびｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2は、等モル濃度にするために、それぞれ２０μｇ／ｋｇおよび３０μｇ／ｋｇを注射した。
データは一群あたり８の値の平均±ＳＥＭとして示している。
結論 ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2およびｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2のどちらも、２０から４０μｇ／ｋｇの範囲の濃度では、ＩＧＦ−１濃度を修飾することができない。しかしながら、脂肪酸の結合により、ＧＲＦはより活性が高まり、そしてＩＧＦ−１分泌に対する活性が顕著に増加した類似体が得られた。脂肪酸の結合は、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2およびｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ2のどちらともの同化作用の活性を増進する効果があった。上記の結果から、使用する理想的な脂肪酸はヘキサン酸あるいは任意のＣ6脂肪誘導体であり、そして好ましくは最大限に活性の高い類似体を回収するためにＧＲＦのＮ末端領域に結合すべきことが結論づけられた。
実施例ＩＩ プロＧＲＦ類似体のブタＩＧＦ−１濃度に対する相対的効果 これは、単一の濃度のそれぞれの試験物質対塩類溶液を、５日間、１日２回皮下投与する処置である。この実験は、(アミノヘキサノイル)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、(ヘキシルフォルミエート(Ｈｅｘｙｌｆｏｒｍｉａｔｅ))0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、（ヘキセノイルトランス−２）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、（ヘキセノイルトランス−３）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2および（ムコノイル）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の効率を、(ヘキサノイル)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の効率と比較するために行われた。
試験した化合物すべては、ＧＲＦ類似体の同一のファミリーに属している：それらは、分子の活性を増進するために設計された、天然のＧＲＦおよび天然の脂肪酸との組み合わせである。
試験類似体の特定 ＴＴ−０１０１５：(ヘキサノイル)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２１：(アミノヘキサノイル)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２２：(ヘキシルフォルミエート(Ｈｅｘｙｌｆｏｒｍｉａｔｅ))0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２３：(ヘキセノイルトランス−２)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２５：(ムコノイル)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、塩類溶液中２０μｇ／ｋｇ 試験物質の経路および頻度 投与：１日２回の皮下注射 試験系：ランドレース×ヨークシャーのブタ 動物の記載：購入時に体重が３５ｋｇの発育期去勢オスブタ５６頭 食餌：商業的濃縮飼料（タンパク質含量１８％）を、随意に給餌した。
実験計画：５６頭のブタを、７実験群（１実験群あたりブタｎ＝８）にランダムに分けた。それぞれの群は、１日２回以下の処置で皮下注射した(用量：３ｍｌ、皮下注射)。
群１：塩類溶液 ２回／日 群２：ＴＴ−０１０１５ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 群３：ＴＴ−０１０２１ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 群４：ＴＴ−０１０２２ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 群５：ＴＴ−０１０２３ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 群６：ＴＴ−０１０２４ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 群７：ＴＴ−０１０２５ ２０μｇ／ｋｇ２回／日 処置として第１日目から第５日目まで投与した。注射の直前にそれぞれの動物から血液サンプルを回収し、さらに第６日目にもう一度血液サンプルを採取した。
血液サンプルは凝固させ、血清を遠心分離で回収し、そしてＩＧＦ−１アッセイに供した。
結果は、第１日目（処置前濃度）から第６日目（５日間のＧＲＦの投与後）
までのＩＧＦ−１濃度の上昇として定義される、Ｄ−ＩＧＦ−１として図１に示した。試験した類似体すべての中で、ヘキサノイル−、ヘキシルフォルミエート−、ヘキセノイルトランス−２−、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2だけが６日間の実験期間を通じてＩＧＦ−１濃度を顕著に増加させ、一方でアミノヘキサノイル−およびムコノイル−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は顕著には増加させなかった。ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は先のアッセイ（実施例１）と同一濃度、同一条件において、効果がないことを示したため、ＧＲＦのＮ末端領域にさらに様々なＣ6炭素鎖を付加することによりその生物活性を増加することが、これらの結果から示された。
実施例ＩＩＩ (ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2対 ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の、ブタにおける血管内ＧＨ放出活性。
この実験は、プロＧＲＦ類似体である（ヘキセノイルトランス−３）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2による静脈内（Ｉ．Ｖ.）の急性ＧＨ放出活性をテストするために、ヒトに生理学的に近似したモデルにおいて、そしてｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の効果と比較することにより行われた。
(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は、天然のｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2および天然の脂肪酸と組合わさる。この研究は、複数の濃度で、１回の静脈内（Ｉ．Ｖ.）注射を行う研究であった。
試験類似体の特定 ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、０．２５μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、１μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、４μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、０．２５μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、１μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、４μｇ／ｋｇ 試験物質の経路および頻度 投与：静脈内の短時間注射 試験系：ランドレース×ヨークシャーのブタ 動物の記載：購入時に体重が３５ｋｇの発育期去勢オスブタ５６頭 食餌：商業的濃縮飼料（タンパク質含量１８％）を、随意に給餌した。
実験計画：５６頭のブタ（４頭の予備のブタ）を、実験の前１週間以内にカニュレーション（カテーテルを頸静脈中に外科的に移植）した。第１日目と第７日目に、カニュレーションした動物は、７実験群（１実験群あたりブタｎ＝４）
にランダムに分けた。
群１：塩類溶液 群２：ＴＴ−０１０２４、 ０．２５μｇ／ｋｇ 群３：ＴＴ−０１０２４、 １μｇ／ｋｇ 群４：ＴＴ−０１０２４、 ４μｇ／ｋｇ 群５：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 ０．２５μｇ／ｋｇ 群６：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 １μｇ／ｋｇ 群７：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 ４μｇ／ｋｇ ｐＧＨアッセイのための血液サンプルはＧＲＦの注射の１時間前から５時間後まで、２０分ごとに採取し、さらに追加的に注射の１０分後と３０分後にも採取した(ｎ＝２１サンプル)。血液サンプルは＋４℃で凝固させた。血清は遠心分離により回収し、−２０℃で保存しそしてｐＧＨのアッセイに供した。
結果を図２および図３に示す。図２に示したように、ｈＧＲＦ（１−２９）
ＮＨ2（４μｇ／ｋｇ）は、注射後およそ６０分間継続する急速なＧＨ放出を誘導した。対照的に、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2により同一の濃度でもっと長い時間、およそ２６０分間にわたってＧＨ濃度が上昇した。さらに、最初の６０分間のＧＨ反応は穏やかであり、このことからこの類似体がプロＧＲＦとして機能し、注射後数分間あるいは数時間のうちに血清中で切断されて天然のＧＲＦに変化することが示唆される。様々な濃度のＧＲＦおよびその類似体の、ＧＨの曲線下領域（注射後０−３００分）に対する効果を示した図３に示したように、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は０．２５あるいは１μｇ／ｋｇの時には顕著な効果を示さなかったが、４μｇ／ｋｇの時にはＧＨの分泌に対して顕著な効果を示した。一方、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は試験した３濃度すべてにおいて顕著な反応を示した。まとめると、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は、ＧＨ分泌に対して効果が増加したＧＲＦ類似体であることをこれらの結果は示しており、プロＧＲＦとして機能することができ、血清中で酵素的分解から保護されていることを示唆している。
実施例ＩＶ (ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2対 ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の、ブタ皮下におけるＧＨ放出活性。
この実験は、プロＧＲＦ類似体である（ヘキセノイルトランス−３）0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2による皮下（Ｓ．Ｃ.）の急性ＧＨ放出活性をテストするために、ヒトに生理学的に近似したモデルにおいて、そしてｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の効果と比較することにより行われた。
試験類似体の特定 ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、０．３１μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、１．２５μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、５μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４：(ヘキセノイルトランス−３)0ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、２０μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、１．２５μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、５μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、２０μｇ／ｋｇ 試験物質の経路および頻度 投与：皮下の短時間注射 試験系：ランドレース×ヨークシャーのブタ 動物の記載：購入時に体重が３５ｋｇの発育期去勢オスブタ６４頭 食餌：商業的濃縮飼料（タンパク質含量１８％）を、随意に給餌した。
実験計画：３６頭のブタ（４頭の予備のブタ）を、実験の前１週間以内にカニュレーション（カテーテルを頸静脈中に外科的に移植）した。第１日目と第７日目に、カニュレーションした動物は、８実験群（１実験群あたりブタｎ＝４）
にランダムに分けた。
群１：塩類溶液 群２：ＴＴ−０１０２４、 ０．３１μｇ／ｋｇ 群３：ＴＴ−０１０２４、 １．２５μｇ／ｋｇ 群４：ＴＴ−０１０２４、 ５μｇ／ｋｇ 群５：ＴＴ−０１０２４、 ２０μｇ／ｋｇ 群６：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 １．２５μｇ／ｋｇ 群７：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 ５μｇ／ｋｇ 群８：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2、 ２０μｇ／ｋｇ ｐＧＨアッセイのための血液サンプルはＧＲＦの注射の１時間前から７時間後まで、２０分ごとに採取した(ｎ＝２５サンプル)。血液サンプルは＋４℃で凝固させた。血清は遠心分離により回収し、−２０℃で保存しそしてｐＧＨのアッセイに供した。
結果を図４および図５に示す。図４に示したように、ｈＧＲＦ（１−２９）
ＮＨ2（５μｇ／ｋｇ）は、注射後の最初の６０分間にＧＨ放出を誘導した。一方、同一の濃度のヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2の注射により２４０分間持続したＧＨ反応を誘導した。図５では、様々な濃度の試験したＧＲＦの、実験時間を通じてのＧＨの曲線下領域（注射後０−４２０分）に対する効果を示した。この期間を通じて、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2はいずれかの試験した濃度においても顕著なＧＨ反応を示さなかったが、一方、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2では５および２０μｇ／ｋｇの時にＧＨ ＡＵＣの顕著な増加を示した。全体的に見ると、皮下に投与した場合でも、ヘキセノイルトランス−３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ2は、ＧＨ分泌に対して非常に効果的であることをこれらの結果は示唆している。
本発明はその特定の態様と組み合わせて記述されている一方、本発明はさらに改変することができることを理解すべきであり、そしてこの応用は発明の原理に従った発明のいずれかの変化、使用あるいは適用も一般的には含むことを意味し、本発明を含む技術分野内において既知のあるいは慣習的な実施において生ずるようなそしてこれまでに述べた、そして添付した請求の範囲に続く本質的な特徴に適用することができるような本発明の開示からの新しい方針などを含むものである。
【特許請求の範囲】
１． 下記の一般式を有する生物学的活性が増加したキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体であって：Ａ１−Ａ２−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａ８−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａ１５−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ１８−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ２４−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａ２７−Ａ２８−Ａｒｇ−Ａ３０ 式中、Ａ２はＶａｌまたはＡｌａであり Ａ１５はＡｌａまたはＧｌｙであり Ａ２４はＧｌｎまたはＨｉｓであり Ａ２７はＭｅｔ、ＩｌｅまたはＮｌｅであり Ａ２８はＳｅｒまたはＡｓｐであり Ａ３０は任意のアミノアルキルカルボキシアミド−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ−であって、ｎ＝１から１２であるか、あるいはＡ３０は１から１５残基のいずれかのアミノ酸配列であり、 Ａ１はＴｙｒまたはＨｉｓであり；Ａ８はＡｓｎまたはＳｅｒであり、そしてＡ１８はＳｅｒまたはＴｈｒであり、その中でＡ１は下記の一般式Ｉの疎水性末端によりＮ−またはＯ−で固定されており：
式中、Ｇはカルボニル、フォスフォニル、スルフリルあるいはスルフィニル基であってａ＝０または１であり、 Ｘは、酸素原子、イオウ原子、あるいはアミノ基（−ＮＨ−）であり、ｂ＝０または１であり、 基Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同一あるいは別個のものであり、そしてヒドロキシル基、水素原子、および低級直鎖あるいは分岐アルキル基から選択され、 −（Ｗ＝Ｙ）−および−（Ｗ’＝Ｙ’）−は、Ｒ5およびＲ6がＨまたはＣ1−Ｃ4アルキルであるシスまたはトランスの二重結合−（ＣＨ＝ＣＲ5）−および−（ＣＨ＝ＣＲ6）−であり、ｄおよびｆ＝０または１であり、 Ｒ4はヒドロキシル基、水素原子またはＣ5−Ｃ9アルキルであり、そして Ｚは酸素原子またはイオウ原子であり、ｈ＝０または１であり、 ただしａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈは、同一または別個のものであり、そしてＲ4が水素であるときそれらはすべてが０ということはなく、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈの和は、式Ｉの疎水性末端が５から８原子の（Ｃ、Ｏおよび／またはＳ）直鎖状の主鎖を有する、キメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
２． 式中、Ａ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａおよびｂの両方が１であり、ｄ、ｆおよびｈのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｘは酸素原子であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が３、４、５または６である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
３． 式中、Ａ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂ、ｄ、ｆおよびｈのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はヒドロキシル基であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
４． 式中、Ａ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、ｄ＋ｆの和が１であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が２、３、４または５である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
５． 式中、Ａ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、ｄ＋ｆの和が２であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が０、１、２または３である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
６． 式中、Ａ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂ、ｈ、ｄおよびｆのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
７． 活性成分として請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を、薬学的に許容可能な担体、賦形剤あるいは希釈剤と組み合わせて含む、成長ホルモンの放出を誘導する薬学的処方剤。
８． 患者に対して効果的な量の請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者において成長ホルモンの濃度を増加する方法。
９． 患者に対して請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与し、そして成長ホルモンの反応を測定することを含む、前記患者において成長ホルモン欠損症を診断する方法。
１０． 患者に対して効果的な量の請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者において下垂体萎縮症あるいは成長遅滞を治療する方法。
１１． 患者に対して効果的な量の請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者において傷害あるいは骨の癒合について治療する方法。
１２． 患者に対して効果的な量の請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者において骨粗鬆症を治療する方法。
１３． ヒトあるいは動物に対して効果的な量の請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記ヒトあるいは動物においてタンパク質の同化作用活性を増進する方法。
１． 下記の一般式を有する生物学的活性が増加したキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体であって：Ａ１−Ａ２−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａ８−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａ１５−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ１８−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ２４−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａ２７−Ａ２８−Ａｒｇ−Ａ３０ 式中、Ａ２はＶａｌまたはＡｌａであり Ａ１５はＡｌａまたはＧｌｙであり Ａ２４はＧｌｎまたはＨｉｓであり Ａ２７はＭｅｔ、ＩｌｅまたはＮｌｅであり Ａ２８はＳｅｒまたはＡｓｐであり Ａ３０は任意のアミノアルキルカルボキシアミド−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ−であって、ｎ＝１から１２であるか、あるいはＡ３０は１から１５残基のいずれかのアミノ酸配列であり、 Ａ１はＴｙｒまたはＨｉｓであり；Ａ８はＡｓｎまたはＳｅｒであり、そしてＡ１８はＳｅｒまたはＴｈｒであり、その中でＡ１は下記の一般式Ｉの疎水性末端によりＮ−またはＯ−で固定されており：
式中、Ｇはカルボニル、フォスフォニル、スルフリルあるいはスルフィニル基であってａ＝０または１であり、 Ｘは、酸素原子、イオウ原子、あるいはアミノ基（−ＮＨ−）であり、ｂ＝０または１であり、 基Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同一あるいは別個のものであり、そしてヒドロキシル基、水素原子、および低級直鎖あるいは分岐アルキル基から選択され、 −（Ｗ＝Ｙ）−および−（Ｗ’＝Ｙ’）−は、Ｒ5およびＲ6がＨまたはＣ1−Ｃ4アルキルであるシスまたはトランスの二重結合−（ＣＨ＝ＣＲ5）−および−（ＣＨ＝ＣＲ6）−であり、ｄおよびｆ＝０または１であり、 Ｒ4はヒドロキシル基、水素原子またはＣ5−Ｃ9アルキルであり、そして Ｚは酸素原子またはイオウ原子であり、ｈ＝０または１であり、 ただしａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈは、同一または別個のものであり、そしてＲ4が水素であるときそれらはすべてが０ということはなく、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈの和は、式Ｉの疎水性末端が５から８原子の（Ｃ、Ｏおよび／またはＳ）直鎖状の主鎖を有する、キメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
２． 式中、Ａ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａおよびｂの両方が１であり、ｄ、ｆおよびｈのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｘは酸素原子であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が３、４、５または６である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
３． 式中、Ａ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂ、ｄ、ｆおよびｈのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はヒドロキシル基であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
４． 式中、Ａ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、ｄ＋ｆの和が１であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が２、３、４または５である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
５． 式中、Ａ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、ｄ＋ｆの和が２であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が０、１、２または３である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
６． 式中、Ａ１は、式Ｉの疎水性末端により結合されたＴｙｒまたはＮ−α位で結合されたＨｉｓであり、その中でａが１であり、ｂ、ｈ、ｄおよびｆのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロＧＲＦ類似体。
７． 活性成分として請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を、薬学的に許容可能な担体、賦形剤あるいは希釈剤と組み合わせて含む、成長ホルモンの放出を誘導する薬学的処方剤。
８． 患者に対して効果的な量の請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者において成長ホルモンの濃度を増加する方法。
９． 患者に対して請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与し、そして成長ホルモンの反応を測定することを含む、前記患者において成長ホルモン欠損症を診断する方法。
１０． 患者に対して効果的な量の請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者において下垂体萎縮症あるいは成長遅滞を治療する方法。
１１． 患者に対して効果的な量の請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者において傷害あるいは骨の癒合について治療する方法。
１２． 患者に対して効果的な量の請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記患者において骨粗鬆症を治療する方法。
１３． ヒトあるいは動物に対して効果的な量の請求項１、２、３、４あるいは５に記載のＧＲＦ類似体を投与することを含む、前記ヒトあるいは動物においてタンパク質の同化作用活性を増進する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表平１１−５０５８０７
【公表日】平成１１年（１９９９）５月２５日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平８−５３５２２５
【出願日】平成８年（１９９６）５月２２日
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ９６／００３２７
【国際公開番号】ＷＯ９６／３７５１４
【国際公開日】平成８年（１９９６）１１月２８日
【出願人】
【氏名又は名称】セラテクノロジーズ・インコーポレーテッド
【公表日】平成１１年（１９９９）５月２５日
【国際特許分類】
【出願日】平成８年（１９９６）５月２２日
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ９６／００３２７
【国際公開番号】ＷＯ９６／３７５１４
【国際公開日】平成８年（１９９６）１１月２８日
【出願人】
【氏名又は名称】セラテクノロジーズ・インコーポレーテッド
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