疾患の処置における細胞毒性物質、薬物プレ増感剤および化学増感剤としてのヒアルロナン
【課題】本発明は、疾患の処置に関する化学治療剤のバイオアベイラビリティーを高めることに関する。特に本発明は、化学治療剤のバイオアベイラビリティーを高める方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のヒアルロナンを投与する工程を含む方法に関する。
【解決手段】本発明は、処置を必要としている被験体の処置方法であって、化学治療剤が単独で投与された場合よりもより有効であるように該化学治療剤と組み合わせて、該被験体に治療有効量のヒアルロナンを投与する工程を含む方法を提供する。
【解決手段】本発明は、処置を必要としている被験体の処置方法であって、化学治療剤が単独で投与された場合よりもより有効であるように該化学治療剤と組み合わせて、該被験体に治療有効量のヒアルロナンを投与する工程を含む方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾患処置のために化学治療剤のバイオアベイラビリティーを高めることに関する。特に、本発明は、疾患処置用の化学治療剤のバイオアベイラビリティーを高めるため、ヒアルロナンを単独で、あるいは化学治療剤と組み合わせて使用することに関する。本発明はまた、薬物耐性疾患の処置であって、これにより、ヒアルロナンを単独で、あるいは化学治療剤と組み合わせて用いてその薬物耐性が克服されるか、あるいは軽減されるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトを含む動物を苦しめる多くの疾患は化学治療剤を用いて処置される。例えば化学治療剤は、結合性または自己免疫疾患、代謝障害、および皮膚科学的疾患を含む腫瘍性疾患の処置において有益であることが示され、多くのこれらの物質は非常に有効であり、全くバイオアベイラビリティーの問題を被らない。
【０００３】
化学治療剤の適正な使用には、化学治療剤の選択、用量の決定、および治療の着手の前に、疾患の性質の履歴および病態生理学を徹底的に熟知することが必要とされる。各被験体は、毒性を増強するかもしれない要因、例えば明らかあるいは隠れた感染、出血性障害、栄養失調状態、深刻な代謝障害などに注意して、注意深く評価されなければならない。さらに、特定の主要器官、例えば肝臓、腎臓、および骨髄の機能状態は非常に重要である。したがって、適当な化学治療剤の選択および有効な治療方法の工夫は被験体の現状に影響される。このような考察は投与される薬物の用量およびタイプに影響する。
【０００４】
不幸なことに、すべての化学治療剤が容易に使用可能であるわけではない。例えば、いくつかの化学治療剤は先天的に抗療性であり、ここでは動物細胞はこれらの物質に対して容易には応答せず、また他の化学治療剤は後天的耐性を被る。例えば、よく認識されているように、長い化学治療時には、時間が経過するにつれて化学治療剤の効果が減少するため、その変更を強要される被験体もいる。さらに、いくつかの化学治療剤は、本質的に先天的または後天的耐性によって影響されないが、それらがバイオアベイラビリティーに伴う本質的問題を有しているために、特定の疾患の処置において有効でない。細胞の耐性とバイオアベイラビリティーの問題の両者によく影響される一疾患は癌である。
【０００５】
癌は西洋社会における四大死の１つである。米国およびカナダにおいて、癌および癌による死の新規ケースの割合は１９９０〜１９９４年の間減少したが、米国において２，６０４，６５０人が１９９０〜１９９４年の間に癌で死亡したことがデータによって示されている（そのうち男性（５３％）は女性（４７％）より多かった）。最も一般的な癌による死の原因は、肺癌（７２８，６４１）、大腸および直腸癌（２８５，７２４）、乳癌（２１８，７８６）、および前立腺癌（１６９，９４３）であった。
【０００６】
女性の間で最も一般的な癌は、乳癌（３１％）、肺癌（１２％）、大腸および直腸癌（１２％）、子宮癌（６％）、卵巣癌（４％）であり、乳癌および卵巣癌は女性に見られるすべての癌の約３５％を占める。これらの型の癌であると診断された女性の大多数は外科手術、放射腺治療または化学治療を組み合わせて受ける。
【０００７】
癌の処置に用いられる化学治療剤は、（１）アルキル化剤、例えばメクロレタミン、クロロホスファミド、メルファラン、ウラシルムスタード、クロラムブシル、ブサルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾチシン、およびデクラバジン；（２）抗代謝産物、例えばメトトレキセート、フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、シタラビン、アザラビン、イドキシウリジン、メルカプトプリン、アザチオプリン、チオグアニン、およびアデニンアラビノシド；（３）天然産物誘導体、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトラマイシン、タキサン（例えばパクリタキセル）、ブレオマイシン、エトポシド、テニポシド、およびミトマイシンＣ；および（４）その他の物質、例えばヒドロキシ尿素、プロカルベジン、ミチタン、およびシスプラチナムを含むいくつかの広いカテゴリーに細分される。
【０００８】
（通常有効量において）臨床の多剤耐性が観察された重要な癌化学治療剤には、ビンブラスチン（０．１ｍｇ／キログラム／週）、ビンクリスチン（０．０１ｍｇ／キログラム／週）、エトポシド（３５〜５０ｍｇ／平方メートル／日）、ダクチノマイシン（０．１５ｍｇ／キログラム／日）、ドキソルビシン（５００〜６００ｍｇ／平方メートル／週）、ダウノルビシン（６５〜７５ｍｇ／平方メートル／週）、およびミトラマイシン（０．０２５ｍｇ／キログラム／日）が含まれる。
【０００９】
現在、化学治療剤に対する細胞の耐性を克服する有効な手段がないことは当業者によく理解されていることである。もっと重要なのは、毒性または副作用の付随する増大を伴なわずに化学治療剤のバイオアベイラビリティーを増大させる実際的な手段が存在しないことである。したがって、後天的または先天的な細胞の耐性に付随する問題を克服するか、あるいは少なくとも軽減する手段、ならびに化学治療剤のバイオアベイラビリティーを増大させる手段が必要がある。
【００１０】
発明者らは以前に、化学治療剤のための薬物デリバリービヒクルとしてのヒアルロナン（ＨＡ）の有用性を研究し、ＨＡがこれらの薬物と同時投与された場合に有用であることを発見した。この発明をカバーする国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ００／００００４を出願した（これは引用によりその全開示内容が本明細書中に包含される）。ＨＡはまたヒアルロン酸として既知であり、これは直鎖のポリマーを含む天然に存在する多糖類であり、動物界中に遍在することがわかっている。ＨＡは非常に水溶性であり、これにより生物系に関する理想的薬物デリバリービヒクルになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ００／００００４の出願後、発明者らは驚くべきことに、ＨＡが単独の物質として作用することを発見した。ＨＡはヒト乳癌細胞、およびプレ感作細胞に対して細胞毒性効果を発揮し、それらを化学治療剤に対してより感受性にする。したがって本発明は、化学治療剤に対して耐性であったか、あるいは耐性になった細胞を有効に処置できる方法を提供する。さらに重要なことに、開示される方法を用いて、被験体に対する効力を減少させることなく化学治療剤の用量を減少させることができる。本発明の方法は、ヒアルロナンを単独で、あるいは化学治療剤と組み合わせて投与することを含む。
【００１２】
本発明は、ヒアルロナン、その誘導体、アナログ、および塩がそれ自身細胞を阻害するだけでなく、標準的または、有効性が低いと思われる、より少ない用量の選択化学治療剤の安全な投与により、ヒト被験者を含む被験体を処置することを可能にするという発見に基づく。ヒアルロナンを化学治療剤と組み合わせてインビボ投与すると、難治性の細胞に対するこれらの物質の治療効果が高められ、これによりその後の多剤耐性の発生を防ぐ。
【００１３】
疾患細胞、例えば癌細胞はしばしば、膜電位の変化のせいで、より透過性の膜を有するか、あるいはその細胞内分子輸送の調節を変更でき、その結果細胞膨張を生じさせ得る増大した受容体ステータスを有する（Lang et al., 1993）。発明者らは、いかなる理論によって結び付けられることをも望まないが、彼らは、ＨＡが単独の物質として、ならびに治療剤の前処置として発揮する細胞性作用を説明できるいくつかの機構が存在することを仮定する：
１）ＨＡがＣＤ４４、ＲＨＡＭＭおよび結合したスカベンジャー受容体に結合すると、ＨＡの正味の負の電荷は細胞の膜電位を変化させ、細胞の透過性を増大させ、結果として疾患細胞へのより大量の薬物流入を可能にする。
２）ＨＡが疾患細胞、例えば腫瘍細胞と結合し、内在化すると、細胞溶解を導く高浸透圧性が存在し得る。
３）ＨＡは酸化的膜損傷を発揮し、アポトーシスを生じさせる。
４）ＨＡ内在化はミトコンドリア膜電位を高め、細胞死または増大した薬物保持を生じさせ得る。
【００１４】
ＨＡは飽和レベルで投与されるため、そのグリコサミノグリカンのコンスタントな内在化が存在し、これはＨＡの容量ドメイン内で平衡状態にある任意の治療剤を同時に内在化させ、薬物の濃縮された細胞内放出を生じさせることを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要旨
その最も広い側面では、本発明は、処置を必要としている被験体の処置方法であって、化学治療剤が単独で投与された場合よりもより有効であるように該化学治療剤と組み合わせて、該被験体に治療有効量のヒアルロナンを投与する工程を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、化学治療剤のバイオアベイラビリティーを高める方法であって、それを必要としている患者に有効量のヒアルロナンを投与する工程を含む方法を提供する。
【００１７】
ヒアルロナンを用いて、任意の投与される化学治療剤のバイオアベイラビリティーを大きく高めることができる。好ましくは、投与される化学治療剤は、カルマスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル（ロイケラン）、シスプラチン（プラチノール）、シタラビン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトキセトレート（メキサート）、ＣＰＴ１１１、エトポシド、プリカマイシン（plicamycin、ミトラシン）およびタキサン例えばパクリタキセルからなる群から選択されるものである。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、多剤耐性または薬物耐性細胞を処置または予防する方法であって、化学治療剤の投与前か、その投与といっしょにか、あるいはその投与後に、治療有効量のヒアルロナンを投与する工程を含む方法を提供する。
【００１９】
以下により完全に記載されるように、ヒアルロナンおよび化学治療剤を投与すると、少なくとも５０％まで；好ましくは６０％；さらにより好ましくは７０％以上の腫瘍生育の抑制が生じる。したがって、腫瘍生育および増殖の排除は、多剤耐性細胞の産生を排除し、癌の再発を減少させ、化学治療処置の効果を増大させる。
【００２０】
本発明はさらに、ヒアルロナンを含む、化学治療剤に対する細胞の感受性を増大させる医薬組成物を提供する。ヒアルロナンおよび／または化学治療剤は、さらなる医薬的担体とともに投与してもよい。
【００２１】
本発明はまた、癌細胞を処置する方法であって、その患者に治療有効量のヒアルロナンを投与する工程を含む方法を提供する。
【００２２】
典型的に、その癌細胞は化学治療剤に耐性である。
【００２３】
本発明のさらなる側面では、細胞の耐性を克服する方法であって、治療有効量のＨＡを投与する工程を含む方法を提供する。
【００２４】
本明細書の詳細な説明および請求の範囲を通じて、用語「含む」およびそのバリエーション、例えば「含んでいる」などは「含むが、それらに制限されない」を意味し、他の追加物、成分、整数または工程を排除することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、７５０，０００ダルトンＨＡに２４時間暴露され、その時点で写真撮影された、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。１０ｎｇ／ｍＬでは、細胞数の減少が生じたが、形態の変化は見られなかった。１００ｎｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬでは、細胞は浸透圧応答を受ける頂点を示し、細胞は膨張した。２ｍｇ／ｍＬおよび５ｍｇ／ｍＬでは、細胞は顆粒状になり、原形質膜が「へこみ」、浸透圧応答および／または細胞死の開始を示す可能性がある。
【図２ａ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図２ｂ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図２ｃ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図２ｄ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図２ｅ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図２ｆ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図３ａ】図３ａ−３ｄは、種々の濃度の７５０，０００ダルトンヒアルロナンに１時間、２４時間または３日間暴露された後、１時間、２４時間または３日間の種々の時間、４０ｎＭアドリアマイシンで処理された指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図は、広い濃度範囲のヒアルロナンが化学感作剤として作用するか、あるいは細胞毒性作用を発揮することができることを示す。
【図３ｂ】図３ａ−３ｄは、種々の濃度の７５０，０００ダルトンヒアルロナンに１時間、２４時間または３日間暴露された後、１時間、２４時間または３日間の種々の時間、４０ｎＭアドリアマイシンで処理された指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図は、広い濃度範囲のヒアルロナンが化学感作剤として作用するか、あるいは細胞毒性作用を発揮することができることを示す。
【図３ｃ】図３ａ−３ｄは、種々の濃度の７５０，０００ダルトンヒアルロナンに１時間、２４時間または３日間暴露された後、１時間、２４時間または３日間の種々の時間、４０ｎＭアドリアマイシンで処理された指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図は、広い濃度範囲のヒアルロナンが化学感作剤として作用するか、あるいは細胞毒性作用を発揮することができることを示す。
【図３ｄ】図３ａ−３ｄは、種々の濃度の７５０，０００ダルトンヒアルロナンに１時間、２４時間または３日間暴露された後、１時間、２４時間または３日間の種々の時間、４０ｎＭアドリアマイシンで処理された指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図は、広い濃度範囲のヒアルロナンが化学感作剤として作用するか、あるいは細胞毒性作用を発揮することができることを示す。
【図４】図４は、６週間の実験を通じて観察された非処理の毒性が存在することを示す。５−ＦＵ処理群と比較して、単独の物質または化学感作剤としてのＨＡ治療を受けたマウスは高められた健康を示し、ここでは動物は体重を失わず、その体重量を維持した。
【図５】図５は、６週間の実験の終了時点で、腫瘍重量を測定したところ、ＨＡ化学感作治療が食塩水群、ＨＡおよび５−ＦＵ群より有意に小さい腫瘍を生じた（ｐ＝０．００５）ことを示す。単独物質としてのＨＡはまた、食塩水コントロールと比べて主な腫瘍重量を減少させることによりその作用を示した。処置の最初の２週間は、腫瘍応答の大きな差異が観察されなかったが、その後、ＨＡ次いで５−ＦＵ腫瘍増殖は、他の処置群と比べて妨げられた。６週間の処置の間、腫瘍倍増サイクル数において興味深い差異が観察された。食塩水処置を受けたマウスは平均４腫瘍倍増を受けたが、一方、処置計画にＨＡを包含させると、腫瘍倍増時間が有意に増大し、ここにＨＡ／５−ＦＵ動物が１腫瘍倍増サイクルの平均を受け、これは５−ＦＵ細胞毒性に対するＨＡの効果を再び際立たせる。
【図６】図６は、ＨＡを同時投与すると、非リンパ性転移の有意な減少が生じることを示す。ＨＡ治療を受けたマウスを除き、初期腫瘍の近傍部分の頚部または腕下領域まわりに新規腫瘍が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明の方法および組成物は、化学治療剤、例えば、パクリタキセルのような抗癌剤、鎮痛薬、鎮静剤、ホルモンまたは抗生物質などに対する細胞の感受性を増大させるのに有用である。特に、本発明の方法および組成物は、細胞増殖性障害（例えば新生物）に関する細胞の感受性を増大させるのに有用である。非癌細胞への付随する毒性を伴わなずに効力を増大させることによって、本発明は、腫瘍を処置し、細胞毒性の結果としての再発および死亡の機会を予防するか、あるいは減少させるのに有用な方法および組成物を提供する。さらに、本発明は、多剤耐性表原型を導く任意の突然変異の前に癌細胞を排除することによって、多剤耐性細胞の数を排除または減少させる。したがって、多剤耐性腫瘍細胞が生じるのを減少させることにより、本発明は現在の治療様相の不十分な箇所を満足させる。
【００２７】
本明細書中で用いられる用語「被験体」とは、化学治療剤での処置を必要とする疾患または症状であって、ここにこの化学治療剤は望ましいものと比較して減少した効力を有している疾患または症状を有する任意の動物を表す。好ましくはこの被験体は細胞増殖性障害（例えば新生物障害）を患っている。本発明の目的の被験体には、哺乳類（例えばウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ）および、好ましくはヒトが含まれるがこれらに制限されない。
【００２８】
「細胞増殖性障害」とは、細胞または細胞群が正常でない増殖、典型的には異常型増殖を示すことを意味し、これにより新生物、腫瘍または癌が導かれる。
【００２９】
細胞増殖性障害には、例えば乳癌、肺癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、神経癌、卵巣癌、子宮癌、肝臓癌、膵臓癌、内皮癌、胃癌、腸癌、外分泌腺癌、内分泌腺癌、リンパ性癌、造血系の癌または頭部および頚部組織の癌が含まれる。
【００３０】
一般には、新生物性疾患は正常でない細胞増殖が新生物または腫瘍と称される組織塊を生じさせる症状である。新生物は構造および行動における種々の程度の異常性を有する。良性の新生物があり、また他のものは悪性あるいは癌性である。新生物疾患の有効な処置は、癌予防性または治療用手法に関する調査に対して貴重な貢献をすると考えられるだろう。
【００３１】
本発明の方法には、一態様において、（１）化学治療剤の投与前、その投与と同時、あるいはその投与後のヒアルロナンの投与；または（２）ヒアルロナンおよび化学治療剤の組み合わせの投与が関与する。
【００３２】
本明細書中で用いられる用語「治療有効量」とは、所望の治療応答を生じさせるのに有効な本発明の化合物量を意味する。例えば癌を予防するか、あるいは宿主における癌の徴候を処置するため、あるいは癌を処置するのに有効な量。
【００３３】
具体的な「治療有効量」は、明らかなように、処置されるべき具体的な症状、患者の身体状態、処置される哺乳類のタイプ、処置期間、（存在すれば）同時治療の性質、および用いられる具体的製剤およびその化合物またはその誘導体の構造などの要因に応じて変化する。
【００３４】
本明細書中で用いられる用語「医薬的担体」とは、ヒアルロナンおよび／または化学治療剤を動物またはヒトにデリバリーするための、製薬的に許容される溶媒、懸濁化剤またはビヒクルである。担体は液状物または固形物であってよく、計画される投与様式に応じて選択される。
【００３５】
本明細書中で用いられる用語「癌」とは、哺乳類に見られるすべてのタイプの癌または新生物または悪性腫瘍を表す。癌には、肉腫、リンパ腫および他の癌が含まれる。例は以下のタイプであるが、これらの具体的タイプの癌に制限することを意図しない：
前立腺癌、大腸癌、乳癌、ＭＸ−１およびＭＣＦライン、膵臓癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、ホーム、肺癌、マウス癌、黒色腫、白血病、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、脳の癌、頭部および頚部の癌、腎臓癌、中皮腫、肉腫、カポジ肉腫、胃癌および子宮癌。
【００３６】
本明細書中で用いられる用語「細胞」とは、哺乳類細胞（例えばマウス細胞、ラット細胞またはヒト細胞）を含むがこれらに制限されない。
【００３７】
ヒアルロナンおよび／または化学治療剤は、慣用の製薬的に許容される非毒性担体、アジュバント、およびビヒクルを含有する単位投与製剤として、経口、局所、または非経口投与することができる。本明細書中で用いられる用語「非経口」には、皮下注射、エアロゾル、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、頭蓋内、胸骨内注射または注入技術が含まれる。
【００３８】
本発明はまた、本発明の処置の新規方法において用いるための、適当な局所、経口、および非経口医薬製剤を提供する。本発明の化合物は、錠剤、水性または油性懸濁剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、粉末剤、顆粒剤、エマルジョン、カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤として経口投与することができる。経口使用のための組成物には、医薬的に質が高く、快適な調製物を製造するために、甘味料、香料、着色料および保存剤からなる群から選択される１またはそれ以上の物質を含ませることができる。錠剤には、活性成分を、錠剤の製造に適する無毒の製薬的に許容される賦形剤と混合して含ませる。
【００３９】
これらの賦形剤は、例えば、（１）不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；（２）顆粒化剤および崩壊剤、例えばコーンスターチまたはアルギン酸；（３）結合剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアカシア；および（４）滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであってよい。これらの錠剤はコーティングしなくてもよいし、既知の技術によりコーティングして、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、これにより、より長い期間にわたって持続した活性を提供してもよい。例えば、時間遅延物質、例えば一ステアリン酸グリセロールまたは二ステアリン酸グリセロールを用いることができる。また米国特許第４，２５６，１０８号；第４，１６０，４５２号；および第４，２６５，８７４号に記載の技術を用いてコーティングを行い、コントロール放出用の浸透圧性治療錠剤を形成させてもよい。
【００４０】
本発明方法に有用なヒアルロナンならびに化学治療剤は、インビボ適用に関して、注射によるか、あるいは独立にあるいはいっしょに、経時的段階的灌流により、非経口的に投与することができる。投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的であってよい。インビトロ研究では、この物質を適当な生物学的に許容されるバッファーに加えるか、あるいは溶解させ、細胞または組織に加えることができる。
【００４１】
非経口投与用の調製物には、滅菌水性または非水性溶液剤、懸濁剤、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブオイル、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルエステルがある。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液（食塩水および緩衝化溶媒を含む）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンガー静脈内ビヒクル（液体および栄養補充物を含む）、電解液補充物（例えばリンガーデキストロースに基づくもの）などが含まれる。また保存剤および他の添加剤、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、成長因子および不活性ガスなどが存在してもよい。
【００４２】
本発明を用いて、例えば新生物、癌（乳癌、肺癌、腎臓癌、皮膚癌、神経癌、卵巣癌、子宮癌、肝臓癌、膵臓癌、内皮癌、胃癌、腸癌、外分泌腺癌、内分泌腺癌、リンパ系の癌、造血系の癌または頭部および頚部組織の癌）、線維性障害などを含む細胞増殖障害に関連する病因を処置できることが想定される。
【００４３】
また本発明の方法および化合物は、化学治療剤処置に関連する他の疾患、例えば神経退化障害、ホルモン不均衡などの処置に用いることができる。したがって、本発明は、細胞増殖、新生物、癌などに関連する障害を改善する方法であって、この障害を有する被験体の障害部位において、細胞増殖またはその障害を阻害または改善するのに十分な量のヒアルロナンおよび化学治療剤で処置することを含む方法を含む。
【００４４】
一般に、本明細書中で用いられる用語「処置する」、「処置」などは、被験体、組織または細胞に影響し、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、完全にあるいは部分的に細胞増殖性障害またはその徴候または症状を妨害するか、ならびに／あるいは障害および／または、例えば異常細胞増殖に帰する有害作用を部分的または完全に治療するという点で、治療的であってよい。本明細書中で用いられる「処置する」とは、脊椎動物、哺乳類、特にヒトにおける細胞増殖性障害の任意の処置または予防を包含し、これには以下が含まれる：
（ａ）障害にかかりやすいかもしれないが、まだその障害を有すると診断されたことがない被験体において障害が発生するのを防ぐこと；
（ｂ）障害を阻害する、すなわちその発達を休止させること；または
（ｃ）障害を救出するか、あるいは改善する、すなわち障害の退行を生じさせること。
【００４５】
本発明は、新生物、癌などを含む細胞増殖性障害の改善に有用な種々の医薬組成物を含む。本発明の一態様にしたがう医薬組成物は、担体、賦形剤および添加剤または補助剤を用い、被験体への投与に適当な剤型としたヒアルロナン、そのアナログ、誘導体または塩および１またはそれ以上の化学治療剤を用いて調製する。よく用いられる担体または補助剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、ミルクプロテイン、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物性および植物性油、ポリエチレングリコールおよび溶媒、例えば滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールが含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養素補充物が含まれる。保存剤には、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスが含まれる。他の製薬的に許容される担体には、水性溶液、無毒の賦形剤（塩、保存剤、バッファーなどを含む）が含まれる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed. Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975) および The National Formulary XIV., 14th ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975)（これらの内容は引用により本明細書中に包含される）に記載されている）。医薬組成物のｐＨおよび種々の成分の正確な濃度は、当分野の慣用技術にしたがって調節する。Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed.) を参照。
【００４６】
医薬組成物は好ましくは投与単位で製造し、投与する。固形投与単位は錠剤、カプセル剤および坐剤である。被験体の処置では、化合物の活性、投与様式、障害の性質および重篤度、被験体の年齢および体重に応じて、種々の毎日の用量を用いることができる。しかし、特定の環境下では、より大量またはより少量の毎日の用量が適当であり得る。毎日の用量の投与は、個別の投与単位またはいくつかのより少量の投与単位の剤型における単一投与および特定の間隔で細分された用量の複数回投与の両者によって行うことができる。
【００４７】
本発明に記載の医薬組成物は、治療有効用量を局所性投与あるいは全身性投与することができる。この使用に関する有効量は、もちろん、疾患の重篤度および被験体の重量および全体的状態に依存する。典型的には、インビトロで用いられる投与量は、この医薬組成物のインサイチュ投与に有用な量の指標を提供することができ、動物モデルを用いて具体的障害の処置に関する有効量を決定することができる。種々の考察は、例えば Langer, Science, 249: 1527, (1990) に記載されている。経口使用用の製剤は、活性成分が不活性固形希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されているゼラチン硬カプセルの剤型であってよい。これらはまた、活性成分が水または油状溶媒、例えば落花生油、液状パラフィンまたはオリーブ油と混合されているゼラチン軟カプセルの剤型としてもよい。
【００４８】
水性懸濁剤は通常、活性物質を水性懸濁剤の製造に適当な賦形剤と混合して含む。このような賦形剤は、（１）懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガム；（２）分散剤または湿潤剤（これらは（ａ）天然に存在するホスファチド、例えばレシチン；（ｂ）酸化アルキレンと脂肪酸の縮合産物、例えばポリオキシエチレンステアラート；（ｃ）酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールの縮合産物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール；（ｄ）酸化エチレンと、脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合産物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、または（ｅ）酸化エチレンと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導された部分エステルの縮合産物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであってよい）であり得る。
【００４９】
医薬組成物は滅菌注射用水性懸濁液または油性懸濁液の剤型であってよい。この懸濁液は、上記適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いる既知の方法にしたがって製剤化することができる。この滅菌注射用調製物はまた、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液剤または懸濁剤、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液剤であってよい。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌、固定油は溶媒または懸濁媒体として慣用的に用いられる。この目的のため、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の低刺激性固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は注射剤の製造に用途がある。
【００５０】
本発明の、化学治療剤と組み合わされたヒアルロナンはまた、リポソームデリバリー系、例えば小単層性小胞、大単層性小胞、および多層性小胞の剤型で投与することができる。リポソームは種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンから形成することができる。
【００５１】
本発明化合物の投与量は、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重のオーダーであり、好ましい投与量は、約５ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日（約０．３ｇｍ〜約１．２ｇｍ／患者／日）の範囲である。担体物質と混合されて、単一の用量を生じさせることができる活性成分の量は、処置される宿主および具体的な投与様式に応じて変化するだろう。例えば、ヒトへの経口投与に関して意図される製剤には、約５ｍｇ〜１ｇの活性化合物を、適当かつ好都合な量の担体物質（これは全組成物の約５〜９５パーセントまで変化し得る）とともに含ませることができる。単位投与剤型は一般に、約５ｍｇ〜５００ｍｇの活性成分を含むだろう。
【００５２】
しかし、任意の特定の患者に関する具体的用量レベルは、用いられる具体的化合物の活性、年齢、体重、全体的健康、性別、食事、投与期間、投与経路、排泄頻度、薬物コンビネーション、および治療を受ける具体的疾患の重篤度を含む種々の要因に依存することが理解されよう。
【００５３】
さらに、本発明の化合物には、水または一般的有機溶媒と溶媒和物を形成し得るものがある。このような溶媒和物は本発明の範囲内に含まれる。
【００５４】
本発明の化合物は、さらに他の化合物と混合することができ、効力のある混合物を提供できる。その組み合わせが本発明のヒアルロナンの活性を排除しない限り、化学治療剤の化学的にコンパチブルな任意の組み合わせを含むことが意図される。
【００５５】
単に以下の非制限的実施例に言及し、本発明をさらに記載する。しかし、以下の実施例は単に例示的であり、いかなる意味においても上記本発明の一般性を制限するものとして理解されるべきでない。特に、本発明は癌に関連して詳細に記載されているが、本明細書中の発見は癌の処置に制限されないことが明らかに理解されよう。例えばＨＡは他の症状の処置に用いることができる。
【実施例】
【００５６】
実施例１
ヒアルロナンおよび５−フルオロウラシル溶液の製造
すべてのインビトロおよびインビボ実験で用いるＨＡは Kyowa Hakko Kogyo (Yamaguchi, Japan) から入手した。５−ＦＵは Sigma，St. Louis, USA から入手した。アドライマイシン (Adraimycin) は Cytomix, Northcote, Melbourne, Australia から入手した。用いたＨＡの標準的プロファイルは表１に示すものである。
表１
ヒアルロナンバルク乾燥粉末に関する説明シート
【表１】
【００５７】
ピロゲンを含まない注射用等級水に乾燥ＨＡ（様式上、Ｍｒ ７．５×１０５ｋＤａ）を溶解することによって、ＨＡ溶液の１０ｍｇ／ｍＬストックを製造した。均質の溶液を保証するため、ＨＡを４℃で一晩の後、ボルテックスして溶解した。ストック溶液の製造中、ＨＡがその分子量を維持していることを保証するために、この溶液を Sepacryl S-1000 サイズ排除ゲル（カラム仕様、１．６ｃｍ×７０ｃｍ、サンプルサイズ２ｍＬ、フロー速度１８ｍＬ／ｈおよび２ｍＬ フラクションサイズ）で分析した。カラムフラクション中、ウロン酸アッセイによってヒアルロナンを検出した。
【００５８】
ウロン酸アッセイを用いて、ゲルろ過クロマトグラフィー手順より収集したフラクションからヒアルロナンの存在を定性的に検出した。次いで各フラクションの２５μＬ量を９６ウェルプレートに移した。次いでカルバゾール試薬（３Ｍ カルバゾール／０．０２５Ｍ ボレート（Ｈ２ＳＯ４中））２５０μＬをこれらのフラクションに加えた。９６ウェルプレートを８０℃で４５〜６０分インキュベートした。５５０ｎｍフィルターを有する Dynatech MR7000 プレートリーダーを用いて９６ウェルプレートを読み取った。吸光度がバックグラウンド吸光度より＞３標準偏差になった時点で有意であると考えた。バックグラウンドは、Ｖ０およびＶｔ前後の同数のサンプルポイントをとる（ここでとった平均数は１６）ことによって計算した（Fraser et al. 1998）。
【００５９】
粉末にした５−ＦＵを０．１Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ８．９）中に溶解して５−ＦＵのストック溶液を調製し、ピロゲンを含まない注射等級０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌを用いて濃度１ｍｇ／ｍＬにした。この保存溶液を０．２２μｍフィルターに通してろ過し、確実に滅菌した。必要量のストック溶液を上記のセルライン特異的生育培地に加えて、５−ＦＵを希釈した。
【００６０】
Cytomix から０．９％ＮａＣｌ中のアドリアマイシンの１０ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【００６１】
実施例２
癌細胞形態に対するヒアルロナンの影響の試験
ＨＡ結合親和力（Culty et al, 1994）およびＣＤ４４およびＲＨＡＭＭのＨＡ受容体の発現（Wang et al, 1996）に基づいてヒト胸腺癌セルラインＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を選択した。これらのセルラインの特徴を表２に示す。
表２
ヒト乳癌セルラインのヒアルロナン結合および受容体発現
【表２】
ａ：Culty et al, 1994
ｂ：Wang et al, 1996
【００６２】
セルラインＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を慣用的に培養し、１７５ｃｍ２培養フラスコ中の１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）および抗生物質／抗真菌性試薬を補充した Leibovitz Ｌ−１５培地において、１００％（ｖ／ｖ）空気が入った湿度コントロールインキュベーター中３７℃で、単層として、サブクローニングした。
【００６３】
グルタミンを含む Leibovitz-L-15（１０×濃縮物）、ＲＰＭＩ（１０×濃縮物）、イーグル基本培地（Eagle basal medium, ＥＢＭ、１０×濃縮物）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０９％ ｗ／ｖ ビカルボナート、ハンク平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、１０×濃縮物）および、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、１０×濃縮物）はＳｉｇｍａ（St Louis, Mo., USA）から購入した。粉末濃縮物を必要量の逆浸透脱イオン化ピロゲン不含蒸留水に溶解し、単一強度溶液を作成し、０．２２μｍ高圧ろ過（Millipore Corporation, MA. U.S.A.）によって滅菌し、４℃で保存した。ＦＣＳは CSL Ltd., Australia から購入した。ＦＣＳは−２０℃で保存した。１０，０００ユニットのペニシリン、ストレプトマイシン１０ｍｇおよびアンホテリシン２５μｇ Ｕ／ｍＬを含む抗生物質／抗真菌性試薬溶液（１００×濃縮物）はＳｉｇｍａ（St Louis, USA）から得た。０．９％ ｗ／ｖ 塩化ナトリウム中、ブタトリプシン５ｇおよびＥＤＴＡ２ｇ／Ｌを含むトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（１０×濃縮物）はＳｉｇｍａ（St Louis, Mo., USA）から得た。すべての乳癌セルラインはAmerican tissue culture collection (Rockville, USA) から購入した。すべてのプラスチック製使い捨て培養容器は Greiner (Austria) から購入した。８ウェル、組織培養顕微鏡スライドグラスは Linbro (Flow Laboratories, VA, USA) から得た。
【００６４】
この試験では、ＭＤＡ ＭＢ−４６８、ＭＤＡ ＭＢ−２３１およびＭＤＡ ＭＢ−４３５セルラインを、１０％ ＦＣＳを補充した９０％ Leibovitz Ｌ−１５培地で培養した。集密した後、培養をＨＢＳＳ中で１×洗浄し、０．２５％ トリプシン／０．０５％ ＥＤＴＡ中でトリプシン処理した。塩類溶液１５ｍＬ＋細胞懸濁液０．２ｍＬを加えて、この細胞懸濁液を自動細胞カウンター（ZM-2 Coulter Counter）を用いてカウントした。
【００６５】
細胞を多数の
ＭＤＡ ＭＢ−４６８：２５，０００細胞／ｍＬ培地
ＭＤＡ ＭＢ−２３１：１２，０００細胞／ｍＬ培地
ＭＤＡ ＭＢ−４３５：１２，０００細胞／ｍＬ培地
に再懸濁した。ウェル当たり細胞懸濁液１ｍＬを加えて細胞を４８ウェルプレート（１ｃｍ２表面領域）にプレートした。細胞を２４時間付着させた後、培地を除去し、単層を洗浄した。試験培地は；０〜１μＭ アドリアマイシンまたは５−フルオロウラシルを含む培養培地であって、０〜１μＭのＨＡ（形式上Ｍｗ ７５０，０００）を加えるか、あるいは加えないものであった。この細胞をいくつかの組み合わせのＨＡおよび薬物に、種々の時間および種々の濃度で暴露した（表３）。
【００６６】
表３
ヒアルロナンおよび薬物に関する、ヒト乳癌セルラインとのインキュベーション条件
【表３】
【００６７】
インキュベーションおよび培養期間の後、細胞単層をＨＢＳＳで洗浄し、０．２５％ トリプシン／０．０５％ ＥＤＴＡ中でトリプシン処理した。塩類溶液１５ｍＬ＋細胞懸濁液０．２ｍＬを加えることによってこの細胞懸濁液を自動細胞カウンター（ZM-2 Coulter Counter）を用いてカウントした。結果は以下のように計算し、薬物なしコントロールの％として記載した：
【数１】
。
あるいは実験に基づいて以下のように計算し、薬物コントロールの％として記載した：
【数２】
。
【００６８】
実施例２に記載の指数関数的に生育するヒト乳癌細胞ＭＤＡ ＭＢ ２３１を０−５ｍｇ／ｍＬ（形式上Ｍｒ ７５０，０００Ｄ）と２４時間インキュベートした。２４時間の時点で、細胞をカウントし、ＣＰＲ（１６００フィルムは Eastman Kodak Company, Rochester, USA より得た）を用いて写真撮影した。
【００６９】
ＨＡを乳癌細胞と３０分、１時間、２４時間または３日間インキュベートすると、変化した応答が観察され、乳癌細胞数の減少は０〜２９％の範囲であった（表４参照）。
【００７０】
表４
ヒト乳癌セルラインに対するＨＡの細胞毒性作用
【表４】
＊値は２〜３回の測定の平均である。
【００７１】
また、ヒト乳癌細胞をＨＡとインキュベートすると、特定の形態変化（図１参照）、例えば原形質膜の膨張、サイトゾル成分のより多大な顆粒化が観察された。
【００７２】
ヒト乳癌細胞をＨＡに３０分、１時間、２４時間または３日間暴露した後、アドリアマイシンに暴露すると、ＨＡは薬物の細胞毒性を高めることがはっきりわかった（図３および表５）。
【００７３】
表５
乳癌セルラインのアドリアマイシンの細胞毒性に対するＨＡの作用
【表５】
すべての値は２〜３回の実験の範囲を表し、ここに数値は、薬物にＨＡを加えるか、あるいは薬物添加前に癌細胞をＨＡでプレ感作することによって達成されるＩＣ５０減少の倍率である。
【００７４】
実施例３
ヒアルロナンのインビボ効力
実施例２のインビトロ薬物感受性実験の結果に基づいて、ヒト乳癌のインビボ処置において、単独物質として、および化学増感剤としてのヒアルロナンの処置効力を評価した。
【００７５】
実施例２の結果から、癌セルラインＭＤＡ−ＭＢ−４６８を任意のヌードマウスヒト腫瘍異種移植片の作成に関する接種源として選択した。細胞を慣用の手順で培養し、上記実施例２に記載のようにサブカルチャーした。マウスへの注射用に、細胞を１００％集密まで培養し、０．０２５％トリプシン／０．０１％ ＥＤＴＡ溶液中でトリプシン処理し、Beckman TJ-6 bench centrifuge 中、４００ｇａｖで１０分間遠心分離して２回洗浄し、Model-ZM Coulter カウンターを用いてカウントし、血清を含まない Leibovitz L-15 培地中、１×１０８細胞／ｍＬで再懸濁した。
【００７６】
Walter and Eliza Hall Research Institute, Melbourne Australia から購入した６〜８週齢胸腺欠損ＣＢＡ／ＷＥＨＩヌード雌性マウスを特定の病原を含まない条件下、無菌のえさおよび水を自由に摂取できるようにして維持した。各マウスは５０μＬ中に５×１０６細胞を含む１回の注射を受けた。この細胞は、２６ゲージ針を用いて乳脂肪床（mammary fat pad）内へ第一乳頭下に直接注射した（Lamszus et al, 1997）。腫瘍測定は毎週行い、３垂直直径（ｄ１ｄ２ｄ３）を測定した。腫瘍容量は、式：
【数３】
を用いて評価した。
癌細胞接種約４〜８週間後に５−ＦＵ＋ＨＡでの処理を開始した。各実験において用いたマウスに関する平均腫瘍サイズを表６にまとめる。
【００７７】
表６
各実験の開始時のヒト乳癌腫瘍のまとめ
【表６】
【００７８】
腫瘍誘導の約８週間後、腫瘍を有する２マウスに致死量のネンブタールを与えた。マウスを犠牲にし、３分以内に、腫瘍を外科的に取り出し、直ちに１０％緩衝化ホルマリン中で１２時間固定した。固定された腫瘍を一連の７０〜１００％エタノールで一晩脱水し、次いでパラフィン包埋し、これから２〜４μｍセクションをカットした。このセクションをスライドグラスに載せ、脱ワックスし、水に入れた。スライドグラスをＰＢＳ中３×５分洗浄した。異種親和性タンパク質を１０％胎児ウシ血清と１０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ洗浄することによってブロックした。
【００７９】
ＨＡおよびＨＡシンターゼ抗体の視覚化に用いられる二次抗体は Dako (California, U.S.A.) から購入した。３，３'−ジアミノベンジジン（Sigma Fast DAB）錠は Sigma, St. Louis, USA から得た。
【００８０】
検出抗体は室温で６０分間適用した。検出抗血清または抗体はＲＨＡＭＭ、ＣＤ４４ＨおよびＣＡＥに対するものであった。スライドグラスをＰＢＳ中で３×５分間洗浄し、メタノール中の０．３％Ｈ２Ｏ２に浸漬して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。さらにＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼコンジュゲート化ブタ抗ウサギ二次抗血清を室温で６０分間適用し、次いでＰＢＳ中で３×５分間洗浄した。Sigma Fast ３，３'−ジアミノベンジジン錠（ＤＡＢ）を製造元の指示書にしたがって調製し、ＤＡＢ溶液を室温で５〜１０分間適用した。スライドグラスをｔａｐ水で１０分間洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、マウントした。
【００８１】
個々のマウス体重に応じて、５０μＬ中３０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵ（平均体重６０ｋｇに関するヒト治療用量１０．５ｍｇ／ｋｇに相当；Inaba et al, 1988）をデリバリーするように個々の５−ＦＵ注射を調製した。１２．５ｍｇ／マウス体重ｋｇに相当する最終ＨＡ濃度を含むＨＡ注射は５０μＬ中１２．５ｍｇ／ｋｇのＨＡをデリバリーするように調製した。この量のＨＡを体内に注射すると、実験期間中、飽和キネティクスが観察されるだろう（Fraser et al, 1983）。
【００８２】
ヒト乳癌に関して最も一般に用いられる処置療法の１つはシクロホスファミド、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシルであり、これを２８日サイクルの１および８日に投与する。ヒト乳癌では、初期の処置療法は６サイクル間であり、この時点で患者の症状を再評価し、したがってマウスを長期間効力実験における６サイクル（６月）の処置および６サイクル（６週）短期間効力実験に暴露することによってできるだけ綿密にヒト処置療法をシミュレーションすることを試みた。マウスのライフサイクルが約２年巻であることを考慮し、短期間および長期間処置プロトコルを開始した（表７を参照）。
【００８３】
表７
処置投与プロトコル
【表７】
【００８４】
マウスを無作為に、短期間実験用には群当たり８動物の７群に分け、長期間実験用には８動物の５群に分けた（用量および処置投与計画に関しては表７を参照）。
【００８５】
６月以上続く化学治療が一般により大きな効果に結び付かないことが示されていた（Harris et al, 1992）ので、処置は６月計画を越えて延長しなかった。
【００８６】
長期間実験に関して処置適用の日に、動物の体重を量り、腫瘍容量を測定した。６週間実験では、毎日、動物の体重を量り、腫瘍容量を測定した。動物を個別に注射用ボックスに入れ、尾静脈を介して注射を投与した。ストレスが化学療法に応答する患者の主要な要因であり得ることが実験的に証明されていた（Shackney et al, 1978）ので、それぞれのおりに同数のマウスを入れ、実験の段階に応じており当たりの動物数が５〜８で変化するようにした。
【００８７】
実験終了時点は、疾患進行程度のせいで動物を安楽死させなければならない時または６月（長期間）または６週（短期間）処置計画が完了した時であった。動物倫理ガイドラインに応じて、疾患進行の程度を評価する独立した動物倫理職員が動物を２週間に１回モニターした。以下の範疇を用いて、動物が死を必要とする実験終了時点の段階に達したかどうかを決定した：
１）動物が動けないほど腫瘍重量が大きくなった場合；
２）動物が飲食しなくなり、劇的な体重喪失を経験した場合；
３）腫瘍サイズが体重の１０％以上になった場合。
【００８８】
実験終了時点では、ネンブタール（６０ｍｇ／ｍＬ）の０．１ｍＬ腹腔内注射によって動物を麻酔し、血液を集めた後、頸部脱臼によって動物を犠牲にした。
【００８９】
マウスを犠牲にした後すぐに、腫瘍、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、左および右腎臓、子宮、肺、胃、腸、脳およびリンパ節を切り出し、０．０６Ｍホスフェート（ｐＨ７．５）で緩衝化された４％ホルマリンおよびセチルピリジニウムクロライド１．０％ｗ／ｖに入れた。この組織を１６〜２４時間固定した後、組織学的に処理した。固定された組織を段階的に１００％エタノールまで脱水し、パラフィンブロックに包埋し、ここから２〜４μｍのセクションを顕微鏡スライドグラスに置いた。ヘマトキシリン核染色およびエオシン細胞質染色を用いてこの組織セクションを染色し、処置毒性を示し得るすべての病理学的特徴を強調した。
【００９０】
９〜１１のリンパ節を動物ごとに集め、腫瘍領域を排出するすべての節が確実に収集されるようにした。現在、リンパ節転移の検出に用いられる２つの方法が存在する：
ｉ）総器官構造の慣用的ヘマトキシリンおよびエオシン染色；および、
ｉｉ）癌マーカー、例えば癌胎児性抗原を用いる免疫組織化学。
【００９１】
転移検出の両方法をこの実験において用いた。すべての市販ＣＥＡ抗体がヒト乳癌細胞と反応するわけではないため、５つの異なる抗体の反応性を試験した（DAKO, Amersham and KPL）。
【００９２】
ヘマトキシリンおよびエオシン染色されたリンパ節は Dr P. Allen (免許を有する病理学者)が試験し、各節は顕微鏡下で腫瘍細胞の存在に関して試験された。ＣＥＡ免疫染色されたリンパ節は顕微鏡下で試験し、すべての正に染色された節をカウントし、リンパ節転移に関して正のものを考慮した。
【００９３】
腫瘍容量はキャピラリー測定によって毎日あるいは毎週モニターし、前記のように計算した。６週実験の最後に、腫瘍重量を測定した。ここでは、図６に示されるように、ＨＡ化学感作治療は食塩水群、ＨＡおよび５−ＦＵ群より有意に小さい腫瘍を有した（ｐ＝０．００５）。処置の最初の２週間は腫瘍応答に有意な差異は見られなかったが、その後、ＨＡ次いで５−ＦＵ腫瘍生育は他の処置群と比較して妨げられた。６週間の処置の間、腫瘍倍増サイクル数に興味深い差異が見られた。食塩水処置を受けたマウスは平均４腫瘍倍増を経験し、ＨＡを処置計画に包含すると腫瘍倍増時間が有意に増加し、ＨＡ／５−ＦＵ動物は平均１腫瘍倍増サイクルを経験し、５−ＦＵ細胞毒性に対するＨＡの効果が再び強調される。
【００９４】
すべての動物は、初期腫瘍に隣接するリンパ節におけるリンパ節転移を表した。リンパ節関与（動物当たりの転移性節数）のパーセンテージは、ＨＡ次いで５−ＦＵ、５−ＦＵおよびＨＡ処置によって大きく減少し、食塩水群はリンパ節関与量の６倍増加を示した。他の処置群は１２．２〜１４．３％の有意に少ないパーセンテージを示した（Dunnett's Multiple Comparison Test, p=<0.001）。
【００９５】
ＨＡを同時に投与すると、非リンパ系転移の有意な減少が生じた。ＨＡ治療を受けたマウスを除き、初期腫瘍に隣接する領域の頸または腕の下領域のまわりに新規腫瘍が観察された。
【００９６】
胃腸管毒性：
５−ＦＵの最も一般的な毒性作用の１つは胃腸管に対するものであり、出血性腸炎および出血性穿孔が生じ得る（Martindale, 1993）。動物をＧＩ管不調、例えば下痢に関して毎日モニターし、より深刻な毒性現象、例えば体重喪失に関して毎週モニターした。体重喪失は、Shibamoto et al, 1996 に引用されるように１ｇ×腫瘍容量（ｃｍ３）として計算された腫瘍重量を差し引くことによって見積もった正味の体重を計算することによってモニターした。すべての重量変化を示すために、以下のように動物の体重を処置開始の時点での体重に対して標準化した：
【数３】
。
【００９７】
６週実験を通して処置毒性は見られなかった。５−ＦＵ処置群と比較して、ＨＡ治療を単独物質としてか、あるいは化学増感剤として受けたマウスは、高められた健康状態を示し、動物は体重を喪失せず、その体重を維持した（図４）。
【００９８】
血液髄抑制
５−ＦＵ処置に付随する主要な毒性の１つとしては、骨髄の抑制およびそれに続く白血球細胞の低下であり、任意の処置関連の血液毒性を評価する必要があった。動物を麻酔した時点で、心臓または大血管から針およびシリンジで血液を収集した。マウステナシティー（tenacity）食塩水（Ｍ）中で血液を１／５０希釈し、血球計算器でカウントすることによって白血球細胞数を見積もった。好中球、リンパ球、および赤血球をカウントすることによって示差血球カウントを行った。血球細胞サブ集団のトータルの見積もりを、マウス血液に関して公開されているデータと比較した。
【００９９】
トータル白色細胞カウントおよびサブ集団差は処置にかかわらず、有意に異なっていなかった。
【０１００】
器官重量に対する処置の効果
処置が器官萎縮症または肥大症を誘導しなかったことを確認するため、器官を取り出し、死後重量を測定した。各器官の重量は全体の正味の体重の％として計算し、食塩水のみの群（群１）の器官重量と比較した。
【０１０１】
全体の患者の生存時間は処置の開始後動物が生存した時間（日数または週数）として計算した。各処置群のすべての動物は６週処置プログラムを完了した。
【０１０２】
器官重量に関して、ＨＡ治療は劇的な毒性を全く生じなかった。５−ＦＵを受けたマウスは肥大した脾臓（重量において６１％増加）を示し、ＨＡおよび５−ＦＵを同時に投与すると、この肥大を３１％まで有意に打ち消した（student t-test, p<0.001）。５−ＦＵ治療は子宮の縮小（２２％）を生じ、ＨＡ／５−ＦＵ治療はこの毒性作用を再び１０％まで減少させた（student t-test, p=0.04）。同時投与または処置日前に投与することによって処置計画にＨＡを加えると、食塩水処置群と比較して、初期腫瘍の重量が有意に減少することが明らかに示された（student t-test, p=0.006）。処置間に器官重量の他の差異は見られなかった。
【０１０３】
実施例４
５−ＦＵのインビトロ効力に対するヒアルロナン濃度の効果
実施例２に記載のように、ＭＤＡ−ＭＢ ４６８、ＭＤＡ−ＭＢ ４３５およびＭＤＡ−ＭＢ ２３１細胞を培養した。この培養が７０〜８０％集密に達した時点で、これを３７℃の１×ＨＢＳＳ中で洗浄し、０．２５％ トリプシン／０．０５％ ＥＤＴＡ１０ｍＬ中で細胞が完全に剥がれるまでトリプシン処理した。１ｍＬ ＦＣＳを加えてトリプシンを中和した後、細胞をカウントし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、以下のように再懸濁した：
ＭＤＡ−ＭＢ ２３１：１２，０００細胞／培地ｍＬ；
ＭＤＡ−ＭＢ ４６８：２５，０００細胞／培地ｍＬ；および、
ＭＤＡ−ＭＢ ４３５：１２，０００細胞／培地ｍＬ。
次いで細胞を４８ウェルプレートにまき、供給元の指示書にしたがってインキュベートした。２４時間後に培地を除去し、以下の試験培地で置換した：
ＭＤＡ−ＭＢ ４６８：４０ｎＭ アドリアマイシン；
ＭＤＡ−ＭＢ ２３１：５０ｎＭ アドリアマイシン；および、
ＭＤＡ−ＭＢ ４３５：１０ｎＭ アドリアマイシン。
４０ｎＭ アドリアマイシン培地：４５０ｍＬ（ストックアドリアマイシンは１．７ｍＭであり、したがって１，７００，０００／４０＝４２，５００；４５０，０００／４２５００＝１０．６ｕＬの１．７ｍＭ アドリアマイシン＋培地４５０ｍＬ）。
ストックＨＡは１４．３μＭで７００，０００ダルトンであった。
【０１０４】
結論
この実験では、ＨＡがインビトロおよびインビボ両方において抗癌薬物、５−ＦＵおよびアドリアマイシンの細胞毒性を高めることができることが明確に示された。より詳細には：
１）単独物質として、ＨＡは、インビトロおよびインビボの両方において癌細胞に対する細胞毒性作用を発揮する（図５）；
２）ＨＡ単独治療または化学感作治療の治療効力を評価すると、これは正常組織に対して毒性ではなく、薬物の毒性プロファイルを高めなかったことが示された。実際、この治療を受けたマウスは６週間の処置期間にわたって有意な重量増加およびリンパ節転移の減少を示した。ＨＡおよび５−ＦＵの同時投与は、最初の腫瘍容量の減少に対して劇的な作用を有した；ならびに、
３）処置計画に組み込まれたＨＡを有するマウスは二次的な腫瘍の形成を全く示さなかった（図６）。
【０１０５】
将来の実験
乳癌のインビボ処置に関するＨＡの使用に対して現在実験が行われている。これらの実験はＨＡ濃度および分子量の効果およびアドリアマイシンの細胞毒性に対して焦点が当てられている。これらの実験の目的はまた、薬物およびＨＡ暴露時間および投与計画、ならびにＨＡの作用の機構、すなわち受容体媒介性輸送および／または細胞膜に対する作用を確立することである。また薬物耐性癌細胞の化学感作におけるＨＡの役割に対するさらなるデータを収集する。
【０１０６】
セクション１：
すべての実験は、種々のレベルのＨＡ受容体、ＣＤ４４およびＲＨＡＭＭを発現する乳癌セルラインに対して行う。試験されるセルラインは、ＭＤＡ−ＭＢ ４３５、ＭＤＡ−ＭＢ ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ ４６８、ＺＲＬ−７５１およびいくつかのＭＤＲ−１発現乳癌セルラインである。
【０１０７】
薬物耐性および薬物感受性乳癌細胞に対するＨＡ／アドリアマイシン暴露時間および濃度の作用を調査する。４ ＭＤＲ−１ポジティブおよび４ ＭＤＲ−１ネガティブセルラインを、１、２．５、５、１０、２０、４０、６０、８０および１００ｎＭのアドリアマイシンに暴露し、以下の変化型を試験する：
１）１ｈ 薬物±１００ｎＭ ＨＡ暴露、次いで３日間の薬物を含まない培養；
２）一定の薬物暴露±１００ｎＭ ＨＡ（３日間）、３０分１００ｎＭ ＨＡ暴露、次いで薬物（１ｈ）、薬物を含まない細胞培養（３日間）；および、
３）２４時間１００ｎＭ ＨＡ暴露、次いで薬物（１時間）、薬物を含まない細胞培養（３日間）。
【０１０８】
これらの実験は、最適なＨＡ暴露時間および投与計画、ＨＡと組み合わせた場合のアドリアマイシン細胞毒性増加の振り幅およびＨＡが乳癌細胞内の流出ポンプ耐性を克服可能であるかどうかを確立する。
【０１０９】
現在までのところ、アドリアマイシンのＩＣ５０は９０ｎＭと測定された。９０ｎＭのアドリアマイシンを用い、ＨＡ（７００ｋＤ）濃度を１、３、１０、３０、１００、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭおよび１００μＭに変化させる。試験されるインキュベーションの変化型は以下である：
１）３０分間ＨＡ暴露、次いで１ｈ薬物暴露、薬物を含まない細胞培養（３日間）；
２）２４ＨＡ暴露、次いで１ｈ薬物暴露、薬物を含まない細胞培養（３日間）；および、
３）ＨＡ±薬物暴露（１ｈｒ）、薬物を含まない細胞培養（３日間）。
【０１１０】
ＨＡが癌細胞剥離および移動において中枢の役割を果たすことができることが示唆されているため、すべての剥離細胞を細胞生存に関して試験する。剥離細胞が生存する場合、ＦＡＣＳ表面エピトープ同定を用いてＨＡ受容体状態を測定する。短いＨＡオリゴ糖、すなわち４糖、６糖、１２糖、５６００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２５０，０００Ｄａを用いて同様の実験を行う。
【０１１１】
これらの実験はインビトロでの最適なＨＡ：薬物比、最適なＨＡ暴露時間および投与計画、アドリアマイシン細胞毒性に対するＨＡ分子量の効果を示す。
【０１１２】
最適なＨＡ濃度を測定した後、一連の時間経過実験においてＩＣ５０のアドリアマイシンを用い、アドリアマイシン代謝に対するＨＡのすべての効果を観察する。
【０１１３】
［１４Ｃ］アドリアマイシンを細胞に、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１６時間および２４時間暴露する。実験条件は以下である：
１）細胞を３０分間ＨＡ、次いで薬物に暴露；ならびに、
２）細胞を２４間ＨＡ、次いで薬物に暴露、ＨＡ／アドリアマイシンの同時暴露。
【０１１４】
細胞を取り出し、低張溶解し、１１３，０００gavで１時間遠心分離する。ＨＰＬＣを用い、膜ペレットおよび上清を代謝産物に関してカウントし、分析する。
【０１１５】
細胞をガバーガラス上で培養し、ここで細胞はアドリアマイシン±ＨＡに暴露され（上記暴露計画）、共焦点写真タイムコースを用いてサイトゾル摂取および薬物移動を追跡する。
【０１１６】
ＭＤＲ−１ポジティブおよびネガティブ乳癌セルラインに対するＨＡ受容体の同定、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ１０およびＲＨＡＭＭ受容体のＦＡＣＳ定量を行う。また、ＦＩＴＣ／ＨＡおよびＦＡＣＳ分析を用いるＨＡ／受容体の結合および飽和キネティクスの定量を行う。
【０１１７】
細胞を以下に暴露することによる：
１）ＨＡ（３０分間）、次いで薬物；
２）ＨＡ（２４時間）、次いで薬物；ならびに、
３）ＨＡ／アドリアマイシン。
これらのうち任意のものがＣＤ４４ｓおよびＲＨＡＭＭ受容体をブロックすることを決定することができる。表面エピトープＦＡＣＳ分析を用いて任意の生存細胞のこの受容体の状態を定量する。ＨＡ受容体のブロッキングがアドリアマイシンおよびＨＡ間の通常観察される相乗作用を減少させるならば、膜結合およびサイトゾル性アドリアマイシンを±ＨＡ受容体ブロッキングで定量する。
【０１１８】
セルラインによるＨＡ分解は［３Ｈ］ＨＡおよびゲルろ過クロマトグラフィー±受容体ブロッキングを用いて実験する。
【０１１９】
分子量４ｓａｃｃ、６ｓａｃｃ、１２ｓａｃｃ、５６００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２５０，０００Ｄａ、７５０，０００Ｄａおよび１，５００，０００ＤａのＨＡを、あらかじめ決められた「効果が観察された」濃度で乳癌セルラインとインキュベートし、以下のパラメータを調査する：
細胞外および細胞内カルシウム流動（細胞プローブアッセイ）。細胞骨格成分の調節（細胞骨格遺伝子のマイクロアレイ）、細胞の容量に対する作用（細胞サイズ分析）および癌細胞移動度（Boyden Chamber matrigel アッセイ）を行った。
【０１２０】
ＨＡのセルサイクルに対する作用は、分子量４ｓａｃｃ、６ｓａｃｃ、１２ｓａｃｃ、５６００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２５０，０００Ｄａ、７５０，０００Ｄａおよび１，５００，０００ＤａのＨＡを、あらかじめ決められた「効果が観察された」濃度で乳癌セルラインとインキュベートすることによって行う。細胞をヨウ化カリウムでラベルし、ＦＡＣＳ分析に付する。セルサイクルの各段階の細胞数を測定する。
【０１２１】
最適なＨＡ／ドキソルビシン調製物およびリポソーム性ドキソルビシンの前臨床試験において Liposome Company によって用いられる用量範囲を用いてリポソーム性ドキソルビシンおよびＨＡ／ドキソルビシン調製物のインビトロ効果を比較する。
【０１２２】
セクション２：
ＨＡ／アドリアマイシン抗癌治療が第一相ヒト乳癌細胞試験に進行する前に、予備毒性実験を行う必要がある。この実験は以下に焦点を当てる：
１）マウス体器官および体液へのアドリアマイシン取り込みに対するヒアルロナンの効果；
２）アドリアマイシンに関する予備用量範囲の確立
ヌードマウスにおいてＨＡがアドリアマイシンをヒト乳癌異種移植片に標的化するかどうかの測定；
３）市販のリポソーム性ドキソルビシンの、マウスにおけるＨＡ／ドキソルビシン取り込みとの比較；ならびに、
４）リポソーム性ドキソルビシンおよびＨＡ／ドキソルビシンの短期間効果の比較。
【０１２３】
Inaba et al, (1988) より、ヌードマウスにおけるアドリアマイシンの用量は、４ｍｇ／ｋｇであり、これは６０ｍｇ／ｍ２のヒト用量と等しい。ヒト腫瘍を保持するヌードマウスにアドリアマイシン±ＨＡを注射する。４ｍｇ／ｋｇ±１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡのアドリアマイシン濃度を用いる。実験プロトコルは以下の処置群を含む：
１）４ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン；
２）４ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン＋１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；ならびに、
３）４ｍｇ／ｋｇ リポソーム性ドキソルビシン。
【０１２４】
アドリアマイシン±ＨＡを、マウスの尾部静脈に定量的に注射する。
【０１２５】
２、１５、３０、６０分および１．５、２、４、８、２４および４８時間（４動物／時点）の時間間隔で、マウスにネンブタール０．１ｍＬをＩＰ注射して犠牲にした。全ての体器官、骨格筋、リンパ節、骨髄、尿および血液を取り出し、ＨＰＬＣおよび蛍光を用いてアドリアマイシン含量を測定する。
【０１２６】
ヒト乳癌をヌードマウス（WEHI CBA 株）内に作成する。このマウスに以下を注射する：
１）マウスＬＤ５０ １０ｍｇ／ｋｇ；
２）４ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン；
３）４ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン＋１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；
４）８ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン；
５）８ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン＋１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；
６）４ｍｇ／ｋｇ リポソーム性ドキソルビシン；
７）食塩水；ならびに、
８）１２．５ｍｇ／ＨＡ。
【０１２７】
毎週のサイクルで２日目、４日目、６日目に、上記をマウス（８動物／群）の尾部静脈に定量的に注射する。
【０１２８】
マウスの腫瘍用量、体重、えさ摂取および機能を毎日モニターする。
【０１２９】
８週実験の完了時に、ネンブタール０．１ｍＬをＩＰ注射してマウスを犠牲にする。全ての体器官、腫瘍、骨格筋、リンパ節、骨髄、尿および血液を取り出し、病理学的評価用に処理する。
【０１３０】
セクション３：
大腸癌細胞に対するＨＡ抗癌治療の効果についてのいくつかの基本的な疑問に答えるために、以下の実験を行うべきである。
ＨＡ／５−ＦＵ暴露時間および濃度の、薬物耐性および薬物感受性大腸癌細胞に対する効果を調査する。
３耐性および３感受性セルラインを、１、２．５、５、１０、２０、４０、６０、８０および１００ｎＭの５−ＦＵに暴露し、以下の変数を試験する：
１）１ｈ 薬物±１００ｎＭ ＨＡ 暴露、次いで薬物を含まない培養（３日間）；
２）一定量薬物暴露±１００ｎＭ ＨＡ（３日間）；
３）３０分 １００ｎＭ ＨＡ 暴露、次いで薬物（１ｈ）、薬物を含まない細胞培養（３日間）；ならびに、
４）２４ｈ １００ｎＭ ＨＡ 暴露、次いで薬物（１ｈ）、薬物を含まない細胞培養（３日間）。
【０１３１】
上記のように測定したＩＣ５０の５−ＦＵを用いて、ＨＡ（７００ｋＤ）濃度を、１、３、１０、３０、１００、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭおよび１００μＭに変化させる。試験するインキュベーション変数：
１）３０分 ＨＡ 暴露、次いで１ｈ 薬物暴露、薬物を含まない細胞培養（３日間）；
２）２４ ＨＡ 暴露、次いで１ｈ 薬物暴露、薬物を含まない細胞培養（３日間）；ならびに、
３）ＨＡ±薬物暴露（１ｈｒ）、薬物を含まない細胞培養（３日間）。
【０１３２】
任意の剥離細胞を細胞生存能に関して試験する。これはＨＡが癌細胞の剥離および移動に中心的役割を果たし得ることが示されているからである。剥離細胞が生存可能であれば、ＨＡ受容体状態をＦＡＣＳ表面エピトープ同定を用いて測定する。
【０１３３】
短いＨＡオリゴ糖、すなわち：４ｓａｃｃ、６ｓａｃｃ、１２ｓａｃｃ、５６００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２５０，０００Ｄａを用いて同様の実験を行う。
【０１３４】
最適ＨＡ濃度を測定後、一連のタイムコース実験でＩＣ５０の５−ＦＵを用い、アドリアマイシン代謝に対するＨＡの任意の作用を観察する。
【０１３５】
３０分、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ、および２４ｈの間、［３Ｈ］５−ＦＵを細胞に暴露する。実験条件は以下である：
１）．細胞をＨＡ（３０分）、次いで薬物に暴露する；ならびに、
２０．細胞をＨＡ（２４）次いで薬物に暴露、ＨＡ／５−ＦＵの同時暴露。
【０１３６】
細胞を取り出し、低浸透圧下で溶解し、１１３，０００ｇａｖで１時間遠心分離する。ＨＰＬＣを用い、代謝産物に関して膜ペレットおよび上清をカウントし、分析する。
【０１３７】
また、細胞をカバーグラス上で培養し、これを５−ＦＵ±ＨＡに暴露（上記暴露方法）し、共焦点写真タイムコースを用いて、薬物のサイトゾル摂取および移動を追跡する。
【０１３８】
耐性および感受性大腸癌セルラインに対するＨＡ受容体の同定、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ１０およびＲＨＡＭＭ受容体のＦＡＣＳ定量、ＦＩＴＣ／ＨＡおよびＦＡＣＳ分析を用いる、ＨＡ／受容体の結合および飽和キネティクスの定量。
【０１３９】
ＣＤ４４ｓおよびＲＨＡＭＭ受容体を阻害抗体でブロッキングし、以下のプロトコルにしたがって５−ＦＵ±ＨＡを適用する：
１）．細胞をＨＡ（３０分）、次いで薬物に暴露する；ならびに、
２）．細胞をＨＡ（２４）、次いで薬物に暴露、ＨＡ／５−ＦＵの同時暴露。
【０１４０】
細胞をカウントする。表面エピトープＦＡＣＳ分析を用いて任意の生存細胞の受容体状態を定量する。
【０１４１】
ＨＡ受容体のブロッキングが５−ＦＵとＨＡ間の通常観察される相乗作用を減少させるならば、膜結合およびサイトゾル性５−ＦＵを±ＨＡ受容体ブロッキングで定量する。
【０１４２】
［３Ｈ］ＨＡおよびゲルろ過クロマトグラフィー±受容体ブロッキングを用いるセルラインによるＨＡ分解を実験する。
【０１４３】
原形質膜に対するＨＡの作用
分子量４ｓａｃｃ、６ｓａｃｃ、１２ｓａｃｃ、５６００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２５０，０００Ｄａ、７５０，０００Ｄａおよび１，５００，０００Ｄａのヒアルロナンを、あらかじめ決められた「効果が観察された」濃度で乳癌セルラインとインキュベートし、以下がパラメータを調査する：
１）．細胞外および細胞内カルシウム流動（細胞プローブアッセイ）；
２）．細胞骨格成分の調節（細胞骨格遺伝子のマイクロアレイ）；
３）．細胞容量に対する作用（ Coulter サイズ分析）；
４）．癌細胞の移動度（Boyden Chamber matrigel アッセイ）；
５）．ＨＡ受容体の定量（ＦＡＣＳ）；ならびに、
６）．膜電位（決定すべき方法）。
【０１４４】
ＨＡネオ−アジュバント治療の器官転移の阻害に対する役割を調査する。他の処置群と比較して、ＨＡ治療を受けたマウスは以下を示した：
１）．他の処置群と比較したリンパ節転移の減少；
２）．新規腫瘍形成の阻害；
３）．体重増加；および、
４）．健康の増大。
【０１４５】
これらの結果は、癌の拡大を減少させる効果的な手段としてのＨＡ抗癌治療の可能性ある役割を強調する。前臨床モデルの環境選択を通じて、制限が存在し、これにより二次的な癌の拡大は通常リンパ節の周りで生じる。各器官および骨への癌の拡大を試験可能なモデルを用いることは有益であろう。ＢＡＧベクター転移モデルとして既知のモデルを用いることによって、各器官および骨への癌の拡大をモニターできるだろう。
【０１４６】
簡単には、ＢＡＧベクターはネオマイシン耐性ＬａｃＺ遺伝子から構成され、これはヒト乳癌細胞内に安定にトランスフェクトできる。ヌードマウスへの心臓内注射、次いで６週間処置計画の後、任意の転移細胞／器官におけるＬａｃＺ遺伝子をＰＣＲ検出することが可能である。骨損傷の検出を伴う Faxitron スキャニングによりすべての骨転移が検出されるだろう。
【０１４７】
６週間の間、週サイクルの第１日目、第２日目に以下の処置を行う。処置群（５動物／群）は以下から構成される：
１．食塩水
２．３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ（第１日目、第２日目）；
３．１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目、第２日目）；
４．３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ ＋ １２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目、第２日目に同時投与）；
５．１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目）、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ（第２日目）、１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第３日目）、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ（第４日目）；
６．１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目、第３日目）；
７．３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ（第２日目、第４日目）；
８．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ（第１日目、第２日目）；
９．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ ＋ １２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目、第２日目に同時投与）；
１０．１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目）、１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ（第２日目）、１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第３日目）、１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ（第４日目）；
１１．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ（第２日目、第４日目）；
１２．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド（cyclophosamide）（第１日目、第２日目）；ならびに、
１３．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド ＋ １２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目、第２日目）；
１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目）、（１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド）（第２日目）、１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第３日目）、（１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド）（第４日目）。
【０１４８】
ネオアジュバント治療：
心臓内注射直前に以下を投与する：
１）．１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；
２）．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ；
３）．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；
４）．３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ；
５）．３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；
６）．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド；ならびに、
７）．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド ＋ １２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ。
【０１４９】
マウスの体重および健康状態を６週間毎日モニターする。処置サイクルの完了時に、各マウスを骨損傷に関してスキャンする。スキャンした後、各器官および体液を採り出す。器官の十分なクロスセクションを可能な将来の病理学的分析用に保存し、残りの組織をホモジナイズし、ＬａｃＺ遺伝子の検出のために拮抗ＰＣＲに付する。
【０１５０】
転移を示したすべての器官を組織学的に処理し、ＬａｃＺ遺伝子のガラクトシダーゼ染色を用いて癌細胞のコロニー形成のパターンを示す。
【０１５１】
参考文献
【表８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾患処置のために化学治療剤のバイオアベイラビリティーを高めることに関する。特に、本発明は、疾患処置用の化学治療剤のバイオアベイラビリティーを高めるため、ヒアルロナンを単独で、あるいは化学治療剤と組み合わせて使用することに関する。本発明はまた、薬物耐性疾患の処置であって、これにより、ヒアルロナンを単独で、あるいは化学治療剤と組み合わせて用いてその薬物耐性が克服されるか、あるいは軽減されるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトを含む動物を苦しめる多くの疾患は化学治療剤を用いて処置される。例えば化学治療剤は、結合性または自己免疫疾患、代謝障害、および皮膚科学的疾患を含む腫瘍性疾患の処置において有益であることが示され、多くのこれらの物質は非常に有効であり、全くバイオアベイラビリティーの問題を被らない。
【０００３】
化学治療剤の適正な使用には、化学治療剤の選択、用量の決定、および治療の着手の前に、疾患の性質の履歴および病態生理学を徹底的に熟知することが必要とされる。各被験体は、毒性を増強するかもしれない要因、例えば明らかあるいは隠れた感染、出血性障害、栄養失調状態、深刻な代謝障害などに注意して、注意深く評価されなければならない。さらに、特定の主要器官、例えば肝臓、腎臓、および骨髄の機能状態は非常に重要である。したがって、適当な化学治療剤の選択および有効な治療方法の工夫は被験体の現状に影響される。このような考察は投与される薬物の用量およびタイプに影響する。
【０００４】
不幸なことに、すべての化学治療剤が容易に使用可能であるわけではない。例えば、いくつかの化学治療剤は先天的に抗療性であり、ここでは動物細胞はこれらの物質に対して容易には応答せず、また他の化学治療剤は後天的耐性を被る。例えば、よく認識されているように、長い化学治療時には、時間が経過するにつれて化学治療剤の効果が減少するため、その変更を強要される被験体もいる。さらに、いくつかの化学治療剤は、本質的に先天的または後天的耐性によって影響されないが、それらがバイオアベイラビリティーに伴う本質的問題を有しているために、特定の疾患の処置において有効でない。細胞の耐性とバイオアベイラビリティーの問題の両者によく影響される一疾患は癌である。
【０００５】
癌は西洋社会における四大死の１つである。米国およびカナダにおいて、癌および癌による死の新規ケースの割合は１９９０〜１９９４年の間減少したが、米国において２，６０４，６５０人が１９９０〜１９９４年の間に癌で死亡したことがデータによって示されている（そのうち男性（５３％）は女性（４７％）より多かった）。最も一般的な癌による死の原因は、肺癌（７２８，６４１）、大腸および直腸癌（２８５，７２４）、乳癌（２１８，７８６）、および前立腺癌（１６９，９４３）であった。
【０００６】
女性の間で最も一般的な癌は、乳癌（３１％）、肺癌（１２％）、大腸および直腸癌（１２％）、子宮癌（６％）、卵巣癌（４％）であり、乳癌および卵巣癌は女性に見られるすべての癌の約３５％を占める。これらの型の癌であると診断された女性の大多数は外科手術、放射腺治療または化学治療を組み合わせて受ける。
【０００７】
癌の処置に用いられる化学治療剤は、（１）アルキル化剤、例えばメクロレタミン、クロロホスファミド、メルファラン、ウラシルムスタード、クロラムブシル、ブサルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾチシン、およびデクラバジン；（２）抗代謝産物、例えばメトトレキセート、フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、シタラビン、アザラビン、イドキシウリジン、メルカプトプリン、アザチオプリン、チオグアニン、およびアデニンアラビノシド；（３）天然産物誘導体、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトラマイシン、タキサン（例えばパクリタキセル）、ブレオマイシン、エトポシド、テニポシド、およびミトマイシンＣ；および（４）その他の物質、例えばヒドロキシ尿素、プロカルベジン、ミチタン、およびシスプラチナムを含むいくつかの広いカテゴリーに細分される。
【０００８】
（通常有効量において）臨床の多剤耐性が観察された重要な癌化学治療剤には、ビンブラスチン（０．１ｍｇ／キログラム／週）、ビンクリスチン（０．０１ｍｇ／キログラム／週）、エトポシド（３５〜５０ｍｇ／平方メートル／日）、ダクチノマイシン（０．１５ｍｇ／キログラム／日）、ドキソルビシン（５００〜６００ｍｇ／平方メートル／週）、ダウノルビシン（６５〜７５ｍｇ／平方メートル／週）、およびミトラマイシン（０．０２５ｍｇ／キログラム／日）が含まれる。
【０００９】
現在、化学治療剤に対する細胞の耐性を克服する有効な手段がないことは当業者によく理解されていることである。もっと重要なのは、毒性または副作用の付随する増大を伴なわずに化学治療剤のバイオアベイラビリティーを増大させる実際的な手段が存在しないことである。したがって、後天的または先天的な細胞の耐性に付随する問題を克服するか、あるいは少なくとも軽減する手段、ならびに化学治療剤のバイオアベイラビリティーを増大させる手段が必要がある。
【００１０】
発明者らは以前に、化学治療剤のための薬物デリバリービヒクルとしてのヒアルロナン（ＨＡ）の有用性を研究し、ＨＡがこれらの薬物と同時投与された場合に有用であることを発見した。この発明をカバーする国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ００／００００４を出願した（これは引用によりその全開示内容が本明細書中に包含される）。ＨＡはまたヒアルロン酸として既知であり、これは直鎖のポリマーを含む天然に存在する多糖類であり、動物界中に遍在することがわかっている。ＨＡは非常に水溶性であり、これにより生物系に関する理想的薬物デリバリービヒクルになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ００／００００４の出願後、発明者らは驚くべきことに、ＨＡが単独の物質として作用することを発見した。ＨＡはヒト乳癌細胞、およびプレ感作細胞に対して細胞毒性効果を発揮し、それらを化学治療剤に対してより感受性にする。したがって本発明は、化学治療剤に対して耐性であったか、あるいは耐性になった細胞を有効に処置できる方法を提供する。さらに重要なことに、開示される方法を用いて、被験体に対する効力を減少させることなく化学治療剤の用量を減少させることができる。本発明の方法は、ヒアルロナンを単独で、あるいは化学治療剤と組み合わせて投与することを含む。
【００１２】
本発明は、ヒアルロナン、その誘導体、アナログ、および塩がそれ自身細胞を阻害するだけでなく、標準的または、有効性が低いと思われる、より少ない用量の選択化学治療剤の安全な投与により、ヒト被験者を含む被験体を処置することを可能にするという発見に基づく。ヒアルロナンを化学治療剤と組み合わせてインビボ投与すると、難治性の細胞に対するこれらの物質の治療効果が高められ、これによりその後の多剤耐性の発生を防ぐ。
【００１３】
疾患細胞、例えば癌細胞はしばしば、膜電位の変化のせいで、より透過性の膜を有するか、あるいはその細胞内分子輸送の調節を変更でき、その結果細胞膨張を生じさせ得る増大した受容体ステータスを有する（Lang et al., 1993）。発明者らは、いかなる理論によって結び付けられることをも望まないが、彼らは、ＨＡが単独の物質として、ならびに治療剤の前処置として発揮する細胞性作用を説明できるいくつかの機構が存在することを仮定する：
１）ＨＡがＣＤ４４、ＲＨＡＭＭおよび結合したスカベンジャー受容体に結合すると、ＨＡの正味の負の電荷は細胞の膜電位を変化させ、細胞の透過性を増大させ、結果として疾患細胞へのより大量の薬物流入を可能にする。
２）ＨＡが疾患細胞、例えば腫瘍細胞と結合し、内在化すると、細胞溶解を導く高浸透圧性が存在し得る。
３）ＨＡは酸化的膜損傷を発揮し、アポトーシスを生じさせる。
４）ＨＡ内在化はミトコンドリア膜電位を高め、細胞死または増大した薬物保持を生じさせ得る。
【００１４】
ＨＡは飽和レベルで投与されるため、そのグリコサミノグリカンのコンスタントな内在化が存在し、これはＨＡの容量ドメイン内で平衡状態にある任意の治療剤を同時に内在化させ、薬物の濃縮された細胞内放出を生じさせることを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要旨
その最も広い側面では、本発明は、処置を必要としている被験体の処置方法であって、化学治療剤が単独で投与された場合よりもより有効であるように該化学治療剤と組み合わせて、該被験体に治療有効量のヒアルロナンを投与する工程を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、化学治療剤のバイオアベイラビリティーを高める方法であって、それを必要としている患者に有効量のヒアルロナンを投与する工程を含む方法を提供する。
【００１７】
ヒアルロナンを用いて、任意の投与される化学治療剤のバイオアベイラビリティーを大きく高めることができる。好ましくは、投与される化学治療剤は、カルマスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル（ロイケラン）、シスプラチン（プラチノール）、シタラビン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトキセトレート（メキサート）、ＣＰＴ１１１、エトポシド、プリカマイシン（plicamycin、ミトラシン）およびタキサン例えばパクリタキセルからなる群から選択されるものである。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、多剤耐性または薬物耐性細胞を処置または予防する方法であって、化学治療剤の投与前か、その投与といっしょにか、あるいはその投与後に、治療有効量のヒアルロナンを投与する工程を含む方法を提供する。
【００１９】
以下により完全に記載されるように、ヒアルロナンおよび化学治療剤を投与すると、少なくとも５０％まで；好ましくは６０％；さらにより好ましくは７０％以上の腫瘍生育の抑制が生じる。したがって、腫瘍生育および増殖の排除は、多剤耐性細胞の産生を排除し、癌の再発を減少させ、化学治療処置の効果を増大させる。
【００２０】
本発明はさらに、ヒアルロナンを含む、化学治療剤に対する細胞の感受性を増大させる医薬組成物を提供する。ヒアルロナンおよび／または化学治療剤は、さらなる医薬的担体とともに投与してもよい。
【００２１】
本発明はまた、癌細胞を処置する方法であって、その患者に治療有効量のヒアルロナンを投与する工程を含む方法を提供する。
【００２２】
典型的に、その癌細胞は化学治療剤に耐性である。
【００２３】
本発明のさらなる側面では、細胞の耐性を克服する方法であって、治療有効量のＨＡを投与する工程を含む方法を提供する。
【００２４】
本明細書の詳細な説明および請求の範囲を通じて、用語「含む」およびそのバリエーション、例えば「含んでいる」などは「含むが、それらに制限されない」を意味し、他の追加物、成分、整数または工程を排除することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、７５０，０００ダルトンＨＡに２４時間暴露され、その時点で写真撮影された、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。１０ｎｇ／ｍＬでは、細胞数の減少が生じたが、形態の変化は見られなかった。１００ｎｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬでは、細胞は浸透圧応答を受ける頂点を示し、細胞は膨張した。２ｍｇ／ｍＬおよび５ｍｇ／ｍＬでは、細胞は顆粒状になり、原形質膜が「へこみ」、浸透圧応答および／または細胞死の開始を示す可能性がある。
【図２ａ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図２ｂ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図２ｃ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図２ｄ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図２ｅ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図２ｆ】図２ａ−２ｆは、７５０，０００ダルトンＨＡに３０分、１時間、または２４時間暴露され、その時点でアドリアマイシンの濃度を変化させた、指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図はまた、１または３日間のＨＡ／薬物同時インキュベーションの効果を示す。これらの図は、ＨＡが細胞を「プレ感作」し、ならびに／あるいは治療薬に対して細胞を化学感作させることができることを示す。
【図３ａ】図３ａ−３ｄは、種々の濃度の７５０，０００ダルトンヒアルロナンに１時間、２４時間または３日間暴露された後、１時間、２４時間または３日間の種々の時間、４０ｎＭアドリアマイシンで処理された指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図は、広い濃度範囲のヒアルロナンが化学感作剤として作用するか、あるいは細胞毒性作用を発揮することができることを示す。
【図３ｂ】図３ａ−３ｄは、種々の濃度の７５０，０００ダルトンヒアルロナンに１時間、２４時間または３日間暴露された後、１時間、２４時間または３日間の種々の時間、４０ｎＭアドリアマイシンで処理された指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図は、広い濃度範囲のヒアルロナンが化学感作剤として作用するか、あるいは細胞毒性作用を発揮することができることを示す。
【図３ｃ】図３ａ−３ｄは、種々の濃度の７５０，０００ダルトンヒアルロナンに１時間、２４時間または３日間暴露された後、１時間、２４時間または３日間の種々の時間、４０ｎＭアドリアマイシンで処理された指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図は、広い濃度範囲のヒアルロナンが化学感作剤として作用するか、あるいは細胞毒性作用を発揮することができることを示す。
【図３ｄ】図３ａ−３ｄは、種々の濃度の７５０，０００ダルトンヒアルロナンに１時間、２４時間または３日間暴露された後、１時間、２４時間または３日間の種々の時間、４０ｎＭアドリアマイシンで処理された指数関数的に増殖する乳癌細胞を示す。これらの図は、広い濃度範囲のヒアルロナンが化学感作剤として作用するか、あるいは細胞毒性作用を発揮することができることを示す。
【図４】図４は、６週間の実験を通じて観察された非処理の毒性が存在することを示す。５−ＦＵ処理群と比較して、単独の物質または化学感作剤としてのＨＡ治療を受けたマウスは高められた健康を示し、ここでは動物は体重を失わず、その体重量を維持した。
【図５】図５は、６週間の実験の終了時点で、腫瘍重量を測定したところ、ＨＡ化学感作治療が食塩水群、ＨＡおよび５−ＦＵ群より有意に小さい腫瘍を生じた（ｐ＝０．００５）ことを示す。単独物質としてのＨＡはまた、食塩水コントロールと比べて主な腫瘍重量を減少させることによりその作用を示した。処置の最初の２週間は、腫瘍応答の大きな差異が観察されなかったが、その後、ＨＡ次いで５−ＦＵ腫瘍増殖は、他の処置群と比べて妨げられた。６週間の処置の間、腫瘍倍増サイクル数において興味深い差異が観察された。食塩水処置を受けたマウスは平均４腫瘍倍増を受けたが、一方、処置計画にＨＡを包含させると、腫瘍倍増時間が有意に増大し、ここにＨＡ／５−ＦＵ動物が１腫瘍倍増サイクルの平均を受け、これは５−ＦＵ細胞毒性に対するＨＡの効果を再び際立たせる。
【図６】図６は、ＨＡを同時投与すると、非リンパ性転移の有意な減少が生じることを示す。ＨＡ治療を受けたマウスを除き、初期腫瘍の近傍部分の頚部または腕下領域まわりに新規腫瘍が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明の方法および組成物は、化学治療剤、例えば、パクリタキセルのような抗癌剤、鎮痛薬、鎮静剤、ホルモンまたは抗生物質などに対する細胞の感受性を増大させるのに有用である。特に、本発明の方法および組成物は、細胞増殖性障害（例えば新生物）に関する細胞の感受性を増大させるのに有用である。非癌細胞への付随する毒性を伴わなずに効力を増大させることによって、本発明は、腫瘍を処置し、細胞毒性の結果としての再発および死亡の機会を予防するか、あるいは減少させるのに有用な方法および組成物を提供する。さらに、本発明は、多剤耐性表原型を導く任意の突然変異の前に癌細胞を排除することによって、多剤耐性細胞の数を排除または減少させる。したがって、多剤耐性腫瘍細胞が生じるのを減少させることにより、本発明は現在の治療様相の不十分な箇所を満足させる。
【００２７】
本明細書中で用いられる用語「被験体」とは、化学治療剤での処置を必要とする疾患または症状であって、ここにこの化学治療剤は望ましいものと比較して減少した効力を有している疾患または症状を有する任意の動物を表す。好ましくはこの被験体は細胞増殖性障害（例えば新生物障害）を患っている。本発明の目的の被験体には、哺乳類（例えばウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ）および、好ましくはヒトが含まれるがこれらに制限されない。
【００２８】
「細胞増殖性障害」とは、細胞または細胞群が正常でない増殖、典型的には異常型増殖を示すことを意味し、これにより新生物、腫瘍または癌が導かれる。
【００２９】
細胞増殖性障害には、例えば乳癌、肺癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、神経癌、卵巣癌、子宮癌、肝臓癌、膵臓癌、内皮癌、胃癌、腸癌、外分泌腺癌、内分泌腺癌、リンパ性癌、造血系の癌または頭部および頚部組織の癌が含まれる。
【００３０】
一般には、新生物性疾患は正常でない細胞増殖が新生物または腫瘍と称される組織塊を生じさせる症状である。新生物は構造および行動における種々の程度の異常性を有する。良性の新生物があり、また他のものは悪性あるいは癌性である。新生物疾患の有効な処置は、癌予防性または治療用手法に関する調査に対して貴重な貢献をすると考えられるだろう。
【００３１】
本発明の方法には、一態様において、（１）化学治療剤の投与前、その投与と同時、あるいはその投与後のヒアルロナンの投与；または（２）ヒアルロナンおよび化学治療剤の組み合わせの投与が関与する。
【００３２】
本明細書中で用いられる用語「治療有効量」とは、所望の治療応答を生じさせるのに有効な本発明の化合物量を意味する。例えば癌を予防するか、あるいは宿主における癌の徴候を処置するため、あるいは癌を処置するのに有効な量。
【００３３】
具体的な「治療有効量」は、明らかなように、処置されるべき具体的な症状、患者の身体状態、処置される哺乳類のタイプ、処置期間、（存在すれば）同時治療の性質、および用いられる具体的製剤およびその化合物またはその誘導体の構造などの要因に応じて変化する。
【００３４】
本明細書中で用いられる用語「医薬的担体」とは、ヒアルロナンおよび／または化学治療剤を動物またはヒトにデリバリーするための、製薬的に許容される溶媒、懸濁化剤またはビヒクルである。担体は液状物または固形物であってよく、計画される投与様式に応じて選択される。
【００３５】
本明細書中で用いられる用語「癌」とは、哺乳類に見られるすべてのタイプの癌または新生物または悪性腫瘍を表す。癌には、肉腫、リンパ腫および他の癌が含まれる。例は以下のタイプであるが、これらの具体的タイプの癌に制限することを意図しない：
前立腺癌、大腸癌、乳癌、ＭＸ−１およびＭＣＦライン、膵臓癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、ホーム、肺癌、マウス癌、黒色腫、白血病、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、脳の癌、頭部および頚部の癌、腎臓癌、中皮腫、肉腫、カポジ肉腫、胃癌および子宮癌。
【００３６】
本明細書中で用いられる用語「細胞」とは、哺乳類細胞（例えばマウス細胞、ラット細胞またはヒト細胞）を含むがこれらに制限されない。
【００３７】
ヒアルロナンおよび／または化学治療剤は、慣用の製薬的に許容される非毒性担体、アジュバント、およびビヒクルを含有する単位投与製剤として、経口、局所、または非経口投与することができる。本明細書中で用いられる用語「非経口」には、皮下注射、エアロゾル、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、頭蓋内、胸骨内注射または注入技術が含まれる。
【００３８】
本発明はまた、本発明の処置の新規方法において用いるための、適当な局所、経口、および非経口医薬製剤を提供する。本発明の化合物は、錠剤、水性または油性懸濁剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、粉末剤、顆粒剤、エマルジョン、カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤として経口投与することができる。経口使用のための組成物には、医薬的に質が高く、快適な調製物を製造するために、甘味料、香料、着色料および保存剤からなる群から選択される１またはそれ以上の物質を含ませることができる。錠剤には、活性成分を、錠剤の製造に適する無毒の製薬的に許容される賦形剤と混合して含ませる。
【００３９】
これらの賦形剤は、例えば、（１）不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；（２）顆粒化剤および崩壊剤、例えばコーンスターチまたはアルギン酸；（３）結合剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアカシア；および（４）滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであってよい。これらの錠剤はコーティングしなくてもよいし、既知の技術によりコーティングして、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、これにより、より長い期間にわたって持続した活性を提供してもよい。例えば、時間遅延物質、例えば一ステアリン酸グリセロールまたは二ステアリン酸グリセロールを用いることができる。また米国特許第４，２５６，１０８号；第４，１６０，４５２号；および第４，２６５，８７４号に記載の技術を用いてコーティングを行い、コントロール放出用の浸透圧性治療錠剤を形成させてもよい。
【００４０】
本発明方法に有用なヒアルロナンならびに化学治療剤は、インビボ適用に関して、注射によるか、あるいは独立にあるいはいっしょに、経時的段階的灌流により、非経口的に投与することができる。投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的であってよい。インビトロ研究では、この物質を適当な生物学的に許容されるバッファーに加えるか、あるいは溶解させ、細胞または組織に加えることができる。
【００４１】
非経口投与用の調製物には、滅菌水性または非水性溶液剤、懸濁剤、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブオイル、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルエステルがある。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液（食塩水および緩衝化溶媒を含む）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンガー静脈内ビヒクル（液体および栄養補充物を含む）、電解液補充物（例えばリンガーデキストロースに基づくもの）などが含まれる。また保存剤および他の添加剤、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、成長因子および不活性ガスなどが存在してもよい。
【００４２】
本発明を用いて、例えば新生物、癌（乳癌、肺癌、腎臓癌、皮膚癌、神経癌、卵巣癌、子宮癌、肝臓癌、膵臓癌、内皮癌、胃癌、腸癌、外分泌腺癌、内分泌腺癌、リンパ系の癌、造血系の癌または頭部および頚部組織の癌）、線維性障害などを含む細胞増殖障害に関連する病因を処置できることが想定される。
【００４３】
また本発明の方法および化合物は、化学治療剤処置に関連する他の疾患、例えば神経退化障害、ホルモン不均衡などの処置に用いることができる。したがって、本発明は、細胞増殖、新生物、癌などに関連する障害を改善する方法であって、この障害を有する被験体の障害部位において、細胞増殖またはその障害を阻害または改善するのに十分な量のヒアルロナンおよび化学治療剤で処置することを含む方法を含む。
【００４４】
一般に、本明細書中で用いられる用語「処置する」、「処置」などは、被験体、組織または細胞に影響し、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、完全にあるいは部分的に細胞増殖性障害またはその徴候または症状を妨害するか、ならびに／あるいは障害および／または、例えば異常細胞増殖に帰する有害作用を部分的または完全に治療するという点で、治療的であってよい。本明細書中で用いられる「処置する」とは、脊椎動物、哺乳類、特にヒトにおける細胞増殖性障害の任意の処置または予防を包含し、これには以下が含まれる：
（ａ）障害にかかりやすいかもしれないが、まだその障害を有すると診断されたことがない被験体において障害が発生するのを防ぐこと；
（ｂ）障害を阻害する、すなわちその発達を休止させること；または
（ｃ）障害を救出するか、あるいは改善する、すなわち障害の退行を生じさせること。
【００４５】
本発明は、新生物、癌などを含む細胞増殖性障害の改善に有用な種々の医薬組成物を含む。本発明の一態様にしたがう医薬組成物は、担体、賦形剤および添加剤または補助剤を用い、被験体への投与に適当な剤型としたヒアルロナン、そのアナログ、誘導体または塩および１またはそれ以上の化学治療剤を用いて調製する。よく用いられる担体または補助剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、ミルクプロテイン、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物性および植物性油、ポリエチレングリコールおよび溶媒、例えば滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールが含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養素補充物が含まれる。保存剤には、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスが含まれる。他の製薬的に許容される担体には、水性溶液、無毒の賦形剤（塩、保存剤、バッファーなどを含む）が含まれる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed. Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975) および The National Formulary XIV., 14th ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975)（これらの内容は引用により本明細書中に包含される）に記載されている）。医薬組成物のｐＨおよび種々の成分の正確な濃度は、当分野の慣用技術にしたがって調節する。Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed.) を参照。
【００４６】
医薬組成物は好ましくは投与単位で製造し、投与する。固形投与単位は錠剤、カプセル剤および坐剤である。被験体の処置では、化合物の活性、投与様式、障害の性質および重篤度、被験体の年齢および体重に応じて、種々の毎日の用量を用いることができる。しかし、特定の環境下では、より大量またはより少量の毎日の用量が適当であり得る。毎日の用量の投与は、個別の投与単位またはいくつかのより少量の投与単位の剤型における単一投与および特定の間隔で細分された用量の複数回投与の両者によって行うことができる。
【００４７】
本発明に記載の医薬組成物は、治療有効用量を局所性投与あるいは全身性投与することができる。この使用に関する有効量は、もちろん、疾患の重篤度および被験体の重量および全体的状態に依存する。典型的には、インビトロで用いられる投与量は、この医薬組成物のインサイチュ投与に有用な量の指標を提供することができ、動物モデルを用いて具体的障害の処置に関する有効量を決定することができる。種々の考察は、例えば Langer, Science, 249: 1527, (1990) に記載されている。経口使用用の製剤は、活性成分が不活性固形希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されているゼラチン硬カプセルの剤型であってよい。これらはまた、活性成分が水または油状溶媒、例えば落花生油、液状パラフィンまたはオリーブ油と混合されているゼラチン軟カプセルの剤型としてもよい。
【００４８】
水性懸濁剤は通常、活性物質を水性懸濁剤の製造に適当な賦形剤と混合して含む。このような賦形剤は、（１）懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガム；（２）分散剤または湿潤剤（これらは（ａ）天然に存在するホスファチド、例えばレシチン；（ｂ）酸化アルキレンと脂肪酸の縮合産物、例えばポリオキシエチレンステアラート；（ｃ）酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールの縮合産物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール；（ｄ）酸化エチレンと、脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合産物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、または（ｅ）酸化エチレンと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導された部分エステルの縮合産物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであってよい）であり得る。
【００４９】
医薬組成物は滅菌注射用水性懸濁液または油性懸濁液の剤型であってよい。この懸濁液は、上記適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いる既知の方法にしたがって製剤化することができる。この滅菌注射用調製物はまた、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液剤または懸濁剤、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液剤であってよい。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌、固定油は溶媒または懸濁媒体として慣用的に用いられる。この目的のため、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の低刺激性固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は注射剤の製造に用途がある。
【００５０】
本発明の、化学治療剤と組み合わされたヒアルロナンはまた、リポソームデリバリー系、例えば小単層性小胞、大単層性小胞、および多層性小胞の剤型で投与することができる。リポソームは種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンから形成することができる。
【００５１】
本発明化合物の投与量は、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重のオーダーであり、好ましい投与量は、約５ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日（約０．３ｇｍ〜約１．２ｇｍ／患者／日）の範囲である。担体物質と混合されて、単一の用量を生じさせることができる活性成分の量は、処置される宿主および具体的な投与様式に応じて変化するだろう。例えば、ヒトへの経口投与に関して意図される製剤には、約５ｍｇ〜１ｇの活性化合物を、適当かつ好都合な量の担体物質（これは全組成物の約５〜９５パーセントまで変化し得る）とともに含ませることができる。単位投与剤型は一般に、約５ｍｇ〜５００ｍｇの活性成分を含むだろう。
【００５２】
しかし、任意の特定の患者に関する具体的用量レベルは、用いられる具体的化合物の活性、年齢、体重、全体的健康、性別、食事、投与期間、投与経路、排泄頻度、薬物コンビネーション、および治療を受ける具体的疾患の重篤度を含む種々の要因に依存することが理解されよう。
【００５３】
さらに、本発明の化合物には、水または一般的有機溶媒と溶媒和物を形成し得るものがある。このような溶媒和物は本発明の範囲内に含まれる。
【００５４】
本発明の化合物は、さらに他の化合物と混合することができ、効力のある混合物を提供できる。その組み合わせが本発明のヒアルロナンの活性を排除しない限り、化学治療剤の化学的にコンパチブルな任意の組み合わせを含むことが意図される。
【００５５】
単に以下の非制限的実施例に言及し、本発明をさらに記載する。しかし、以下の実施例は単に例示的であり、いかなる意味においても上記本発明の一般性を制限するものとして理解されるべきでない。特に、本発明は癌に関連して詳細に記載されているが、本明細書中の発見は癌の処置に制限されないことが明らかに理解されよう。例えばＨＡは他の症状の処置に用いることができる。
【実施例】
【００５６】
実施例１
ヒアルロナンおよび５−フルオロウラシル溶液の製造
すべてのインビトロおよびインビボ実験で用いるＨＡは Kyowa Hakko Kogyo (Yamaguchi, Japan) から入手した。５−ＦＵは Sigma，St. Louis, USA から入手した。アドライマイシン (Adraimycin) は Cytomix, Northcote, Melbourne, Australia から入手した。用いたＨＡの標準的プロファイルは表１に示すものである。
表１
ヒアルロナンバルク乾燥粉末に関する説明シート
【表１】
【００５７】
ピロゲンを含まない注射用等級水に乾燥ＨＡ（様式上、Ｍｒ ７．５×１０５ｋＤａ）を溶解することによって、ＨＡ溶液の１０ｍｇ／ｍＬストックを製造した。均質の溶液を保証するため、ＨＡを４℃で一晩の後、ボルテックスして溶解した。ストック溶液の製造中、ＨＡがその分子量を維持していることを保証するために、この溶液を Sepacryl S-1000 サイズ排除ゲル（カラム仕様、１．６ｃｍ×７０ｃｍ、サンプルサイズ２ｍＬ、フロー速度１８ｍＬ／ｈおよび２ｍＬ フラクションサイズ）で分析した。カラムフラクション中、ウロン酸アッセイによってヒアルロナンを検出した。
【００５８】
ウロン酸アッセイを用いて、ゲルろ過クロマトグラフィー手順より収集したフラクションからヒアルロナンの存在を定性的に検出した。次いで各フラクションの２５μＬ量を９６ウェルプレートに移した。次いでカルバゾール試薬（３Ｍ カルバゾール／０．０２５Ｍ ボレート（Ｈ２ＳＯ４中））２５０μＬをこれらのフラクションに加えた。９６ウェルプレートを８０℃で４５〜６０分インキュベートした。５５０ｎｍフィルターを有する Dynatech MR7000 プレートリーダーを用いて９６ウェルプレートを読み取った。吸光度がバックグラウンド吸光度より＞３標準偏差になった時点で有意であると考えた。バックグラウンドは、Ｖ０およびＶｔ前後の同数のサンプルポイントをとる（ここでとった平均数は１６）ことによって計算した（Fraser et al. 1998）。
【００５９】
粉末にした５−ＦＵを０．１Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ８．９）中に溶解して５−ＦＵのストック溶液を調製し、ピロゲンを含まない注射等級０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌを用いて濃度１ｍｇ／ｍＬにした。この保存溶液を０．２２μｍフィルターに通してろ過し、確実に滅菌した。必要量のストック溶液を上記のセルライン特異的生育培地に加えて、５−ＦＵを希釈した。
【００６０】
Cytomix から０．９％ＮａＣｌ中のアドリアマイシンの１０ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【００６１】
実施例２
癌細胞形態に対するヒアルロナンの影響の試験
ＨＡ結合親和力（Culty et al, 1994）およびＣＤ４４およびＲＨＡＭＭのＨＡ受容体の発現（Wang et al, 1996）に基づいてヒト胸腺癌セルラインＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を選択した。これらのセルラインの特徴を表２に示す。
表２
ヒト乳癌セルラインのヒアルロナン結合および受容体発現
【表２】
ａ：Culty et al, 1994
ｂ：Wang et al, 1996
【００６２】
セルラインＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を慣用的に培養し、１７５ｃｍ２培養フラスコ中の１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）および抗生物質／抗真菌性試薬を補充した Leibovitz Ｌ−１５培地において、１００％（ｖ／ｖ）空気が入った湿度コントロールインキュベーター中３７℃で、単層として、サブクローニングした。
【００６３】
グルタミンを含む Leibovitz-L-15（１０×濃縮物）、ＲＰＭＩ（１０×濃縮物）、イーグル基本培地（Eagle basal medium, ＥＢＭ、１０×濃縮物）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０９％ ｗ／ｖ ビカルボナート、ハンク平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、１０×濃縮物）および、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、１０×濃縮物）はＳｉｇｍａ（St Louis, Mo., USA）から購入した。粉末濃縮物を必要量の逆浸透脱イオン化ピロゲン不含蒸留水に溶解し、単一強度溶液を作成し、０．２２μｍ高圧ろ過（Millipore Corporation, MA. U.S.A.）によって滅菌し、４℃で保存した。ＦＣＳは CSL Ltd., Australia から購入した。ＦＣＳは−２０℃で保存した。１０，０００ユニットのペニシリン、ストレプトマイシン１０ｍｇおよびアンホテリシン２５μｇ Ｕ／ｍＬを含む抗生物質／抗真菌性試薬溶液（１００×濃縮物）はＳｉｇｍａ（St Louis, USA）から得た。０．９％ ｗ／ｖ 塩化ナトリウム中、ブタトリプシン５ｇおよびＥＤＴＡ２ｇ／Ｌを含むトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（１０×濃縮物）はＳｉｇｍａ（St Louis, Mo., USA）から得た。すべての乳癌セルラインはAmerican tissue culture collection (Rockville, USA) から購入した。すべてのプラスチック製使い捨て培養容器は Greiner (Austria) から購入した。８ウェル、組織培養顕微鏡スライドグラスは Linbro (Flow Laboratories, VA, USA) から得た。
【００６４】
この試験では、ＭＤＡ ＭＢ−４６８、ＭＤＡ ＭＢ−２３１およびＭＤＡ ＭＢ−４３５セルラインを、１０％ ＦＣＳを補充した９０％ Leibovitz Ｌ−１５培地で培養した。集密した後、培養をＨＢＳＳ中で１×洗浄し、０．２５％ トリプシン／０．０５％ ＥＤＴＡ中でトリプシン処理した。塩類溶液１５ｍＬ＋細胞懸濁液０．２ｍＬを加えて、この細胞懸濁液を自動細胞カウンター（ZM-2 Coulter Counter）を用いてカウントした。
【００６５】
細胞を多数の
ＭＤＡ ＭＢ−４６８：２５，０００細胞／ｍＬ培地
ＭＤＡ ＭＢ−２３１：１２，０００細胞／ｍＬ培地
ＭＤＡ ＭＢ−４３５：１２，０００細胞／ｍＬ培地
に再懸濁した。ウェル当たり細胞懸濁液１ｍＬを加えて細胞を４８ウェルプレート（１ｃｍ２表面領域）にプレートした。細胞を２４時間付着させた後、培地を除去し、単層を洗浄した。試験培地は；０〜１μＭ アドリアマイシンまたは５−フルオロウラシルを含む培養培地であって、０〜１μＭのＨＡ（形式上Ｍｗ ７５０，０００）を加えるか、あるいは加えないものであった。この細胞をいくつかの組み合わせのＨＡおよび薬物に、種々の時間および種々の濃度で暴露した（表３）。
【００６６】
表３
ヒアルロナンおよび薬物に関する、ヒト乳癌セルラインとのインキュベーション条件
【表３】
【００６７】
インキュベーションおよび培養期間の後、細胞単層をＨＢＳＳで洗浄し、０．２５％ トリプシン／０．０５％ ＥＤＴＡ中でトリプシン処理した。塩類溶液１５ｍＬ＋細胞懸濁液０．２ｍＬを加えることによってこの細胞懸濁液を自動細胞カウンター（ZM-2 Coulter Counter）を用いてカウントした。結果は以下のように計算し、薬物なしコントロールの％として記載した：
【数１】
。
あるいは実験に基づいて以下のように計算し、薬物コントロールの％として記載した：
【数２】
。
【００６８】
実施例２に記載の指数関数的に生育するヒト乳癌細胞ＭＤＡ ＭＢ ２３１を０−５ｍｇ／ｍＬ（形式上Ｍｒ ７５０，０００Ｄ）と２４時間インキュベートした。２４時間の時点で、細胞をカウントし、ＣＰＲ（１６００フィルムは Eastman Kodak Company, Rochester, USA より得た）を用いて写真撮影した。
【００６９】
ＨＡを乳癌細胞と３０分、１時間、２４時間または３日間インキュベートすると、変化した応答が観察され、乳癌細胞数の減少は０〜２９％の範囲であった（表４参照）。
【００７０】
表４
ヒト乳癌セルラインに対するＨＡの細胞毒性作用
【表４】
＊値は２〜３回の測定の平均である。
【００７１】
また、ヒト乳癌細胞をＨＡとインキュベートすると、特定の形態変化（図１参照）、例えば原形質膜の膨張、サイトゾル成分のより多大な顆粒化が観察された。
【００７２】
ヒト乳癌細胞をＨＡに３０分、１時間、２４時間または３日間暴露した後、アドリアマイシンに暴露すると、ＨＡは薬物の細胞毒性を高めることがはっきりわかった（図３および表５）。
【００７３】
表５
乳癌セルラインのアドリアマイシンの細胞毒性に対するＨＡの作用
【表５】
すべての値は２〜３回の実験の範囲を表し、ここに数値は、薬物にＨＡを加えるか、あるいは薬物添加前に癌細胞をＨＡでプレ感作することによって達成されるＩＣ５０減少の倍率である。
【００７４】
実施例３
ヒアルロナンのインビボ効力
実施例２のインビトロ薬物感受性実験の結果に基づいて、ヒト乳癌のインビボ処置において、単独物質として、および化学増感剤としてのヒアルロナンの処置効力を評価した。
【００７５】
実施例２の結果から、癌セルラインＭＤＡ−ＭＢ−４６８を任意のヌードマウスヒト腫瘍異種移植片の作成に関する接種源として選択した。細胞を慣用の手順で培養し、上記実施例２に記載のようにサブカルチャーした。マウスへの注射用に、細胞を１００％集密まで培養し、０．０２５％トリプシン／０．０１％ ＥＤＴＡ溶液中でトリプシン処理し、Beckman TJ-6 bench centrifuge 中、４００ｇａｖで１０分間遠心分離して２回洗浄し、Model-ZM Coulter カウンターを用いてカウントし、血清を含まない Leibovitz L-15 培地中、１×１０８細胞／ｍＬで再懸濁した。
【００７６】
Walter and Eliza Hall Research Institute, Melbourne Australia から購入した６〜８週齢胸腺欠損ＣＢＡ／ＷＥＨＩヌード雌性マウスを特定の病原を含まない条件下、無菌のえさおよび水を自由に摂取できるようにして維持した。各マウスは５０μＬ中に５×１０６細胞を含む１回の注射を受けた。この細胞は、２６ゲージ針を用いて乳脂肪床（mammary fat pad）内へ第一乳頭下に直接注射した（Lamszus et al, 1997）。腫瘍測定は毎週行い、３垂直直径（ｄ１ｄ２ｄ３）を測定した。腫瘍容量は、式：
【数３】
を用いて評価した。
癌細胞接種約４〜８週間後に５−ＦＵ＋ＨＡでの処理を開始した。各実験において用いたマウスに関する平均腫瘍サイズを表６にまとめる。
【００７７】
表６
各実験の開始時のヒト乳癌腫瘍のまとめ
【表６】
【００７８】
腫瘍誘導の約８週間後、腫瘍を有する２マウスに致死量のネンブタールを与えた。マウスを犠牲にし、３分以内に、腫瘍を外科的に取り出し、直ちに１０％緩衝化ホルマリン中で１２時間固定した。固定された腫瘍を一連の７０〜１００％エタノールで一晩脱水し、次いでパラフィン包埋し、これから２〜４μｍセクションをカットした。このセクションをスライドグラスに載せ、脱ワックスし、水に入れた。スライドグラスをＰＢＳ中３×５分洗浄した。異種親和性タンパク質を１０％胎児ウシ血清と１０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ洗浄することによってブロックした。
【００７９】
ＨＡおよびＨＡシンターゼ抗体の視覚化に用いられる二次抗体は Dako (California, U.S.A.) から購入した。３，３'−ジアミノベンジジン（Sigma Fast DAB）錠は Sigma, St. Louis, USA から得た。
【００８０】
検出抗体は室温で６０分間適用した。検出抗血清または抗体はＲＨＡＭＭ、ＣＤ４４ＨおよびＣＡＥに対するものであった。スライドグラスをＰＢＳ中で３×５分間洗浄し、メタノール中の０．３％Ｈ２Ｏ２に浸漬して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。さらにＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼコンジュゲート化ブタ抗ウサギ二次抗血清を室温で６０分間適用し、次いでＰＢＳ中で３×５分間洗浄した。Sigma Fast ３，３'−ジアミノベンジジン錠（ＤＡＢ）を製造元の指示書にしたがって調製し、ＤＡＢ溶液を室温で５〜１０分間適用した。スライドグラスをｔａｐ水で１０分間洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、マウントした。
【００８１】
個々のマウス体重に応じて、５０μＬ中３０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵ（平均体重６０ｋｇに関するヒト治療用量１０．５ｍｇ／ｋｇに相当；Inaba et al, 1988）をデリバリーするように個々の５−ＦＵ注射を調製した。１２．５ｍｇ／マウス体重ｋｇに相当する最終ＨＡ濃度を含むＨＡ注射は５０μＬ中１２．５ｍｇ／ｋｇのＨＡをデリバリーするように調製した。この量のＨＡを体内に注射すると、実験期間中、飽和キネティクスが観察されるだろう（Fraser et al, 1983）。
【００８２】
ヒト乳癌に関して最も一般に用いられる処置療法の１つはシクロホスファミド、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシルであり、これを２８日サイクルの１および８日に投与する。ヒト乳癌では、初期の処置療法は６サイクル間であり、この時点で患者の症状を再評価し、したがってマウスを長期間効力実験における６サイクル（６月）の処置および６サイクル（６週）短期間効力実験に暴露することによってできるだけ綿密にヒト処置療法をシミュレーションすることを試みた。マウスのライフサイクルが約２年巻であることを考慮し、短期間および長期間処置プロトコルを開始した（表７を参照）。
【００８３】
表７
処置投与プロトコル
【表７】
【００８４】
マウスを無作為に、短期間実験用には群当たり８動物の７群に分け、長期間実験用には８動物の５群に分けた（用量および処置投与計画に関しては表７を参照）。
【００８５】
６月以上続く化学治療が一般により大きな効果に結び付かないことが示されていた（Harris et al, 1992）ので、処置は６月計画を越えて延長しなかった。
【００８６】
長期間実験に関して処置適用の日に、動物の体重を量り、腫瘍容量を測定した。６週間実験では、毎日、動物の体重を量り、腫瘍容量を測定した。動物を個別に注射用ボックスに入れ、尾静脈を介して注射を投与した。ストレスが化学療法に応答する患者の主要な要因であり得ることが実験的に証明されていた（Shackney et al, 1978）ので、それぞれのおりに同数のマウスを入れ、実験の段階に応じており当たりの動物数が５〜８で変化するようにした。
【００８７】
実験終了時点は、疾患進行程度のせいで動物を安楽死させなければならない時または６月（長期間）または６週（短期間）処置計画が完了した時であった。動物倫理ガイドラインに応じて、疾患進行の程度を評価する独立した動物倫理職員が動物を２週間に１回モニターした。以下の範疇を用いて、動物が死を必要とする実験終了時点の段階に達したかどうかを決定した：
１）動物が動けないほど腫瘍重量が大きくなった場合；
２）動物が飲食しなくなり、劇的な体重喪失を経験した場合；
３）腫瘍サイズが体重の１０％以上になった場合。
【００８８】
実験終了時点では、ネンブタール（６０ｍｇ／ｍＬ）の０．１ｍＬ腹腔内注射によって動物を麻酔し、血液を集めた後、頸部脱臼によって動物を犠牲にした。
【００８９】
マウスを犠牲にした後すぐに、腫瘍、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、左および右腎臓、子宮、肺、胃、腸、脳およびリンパ節を切り出し、０．０６Ｍホスフェート（ｐＨ７．５）で緩衝化された４％ホルマリンおよびセチルピリジニウムクロライド１．０％ｗ／ｖに入れた。この組織を１６〜２４時間固定した後、組織学的に処理した。固定された組織を段階的に１００％エタノールまで脱水し、パラフィンブロックに包埋し、ここから２〜４μｍのセクションを顕微鏡スライドグラスに置いた。ヘマトキシリン核染色およびエオシン細胞質染色を用いてこの組織セクションを染色し、処置毒性を示し得るすべての病理学的特徴を強調した。
【００９０】
９〜１１のリンパ節を動物ごとに集め、腫瘍領域を排出するすべての節が確実に収集されるようにした。現在、リンパ節転移の検出に用いられる２つの方法が存在する：
ｉ）総器官構造の慣用的ヘマトキシリンおよびエオシン染色；および、
ｉｉ）癌マーカー、例えば癌胎児性抗原を用いる免疫組織化学。
【００９１】
転移検出の両方法をこの実験において用いた。すべての市販ＣＥＡ抗体がヒト乳癌細胞と反応するわけではないため、５つの異なる抗体の反応性を試験した（DAKO, Amersham and KPL）。
【００９２】
ヘマトキシリンおよびエオシン染色されたリンパ節は Dr P. Allen (免許を有する病理学者)が試験し、各節は顕微鏡下で腫瘍細胞の存在に関して試験された。ＣＥＡ免疫染色されたリンパ節は顕微鏡下で試験し、すべての正に染色された節をカウントし、リンパ節転移に関して正のものを考慮した。
【００９３】
腫瘍容量はキャピラリー測定によって毎日あるいは毎週モニターし、前記のように計算した。６週実験の最後に、腫瘍重量を測定した。ここでは、図６に示されるように、ＨＡ化学感作治療は食塩水群、ＨＡおよび５−ＦＵ群より有意に小さい腫瘍を有した（ｐ＝０．００５）。処置の最初の２週間は腫瘍応答に有意な差異は見られなかったが、その後、ＨＡ次いで５−ＦＵ腫瘍生育は他の処置群と比較して妨げられた。６週間の処置の間、腫瘍倍増サイクル数に興味深い差異が見られた。食塩水処置を受けたマウスは平均４腫瘍倍増を経験し、ＨＡを処置計画に包含すると腫瘍倍増時間が有意に増加し、ＨＡ／５−ＦＵ動物は平均１腫瘍倍増サイクルを経験し、５−ＦＵ細胞毒性に対するＨＡの効果が再び強調される。
【００９４】
すべての動物は、初期腫瘍に隣接するリンパ節におけるリンパ節転移を表した。リンパ節関与（動物当たりの転移性節数）のパーセンテージは、ＨＡ次いで５−ＦＵ、５−ＦＵおよびＨＡ処置によって大きく減少し、食塩水群はリンパ節関与量の６倍増加を示した。他の処置群は１２．２〜１４．３％の有意に少ないパーセンテージを示した（Dunnett's Multiple Comparison Test, p=<0.001）。
【００９５】
ＨＡを同時に投与すると、非リンパ系転移の有意な減少が生じた。ＨＡ治療を受けたマウスを除き、初期腫瘍に隣接する領域の頸または腕の下領域のまわりに新規腫瘍が観察された。
【００９６】
胃腸管毒性：
５−ＦＵの最も一般的な毒性作用の１つは胃腸管に対するものであり、出血性腸炎および出血性穿孔が生じ得る（Martindale, 1993）。動物をＧＩ管不調、例えば下痢に関して毎日モニターし、より深刻な毒性現象、例えば体重喪失に関して毎週モニターした。体重喪失は、Shibamoto et al, 1996 に引用されるように１ｇ×腫瘍容量（ｃｍ３）として計算された腫瘍重量を差し引くことによって見積もった正味の体重を計算することによってモニターした。すべての重量変化を示すために、以下のように動物の体重を処置開始の時点での体重に対して標準化した：
【数３】
。
【００９７】
６週実験を通して処置毒性は見られなかった。５−ＦＵ処置群と比較して、ＨＡ治療を単独物質としてか、あるいは化学増感剤として受けたマウスは、高められた健康状態を示し、動物は体重を喪失せず、その体重を維持した（図４）。
【００９８】
血液髄抑制
５−ＦＵ処置に付随する主要な毒性の１つとしては、骨髄の抑制およびそれに続く白血球細胞の低下であり、任意の処置関連の血液毒性を評価する必要があった。動物を麻酔した時点で、心臓または大血管から針およびシリンジで血液を収集した。マウステナシティー（tenacity）食塩水（Ｍ）中で血液を１／５０希釈し、血球計算器でカウントすることによって白血球細胞数を見積もった。好中球、リンパ球、および赤血球をカウントすることによって示差血球カウントを行った。血球細胞サブ集団のトータルの見積もりを、マウス血液に関して公開されているデータと比較した。
【００９９】
トータル白色細胞カウントおよびサブ集団差は処置にかかわらず、有意に異なっていなかった。
【０１００】
器官重量に対する処置の効果
処置が器官萎縮症または肥大症を誘導しなかったことを確認するため、器官を取り出し、死後重量を測定した。各器官の重量は全体の正味の体重の％として計算し、食塩水のみの群（群１）の器官重量と比較した。
【０１０１】
全体の患者の生存時間は処置の開始後動物が生存した時間（日数または週数）として計算した。各処置群のすべての動物は６週処置プログラムを完了した。
【０１０２】
器官重量に関して、ＨＡ治療は劇的な毒性を全く生じなかった。５−ＦＵを受けたマウスは肥大した脾臓（重量において６１％増加）を示し、ＨＡおよび５−ＦＵを同時に投与すると、この肥大を３１％まで有意に打ち消した（student t-test, p<0.001）。５−ＦＵ治療は子宮の縮小（２２％）を生じ、ＨＡ／５−ＦＵ治療はこの毒性作用を再び１０％まで減少させた（student t-test, p=0.04）。同時投与または処置日前に投与することによって処置計画にＨＡを加えると、食塩水処置群と比較して、初期腫瘍の重量が有意に減少することが明らかに示された（student t-test, p=0.006）。処置間に器官重量の他の差異は見られなかった。
【０１０３】
実施例４
５−ＦＵのインビトロ効力に対するヒアルロナン濃度の効果
実施例２に記載のように、ＭＤＡ−ＭＢ ４６８、ＭＤＡ−ＭＢ ４３５およびＭＤＡ−ＭＢ ２３１細胞を培養した。この培養が７０〜８０％集密に達した時点で、これを３７℃の１×ＨＢＳＳ中で洗浄し、０．２５％ トリプシン／０．０５％ ＥＤＴＡ１０ｍＬ中で細胞が完全に剥がれるまでトリプシン処理した。１ｍＬ ＦＣＳを加えてトリプシンを中和した後、細胞をカウントし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、以下のように再懸濁した：
ＭＤＡ−ＭＢ ２３１：１２，０００細胞／培地ｍＬ；
ＭＤＡ−ＭＢ ４６８：２５，０００細胞／培地ｍＬ；および、
ＭＤＡ−ＭＢ ４３５：１２，０００細胞／培地ｍＬ。
次いで細胞を４８ウェルプレートにまき、供給元の指示書にしたがってインキュベートした。２４時間後に培地を除去し、以下の試験培地で置換した：
ＭＤＡ−ＭＢ ４６８：４０ｎＭ アドリアマイシン；
ＭＤＡ−ＭＢ ２３１：５０ｎＭ アドリアマイシン；および、
ＭＤＡ−ＭＢ ４３５：１０ｎＭ アドリアマイシン。
４０ｎＭ アドリアマイシン培地：４５０ｍＬ（ストックアドリアマイシンは１．７ｍＭであり、したがって１，７００，０００／４０＝４２，５００；４５０，０００／４２５００＝１０．６ｕＬの１．７ｍＭ アドリアマイシン＋培地４５０ｍＬ）。
ストックＨＡは１４．３μＭで７００，０００ダルトンであった。
【０１０４】
結論
この実験では、ＨＡがインビトロおよびインビボ両方において抗癌薬物、５−ＦＵおよびアドリアマイシンの細胞毒性を高めることができることが明確に示された。より詳細には：
１）単独物質として、ＨＡは、インビトロおよびインビボの両方において癌細胞に対する細胞毒性作用を発揮する（図５）；
２）ＨＡ単独治療または化学感作治療の治療効力を評価すると、これは正常組織に対して毒性ではなく、薬物の毒性プロファイルを高めなかったことが示された。実際、この治療を受けたマウスは６週間の処置期間にわたって有意な重量増加およびリンパ節転移の減少を示した。ＨＡおよび５−ＦＵの同時投与は、最初の腫瘍容量の減少に対して劇的な作用を有した；ならびに、
３）処置計画に組み込まれたＨＡを有するマウスは二次的な腫瘍の形成を全く示さなかった（図６）。
【０１０５】
将来の実験
乳癌のインビボ処置に関するＨＡの使用に対して現在実験が行われている。これらの実験はＨＡ濃度および分子量の効果およびアドリアマイシンの細胞毒性に対して焦点が当てられている。これらの実験の目的はまた、薬物およびＨＡ暴露時間および投与計画、ならびにＨＡの作用の機構、すなわち受容体媒介性輸送および／または細胞膜に対する作用を確立することである。また薬物耐性癌細胞の化学感作におけるＨＡの役割に対するさらなるデータを収集する。
【０１０６】
セクション１：
すべての実験は、種々のレベルのＨＡ受容体、ＣＤ４４およびＲＨＡＭＭを発現する乳癌セルラインに対して行う。試験されるセルラインは、ＭＤＡ−ＭＢ ４３５、ＭＤＡ−ＭＢ ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ ４６８、ＺＲＬ−７５１およびいくつかのＭＤＲ−１発現乳癌セルラインである。
【０１０７】
薬物耐性および薬物感受性乳癌細胞に対するＨＡ／アドリアマイシン暴露時間および濃度の作用を調査する。４ ＭＤＲ−１ポジティブおよび４ ＭＤＲ−１ネガティブセルラインを、１、２．５、５、１０、２０、４０、６０、８０および１００ｎＭのアドリアマイシンに暴露し、以下の変化型を試験する：
１）１ｈ 薬物±１００ｎＭ ＨＡ暴露、次いで３日間の薬物を含まない培養；
２）一定の薬物暴露±１００ｎＭ ＨＡ（３日間）、３０分１００ｎＭ ＨＡ暴露、次いで薬物（１ｈ）、薬物を含まない細胞培養（３日間）；および、
３）２４時間１００ｎＭ ＨＡ暴露、次いで薬物（１時間）、薬物を含まない細胞培養（３日間）。
【０１０８】
これらの実験は、最適なＨＡ暴露時間および投与計画、ＨＡと組み合わせた場合のアドリアマイシン細胞毒性増加の振り幅およびＨＡが乳癌細胞内の流出ポンプ耐性を克服可能であるかどうかを確立する。
【０１０９】
現在までのところ、アドリアマイシンのＩＣ５０は９０ｎＭと測定された。９０ｎＭのアドリアマイシンを用い、ＨＡ（７００ｋＤ）濃度を１、３、１０、３０、１００、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭおよび１００μＭに変化させる。試験されるインキュベーションの変化型は以下である：
１）３０分間ＨＡ暴露、次いで１ｈ薬物暴露、薬物を含まない細胞培養（３日間）；
２）２４ＨＡ暴露、次いで１ｈ薬物暴露、薬物を含まない細胞培養（３日間）；および、
３）ＨＡ±薬物暴露（１ｈｒ）、薬物を含まない細胞培養（３日間）。
【０１１０】
ＨＡが癌細胞剥離および移動において中枢の役割を果たすことができることが示唆されているため、すべての剥離細胞を細胞生存に関して試験する。剥離細胞が生存する場合、ＦＡＣＳ表面エピトープ同定を用いてＨＡ受容体状態を測定する。短いＨＡオリゴ糖、すなわち４糖、６糖、１２糖、５６００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２５０，０００Ｄａを用いて同様の実験を行う。
【０１１１】
これらの実験はインビトロでの最適なＨＡ：薬物比、最適なＨＡ暴露時間および投与計画、アドリアマイシン細胞毒性に対するＨＡ分子量の効果を示す。
【０１１２】
最適なＨＡ濃度を測定した後、一連の時間経過実験においてＩＣ５０のアドリアマイシンを用い、アドリアマイシン代謝に対するＨＡのすべての効果を観察する。
【０１１３】
［１４Ｃ］アドリアマイシンを細胞に、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１６時間および２４時間暴露する。実験条件は以下である：
１）細胞を３０分間ＨＡ、次いで薬物に暴露；ならびに、
２）細胞を２４間ＨＡ、次いで薬物に暴露、ＨＡ／アドリアマイシンの同時暴露。
【０１１４】
細胞を取り出し、低張溶解し、１１３，０００gavで１時間遠心分離する。ＨＰＬＣを用い、膜ペレットおよび上清を代謝産物に関してカウントし、分析する。
【０１１５】
細胞をガバーガラス上で培養し、ここで細胞はアドリアマイシン±ＨＡに暴露され（上記暴露計画）、共焦点写真タイムコースを用いてサイトゾル摂取および薬物移動を追跡する。
【０１１６】
ＭＤＲ−１ポジティブおよびネガティブ乳癌セルラインに対するＨＡ受容体の同定、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ１０およびＲＨＡＭＭ受容体のＦＡＣＳ定量を行う。また、ＦＩＴＣ／ＨＡおよびＦＡＣＳ分析を用いるＨＡ／受容体の結合および飽和キネティクスの定量を行う。
【０１１７】
細胞を以下に暴露することによる：
１）ＨＡ（３０分間）、次いで薬物；
２）ＨＡ（２４時間）、次いで薬物；ならびに、
３）ＨＡ／アドリアマイシン。
これらのうち任意のものがＣＤ４４ｓおよびＲＨＡＭＭ受容体をブロックすることを決定することができる。表面エピトープＦＡＣＳ分析を用いて任意の生存細胞のこの受容体の状態を定量する。ＨＡ受容体のブロッキングがアドリアマイシンおよびＨＡ間の通常観察される相乗作用を減少させるならば、膜結合およびサイトゾル性アドリアマイシンを±ＨＡ受容体ブロッキングで定量する。
【０１１８】
セルラインによるＨＡ分解は［３Ｈ］ＨＡおよびゲルろ過クロマトグラフィー±受容体ブロッキングを用いて実験する。
【０１１９】
分子量４ｓａｃｃ、６ｓａｃｃ、１２ｓａｃｃ、５６００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２５０，０００Ｄａ、７５０，０００Ｄａおよび１，５００，０００ＤａのＨＡを、あらかじめ決められた「効果が観察された」濃度で乳癌セルラインとインキュベートし、以下のパラメータを調査する：
細胞外および細胞内カルシウム流動（細胞プローブアッセイ）。細胞骨格成分の調節（細胞骨格遺伝子のマイクロアレイ）、細胞の容量に対する作用（細胞サイズ分析）および癌細胞移動度（Boyden Chamber matrigel アッセイ）を行った。
【０１２０】
ＨＡのセルサイクルに対する作用は、分子量４ｓａｃｃ、６ｓａｃｃ、１２ｓａｃｃ、５６００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２５０，０００Ｄａ、７５０，０００Ｄａおよび１，５００，０００ＤａのＨＡを、あらかじめ決められた「効果が観察された」濃度で乳癌セルラインとインキュベートすることによって行う。細胞をヨウ化カリウムでラベルし、ＦＡＣＳ分析に付する。セルサイクルの各段階の細胞数を測定する。
【０１２１】
最適なＨＡ／ドキソルビシン調製物およびリポソーム性ドキソルビシンの前臨床試験において Liposome Company によって用いられる用量範囲を用いてリポソーム性ドキソルビシンおよびＨＡ／ドキソルビシン調製物のインビトロ効果を比較する。
【０１２２】
セクション２：
ＨＡ／アドリアマイシン抗癌治療が第一相ヒト乳癌細胞試験に進行する前に、予備毒性実験を行う必要がある。この実験は以下に焦点を当てる：
１）マウス体器官および体液へのアドリアマイシン取り込みに対するヒアルロナンの効果；
２）アドリアマイシンに関する予備用量範囲の確立
ヌードマウスにおいてＨＡがアドリアマイシンをヒト乳癌異種移植片に標的化するかどうかの測定；
３）市販のリポソーム性ドキソルビシンの、マウスにおけるＨＡ／ドキソルビシン取り込みとの比較；ならびに、
４）リポソーム性ドキソルビシンおよびＨＡ／ドキソルビシンの短期間効果の比較。
【０１２３】
Inaba et al, (1988) より、ヌードマウスにおけるアドリアマイシンの用量は、４ｍｇ／ｋｇであり、これは６０ｍｇ／ｍ２のヒト用量と等しい。ヒト腫瘍を保持するヌードマウスにアドリアマイシン±ＨＡを注射する。４ｍｇ／ｋｇ±１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡのアドリアマイシン濃度を用いる。実験プロトコルは以下の処置群を含む：
１）４ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン；
２）４ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン＋１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；ならびに、
３）４ｍｇ／ｋｇ リポソーム性ドキソルビシン。
【０１２４】
アドリアマイシン±ＨＡを、マウスの尾部静脈に定量的に注射する。
【０１２５】
２、１５、３０、６０分および１．５、２、４、８、２４および４８時間（４動物／時点）の時間間隔で、マウスにネンブタール０．１ｍＬをＩＰ注射して犠牲にした。全ての体器官、骨格筋、リンパ節、骨髄、尿および血液を取り出し、ＨＰＬＣおよび蛍光を用いてアドリアマイシン含量を測定する。
【０１２６】
ヒト乳癌をヌードマウス（WEHI CBA 株）内に作成する。このマウスに以下を注射する：
１）マウスＬＤ５０ １０ｍｇ／ｋｇ；
２）４ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン；
３）４ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン＋１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；
４）８ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン；
５）８ｍｇ／ｋｇ アドリアマイシン＋１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；
６）４ｍｇ／ｋｇ リポソーム性ドキソルビシン；
７）食塩水；ならびに、
８）１２．５ｍｇ／ＨＡ。
【０１２７】
毎週のサイクルで２日目、４日目、６日目に、上記をマウス（８動物／群）の尾部静脈に定量的に注射する。
【０１２８】
マウスの腫瘍用量、体重、えさ摂取および機能を毎日モニターする。
【０１２９】
８週実験の完了時に、ネンブタール０．１ｍＬをＩＰ注射してマウスを犠牲にする。全ての体器官、腫瘍、骨格筋、リンパ節、骨髄、尿および血液を取り出し、病理学的評価用に処理する。
【０１３０】
セクション３：
大腸癌細胞に対するＨＡ抗癌治療の効果についてのいくつかの基本的な疑問に答えるために、以下の実験を行うべきである。
ＨＡ／５−ＦＵ暴露時間および濃度の、薬物耐性および薬物感受性大腸癌細胞に対する効果を調査する。
３耐性および３感受性セルラインを、１、２．５、５、１０、２０、４０、６０、８０および１００ｎＭの５−ＦＵに暴露し、以下の変数を試験する：
１）１ｈ 薬物±１００ｎＭ ＨＡ 暴露、次いで薬物を含まない培養（３日間）；
２）一定量薬物暴露±１００ｎＭ ＨＡ（３日間）；
３）３０分 １００ｎＭ ＨＡ 暴露、次いで薬物（１ｈ）、薬物を含まない細胞培養（３日間）；ならびに、
４）２４ｈ １００ｎＭ ＨＡ 暴露、次いで薬物（１ｈ）、薬物を含まない細胞培養（３日間）。
【０１３１】
上記のように測定したＩＣ５０の５−ＦＵを用いて、ＨＡ（７００ｋＤ）濃度を、１、３、１０、３０、１００、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭおよび１００μＭに変化させる。試験するインキュベーション変数：
１）３０分 ＨＡ 暴露、次いで１ｈ 薬物暴露、薬物を含まない細胞培養（３日間）；
２）２４ ＨＡ 暴露、次いで１ｈ 薬物暴露、薬物を含まない細胞培養（３日間）；ならびに、
３）ＨＡ±薬物暴露（１ｈｒ）、薬物を含まない細胞培養（３日間）。
【０１３２】
任意の剥離細胞を細胞生存能に関して試験する。これはＨＡが癌細胞の剥離および移動に中心的役割を果たし得ることが示されているからである。剥離細胞が生存可能であれば、ＨＡ受容体状態をＦＡＣＳ表面エピトープ同定を用いて測定する。
【０１３３】
短いＨＡオリゴ糖、すなわち：４ｓａｃｃ、６ｓａｃｃ、１２ｓａｃｃ、５６００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２５０，０００Ｄａを用いて同様の実験を行う。
【０１３４】
最適ＨＡ濃度を測定後、一連のタイムコース実験でＩＣ５０の５−ＦＵを用い、アドリアマイシン代謝に対するＨＡの任意の作用を観察する。
【０１３５】
３０分、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ、および２４ｈの間、［３Ｈ］５−ＦＵを細胞に暴露する。実験条件は以下である：
１）．細胞をＨＡ（３０分）、次いで薬物に暴露する；ならびに、
２０．細胞をＨＡ（２４）次いで薬物に暴露、ＨＡ／５−ＦＵの同時暴露。
【０１３６】
細胞を取り出し、低浸透圧下で溶解し、１１３，０００ｇａｖで１時間遠心分離する。ＨＰＬＣを用い、代謝産物に関して膜ペレットおよび上清をカウントし、分析する。
【０１３７】
また、細胞をカバーグラス上で培養し、これを５−ＦＵ±ＨＡに暴露（上記暴露方法）し、共焦点写真タイムコースを用いて、薬物のサイトゾル摂取および移動を追跡する。
【０１３８】
耐性および感受性大腸癌セルラインに対するＨＡ受容体の同定、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ１０およびＲＨＡＭＭ受容体のＦＡＣＳ定量、ＦＩＴＣ／ＨＡおよびＦＡＣＳ分析を用いる、ＨＡ／受容体の結合および飽和キネティクスの定量。
【０１３９】
ＣＤ４４ｓおよびＲＨＡＭＭ受容体を阻害抗体でブロッキングし、以下のプロトコルにしたがって５−ＦＵ±ＨＡを適用する：
１）．細胞をＨＡ（３０分）、次いで薬物に暴露する；ならびに、
２）．細胞をＨＡ（２４）、次いで薬物に暴露、ＨＡ／５−ＦＵの同時暴露。
【０１４０】
細胞をカウントする。表面エピトープＦＡＣＳ分析を用いて任意の生存細胞の受容体状態を定量する。
【０１４１】
ＨＡ受容体のブロッキングが５−ＦＵとＨＡ間の通常観察される相乗作用を減少させるならば、膜結合およびサイトゾル性５−ＦＵを±ＨＡ受容体ブロッキングで定量する。
【０１４２】
［３Ｈ］ＨＡおよびゲルろ過クロマトグラフィー±受容体ブロッキングを用いるセルラインによるＨＡ分解を実験する。
【０１４３】
原形質膜に対するＨＡの作用
分子量４ｓａｃｃ、６ｓａｃｃ、１２ｓａｃｃ、５６００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２５０，０００Ｄａ、７５０，０００Ｄａおよび１，５００，０００Ｄａのヒアルロナンを、あらかじめ決められた「効果が観察された」濃度で乳癌セルラインとインキュベートし、以下がパラメータを調査する：
１）．細胞外および細胞内カルシウム流動（細胞プローブアッセイ）；
２）．細胞骨格成分の調節（細胞骨格遺伝子のマイクロアレイ）；
３）．細胞容量に対する作用（ Coulter サイズ分析）；
４）．癌細胞の移動度（Boyden Chamber matrigel アッセイ）；
５）．ＨＡ受容体の定量（ＦＡＣＳ）；ならびに、
６）．膜電位（決定すべき方法）。
【０１４４】
ＨＡネオ−アジュバント治療の器官転移の阻害に対する役割を調査する。他の処置群と比較して、ＨＡ治療を受けたマウスは以下を示した：
１）．他の処置群と比較したリンパ節転移の減少；
２）．新規腫瘍形成の阻害；
３）．体重増加；および、
４）．健康の増大。
【０１４５】
これらの結果は、癌の拡大を減少させる効果的な手段としてのＨＡ抗癌治療の可能性ある役割を強調する。前臨床モデルの環境選択を通じて、制限が存在し、これにより二次的な癌の拡大は通常リンパ節の周りで生じる。各器官および骨への癌の拡大を試験可能なモデルを用いることは有益であろう。ＢＡＧベクター転移モデルとして既知のモデルを用いることによって、各器官および骨への癌の拡大をモニターできるだろう。
【０１４６】
簡単には、ＢＡＧベクターはネオマイシン耐性ＬａｃＺ遺伝子から構成され、これはヒト乳癌細胞内に安定にトランスフェクトできる。ヌードマウスへの心臓内注射、次いで６週間処置計画の後、任意の転移細胞／器官におけるＬａｃＺ遺伝子をＰＣＲ検出することが可能である。骨損傷の検出を伴う Faxitron スキャニングによりすべての骨転移が検出されるだろう。
【０１４７】
６週間の間、週サイクルの第１日目、第２日目に以下の処置を行う。処置群（５動物／群）は以下から構成される：
１．食塩水
２．３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ（第１日目、第２日目）；
３．１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目、第２日目）；
４．３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ ＋ １２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目、第２日目に同時投与）；
５．１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目）、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ（第２日目）、１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第３日目）、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ（第４日目）；
６．１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目、第３日目）；
７．３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ（第２日目、第４日目）；
８．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ（第１日目、第２日目）；
９．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ ＋ １２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目、第２日目に同時投与）；
１０．１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目）、１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ（第２日目）、１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第３日目）、１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ（第４日目）；
１１．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ（第２日目、第４日目）；
１２．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド（cyclophosamide）（第１日目、第２日目）；ならびに、
１３．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド ＋ １２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目、第２日目）；
１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第１日目）、（１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド）（第２日目）、１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ（第３日目）、（１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド）（第４日目）。
【０１４８】
ネオアジュバント治療：
心臓内注射直前に以下を投与する：
１）．１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；
２）．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ；
３）．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；
４）．３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ；
５）．３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、１２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ；
６）．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド；ならびに、
７）．１５ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ ５−ＦＵ、３０ｍｇ／ｋｇ シクロホサミド ＋ １２．５ｍｇ／ｋｇ ＨＡ。
【０１４９】
マウスの体重および健康状態を６週間毎日モニターする。処置サイクルの完了時に、各マウスを骨損傷に関してスキャンする。スキャンした後、各器官および体液を採り出す。器官の十分なクロスセクションを可能な将来の病理学的分析用に保存し、残りの組織をホモジナイズし、ＬａｃＺ遺伝子の検出のために拮抗ＰＣＲに付する。
【０１５０】
転移を示したすべての器官を組織学的に処理し、ＬａｃＺ遺伝子のガラクトシダーゼ染色を用いて癌細胞のコロニー形成のパターンを示す。
【０１５１】
参考文献
【表８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖性疾患の転移を予防する方法であって、それを必要としている被検体に治療有効量のヒアルロナンを、場合により医薬的担体、アジュバントまたはビヒクルとともに投与する工程を含む方法。
【請求項２】
細胞増殖性疾患の処置方法であって、それを必要としている被検体に、ヒアルロナンおよび化学治療剤を含む組成物の治療有効量を、場合により医薬的担体、アジュバントまたはビヒクルとともに投与し、ここに該組成物が相乗的な化学治療効果を達成する工程を含む方法。
【請求項３】
薬物耐性疾患の処置方法であって、その処置を必要としている被検体に、治療有効量のヒアルロナンを化学治療剤と組み合わせて投与し、ここに該化学治療剤が単独で投与される場合よりも有効である工程を含む方法。
【請求項４】
薬物耐性疾患が細胞増殖性障害である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞増殖性障害が乳癌、肺癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、神経癌、卵巣癌、子宮癌、肝臓癌、膵癌、上皮癌、胃癌、腸癌、外分泌腺癌、内分泌腺癌、リンパ性癌、造血系の癌または頭部および頚部組織の癌からなる群から選択されるものである、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
被検体が哺乳類である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
哺乳類がウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ブタおよびヒトからなる群から選択されるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヒアルロナンの投与が化学治療剤の投与前であるか、あるいは投与後である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項９】
さらに化学治療剤を投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
化学治療剤がカルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル（ロイケラン）、シスプラチン（プラチノール）、シタラビン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート（メクサート）、ＣＰＴ１１１、エトポシド、プリアマイシン（ミトラシン）およびタキサンからなる群から選択されるものである、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
化学治療剤がフルオロウラシル（５−ＦＵ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
投与が経口、局所、または非経口である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
細胞増殖性疾患の転移を予防する方法であって、それを必要としている被検体に治療有効量のヒアルロナンを、場合により医薬的担体、アジュバントまたはビヒクルとともに投与する工程を含む方法。
【請求項２】
細胞増殖性疾患の処置方法であって、それを必要としている被検体に、ヒアルロナンおよび化学治療剤を含む組成物の治療有効量を、場合により医薬的担体、アジュバントまたはビヒクルとともに投与し、ここに該組成物が相乗的な化学治療効果を達成する工程を含む方法。
【請求項３】
薬物耐性疾患の処置方法であって、その処置を必要としている被検体に、治療有効量のヒアルロナンを化学治療剤と組み合わせて投与し、ここに該化学治療剤が単独で投与される場合よりも有効である工程を含む方法。
【請求項４】
薬物耐性疾患が細胞増殖性障害である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞増殖性障害が乳癌、肺癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、神経癌、卵巣癌、子宮癌、肝臓癌、膵癌、上皮癌、胃癌、腸癌、外分泌腺癌、内分泌腺癌、リンパ性癌、造血系の癌または頭部および頚部組織の癌からなる群から選択されるものである、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
被検体が哺乳類である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
哺乳類がウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ブタおよびヒトからなる群から選択されるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヒアルロナンの投与が化学治療剤の投与前であるか、あるいは投与後である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項９】
さらに化学治療剤を投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
化学治療剤がカルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル（ロイケラン）、シスプラチン（プラチノール）、シタラビン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート（メクサート）、ＣＰＴ１１１、エトポシド、プリアマイシン（ミトラシン）およびタキサンからなる群から選択されるものである、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
化学治療剤がフルオロウラシル（５−ＦＵ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
投与が経口、局所、または非経口である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１６２５６９（Ｐ２０１２−１６２５６９Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１２３３５４（Ｐ２０１２−１２３３５４）
【出願日】平成２４年５月３０日（２０１２．５．３０）
【分割の表示】特願２００２−５１１７８３（Ｐ２００２−５１１７８３）の分割
【原出願日】平成１３年７月１３日（２００１．７．１３）
【出願人】（５０１２７４６５４）アルケミア オンコロジー ピーティワイ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１２３３５４（Ｐ２０１２−１２３３５４）
【出願日】平成２４年５月３０日（２０１２．５．３０）
【分割の表示】特願２００２−５１１７８３（Ｐ２００２−５１１７８３）の分割
【原出願日】平成１３年７月１３日（２００１．７．１３）
【出願人】（５０１２７４６５４）アルケミア オンコロジー ピーティワイ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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