界面活性剤およびプロテアーゼを使用して核酸を単離するための組成物、方法およびキット
【課題】本発明は、組織全体を含む生物学的サンプルから核酸を単離するための組成物および方法を提供することを課題とする。本発明はまた、生物学的サンプルから核酸を単離するためのキットを提供することを課題とする。
【解決手段】生物学的サンプルから核酸を得て、そして該核酸を固相に結合させるための方法であって、以下：該生物学的サンプルに破壊緩衝液を接触させる工程であって、該破壊緩衝液は、プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤を含む、工程；該カチオン性界面活性剤を実質的に中和する工程；ならびに該核酸を固相に結合させる工程、を包含する方法を提供することによって、上記課題が解決された。
【解決手段】生物学的サンプルから核酸を得て、そして該核酸を固相に結合させるための方法であって、以下：該生物学的サンプルに破壊緩衝液を接触させる工程であって、該破壊緩衝液は、プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤を含む、工程；該カチオン性界面活性剤を実質的に中和する工程；ならびに該核酸を固相に結合させる工程、を包含する方法を提供することによって、上記課題が解決された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全組織を含む生物学的サンプルからの、核酸の遊離および単離のための組成物および方法に関連する。本発明はまた、生物学的サンプルからの核酸の単離および／または遊離のためのキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的サンプルから核酸を単離するための現行の方法としては、組織の浸軟、細胞の溶解、ならびにカオトロピズム塩（グアニジン塩酸塩、またはチオシアン酸グアニジニウムなど）、および非イオン性界面活性剤を用いるヌクレアーゼの不活性化が挙げられ得る。次いで、遊離された核酸は、溶液から選択的に沈殿され得る。
【０００３】
様々な化学分解方法（界面活性剤、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）、プロテアーゼ、胆汁酸塩、有機溶媒、および過酷な酸性条件または過酷な塩基性条件を用いる）が、組織を浸軟し、核酸を遊離させるために使用されている。そのような方法を使用して得られる核酸は、長いインキュベーション時間または過酷な条件への曝露が原因で、分解され得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の概要）
特定の実施形態において、生物学的サンプルからの核酸の遊離のための組成物が、提供される。特定の実施形態において、この組成物は、少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、少なくとも１つのプロテアーゼ、および緩衝液を含む。
【０００５】
特定の実施形態において、生物学的サンプルから核酸を遊離する方法が、提供される。特定の実施形態において、生体から核酸を単離する方法が、提供される。特定の実施形態において、これらの方法は、反応組成物を形成するために、少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、少なくとも１つのプロテアーゼ、および緩衝液とサンプルとを混合する工程を含む。特定の実施形態において、この反応組成物は、第２の界面活性剤をさらに含む。特定の実施形態において、この反応組成物は、塩をさらに含む。特定の実施形態において、この反応組成物は、生物学的サンプルから核酸を遊離するのに、適した条件下でインキュベートされる。特定の実施形態において、遊離された核酸は、次いで、単離される。
【０００６】
特定の実施形態において、生物学的サンプルから核酸を単離および／または遊離するためのキットがまた、提供される。特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのカチオン性界面活性剤および少なくとも１つのプロテアーゼを含むキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、第２の界面活性剤、塩、有機抽出剤、有機沈殿剤、可溶化剤、核酸結合固相、またはこれらの成分の組合せをさらに含む。
【０００７】
特定の実施形態に従って、生物学的サンプルから核酸を得る方法、および固相に核酸を結合する方法が、提供される。特定の実施形態において、この方法は、生物学的サンプルと、（プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤を含む）破壊緩衝液とを接触させる工程、および核酸を固相へ結合させる工程を含む。特定の実施形態において、この方法は、生物学的サンプルと、（プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤を含む）破壊緩衝液とを接触させる工程、およびカチオン性界面活性剤を実質的に中和する工程、および核酸を固相に結合する工程を含む。
【０００８】
特定の実施形態に従って、プロテアーゼ、カチオン性界面活性剤および第２の界面活性剤を含むキットが、提供される。第２の界面活性剤は、プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤の存在下で、核酸の固相への結合を可能にする。
【０００９】
特定の実施形態に従って、生物学的サンプルから核酸を得るためのキットが提供され、このキットは、プロテアーゼ、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤を含む。ここで、非イオン性界面活性剤は、プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤、および高塩緩衝液の存在下で、核酸の固相への結合を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（実施形態の詳細な説明）
本発明においては、以下が提供される。
（項目１） 生物学的サンプルから核酸を得て、そして該核酸を固相に結合させるための方法であって、以下：
該生物学的サンプルに破壊緩衝液を接触させる工程であって、該破壊緩衝液は、以下：
プロテアーゼ；および
カチオン性界面活性剤、
を含む、工程；
該カチオン性界面活性剤を実質的に中和する工程；ならびに
該核酸を固相に結合させる工程、
を包含する、方法。
（項目２） 項目１に記載の方法であって、前記緩衝剤のｐＨがｐＨ８よりも上昇される場合に、前記カチオン性界面活性剤が沈殿しない、方法。
（項目３） 項目１に記載の方法であって、前記カチオン性界面活性剤を実質的に中和する工程が、該カチオン性界面活性剤を除去することを包含する、方法。
（項目４） 項目１に記載の方法であって、前記カチオン性界面活性剤を実質的に中和する工程が、該カチオン性界面活性剤を実質的に中和する第２の界面活性剤を添加することを包含する、方法。
（項目５） 項目４に記載の方法であって、前記界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣｌ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣｌ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＡＣｌ）、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＥＤＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｄ１０ＴＡＢ）、およびドデシルトリフェニルホスホニウムブロミド（ＤＴＰＢ）からなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目６） 塩を添加する工程をさらに包含する、項目４に記載の方法。
（項目７） 項目６に記載の方法であって、前記塩が、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌおよびＧｕＳＣＮからなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目８） 項目６に記載の方法であって、前記塩が、ＣａＣｌ２であり、そして少なくとも２０ｍＭの濃度で存在する、方法。
（項目９） 前記第２の界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、項目４に記載の方法。
（項目１０） 項目９に記載の方法であって、前記非イオン性界面活性剤が、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）からなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目１１） 前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）である、項目９に記載の方法。
（項目１２） 前記Ｔｗｅｅｎ ２０が、少なくとも４％ ｗ／ｗの濃度で存在する、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 前記Ｔｗｅｅｎ ２０が、２０％ ｗ／ｗの濃度で存在する、項目１２に記載の方法。
（項目１４） 前記プロテアーゼが、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリセリンプロテアーゼからなる群の少なくとも１つから選択される、項目１に記載の方法。
（項目１５） 項目１４に記載の方法であって、前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、ディスパーゼ、サブチリシンＣａｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼＡ、およびサーモリシンからなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目１６） 前記プロテアーゼが、熱安定性プロテアーゼである、項目１に記載の方法。
（項目１７） 項目１６に記載の方法であって、前記熱安定性プロテアーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏからなる群の少なくとも１つから選択される生物から単離される、方法。
（項目１８） 前記破壊緩衝液が、リボヌクレアーゼインヒビターをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目１９） 項目１８に記載の方法であって、前記リボヌクレアーゼインヒビターが、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸）、硫酸亜鉛、ブロモピルベート、ホルムアミド、銅、および亜鉛からなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目２０） 前記リボヌクレアーゼインヒビターが、アウリントリカルボン酸である、項目１８に記載の方法。
（項目２１） 前記アウリントリカルボン酸が、１０μＭの濃度で存在する、項目２０に記載の方法。
（項目２２） デオキシリボヌクレアーゼインヒビターを添加する工程をさらに包含する、項目４に記載の方法。
（項目２３） 前記デオキシリボヌクレアーゼインヒビターが、二価カチオンキレート剤を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４） 前記二価カチオンキレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＰＴＡからなる群の少なくとも１つから選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５） 生物学的サンプルから核酸を得て、そして該核酸を固相に結合させるための方法であって、以下：
該生物学的サンプルに破壊緩衝液を接触させる工程であって、該破壊緩衝液は、以下：
プロテアーゼ；および
カチオン性界面活性剤、
を含む、工程；ならびに
該核酸を固相に結合させる工程、
を包含する、方法。
（項目２６） 項目２５に記載の方法であって、前記カチオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣｌ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣｌ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＡＣｌ）、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＥＤＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｄ１０ＴＡＢ）、およびドデシルトリフェニルホスホニウムブロミド（ＤＴＰＢ）からなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目２７） 塩を添加する工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２８） 項目２７に記載の方法であって、前記塩が、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌおよびＧｕＳＣＮからなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目２９） 項目２７に記載の方法であって、前記塩が、ＣａＣｌ２であり、そして少なくとも２０ｍＭの濃度で存在する、方法。
（項目３０） 前記プロテアーゼが、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリセリンプロテアーゼからなる群の少なくとも１つから選択される、項目２５に記載の方法。
（項目３１） 項目３０に記載の方法であって、前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、ディスパーゼ、サブチリシンＣａｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼＡ、およびサーモリシンからなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目３２） 前記プロテアーゼが、熱安定性プロテアーゼである、項目２５に記載の方法。
（項目３３） 項目３２に記載の方法であって、前記熱安定性プロテアーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏからなる群の少なくとも１つから選択される生物から単離される、方法。
（項目３４） 前記破壊緩衝液が、リボヌクレアーゼインヒビターをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目３５） 項目３４に記載の方法であって、前記リボヌクレアーゼインヒビターが、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸）、硫酸亜鉛、ブロモピルベート、ホルムアミド、銅、および亜鉛からなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目３６） 前記リボヌクレアーゼインヒビターが、アウリントリカルボン酸である、項目３４に記載の方法。
（項目３７） 前記アウリントリカルボン酸が、１０μＭの濃度で存在する、項目３６に記載の方法。
（項目３８） デオキシリボヌクレアーゼインヒビターを添加する工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目３９） 前記デオキシリボヌクレアーゼインヒビターが、二価カチオンキレート剤を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 前記二価カチオンキレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＰＴＡからなる群の少なくとも１つから選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４１） キットであって、以下：
プロテアーゼ；
カチオン性界面活性剤；および
第２の界面活性剤
を備え、該第２の界面活性剤が、該カチオン性界面活性剤を実質的に中和する、キット。
（項目４２） 項目４１に記載のキットであって、前記緩衝剤のｐＨがｐＨ８よりも上昇される場合に、前記カチオン性界面活性剤が沈殿しない、キット。
（項目４３） 項目４１に記載のキットであって、前記カチオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣｌ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣｌ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＡＣｌ）、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＥＤＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｄ１０ＴＡＢ）、およびドデシルトリフェニルホスホニウムブロミド（ＤＴＰＢ）からなる群の少なくとも１つから選択される、キット。
（項目４４） 前記プロテアーゼが、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリセリンプロテアーゼからなる群の少なくとも１つから選択される、項目４１に記載のキット。
（項目４５） 項目４４に記載のキットであって、前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、ディスパーゼ、サブチリシンＣａｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼＡ、およびサーモリシンからなる群の少なくとも１つから選択される、キット。
（項目４６） 前記プロテアーゼが、熱安定性プロテアーゼである、項目４１に記載のキット。
（項目４７） 項目４６に記載のキットであって、前記熱安定性プロテアーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏからなる群の少なくとも１つから選択される生物から単離される、キット。
（項目４８） リボヌクレアーゼインヒビターをさらに備える、項目４１に記載のキット。
（項目４９） 項目４８に記載のキットであって、前記リボヌクレアーゼインヒビターが、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸）、硫酸亜鉛、ブロモピルベート、ホルムアミド、銅、および亜鉛からなる群の少なくとも１つから選択される、キット。
（項目５０） 前記リボヌクレアーゼインヒビターが、アウリントリカルボン酸である、項目４８に記載のキット。
（項目５１） 前記アウリントリカルボン酸が、１０μＭの濃度で存在する、項目５０に記載のキット。
（項目５２） デオキシリボヌクレアーゼインヒビターをさらに備える、項目４１に記載のキット。
（項目５３） 前記デオキシリボヌクレアーゼインヒビターが、二価カチオンキレート剤を備える、項目５２に記載のキット。
（項目５４） 前記二価カチオンキレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＰＴＡからなる群の少なくとも１つから選択される、項目５３に記載のキット。
（項目５５） 塩をさらに備える、項目４１に記載のキット。
（項目５６） 項目５５に記載のキットであって、前記塩が、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌおよびＧｕＳＣＮからなる群から選択される、キット。
（項目５７） 前記塩が、ＣａＣｌ２である、項目５５に記載のキット。
（項目５８） 前記ＣａＣｌ２が、少なくとも２０ｍＭの濃度で存在する、項目５７に記載のキット。
（項目５９） 前記第２の界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、項目４１に記載のキット。
（項目６０） 項目５９に記載のキットであって、前記非イオン性界面活性剤が、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）からなる群から選択される、キット。
（項目６１） 前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）である、項目５９に記載のキット。
（項目６２） 前記Ｔｗｅｅｎ ２０が、少なくとも４％ ｗ／ｗの濃度で存在する、項目６１に記載のキット。
（項目６３） 前記Ｔｗｅｅｎ ２０が、２０％ ｗ／ｗの濃度で存在する、項目６１に記載のキット。
（項目６４） 生物学的サンプルから核酸を得るためのキットであって、以下：
プロテアーゼ；
カチオン性界面活性剤；
非イオン性界面活性剤であって、該非イオン性界面活性剤は、該プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤の存在下で、固相への核酸の結合を可能にする、非イオン性界面活性剤；および
高塩濃度を有する緩衝液
を備える、キット。
【００１１】
上記の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方が、例示および説明のみのためであり、そして特許請求される本発明の限定ではないことが、理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は、他に特に示されない限り、複数形を含む。本出願において、「または」の使用は、他に特に示されない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の形態（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」）の使用は、限定ではない。
【００１２】
本明細書中に使用される節の見出しは、編成目的のみのためであり、記載される本件事項を制限するものとして解釈されるべきではない。本出願に引用される全文書（特許、特許出願、論文、書籍、および学術論文が挙げられるが、これらに限定されない）は、その全体がいずれかの目的のために参考として明確に引用される。
【００１３】
（定義）
用語「アルキル基」は、直鎖アルカン、分枝アルカン、または環状アルカンに基づく炭化水素部分をいう。直鎖アルカンは、一般化学式ＣｎＨ２ｎ＋２（ここでＣは、炭素原子を表し、Ｈは水素原子を表し、そしてｎは自然数を表す）を有する有機化合物である。例示的な直鎖アルカンとしては、メタン（ＣＨ４）、エタン（Ｃ２Ｈ６）、プロパン（Ｃ３Ｈ８）、ブタン（Ｃ４Ｈ１０）、オクタンなどが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な分枝アルカンとしては、イソブタン（Ｃ４Ｈ１０）、イソペンタン（Ｃ５Ｈ１２）などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な環状アルカンとしては、シクロブタン（Ｃ４Ｈ８）、シクロヘキサン（Ｃ６Ｈ１２）などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアルキル基としては、メチル（−ＣＨ３）、プロピル（−Ｃ３Ｈ７）、オクチル（−Ｃ８Ｈ１７）などが挙げられるが、これらに限定されない。アルカンは、代表的に不活性であるが、アルキル基はほかの分子と組み合わされて化合物を形成し得る。例えば、イソプロピルアルコール（Ｃ３Ｈ７ＯＨ）は、プロピル基を含むアルコールである。アルキル基およびアルカンの一般的な考察は、とりわけ、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版、Ａｌｌｙｎ ａｎｄ Ｂａｃｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，１９７３；ならびにＶｏｌｌｈａｒｄｔ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８７に見出され得る。
【００１４】
用語「アリール基」は、ベンゼンまたは他の芳香族化合物に基づく炭化水素部分をいう。アリール基は、アルキル基のように、他の分子を組み合わされて、化合物を形成し得る。芳香族化合物およびアリール基の一般的な考察は、とりわけ、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版、Ａｌｌｙｎ ａｎｄ Ｂａｃｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，１９７３；ならびにＶｏｌｌｈａｒｄｔ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８７，特に、第１９章に見出され得る。
【００１５】
用語「生物学的サンプル」は、広義に使用され、核酸を含む種々の生物学的供給源を含むことが意図される。このような供給源としては、組織全体（生検材料および吸引物を含む）；インビトロ培養細胞（初代細胞および二次細胞、形質転換細胞株、ならびに組織および細胞外植片を含む）；全血、赤血球、白血球、およびリンパ；ならびに体液（例えば、尿、唾液、精液、分泌物、洗眼水および吸引物、肺洗浄水および吸引物）が挙げられるが、これらに限定されない。真菌および植物組織（例えば、葉、根、幹、およびキャップ）もまた、本発明の範囲内である。生物学的サンプル上または生物学的サンプル中に存在し得る微生物およびウイルスは、本発明の範囲内である。細菌細胞もまた、本発明の範囲内である。
【００１６】
用語「緩衝液」は、本明細書中に使用される場合、酸または塩基がその溶液に添加された場合に、ｐＨの変化に抵抗する水溶液または組成物をいう。ｐＨ変化に対するこの抵抗性は、その溶液の緩衝作用に起因する。緩衝活性を示す溶液は、緩衝液または緩衝溶液と呼ばれる。緩衝液は、代表的に、溶液または組成物のｐＨを維持する無制限の能力は有さない。むしろ、緩衝液は、代表的に、特定の範囲内のｐＨ（例えば、ｐＨ５とｐＨ７との間）を維持し得る。一般的に、Ｃ．Ｍｏｈａｎ，Ｂｕｆｆｅｒｓ，Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，１９９９を参照のこと。例示的な緩衝液としては、ＭＥＳ（［２−（Ｎ−モルホリノ（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｉｌｉｎｏ））エタンスルホン酸］）、ＡＤＡ（Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノジ酢酸）、Ｔｒｉｓ（［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］；Ｔｒｉｚｍａとしても公知）；Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ；ＡＣＥＳ；ＰＩＰＥＳ；ＭＯＰＳなど（全てＳｉｇｍａから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
特定のｐＨ範囲内（例えば、ｐＨ５とｐＨ７との間）でｐＨを維持する緩衝液、および本明細書中に使用されるような類似の用語は、示されたｐＨ範囲内のいくつかの点で緩衝作用を示す、任意の緩衝液を含むことが意図される。従って、この用語は、示された範囲全体内で緩衝能力を示さない緩衝液、および示された範囲を超えて緩衝能力を有する緩衝液を含む。例えば、溶液Ａは、ｐＨ５．２とｐＨ６．７との間で緩衝能力を示し得、溶液Ｂは、ｐＨ６．０とｐＨ８．０との間で緩衝能力を示し得る。本発明のために、これらの溶液は両方とも、ｐＨ５．０〜ｐＨ７．０の範囲内でｐＨを維持する緩衝液とみなされる。当業者は、緩衝液の表を用いて、特定された範囲間でｐＨを維持するための適切な緩衝液を同定し得る。緩衝液の表は、特に、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ２０００−２００１ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃａｔａｌｏｇ ８１〜８２頁、およびＳｉｇｍａ ２０００−２００１ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ １８７３頁（これらは共に、参考として明確に援用される）に見出され得る。
【００１８】
用語「カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）」または「カオトロープ塩」は、本明細書中に使用される場合、例えば、タンパク質または核酸の一次構造をインタクトにしたままで、タンパク質または核酸の二次構造、三次構造、または四次構造を変更することによって（これに限定されない）、タンパク質または核酸中に異常をもたらす物質をいう。例示的なカオトロープとしては、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウムおよび尿素が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なアニオン性カオトロープシリーズとしては、カオトロープ強度が低下する順に示すと：ＣＣｌ３ＣＯＯ−＞＞ＣＮＳ−＞ＣＦ３ＣＯＯ−＞ＣｌＯ４−＞−Ｉ＞ＣＨ３ＣＯＯ−＞Ｂｒ−、Ｃｌ、またはＣＨＯ２−が挙げられる。カオトロープおよびカオトロープ塩の説明は、特に、Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，ＫｏｚｏおよびＧｅｉｄｕｓｃｈｅｋ；Ｅ．Ｐｅｔｅｒ；Ｈａｔｅｆｉ，ＹおよびＨａｎｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ｇ．（１９６２）、「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｎｄ Ｎｏｎｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ
ｂｙ Ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６２：１１２９−１１３６）；Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｔｅ Ｈｅｌｉｘ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８４：１３２９−１３３８）；ならびに米国特許第５，２３４，８０９号に見出され得る。
【００１９】
「キレート剤」は、金属カチオン（例えば、ナトリウム（Ｎａ＋）イオン、マグネシウム（Ｍｇ＋＋）イオン、またはカルシウム（Ｃａ＋＋）イオン）に結合し得る、化合物である。キレート剤の少なくとも２つの非金属イオンが、金属カチオンをその環の中に組み込んで、金属カチオンと配位結合を形成する。従って、金属カチオンは、いくつかの反応に関与するためには、もはや遊離ではない。例えば、キレートされた金属は、タンパク質を結合および活性化するために利用可能ではないかもしれない。１つの電荷を有するカチオン（例えば、Ｎａ＋）は、一価カチオンと呼ばれ、一方、２つの電荷を有するカチオン（例えば、Ｍｇ＋＋またはＣａ＋＋）は、二価カチオンと呼ばれる。いくつかの酵素（例えば、特定のポリメラーゼおよびヌクレアーゼ）は、代表的に、遊離の二価カチオンの存在下で機能する。従って、二価カチオンキレート剤は、十分な量で提供される場合、このような二価カチオン依存性酵素の活性を阻害または低下させ得る。例示的なキレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ジアミノエタンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
「ヌクレアーゼ」（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）またはリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）は、核酸ポリマー中のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する、酵素である。ヌクレアーゼは、核酸ポリマーの分解を引き起こし、構成要素であるヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド（そのポリマーのフラグメント）を放出させる。ＤＮアーゼは、ＤＮＡ分子を分解し、ＲＮアーゼは、ＲＮＡ分子を分解する。ヌクレアーゼ活性は、代表的には、適切なヌクレアーゼインヒビターによって遅延または妨害され得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを分解する化学物質であり得る。このようなヌクレアーゼの例としては、フェナントロリン−銅複合体；ならびに鉄と、過酸化水素と、エチレンジアミンテトラ酢酸との組合せが、挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「有機溶媒」とは、有機液体（すなわち、炭化水素骨格を有する分子を含む液体）を指す。有機溶媒は、例えば、非溶媒分子がその溶媒中に溶解されるようにその溶媒分子でその非溶媒分子を囲むことによって、非溶媒分子を溶媒和させることができる。例示的有機溶媒としては、ベンゼン、四塩化炭素、クロロホルム、フェノール、および他のアルコール（例えば、エタノール、メタノール、およびイソプロパノール（２−プロパノール））、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられるが、これらに限定されない。有機溶媒は、例えば、特定の生化学的組成物から核酸を抽出するために、または水溶液から核酸を沈殿させるために、使用され得る。有機溶媒の考察は、とりわけ、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、ＡｌｌｙｎおよびＢａｃｏｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、１９７３に見出され得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「プロテアーゼ」とは、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチド（まとめて「ペプチド」）中のペプチド結合の切断を触媒する、酵素を指す。例示的プロテアーゼとしては、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリセリンプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。サブチラーゼは、セリンプロテアーゼ（すなわち、切断のためにその活性部位中のセリンを使用する酵素）のファミリーである。サブチラーゼは、原核生物および真核生物（例えば、細菌、真菌、酵母および他の門）において見出される。サブチリシンは、広範な基質特異性を有する細菌性セリンプロテアーゼである。サブチリシンは、カオトロープ（例えば、尿素および塩酸グアニジン）およびアニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））による変性に対して、比較的耐性である。例示的サブチリシンとしては、プロテイナーゼＫ；プロテイナーゼＲ；プロテイナーゼＴ（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ Ｌｉｍｂｅｒから単離される）；サブチリシンＤＹ，カールスバーグ（サブチリシン、サブチリシンＡ、サブチロペプチダーゼＡ、またはアルカラーゼＮｏｖｏとも呼ばれる）；ＢＰＮ’（ナガーゼプロテイナーゼ、ナガーゼ、またはサブチロペプチダーゼＣとも呼ばれる）；Ｎｏｖｏ（細菌性プロテイナーゼＮｏｖｏ、サブチリシンＢ、またはサブチロペプチダーゼＢとも呼ばれる）；腸膜間ペプチダーゼ；およびサーミターゼ（ｔｈｅｒｍｉｔａｓｅ）が、挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
サブチラーゼ、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、および他のプロテアーゼの考察は、とりわけ、Ｇｅｎｏｖら（１９９５）Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｏｆ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｓ Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ（Ｓｕｂｔｉｌａｓｅｓ），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４５：３９１〜４００）；ＮａｒｈｉおよびＡｒａｋａｗａ（１９８９）Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ａｓ Ａ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｏｆ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．第９９０巻：１４４〜１４９）；ＤｉｘｏｎおよびＷｅｂｂ，Ｅｎｚｙｍｅｓ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７９）；ならびにＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）に見出され得る。
【００２４】
用語「塩」とは、本明細書中で使用される場合、酸と塩基との相互作用により生成される化合物をさす。例示的塩基としては、塩化ナトリウム、リン酸カリウム、および炭酸水素ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。水および他の水溶液において、塩は、代表的には、「アニオン」（すなわち、負に荷電した小成分）と「カチオン」（すなわち、正に荷電した小成分）とに解離する。例えば、塩化ナトリウムが水中で解離する場合、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、ナトリウムカチオン（Ｎａ＋）と塩化物アニオン（Ｃｌ−）とに解離する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「界面活性剤」とは、一般的には、疎水性部分と親水性部分とを含む、表面活性剤を指す。界面活性剤の例としては、洗剤および胆汁酸塩が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｂｈａｉｒｉ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．１９９７を参照のこと）。界面活性剤は、１つ以上の荷電基を含むか否かに依存して、アニオン性、非イオン性、双性イオン性、またはカチオン性に分類され得る。アニオン性界面活性剤（例えば、ＳＤＳまたはラウリルサルコシン）は、負に荷電した基を含み、そして正味負の電荷を有する。非イオン性界面活性剤は、非荷電性極性基を含み、電荷を有さない。例示的非イオン性界面活性剤としては、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）が、挙げられるが、これらに限定されない。双性イオン性界面活性剤は、正に荷電した基と負に荷電した基との両方を含み、そして正味の電荷を有さない。
【００２６】
「カチオン性界面活性剤」は、試験した条件下で正に荷電した基を有する。カチオン性界面活性剤は、四級アミンまたは三級アミンを含み得る。例示的四級アミン界面活性剤としては、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃Ｂ２２６３３またはＡｌｄｒｉｃｈ＃８５５８２−０）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ＃２９２７３−７）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ、Ｓｉｇｍａ＃Ｄ−８６３８）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＣｌ）、臭化オクチルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＣｌ）、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム（ＤＥＤＴＡＢ）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（Ｄ１０ＴＡＢ）、臭化ドデシルトリフェニルホスホニウム（ＤＴＰＢ）、臭化オクタデシリルトリメチルアンモニウム、塩化ステアロアルコニウム、塩化オレアルコニウム、塩化セトリモニウム、アルキルトリメチルアンモニウムメソサルフェート、パルミトアミドプロピルトリメチルクロリド、クオーターニウム８４（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥ；ＭｃＩｎｔｙｒｅ
Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）およびコムギ脂質エポキシド（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ
ＷＬＥ；ＭｃＩｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的三級アミン界面活性剤としては、オクチルジメチルアミン、デシルジメチルアミン、ドデシルジメチルアミン、テトラデシルジメチルアミン、ヘキサデシルジメチルアミン、オクチルデシルジメチルアミン、オクチルデシルメチルアミン、ジデシルメチルアミン、ドデシルメチルアミン、塩化トリアセチルアンモニウム、塩化セトリモニウム、および塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性界面活性剤のさらなる種類としては、ホスホニウム、イミダゾリン、およびエチル化アミン基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
アルキルアミンオキシドは、より低いｐＨでは代表的にはカチオン性であるが中性ｐＨでは非イオン性である、種類の界面活性剤を示す。一般的構造は、以下の通りである：
【００２８】
【化１】
【００２９】
ここで、ｎは１と３０との間の数値を示す。例としては、ヘキサデシルアミンオキシド、テトラデシルアミンオキシ、ドデシルアミンオキシド、デシルアミンオキシドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明に従う用語「全組織」は、単一の生物由来の任意の細胞収集物を含むように、広範な意味で使用される。組織の例としては、筋肉（心筋、横紋筋、および平滑筋を含む）；器官（例えば、腎臓、肝臓、脾臓、および心臓）；神経；皮膚層および表皮層（例えば、皮膚）；血液；結合組織（例えば、骨、軟骨、靭帯、および腱）などが挙げられるが、これらに限定されない。全組織のフラグメント、片、セクション、スライス、および小成分は、本発明の範囲内にある。用語、全組織は、例えば、器官または骨全体には限定されない。任意のレベルの任意の細胞凝集物または細胞集合が、本発明の目的のためには、全組織であると見なされる。真菌組織および植物組織（例えば、葉、根、幹、およびキャップ）もまた、本発明の範囲内にある。
【００３１】
用語「核酸」とは、本明細書中で使用される場合、サブユニット間にホスホジエステル結合を含む、リボヌクレオシドポリマーまたはデオキシリボヌクレオシドポリマーを指す。このような核酸としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、断片核酸、亜細胞小器官（例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体）から得られた核酸、ならびに生物学的サンプル上またはサンプル中に存在し得る微生物またはＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスから得られた核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
生物学的サンプルから放出される核酸に結合することができる固相成分（固相または固相支持体とも呼ばれる）としては、適切な条件下で核酸に結合することができる種々の材料が挙げられる。例示的固相成分としては、シリカ粒子、二酸化ケイ素、ケイ藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、ホウケイ酸塩、ニトロセルロース、ジアゾ化紙、ヒドロキシアパタイト、ナイロン、金属酸化物、ジルコニア、アルミナ、ジエチルアミノエチル誘導体化支持体およびトリエチルアミノエチル誘導体化支持体（Ｃｈｒｏｍｅｇａｂｏｎｄ ＳＡＸ，ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ−ＡＮ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ＳＢ、Ｐａｒｔｉｓｉｌ ＳＡＸ、ＲＳＬ、Ａｎｉｏｎ、Ｖｙｄａｃ ＴＰ Ａｎｉｏｎ、Ｚｏｒｂａｘ ＳＡＸ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ＮＭｅ２、Ａｍｉｎｅｘ Ａシリーズ、Ｃｈｒｏｍｅｘ、およびＨａｍｉｌｔｏｎ ＨＡ ｌｏｎｅｘ ＳＢ、ＤＥＡＥセファロース、ＱＡＥセファロース）、ならびに疎水性クロマトグラフィー樹脂（例えば、フェニルセファロースまたはオクチルセファロース）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
特定のポリマーは、適切な条件下で、溶液から核酸を沈殿させることができる。いくつかのポリマーは、低溶解度を有するかまたは不溶性である、核酸−ポリマー複合体を形成することができ、その結果、複合体化した核酸は沈殿し得る。核酸とこのような複合体を形成するポリマーの例としては、ポリエチレンイミン、ＤＥＡＥデキストラン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、他の弱塩基性ポリマー（とりわけ、米国特許第５，５８２，９８８号；同第５，７３３，７６２号；同第５，６２２，８２２号；および同第５，５９９，６６７号に記載される）などが挙げられるが、これらに限定されない。他のポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）は、溶液中で有意な量の水と結合し、これもまた、その溶液からの核酸の沈殿を引き起こし得る。
【００３４】
特定の実施形態に従って、生物学的サンプルから核酸を放出させる方法およびその核酸を固相に結合する方法は、カチオン性界面活性剤を「実質的に中和する」工程を包含する。用語：カチオン性界面活性剤を「実質的に中和する」とは、本出願の目的のために、サンプル中の多数の核酸が、中和するのではなく、このような実質的な中和により固相に結合し得ることを意味する。特定の実施形態に従って、このカチオン性界面活性剤の実質的な中和は、カチオン性界面活性剤の１以上の効果を低減させること、阻害すること、または防止することによって達成され得る。特定の実施形態において、これらの効果としては、以下のうちの１以上が挙げられ得る：カチオン性界面活性剤によって核酸が沈殿すること、カチオン性界面活性剤が核酸に結合すること、核酸が固相に結合するのをブロックすること、および固相と相互作用した結果、核酸との結合を妨害すること。これらの効果の全てが、本発明の実施形態の全てにおいて、必ずしも存在するわけではない。特定の実施形態に従って、カチオン性界面活性剤を実質的に中和することは、破壊緩衝液中の条件によって達成され、そしてこの生物学的なサンプルをこの破壊緩衝液と接触させる工程からの分離工程を必ずしも含むわけではない。
【００３５】
特定の実施形態において、カチオン性界面活性剤を「実質的に中和する」工程は、このカチオン性界面活性剤を実質的に中和する試薬を添加する工程、カチオン性界面活性剤を沈殿させる工程、相抽出によってカチオン性界面活性剤を除去する工程、透析によってカチオン性界面活性剤を除去する工程、カチオン性界面活性剤を固相に結合させる工程、および他の方法によってカチオン性界面活性剤を除去する工程のうちの少なくとも１つを包含し得るが、これらに限定されるわけではない。特定の実施形態において、カチオン性界面活性剤を実質的に中和する試薬としては、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、および双性イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「破壊緩衝液」は、細胞を組織から放出させるプロセス、細胞を破壊して開くプロセス、または細胞を組織から放出させかつ、細胞を破壊して開くプロセスにおいて使用される、緩衝液をいう。
【００３７】
（例示的な実施形態）
特定の実施形態において、本発明は、核酸を生物学的なサンプル（好ましくは、全組織）から単離するための、組成物、方法、およびキットに関する。特定の実施形態において、本発明の組成物、方法、およびキットは、サンプル調製に必要な時間を減少させ、繰り返されるサンプル操作を必要とする多段階手順によって課される潜在的な安全性の危険度を減少させ、そして／または高い完全性（すなわち、最小の分解性）の高分子量の核酸を提供する。特定の実施形態において、本発明の組成物、方法、およびキットは、組織を物理学的または機械学的に破壊するために、さらなる装置の必要性を除去する。
【００３８】
この組成物およびキットは、界面活性剤およびプロテアーゼを含み、そしてこの方法は、界面活性剤およびプロテアーゼを使用する。特定の実施形態において、この生物学的なサンプルは、少なくとも１種のカチオン性界面活性剤と少なくとも１種のプロテアーゼとを合わされて、反応組成物を形成する。特定の実施形態において、次いで、この反応組成物が、核酸が生物学的サンプルから放出されるような様式でインキュベートされる。例えば、特定の実施形態において、インキュベーションの間、これらの反応組成物は、代表的に：（ｉ）生物学的なサンプルを液浸軟化または脱凝集させ得；（ｉｉ）このサンプルを含む細胞を溶解し得；（ｉｉｉ）このサンプルを滅菌し得；（ｉｖ）ヌクレアーゼを中和または不活化させ得；そして（ｖ）核酸を生物学的サンプルから放出させ得る。
【００３９】
プロテイナーゼＫ単独は、代表的に、約１２〜１８時間インキュベートした場合に全組織を効果的に液浸軟化させるが、この放出した核酸は、頻繁に非常に分解される。この分解は、サンプル中に存在するヌクレアーゼに少なくとも一部において起因する。特定の実施形態において、この液浸軟化プロセスは、本明細書中に開示されるように、反応組成物にカチオン性界面活性剤を添加することによって、促進され得る。適切な条件下で、特定の実施形態において、高度な完全性の核酸は、本発明の組成物および方法を使用して、６０分以内で生物学的サンプルから効率的に得られ得る。従って、特定の実施形態において、本発明の組成物および方法は、予想外の利点を提供する。
【００４０】
いくつかのカチオン性界面活性剤は、適切な条件下で、放出された核酸と沈殿物との複合体を形成する。特定の実施形態において、これらのカチオン性界面活性剤：核酸複合体は、非イオン性界面活性剤および適切な塩を使用して溶解され得る。特定の実施形態において、これらのカチオン性界面活性剤：核酸複合体は、双性イオン性界面活性剤またはアニオン性界面活性剤、および適切な塩を使用して、溶解され得る。従って、特定の実施形態において、この組成物は、第２の界面活性剤および塩をさらに含む。
【００４１】
特定の実施形態において、この放出された核酸は、単離される。特定の実施形態において、核酸は、有機溶媒を使用して、生体分子（例えば、脂質、タンパク質など）を含む水溶液から効率的に単離され得る。例えば、特定の実施形態において、有機溶媒（例えば、フェノールまたはフェノールとクロロホルムとの組み合わせ）を使用して、このような溶液から核酸を抽出し得る。特定の実施形態において、抽出された核酸は、例えば、エタノール、プロパノール、またはブタノールのようなアルコールを使用して核酸を沈殿させることによって、単離され得る。特定の実施形態において、この放出された核酸は、この反応組成物から単離されない。
【００４２】
特定の実施形態において、核酸はまた、その核酸を沈殿させるために、特定のポリマーまたは二価カチオンを使用して、反応組成物から単離され得る。核酸を沈殿させるための例示的なポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ＤＥＡＥデキストラン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、および他の弱い塩基性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。このようなポリマーの記載は、数ある中でも、米国特許第５，５８２，９８８号；同第５，７３３，７６２号；同第５，６２２，８２２号；および同第５，５９９，６６７号に見出され得る。特定の実施形態において、特定の二価カチオンがまた、核酸を、溶液から選択的に沈殿させ得る。このような二価カチオンの例としては、塩化亜鉛、塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
さらに、特定の実施形態において、核酸は、選択的に核酸と結合する固相支持対を使用して単離され得る。例えば、これに限定されないが、サンプル由来の核酸は、高濃度のカオトロープまたは塩の存在下で固相に吸着され得る。特定の実施形態において、固相を洗浄して、汚染物質を除去し得、そしてこの核酸を、低イオン強度の溶液を使用して固相から溶出し得る。適切な固相としては、シリカ粒子、二酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ素酸アルミニウム、またはホウケイ酸塩。
【００４４】
また、特定の実施形態において、核酸は、低イオン強度の存在下で、イオン交換樹脂に結合され得る。特定の実施形態において、洗浄による汚染成分の除去後、核酸は、イオン強度を増加することによって、固相から溶出され得る。例示的なイオン交換樹脂としては、ジエチルアミノエチル誘導体化支持体およびトリエチルアミノエチル誘導体化支持体（Ｃｈｒｏｍｅｇａｂｏｎｄ ＳＡＸ、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ−ＡＮ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ＳＢ、Ｐａｒｔｉｓｉｌ ＳＡＸ、ＲＳＬ Ａｎｉｏｎ、Ｖｙｄａｃ ＴＰ Ａｎｉｏｎ、Ｚｏｒｂａｘ ＳＡＸ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ＮＭｅ２、Ａｍｉｎｅｘ Ａシリーズ、Ｃｈｒｏｍｅｘ、およびＨａｍｉｌｔｏｎ ＨＡ ｌｏｎｅｘ ＳＢ，ＤＥＡＥセファロース、またはＱＡＥセファロースなど）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、他の固相物質としてはまた、例えば、ニトロセルロース、ジアゾ化紙、ヒドロキシアパタイト、ナイロン、金属酸化物、ジルコニア、アルミナ、および逆相樹脂（例えば、オクチルセファロースまたはフェニルセファロース）を使用し得るが、これらに限定されないことを、当業者は理解する。
【００４５】
本発明の組成物は、少なくとも１種のプロテアーゼを含む。特定の実施形態において、サブチリシン、サブチラーゼおよびアルカリセリンプロテアーゼのようなプロテアーゼを、使用する。例示的なプロテアーゼとしては、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、ディスパーゼ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼ（ｓｕｂｔｉｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）Ａ、サーモリシン、熱安定性プロテアーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏ由来のもの）、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態に従って、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫである。
【００４６】
特定のプロテアーゼ（プロテイナーゼＫを含む）は、塩化カルシウムの存在によって安定化され得る。塩化カルシウムが、特定のアニオン性界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）と合わされる場合、比較的不溶性の沈殿物が、形成され得る。特定の実施形態において、科学者は、プロテアーゼおよびアニオン性界面活性剤の両方を使用する場合に塩化カルシウムを使用しないことによって、このような沈殿を避けようとし得る。実質的な量のアニオン性界面活性剤が使用されない、本発明の特定の実施形態において、塩化カルシウムが、含まれ得る。カルシウムイオンおよび他の二価カチオンは、代表的に、カチオン性界面活性剤と反応して、不溶性の複合体を形成しない。
【００４７】
特定の実施形態において、高い完全性のＤＮＡを得るために、ＤＮアーゼインヒビターが、本発明の組成物に添加され得る。例えば、多くの内因性ＤＮアーゼｓは、二価カチオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、ＥＧＴＡ（［エチレングリコール−ビス（β−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸］）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）など）よって阻害される。
【００４８】
特定の実施形態において、少なくとも１種のカチオン性界面活性剤は、４級アミン、３級アミン、またはその両方を含む。特定の実施形態において、その少なくとも１種のカチオン性界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロライド（ＣＴＡＣｌ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＤＴＡＢ）、またはヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（ＨＤＴＡＣｌ）を含み、そしてこの少なくとも１種のプロテアーゼは、プロテイナーゼＫを含む。
【００４９】
特定の実施形態において、この少なくとも１種のカチオン性界面活性剤は、この界面活性剤をカチオン性にするｐＨのアルキルアミン酸化物（ａｌｋｙ ａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ）を含む。特定の実施形態において、この少なくとも１種のカチオン性界面活性剤は、酸化オクチルアミン、酸化デシルアミン、酸化ドデシルアミン、酸化テトラデシルアミン、および酸化ヘキサデシルアミンのうちの少なくとも１つを含む。
【００５０】
特定の実施形態において、この少なくとも１種のカチオン性界面活性剤は、アルキルイミダゾリン誘導体またはアルキルホスホニウム誘導体を含む。
【００５１】
特定の実施形態において、核酸を単離する工程としては、有機因子（例えば、フェノール、クロロホルム、フェノールとクロロホルムとの両方、またはβラクタム誘導体（これらに限定されない））を用いて、核酸を抽出する工程を包含する。特定の実施形態において、核酸は、有機因子（例えば、イソプロパノール、エタノール、またはブタノールのようなアルコール（これらに限定されない））で沈殿され得る。特定の実施形態において、核酸を単離する工程は、核酸を有機因子を用いて抽出する工程と、この抽出された核酸を有機因子を用いて沈殿させる工程との組み合わせを包含する。
【００５２】
特定の実施形態において、カチオン性界面活性剤、プロテアーゼおよび緩衝液を使用する工程を包含する、リボ核酸を生物学的サンプルから単離する方法を提供する。特定の実施形態において、カチオン性界面活性剤は、ＣＴＡＢ（ＳｉｇｍａまたはＡｌｄｒｉｃｈ）、ＣＴＡＣｌ（ＳｉｇｍａまたはＡｌｄｒｉｃｈ）、ＨＤＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ＃Ｈ−５８８２またはＦｌｕｋａ＃５２３６７）、またはＨＤＴＡＣｌ（Ｆｌｕｋａ＃４１１９９）である。高度な完全性のＲＮＡが所望される場合、内因性ＲＮアーゼの存在は、しばしば、いくつかの現在の手順の効率を制限する。しかし、特定の実施形態において、本組成物および本方法の２つの成分は、高度な完全性のＲＮＡの単離を増強する、内因性ＲＮアーゼの活性を相殺し得る。第１に、プロテイナーゼＫは、ＲＮアーゼと不朽化し得る。第２に、カチオン性界面活性剤は、ＲＮＡと複合体を形成して、ＲＮアーゼ分解に対するＲＮＡの感受性を減少させ得る。例えば、Ｄａｈｌ，Ｃ．Ｅ．およびＭａｃｆａｒｌａｎｅ，Ｄ．Ｅ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ ＲＮＡ Ｆｒｏｍ
Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｔｒｉｍｏｘ−１４ＴＭ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ」，ＢｉｏＴｅｃｎｉｑｕｅｓ 第１５巻、第６号：１１０２〜１１０５（１９９３）；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，Ｄ．Ｅ．およびＤａｈｌｅ，Ｃ．Ｅ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＲＮＡ Ｆｒｏｍ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｔｈｅ Ｄａｗｎ Ｏｆ ＲＮＡ−Ｂａｓｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ？」，Ｎａｔｕｒｅ，第３６２号：１８６−１８８（１９９３）；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，Ｄ．Ｅ．およびＤａｈｌｅ，Ｃ．Ｅ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ＲＮＡ Ｆｒｏｍ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｗｉｔｈ Ｃａｔｒｉｍｏｘ−１４ ａｎｄ Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，１１：１３２−１３９（１９９７）を参照のこと。
【００５３】
特定の実施形態によれば、内因性ＲＮＡｓｅ活性は、本発明の組成物および方法を使用して、さらに低減される。例えば、特定の実施形態において、ＲＮＡｓｅは、代表的に、より低いｐＨ（例えば、ｐＨ５とｐＨ７との間）および５０℃未満の温度において、活性が低い。特定の実施形態において、アクリジンオレンジもまた、恐らく、放出されたＲＮＡ分子と相互作用してこれらのＲＮＡを分解に対して感受性を低くすることによって、ＲＮＡｓｅの核酸分解性（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を低下させ得る。特定の実施形態において、ＲＮＡｓｅインヒビターがまた添加されて、ＲＮＡｓｅ活性を制限または防止し得る。例示的なＲＮＡｓｅインヒビターとしては、アウリントリカルボン酸、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェノールグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸（ａｄｅｎｙｈｌｉｃ ａｃｉｄ））、硫酸亜鉛、ブロモピルビン酸、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、銅、亜鉛などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物および方法は、少なくとも１つのＲＮＡｓｅインヒビターを含む。
【００５４】
特定の実施形態によれば、組成物中、および方法において使用される、カチオン性界面活性剤は、以下の一般化学式を有する：
【００５５】
【化２】
【００５６】
（Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４：Ｘ−）、ここで、カチオン部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、−Ｈ、２０個までの炭素原子を含むアルキル基、または６個と２６個との間の炭素原子を含むアリール基であり得；ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つは、少なくとも６個の炭素のアルキル基を含み；そしてここで、Ｘ−は、アニオンである。例えば、カチオン性界面活性剤は、アルキルトリメチルアンモニウム塩であり得、ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、メチル基であり、そしてＲ４は、６、８、１０、１２、１４、１６、または１８の炭素原子を含むアルキル基である。アルキルトリメチルアンモニウム塩のカチオン性副成分（Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４）は、（限定せずに）セチルトリメチルアンモニウム基、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム基、テトラデシルトリメチルアンモニウム基、ドデシルトリメチルアンモニウム基、ラウリルトリメチルアンモニウム基などであり得る。この例示的なアルキルトリメチルアンモニウム塩のアニオン性副成分（Ｘ−）は、（限定せずに）以下のイオンのいずれかであり得る：臭化物イオン、塩化物イオン、ヨウ化物イオン、水酸化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、シュウ酸イオン、マロン酸イオン、コハク酸イオン、またはクエン酸イオン。特定の実施形態において、カチオン性界面活性剤は、同じ群のアニオンを含む、ベンジルジメチル−ｎ−アルキルアンモニウム塩である。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明の組成物および方法は、可溶化剤をさらに含み得る。特定の実施形態において、可溶化剤は、生物学的サンプルが消化に対して耐性である場合（例えば、このサンプルが組織全体を含む場合）に、特に有用である。特定の実施形態において、可溶化剤は、細胞内マトリックスの分解を補助し、界面活性剤およびプロテアーゼがサンプルに効率的に侵入し、そして分離することを可能にする。例示的な可溶化剤としては、１−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ−メチルピロリジノン、ピロリジノン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明はまた、核酸を生物学的サンプルから放出および／または単離するために設計された、キットを提供する。このキットは、少なくとも１つのカチオン性界面活性剤および少なくとも１つのプロテアーゼを含み、そして特定の実施形態によれば、さらなる成分を含み得る。特定の実施形態において、このキットは好ましくは、予め測定された単位量で成分を含み、最終使用者による測定を最小にする。特定の実施形態において、このキットは、本発明の１つ以上の方法を実施するための指示書を含む。特定の実施形態において、このキットは、別のものと組み合わせて操作するために最適化される。
【００５９】
特定の実施形態において、少なくとも１つの界面活性剤は、ＣＴＡＢ、ＣＴＡＣｌ、ＨＤＴＡＢ、ＨＤＴＡＣｌ、または等価物を含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのプロテアーゼは、プロテイナーゼＫを含む。特定の実施形態において、抽出された核酸を単離するための他の試薬が、このようなキットに含まれ得る。特定の実施形態において、本発明のキットは、反応緩衝剤、塩、イオン、安定剤、ヌクレアーゼインヒビター、可溶化剤、またはこれらの成分の組み合わせをさらに含み得る。
【００６０】
特定の実施形態によれば、生物学的サンプルから核酸を得、そしてこの核酸を固相に結合させるための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：この生物学的サンプルを破壊緩衝剤に接触させる工程であって、ここで、この破壊緩衝剤は、プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤を含む、工程；ならびにこの核酸を固相に結合させる工程。
【００６１】
特定の実施形態によれば、生物学的サンプルから核酸を得、そしてこの核酸を固相に結合させるための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：この生物学的サンプルを、破壊緩衝剤に接触させる工程であって、ここで、この破壊緩衝剤は、プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤を含む、工程；引き続いて、このカチオン性界面活性剤を中和する工程；ならびにこの核酸を固相に結合させる工程。特定の実施形態によれば、このカチオン性界面活性剤は、この緩衝剤のｐＨがｐＨ８より高く上昇する場合に、沈澱しない。
【００６２】
方法の特定の実施形態によれば、カチオン性界面活性剤は、以下からなる群の少なくとも１つから選択される：セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣｌ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣｌ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＡＣｌ）、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＥＤＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｄ１０ＴＡＢ）、およびドデシルトリフェニルホスホニウムブロミド（ＤＴＰＢ）。
【００６３】
特定の実施形態によれば、カチオン性界面活性剤を実質的に中和することは、このカチオン性界面活性剤を実質的に除去することによって達成される。特定の実施形態によれば、このような方法としては、沈澱、相抽出、および透析のうちの１つ以上が挙げられ得るが、これらに限定されない。このような方法の例示的な要約については、例えば、Ｋ．Ｏｈｌｅｎｄｉｅｃｋ，Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ
Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９：３０５−３１２（１９９６）を参照のこと。特定の実施形態において、アニオン性界面活性剤は、不溶性の錯体を形成するカチオン（例えば、カリウムおよびグアニジニウム）との沈澱によって、除去され得る。例えば、Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，４１−８７頁（１９８６）を参照のこと。界面活性剤除去のための、市販の透析製品としては、Ｈａｒｖｅｒｄ／Ａｍｉｋａ Ｄｉａｌｙｓｉｓ製品、Ｂｉｏｄｉａｌｙｓｅｒ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）、ならびにＡｍｉｃｏｎ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）、およびＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）遠心分離デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤の除去のためのクロマトグラフィーアプローチとしては、ゲル濾過；疎水性クロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。このような技術および原理の例示的な要約に関しては、例えば、Ｂｈａｉｒｉ，Ｓ．Ｍ．，Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ
Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，（１９９７）を参照のこと。界面活性剤の除去のための、市販の樹脂および他の製品の例としては、ＣＡＬＢＩＯＳＯＲＢＴＭ Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ＯＵＴＴＭ ＳＤＳ−３００（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ）；Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ＯＵＴＴＭ ＤＴＧ−１００；ＯｒｇｏＳｏｌ−Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ＯＵＴＴＭ（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ）；Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ ＳＭ２ＴＭ（ＢｉｏＲａｄ）；Ｖｉｖａｐｕｒｅ Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）；およびＺｉｐ ＴｉｍＨＰＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｉｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
方法の特定の実施形態によれば、カチオン性界面活性剤を実質的に中和することは、このカチオン性界面活性剤を実質的に中和する、第２の界面活性剤を添加する工程を包含する。特定の実施形態によれば、この第２の界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。特定の実施形態によれば、非界面活性剤は、以下からなる群の少なくとも１つから選択される：ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）。特定の実施形態によれば、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ２０である。特定の実施形態によれば、Ｔｗｅｅｎ ２０は、少なくとも４％ｗ／ｗの濃度で存在する。特定の実施形態によれば、Ｔｗｅｅｎ ２０は、２０％ｗ／ｗの濃度で存在する。
【００６５】
方法の特定の実施形態によれば、核酸を生物学的サンプルから得、そしてこの核酸を固相に結合させるための方法は、塩を添加する工程をさらに包含する。特定の実施形態によれば、この塩は、ＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌ、およびＧｕＳＣＮからなる群の少なくとも１つから選択される。方法の特定の実施形態によれば、塩はＣａＣｌ２であり、そして少なくとも２０ｍＭの濃度で存在する。
【００６６】
方法の特定の実施形態によれば、プロテアーゼは、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリセリンプロテアーゼからなる群の少なくとも１つから選択される。特定の実施形態によれば、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、ジスパーゼ、サブチリシンＣａｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼＡ、およびサーモリシンからなる群の少なくとも１つから選択される。
【００６７】
特定の実施形態によれば、プロテアーゼは、熱安定性プロテアーゼである。特定の実施形態によれば、熱安定性プロテアーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏを含む群の少なくとも１つから選択される生物から、単離される。
【００６８】
方法の特定の実施形態によれば、溶解緩衝剤は、さらに、リボヌクレアーゼインヒビターを含む。特定の実施形態によれば、リボヌクレアーゼインヒビターは、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸）、硫酸亜鉛、ブロモピルベート、ホルムアミド、銅、および亜鉛を含む群の少なくとも１つから選択される。特定の実施形態によれば、リボヌクレアーゼインヒビターは、アウリントリカルボン酸である。特定の実施形態によれば、アウリントリカルボン酸は、１０μＭの濃度で存在する。
【００６９】
特定の実施形態によれば、核酸を生物学的サンプルから得、そしてその核酸を固相に結合するための方法は、デオキシリボヌクレアーゼインヒビターを添加する工程をさらに包含する。特定の実施形態によれば、デオキシリボヌクレアーゼインヒビターは、二価のカチオンキレート剤を含む。特定の実施形態によれば、二価のカチオンキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＰＴＡからなる群の少なくとも１つから選択される。
【００７０】
特定の実施形態によれば、プロテアーゼ；カチオン性界面活性剤；塩；および第２の界面活性剤を備えるキットが提供され、ここで、この第２の界面活性剤は、カチオン性界面活性剤を実質的に中和する。
【００７１】
このキットの特定の実施形態に従って、このカチオン性界面活性剤は、緩衝液のｐＨが８より上に上昇する場合、沈殿しない。
【００７２】
このキットの特定の実施形態に従って、このカチオン性界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣｌ）、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＣｌ）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＣｌ）、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム（ＤＥＤＴＡＢ）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（Ｄ１０ＴＡＢ）、および臭化ドデシルトリフェニルホスホニウム（ＤＴＰＢ）を含む群のうちの少なくとも１つから選択される。
【００７３】
このキットの特定の実施形態に従って、このプロテアーゼは、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリ性セリンプロテアーゼを含む群のうちの少なくとも１つから選択される。特定の実施形態において、このプロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、ジスパーゼ、サブチリシンＣａｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼＡ、およびサーモリシンを含む群のうちの少なくとも１つより選択される。
【００７４】
このキットの特定の実施形態に従って、このプロテアーゼは、熱安定性プロテアーゼである。特定の実施形態において、この熱安定性プロテアーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏを含む群のうちの少なくとも１つより選択される生物体から単離される。
【００７５】
特定の実施形態に従って、このキットはさらに、リボヌクレアーゼインヒビターを含む。特定の実施形態において、このリボヌクレアーゼインヒビターは、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸）、硫酸亜鉛、ブロモピルベート、ホルムアミド、銅、および亜鉛を含む群のうちの少なくとも１つより選択される。特定の実施形態において、このリボヌクレアーゼインヒビターは、アウリントリカルボン酸である。特定の実施形態において、このアウリントリカルボン酸は、１０μＭの濃度で存在する。
【００７６】
特定の実施形態に従って、このキットはさらに、デオキシリボヌクレアーゼインヒビターを含む。特定の実施形態において、このデオキシリボヌクレアーゼインヒビターは、２価のカチオンキレート剤を含む。特定の実施形態において、この２価のカチオンキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＰＴＡを含む群のうちの少なくとも１つより選択される。
【００７７】
特定の実施形態に従って、このキットはさらに、塩を含む。特定の実施形態において、この塩は、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌ、およびＧｕＳＣＮを含む群より選択される。特定の実施形態において、この塩はＣａＣｌ２である。特定の実施形態において、このＣａＣｌ２は、少なくとも２０ｍＭの濃度で存在する。
【００７８】
特定の実施形態に従って、このキットの第２の界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。特定の実施形態において、この非イオン性界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）を含む群より選択される。特定の実施形態において、この非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ２０である。特定の実施形態において、このＴｗｅｅｎ ２０は、少なくとも４％重量／重量の濃度で存在する。特定の実施形態において、このＴｗｅｅｎ ２０は、２０％重量／重量の濃度で存在する。
【００７９】
特定の実施形態に従って、プロテアーゼ；カチオン性界面活性剤；非イオン性界面活性剤（この非イオン性界面活性剤は、このプロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤の存在下で、核酸と固相との結合を可能にする）；および高い塩濃度の緩衝液を含む、生体サンプルから核酸を単離するためのキットが提供される。
【００８０】
核酸を固相に結合するプロセスと、カチオン性界面活性剤を用いて核酸をサンプルから放出するプロセスとを組み合わせて、単一の核酸単離プロセスとするプロセスの間、タンパク質分解を達成するために用いられるカチオン性界面活性剤のうちの多くが、核酸を固相上に結合するために用いられた高い塩濃度の存在下で不溶性であることを見出した。さらに、高い塩濃度中において可溶である、いくつかのカチオン性界面活性剤は、固相への核酸の結合を阻害した。このことは、固相に結合する核酸を減少させる。特定の実施形態において、核酸を固相に結合するために、高い塩濃度を用いる。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示し、そして決して本発明の範囲を限定しない。
【００８２】
（実施例１）
プロテイナーゼＫの活性を測定するために、ＢｏＤｉｐｙで標識化されたカゼイン結合体（Ｅｎｚ Ｃｈｅｃｋ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，製品番号Ｅ６６３８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いるアッセイを開発した。この誘導体化された結合体中の、蛍光ＢｏＤｉｐｙ部分の濃度は、このタンパク質がインタクトである場合に、個々の部分の蛍光が消失するほど十分に高い。しかし、この誘導体化されたカゼインの、プロテアーゼによる消化において、より少数のＢｏＤｉｐｙ色素分子を含むペプチドが放出され、蛍光の増大を生じる。アッセイのための初期ダイナミックレンジを決定するために、以下のように、プロテイナーゼＫの濃度を減少させながら、ＢｏＤｉｐｙで標識化されたカゼインを１時間消化した。
【００８３】
プロテイナーゼＫ（製品番号２５４６、Ａｍｂｉｏｎ）を、１０μｇ／ｍｌのＢｏＤｉｐｙで標識化されたカゼイン結合体を含む５００μＬの緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、２０ｍＭのＣａＣｌ２）に、最終濃度の範囲（４０ｆｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌ）にわたって添加した。混合しながらの６０℃での１時間のインキュベーションの後で、１００μＬのアリコートを、９６ウェルの光学プレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標） Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に移動し、そしてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００分光光度計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において蛍光を測定した。バックグラウンドの蛍光を、プロテイナーゼＫを有さない緩衝液中で基質をインキュベートすることによって決定した。
【００８４】
図１に示したように、プロテイナーゼＫの濃度が増大するにつれて、蛍光の量は増大した。このシグナルは、約３０，０００蛍光単位で平坦域に達しているようであった。そして、放出された蛍光を、わずか５０ｎｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む反応組成物から検出した。
【００８５】
（実施例２）
最初に、一連の反応組成物を、生体サンプル（例えば、肝臓の切片）を脱凝集させる能力について分析した。これらの反応組成物は、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ならびに必要に応じて、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤およびアニオン性界面活性剤）、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅｓ）、または添加物１−メチル−２−ピロリジノン（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。各々の反応組成物を、肝臓の切片とともにチューブに配置し、次いで、６５℃でインキュベートした。このチューブを定期的に観察して、どの反応組成物がサンプルを効率的に軟化し得るかを決定した。
【００８６】
表１に示したように、単独のプロテイナーゼＫは、この肝臓組織を効率的に消化し得たが、それは６５℃での延長されたインキュベーションの後でのみであった。試験された全ての反応組成物の中で、カチオン性界面活性剤ＣＴＡＢを含むものが、１時間のインキュベーション期間の間、もっとも効率的にこのサンプルを軟化した。さらに、ＣＴＡＢは、プロテイナーゼＫのタンパク質分解活性を増強するようであった。
【００８７】
【表１】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
（実施例３）
プロテイナーゼＫの活性に対するカチオン性界面活性剤の効果を試験するために、以下のように一連の反応組成物を調製した。反応混合物は、以下を含んだ：カゼインＢｏＤｉｐｙ結合体（１μｇ、１０ｎｇ／μＬ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのＣａＣｌ２、１％の界面活性剤（以下の表２に示す）、ならびに、２０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．３１μｇ／ｍｌ、０．０７８μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌおよび０．００５μｇ／ｍｌの濃度の、一連のプロテイナーゼＫ希釈物。アニオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（試験された条件下でプロテイナーゼＫの活性を活性化することが公知である）を、ポジティブコントロールとして含めた。反応チューブを、９６−ウェルの光学プレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標） Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において６０℃でインキュベートし、そして、放出された蛍光の量を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００を用いて、示した時点で測定した。
【００９１】
【表２】
【００９２】
【００９３】
図２Ａ〜２Ｃに示すように：（ｉ）プロテイナーゼＫは界面活性剤なしで、周囲温度でさえも、高いタンパク質分解活性を有する（水中での０分インキュベーションを参照のこと）；（ｉｉ）ＳＤＳは、カゼイン基質におけるプロテイナーゼＫの活性を増強する；（ｉｉｉ）２つのカチオン性ポリマー（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ００６および００７）は、プロテイナーゼＫ活性に対するわずかな阻害活性を有する；そして（ｉｖ）試験された全てのカチオン性界面活性剤は、（単独の水に対する（すなわち、界面活性剤を有さない）プロテイナーゼＫ活性と、ハロゲン化テトラアルキルアンモニウム曲線、ハロゲン化ベンジルアルキルアンモニウム曲線、またはポリクオーターニウム（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｉｕｍｓ）曲線とを比較した場合）プロテイナーゼＫ活性を阻害するようである。
【００９４】
（実施例４）
組織全体から核酸を抽出することは、代表的には困難であるので、本発明の組成物および方法の効力を例示することは、有効に用いられ得る。従って、実施例の残りを、例示的な組織全体として肝臓組織を用いて行った。しかし、当業者は、開示された組成物および方法がまた、広範囲の生体サンプルを用いて有効に使用され得ること、ならびに、本発明がいかなる型のサンプルを用いる使用にも限定されないことを、理解する。
【００９５】
核酸放出の効力を、種々の試験処理によって評価するための最初のアプローチにおいて、肝臓サンプルを、界面活性剤およびプロテイナーゼＫを含む反応組成物中で、特定の期間にわたって消化した。このプロトコルは、遠心分離を用いて未消化の物質を除去する工程を含んだ。精製核酸およびカチオン性界面活性剤を用いた予備的な結果は、このカチオン性界面活性剤が核酸とともに沈殿を形成していることを示した（データを示さず）。さらに、この複合体は、遠心分離の間、未消化の組織とともに除去されていた。従って、サンプルから放出されている核酸の量を定量する１つの方法は、界面活性剤：核酸複合体から核酸を遊離させることを含んだ。カチオン性界面活性剤複合体から核酸を遊離させるために、以下のように条件を評価した。
【００９６】
ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ；１８ゲージの皮下注射針を使用して穏やかに剪断した７００μｇ／ｍｌ）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８中の１％ＣＴＡＢと混合して、反応組成物を生成した。最初に、顕著な沈殿が観察された。表３に示される種々の添加物を、この反応組成物のアリコートを用いて試験して、カチオン性界面活性剤：核酸沈殿物を可溶化する組成物を同定した。
【００９７】
【表３】
【００９８】
【００９９】
表３に示したように、反応組成物のうち４つが、沈殿を完全に可溶化した。最終濃度３３％または５０％で使用した、核酸精製物溶解溶液（＃４３０５８９５，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、沈殿を完全に可溶化した（サンプル２４〜２５を参照のこと）。さらに、ＮａＣｌ塩および非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０のいくつかの組合せは、沈殿を完全に可溶化した（サンプル１６および３０を参照のこと）。しかし、単独で使用したＮａＣｌもＴｗｅｅｎ２０も、沈殿を可溶化しなかった（サンプル１，２，１５および１７を参照のこと）。当業者は、種々の濃度で使用した塩および非イオン性界面活性剤のさらなる組合せは、カチオン性界面活性剤：核酸沈殿を溶解するのに使用され得ることを理解する。
【０１００】
（実施例５）
種々のカチオン性界面活性剤がプロテイナーゼＫによる組織の消化を増大する能力を評価するために、１６の界面活性剤のうち１つを含む反応組成物を使用し、プロテイナーゼＫの有りまたは無しの両方で、肝臓切片を消化した（表４に示される）。還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を、組織消化に対する還元条件の効果を評価するために含ませた。肝臓組織（８０ｍｇ〜１２０ｍｇ）を、１０００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および２０ｍＭジチオトレイトールを含む３４本のエッペンドルフチューブ（１７対のチューブ）の各々の中に置いた。１６の界面活性剤のうち１つを、最終濃度１％の界面活性剤を生じるように一対のチューブに加えた。第１７対目のチューブは、非界面活性剤コントロールとして働く。１ミリグラム（ｍｇ）のプロテイナーゼＫを、１７対の各々の一方のチューブに加えた。次いで、３４本のチューブを６０℃で攪拌しながらインキュベーションした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ、モデル５４３６）。
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
【０１０３】
各々のチューブを、インキュベーションの１５分後および５２分後に視覚的に評価した。表５（１５分インキュベーション）および表６（５２分インキュベーション）に示した結果は、試験した条件下では、ＣＴＡＢおよびプロテイナーゼＫの組合せが、いずれの時点でも組織サンプルの全体的な脱凝集を引き起こしたことを示す。特に、ＣＴＡＢ単独では、明らかなサンプルの脱凝集を引き起こさなかった。ＤＴＴの存在は、これらの条件下で、組織の脱凝集を有意にもたらさないようにみえた。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
【０１０６】
ＰＫ＝反応組成物中のプロテイナーゼＫの存在または非存在；Ｙ＝プロテイナーゼＫは存在した；Ｎ＝プロテイナーゼＫは、反応組成物中に存在しなかった。組織脱凝集：０＝なし；１＝フラグメント化なし、わずかに濁った上清；２＝フラグメント化ほとんどなし、わずかに濁った上清、３＝より有意な組織の上清、ひどく濁った上清；４＝不溶性物質がほとんど残されていない、完全な組織凝集
【０１０７】
【表６】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
命名法の意味は、表５の凡例を参照のこと。
【０１１１】
（実施例６）
カチオン性界面活性剤およびプロテイナーゼＫが生物学的サンプルから高度に完全な核酸を放出する能力を検査するために、放出された核酸を単離した。肝臓組織の切片（一片あたり９０ｍｇ〜２００ｍｇ）を、２２本のエッペンドルフマイクロフューズチューブ各々の中に置いた。４００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、１％界面活性剤、および１ｍｇプロテイナーゼＫを各々のチューブに加えた。チューブを６０℃で２２分間、攪拌しながらインキュベーションした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ、モデル５４３６）。
【０１１２】
インキュベーションに続いて、界面活性剤：核酸複合体を溶解するために、核酸精製物溶解溶液（＃４３０５８９５，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；最終濃度２９％）、酢酸ナトリウム（最終濃度２１４ｍＭ）およびグリコーゲン（イガイ（Ｍｕｓｓｅｌ）ＶＩＩ型、Ｓｉｇｍａ；最終濃度１４３μｇ／ｍｌ）を、各々のチューブに加えた。残りの組織フラグメントをペレット化するために、これらチューブを、１４，０００ＲＰＭで５分間、エッペンドルフマイクロフューズ（モデル５４１５Ｃ）中で遠心分離した。得られた上清を、１０ｍＭＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および１ｍＭ ＥＤＴＡ（フェノール飽和）で飽和させた７００μＬのフェノール（Ｓｉｇｍａ）を使用して、抽出した。ペレット化された材料もまた、たとえ未消化サンプル中にいくらか残ってたとしても、核酸を得るために、飽和フェノールで抽出した。抽出された核酸を、等容量（７５０μＬ）の２−プロパノールを使用して沈殿させ、そしてこれらのチューブを−２０℃で３時間インキュベーションした。前記のように、核酸をペレット化するために、１４，０００ＲＰＭで５分間室温で、マイクロフューズ中でサンプルを遠心分離した。核酸のペレットを、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、そして１４，０００ＲＰＭで５分間室温で、マイクロフューズ中でサンプルを遠心分離した。洗浄した核酸ペレットを、１００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１単位／μＬのＲＮａｓｉｎ中に再懸濁した。放出された核酸の量を、ＵＶ／可視光分光光度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、モデル８４５３）を使用して定量した。定量の目的のために、２６０ｎｍの波長でＵＶ光を吸収する材料が核酸であると仮定した。従って、吸光係数１ＯＤ２６０＝４０μｇ／ｍｌを使用した。
【０１１３】
図３は、サンプル（μｇ核酸／処理した組織１ｍｇ）から回収したＡ２６０吸収材料の量を示す。結果を、各々のサンプルの重量について正規化した。前記実施例中で実証されたように、カチオン性界面活性剤の存在下における、プロテイナーゼＫの減少したタンパク質分解活性にも関わらず、Ａ２６０吸収物質の量は、アニオン性界面活性剤を用いて得られる量または界面活性剤を用いずに得られる量と類似していた。
【０１１４】
放出された核酸の完全性（すなわち、その分解度）および組織ペレット中に残っている核酸の量を評価するために、各々のサンプルの１０分の１を、標準的分子生物学の手順に従って、１％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。標準的分子生物学の手順の記述は、特に、以下において見出され得る：ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｂｅｌら，１９９３ および２０００年９月補遺， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｗ．Ｒｅａｍら，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９９。
【０１１５】
図４に示したように、カチオン性界面活性剤：プロテイナーゼＫの組合せのほとんどは、ペレット中に残る核酸がほとんどないことによって証明されるように、核酸を放出した。放出された核酸は、大きな電気泳動移動度を有することが観測された。なぜならば放出した核酸は、ゲルの底辺近くに現れたからである。インタクトな高度に完全な核酸は、代表的に、大きいというよりむしろ、小さい電気泳動移動度を有するので、回収した核酸はこれらの条件を使用することで、明らかに高度にフラグメント化された。言い換えると、核酸は明らかに低い完全性を有していた。
【０１１６】
（実施例７）
実施例６から得た結果は、サンプル中に有意なヌクレアーゼ活性があったことを示す。内因性ＲＮＡｓｅｓの核酸分解活性を減少させるために、反応組成物のｐＨを約６．０へ低下させ、そしてインキュベーション温度を４５℃へ低下させた。フェニルグリオキサ−ル（Ａｌｄｒｉｃｈ＃１４２４３−３）、１−メチル−２−ピロリジノン、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，＃７０２０）、およびＳｔｒｅｃｋ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆｉｘｉｔｉｖｅ（Ｓｔｒｅｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃２６５１３８）を含むいくつかの添加物をまた、試験して、反応組成物中での内因性ＲＮＡｓｅ活性に対する効果を評価した。フェニルグリオキサ−ルは、リボヌクレアーゼ活性を減少することが知られている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔ１．ＸＩ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔ１ Ｂｙ Ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｏｘａｌ Ａｎｄ Ｇｌｙｏｘａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｊａｐａｎ）６８：６５９−６６４，１９７０を参照のこと）。ＲＮＡ Ｌａｔｅｒについての製品の印刷物は、この試薬が組織中でＲＮＡを安定化し、そして、Ｓｔｒｅｃｋ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆｉｘａｔｉｖｅは、組織の完全性を保存すると考えれていると主張している。
【０１１７】
肝臓組織の切片（１００ｍｇ〜２００ｍｇ／サンプル）を１９本のエッペンドルフチューブ中に置いた。１００ｍＭ ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ＃Ｍ−５２８７）、ｐＨ６、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および１ｍｇプロテイナーゼＫを含む反応組成物（４００マイクロリットル）を、各々のチューブに加えた。表７に示すように、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ，サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ））およびカチオン性界面活性剤（ＣＴＡＢ、ＣＴＡＣｌ、およびテトラメチルアンモニウムクロリド）を含むさらなる成分を特定のチューブに加えた。
【０１１８】
【表７】
【０１１９】
【０１２０】
これらのチューブを、混合しながら（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ５４３６）、４５℃で２０分間インキュベートした。このインキュベーションの後、１．７５Ｍ ＮａＣｌ、２９％ Ｔｗｅｅｎ ２０、５８５μｇ／ｍｌ グリコーゲン（４４７ｍＭ ＮａＣｌ、７．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、および１４９μｇ／ｍｌ グリコーゲン）を含む溶液（１７１μＬ）を、各チューブに添加して、界面活性剤：核酸複合体を溶解した。グリコーゲンは、核酸キャリアとして作用した。消化されていない組織フラグメントを、実施例６に開示される方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遠心分離によって除去した。実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、上清を、フェノール（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡで飽和；Ｓｉｇｍａ ＃Ｐ−４５５７）で抽出し、イソプロパノール（Ａｌｄｒｉｃｈ ＃１９０７６−４）で沈殿させ、そしてエタノールで洗浄した。この洗浄した核酸ペレットを、１００μＬの、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１単位／μＬ Ｒｎａｓｉｎと共に再懸濁した。遊離された核酸の量およびその完全性を、実施例６に記載されるようにして評価した。
【０１２１】
図５に示すように、これらの条件下で、カチオン性界面活性剤（ＣＴＡＢおよびＣＴＡＣｌ）またはアニオン性界面活性剤（ＳＤＳおよびＳａｒｋｏｓｙｌ）のいずれかと組み合わせたプロテイナーゼＫは、このサンプルからＡ２６０吸収物質を遊離させた。Ｓｔｒｅｃｋ Ｔｉｓｓｕｅ ＦｉｘａｔｉｖｅまたはＲＮＡ Ｌａｔｅｒのいずれかを、これらの反応物に添加した場合、非常にわずかなＡ２６０吸収物質が遊離された。この遊離された核酸の平均分子量は、代表的に、プロテイナーゼＫの消化がより低いｐＨおよびより低温で行われる場合、より大きかった（図４と図６とを比較９）。さらに、遊離された核酸の平均分子量は、代表的には、プロテイナーゼＫ消化をカチオン性界面活性剤の存在下で行った場合よりも大きかった（図６のレーン５〜９および１５〜１９と１０〜１４とを比較）。
【０１２２】
（実施例８）
ＣＴＡＣｌとＣＴＡＢとを比較するために、これら２つの界面活性剤を、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＤＴＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＨＤＴＡＣｌ）、およびＳａｒｋｏｓｙｌと並行して評価した。３種の添加剤、フェニルグリオキサール、アクリジンオレンジ（例えば、Ｓｉｇｍａ ＃Ａ６０１４）、および１−メチル−２−ピロリジノンもまた評価した。フェニルグリオキサールを試験して、これがＲＮＡａｓｅ活性を減少させるか否かを決定した。核酸分子と相互作用することが知られている色素化合物であるアクリジンオレンジを試験して、これがヌクレアーゼ活性を減少させるか否かを決定した。１−メチル−２−ピロリジノンを試験して、これが種々の反応組成物によるサンプルの溶解性を増大させるか否かを観察した。
【０１２３】
肝臓組織のスライス（１００〜２００ｍｇ／サンプル）を、２１本のエッペンドルフチューブに入れた。１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および１ｍｇ プロテイナーゼＫを含む反応組成物（４００μｌ）を、各チューブに添加した。表８に示すように、追加の成分を、特定のチューブに添加した。
【０１２４】
【表８】
【０１２５】
これらのチューブを、混合しながら（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ５４３６）、４５℃で３０分間インキュベートした。界面活性剤：プロテアーゼ複合体を、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、可溶化した。残った組織フラグメントを、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遠心分離によって除去した。実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、上清をフェノールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてエタノールで洗浄した。この洗浄した核酸ペレットを、再懸濁し、そして遊離された核酸の量および完全性を、実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して評価した。
【０１２６】
図７に示すように、３種の添加剤の効果は、界面活性剤に依存して異なった。例えば、ＣＴＡＣｌおよび１−メチル−２−ピロリジノンを使用して遊離された核酸の量は、添加剤を含まないＣＴＡＣｌの組成物と比較して多かった。しかし、ＨＤＴＡＢおよび１−メチル−２−ピロリジノンを使用して遊離された核酸の量は、添加剤を含まないＨＤＴＡＢの組成物と比較して、少なかった。
【０１２７】
遊離された核酸をゲル電気泳動により分析した場合、高分子量核酸が、ＨＤＴＡＢを含む全ての反応組成物において現れた（図８を参照のこと）。高分子量核酸はまた、ＣＴＡＣｌと１−メチル−２−ピロリジノンまたはアクリジンオレンジのいずれかとを含む反応組成物中に存在した。高分子量核酸はまた、ＨＤＴＡＣｌおよび１−メチル−２−ピロリジノンを含む反応組成物において観察された。
【０１２８】
（実施例９）
実施例７は、組織サンプル中のＲＮＡを安定化するために使用される特定の試薬（すなわち、Ｓｔｒｅｃｋ Ｔｉｓｓｕｅ ＦｉｘａｔｉｖｅおよびＲＮＡ Ｌａｔｅｒ）の存在が、プロテイナーゼＫの活性を阻害することを証明した。この阻害の減少を試みるために、組織を、いくつかの試薬中でプレインキュベートして、この組織をサンプル中に拡散させた。残った試薬を、反応組成物中でのサンプルのインキュベーションの前に除去した。
【０１２９】
肝臓スライスを、以下のように、反応組成物に暴露する前に、種々の溶液中でインキュベートした。肝臓組織のスライス（９４〜３３０ｍｇ／サンプル）を、４セットの６個のエッペンドルフチューブに配置した。核酸精製溶解溶液（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＲＮＡ ＬａｔｅｒまたはＳｔｒｅｃｋ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆｉｘａｔｉｖｅのいずれか（５００μｌ）を、１セットのチューブに添加した。４番目のセットのチューブは、予備処理溶液を含まず、コントロールとしてはたらいた。
【０１３０】
これらのチューブを４℃で４時間インキュベートし、次いで、周囲温度で２分間、１４，０００ＲＰＭにて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心機（Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ）で遠心分離した。上清を捨て、そして１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および１ｍｇ プロテイナーゼＫを含む反応組成物（４００μｌ）を、各チューブに添加した。表９に示す６種の追加成分のうちの１つをまた、各チューブに添加した。これらのチューブを、混合しながら（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ５４３６）、４５℃で３０分間インキュベートした。
【０１３１】
得られた界面活性剤：プロテアーゼ複合体を、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、可溶化した。残った組織フラグメントを、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遠心分離によって除去した。実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、上清を、フェノールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてエタノールで洗浄した。この洗浄した核酸ペレットを再懸濁し、そして遊離された核酸の量およびその核酸の完全性を、実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して評価した。
【０１３２】
【表９】
【０１３３】
図９に示すように、予備処理溶液の１つでのサンプルの予備処理は、コントロールと比較した場合、遊離されるＡ２６０吸収物質の量の減少を生じた。
【０１３４】
（実施例１０）
アウリントリカルボン酸がＣＴＡＢ、ＣＴＡＣｌまたはＳＤＳを含む反応組成物を使用して遊離される核酸の完全性を維持する能力を評価した。アウリントリカルボン酸は、核酸へのタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）の結合を阻害すると考えられ、そしてリボヌクレアーゼを阻害することが証明されている。肝臓組織のスライス（７７〜１８６ｍｇ／サンプル）を、２１本のエッペンドルフチューブに入れた。各チューブに、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および表１０に示されるような追加成分を含む反応組成物（４００μＬ）を添加した。
【０１３５】
【表１０】
【０１３６】
これらのチューブを、混合しながら（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ５４３６）、５５℃で３０分間インキュベートした。得られた界面活性剤−プロテアーゼ複合体を、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、可溶化した。消化されていない組織フラグメントを、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遠心分離によって除去した。実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、上清を、フェノールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてエタノールで洗浄した。この洗浄した核酸ペレットを再懸濁し、そして実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遊離された核酸の完全性を評価した。
【０１３７】
図１１に示すように、反応組成物中のアウリントリカルボン酸の存在は、高分子量核酸の収量を増大させた。アウリントリカルボン酸とＣＴＡＢまたはＣＴＡＣｌのいずれかとを含む反応組成物は、多量の高完全性の核酸を遊離させた。この反応組成物中の界面活性剤がＳＤＳである場合、より少ない核酸が遊離された。
【０１３８】
（実施例１１）
他のカチオン性試薬が高完全性の核酸を遊離する能力を試験するために、さらなる化合物を、以下のようにして試験した。肝臓組織のスライス（８０〜１４０ｍｇ／サンプル）を、１４本のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入れた。１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ６）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ アウリントリカルボン酸（例えば、Ｓｉｇｍａ ＃Ａ１８９５）、および１ｍｇ プロテイナーゼＫを含む反応組成物（５００μｌ）を、各チューブに添加した。表１１に示すカチオン性試薬の１つを、最終濃度が１％になるまでこのチューブに添加した。コントロールとして、１つのチューブは、追加の試薬を含まなかった。これらのチューブを、混合しながら（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ５４３６）、６０℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーションの後、１．７５Ｍ ＮａＣｌ、２９％ Ｔｗｅｅｎ ２０、５８５μｇ／ｍｌ グリコーゲンを含む溶液（２００μＬ）（４４７ｍＭ ＮａＣｌ、７．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、および１４９μｇ／ｍｌ グリコーゲンの最終濃度を生じる）を、各チューブに添加して、界面活性剤：核酸複合体を溶解した。残った組織フラグメントを、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遠心分離によって除去した。実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、上清を、フェノールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてエタノールで洗浄した。この洗浄した核酸ペレットを、１００μＬの、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１単位／μＬ Ｒｎａｓｉｎに再懸濁した。遊離された核酸の量およびその完全性を、実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、評価した。
【０１３９】
【表１１】
【０１４０】
図１２に示されるように、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００６およびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００７を除く、試験したカチオン試薬の全ては、高い完全性の核酸を放出した。試験した１１のカチオン試薬のうちで、９つは、界面活性剤であり、そして２つ（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００６およびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００７）は、カチオンポリマーであった。この結果は、これらの条件において、プロテイナーゼＫと関連して使用される場合、カチオン性界面活性剤の全てが、効率的にサンプルから核酸を放出したことを示す。
【０１４１】
以下の用語、略語、および供給源を、実施例１２〜実施例２１の全体にわたって議論される物質に適用する。
【０１４２】
固相ガラス繊維膜（ＧＦ／ＢおよびＧＦ／Ｄ）を、Ｗｈａｔｍａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カタログ番号１８２１−１５０およびカタログ番号１８２３−１５０）から入手した。プロテイナーゼＫを、Ａｍｂｉｏｎ（カタログ番号２５４８）から入手した。ラット組織およびマウス組織を、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｒｏｇｅｒｓ、Ａｒｋａｎｓａｓ）により供給される動物から入手した。仔ウシ胸腺のゲノムＤＮＡを、Ｓｉｇｍａ（製品番号Ｄ８５１５）から入手した。
【０１４３】
以下の試薬およびそれらに対する供給源の略語または名称は、以下の通りである：
以下の実施例において、これらの以下のカチオン性界面活性剤を使用した：臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ、Ａｌｄｒｉｃｈ ＃８５５８２−０）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ ＃２９２７３−７）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ、Ｓｉｇｍａ
＃Ｄ−８６３８）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＣｌ、Ｆｌｕｋａ 製品番号４４２４２）、臭化オクチルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｔ４７６２）、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＣｌ、Ｆｌｕｋａ 製品番号８７２１２）、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム（ＤＥＤＴＡＢ、Ｆｌｕｋａ 製品番号４４１６５）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（Ｄ１０ＴＡＢ Ｆｌｕｋａ 製品番号３０７２５）、臭化ドデシルトリフェニルホスホニウム（ＤＴＰＢ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ 製品番号１４２９５）、クオーターニウム８４（ＭＮＬＥまたはＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）、オレアルコニウムクロリド（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＫＰまたはＭＫＰ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）、およびコムギ（ｗｈｅａｔ）リピドエポキシド（ＭＷＬまたはＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＷＬＥ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）。
【０１４４】
以下の試薬およびそれらに対する供給源の略語または名称は、以下の通りである：ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、Ａｍｂｉｏｎ カタログ番号９８２２）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｌ４６３２）、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムまたはラウロイルサルコシン（Ｓａｒｋｏｓｙｌ、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｌ５１２５）、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｔ８７８７）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｓｉｇｍａ
製品番号Ｐ９４１６）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｐ２５６５）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｐ１５０４）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｐ１６２９）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｐ８０７４）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｐ４６３４）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｉ３０２１）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０、Ａｌｄｒｉｃｈ 製品番号２３５９８−９）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０、Ｓｉｇｍａ
製品番号Ｓ６６３５）。
【０１４５】
以下の試薬およびそれらに対する供給源の略語または名称は、以下の通りである：塩酸グアニジニウム（Ｓｉｇｍａ、ロット３８Ｈ５４３２）、チオシアン酸グアニジニウム（Ｓｉｇｍａ、製品番号Ｇ−９２７７）、ヨウ化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号３８，３１１−２、ロット番号０７００４ＴＳ）、過塩素酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号４１，０２４−１、ロット ＫＵ ０６９１０ＨＵ）、臭化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号３１０５０−６、ロット１１８０５ＫＲ）、塩化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号３３，２５１−４、ロット番号１６５２４ＣＳ）、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン、Ｓｉｇｍａ、製品番号Ｔ−６７９１、ロット番号１２６１−１５７３８）、ヨウ化リチウム（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｌ４５０８）、ヨウ化カリウム（Ｓｉｇｍａ
製品番号Ｐ２９６３）、ヨウ化ルビジウム（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｒ２２５２）、ヨウ化セシウム（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｃ８６４３）、臭化リチウム（Ａｌｄｒｉｃｈ ２１，３２２−５）、塩化リチウム（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｌ９６５０）、チオシアン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｓ７７５７）、尿素（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｕ５３７８）、ＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ カタログ番号９２６１）、および水酸化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、製品番号Ｓ−８０４５、ロット番号１２７Ｈ０５３１および６９Ｈ１２６４）。
【０１４６】
（実施例１２）
特定の例において、高塩中での洗浄剤の可溶性は、塩および洗浄剤それ自体の組成に関連し得る。混合実験を、異なる塩組成における種々のアニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤の溶解性を試験するために実施した。０．５％（Ｓａｒｋｏｓｙｌ、ＬＤＳ、ＳＤＳ、およびＣＴＡＢ）または５．０％（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ２１、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｔｗｅｅｎ ８５、ＮＰ−４０、Ｂｒｉｊ ３０、およびＳｐａｎ ２０）の最終濃度で、界面活性剤を、塩溶液に対して加えた。この塩溶液は、ｐＨ６．０またはｐＨ１０．０で、ＬｉＩ、ＮａＩ、ＫＩ、ＲｂＩ、ＣｓＩ、ＧｕＳＣＮ、ＧｕＨＣｌ、またはＮａＣｌＯ４を含有した。表１２に示すように、濃度は、加えた塩について２Ｍ、４Ｍまたは６Ｍであった。いくつかの塩溶液は、８Ｍの尿素を含み、そして他の塩溶液は、８Ｍの尿素を含まなかった。界面活性剤の可溶性を、可溶性または不溶性のいずれかとして記録した。塩溶液中の界面活性剤の可溶性を、最初に、曇りまたは沈殿の形成に対する目視観測によって決定した。得られた溶液をまた、沈殿ペレットが存在しないことによって、沈殿物が存在しないことを確認するために遠心分離した。溶液中に曇りを生じたかまたは沈殿物および沈殿ペレットを形成した界面活性剤を、不溶性（Ｘ）と記録し、そして遠心分離後に明らかなペレットを形成しない透明な溶液を生じた界面活性剤を、可溶性（Ｓ）として記録した。「Ｓ（Ｖ）」の記録を有するいくつかの洗浄剤は、塩溶液中に溶解したが、著しく粘稠な溶液を生じた。これらの結果を、表１２に示す。観測された不溶性は、ｐＨに独立であるように考えられ、そして変性試薬の尿素の添加によって変化しなかった。
【０１４７】
【表１２】
【０１４８】
（実施例１３）
いくつかのカチオン性界面活性剤の可溶性を、異なるカオトロピズムの塩溶液中で試験した。試験したカチオン性界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣｌ）、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＣｌ）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＣｌ）、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム（ＤＥＤＴＡＢ）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（Ｄ１０ＴＡＢ）、および臭化ドデシルトリフェニルホスホニウム（ＤＴＰＢ）であった。試験したカチオン性界面活性剤のそれぞれは、１％濃度で存在した。カチオン性界面活性剤のそれぞれは、２％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するカオトロピズムの塩の１つの５Ｍ溶液中で試験した。それぞれのカチオン性界面活性剤および塩の組み合わせを、ｐＨ６（５０ｍＭ ＭＥＳ）、ｐＨ８（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、およびｐＨ１０（５０ｍＭ ＡＭＰ）で試験した。各界面活性剤の可溶性を、視覚的に評価し、そして実施例１２において使用した同一の基準を用いて記録した。これらの結果を表１３に示す。
【０１４９】
【表１３】
【０１５０】
これらの結果は、可溶性と界面活性剤の鎖長との関係を示唆する。さらに、対アニオンの半径もまた、洗浄剤の可溶性に影響する。１２個以下の炭素原子のアルキル鎖長を有する界面活性剤（例えば、ＤＥＤＴＡＢ、Ｄ１０ＴＡＢ（Ｄ１０ＴＡＢ）、ＤＴＰＢ、ＤＴＡＢおよびＤＴＡＣｌ）は、より長い界面活性剤よりもより可溶性と考えられる。大きなヨウ化物アニオンの存在下では、カチオン性界面活性剤のいくつかは、不溶性であった。全てのカチオン性界面活性剤は、他のカオトロピズムの塩よりも、ＧｕＨＣｌおよびＬｉＣｌの両方においてより可溶性であった。
【０１５１】
（実施例１４）
ＤＴＡＢおよびＤＴＡＣｌの存在下で、界面活性剤−核酸沈殿物の形成が可逆的であることを確認するために、以下の実験を実施した。仔ウシ胸腺のゲノムＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を、１８ゲージの皮下注射針中を３回通すことによって部分的に切断した。８μｇの切断されたＤＮＡを含有する９０μＬの溶液を、１６の微量遠心管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）のそれぞれの中へ入れた。ＤＴＡＢを、８つのチューブに最終１．６％濃度まで加え、そしてＤＴＡＣｌを残りの８つに加えた。このチューブを、手短にボルテックスし、そして沈殿物を、全てのチューブにおいて注目した。次いで、８つのカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）溶液を、ｐＨ６．０で５０ｍＭ ＭＥＳおよび５Ｍの以下：ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌまたはＧｕＳＣＮの１つとともに調製した。６００μｌのそれぞれのカオトロープ溶液を、別々に、ＤＴＡＢおよび沈殿物とともに６つの異なるチューブに加えた。６００μｌのそれぞれのカオトロープ溶液を、別々に、ＤＴＡＣｌおよび沈殿物とともに６つの異なるチューブに加えた。結果を、表１３に示す。溶液を、ＤＮＡが溶解した（「Ｒ」）かまたは溶解しない（「ＩＲ」）かどうかについて評価した。
【０１５２】
核酸沈殿物は、界面活性剤それ自体が可溶でないカオトロピズムの溶液を含む、ほとんどのカオトロピズムの塩溶液中に溶解した。
【０１５３】
（実施例１５）
ラットの尾由来のゲノムＤＮＡを入手しようと試みるために、５０ｍｇのラットの尾の小片を、微量遠心管中の、５ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０μＭ ＡＴＡ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および１％の以下のカチオン性界面活性剤：ＣＴＡＣｌ、ＣＴＡＢ、ＴＴＡＢ、ＤＴＡＢ、ＭＮＬＥ（クオーターニウム８４、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）、ＭＫＰ（オレアルコニウムクロリド、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＫＰ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｐ，Ｌｔｄ）、およびＭＷＬ（コムギ（ｗｈｅａｔ）リピドエポキシド、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ
ＷＬＥ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）を含有する、２００μｌの緩衝液中に浸軟した。このチューブを、６５℃で１０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ、Ｍｏｄｅｌ５４３６）で混合しながら６０分間インキュベートした。各チューブから、１００μｌアリコートおよび５０μｌアリコートを、新たなチューブに移した。５Ｍ ＧｕＳＣＮ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、および２％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する、６００μｌのカオトロープ溶液を、各チューブに加え、そして溶液をＳｃｈｌｅｒｉｎパターンが消失するまで混合した。消化されない組織微粒子物（例えば、毛および骨）を除去するために、このチューブを、４℃で５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清溶液中に放出されたゲノムＤＮＡを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 製品番号６１００−０１）を使用する、ガラスフィルター−吸着および真空濾過法によって単離した。サンプル溶液を、ガラス繊維ＧＦ／Ｂフィルター（９６−ウェル形式における）に移し、そして２．４ｐｓｉ真空で排出した。フィルターを、９０％エチルアルコールで３回洗浄した。ＤＮＡを、最初に、２００μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の使用によって、ガラス繊維から回収した。室温での３分間のインキュベーションに続いて、ＤＮＡ含有溶出液を、９６−ウェルサンプル保管トレー中に排出および回収した（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ４３０６７３７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。第２の分離溶出液を、１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで実施した。
【０１５４】
回収の結果を、ラットの尾の組織（ｍｇ）あたりの回収されたＤＮＡ（ｎｇ）の関数として表１３に示す。さらに、ＮａＯＨによる回収における実質的な増加から、回収されたＤＮＡが、アルカリ性条件でより効率的に溶出したと考えられる。
【０１５５】
（実施例１６）
ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターに可逆的に結合される精製ＤＮＡの能力を、評価した。ゲノムＤＮＡの結合および放出を、２％ Ｔｗｅｅｎ ２０の存在下で、３つの異なるｐＨレベル（ｐＨ６、８および１０）にて、３つの異なる塩（チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジニウム、および臭化ナトリウム）のうちの１つの存在下、および２つの異なるカチオン性界面活性剤（ＤＴＡＢおよびＤＴＡＣｌ）のうちのいずれか１つの存在下またはいずれのカチオン性界面活性剤の非存在下で、試験した。８マイクログラムの部分剪断仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡ（実施例１５にて調製されるような）を、６００μｌのＤＮＡ結合溶液に添加した。このＤＮＡ結合溶液は、５Ｍの１つの塩（ＮａＳＣＮ、ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮ）、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２％のＴｗｅｅｎ ２０、５０ｍＭの緩衝液（ＭＥＳ、ｐＨ６．０；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；またはＡＭＰ、ｐＨ１０のうちの１つ）および１％のカチオン性界面活性剤（ＤＴＡＢ、ＤＴＡＣｌ、または界面活性剤を含まない水（コントロール「Ｎｏ Ｄｅｔｅｒｇ（界面活性剤なし）」として））を含む。従って、２７個の異なる組み合わせを試験した。ゲノムＤＮＡを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６１００−０１）を使用する真空濾過によって、ガラスフィルター上に吸着させた。サンプル溶液を、ガラス繊維ＧＦ／Ｂフィルター（９６ウェル形式）に移し、そして２．４ｐｓｉの減圧下で脱気した。フィルターを、９０％ ＥｔＯＨで３回洗浄した。最初に、ＤＮＡを、２００μｌのＴＥ溶液を使用することによってガラス繊維から回収した。室温で３分のインキュベーション後、このＤＮＡ含有溶出物を、脱気し、そして９６ウェルサンプルアーカイブトレイ（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ４３０６７３７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に収集した。２回目の別の溶出を、１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨを用いて行った。
【０１５６】
ほとんどの条件下で、図１４に示されるように、精製ＤＮＡの結合は、乏しかった。チオシアン酸グアニジニウムが結合塩である場合、カチオン性界面活性剤ＤＴＡＢおよびＤＴＡＣｌの存在は、ＤＮＡの回収を阻害するようであった。
【０１５７】
（実施例１７）
ＤＮＡ回収に対するＴｗｅｅｎ−２０の効果を、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０）の非存在下で、実施例１５に示される実験を繰り返して試験した。８マイクログラムの部分剪断仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡ（実施例１５にて調製されるような）を、６００μｌのＤＮＡ結合溶液に添加した。このＤＮＡ結合溶液は、５Ｍの１つの塩（ＮａＳＣＮ、ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮ）、２０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭの緩衝液（ＭＥＳ、ｐＨ６．０；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；またはＡＭＰ、ｐＨ１０のうちの１つ）および１％のカチオン性界面活性剤（ＤＴＡＢ、ＤＴＡＣｌ、または界面活性剤を含まない水（コントロール「Ｎｏ
Ｄｅｔｅｒｇ（界面活性剤なし）」として））を含む。従って、２７個の異なる組み合わせを試験した。ゲノムＤＮＡを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．６１００−０１）を使用する真空濾過によって、ガラスフィルター上に吸着させた。サンプル溶液を、ガラス繊維ＧＦ／Ｂフィルター（９６ウェル形式）に移し、そして２．４ｐｓｉの減圧下で脱気した。フィルターを、９０％ ＥｔＯＨで３回洗浄した。最初に、ＤＮＡを、２００μｌのＴＥ溶液を使用することによってガラス繊維から回収した。室温で３分のインキュベーション後、このＤＮＡ含有溶出物を、脱気し、そして９６ウェルサンプルアーカイブトレイ（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ４３０６７３７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に収集した。２回目の別の溶出を、１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨを用いて行った。
【０１５８】
Ｔｗｅｅｎ ２０の非存在下でさえ、アッセイした全ての条件は、ＤＮＡをガラス繊維ＧＦ／Ｂ膜に結合させた場合に、ＤＮＡの回収をほとんど示さなかった（図１５）。チオシアン酸グアニジニウムおよびＤＴＡＢの存在は、いくらかの回収を示した。カチオン性界面活性剤が、結合中に存在しない場合、ＤＮＡは、３つの全ての塩によってＧＦ／Ｂから回収され得た（図１５）。また、より多くのＤＮＡが、ｐＨ８．０またはｐＨ１０．０よりもｐＨ６．０にて、ＧＦ／Ｂから回収された。
【０１５９】
（実施例１８）
カチオン性界面活性剤ＤＴＡＢの阻害効果をさらに試験した。ＤＴＡＢを、ＤＮＡ結合が固相上で生じる前、ＤＮＡ結合が固相上で生じる間、またはＤＮＡ結合が固相上で生じた後の、精製反応の種々の時点で導入した。ＤＮＡ結合および精製手順を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ６１００上のＧＦ／Ｂガラス繊維フィルター（９６ウェル形式）を使用して行った。種々の精製条件を、図１６において示されるように、Ａ〜Ｄで示す。
【０１６０】
セットＡにおいて、ＧＦ／Ｂ膜を、１％ ＤＴＡＢを含まない（Ａ−）かまたは含む（Ａ＋）、１００μｌの液体で前処理した。次いで、仔ウシ胸腺ＤＮＡ（８μｇ）を、８００μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）中で結合させた。次いで、膜を、９０％エタノールで洗浄し、そして結合した核酸を、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００ｍＭ ＮａＯＨで溶出した。
【０１６１】
セットＢにおいて、膜を前洗浄しなかった。仔ウシ胸腺ＤＮＡ（８μｇ）を、８００μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）中で、ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターに結合させた。結合後、膜を、１％ ＤＴＡＢを含まない（Ｂ−）かまたは含む（Ｂ＋）かのいずれかの、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）において洗浄した。次いで、膜を、９０％エタノールで洗浄し、そして結合した核酸を、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００ｍＭ ＮａＯＨで溶出した。
【０１６２】
セットＣにおいて、膜を前洗浄しなかった。仔ウシ胸腺ＤＮＡ（８μｇ）を、１％ ＤＴＡＢを含まない（Ｃ−）かまたは含む（Ｃ＋）かのいずれかの、８００μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）中で、ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターに結合させた。次いで、膜を、９０％エタノールで洗浄し、そして結合した核酸を、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００ｍＭ ＮａＯＨで溶出した。
【０１６３】
セットＤにおいて、ＧＦ／Ｂ膜を、１％ ＤＴＡＢを含まない（Ａ−）かまたは含む（Ａ＋）、１００μｌの５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）で前処理した。次いで、仔ウシ胸腺ＤＮＡ（８μｇ）を、８００μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）中で結合させた。次いで、膜を、９０％エタノールで洗浄し、そして結合した核酸を、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００ｍＭ ＮａＯＨで溶出した。これらの結果を、図１６に示す。
【０１６４】
ＧＦ／Ｂ膜をＤＴＡＢで前処理し（Ａ＋）、そしてＤＮＡを、ＤＴＡＢを含まないＧｕＳＣＮまたはＮａＢｒの存在下で結合させた場合、ＧＦ／Ｂ膜からのＤＮＡ回収は、ＤＴＡＢで前処理しなかった（Ａ−）ＧＦ／Ｂ膜からの回収と比較して、有意に減少されなかった。従って、この実験において、界面活性剤は、固相と直接的に相互作用して核酸の結合を阻害しないようであった。
【０１６５】
ＤＮＡを、塩の存在下であるがＤＴＡＢの非存在下でＧＦ／Ｂ膜に結合させ、ＤＴＡＢを、洗浄緩衝液としてカオトロピック溶液中に含ませた（Ｂ＋）場合、膜からのＤＮＡ回収は、洗浄緩衝液中にＤＴＡＢが存在しない（Ｂ−）ＧＦ／Ｂ膜からの回収と比較して、有意に減少された。これらの結果は、洗浄工程中のカチオン性界面活性剤の存在は、固相に結合したＤＮＡを除去することを示唆する。
【０１６６】
この実験における固相への結合中のカチオン性界面活性剤の効果は、結合中に使用される塩の組成に関連するようであった。ＮａＢｒが結合塩である場合（ＮａＢｒ Ｃ＋とＮａＢｒ Ｃ−を比較して）、およびＤＴＡＢを結合中に含ませた場合（Ｃ＋）、ＤＮＡの回収は、結合中にＤＴＡＢを含まない場合の回収と比較して、有意に減少された。しかし、ＧｕＳＣＮが結合塩である場合、回収の有意な減少は、見られなかった（ＧｕＳＣＮ Ｃ＋とＧｕＳＣＮ Ｃ−を比較して）。従って、この実験において、塩組成に依存して、結合中のカチオン性界面活性剤の存在は、固相へのＤＮＡ結合を阻害し得る。
【０１６７】
Ａにおけるように、１％ ＤＴＡＢの非存在下（Ｄ−）または存在下（Ｄ＋）の５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）でのＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターの前処理は、核酸のその後の結合に影響しないようであった。
【０１６８】
図１６における結果は、この実験において、ＤＴＡＢが、ＧＦ／Ｂ膜と密接に相互作用してＤＮＡ結合をブロックしなかったことを示す。この研究において、カチオン性界面活性剤は、結合反応中に存在する場合、ＧＦ／Ｂ膜へのＤＮＡの結合をブロックした。さらに、この研究において、一旦ＤＮＡを（カチオン性界面活性剤の非存在下で）結合させると、その後の洗浄工程中のカチオン性界面活性剤の存在は、結合されたＤＮＡの膜から除去を生じた。
【０１６９】
（実施例１９）
ガラス繊維ＧＦ／Ｂ膜へのＤＮＡ結合を干渉したプロテアーゼ消化反応の成分を同定することを試みるために、ＣａＣｌ２、アウリントリカルボン酸およびＴｗｅｅｎ ２０の各々を、ＤＮＡ結合反応において別々に評価した。ＤＮＡの結合および回収は、サンプル中のタンパク質の存在によって影響され得るので、結合を、１３％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の存在下または非存在下で行った。
【０１７０】
この研究において、より高い濃度でのＣａＣｌ２（図２０）、アウリントリカルボン酸（図１８）およびＴｗｅｅｎ ２０（図１９）の添加が、全て、ＧＦ／Ｂ膜からのＤＮＡの回収を増加した。アウリントリカルボン酸を、１０μＭ〜３２０μＭまでの２倍増分の６つの濃度で評価し、ＤＴＡＢおよびＴｗｅｅｎ ２０の両方を、１％〜１６％までの２倍増分の５つの濃度レベルで評価した。ＤＮＡを、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで別に溶出した。最大の増加が、１０μＭのアウリントリカルボン酸（図１８）、２０％のＴｗｅｅｎ−２０（図１９）、および２０ｍＭのＣａＣｌ２（図２０）で見出された。
【０１７１】
対照的に、この研究において、カチオン性界面活性剤ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）の存在は、ＤＮＡの回収を有意に減少させた（図１７）。さらに、回収されたＤＮＡは、ＧＦ／Ｂ膜に非常に密接に結合され、その結果、ＤＮＡのほとんどが、０．１Ｎ ＮａＯＨでのみ溶出されて回収された。
【０１７２】
（実施例２０）
ＤＮＡ回収を阻害する主要成分としてカチオン性界面活性剤を同定したので、阻害性効果を打ち消す非イオン性界面活性剤の能力を試験した。仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡ（８μｇ）を、漸増濃度のＴｗｅｅｎ ２０と共に０％、１％および４％のドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）の存在下で、ガラス繊維ＧＦ／Ｂ膜に結合させた。
【０１７３】
結合緩衝液もまた、５Ｍ ＧｕＳＣＮ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、および５０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ６．０）を含んだ。ＤＮＡを、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで別に溶出した。全ての結合工程および溶出工程を、周囲温度で行った。
【０１７４】
カチオン性界面活性剤の非存在下（０％ ＤＴＡＢ）であるが、漸増Ｔｗｅｅｎ ２０濃度下で、ＤＮＡ回収は、任意の非イオン性界面活性剤の非存在下で観察された（図２１）。回収されたＤＮＡの量は、Ｔｗｅｅｎ ２０の濃度が少なくとも１％に増加された場合に、有意に増加した（図２１）。
【０１７５】
１％のＤＴＡＢの存在下で、繊維からのＤＮＡ回収は、Ｔｗｅｅｎ−２０の非存在下で完全に阻害された（図２２）。少なくとも２％の濃度へのＴｗｅｅｎ ２０の添加は、カチオン性界面活性剤の阻害効果を実質的にブロックした（図２２）。４％のＤＴＡＢの存在下で、少なくとも４％のＴｗｅｅｎ−２０の濃度が、カチオン性界面活性剤の阻害効果を実質的にブロックした（図２３）。この研究において、適切な量のＴｗｅｅｎ−２０を結合反応に添加した場合、ガラス繊維ＧＦ／Ｂフィルターから回収されるゲノムＤＮＡの量は、カチオン性界面活性剤の存在によって影響されなかった（図２４）。さらに、結合されたＤＮＡのほとんどは、ＴＥ溶出によって回収され、そしてアルカリ溶出緩衝液を必要としなかった（図２５）。
【０１７６】
（実施例２１）
組織解離方法の特定の成分の存在下でのガラス繊維ＧＦ／Ｂ膜へのゲノムＤＮＡの結合を生じる条件が同定されたので、ラット尾組織由来のＤＮＡを単離する能力を試験した。この実施例において、２つのガラス繊維膜ＧＦ／ＢおよびＧＦ／Ｄを試験した。
【０１７７】
ラット尾切片（５０ｍｇ）を、２００μｌの溶液（１ｍｇのプロテイナーゼＫ、１％のＤＴＡＢ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０μＭのＡＴＡおよび２０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する）を含む微量遠心チューブ中で消化した。反応チューブを、全てのサンプルが消化されるまで、混合しながら６５℃でインキュベートした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｍｏｄｅｌ ５４３６）。未消化の骨および毛を含む濁った溶液にまでラット尾切片を減少させるのに、４５〜５０分要した。次いで、消化物を、５Ｍ ＧｕＳＣＮ、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび６％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む６００μｌの結合溶液によって清澄化した。次いで、チューブの底に骨および未消化粒子を残して、ＧＦ／ＢフィルターまたはＧＦ／Ｄフィルターにその溶液を移すことによって、放出されたＤＮＡをこのフィルターに結合させた。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ６１００上でのサンプルの真空媒介脱気後、フィルターを、９０％エタノールで洗浄した。ゲノムＤＮＡを、１５０μｌのＴＥまたは０．０１ＮのＮａＯＨの溶液いずれかの溶液で溶出した。回収されたＤＮＡの完全性を可視化するために、得られた溶出液の２０μｌを、１％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロミド染色した（図２８）。
【０１７８】
この研究において、ガラス繊維フィルターＧＦ／Ｂは、ＧＦ／Ｄよりも、ゲノムＤＮＡ回収に優れていた（図２６）。ＴＥと比較して、０．０１Ｎ ＮａＯＨで溶出した場合に、より多くの量のＤＮＡが回収された。ほとんどのＤＮＡは、０．０１Ｎ ＮａＯＨで膜から回収されたが、いくらかのＤＮＡは、膜に残ったままであり、これは、０．１Ｎ ＮａＯＨでのさらなる溶出で確認された（図２７）。回収されたＤＮＡは、図２８に示されるように、高分子量のＤＮＡである。
【０１７９】
（実施例２２）
実施例２１からのプロセスを使用して、いくつかのラット組織およびマウス尾からゲノムＤＮＡを単離した。ラット筋肉、肝臓、肺、膵臓、腎臓、脳、小腸および尾の５０ｍｇの切片、ならびにマウス尾の５０ｍｇ切片を、２００μｌの消化溶液を含む微量遠心チューブに置いた。この消化溶液は、１ｍｇのプロテイナーゼＫ、１％のＤＴＡＢ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０μＭのＡＴＡおよび２０ｍＭのＣａＣｌ２を含んだ。
【０１８０】
３つの同一のサンプルを、各組織型について処理した。これらの反応チューブを、混合しながら６５℃で、６０分間インキュベートした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｍｏｄｅｌ ５４３６）。各組織の消化時間を記録し、そして６０分の終了時に、未消化組織の量を決定した。５０ｍｇの種々のげっ歯類組織を分解するのに要した時間量を、表１４に示す。
表１４
【０１８１】
【表１４】
【０１８２】
＊１〜３ｍｇの組織が、６０℃での６０分間のインキュベーション後に未消化のままであった。
【０１８３】
表１４に示されるように、これらの組織のほとんどが、１時間未満で効果的に消化された。肝臓、脳および腎臓の消化は、１時間後に約９５％完了した。
【０１８４】
６０分間の消化後、次いで、６００μｌの結合溶液を各サンプルに加えた。結合溶液は、５Ｍ ＧｕＳＣＮ、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび６％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含んだ。次いで、サンプルを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ６１００上のＧＦ／Ｂフィルター膜上に置いた。次いで、フィルターを、９０％エタノールで洗浄した。ゲノムＤＮＡを、１００μｌの０．０１ＮのＮａＯＨ溶液で溶出し、そしてその最初の溶出物を、１００μｌの１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．０で中和した。得られた２００μｌの溶出物のうち、２０μｌを、１％アガロース上での電気泳動（１０μｌ／レーン）に使用した（図３０）。回収されたＤＮＡは、図３０に見られるように、高分子量のＤＮＡであった。
【０１８５】
総ゲノムＤＮＡ回収率を、図２９に示す。ゲノムＤＮＡの総量（１ウェルあたりのｇＤＮＡのμｇ）を、グラフの左の目盛りによって測定されるように、棒グラフで示す。ＤＮＡの相対純度を、黒菱形で示し、そしてグラフの右の目盛りによって示される、２８０ｎｍに対する２６０ｎｍのＵＶ吸収の比によって測定する。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】図１は、４０ｆｇ／ｍｌ〜４０ｕｇ／ｍｌの範囲の濃度においてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋでインキュベートされた、色素標識されたカゼイン基質の蛍光強度（蛍光単位で測定される）を示す。
【図２Ａ】図２は、色素標識されたカゼイン基質のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ消化に対する、様々な界面活性剤の効果を図示する。図２Ａは、２０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｂは、２．５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｃは、１．２５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示す。テトラアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きのダイヤ）は、カチオン性界面活性剤である、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および混合された臭化アルキルトリメチルアンモニウムの平均データを示す。ベジルアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きの丸）は、カチオン性界面活性剤である、塩化ベンズアルコニウム、臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、および塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムの平均データを示す。Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍの記号（×）は、カチオン性界面活性剤である、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＳＤＣ−８５、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＫＰ、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＷＬＥおよびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥの平均データを示す。ポリクオーターニウム（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｕｍ）の記号（黒塗りの丸）は、カチオンポリマーである、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００６、およびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００７の平均データを示す。水（黒塗りのダイヤ）を使用して得られた結果、およびアニオン性の界面活性剤ＳＤＳ（黒塗りの四角）を使用して得られた結果もまた示される。エラーバーは、各データセットの標準偏差を示す。
【図２Ｂ】図２は、色素標識されたカゼイン基質のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ消化に対する、様々な界面活性剤の効果を図示する。図２Ａは、２０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｂは、２．５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｃは、１．２５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示す。テトラアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きのダイヤ）は、カチオン性界面活性剤である、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および混合された臭化アルキルトリメチルアンモニウムの平均データを示す。ベジルアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きの丸）は、カチオン性界面活性剤である、塩化ベンズアルコニウム、臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、および塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムの平均データを示す。Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍの記号（×）は、カチオン性界面活性剤である、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＳＤＣ−８５、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＫＰ、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＷＬＥおよびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥの平均データを示す。ポリクオーターニウム（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｕｍ）の記号（黒塗りの丸）は、カチオンポリマーである、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００６、およびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００７の平均データを示す。水（黒塗りのダイヤ）を使用して得られた結果、およびアニオン性の界面活性剤ＳＤＳ（黒塗りの四角）を使用して得られた結果もまた示される。エラーバーは、各データセットの標準偏差を示す。
【図２Ｃ】図２は、色素標識されたカゼイン基質のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ消化に対する、様々な界面活性剤の効果を図示する。図２Ａは、２０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｂは、２．５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｃは、１．２５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示す。テトラアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きのダイヤ）は、カチオン性界面活性剤である、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および混合された臭化アルキルトリメチルアンモニウムの平均データを示す。ベジルアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きの丸）は、カチオン性界面活性剤である、塩化ベンズアルコニウム、臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、および塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムの平均データを示す。Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍの記号（×）は、カチオン性界面活性剤である、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＳＤＣ−８５、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＫＰ、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＷＬＥおよびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥの平均データを示す。ポリクオーターニウム（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｕｍ）の記号（黒塗りの丸）は、カチオンポリマーである、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００６、およびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００７の平均データを示す。水（黒塗りのダイヤ）を使用して得られた結果、およびアニオン性の界面活性剤ＳＤＳ（黒塗りの四角）を使用して得られた結果もまた示される。エラーバーは、各データセットの標準偏差を示す。
【図３】図３は、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋおよび様々な界面活性剤を含む、反応組成物を使用して遊離された、μｇ核酸／ｍｇサンプルで測定される、核酸の量を図示する。
【図４−１】図４は、表示された界面活性剤を含む反応組成物とのインキュベーションに続いて、遊離された核酸（上清）の量とサンプル中に残る核酸（ペレット）との間の比較を提供する、染色されたアガロースゲルを示す。
【図４−２】図４は、表示された界面活性剤を含む反応組成物とのインキュベーションに続いて、遊離された核酸（上清）の量とサンプル中に残る核酸（ペレット）との間の比較を提供する、染色されたアガロースゲルを示す。
【図５】図５は、２ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋおよび示される界面活性剤を含む反応組成物中で、４５℃で２０分間、インキュベートされた肝臓片から、遊離および単離された核酸の量を図示する。これらの図において使用する場合、ＮＭＰは１−メチル−２−ピロリジノンである。
【図６】図６は、遊離および単離された、図５の核酸の品質（完全性）を実証する、臭化エチジウム染色されたアガロースゲルを示す。
【図７】図７は、１ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋおよび表示された界面活性剤および添加剤を含む、反応組成物中で、４５℃で３０分間インキュベートされた肝臓片から、遊離および単離された核酸の量を図示する。これらの図において使用する場合、「無し」は、さらなる界面活性剤が添加されなかったことを意味する。
【図８】図８は、遊離および単離された、図７の核酸の品質（完全性）を実証する臭化エチジウム染色されたアガロースゲルを示す。
【図９】図９は、１ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋおよび表示された界面活性剤および添加剤を含む、反応組成物中で、４５℃で３０分間インキュベートをする前の、前処理溶液に肝臓片を曝露する工程の効果を図示する。これらの図において使用される場合、ＨＴＳＰ ２Ｘは、核酸精製リジン溶液を意味し；ＡｃｒＯｒは、アクリジンオレンジを意味する。
【図１０】図１０は、界面活性剤：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処置の前に、前処理溶液中でインキュベートされたサンプルから、遊離および単離された核酸の質を示す、染色されたアガロースゲルを示す。
【図１１】図１１は、可変量のアウリントリカルボン酸を含む反応組成物を使用して、遊離および単離された核酸の量を質を示す、染色されたアガロースゲルを示す。
【図１２】図１２は、様々なカチオン性化合物を用いて、遊離および単離された、核酸の量および完全性の比較を提供する、染色されたアガロースゲルを示す。
【図１３】図１３は、ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて初めに溶出し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨを用いて溶出した時の、５ＭのＧｕＳＣＮ、２％のＴｗｅｅｎ ２０中で、異なる種々の界面活性剤を使用した、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ消化されたラットの尾からのゲノムＤＮＡの回収の平均有効性を示す。値は、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１４】図１４は、ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて初めに溶出し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨを用いて溶出した時の、異なる多数のｐＨ値、塩、および界面活性剤を使用した、２％のＴｗｅｅｎ ２０の存在下におけるグラスファイバーＧＦ／ＢフィルターからのゲノムＤＮＡの回収の有効性を示す。値は、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１５】図１５は、ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて初めに溶離し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨを用いて溶離した時の、異なる多数のｐＨレベル、塩、および界面活性剤を使用した、Ｔｗｅｅｎ ２０の非存在下におけるグラスファイバーＧＦ／ＢフィルターからのゲノムＤＮＡの回収の有効性を示す。値は、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１６】図１６は、カチオン性界面活性剤、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）を、ＤＮＡ結合の前、結合の間、結合の後に添加した場合の、ＤＮＡ回収に対する効果を示す。値は、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１７】図１７は、ＴＥを用いて初めに溶出し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨで溶出した時の、ＤＴＡＢ濃度の関数としての、１％のウシ胎仔血清を含む緩衝液からのゲノムＤＮＡの回収を示す。値は、２つの溶出工程後の、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１８】図１８は、ＴＥを用いて初めに溶出し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨで溶出した時の、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）濃度の関数としての、１％のウシ胎仔血清を含む緩衝液からのゲノムＤＮＡの回収を示す。値は、２つの溶出工程後の、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１９】図１９は、ＴＥを用いて初めに溶出し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨで溶出した時の、Ｔｗｅｅｎ ２０濃度の関数としての、１％ウシ胎仔血清を含む緩衝液からのゲノムＤＮＡの回収を示す。値は、２つの溶出工程後の、核酸の累積的な遊離を示す。
【図２０】図２０は、ＴＥを用いて最初に溶出し、続いて１００ｍＭ ＮａＯＨを用いて溶出した場合の、ＣａＣｌ２濃度の関数としての、１％胎仔ウシ血清を含む緩衝液からのゲノムＤＮＡの回収を示す。値は、２つの溶出工程後の、核酸の累積した解離を示す。
【図２１】図２１は、ＤＴＡＢを欠く３．７５Ｍ チオシアン酸グアニジニウムの存在下での、ＧＦ／ＢフィルターへのゲノムＤＮＡの結合に対する、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度の効果を示す。値は、ＴＥ、１００ｍＭ ＮａＯＨを用いて溶出された際に解離された核酸の量、および２つの条件下で溶出された正味の量を示す。
【図２２】図２２は、３．７５Ｍ チオシアン酸グアニジニウムおよび１％ ＤＴＡＢの存在下での、ＧＦ／ＢフィルターへのゲノムＤＮＡの結合に対する、Ｔｗｅｅｎ２０濃度の効果を示す。値は、ＴＥ、１００ｍＭ ＮａＯＨを用いて溶出された際に解離された核酸の量、および２つの条件下で溶出された正味の量を示す。
【図２３】図２３は、３．７５Ｍ チオシアン酸グアニジニウムおよび４％ ＤＴＡＢの存在下での、ＧＦ／ＢフィルターへのゲノムＤＮＡの結合に対する、Ｔｗｅｅｎ２０濃度の効果を示す。値は、ＴＥ、１００ｍＭ ＮａＯＨを用いて溶出された際に解離された核酸の量、および２つの条件下で溶出された正味の量を示す。
【図２４】図２４は、示されたＤＴＡＢ濃度の存在下でのＧＦ／ＢフィルターへのゲノムＤＮＡの結合およびＴＥを用いた溶出、続くＮａＯＨを用いた溶出に対する、Ｔｗｅｅｎ２０の効果を示す。
【図２５】図２５は、示されたＤＴＡＢ濃度の存在下でのＧＦ／ＢフィルターへのゲノムＤＮＡの結合およびＴＥを用いた溶出による回収に対する、Ｔｗｅｅｎ２０濃度の効果を示す。
【図２６】図２６は、ＧＦ／ＢまたはＧＦ／Ｄガラスフィルターのいずれか、および０．０１Ｎ ＮａＯＨまたはＴＥのいずれかを用いた、ラット尾部（約５０ｍｇ）からのゲノムＤＮＡの回収を示す。
【図２７】図２７は、最初に０．０１Ｎ ＮａＯＨまたはＴＥで溶出したＧＦ／ＢまたはＧＦ／Ｄガラスファイバーフィルターからの、０．１Ｎ ＮａＯＨを用いる第２溶出後の、ラット尾部（約５０ｍｇ）から回収した総ゲノムＤＮＡを示す。
【図２８】図２８は、１ｍｇのプロテイナーゼＫおよび１％のＤＴＡＢを用いて消化し、３．７５Ｍ ＧｕＳＣＮおよび４．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０の存在下でＧＦ／ＢまたはＧＦ／Ｄフィルターに結合させた、５０ｍｇのラット尾部切片由来のゲノムＤＮＡを示す。ゲノムＤＮＡを、１５０μｌのＴＥで溶出し、続いて０．０１ＮのＮａＯＨを用いて溶出した。この溶出物のうち、２０μｌ（全サンプルの１４％）を、１％ アガロース上でのゲル電気泳動に使用した。
【図２９】図２９は、５０ｍｇの種々のげっ歯類組織から回収したゲノムＤＮＡを示す。組織を、１％ ＤＴＡＢの存在下で１ｍｇのプロテイナーゼＫで消化した。解離した核酸を、４．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む３．７５Ｍ チオシアン酸グアニジニウムの存在下でＧＦ／Ｄ膜に結合させた。
【図３０】図３０は、１ｍｇのプロテイナーゼＫおよび１％のＤＴＡＢを用いて消化し、３．７５Ｍ ＧｕＳＣＮおよび４．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０の存在下でＧＦ／Ｂフィルターに結合させた、５０ｍｇのラット組織切片および３５ｍｇのマウス尾部切片由来のゲノムＤＮＡを示す。ゲノムＤＮＡを、１００μｌの０．０１Ｎ ＮａＯＨで溶出し、続いて１００μｌのＴＥを用いて溶出した。ゲル電気泳動（１％アガロース上）に関して、各溶出物の１５μｌを使用した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全組織を含む生物学的サンプルからの、核酸の遊離および単離のための組成物および方法に関連する。本発明はまた、生物学的サンプルからの核酸の単離および／または遊離のためのキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的サンプルから核酸を単離するための現行の方法としては、組織の浸軟、細胞の溶解、ならびにカオトロピズム塩（グアニジン塩酸塩、またはチオシアン酸グアニジニウムなど）、および非イオン性界面活性剤を用いるヌクレアーゼの不活性化が挙げられ得る。次いで、遊離された核酸は、溶液から選択的に沈殿され得る。
【０００３】
様々な化学分解方法（界面活性剤、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）、プロテアーゼ、胆汁酸塩、有機溶媒、および過酷な酸性条件または過酷な塩基性条件を用いる）が、組織を浸軟し、核酸を遊離させるために使用されている。そのような方法を使用して得られる核酸は、長いインキュベーション時間または過酷な条件への曝露が原因で、分解され得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の概要）
特定の実施形態において、生物学的サンプルからの核酸の遊離のための組成物が、提供される。特定の実施形態において、この組成物は、少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、少なくとも１つのプロテアーゼ、および緩衝液を含む。
【０００５】
特定の実施形態において、生物学的サンプルから核酸を遊離する方法が、提供される。特定の実施形態において、生体から核酸を単離する方法が、提供される。特定の実施形態において、これらの方法は、反応組成物を形成するために、少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、少なくとも１つのプロテアーゼ、および緩衝液とサンプルとを混合する工程を含む。特定の実施形態において、この反応組成物は、第２の界面活性剤をさらに含む。特定の実施形態において、この反応組成物は、塩をさらに含む。特定の実施形態において、この反応組成物は、生物学的サンプルから核酸を遊離するのに、適した条件下でインキュベートされる。特定の実施形態において、遊離された核酸は、次いで、単離される。
【０００６】
特定の実施形態において、生物学的サンプルから核酸を単離および／または遊離するためのキットがまた、提供される。特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのカチオン性界面活性剤および少なくとも１つのプロテアーゼを含むキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、第２の界面活性剤、塩、有機抽出剤、有機沈殿剤、可溶化剤、核酸結合固相、またはこれらの成分の組合せをさらに含む。
【０００７】
特定の実施形態に従って、生物学的サンプルから核酸を得る方法、および固相に核酸を結合する方法が、提供される。特定の実施形態において、この方法は、生物学的サンプルと、（プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤を含む）破壊緩衝液とを接触させる工程、および核酸を固相へ結合させる工程を含む。特定の実施形態において、この方法は、生物学的サンプルと、（プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤を含む）破壊緩衝液とを接触させる工程、およびカチオン性界面活性剤を実質的に中和する工程、および核酸を固相に結合する工程を含む。
【０００８】
特定の実施形態に従って、プロテアーゼ、カチオン性界面活性剤および第２の界面活性剤を含むキットが、提供される。第２の界面活性剤は、プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤の存在下で、核酸の固相への結合を可能にする。
【０００９】
特定の実施形態に従って、生物学的サンプルから核酸を得るためのキットが提供され、このキットは、プロテアーゼ、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤を含む。ここで、非イオン性界面活性剤は、プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤、および高塩緩衝液の存在下で、核酸の固相への結合を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（実施形態の詳細な説明）
本発明においては、以下が提供される。
（項目１） 生物学的サンプルから核酸を得て、そして該核酸を固相に結合させるための方法であって、以下：
該生物学的サンプルに破壊緩衝液を接触させる工程であって、該破壊緩衝液は、以下：
プロテアーゼ；および
カチオン性界面活性剤、
を含む、工程；
該カチオン性界面活性剤を実質的に中和する工程；ならびに
該核酸を固相に結合させる工程、
を包含する、方法。
（項目２） 項目１に記載の方法であって、前記緩衝剤のｐＨがｐＨ８よりも上昇される場合に、前記カチオン性界面活性剤が沈殿しない、方法。
（項目３） 項目１に記載の方法であって、前記カチオン性界面活性剤を実質的に中和する工程が、該カチオン性界面活性剤を除去することを包含する、方法。
（項目４） 項目１に記載の方法であって、前記カチオン性界面活性剤を実質的に中和する工程が、該カチオン性界面活性剤を実質的に中和する第２の界面活性剤を添加することを包含する、方法。
（項目５） 項目４に記載の方法であって、前記界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣｌ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣｌ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＡＣｌ）、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＥＤＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｄ１０ＴＡＢ）、およびドデシルトリフェニルホスホニウムブロミド（ＤＴＰＢ）からなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目６） 塩を添加する工程をさらに包含する、項目４に記載の方法。
（項目７） 項目６に記載の方法であって、前記塩が、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌおよびＧｕＳＣＮからなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目８） 項目６に記載の方法であって、前記塩が、ＣａＣｌ２であり、そして少なくとも２０ｍＭの濃度で存在する、方法。
（項目９） 前記第２の界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、項目４に記載の方法。
（項目１０） 項目９に記載の方法であって、前記非イオン性界面活性剤が、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）からなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目１１） 前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）である、項目９に記載の方法。
（項目１２） 前記Ｔｗｅｅｎ ２０が、少なくとも４％ ｗ／ｗの濃度で存在する、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 前記Ｔｗｅｅｎ ２０が、２０％ ｗ／ｗの濃度で存在する、項目１２に記載の方法。
（項目１４） 前記プロテアーゼが、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリセリンプロテアーゼからなる群の少なくとも１つから選択される、項目１に記載の方法。
（項目１５） 項目１４に記載の方法であって、前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、ディスパーゼ、サブチリシンＣａｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼＡ、およびサーモリシンからなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目１６） 前記プロテアーゼが、熱安定性プロテアーゼである、項目１に記載の方法。
（項目１７） 項目１６に記載の方法であって、前記熱安定性プロテアーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏからなる群の少なくとも１つから選択される生物から単離される、方法。
（項目１８） 前記破壊緩衝液が、リボヌクレアーゼインヒビターをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目１９） 項目１８に記載の方法であって、前記リボヌクレアーゼインヒビターが、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸）、硫酸亜鉛、ブロモピルベート、ホルムアミド、銅、および亜鉛からなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目２０） 前記リボヌクレアーゼインヒビターが、アウリントリカルボン酸である、項目１８に記載の方法。
（項目２１） 前記アウリントリカルボン酸が、１０μＭの濃度で存在する、項目２０に記載の方法。
（項目２２） デオキシリボヌクレアーゼインヒビターを添加する工程をさらに包含する、項目４に記載の方法。
（項目２３） 前記デオキシリボヌクレアーゼインヒビターが、二価カチオンキレート剤を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４） 前記二価カチオンキレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＰＴＡからなる群の少なくとも１つから選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５） 生物学的サンプルから核酸を得て、そして該核酸を固相に結合させるための方法であって、以下：
該生物学的サンプルに破壊緩衝液を接触させる工程であって、該破壊緩衝液は、以下：
プロテアーゼ；および
カチオン性界面活性剤、
を含む、工程；ならびに
該核酸を固相に結合させる工程、
を包含する、方法。
（項目２６） 項目２５に記載の方法であって、前記カチオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣｌ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣｌ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＡＣｌ）、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＥＤＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｄ１０ＴＡＢ）、およびドデシルトリフェニルホスホニウムブロミド（ＤＴＰＢ）からなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目２７） 塩を添加する工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２８） 項目２７に記載の方法であって、前記塩が、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌおよびＧｕＳＣＮからなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目２９） 項目２７に記載の方法であって、前記塩が、ＣａＣｌ２であり、そして少なくとも２０ｍＭの濃度で存在する、方法。
（項目３０） 前記プロテアーゼが、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリセリンプロテアーゼからなる群の少なくとも１つから選択される、項目２５に記載の方法。
（項目３１） 項目３０に記載の方法であって、前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、ディスパーゼ、サブチリシンＣａｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼＡ、およびサーモリシンからなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目３２） 前記プロテアーゼが、熱安定性プロテアーゼである、項目２５に記載の方法。
（項目３３） 項目３２に記載の方法であって、前記熱安定性プロテアーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏからなる群の少なくとも１つから選択される生物から単離される、方法。
（項目３４） 前記破壊緩衝液が、リボヌクレアーゼインヒビターをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目３５） 項目３４に記載の方法であって、前記リボヌクレアーゼインヒビターが、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸）、硫酸亜鉛、ブロモピルベート、ホルムアミド、銅、および亜鉛からなる群の少なくとも１つから選択される、方法。
（項目３６） 前記リボヌクレアーゼインヒビターが、アウリントリカルボン酸である、項目３４に記載の方法。
（項目３７） 前記アウリントリカルボン酸が、１０μＭの濃度で存在する、項目３６に記載の方法。
（項目３８） デオキシリボヌクレアーゼインヒビターを添加する工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目３９） 前記デオキシリボヌクレアーゼインヒビターが、二価カチオンキレート剤を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 前記二価カチオンキレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＰＴＡからなる群の少なくとも１つから選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４１） キットであって、以下：
プロテアーゼ；
カチオン性界面活性剤；および
第２の界面活性剤
を備え、該第２の界面活性剤が、該カチオン性界面活性剤を実質的に中和する、キット。
（項目４２） 項目４１に記載のキットであって、前記緩衝剤のｐＨがｐＨ８よりも上昇される場合に、前記カチオン性界面活性剤が沈殿しない、キット。
（項目４３） 項目４１に記載のキットであって、前記カチオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣｌ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣｌ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＡＣｌ）、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＥＤＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｄ１０ＴＡＢ）、およびドデシルトリフェニルホスホニウムブロミド（ＤＴＰＢ）からなる群の少なくとも１つから選択される、キット。
（項目４４） 前記プロテアーゼが、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリセリンプロテアーゼからなる群の少なくとも１つから選択される、項目４１に記載のキット。
（項目４５） 項目４４に記載のキットであって、前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、ディスパーゼ、サブチリシンＣａｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼＡ、およびサーモリシンからなる群の少なくとも１つから選択される、キット。
（項目４６） 前記プロテアーゼが、熱安定性プロテアーゼである、項目４１に記載のキット。
（項目４７） 項目４６に記載のキットであって、前記熱安定性プロテアーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏからなる群の少なくとも１つから選択される生物から単離される、キット。
（項目４８） リボヌクレアーゼインヒビターをさらに備える、項目４１に記載のキット。
（項目４９） 項目４８に記載のキットであって、前記リボヌクレアーゼインヒビターが、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸）、硫酸亜鉛、ブロモピルベート、ホルムアミド、銅、および亜鉛からなる群の少なくとも１つから選択される、キット。
（項目５０） 前記リボヌクレアーゼインヒビターが、アウリントリカルボン酸である、項目４８に記載のキット。
（項目５１） 前記アウリントリカルボン酸が、１０μＭの濃度で存在する、項目５０に記載のキット。
（項目５２） デオキシリボヌクレアーゼインヒビターをさらに備える、項目４１に記載のキット。
（項目５３） 前記デオキシリボヌクレアーゼインヒビターが、二価カチオンキレート剤を備える、項目５２に記載のキット。
（項目５４） 前記二価カチオンキレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＰＴＡからなる群の少なくとも１つから選択される、項目５３に記載のキット。
（項目５５） 塩をさらに備える、項目４１に記載のキット。
（項目５６） 項目５５に記載のキットであって、前記塩が、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌおよびＧｕＳＣＮからなる群から選択される、キット。
（項目５７） 前記塩が、ＣａＣｌ２である、項目５５に記載のキット。
（項目５８） 前記ＣａＣｌ２が、少なくとも２０ｍＭの濃度で存在する、項目５７に記載のキット。
（項目５９） 前記第２の界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、項目４１に記載のキット。
（項目６０） 項目５９に記載のキットであって、前記非イオン性界面活性剤が、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）からなる群から選択される、キット。
（項目６１） 前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）である、項目５９に記載のキット。
（項目６２） 前記Ｔｗｅｅｎ ２０が、少なくとも４％ ｗ／ｗの濃度で存在する、項目６１に記載のキット。
（項目６３） 前記Ｔｗｅｅｎ ２０が、２０％ ｗ／ｗの濃度で存在する、項目６１に記載のキット。
（項目６４） 生物学的サンプルから核酸を得るためのキットであって、以下：
プロテアーゼ；
カチオン性界面活性剤；
非イオン性界面活性剤であって、該非イオン性界面活性剤は、該プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤の存在下で、固相への核酸の結合を可能にする、非イオン性界面活性剤；および
高塩濃度を有する緩衝液
を備える、キット。
【００１１】
上記の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方が、例示および説明のみのためであり、そして特許請求される本発明の限定ではないことが、理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は、他に特に示されない限り、複数形を含む。本出願において、「または」の使用は、他に特に示されない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の形態（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」）の使用は、限定ではない。
【００１２】
本明細書中に使用される節の見出しは、編成目的のみのためであり、記載される本件事項を制限するものとして解釈されるべきではない。本出願に引用される全文書（特許、特許出願、論文、書籍、および学術論文が挙げられるが、これらに限定されない）は、その全体がいずれかの目的のために参考として明確に引用される。
【００１３】
（定義）
用語「アルキル基」は、直鎖アルカン、分枝アルカン、または環状アルカンに基づく炭化水素部分をいう。直鎖アルカンは、一般化学式ＣｎＨ２ｎ＋２（ここでＣは、炭素原子を表し、Ｈは水素原子を表し、そしてｎは自然数を表す）を有する有機化合物である。例示的な直鎖アルカンとしては、メタン（ＣＨ４）、エタン（Ｃ２Ｈ６）、プロパン（Ｃ３Ｈ８）、ブタン（Ｃ４Ｈ１０）、オクタンなどが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な分枝アルカンとしては、イソブタン（Ｃ４Ｈ１０）、イソペンタン（Ｃ５Ｈ１２）などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な環状アルカンとしては、シクロブタン（Ｃ４Ｈ８）、シクロヘキサン（Ｃ６Ｈ１２）などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアルキル基としては、メチル（−ＣＨ３）、プロピル（−Ｃ３Ｈ７）、オクチル（−Ｃ８Ｈ１７）などが挙げられるが、これらに限定されない。アルカンは、代表的に不活性であるが、アルキル基はほかの分子と組み合わされて化合物を形成し得る。例えば、イソプロピルアルコール（Ｃ３Ｈ７ＯＨ）は、プロピル基を含むアルコールである。アルキル基およびアルカンの一般的な考察は、とりわけ、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版、Ａｌｌｙｎ ａｎｄ Ｂａｃｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，１９７３；ならびにＶｏｌｌｈａｒｄｔ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８７に見出され得る。
【００１４】
用語「アリール基」は、ベンゼンまたは他の芳香族化合物に基づく炭化水素部分をいう。アリール基は、アルキル基のように、他の分子を組み合わされて、化合物を形成し得る。芳香族化合物およびアリール基の一般的な考察は、とりわけ、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版、Ａｌｌｙｎ ａｎｄ Ｂａｃｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，１９７３；ならびにＶｏｌｌｈａｒｄｔ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８７，特に、第１９章に見出され得る。
【００１５】
用語「生物学的サンプル」は、広義に使用され、核酸を含む種々の生物学的供給源を含むことが意図される。このような供給源としては、組織全体（生検材料および吸引物を含む）；インビトロ培養細胞（初代細胞および二次細胞、形質転換細胞株、ならびに組織および細胞外植片を含む）；全血、赤血球、白血球、およびリンパ；ならびに体液（例えば、尿、唾液、精液、分泌物、洗眼水および吸引物、肺洗浄水および吸引物）が挙げられるが、これらに限定されない。真菌および植物組織（例えば、葉、根、幹、およびキャップ）もまた、本発明の範囲内である。生物学的サンプル上または生物学的サンプル中に存在し得る微生物およびウイルスは、本発明の範囲内である。細菌細胞もまた、本発明の範囲内である。
【００１６】
用語「緩衝液」は、本明細書中に使用される場合、酸または塩基がその溶液に添加された場合に、ｐＨの変化に抵抗する水溶液または組成物をいう。ｐＨ変化に対するこの抵抗性は、その溶液の緩衝作用に起因する。緩衝活性を示す溶液は、緩衝液または緩衝溶液と呼ばれる。緩衝液は、代表的に、溶液または組成物のｐＨを維持する無制限の能力は有さない。むしろ、緩衝液は、代表的に、特定の範囲内のｐＨ（例えば、ｐＨ５とｐＨ７との間）を維持し得る。一般的に、Ｃ．Ｍｏｈａｎ，Ｂｕｆｆｅｒｓ，Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，１９９９を参照のこと。例示的な緩衝液としては、ＭＥＳ（［２−（Ｎ−モルホリノ（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｉｌｉｎｏ））エタンスルホン酸］）、ＡＤＡ（Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノジ酢酸）、Ｔｒｉｓ（［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］；Ｔｒｉｚｍａとしても公知）；Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ；ＡＣＥＳ；ＰＩＰＥＳ；ＭＯＰＳなど（全てＳｉｇｍａから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
特定のｐＨ範囲内（例えば、ｐＨ５とｐＨ７との間）でｐＨを維持する緩衝液、および本明細書中に使用されるような類似の用語は、示されたｐＨ範囲内のいくつかの点で緩衝作用を示す、任意の緩衝液を含むことが意図される。従って、この用語は、示された範囲全体内で緩衝能力を示さない緩衝液、および示された範囲を超えて緩衝能力を有する緩衝液を含む。例えば、溶液Ａは、ｐＨ５．２とｐＨ６．７との間で緩衝能力を示し得、溶液Ｂは、ｐＨ６．０とｐＨ８．０との間で緩衝能力を示し得る。本発明のために、これらの溶液は両方とも、ｐＨ５．０〜ｐＨ７．０の範囲内でｐＨを維持する緩衝液とみなされる。当業者は、緩衝液の表を用いて、特定された範囲間でｐＨを維持するための適切な緩衝液を同定し得る。緩衝液の表は、特に、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ２０００−２００１ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃａｔａｌｏｇ ８１〜８２頁、およびＳｉｇｍａ ２０００−２００１ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ １８７３頁（これらは共に、参考として明確に援用される）に見出され得る。
【００１８】
用語「カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）」または「カオトロープ塩」は、本明細書中に使用される場合、例えば、タンパク質または核酸の一次構造をインタクトにしたままで、タンパク質または核酸の二次構造、三次構造、または四次構造を変更することによって（これに限定されない）、タンパク質または核酸中に異常をもたらす物質をいう。例示的なカオトロープとしては、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウムおよび尿素が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なアニオン性カオトロープシリーズとしては、カオトロープ強度が低下する順に示すと：ＣＣｌ３ＣＯＯ−＞＞ＣＮＳ−＞ＣＦ３ＣＯＯ−＞ＣｌＯ４−＞−Ｉ＞ＣＨ３ＣＯＯ−＞Ｂｒ−、Ｃｌ、またはＣＨＯ２−が挙げられる。カオトロープおよびカオトロープ塩の説明は、特に、Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，ＫｏｚｏおよびＧｅｉｄｕｓｃｈｅｋ；Ｅ．Ｐｅｔｅｒ；Ｈａｔｅｆｉ，ＹおよびＨａｎｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ｇ．（１９６２）、「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｎｄ Ｎｏｎｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ
ｂｙ Ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６２：１１２９−１１３６）；Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｔｅ Ｈｅｌｉｘ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８４：１３２９−１３３８）；ならびに米国特許第５，２３４，８０９号に見出され得る。
【００１９】
「キレート剤」は、金属カチオン（例えば、ナトリウム（Ｎａ＋）イオン、マグネシウム（Ｍｇ＋＋）イオン、またはカルシウム（Ｃａ＋＋）イオン）に結合し得る、化合物である。キレート剤の少なくとも２つの非金属イオンが、金属カチオンをその環の中に組み込んで、金属カチオンと配位結合を形成する。従って、金属カチオンは、いくつかの反応に関与するためには、もはや遊離ではない。例えば、キレートされた金属は、タンパク質を結合および活性化するために利用可能ではないかもしれない。１つの電荷を有するカチオン（例えば、Ｎａ＋）は、一価カチオンと呼ばれ、一方、２つの電荷を有するカチオン（例えば、Ｍｇ＋＋またはＣａ＋＋）は、二価カチオンと呼ばれる。いくつかの酵素（例えば、特定のポリメラーゼおよびヌクレアーゼ）は、代表的に、遊離の二価カチオンの存在下で機能する。従って、二価カチオンキレート剤は、十分な量で提供される場合、このような二価カチオン依存性酵素の活性を阻害または低下させ得る。例示的なキレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ジアミノエタンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
「ヌクレアーゼ」（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）またはリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）は、核酸ポリマー中のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する、酵素である。ヌクレアーゼは、核酸ポリマーの分解を引き起こし、構成要素であるヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド（そのポリマーのフラグメント）を放出させる。ＤＮアーゼは、ＤＮＡ分子を分解し、ＲＮアーゼは、ＲＮＡ分子を分解する。ヌクレアーゼ活性は、代表的には、適切なヌクレアーゼインヒビターによって遅延または妨害され得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを分解する化学物質であり得る。このようなヌクレアーゼの例としては、フェナントロリン−銅複合体；ならびに鉄と、過酸化水素と、エチレンジアミンテトラ酢酸との組合せが、挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「有機溶媒」とは、有機液体（すなわち、炭化水素骨格を有する分子を含む液体）を指す。有機溶媒は、例えば、非溶媒分子がその溶媒中に溶解されるようにその溶媒分子でその非溶媒分子を囲むことによって、非溶媒分子を溶媒和させることができる。例示的有機溶媒としては、ベンゼン、四塩化炭素、クロロホルム、フェノール、および他のアルコール（例えば、エタノール、メタノール、およびイソプロパノール（２−プロパノール））、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられるが、これらに限定されない。有機溶媒は、例えば、特定の生化学的組成物から核酸を抽出するために、または水溶液から核酸を沈殿させるために、使用され得る。有機溶媒の考察は、とりわけ、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、ＡｌｌｙｎおよびＢａｃｏｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、１９７３に見出され得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「プロテアーゼ」とは、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチド（まとめて「ペプチド」）中のペプチド結合の切断を触媒する、酵素を指す。例示的プロテアーゼとしては、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリセリンプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。サブチラーゼは、セリンプロテアーゼ（すなわち、切断のためにその活性部位中のセリンを使用する酵素）のファミリーである。サブチラーゼは、原核生物および真核生物（例えば、細菌、真菌、酵母および他の門）において見出される。サブチリシンは、広範な基質特異性を有する細菌性セリンプロテアーゼである。サブチリシンは、カオトロープ（例えば、尿素および塩酸グアニジン）およびアニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））による変性に対して、比較的耐性である。例示的サブチリシンとしては、プロテイナーゼＫ；プロテイナーゼＲ；プロテイナーゼＴ（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ Ｌｉｍｂｅｒから単離される）；サブチリシンＤＹ，カールスバーグ（サブチリシン、サブチリシンＡ、サブチロペプチダーゼＡ、またはアルカラーゼＮｏｖｏとも呼ばれる）；ＢＰＮ’（ナガーゼプロテイナーゼ、ナガーゼ、またはサブチロペプチダーゼＣとも呼ばれる）；Ｎｏｖｏ（細菌性プロテイナーゼＮｏｖｏ、サブチリシンＢ、またはサブチロペプチダーゼＢとも呼ばれる）；腸膜間ペプチダーゼ；およびサーミターゼ（ｔｈｅｒｍｉｔａｓｅ）が、挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
サブチラーゼ、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、および他のプロテアーゼの考察は、とりわけ、Ｇｅｎｏｖら（１９９５）Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｏｆ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｓ Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ（Ｓｕｂｔｉｌａｓｅｓ），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４５：３９１〜４００）；ＮａｒｈｉおよびＡｒａｋａｗａ（１９８９）Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ａｓ Ａ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｏｆ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．第９９０巻：１４４〜１４９）；ＤｉｘｏｎおよびＷｅｂｂ，Ｅｎｚｙｍｅｓ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７９）；ならびにＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）に見出され得る。
【００２４】
用語「塩」とは、本明細書中で使用される場合、酸と塩基との相互作用により生成される化合物をさす。例示的塩基としては、塩化ナトリウム、リン酸カリウム、および炭酸水素ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。水および他の水溶液において、塩は、代表的には、「アニオン」（すなわち、負に荷電した小成分）と「カチオン」（すなわち、正に荷電した小成分）とに解離する。例えば、塩化ナトリウムが水中で解離する場合、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、ナトリウムカチオン（Ｎａ＋）と塩化物アニオン（Ｃｌ−）とに解離する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「界面活性剤」とは、一般的には、疎水性部分と親水性部分とを含む、表面活性剤を指す。界面活性剤の例としては、洗剤および胆汁酸塩が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｂｈａｉｒｉ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．１９９７を参照のこと）。界面活性剤は、１つ以上の荷電基を含むか否かに依存して、アニオン性、非イオン性、双性イオン性、またはカチオン性に分類され得る。アニオン性界面活性剤（例えば、ＳＤＳまたはラウリルサルコシン）は、負に荷電した基を含み、そして正味負の電荷を有する。非イオン性界面活性剤は、非荷電性極性基を含み、電荷を有さない。例示的非イオン性界面活性剤としては、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）が、挙げられるが、これらに限定されない。双性イオン性界面活性剤は、正に荷電した基と負に荷電した基との両方を含み、そして正味の電荷を有さない。
【００２６】
「カチオン性界面活性剤」は、試験した条件下で正に荷電した基を有する。カチオン性界面活性剤は、四級アミンまたは三級アミンを含み得る。例示的四級アミン界面活性剤としては、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃Ｂ２２６３３またはＡｌｄｒｉｃｈ＃８５５８２−０）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ＃２９２７３−７）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ、Ｓｉｇｍａ＃Ｄ−８６３８）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＣｌ）、臭化オクチルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＣｌ）、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム（ＤＥＤＴＡＢ）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（Ｄ１０ＴＡＢ）、臭化ドデシルトリフェニルホスホニウム（ＤＴＰＢ）、臭化オクタデシリルトリメチルアンモニウム、塩化ステアロアルコニウム、塩化オレアルコニウム、塩化セトリモニウム、アルキルトリメチルアンモニウムメソサルフェート、パルミトアミドプロピルトリメチルクロリド、クオーターニウム８４（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥ；ＭｃＩｎｔｙｒｅ
Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）およびコムギ脂質エポキシド（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ
ＷＬＥ；ＭｃＩｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的三級アミン界面活性剤としては、オクチルジメチルアミン、デシルジメチルアミン、ドデシルジメチルアミン、テトラデシルジメチルアミン、ヘキサデシルジメチルアミン、オクチルデシルジメチルアミン、オクチルデシルメチルアミン、ジデシルメチルアミン、ドデシルメチルアミン、塩化トリアセチルアンモニウム、塩化セトリモニウム、および塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性界面活性剤のさらなる種類としては、ホスホニウム、イミダゾリン、およびエチル化アミン基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
アルキルアミンオキシドは、より低いｐＨでは代表的にはカチオン性であるが中性ｐＨでは非イオン性である、種類の界面活性剤を示す。一般的構造は、以下の通りである：
【００２８】
【化１】
【００２９】
ここで、ｎは１と３０との間の数値を示す。例としては、ヘキサデシルアミンオキシド、テトラデシルアミンオキシ、ドデシルアミンオキシド、デシルアミンオキシドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明に従う用語「全組織」は、単一の生物由来の任意の細胞収集物を含むように、広範な意味で使用される。組織の例としては、筋肉（心筋、横紋筋、および平滑筋を含む）；器官（例えば、腎臓、肝臓、脾臓、および心臓）；神経；皮膚層および表皮層（例えば、皮膚）；血液；結合組織（例えば、骨、軟骨、靭帯、および腱）などが挙げられるが、これらに限定されない。全組織のフラグメント、片、セクション、スライス、および小成分は、本発明の範囲内にある。用語、全組織は、例えば、器官または骨全体には限定されない。任意のレベルの任意の細胞凝集物または細胞集合が、本発明の目的のためには、全組織であると見なされる。真菌組織および植物組織（例えば、葉、根、幹、およびキャップ）もまた、本発明の範囲内にある。
【００３１】
用語「核酸」とは、本明細書中で使用される場合、サブユニット間にホスホジエステル結合を含む、リボヌクレオシドポリマーまたはデオキシリボヌクレオシドポリマーを指す。このような核酸としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、断片核酸、亜細胞小器官（例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体）から得られた核酸、ならびに生物学的サンプル上またはサンプル中に存在し得る微生物またはＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスから得られた核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
生物学的サンプルから放出される核酸に結合することができる固相成分（固相または固相支持体とも呼ばれる）としては、適切な条件下で核酸に結合することができる種々の材料が挙げられる。例示的固相成分としては、シリカ粒子、二酸化ケイ素、ケイ藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、ホウケイ酸塩、ニトロセルロース、ジアゾ化紙、ヒドロキシアパタイト、ナイロン、金属酸化物、ジルコニア、アルミナ、ジエチルアミノエチル誘導体化支持体およびトリエチルアミノエチル誘導体化支持体（Ｃｈｒｏｍｅｇａｂｏｎｄ ＳＡＸ，ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ−ＡＮ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ＳＢ、Ｐａｒｔｉｓｉｌ ＳＡＸ、ＲＳＬ、Ａｎｉｏｎ、Ｖｙｄａｃ ＴＰ Ａｎｉｏｎ、Ｚｏｒｂａｘ ＳＡＸ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ＮＭｅ２、Ａｍｉｎｅｘ Ａシリーズ、Ｃｈｒｏｍｅｘ、およびＨａｍｉｌｔｏｎ ＨＡ ｌｏｎｅｘ ＳＢ、ＤＥＡＥセファロース、ＱＡＥセファロース）、ならびに疎水性クロマトグラフィー樹脂（例えば、フェニルセファロースまたはオクチルセファロース）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
特定のポリマーは、適切な条件下で、溶液から核酸を沈殿させることができる。いくつかのポリマーは、低溶解度を有するかまたは不溶性である、核酸−ポリマー複合体を形成することができ、その結果、複合体化した核酸は沈殿し得る。核酸とこのような複合体を形成するポリマーの例としては、ポリエチレンイミン、ＤＥＡＥデキストラン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、他の弱塩基性ポリマー（とりわけ、米国特許第５，５８２，９８８号；同第５，７３３，７６２号；同第５，６２２，８２２号；および同第５，５９９，６６７号に記載される）などが挙げられるが、これらに限定されない。他のポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）は、溶液中で有意な量の水と結合し、これもまた、その溶液からの核酸の沈殿を引き起こし得る。
【００３４】
特定の実施形態に従って、生物学的サンプルから核酸を放出させる方法およびその核酸を固相に結合する方法は、カチオン性界面活性剤を「実質的に中和する」工程を包含する。用語：カチオン性界面活性剤を「実質的に中和する」とは、本出願の目的のために、サンプル中の多数の核酸が、中和するのではなく、このような実質的な中和により固相に結合し得ることを意味する。特定の実施形態に従って、このカチオン性界面活性剤の実質的な中和は、カチオン性界面活性剤の１以上の効果を低減させること、阻害すること、または防止することによって達成され得る。特定の実施形態において、これらの効果としては、以下のうちの１以上が挙げられ得る：カチオン性界面活性剤によって核酸が沈殿すること、カチオン性界面活性剤が核酸に結合すること、核酸が固相に結合するのをブロックすること、および固相と相互作用した結果、核酸との結合を妨害すること。これらの効果の全てが、本発明の実施形態の全てにおいて、必ずしも存在するわけではない。特定の実施形態に従って、カチオン性界面活性剤を実質的に中和することは、破壊緩衝液中の条件によって達成され、そしてこの生物学的なサンプルをこの破壊緩衝液と接触させる工程からの分離工程を必ずしも含むわけではない。
【００３５】
特定の実施形態において、カチオン性界面活性剤を「実質的に中和する」工程は、このカチオン性界面活性剤を実質的に中和する試薬を添加する工程、カチオン性界面活性剤を沈殿させる工程、相抽出によってカチオン性界面活性剤を除去する工程、透析によってカチオン性界面活性剤を除去する工程、カチオン性界面活性剤を固相に結合させる工程、および他の方法によってカチオン性界面活性剤を除去する工程のうちの少なくとも１つを包含し得るが、これらに限定されるわけではない。特定の実施形態において、カチオン性界面活性剤を実質的に中和する試薬としては、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、および双性イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「破壊緩衝液」は、細胞を組織から放出させるプロセス、細胞を破壊して開くプロセス、または細胞を組織から放出させかつ、細胞を破壊して開くプロセスにおいて使用される、緩衝液をいう。
【００３７】
（例示的な実施形態）
特定の実施形態において、本発明は、核酸を生物学的なサンプル（好ましくは、全組織）から単離するための、組成物、方法、およびキットに関する。特定の実施形態において、本発明の組成物、方法、およびキットは、サンプル調製に必要な時間を減少させ、繰り返されるサンプル操作を必要とする多段階手順によって課される潜在的な安全性の危険度を減少させ、そして／または高い完全性（すなわち、最小の分解性）の高分子量の核酸を提供する。特定の実施形態において、本発明の組成物、方法、およびキットは、組織を物理学的または機械学的に破壊するために、さらなる装置の必要性を除去する。
【００３８】
この組成物およびキットは、界面活性剤およびプロテアーゼを含み、そしてこの方法は、界面活性剤およびプロテアーゼを使用する。特定の実施形態において、この生物学的なサンプルは、少なくとも１種のカチオン性界面活性剤と少なくとも１種のプロテアーゼとを合わされて、反応組成物を形成する。特定の実施形態において、次いで、この反応組成物が、核酸が生物学的サンプルから放出されるような様式でインキュベートされる。例えば、特定の実施形態において、インキュベーションの間、これらの反応組成物は、代表的に：（ｉ）生物学的なサンプルを液浸軟化または脱凝集させ得；（ｉｉ）このサンプルを含む細胞を溶解し得；（ｉｉｉ）このサンプルを滅菌し得；（ｉｖ）ヌクレアーゼを中和または不活化させ得；そして（ｖ）核酸を生物学的サンプルから放出させ得る。
【００３９】
プロテイナーゼＫ単独は、代表的に、約１２〜１８時間インキュベートした場合に全組織を効果的に液浸軟化させるが、この放出した核酸は、頻繁に非常に分解される。この分解は、サンプル中に存在するヌクレアーゼに少なくとも一部において起因する。特定の実施形態において、この液浸軟化プロセスは、本明細書中に開示されるように、反応組成物にカチオン性界面活性剤を添加することによって、促進され得る。適切な条件下で、特定の実施形態において、高度な完全性の核酸は、本発明の組成物および方法を使用して、６０分以内で生物学的サンプルから効率的に得られ得る。従って、特定の実施形態において、本発明の組成物および方法は、予想外の利点を提供する。
【００４０】
いくつかのカチオン性界面活性剤は、適切な条件下で、放出された核酸と沈殿物との複合体を形成する。特定の実施形態において、これらのカチオン性界面活性剤：核酸複合体は、非イオン性界面活性剤および適切な塩を使用して溶解され得る。特定の実施形態において、これらのカチオン性界面活性剤：核酸複合体は、双性イオン性界面活性剤またはアニオン性界面活性剤、および適切な塩を使用して、溶解され得る。従って、特定の実施形態において、この組成物は、第２の界面活性剤および塩をさらに含む。
【００４１】
特定の実施形態において、この放出された核酸は、単離される。特定の実施形態において、核酸は、有機溶媒を使用して、生体分子（例えば、脂質、タンパク質など）を含む水溶液から効率的に単離され得る。例えば、特定の実施形態において、有機溶媒（例えば、フェノールまたはフェノールとクロロホルムとの組み合わせ）を使用して、このような溶液から核酸を抽出し得る。特定の実施形態において、抽出された核酸は、例えば、エタノール、プロパノール、またはブタノールのようなアルコールを使用して核酸を沈殿させることによって、単離され得る。特定の実施形態において、この放出された核酸は、この反応組成物から単離されない。
【００４２】
特定の実施形態において、核酸はまた、その核酸を沈殿させるために、特定のポリマーまたは二価カチオンを使用して、反応組成物から単離され得る。核酸を沈殿させるための例示的なポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ＤＥＡＥデキストラン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、および他の弱い塩基性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。このようなポリマーの記載は、数ある中でも、米国特許第５，５８２，９８８号；同第５，７３３，７６２号；同第５，６２２，８２２号；および同第５，５９９，６６７号に見出され得る。特定の実施形態において、特定の二価カチオンがまた、核酸を、溶液から選択的に沈殿させ得る。このような二価カチオンの例としては、塩化亜鉛、塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
さらに、特定の実施形態において、核酸は、選択的に核酸と結合する固相支持対を使用して単離され得る。例えば、これに限定されないが、サンプル由来の核酸は、高濃度のカオトロープまたは塩の存在下で固相に吸着され得る。特定の実施形態において、固相を洗浄して、汚染物質を除去し得、そしてこの核酸を、低イオン強度の溶液を使用して固相から溶出し得る。適切な固相としては、シリカ粒子、二酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ素酸アルミニウム、またはホウケイ酸塩。
【００４４】
また、特定の実施形態において、核酸は、低イオン強度の存在下で、イオン交換樹脂に結合され得る。特定の実施形態において、洗浄による汚染成分の除去後、核酸は、イオン強度を増加することによって、固相から溶出され得る。例示的なイオン交換樹脂としては、ジエチルアミノエチル誘導体化支持体およびトリエチルアミノエチル誘導体化支持体（Ｃｈｒｏｍｅｇａｂｏｎｄ ＳＡＸ、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ−ＡＮ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ＳＢ、Ｐａｒｔｉｓｉｌ ＳＡＸ、ＲＳＬ Ａｎｉｏｎ、Ｖｙｄａｃ ＴＰ Ａｎｉｏｎ、Ｚｏｒｂａｘ ＳＡＸ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ＮＭｅ２、Ａｍｉｎｅｘ Ａシリーズ、Ｃｈｒｏｍｅｘ、およびＨａｍｉｌｔｏｎ ＨＡ ｌｏｎｅｘ ＳＢ，ＤＥＡＥセファロース、またはＱＡＥセファロースなど）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、他の固相物質としてはまた、例えば、ニトロセルロース、ジアゾ化紙、ヒドロキシアパタイト、ナイロン、金属酸化物、ジルコニア、アルミナ、および逆相樹脂（例えば、オクチルセファロースまたはフェニルセファロース）を使用し得るが、これらに限定されないことを、当業者は理解する。
【００４５】
本発明の組成物は、少なくとも１種のプロテアーゼを含む。特定の実施形態において、サブチリシン、サブチラーゼおよびアルカリセリンプロテアーゼのようなプロテアーゼを、使用する。例示的なプロテアーゼとしては、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、ディスパーゼ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼ（ｓｕｂｔｉｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）Ａ、サーモリシン、熱安定性プロテアーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏ由来のもの）、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態に従って、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫである。
【００４６】
特定のプロテアーゼ（プロテイナーゼＫを含む）は、塩化カルシウムの存在によって安定化され得る。塩化カルシウムが、特定のアニオン性界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）と合わされる場合、比較的不溶性の沈殿物が、形成され得る。特定の実施形態において、科学者は、プロテアーゼおよびアニオン性界面活性剤の両方を使用する場合に塩化カルシウムを使用しないことによって、このような沈殿を避けようとし得る。実質的な量のアニオン性界面活性剤が使用されない、本発明の特定の実施形態において、塩化カルシウムが、含まれ得る。カルシウムイオンおよび他の二価カチオンは、代表的に、カチオン性界面活性剤と反応して、不溶性の複合体を形成しない。
【００４７】
特定の実施形態において、高い完全性のＤＮＡを得るために、ＤＮアーゼインヒビターが、本発明の組成物に添加され得る。例えば、多くの内因性ＤＮアーゼｓは、二価カチオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、ＥＧＴＡ（［エチレングリコール−ビス（β−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸］）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）など）よって阻害される。
【００４８】
特定の実施形態において、少なくとも１種のカチオン性界面活性剤は、４級アミン、３級アミン、またはその両方を含む。特定の実施形態において、その少なくとも１種のカチオン性界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロライド（ＣＴＡＣｌ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＤＴＡＢ）、またはヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（ＨＤＴＡＣｌ）を含み、そしてこの少なくとも１種のプロテアーゼは、プロテイナーゼＫを含む。
【００４９】
特定の実施形態において、この少なくとも１種のカチオン性界面活性剤は、この界面活性剤をカチオン性にするｐＨのアルキルアミン酸化物（ａｌｋｙ ａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ）を含む。特定の実施形態において、この少なくとも１種のカチオン性界面活性剤は、酸化オクチルアミン、酸化デシルアミン、酸化ドデシルアミン、酸化テトラデシルアミン、および酸化ヘキサデシルアミンのうちの少なくとも１つを含む。
【００５０】
特定の実施形態において、この少なくとも１種のカチオン性界面活性剤は、アルキルイミダゾリン誘導体またはアルキルホスホニウム誘導体を含む。
【００５１】
特定の実施形態において、核酸を単離する工程としては、有機因子（例えば、フェノール、クロロホルム、フェノールとクロロホルムとの両方、またはβラクタム誘導体（これらに限定されない））を用いて、核酸を抽出する工程を包含する。特定の実施形態において、核酸は、有機因子（例えば、イソプロパノール、エタノール、またはブタノールのようなアルコール（これらに限定されない））で沈殿され得る。特定の実施形態において、核酸を単離する工程は、核酸を有機因子を用いて抽出する工程と、この抽出された核酸を有機因子を用いて沈殿させる工程との組み合わせを包含する。
【００５２】
特定の実施形態において、カチオン性界面活性剤、プロテアーゼおよび緩衝液を使用する工程を包含する、リボ核酸を生物学的サンプルから単離する方法を提供する。特定の実施形態において、カチオン性界面活性剤は、ＣＴＡＢ（ＳｉｇｍａまたはＡｌｄｒｉｃｈ）、ＣＴＡＣｌ（ＳｉｇｍａまたはＡｌｄｒｉｃｈ）、ＨＤＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ＃Ｈ−５８８２またはＦｌｕｋａ＃５２３６７）、またはＨＤＴＡＣｌ（Ｆｌｕｋａ＃４１１９９）である。高度な完全性のＲＮＡが所望される場合、内因性ＲＮアーゼの存在は、しばしば、いくつかの現在の手順の効率を制限する。しかし、特定の実施形態において、本組成物および本方法の２つの成分は、高度な完全性のＲＮＡの単離を増強する、内因性ＲＮアーゼの活性を相殺し得る。第１に、プロテイナーゼＫは、ＲＮアーゼと不朽化し得る。第２に、カチオン性界面活性剤は、ＲＮＡと複合体を形成して、ＲＮアーゼ分解に対するＲＮＡの感受性を減少させ得る。例えば、Ｄａｈｌ，Ｃ．Ｅ．およびＭａｃｆａｒｌａｎｅ，Ｄ．Ｅ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ ＲＮＡ Ｆｒｏｍ
Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｔｒｉｍｏｘ−１４ＴＭ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ」，ＢｉｏＴｅｃｎｉｑｕｅｓ 第１５巻、第６号：１１０２〜１１０５（１９９３）；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，Ｄ．Ｅ．およびＤａｈｌｅ，Ｃ．Ｅ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＲＮＡ Ｆｒｏｍ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｔｈｅ Ｄａｗｎ Ｏｆ ＲＮＡ−Ｂａｓｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ？」，Ｎａｔｕｒｅ，第３６２号：１８６−１８８（１９９３）；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，Ｄ．Ｅ．およびＤａｈｌｅ，Ｃ．Ｅ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ＲＮＡ Ｆｒｏｍ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｗｉｔｈ Ｃａｔｒｉｍｏｘ−１４ ａｎｄ Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，１１：１３２−１３９（１９９７）を参照のこと。
【００５３】
特定の実施形態によれば、内因性ＲＮＡｓｅ活性は、本発明の組成物および方法を使用して、さらに低減される。例えば、特定の実施形態において、ＲＮＡｓｅは、代表的に、より低いｐＨ（例えば、ｐＨ５とｐＨ７との間）および５０℃未満の温度において、活性が低い。特定の実施形態において、アクリジンオレンジもまた、恐らく、放出されたＲＮＡ分子と相互作用してこれらのＲＮＡを分解に対して感受性を低くすることによって、ＲＮＡｓｅの核酸分解性（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を低下させ得る。特定の実施形態において、ＲＮＡｓｅインヒビターがまた添加されて、ＲＮＡｓｅ活性を制限または防止し得る。例示的なＲＮＡｓｅインヒビターとしては、アウリントリカルボン酸、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェノールグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸（ａｄｅｎｙｈｌｉｃ ａｃｉｄ））、硫酸亜鉛、ブロモピルビン酸、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、銅、亜鉛などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物および方法は、少なくとも１つのＲＮＡｓｅインヒビターを含む。
【００５４】
特定の実施形態によれば、組成物中、および方法において使用される、カチオン性界面活性剤は、以下の一般化学式を有する：
【００５５】
【化２】
【００５６】
（Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４：Ｘ−）、ここで、カチオン部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、−Ｈ、２０個までの炭素原子を含むアルキル基、または６個と２６個との間の炭素原子を含むアリール基であり得；ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つは、少なくとも６個の炭素のアルキル基を含み；そしてここで、Ｘ−は、アニオンである。例えば、カチオン性界面活性剤は、アルキルトリメチルアンモニウム塩であり得、ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、メチル基であり、そしてＲ４は、６、８、１０、１２、１４、１６、または１８の炭素原子を含むアルキル基である。アルキルトリメチルアンモニウム塩のカチオン性副成分（Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４）は、（限定せずに）セチルトリメチルアンモニウム基、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム基、テトラデシルトリメチルアンモニウム基、ドデシルトリメチルアンモニウム基、ラウリルトリメチルアンモニウム基などであり得る。この例示的なアルキルトリメチルアンモニウム塩のアニオン性副成分（Ｘ−）は、（限定せずに）以下のイオンのいずれかであり得る：臭化物イオン、塩化物イオン、ヨウ化物イオン、水酸化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、シュウ酸イオン、マロン酸イオン、コハク酸イオン、またはクエン酸イオン。特定の実施形態において、カチオン性界面活性剤は、同じ群のアニオンを含む、ベンジルジメチル−ｎ−アルキルアンモニウム塩である。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明の組成物および方法は、可溶化剤をさらに含み得る。特定の実施形態において、可溶化剤は、生物学的サンプルが消化に対して耐性である場合（例えば、このサンプルが組織全体を含む場合）に、特に有用である。特定の実施形態において、可溶化剤は、細胞内マトリックスの分解を補助し、界面活性剤およびプロテアーゼがサンプルに効率的に侵入し、そして分離することを可能にする。例示的な可溶化剤としては、１−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ−メチルピロリジノン、ピロリジノン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明はまた、核酸を生物学的サンプルから放出および／または単離するために設計された、キットを提供する。このキットは、少なくとも１つのカチオン性界面活性剤および少なくとも１つのプロテアーゼを含み、そして特定の実施形態によれば、さらなる成分を含み得る。特定の実施形態において、このキットは好ましくは、予め測定された単位量で成分を含み、最終使用者による測定を最小にする。特定の実施形態において、このキットは、本発明の１つ以上の方法を実施するための指示書を含む。特定の実施形態において、このキットは、別のものと組み合わせて操作するために最適化される。
【００５９】
特定の実施形態において、少なくとも１つの界面活性剤は、ＣＴＡＢ、ＣＴＡＣｌ、ＨＤＴＡＢ、ＨＤＴＡＣｌ、または等価物を含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのプロテアーゼは、プロテイナーゼＫを含む。特定の実施形態において、抽出された核酸を単離するための他の試薬が、このようなキットに含まれ得る。特定の実施形態において、本発明のキットは、反応緩衝剤、塩、イオン、安定剤、ヌクレアーゼインヒビター、可溶化剤、またはこれらの成分の組み合わせをさらに含み得る。
【００６０】
特定の実施形態によれば、生物学的サンプルから核酸を得、そしてこの核酸を固相に結合させるための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：この生物学的サンプルを破壊緩衝剤に接触させる工程であって、ここで、この破壊緩衝剤は、プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤を含む、工程；ならびにこの核酸を固相に結合させる工程。
【００６１】
特定の実施形態によれば、生物学的サンプルから核酸を得、そしてこの核酸を固相に結合させるための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：この生物学的サンプルを、破壊緩衝剤に接触させる工程であって、ここで、この破壊緩衝剤は、プロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤を含む、工程；引き続いて、このカチオン性界面活性剤を中和する工程；ならびにこの核酸を固相に結合させる工程。特定の実施形態によれば、このカチオン性界面活性剤は、この緩衝剤のｐＨがｐＨ８より高く上昇する場合に、沈澱しない。
【００６２】
方法の特定の実施形態によれば、カチオン性界面活性剤は、以下からなる群の少なくとも１つから選択される：セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣｌ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣｌ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＴＡＣｌ）、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＥＤＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｄ１０ＴＡＢ）、およびドデシルトリフェニルホスホニウムブロミド（ＤＴＰＢ）。
【００６３】
特定の実施形態によれば、カチオン性界面活性剤を実質的に中和することは、このカチオン性界面活性剤を実質的に除去することによって達成される。特定の実施形態によれば、このような方法としては、沈澱、相抽出、および透析のうちの１つ以上が挙げられ得るが、これらに限定されない。このような方法の例示的な要約については、例えば、Ｋ．Ｏｈｌｅｎｄｉｅｃｋ，Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ
Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９：３０５−３１２（１９９６）を参照のこと。特定の実施形態において、アニオン性界面活性剤は、不溶性の錯体を形成するカチオン（例えば、カリウムおよびグアニジニウム）との沈澱によって、除去され得る。例えば、Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，４１−８７頁（１９８６）を参照のこと。界面活性剤除去のための、市販の透析製品としては、Ｈａｒｖｅｒｄ／Ａｍｉｋａ Ｄｉａｌｙｓｉｓ製品、Ｂｉｏｄｉａｌｙｓｅｒ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）、ならびにＡｍｉｃｏｎ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）、およびＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）遠心分離デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤の除去のためのクロマトグラフィーアプローチとしては、ゲル濾過；疎水性クロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。このような技術および原理の例示的な要約に関しては、例えば、Ｂｈａｉｒｉ，Ｓ．Ｍ．，Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ
Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，（１９９７）を参照のこと。界面活性剤の除去のための、市販の樹脂および他の製品の例としては、ＣＡＬＢＩＯＳＯＲＢＴＭ Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ＯＵＴＴＭ ＳＤＳ−３００（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ）；Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ＯＵＴＴＭ ＤＴＧ−１００；ＯｒｇｏＳｏｌ−Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ＯＵＴＴＭ（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ）；Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ ＳＭ２ＴＭ（ＢｉｏＲａｄ）；Ｖｉｖａｐｕｒｅ Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）；およびＺｉｐ ＴｉｍＨＰＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｉｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
方法の特定の実施形態によれば、カチオン性界面活性剤を実質的に中和することは、このカチオン性界面活性剤を実質的に中和する、第２の界面活性剤を添加する工程を包含する。特定の実施形態によれば、この第２の界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。特定の実施形態によれば、非界面活性剤は、以下からなる群の少なくとも１つから選択される：ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）。特定の実施形態によれば、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ２０である。特定の実施形態によれば、Ｔｗｅｅｎ ２０は、少なくとも４％ｗ／ｗの濃度で存在する。特定の実施形態によれば、Ｔｗｅｅｎ ２０は、２０％ｗ／ｗの濃度で存在する。
【００６５】
方法の特定の実施形態によれば、核酸を生物学的サンプルから得、そしてこの核酸を固相に結合させるための方法は、塩を添加する工程をさらに包含する。特定の実施形態によれば、この塩は、ＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌ、およびＧｕＳＣＮからなる群の少なくとも１つから選択される。方法の特定の実施形態によれば、塩はＣａＣｌ２であり、そして少なくとも２０ｍＭの濃度で存在する。
【００６６】
方法の特定の実施形態によれば、プロテアーゼは、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリセリンプロテアーゼからなる群の少なくとも１つから選択される。特定の実施形態によれば、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、ジスパーゼ、サブチリシンＣａｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼＡ、およびサーモリシンからなる群の少なくとも１つから選択される。
【００６７】
特定の実施形態によれば、プロテアーゼは、熱安定性プロテアーゼである。特定の実施形態によれば、熱安定性プロテアーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏを含む群の少なくとも１つから選択される生物から、単離される。
【００６８】
方法の特定の実施形態によれば、溶解緩衝剤は、さらに、リボヌクレアーゼインヒビターを含む。特定の実施形態によれば、リボヌクレアーゼインヒビターは、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸）、硫酸亜鉛、ブロモピルベート、ホルムアミド、銅、および亜鉛を含む群の少なくとも１つから選択される。特定の実施形態によれば、リボヌクレアーゼインヒビターは、アウリントリカルボン酸である。特定の実施形態によれば、アウリントリカルボン酸は、１０μＭの濃度で存在する。
【００６９】
特定の実施形態によれば、核酸を生物学的サンプルから得、そしてその核酸を固相に結合するための方法は、デオキシリボヌクレアーゼインヒビターを添加する工程をさらに包含する。特定の実施形態によれば、デオキシリボヌクレアーゼインヒビターは、二価のカチオンキレート剤を含む。特定の実施形態によれば、二価のカチオンキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＰＴＡからなる群の少なくとも１つから選択される。
【００７０】
特定の実施形態によれば、プロテアーゼ；カチオン性界面活性剤；塩；および第２の界面活性剤を備えるキットが提供され、ここで、この第２の界面活性剤は、カチオン性界面活性剤を実質的に中和する。
【００７１】
このキットの特定の実施形態に従って、このカチオン性界面活性剤は、緩衝液のｐＨが８より上に上昇する場合、沈殿しない。
【００７２】
このキットの特定の実施形態に従って、このカチオン性界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣｌ）、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＣｌ）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＣｌ）、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム（ＤＥＤＴＡＢ）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（Ｄ１０ＴＡＢ）、および臭化ドデシルトリフェニルホスホニウム（ＤＴＰＢ）を含む群のうちの少なくとも１つから選択される。
【００７３】
このキットの特定の実施形態に従って、このプロテアーゼは、サブチリシン、サブチラーゼ、およびアルカリ性セリンプロテアーゼを含む群のうちの少なくとも１つから選択される。特定の実施形態において、このプロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシンＤＹ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリセリンプロテアーゼ、ジスパーゼ、サブチリシンＣａｌｓｂｅｒｇ、サブチロペプチダーゼＡ、およびサーモリシンを含む群のうちの少なくとも１つより選択される。
【００７４】
このキットの特定の実施形態に従って、このプロテアーゼは、熱安定性プロテアーゼである。特定の実施形態において、この熱安定性プロテアーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｒｔ４１ＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ｒｏｋｋｏを含む群のうちの少なくとも１つより選択される生物体から単離される。
【００７５】
特定の実施形態に従って、このキットはさらに、リボヌクレアーゼインヒビターを含む。特定の実施形態において、このリボヌクレアーゼインヒビターは、バナジレートリボヌクレオシド複合体、フェニルグリオキサール、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール、ポリアミン、スペルミジン、９−アミノアクリジン、ヨードアセテート、ベントナイト、ポリ［２’−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニル）］ポリ（アデニル酸）、硫酸亜鉛、ブロモピルベート、ホルムアミド、銅、および亜鉛を含む群のうちの少なくとも１つより選択される。特定の実施形態において、このリボヌクレアーゼインヒビターは、アウリントリカルボン酸である。特定の実施形態において、このアウリントリカルボン酸は、１０μＭの濃度で存在する。
【００７６】
特定の実施形態に従って、このキットはさらに、デオキシリボヌクレアーゼインヒビターを含む。特定の実施形態において、このデオキシリボヌクレアーゼインヒビターは、２価のカチオンキレート剤を含む。特定の実施形態において、この２価のカチオンキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＰＴＡを含む群のうちの少なくとも１つより選択される。
【００７７】
特定の実施形態に従って、このキットはさらに、塩を含む。特定の実施形態において、この塩は、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌ、およびＧｕＳＣＮを含む群より選択される。特定の実施形態において、この塩はＣａＣｌ２である。特定の実施形態において、このＣａＣｌ２は、少なくとも２０ｍＭの濃度で存在する。
【００７８】
特定の実施形態に従って、このキットの第２の界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。特定の実施形態において、この非イオン性界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）を含む群より選択される。特定の実施形態において、この非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ２０である。特定の実施形態において、このＴｗｅｅｎ ２０は、少なくとも４％重量／重量の濃度で存在する。特定の実施形態において、このＴｗｅｅｎ ２０は、２０％重量／重量の濃度で存在する。
【００７９】
特定の実施形態に従って、プロテアーゼ；カチオン性界面活性剤；非イオン性界面活性剤（この非イオン性界面活性剤は、このプロテアーゼおよびカチオン性界面活性剤の存在下で、核酸と固相との結合を可能にする）；および高い塩濃度の緩衝液を含む、生体サンプルから核酸を単離するためのキットが提供される。
【００８０】
核酸を固相に結合するプロセスと、カチオン性界面活性剤を用いて核酸をサンプルから放出するプロセスとを組み合わせて、単一の核酸単離プロセスとするプロセスの間、タンパク質分解を達成するために用いられるカチオン性界面活性剤のうちの多くが、核酸を固相上に結合するために用いられた高い塩濃度の存在下で不溶性であることを見出した。さらに、高い塩濃度中において可溶である、いくつかのカチオン性界面活性剤は、固相への核酸の結合を阻害した。このことは、固相に結合する核酸を減少させる。特定の実施形態において、核酸を固相に結合するために、高い塩濃度を用いる。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示し、そして決して本発明の範囲を限定しない。
【００８２】
（実施例１）
プロテイナーゼＫの活性を測定するために、ＢｏＤｉｐｙで標識化されたカゼイン結合体（Ｅｎｚ Ｃｈｅｃｋ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，製品番号Ｅ６６３８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いるアッセイを開発した。この誘導体化された結合体中の、蛍光ＢｏＤｉｐｙ部分の濃度は、このタンパク質がインタクトである場合に、個々の部分の蛍光が消失するほど十分に高い。しかし、この誘導体化されたカゼインの、プロテアーゼによる消化において、より少数のＢｏＤｉｐｙ色素分子を含むペプチドが放出され、蛍光の増大を生じる。アッセイのための初期ダイナミックレンジを決定するために、以下のように、プロテイナーゼＫの濃度を減少させながら、ＢｏＤｉｐｙで標識化されたカゼインを１時間消化した。
【００８３】
プロテイナーゼＫ（製品番号２５４６、Ａｍｂｉｏｎ）を、１０μｇ／ｍｌのＢｏＤｉｐｙで標識化されたカゼイン結合体を含む５００μＬの緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、２０ｍＭのＣａＣｌ２）に、最終濃度の範囲（４０ｆｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌ）にわたって添加した。混合しながらの６０℃での１時間のインキュベーションの後で、１００μＬのアリコートを、９６ウェルの光学プレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標） Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に移動し、そしてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００分光光度計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において蛍光を測定した。バックグラウンドの蛍光を、プロテイナーゼＫを有さない緩衝液中で基質をインキュベートすることによって決定した。
【００８４】
図１に示したように、プロテイナーゼＫの濃度が増大するにつれて、蛍光の量は増大した。このシグナルは、約３０，０００蛍光単位で平坦域に達しているようであった。そして、放出された蛍光を、わずか５０ｎｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む反応組成物から検出した。
【００８５】
（実施例２）
最初に、一連の反応組成物を、生体サンプル（例えば、肝臓の切片）を脱凝集させる能力について分析した。これらの反応組成物は、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ならびに必要に応じて、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤およびアニオン性界面活性剤）、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅｓ）、または添加物１−メチル−２−ピロリジノン（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。各々の反応組成物を、肝臓の切片とともにチューブに配置し、次いで、６５℃でインキュベートした。このチューブを定期的に観察して、どの反応組成物がサンプルを効率的に軟化し得るかを決定した。
【００８６】
表１に示したように、単独のプロテイナーゼＫは、この肝臓組織を効率的に消化し得たが、それは６５℃での延長されたインキュベーションの後でのみであった。試験された全ての反応組成物の中で、カチオン性界面活性剤ＣＴＡＢを含むものが、１時間のインキュベーション期間の間、もっとも効率的にこのサンプルを軟化した。さらに、ＣＴＡＢは、プロテイナーゼＫのタンパク質分解活性を増強するようであった。
【００８７】
【表１】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
（実施例３）
プロテイナーゼＫの活性に対するカチオン性界面活性剤の効果を試験するために、以下のように一連の反応組成物を調製した。反応混合物は、以下を含んだ：カゼインＢｏＤｉｐｙ結合体（１μｇ、１０ｎｇ／μＬ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのＣａＣｌ２、１％の界面活性剤（以下の表２に示す）、ならびに、２０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．３１μｇ／ｍｌ、０．０７８μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌおよび０．００５μｇ／ｍｌの濃度の、一連のプロテイナーゼＫ希釈物。アニオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（試験された条件下でプロテイナーゼＫの活性を活性化することが公知である）を、ポジティブコントロールとして含めた。反応チューブを、９６−ウェルの光学プレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標） Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において６０℃でインキュベートし、そして、放出された蛍光の量を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００を用いて、示した時点で測定した。
【００９１】
【表２】
【００９２】
【００９３】
図２Ａ〜２Ｃに示すように：（ｉ）プロテイナーゼＫは界面活性剤なしで、周囲温度でさえも、高いタンパク質分解活性を有する（水中での０分インキュベーションを参照のこと）；（ｉｉ）ＳＤＳは、カゼイン基質におけるプロテイナーゼＫの活性を増強する；（ｉｉｉ）２つのカチオン性ポリマー（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ００６および００７）は、プロテイナーゼＫ活性に対するわずかな阻害活性を有する；そして（ｉｖ）試験された全てのカチオン性界面活性剤は、（単独の水に対する（すなわち、界面活性剤を有さない）プロテイナーゼＫ活性と、ハロゲン化テトラアルキルアンモニウム曲線、ハロゲン化ベンジルアルキルアンモニウム曲線、またはポリクオーターニウム（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｉｕｍｓ）曲線とを比較した場合）プロテイナーゼＫ活性を阻害するようである。
【００９４】
（実施例４）
組織全体から核酸を抽出することは、代表的には困難であるので、本発明の組成物および方法の効力を例示することは、有効に用いられ得る。従って、実施例の残りを、例示的な組織全体として肝臓組織を用いて行った。しかし、当業者は、開示された組成物および方法がまた、広範囲の生体サンプルを用いて有効に使用され得ること、ならびに、本発明がいかなる型のサンプルを用いる使用にも限定されないことを、理解する。
【００９５】
核酸放出の効力を、種々の試験処理によって評価するための最初のアプローチにおいて、肝臓サンプルを、界面活性剤およびプロテイナーゼＫを含む反応組成物中で、特定の期間にわたって消化した。このプロトコルは、遠心分離を用いて未消化の物質を除去する工程を含んだ。精製核酸およびカチオン性界面活性剤を用いた予備的な結果は、このカチオン性界面活性剤が核酸とともに沈殿を形成していることを示した（データを示さず）。さらに、この複合体は、遠心分離の間、未消化の組織とともに除去されていた。従って、サンプルから放出されている核酸の量を定量する１つの方法は、界面活性剤：核酸複合体から核酸を遊離させることを含んだ。カチオン性界面活性剤複合体から核酸を遊離させるために、以下のように条件を評価した。
【００９６】
ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ；１８ゲージの皮下注射針を使用して穏やかに剪断した７００μｇ／ｍｌ）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８中の１％ＣＴＡＢと混合して、反応組成物を生成した。最初に、顕著な沈殿が観察された。表３に示される種々の添加物を、この反応組成物のアリコートを用いて試験して、カチオン性界面活性剤：核酸沈殿物を可溶化する組成物を同定した。
【００９７】
【表３】
【００９８】
【００９９】
表３に示したように、反応組成物のうち４つが、沈殿を完全に可溶化した。最終濃度３３％または５０％で使用した、核酸精製物溶解溶液（＃４３０５８９５，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、沈殿を完全に可溶化した（サンプル２４〜２５を参照のこと）。さらに、ＮａＣｌ塩および非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０のいくつかの組合せは、沈殿を完全に可溶化した（サンプル１６および３０を参照のこと）。しかし、単独で使用したＮａＣｌもＴｗｅｅｎ２０も、沈殿を可溶化しなかった（サンプル１，２，１５および１７を参照のこと）。当業者は、種々の濃度で使用した塩および非イオン性界面活性剤のさらなる組合せは、カチオン性界面活性剤：核酸沈殿を溶解するのに使用され得ることを理解する。
【０１００】
（実施例５）
種々のカチオン性界面活性剤がプロテイナーゼＫによる組織の消化を増大する能力を評価するために、１６の界面活性剤のうち１つを含む反応組成物を使用し、プロテイナーゼＫの有りまたは無しの両方で、肝臓切片を消化した（表４に示される）。還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を、組織消化に対する還元条件の効果を評価するために含ませた。肝臓組織（８０ｍｇ〜１２０ｍｇ）を、１０００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および２０ｍＭジチオトレイトールを含む３４本のエッペンドルフチューブ（１７対のチューブ）の各々の中に置いた。１６の界面活性剤のうち１つを、最終濃度１％の界面活性剤を生じるように一対のチューブに加えた。第１７対目のチューブは、非界面活性剤コントロールとして働く。１ミリグラム（ｍｇ）のプロテイナーゼＫを、１７対の各々の一方のチューブに加えた。次いで、３４本のチューブを６０℃で攪拌しながらインキュベーションした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ、モデル５４３６）。
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
【０１０３】
各々のチューブを、インキュベーションの１５分後および５２分後に視覚的に評価した。表５（１５分インキュベーション）および表６（５２分インキュベーション）に示した結果は、試験した条件下では、ＣＴＡＢおよびプロテイナーゼＫの組合せが、いずれの時点でも組織サンプルの全体的な脱凝集を引き起こしたことを示す。特に、ＣＴＡＢ単独では、明らかなサンプルの脱凝集を引き起こさなかった。ＤＴＴの存在は、これらの条件下で、組織の脱凝集を有意にもたらさないようにみえた。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
【０１０６】
ＰＫ＝反応組成物中のプロテイナーゼＫの存在または非存在；Ｙ＝プロテイナーゼＫは存在した；Ｎ＝プロテイナーゼＫは、反応組成物中に存在しなかった。組織脱凝集：０＝なし；１＝フラグメント化なし、わずかに濁った上清；２＝フラグメント化ほとんどなし、わずかに濁った上清、３＝より有意な組織の上清、ひどく濁った上清；４＝不溶性物質がほとんど残されていない、完全な組織凝集
【０１０７】
【表６】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
命名法の意味は、表５の凡例を参照のこと。
【０１１１】
（実施例６）
カチオン性界面活性剤およびプロテイナーゼＫが生物学的サンプルから高度に完全な核酸を放出する能力を検査するために、放出された核酸を単離した。肝臓組織の切片（一片あたり９０ｍｇ〜２００ｍｇ）を、２２本のエッペンドルフマイクロフューズチューブ各々の中に置いた。４００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、１％界面活性剤、および１ｍｇプロテイナーゼＫを各々のチューブに加えた。チューブを６０℃で２２分間、攪拌しながらインキュベーションした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ、モデル５４３６）。
【０１１２】
インキュベーションに続いて、界面活性剤：核酸複合体を溶解するために、核酸精製物溶解溶液（＃４３０５８９５，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；最終濃度２９％）、酢酸ナトリウム（最終濃度２１４ｍＭ）およびグリコーゲン（イガイ（Ｍｕｓｓｅｌ）ＶＩＩ型、Ｓｉｇｍａ；最終濃度１４３μｇ／ｍｌ）を、各々のチューブに加えた。残りの組織フラグメントをペレット化するために、これらチューブを、１４，０００ＲＰＭで５分間、エッペンドルフマイクロフューズ（モデル５４１５Ｃ）中で遠心分離した。得られた上清を、１０ｍＭＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および１ｍＭ ＥＤＴＡ（フェノール飽和）で飽和させた７００μＬのフェノール（Ｓｉｇｍａ）を使用して、抽出した。ペレット化された材料もまた、たとえ未消化サンプル中にいくらか残ってたとしても、核酸を得るために、飽和フェノールで抽出した。抽出された核酸を、等容量（７５０μＬ）の２−プロパノールを使用して沈殿させ、そしてこれらのチューブを−２０℃で３時間インキュベーションした。前記のように、核酸をペレット化するために、１４，０００ＲＰＭで５分間室温で、マイクロフューズ中でサンプルを遠心分離した。核酸のペレットを、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、そして１４，０００ＲＰＭで５分間室温で、マイクロフューズ中でサンプルを遠心分離した。洗浄した核酸ペレットを、１００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１単位／μＬのＲＮａｓｉｎ中に再懸濁した。放出された核酸の量を、ＵＶ／可視光分光光度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、モデル８４５３）を使用して定量した。定量の目的のために、２６０ｎｍの波長でＵＶ光を吸収する材料が核酸であると仮定した。従って、吸光係数１ＯＤ２６０＝４０μｇ／ｍｌを使用した。
【０１１３】
図３は、サンプル（μｇ核酸／処理した組織１ｍｇ）から回収したＡ２６０吸収材料の量を示す。結果を、各々のサンプルの重量について正規化した。前記実施例中で実証されたように、カチオン性界面活性剤の存在下における、プロテイナーゼＫの減少したタンパク質分解活性にも関わらず、Ａ２６０吸収物質の量は、アニオン性界面活性剤を用いて得られる量または界面活性剤を用いずに得られる量と類似していた。
【０１１４】
放出された核酸の完全性（すなわち、その分解度）および組織ペレット中に残っている核酸の量を評価するために、各々のサンプルの１０分の１を、標準的分子生物学の手順に従って、１％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。標準的分子生物学の手順の記述は、特に、以下において見出され得る：ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｂｅｌら，１９９３ および２０００年９月補遺， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｗ．Ｒｅａｍら，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９９。
【０１１５】
図４に示したように、カチオン性界面活性剤：プロテイナーゼＫの組合せのほとんどは、ペレット中に残る核酸がほとんどないことによって証明されるように、核酸を放出した。放出された核酸は、大きな電気泳動移動度を有することが観測された。なぜならば放出した核酸は、ゲルの底辺近くに現れたからである。インタクトな高度に完全な核酸は、代表的に、大きいというよりむしろ、小さい電気泳動移動度を有するので、回収した核酸はこれらの条件を使用することで、明らかに高度にフラグメント化された。言い換えると、核酸は明らかに低い完全性を有していた。
【０１１６】
（実施例７）
実施例６から得た結果は、サンプル中に有意なヌクレアーゼ活性があったことを示す。内因性ＲＮＡｓｅｓの核酸分解活性を減少させるために、反応組成物のｐＨを約６．０へ低下させ、そしてインキュベーション温度を４５℃へ低下させた。フェニルグリオキサ−ル（Ａｌｄｒｉｃｈ＃１４２４３−３）、１−メチル−２−ピロリジノン、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，＃７０２０）、およびＳｔｒｅｃｋ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆｉｘｉｔｉｖｅ（Ｓｔｒｅｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃２６５１３８）を含むいくつかの添加物をまた、試験して、反応組成物中での内因性ＲＮＡｓｅ活性に対する効果を評価した。フェニルグリオキサ−ルは、リボヌクレアーゼ活性を減少することが知られている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔ１．ＸＩ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔ１ Ｂｙ Ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｏｘａｌ Ａｎｄ Ｇｌｙｏｘａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｊａｐａｎ）６８：６５９−６６４，１９７０を参照のこと）。ＲＮＡ Ｌａｔｅｒについての製品の印刷物は、この試薬が組織中でＲＮＡを安定化し、そして、Ｓｔｒｅｃｋ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆｉｘａｔｉｖｅは、組織の完全性を保存すると考えれていると主張している。
【０１１７】
肝臓組織の切片（１００ｍｇ〜２００ｍｇ／サンプル）を１９本のエッペンドルフチューブ中に置いた。１００ｍＭ ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ＃Ｍ−５２８７）、ｐＨ６、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および１ｍｇプロテイナーゼＫを含む反応組成物（４００マイクロリットル）を、各々のチューブに加えた。表７に示すように、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ，サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ））およびカチオン性界面活性剤（ＣＴＡＢ、ＣＴＡＣｌ、およびテトラメチルアンモニウムクロリド）を含むさらなる成分を特定のチューブに加えた。
【０１１８】
【表７】
【０１１９】
【０１２０】
これらのチューブを、混合しながら（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ５４３６）、４５℃で２０分間インキュベートした。このインキュベーションの後、１．７５Ｍ ＮａＣｌ、２９％ Ｔｗｅｅｎ ２０、５８５μｇ／ｍｌ グリコーゲン（４４７ｍＭ ＮａＣｌ、７．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、および１４９μｇ／ｍｌ グリコーゲン）を含む溶液（１７１μＬ）を、各チューブに添加して、界面活性剤：核酸複合体を溶解した。グリコーゲンは、核酸キャリアとして作用した。消化されていない組織フラグメントを、実施例６に開示される方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遠心分離によって除去した。実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、上清を、フェノール（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡで飽和；Ｓｉｇｍａ ＃Ｐ−４５５７）で抽出し、イソプロパノール（Ａｌｄｒｉｃｈ ＃１９０７６−４）で沈殿させ、そしてエタノールで洗浄した。この洗浄した核酸ペレットを、１００μＬの、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１単位／μＬ Ｒｎａｓｉｎと共に再懸濁した。遊離された核酸の量およびその完全性を、実施例６に記載されるようにして評価した。
【０１２１】
図５に示すように、これらの条件下で、カチオン性界面活性剤（ＣＴＡＢおよびＣＴＡＣｌ）またはアニオン性界面活性剤（ＳＤＳおよびＳａｒｋｏｓｙｌ）のいずれかと組み合わせたプロテイナーゼＫは、このサンプルからＡ２６０吸収物質を遊離させた。Ｓｔｒｅｃｋ Ｔｉｓｓｕｅ ＦｉｘａｔｉｖｅまたはＲＮＡ Ｌａｔｅｒのいずれかを、これらの反応物に添加した場合、非常にわずかなＡ２６０吸収物質が遊離された。この遊離された核酸の平均分子量は、代表的に、プロテイナーゼＫの消化がより低いｐＨおよびより低温で行われる場合、より大きかった（図４と図６とを比較９）。さらに、遊離された核酸の平均分子量は、代表的には、プロテイナーゼＫ消化をカチオン性界面活性剤の存在下で行った場合よりも大きかった（図６のレーン５〜９および１５〜１９と１０〜１４とを比較）。
【０１２２】
（実施例８）
ＣＴＡＣｌとＣＴＡＢとを比較するために、これら２つの界面活性剤を、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＤＴＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＨＤＴＡＣｌ）、およびＳａｒｋｏｓｙｌと並行して評価した。３種の添加剤、フェニルグリオキサール、アクリジンオレンジ（例えば、Ｓｉｇｍａ ＃Ａ６０１４）、および１−メチル−２−ピロリジノンもまた評価した。フェニルグリオキサールを試験して、これがＲＮＡａｓｅ活性を減少させるか否かを決定した。核酸分子と相互作用することが知られている色素化合物であるアクリジンオレンジを試験して、これがヌクレアーゼ活性を減少させるか否かを決定した。１−メチル−２−ピロリジノンを試験して、これが種々の反応組成物によるサンプルの溶解性を増大させるか否かを観察した。
【０１２３】
肝臓組織のスライス（１００〜２００ｍｇ／サンプル）を、２１本のエッペンドルフチューブに入れた。１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および１ｍｇ プロテイナーゼＫを含む反応組成物（４００μｌ）を、各チューブに添加した。表８に示すように、追加の成分を、特定のチューブに添加した。
【０１２４】
【表８】
【０１２５】
これらのチューブを、混合しながら（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ５４３６）、４５℃で３０分間インキュベートした。界面活性剤：プロテアーゼ複合体を、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、可溶化した。残った組織フラグメントを、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遠心分離によって除去した。実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、上清をフェノールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてエタノールで洗浄した。この洗浄した核酸ペレットを、再懸濁し、そして遊離された核酸の量および完全性を、実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して評価した。
【０１２６】
図７に示すように、３種の添加剤の効果は、界面活性剤に依存して異なった。例えば、ＣＴＡＣｌおよび１−メチル−２−ピロリジノンを使用して遊離された核酸の量は、添加剤を含まないＣＴＡＣｌの組成物と比較して多かった。しかし、ＨＤＴＡＢおよび１−メチル−２−ピロリジノンを使用して遊離された核酸の量は、添加剤を含まないＨＤＴＡＢの組成物と比較して、少なかった。
【０１２７】
遊離された核酸をゲル電気泳動により分析した場合、高分子量核酸が、ＨＤＴＡＢを含む全ての反応組成物において現れた（図８を参照のこと）。高分子量核酸はまた、ＣＴＡＣｌと１−メチル−２−ピロリジノンまたはアクリジンオレンジのいずれかとを含む反応組成物中に存在した。高分子量核酸はまた、ＨＤＴＡＣｌおよび１−メチル−２−ピロリジノンを含む反応組成物において観察された。
【０１２８】
（実施例９）
実施例７は、組織サンプル中のＲＮＡを安定化するために使用される特定の試薬（すなわち、Ｓｔｒｅｃｋ Ｔｉｓｓｕｅ ＦｉｘａｔｉｖｅおよびＲＮＡ Ｌａｔｅｒ）の存在が、プロテイナーゼＫの活性を阻害することを証明した。この阻害の減少を試みるために、組織を、いくつかの試薬中でプレインキュベートして、この組織をサンプル中に拡散させた。残った試薬を、反応組成物中でのサンプルのインキュベーションの前に除去した。
【０１２９】
肝臓スライスを、以下のように、反応組成物に暴露する前に、種々の溶液中でインキュベートした。肝臓組織のスライス（９４〜３３０ｍｇ／サンプル）を、４セットの６個のエッペンドルフチューブに配置した。核酸精製溶解溶液（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＲＮＡ ＬａｔｅｒまたはＳｔｒｅｃｋ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆｉｘａｔｉｖｅのいずれか（５００μｌ）を、１セットのチューブに添加した。４番目のセットのチューブは、予備処理溶液を含まず、コントロールとしてはたらいた。
【０１３０】
これらのチューブを４℃で４時間インキュベートし、次いで、周囲温度で２分間、１４，０００ＲＰＭにて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心機（Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ）で遠心分離した。上清を捨て、そして１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および１ｍｇ プロテイナーゼＫを含む反応組成物（４００μｌ）を、各チューブに添加した。表９に示す６種の追加成分のうちの１つをまた、各チューブに添加した。これらのチューブを、混合しながら（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ５４３６）、４５℃で３０分間インキュベートした。
【０１３１】
得られた界面活性剤：プロテアーゼ複合体を、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、可溶化した。残った組織フラグメントを、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遠心分離によって除去した。実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、上清を、フェノールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてエタノールで洗浄した。この洗浄した核酸ペレットを再懸濁し、そして遊離された核酸の量およびその核酸の完全性を、実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して評価した。
【０１３２】
【表９】
【０１３３】
図９に示すように、予備処理溶液の１つでのサンプルの予備処理は、コントロールと比較した場合、遊離されるＡ２６０吸収物質の量の減少を生じた。
【０１３４】
（実施例１０）
アウリントリカルボン酸がＣＴＡＢ、ＣＴＡＣｌまたはＳＤＳを含む反応組成物を使用して遊離される核酸の完全性を維持する能力を評価した。アウリントリカルボン酸は、核酸へのタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）の結合を阻害すると考えられ、そしてリボヌクレアーゼを阻害することが証明されている。肝臓組織のスライス（７７〜１８６ｍｇ／サンプル）を、２１本のエッペンドルフチューブに入れた。各チューブに、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および表１０に示されるような追加成分を含む反応組成物（４００μＬ）を添加した。
【０１３５】
【表１０】
【０１３６】
これらのチューブを、混合しながら（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ５４３６）、５５℃で３０分間インキュベートした。得られた界面活性剤−プロテアーゼ複合体を、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、可溶化した。消化されていない組織フラグメントを、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遠心分離によって除去した。実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、上清を、フェノールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてエタノールで洗浄した。この洗浄した核酸ペレットを再懸濁し、そして実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遊離された核酸の完全性を評価した。
【０１３７】
図１１に示すように、反応組成物中のアウリントリカルボン酸の存在は、高分子量核酸の収量を増大させた。アウリントリカルボン酸とＣＴＡＢまたはＣＴＡＣｌのいずれかとを含む反応組成物は、多量の高完全性の核酸を遊離させた。この反応組成物中の界面活性剤がＳＤＳである場合、より少ない核酸が遊離された。
【０１３８】
（実施例１１）
他のカチオン性試薬が高完全性の核酸を遊離する能力を試験するために、さらなる化合物を、以下のようにして試験した。肝臓組織のスライス（８０〜１４０ｍｇ／サンプル）を、１４本のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入れた。１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ６）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ アウリントリカルボン酸（例えば、Ｓｉｇｍａ ＃Ａ１８９５）、および１ｍｇ プロテイナーゼＫを含む反応組成物（５００μｌ）を、各チューブに添加した。表１１に示すカチオン性試薬の１つを、最終濃度が１％になるまでこのチューブに添加した。コントロールとして、１つのチューブは、追加の試薬を含まなかった。これらのチューブを、混合しながら（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ５４３６）、６０℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーションの後、１．７５Ｍ ＮａＣｌ、２９％ Ｔｗｅｅｎ ２０、５８５μｇ／ｍｌ グリコーゲンを含む溶液（２００μＬ）（４４７ｍＭ ＮａＣｌ、７．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、および１４９μｇ／ｍｌ グリコーゲンの最終濃度を生じる）を、各チューブに添加して、界面活性剤：核酸複合体を溶解した。残った組織フラグメントを、実施例７に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、遠心分離によって除去した。実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、上清を、フェノールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてエタノールで洗浄した。この洗浄した核酸ペレットを、１００μＬの、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１単位／μＬ Ｒｎａｓｉｎに再懸濁した。遊離された核酸の量およびその完全性を、実施例６に記載の方法と同じかまたは類似の方法を使用して、評価した。
【０１３９】
【表１１】
【０１４０】
図１２に示されるように、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００６およびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００７を除く、試験したカチオン試薬の全ては、高い完全性の核酸を放出した。試験した１１のカチオン試薬のうちで、９つは、界面活性剤であり、そして２つ（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００６およびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００７）は、カチオンポリマーであった。この結果は、これらの条件において、プロテイナーゼＫと関連して使用される場合、カチオン性界面活性剤の全てが、効率的にサンプルから核酸を放出したことを示す。
【０１４１】
以下の用語、略語、および供給源を、実施例１２〜実施例２１の全体にわたって議論される物質に適用する。
【０１４２】
固相ガラス繊維膜（ＧＦ／ＢおよびＧＦ／Ｄ）を、Ｗｈａｔｍａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カタログ番号１８２１−１５０およびカタログ番号１８２３−１５０）から入手した。プロテイナーゼＫを、Ａｍｂｉｏｎ（カタログ番号２５４８）から入手した。ラット組織およびマウス組織を、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｒｏｇｅｒｓ、Ａｒｋａｎｓａｓ）により供給される動物から入手した。仔ウシ胸腺のゲノムＤＮＡを、Ｓｉｇｍａ（製品番号Ｄ８５１５）から入手した。
【０１４３】
以下の試薬およびそれらに対する供給源の略語または名称は、以下の通りである：
以下の実施例において、これらの以下のカチオン性界面活性剤を使用した：臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ、Ａｌｄｒｉｃｈ ＃８５５８２−０）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ ＃２９２７３−７）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ、Ｓｉｇｍａ
＃Ｄ−８６３８）、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＣｌ、Ｆｌｕｋａ 製品番号４４２４２）、臭化オクチルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｔ４７６２）、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＣｌ、Ｆｌｕｋａ 製品番号８７２１２）、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム（ＤＥＤＴＡＢ、Ｆｌｕｋａ 製品番号４４１６５）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（Ｄ１０ＴＡＢ Ｆｌｕｋａ 製品番号３０７２５）、臭化ドデシルトリフェニルホスホニウム（ＤＴＰＢ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ 製品番号１４２９５）、クオーターニウム８４（ＭＮＬＥまたはＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）、オレアルコニウムクロリド（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＫＰまたはＭＫＰ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）、およびコムギ（ｗｈｅａｔ）リピドエポキシド（ＭＷＬまたはＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＷＬＥ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）。
【０１４４】
以下の試薬およびそれらに対する供給源の略語または名称は、以下の通りである：ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、Ａｍｂｉｏｎ カタログ番号９８２２）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｌ４６３２）、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムまたはラウロイルサルコシン（Ｓａｒｋｏｓｙｌ、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｌ５１２５）、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｔ８７８７）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｓｉｇｍａ
製品番号Ｐ９４１６）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２１、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｐ２５６５）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｐ１５０４）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｐ１６２９）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｐ８０７４）、ポリオキシエチレンソルビタンモノトリオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８５、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｐ４６３４）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０、Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｉ３０２１）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０、Ａｌｄｒｉｃｈ 製品番号２３５９８−９）、およびソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０、Ｓｉｇｍａ
製品番号Ｓ６６３５）。
【０１４５】
以下の試薬およびそれらに対する供給源の略語または名称は、以下の通りである：塩酸グアニジニウム（Ｓｉｇｍａ、ロット３８Ｈ５４３２）、チオシアン酸グアニジニウム（Ｓｉｇｍａ、製品番号Ｇ−９２７７）、ヨウ化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号３８，３１１−２、ロット番号０７００４ＴＳ）、過塩素酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号４１，０２４−１、ロット ＫＵ ０６９１０ＨＵ）、臭化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号３１０５０−６、ロット１１８０５ＫＲ）、塩化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、製品番号３３，２５１−４、ロット番号１６５２４ＣＳ）、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン、Ｓｉｇｍａ、製品番号Ｔ−６７９１、ロット番号１２６１−１５７３８）、ヨウ化リチウム（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｌ４５０８）、ヨウ化カリウム（Ｓｉｇｍａ
製品番号Ｐ２９６３）、ヨウ化ルビジウム（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｒ２２５２）、ヨウ化セシウム（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｃ８６４３）、臭化リチウム（Ａｌｄｒｉｃｈ ２１，３２２−５）、塩化リチウム（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｌ９６５０）、チオシアン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｓ７７５７）、尿素（Ｓｉｇｍａ 製品番号Ｕ５３７８）、ＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ カタログ番号９２６１）、および水酸化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、製品番号Ｓ−８０４５、ロット番号１２７Ｈ０５３１および６９Ｈ１２６４）。
【０１４６】
（実施例１２）
特定の例において、高塩中での洗浄剤の可溶性は、塩および洗浄剤それ自体の組成に関連し得る。混合実験を、異なる塩組成における種々のアニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤の溶解性を試験するために実施した。０．５％（Ｓａｒｋｏｓｙｌ、ＬＤＳ、ＳＤＳ、およびＣＴＡＢ）または５．０％（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ２１、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｔｗｅｅｎ ８５、ＮＰ−４０、Ｂｒｉｊ ３０、およびＳｐａｎ ２０）の最終濃度で、界面活性剤を、塩溶液に対して加えた。この塩溶液は、ｐＨ６．０またはｐＨ１０．０で、ＬｉＩ、ＮａＩ、ＫＩ、ＲｂＩ、ＣｓＩ、ＧｕＳＣＮ、ＧｕＨＣｌ、またはＮａＣｌＯ４を含有した。表１２に示すように、濃度は、加えた塩について２Ｍ、４Ｍまたは６Ｍであった。いくつかの塩溶液は、８Ｍの尿素を含み、そして他の塩溶液は、８Ｍの尿素を含まなかった。界面活性剤の可溶性を、可溶性または不溶性のいずれかとして記録した。塩溶液中の界面活性剤の可溶性を、最初に、曇りまたは沈殿の形成に対する目視観測によって決定した。得られた溶液をまた、沈殿ペレットが存在しないことによって、沈殿物が存在しないことを確認するために遠心分離した。溶液中に曇りを生じたかまたは沈殿物および沈殿ペレットを形成した界面活性剤を、不溶性（Ｘ）と記録し、そして遠心分離後に明らかなペレットを形成しない透明な溶液を生じた界面活性剤を、可溶性（Ｓ）として記録した。「Ｓ（Ｖ）」の記録を有するいくつかの洗浄剤は、塩溶液中に溶解したが、著しく粘稠な溶液を生じた。これらの結果を、表１２に示す。観測された不溶性は、ｐＨに独立であるように考えられ、そして変性試薬の尿素の添加によって変化しなかった。
【０１４７】
【表１２】
【０１４８】
（実施例１３）
いくつかのカチオン性界面活性剤の可溶性を、異なるカオトロピズムの塩溶液中で試験した。試験したカチオン性界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣｌ）、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＣｌ）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＣｌ）、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム（ＤＥＤＴＡＢ）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（Ｄ１０ＴＡＢ）、および臭化ドデシルトリフェニルホスホニウム（ＤＴＰＢ）であった。試験したカチオン性界面活性剤のそれぞれは、１％濃度で存在した。カチオン性界面活性剤のそれぞれは、２％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するカオトロピズムの塩の１つの５Ｍ溶液中で試験した。それぞれのカチオン性界面活性剤および塩の組み合わせを、ｐＨ６（５０ｍＭ ＭＥＳ）、ｐＨ８（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、およびｐＨ１０（５０ｍＭ ＡＭＰ）で試験した。各界面活性剤の可溶性を、視覚的に評価し、そして実施例１２において使用した同一の基準を用いて記録した。これらの結果を表１３に示す。
【０１４９】
【表１３】
【０１５０】
これらの結果は、可溶性と界面活性剤の鎖長との関係を示唆する。さらに、対アニオンの半径もまた、洗浄剤の可溶性に影響する。１２個以下の炭素原子のアルキル鎖長を有する界面活性剤（例えば、ＤＥＤＴＡＢ、Ｄ１０ＴＡＢ（Ｄ１０ＴＡＢ）、ＤＴＰＢ、ＤＴＡＢおよびＤＴＡＣｌ）は、より長い界面活性剤よりもより可溶性と考えられる。大きなヨウ化物アニオンの存在下では、カチオン性界面活性剤のいくつかは、不溶性であった。全てのカチオン性界面活性剤は、他のカオトロピズムの塩よりも、ＧｕＨＣｌおよびＬｉＣｌの両方においてより可溶性であった。
【０１５１】
（実施例１４）
ＤＴＡＢおよびＤＴＡＣｌの存在下で、界面活性剤−核酸沈殿物の形成が可逆的であることを確認するために、以下の実験を実施した。仔ウシ胸腺のゲノムＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を、１８ゲージの皮下注射針中を３回通すことによって部分的に切断した。８μｇの切断されたＤＮＡを含有する９０μＬの溶液を、１６の微量遠心管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）のそれぞれの中へ入れた。ＤＴＡＢを、８つのチューブに最終１．６％濃度まで加え、そしてＤＴＡＣｌを残りの８つに加えた。このチューブを、手短にボルテックスし、そして沈殿物を、全てのチューブにおいて注目した。次いで、８つのカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）溶液を、ｐＨ６．０で５０ｍＭ ＭＥＳおよび５Ｍの以下：ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＩ、ＧｕＨＣｌまたはＧｕＳＣＮの１つとともに調製した。６００μｌのそれぞれのカオトロープ溶液を、別々に、ＤＴＡＢおよび沈殿物とともに６つの異なるチューブに加えた。６００μｌのそれぞれのカオトロープ溶液を、別々に、ＤＴＡＣｌおよび沈殿物とともに６つの異なるチューブに加えた。結果を、表１３に示す。溶液を、ＤＮＡが溶解した（「Ｒ」）かまたは溶解しない（「ＩＲ」）かどうかについて評価した。
【０１５２】
核酸沈殿物は、界面活性剤それ自体が可溶でないカオトロピズムの溶液を含む、ほとんどのカオトロピズムの塩溶液中に溶解した。
【０１５３】
（実施例１５）
ラットの尾由来のゲノムＤＮＡを入手しようと試みるために、５０ｍｇのラットの尾の小片を、微量遠心管中の、５ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０μＭ ＡＴＡ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および１％の以下のカチオン性界面活性剤：ＣＴＡＣｌ、ＣＴＡＢ、ＴＴＡＢ、ＤＴＡＢ、ＭＮＬＥ（クオーターニウム８４、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）、ＭＫＰ（オレアルコニウムクロリド、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＫＰ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｐ，Ｌｔｄ）、およびＭＷＬ（コムギ（ｗｈｅａｔ）リピドエポキシド、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ
ＷＬＥ；Ｍｃｌｎｔｙｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．）を含有する、２００μｌの緩衝液中に浸軟した。このチューブを、６５℃で１０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ、Ｍｏｄｅｌ５４３６）で混合しながら６０分間インキュベートした。各チューブから、１００μｌアリコートおよび５０μｌアリコートを、新たなチューブに移した。５Ｍ ＧｕＳＣＮ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、および２％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する、６００μｌのカオトロープ溶液を、各チューブに加え、そして溶液をＳｃｈｌｅｒｉｎパターンが消失するまで混合した。消化されない組織微粒子物（例えば、毛および骨）を除去するために、このチューブを、４℃で５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清溶液中に放出されたゲノムＤＮＡを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 製品番号６１００−０１）を使用する、ガラスフィルター−吸着および真空濾過法によって単離した。サンプル溶液を、ガラス繊維ＧＦ／Ｂフィルター（９６−ウェル形式における）に移し、そして２．４ｐｓｉ真空で排出した。フィルターを、９０％エチルアルコールで３回洗浄した。ＤＮＡを、最初に、２００μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の使用によって、ガラス繊維から回収した。室温での３分間のインキュベーションに続いて、ＤＮＡ含有溶出液を、９６−ウェルサンプル保管トレー中に排出および回収した（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ４３０６７３７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。第２の分離溶出液を、１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで実施した。
【０１５４】
回収の結果を、ラットの尾の組織（ｍｇ）あたりの回収されたＤＮＡ（ｎｇ）の関数として表１３に示す。さらに、ＮａＯＨによる回収における実質的な増加から、回収されたＤＮＡが、アルカリ性条件でより効率的に溶出したと考えられる。
【０１５５】
（実施例１６）
ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターに可逆的に結合される精製ＤＮＡの能力を、評価した。ゲノムＤＮＡの結合および放出を、２％ Ｔｗｅｅｎ ２０の存在下で、３つの異なるｐＨレベル（ｐＨ６、８および１０）にて、３つの異なる塩（チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジニウム、および臭化ナトリウム）のうちの１つの存在下、および２つの異なるカチオン性界面活性剤（ＤＴＡＢおよびＤＴＡＣｌ）のうちのいずれか１つの存在下またはいずれのカチオン性界面活性剤の非存在下で、試験した。８マイクログラムの部分剪断仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡ（実施例１５にて調製されるような）を、６００μｌのＤＮＡ結合溶液に添加した。このＤＮＡ結合溶液は、５Ｍの１つの塩（ＮａＳＣＮ、ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮ）、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２％のＴｗｅｅｎ ２０、５０ｍＭの緩衝液（ＭＥＳ、ｐＨ６．０；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；またはＡＭＰ、ｐＨ１０のうちの１つ）および１％のカチオン性界面活性剤（ＤＴＡＢ、ＤＴＡＣｌ、または界面活性剤を含まない水（コントロール「Ｎｏ Ｄｅｔｅｒｇ（界面活性剤なし）」として））を含む。従って、２７個の異なる組み合わせを試験した。ゲノムＤＮＡを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６１００−０１）を使用する真空濾過によって、ガラスフィルター上に吸着させた。サンプル溶液を、ガラス繊維ＧＦ／Ｂフィルター（９６ウェル形式）に移し、そして２．４ｐｓｉの減圧下で脱気した。フィルターを、９０％ ＥｔＯＨで３回洗浄した。最初に、ＤＮＡを、２００μｌのＴＥ溶液を使用することによってガラス繊維から回収した。室温で３分のインキュベーション後、このＤＮＡ含有溶出物を、脱気し、そして９６ウェルサンプルアーカイブトレイ（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ４３０６７３７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に収集した。２回目の別の溶出を、１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨを用いて行った。
【０１５６】
ほとんどの条件下で、図１４に示されるように、精製ＤＮＡの結合は、乏しかった。チオシアン酸グアニジニウムが結合塩である場合、カチオン性界面活性剤ＤＴＡＢおよびＤＴＡＣｌの存在は、ＤＮＡの回収を阻害するようであった。
【０１５７】
（実施例１７）
ＤＮＡ回収に対するＴｗｅｅｎ−２０の効果を、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０）の非存在下で、実施例１５に示される実験を繰り返して試験した。８マイクログラムの部分剪断仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡ（実施例１５にて調製されるような）を、６００μｌのＤＮＡ結合溶液に添加した。このＤＮＡ結合溶液は、５Ｍの１つの塩（ＮａＳＣＮ、ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮ）、２０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭの緩衝液（ＭＥＳ、ｐＨ６．０；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；またはＡＭＰ、ｐＨ１０のうちの１つ）および１％のカチオン性界面活性剤（ＤＴＡＢ、ＤＴＡＣｌ、または界面活性剤を含まない水（コントロール「Ｎｏ
Ｄｅｔｅｒｇ（界面活性剤なし）」として））を含む。従って、２７個の異なる組み合わせを試験した。ゲノムＤＮＡを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．６１００−０１）を使用する真空濾過によって、ガラスフィルター上に吸着させた。サンプル溶液を、ガラス繊維ＧＦ／Ｂフィルター（９６ウェル形式）に移し、そして２．４ｐｓｉの減圧下で脱気した。フィルターを、９０％ ＥｔＯＨで３回洗浄した。最初に、ＤＮＡを、２００μｌのＴＥ溶液を使用することによってガラス繊維から回収した。室温で３分のインキュベーション後、このＤＮＡ含有溶出物を、脱気し、そして９６ウェルサンプルアーカイブトレイ（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ４３０６７３７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に収集した。２回目の別の溶出を、１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨを用いて行った。
【０１５８】
Ｔｗｅｅｎ ２０の非存在下でさえ、アッセイした全ての条件は、ＤＮＡをガラス繊維ＧＦ／Ｂ膜に結合させた場合に、ＤＮＡの回収をほとんど示さなかった（図１５）。チオシアン酸グアニジニウムおよびＤＴＡＢの存在は、いくらかの回収を示した。カチオン性界面活性剤が、結合中に存在しない場合、ＤＮＡは、３つの全ての塩によってＧＦ／Ｂから回収され得た（図１５）。また、より多くのＤＮＡが、ｐＨ８．０またはｐＨ１０．０よりもｐＨ６．０にて、ＧＦ／Ｂから回収された。
【０１５９】
（実施例１８）
カチオン性界面活性剤ＤＴＡＢの阻害効果をさらに試験した。ＤＴＡＢを、ＤＮＡ結合が固相上で生じる前、ＤＮＡ結合が固相上で生じる間、またはＤＮＡ結合が固相上で生じた後の、精製反応の種々の時点で導入した。ＤＮＡ結合および精製手順を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ６１００上のＧＦ／Ｂガラス繊維フィルター（９６ウェル形式）を使用して行った。種々の精製条件を、図１６において示されるように、Ａ〜Ｄで示す。
【０１６０】
セットＡにおいて、ＧＦ／Ｂ膜を、１％ ＤＴＡＢを含まない（Ａ−）かまたは含む（Ａ＋）、１００μｌの液体で前処理した。次いで、仔ウシ胸腺ＤＮＡ（８μｇ）を、８００μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）中で結合させた。次いで、膜を、９０％エタノールで洗浄し、そして結合した核酸を、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００ｍＭ ＮａＯＨで溶出した。
【０１６１】
セットＢにおいて、膜を前洗浄しなかった。仔ウシ胸腺ＤＮＡ（８μｇ）を、８００μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）中で、ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターに結合させた。結合後、膜を、１％ ＤＴＡＢを含まない（Ｂ−）かまたは含む（Ｂ＋）かのいずれかの、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）において洗浄した。次いで、膜を、９０％エタノールで洗浄し、そして結合した核酸を、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００ｍＭ ＮａＯＨで溶出した。
【０１６２】
セットＣにおいて、膜を前洗浄しなかった。仔ウシ胸腺ＤＮＡ（８μｇ）を、１％ ＤＴＡＢを含まない（Ｃ−）かまたは含む（Ｃ＋）かのいずれかの、８００μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）中で、ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターに結合させた。次いで、膜を、９０％エタノールで洗浄し、そして結合した核酸を、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００ｍＭ ＮａＯＨで溶出した。
【０１６３】
セットＤにおいて、ＧＦ／Ｂ膜を、１％ ＤＴＡＢを含まない（Ａ−）かまたは含む（Ａ＋）、１００μｌの５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）で前処理した。次いで、仔ウシ胸腺ＤＮＡ（８μｇ）を、８００μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）中で結合させた。次いで、膜を、９０％エタノールで洗浄し、そして結合した核酸を、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００ｍＭ ＮａＯＨで溶出した。これらの結果を、図１６に示す。
【０１６４】
ＧＦ／Ｂ膜をＤＴＡＢで前処理し（Ａ＋）、そしてＤＮＡを、ＤＴＡＢを含まないＧｕＳＣＮまたはＮａＢｒの存在下で結合させた場合、ＧＦ／Ｂ膜からのＤＮＡ回収は、ＤＴＡＢで前処理しなかった（Ａ−）ＧＦ／Ｂ膜からの回収と比較して、有意に減少されなかった。従って、この実験において、界面活性剤は、固相と直接的に相互作用して核酸の結合を阻害しないようであった。
【０１６５】
ＤＮＡを、塩の存在下であるがＤＴＡＢの非存在下でＧＦ／Ｂ膜に結合させ、ＤＴＡＢを、洗浄緩衝液としてカオトロピック溶液中に含ませた（Ｂ＋）場合、膜からのＤＮＡ回収は、洗浄緩衝液中にＤＴＡＢが存在しない（Ｂ−）ＧＦ／Ｂ膜からの回収と比較して、有意に減少された。これらの結果は、洗浄工程中のカチオン性界面活性剤の存在は、固相に結合したＤＮＡを除去することを示唆する。
【０１６６】
この実験における固相への結合中のカチオン性界面活性剤の効果は、結合中に使用される塩の組成に関連するようであった。ＮａＢｒが結合塩である場合（ＮａＢｒ Ｃ＋とＮａＢｒ Ｃ−を比較して）、およびＤＴＡＢを結合中に含ませた場合（Ｃ＋）、ＤＮＡの回収は、結合中にＤＴＡＢを含まない場合の回収と比較して、有意に減少された。しかし、ＧｕＳＣＮが結合塩である場合、回収の有意な減少は、見られなかった（ＧｕＳＣＮ Ｃ＋とＧｕＳＣＮ Ｃ−を比較して）。従って、この実験において、塩組成に依存して、結合中のカチオン性界面活性剤の存在は、固相へのＤＮＡ結合を阻害し得る。
【０１６７】
Ａにおけるように、１％ ＤＴＡＢの非存在下（Ｄ−）または存在下（Ｄ＋）の５Ｍ 塩（ＮａＢｒまたはＧｕＳＣＮのいずれか）でのＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターの前処理は、核酸のその後の結合に影響しないようであった。
【０１６８】
図１６における結果は、この実験において、ＤＴＡＢが、ＧＦ／Ｂ膜と密接に相互作用してＤＮＡ結合をブロックしなかったことを示す。この研究において、カチオン性界面活性剤は、結合反応中に存在する場合、ＧＦ／Ｂ膜へのＤＮＡの結合をブロックした。さらに、この研究において、一旦ＤＮＡを（カチオン性界面活性剤の非存在下で）結合させると、その後の洗浄工程中のカチオン性界面活性剤の存在は、結合されたＤＮＡの膜から除去を生じた。
【０１６９】
（実施例１９）
ガラス繊維ＧＦ／Ｂ膜へのＤＮＡ結合を干渉したプロテアーゼ消化反応の成分を同定することを試みるために、ＣａＣｌ２、アウリントリカルボン酸およびＴｗｅｅｎ ２０の各々を、ＤＮＡ結合反応において別々に評価した。ＤＮＡの結合および回収は、サンプル中のタンパク質の存在によって影響され得るので、結合を、１３％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の存在下または非存在下で行った。
【０１７０】
この研究において、より高い濃度でのＣａＣｌ２（図２０）、アウリントリカルボン酸（図１８）およびＴｗｅｅｎ ２０（図１９）の添加が、全て、ＧＦ／Ｂ膜からのＤＮＡの回収を増加した。アウリントリカルボン酸を、１０μＭ〜３２０μＭまでの２倍増分の６つの濃度で評価し、ＤＴＡＢおよびＴｗｅｅｎ ２０の両方を、１％〜１６％までの２倍増分の５つの濃度レベルで評価した。ＤＮＡを、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで別に溶出した。最大の増加が、１０μＭのアウリントリカルボン酸（図１８）、２０％のＴｗｅｅｎ−２０（図１９）、および２０ｍＭのＣａＣｌ２（図２０）で見出された。
【０１７１】
対照的に、この研究において、カチオン性界面活性剤ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）の存在は、ＤＮＡの回収を有意に減少させた（図１７）。さらに、回収されたＤＮＡは、ＧＦ／Ｂ膜に非常に密接に結合され、その結果、ＤＮＡのほとんどが、０．１Ｎ ＮａＯＨでのみ溶出されて回収された。
【０１７２】
（実施例２０）
ＤＮＡ回収を阻害する主要成分としてカチオン性界面活性剤を同定したので、阻害性効果を打ち消す非イオン性界面活性剤の能力を試験した。仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡ（８μｇ）を、漸増濃度のＴｗｅｅｎ ２０と共に０％、１％および４％のドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）の存在下で、ガラス繊維ＧＦ／Ｂ膜に結合させた。
【０１７３】
結合緩衝液もまた、５Ｍ ＧｕＳＣＮ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、および５０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ６．０）を含んだ。ＤＮＡを、２００μｌのＴＥで最初に溶出し、次いで、１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで別に溶出した。全ての結合工程および溶出工程を、周囲温度で行った。
【０１７４】
カチオン性界面活性剤の非存在下（０％ ＤＴＡＢ）であるが、漸増Ｔｗｅｅｎ ２０濃度下で、ＤＮＡ回収は、任意の非イオン性界面活性剤の非存在下で観察された（図２１）。回収されたＤＮＡの量は、Ｔｗｅｅｎ ２０の濃度が少なくとも１％に増加された場合に、有意に増加した（図２１）。
【０１７５】
１％のＤＴＡＢの存在下で、繊維からのＤＮＡ回収は、Ｔｗｅｅｎ−２０の非存在下で完全に阻害された（図２２）。少なくとも２％の濃度へのＴｗｅｅｎ ２０の添加は、カチオン性界面活性剤の阻害効果を実質的にブロックした（図２２）。４％のＤＴＡＢの存在下で、少なくとも４％のＴｗｅｅｎ−２０の濃度が、カチオン性界面活性剤の阻害効果を実質的にブロックした（図２３）。この研究において、適切な量のＴｗｅｅｎ−２０を結合反応に添加した場合、ガラス繊維ＧＦ／Ｂフィルターから回収されるゲノムＤＮＡの量は、カチオン性界面活性剤の存在によって影響されなかった（図２４）。さらに、結合されたＤＮＡのほとんどは、ＴＥ溶出によって回収され、そしてアルカリ溶出緩衝液を必要としなかった（図２５）。
【０１７６】
（実施例２１）
組織解離方法の特定の成分の存在下でのガラス繊維ＧＦ／Ｂ膜へのゲノムＤＮＡの結合を生じる条件が同定されたので、ラット尾組織由来のＤＮＡを単離する能力を試験した。この実施例において、２つのガラス繊維膜ＧＦ／ＢおよびＧＦ／Ｄを試験した。
【０１７７】
ラット尾切片（５０ｍｇ）を、２００μｌの溶液（１ｍｇのプロテイナーゼＫ、１％のＤＴＡＢ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０μＭのＡＴＡおよび２０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する）を含む微量遠心チューブ中で消化した。反応チューブを、全てのサンプルが消化されるまで、混合しながら６５℃でインキュベートした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｍｏｄｅｌ ５４３６）。未消化の骨および毛を含む濁った溶液にまでラット尾切片を減少させるのに、４５〜５０分要した。次いで、消化物を、５Ｍ ＧｕＳＣＮ、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび６％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む６００μｌの結合溶液によって清澄化した。次いで、チューブの底に骨および未消化粒子を残して、ＧＦ／ＢフィルターまたはＧＦ／Ｄフィルターにその溶液を移すことによって、放出されたＤＮＡをこのフィルターに結合させた。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ６１００上でのサンプルの真空媒介脱気後、フィルターを、９０％エタノールで洗浄した。ゲノムＤＮＡを、１５０μｌのＴＥまたは０．０１ＮのＮａＯＨの溶液いずれかの溶液で溶出した。回収されたＤＮＡの完全性を可視化するために、得られた溶出液の２０μｌを、１％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロミド染色した（図２８）。
【０１７８】
この研究において、ガラス繊維フィルターＧＦ／Ｂは、ＧＦ／Ｄよりも、ゲノムＤＮＡ回収に優れていた（図２６）。ＴＥと比較して、０．０１Ｎ ＮａＯＨで溶出した場合に、より多くの量のＤＮＡが回収された。ほとんどのＤＮＡは、０．０１Ｎ ＮａＯＨで膜から回収されたが、いくらかのＤＮＡは、膜に残ったままであり、これは、０．１Ｎ ＮａＯＨでのさらなる溶出で確認された（図２７）。回収されたＤＮＡは、図２８に示されるように、高分子量のＤＮＡである。
【０１７９】
（実施例２２）
実施例２１からのプロセスを使用して、いくつかのラット組織およびマウス尾からゲノムＤＮＡを単離した。ラット筋肉、肝臓、肺、膵臓、腎臓、脳、小腸および尾の５０ｍｇの切片、ならびにマウス尾の５０ｍｇ切片を、２００μｌの消化溶液を含む微量遠心チューブに置いた。この消化溶液は、１ｍｇのプロテイナーゼＫ、１％のＤＴＡＢ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０μＭのＡＴＡおよび２０ｍＭのＣａＣｌ２を含んだ。
【０１８０】
３つの同一のサンプルを、各組織型について処理した。これらの反応チューブを、混合しながら６５℃で、６０分間インキュベートした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｍｏｄｅｌ ５４３６）。各組織の消化時間を記録し、そして６０分の終了時に、未消化組織の量を決定した。５０ｍｇの種々のげっ歯類組織を分解するのに要した時間量を、表１４に示す。
表１４
【０１８１】
【表１４】
【０１８２】
＊１〜３ｍｇの組織が、６０℃での６０分間のインキュベーション後に未消化のままであった。
【０１８３】
表１４に示されるように、これらの組織のほとんどが、１時間未満で効果的に消化された。肝臓、脳および腎臓の消化は、１時間後に約９５％完了した。
【０１８４】
６０分間の消化後、次いで、６００μｌの結合溶液を各サンプルに加えた。結合溶液は、５Ｍ ＧｕＳＣＮ、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび６％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含んだ。次いで、サンプルを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ６１００上のＧＦ／Ｂフィルター膜上に置いた。次いで、フィルターを、９０％エタノールで洗浄した。ゲノムＤＮＡを、１００μｌの０．０１ＮのＮａＯＨ溶液で溶出し、そしてその最初の溶出物を、１００μｌの１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．０で中和した。得られた２００μｌの溶出物のうち、２０μｌを、１％アガロース上での電気泳動（１０μｌ／レーン）に使用した（図３０）。回収されたＤＮＡは、図３０に見られるように、高分子量のＤＮＡであった。
【０１８５】
総ゲノムＤＮＡ回収率を、図２９に示す。ゲノムＤＮＡの総量（１ウェルあたりのｇＤＮＡのμｇ）を、グラフの左の目盛りによって測定されるように、棒グラフで示す。ＤＮＡの相対純度を、黒菱形で示し、そしてグラフの右の目盛りによって示される、２８０ｎｍに対する２６０ｎｍのＵＶ吸収の比によって測定する。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】図１は、４０ｆｇ／ｍｌ〜４０ｕｇ／ｍｌの範囲の濃度においてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋでインキュベートされた、色素標識されたカゼイン基質の蛍光強度（蛍光単位で測定される）を示す。
【図２Ａ】図２は、色素標識されたカゼイン基質のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ消化に対する、様々な界面活性剤の効果を図示する。図２Ａは、２０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｂは、２．５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｃは、１．２５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示す。テトラアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きのダイヤ）は、カチオン性界面活性剤である、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および混合された臭化アルキルトリメチルアンモニウムの平均データを示す。ベジルアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きの丸）は、カチオン性界面活性剤である、塩化ベンズアルコニウム、臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、および塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムの平均データを示す。Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍの記号（×）は、カチオン性界面活性剤である、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＳＤＣ−８５、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＫＰ、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＷＬＥおよびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥの平均データを示す。ポリクオーターニウム（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｕｍ）の記号（黒塗りの丸）は、カチオンポリマーである、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００６、およびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００７の平均データを示す。水（黒塗りのダイヤ）を使用して得られた結果、およびアニオン性の界面活性剤ＳＤＳ（黒塗りの四角）を使用して得られた結果もまた示される。エラーバーは、各データセットの標準偏差を示す。
【図２Ｂ】図２は、色素標識されたカゼイン基質のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ消化に対する、様々な界面活性剤の効果を図示する。図２Ａは、２０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｂは、２．５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｃは、１．２５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示す。テトラアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きのダイヤ）は、カチオン性界面活性剤である、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および混合された臭化アルキルトリメチルアンモニウムの平均データを示す。ベジルアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きの丸）は、カチオン性界面活性剤である、塩化ベンズアルコニウム、臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、および塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムの平均データを示す。Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍの記号（×）は、カチオン性界面活性剤である、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＳＤＣ−８５、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＫＰ、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＷＬＥおよびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥの平均データを示す。ポリクオーターニウム（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｕｍ）の記号（黒塗りの丸）は、カチオンポリマーである、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００６、およびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００７の平均データを示す。水（黒塗りのダイヤ）を使用して得られた結果、およびアニオン性の界面活性剤ＳＤＳ（黒塗りの四角）を使用して得られた結果もまた示される。エラーバーは、各データセットの標準偏差を示す。
【図２Ｃ】図２は、色素標識されたカゼイン基質のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ消化に対する、様々な界面活性剤の効果を図示する。図２Ａは、２０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｂは、２．５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示し；図２Ｃは、１．２５μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む反応組成物を示す。テトラアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きのダイヤ）は、カチオン性界面活性剤である、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および混合された臭化アルキルトリメチルアンモニウムの平均データを示す。ベジルアルキルアンモニウムハライドの記号（白抜きの丸）は、カチオン性界面活性剤である、塩化ベンズアルコニウム、臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、および塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムの平均データを示す。Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍの記号（×）は、カチオン性界面活性剤である、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＳＤＣ−８５、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＫＰ、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＷＬＥおよびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ＮＬＥの平均データを示す。ポリクオーターニウム（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｕｍ）の記号（黒塗りの丸）は、カチオンポリマーである、Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００６、およびＭａｃｋｅｒｎｉｕｍ ００７の平均データを示す。水（黒塗りのダイヤ）を使用して得られた結果、およびアニオン性の界面活性剤ＳＤＳ（黒塗りの四角）を使用して得られた結果もまた示される。エラーバーは、各データセットの標準偏差を示す。
【図３】図３は、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋおよび様々な界面活性剤を含む、反応組成物を使用して遊離された、μｇ核酸／ｍｇサンプルで測定される、核酸の量を図示する。
【図４−１】図４は、表示された界面活性剤を含む反応組成物とのインキュベーションに続いて、遊離された核酸（上清）の量とサンプル中に残る核酸（ペレット）との間の比較を提供する、染色されたアガロースゲルを示す。
【図４−２】図４は、表示された界面活性剤を含む反応組成物とのインキュベーションに続いて、遊離された核酸（上清）の量とサンプル中に残る核酸（ペレット）との間の比較を提供する、染色されたアガロースゲルを示す。
【図５】図５は、２ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋおよび示される界面活性剤を含む反応組成物中で、４５℃で２０分間、インキュベートされた肝臓片から、遊離および単離された核酸の量を図示する。これらの図において使用する場合、ＮＭＰは１−メチル−２−ピロリジノンである。
【図６】図６は、遊離および単離された、図５の核酸の品質（完全性）を実証する、臭化エチジウム染色されたアガロースゲルを示す。
【図７】図７は、１ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋおよび表示された界面活性剤および添加剤を含む、反応組成物中で、４５℃で３０分間インキュベートされた肝臓片から、遊離および単離された核酸の量を図示する。これらの図において使用する場合、「無し」は、さらなる界面活性剤が添加されなかったことを意味する。
【図８】図８は、遊離および単離された、図７の核酸の品質（完全性）を実証する臭化エチジウム染色されたアガロースゲルを示す。
【図９】図９は、１ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋおよび表示された界面活性剤および添加剤を含む、反応組成物中で、４５℃で３０分間インキュベートをする前の、前処理溶液に肝臓片を曝露する工程の効果を図示する。これらの図において使用される場合、ＨＴＳＰ ２Ｘは、核酸精製リジン溶液を意味し；ＡｃｒＯｒは、アクリジンオレンジを意味する。
【図１０】図１０は、界面活性剤：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処置の前に、前処理溶液中でインキュベートされたサンプルから、遊離および単離された核酸の質を示す、染色されたアガロースゲルを示す。
【図１１】図１１は、可変量のアウリントリカルボン酸を含む反応組成物を使用して、遊離および単離された核酸の量を質を示す、染色されたアガロースゲルを示す。
【図１２】図１２は、様々なカチオン性化合物を用いて、遊離および単離された、核酸の量および完全性の比較を提供する、染色されたアガロースゲルを示す。
【図１３】図１３は、ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて初めに溶出し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨを用いて溶出した時の、５ＭのＧｕＳＣＮ、２％のＴｗｅｅｎ ２０中で、異なる種々の界面活性剤を使用した、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ消化されたラットの尾からのゲノムＤＮＡの回収の平均有効性を示す。値は、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１４】図１４は、ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて初めに溶出し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨを用いて溶出した時の、異なる多数のｐＨ値、塩、および界面活性剤を使用した、２％のＴｗｅｅｎ ２０の存在下におけるグラスファイバーＧＦ／ＢフィルターからのゲノムＤＮＡの回収の有効性を示す。値は、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１５】図１５は、ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて初めに溶離し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨを用いて溶離した時の、異なる多数のｐＨレベル、塩、および界面活性剤を使用した、Ｔｗｅｅｎ ２０の非存在下におけるグラスファイバーＧＦ／ＢフィルターからのゲノムＤＮＡの回収の有効性を示す。値は、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１６】図１６は、カチオン性界面活性剤、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）を、ＤＮＡ結合の前、結合の間、結合の後に添加した場合の、ＤＮＡ回収に対する効果を示す。値は、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１７】図１７は、ＴＥを用いて初めに溶出し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨで溶出した時の、ＤＴＡＢ濃度の関数としての、１％のウシ胎仔血清を含む緩衝液からのゲノムＤＮＡの回収を示す。値は、２つの溶出工程後の、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１８】図１８は、ＴＥを用いて初めに溶出し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨで溶出した時の、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）濃度の関数としての、１％のウシ胎仔血清を含む緩衝液からのゲノムＤＮＡの回収を示す。値は、２つの溶出工程後の、核酸の累積的な遊離を示す。
【図１９】図１９は、ＴＥを用いて初めに溶出し、続いて１００ｍＭのＮａＯＨで溶出した時の、Ｔｗｅｅｎ ２０濃度の関数としての、１％ウシ胎仔血清を含む緩衝液からのゲノムＤＮＡの回収を示す。値は、２つの溶出工程後の、核酸の累積的な遊離を示す。
【図２０】図２０は、ＴＥを用いて最初に溶出し、続いて１００ｍＭ ＮａＯＨを用いて溶出した場合の、ＣａＣｌ２濃度の関数としての、１％胎仔ウシ血清を含む緩衝液からのゲノムＤＮＡの回収を示す。値は、２つの溶出工程後の、核酸の累積した解離を示す。
【図２１】図２１は、ＤＴＡＢを欠く３．７５Ｍ チオシアン酸グアニジニウムの存在下での、ＧＦ／ＢフィルターへのゲノムＤＮＡの結合に対する、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度の効果を示す。値は、ＴＥ、１００ｍＭ ＮａＯＨを用いて溶出された際に解離された核酸の量、および２つの条件下で溶出された正味の量を示す。
【図２２】図２２は、３．７５Ｍ チオシアン酸グアニジニウムおよび１％ ＤＴＡＢの存在下での、ＧＦ／ＢフィルターへのゲノムＤＮＡの結合に対する、Ｔｗｅｅｎ２０濃度の効果を示す。値は、ＴＥ、１００ｍＭ ＮａＯＨを用いて溶出された際に解離された核酸の量、および２つの条件下で溶出された正味の量を示す。
【図２３】図２３は、３．７５Ｍ チオシアン酸グアニジニウムおよび４％ ＤＴＡＢの存在下での、ＧＦ／ＢフィルターへのゲノムＤＮＡの結合に対する、Ｔｗｅｅｎ２０濃度の効果を示す。値は、ＴＥ、１００ｍＭ ＮａＯＨを用いて溶出された際に解離された核酸の量、および２つの条件下で溶出された正味の量を示す。
【図２４】図２４は、示されたＤＴＡＢ濃度の存在下でのＧＦ／ＢフィルターへのゲノムＤＮＡの結合およびＴＥを用いた溶出、続くＮａＯＨを用いた溶出に対する、Ｔｗｅｅｎ２０の効果を示す。
【図２５】図２５は、示されたＤＴＡＢ濃度の存在下でのＧＦ／ＢフィルターへのゲノムＤＮＡの結合およびＴＥを用いた溶出による回収に対する、Ｔｗｅｅｎ２０濃度の効果を示す。
【図２６】図２６は、ＧＦ／ＢまたはＧＦ／Ｄガラスフィルターのいずれか、および０．０１Ｎ ＮａＯＨまたはＴＥのいずれかを用いた、ラット尾部（約５０ｍｇ）からのゲノムＤＮＡの回収を示す。
【図２７】図２７は、最初に０．０１Ｎ ＮａＯＨまたはＴＥで溶出したＧＦ／ＢまたはＧＦ／Ｄガラスファイバーフィルターからの、０．１Ｎ ＮａＯＨを用いる第２溶出後の、ラット尾部（約５０ｍｇ）から回収した総ゲノムＤＮＡを示す。
【図２８】図２８は、１ｍｇのプロテイナーゼＫおよび１％のＤＴＡＢを用いて消化し、３．７５Ｍ ＧｕＳＣＮおよび４．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０の存在下でＧＦ／ＢまたはＧＦ／Ｄフィルターに結合させた、５０ｍｇのラット尾部切片由来のゲノムＤＮＡを示す。ゲノムＤＮＡを、１５０μｌのＴＥで溶出し、続いて０．０１ＮのＮａＯＨを用いて溶出した。この溶出物のうち、２０μｌ（全サンプルの１４％）を、１％ アガロース上でのゲル電気泳動に使用した。
【図２９】図２９は、５０ｍｇの種々のげっ歯類組織から回収したゲノムＤＮＡを示す。組織を、１％ ＤＴＡＢの存在下で１ｍｇのプロテイナーゼＫで消化した。解離した核酸を、４．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む３．７５Ｍ チオシアン酸グアニジニウムの存在下でＧＦ／Ｄ膜に結合させた。
【図３０】図３０は、１ｍｇのプロテイナーゼＫおよび１％のＤＴＡＢを用いて消化し、３．７５Ｍ ＧｕＳＣＮおよび４．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０の存在下でＧＦ／Ｂフィルターに結合させた、５０ｍｇのラット組織切片および３５ｍｇのマウス尾部切片由来のゲノムＤＮＡを示す。ゲノムＤＮＡを、１００μｌの０．０１Ｎ ＮａＯＨで溶出し、続いて１００μｌのＴＥを用いて溶出した。ゲル電気泳動（１％アガロース上）に関して、各溶出物の１５μｌを使用した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルから核酸を得て、そして該核酸を固相に結合させるための方法。
【請求項１】
生物学的サンプルから核酸を得て、そして該核酸を固相に結合させるための方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【公開番号】特開２００６−１９７９４１（Ｐ２００６−１９７９４１Ａ）
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−７４８４４（Ｐ２００６−７４８４４）
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【分割の表示】特願２００２−５８７６００（Ｐ２００２−５８７６００）の分割
【原出願日】平成１３年１１月２８日（２００１．１１．２８）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【分割の表示】特願２００２−５８７６００（Ｐ２００２−５８７６００）の分割
【原出願日】平成１３年１１月２８日（２００１．１１．２８）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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