病原性微生物の不活性化方法
【課題】 有機物の存在下でも、病原性微生物を、環境への負荷を軽減しつつ、簡単かつ確実に病原性微生物を不活性化する方法を提供する。
【解決手段】 病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体、二酸化塩素および活性酸素供与体を順次加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体の病原性微生物を不活性化する。
【解決手段】 病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体、二酸化塩素および活性酸素供与体を順次加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体の病原性微生物を不活性化する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体中の病原性微生物を不活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原性細菌やウイルスなどの病原性微生物を不活性化することは、医療機関などの感染性物質を取り扱う施設にとって非常に重要なことである。とりわけ、病原性細菌やウイルスなどにより発病した患者や保菌者からの分泌物や排泄物もしくはこれらを含む排水、治療に使用した医療機器の洗浄液などの感染性物質を外部に排出する場合には、当該廃液が感染性をもたない程度にまで病原性微生物などを不活性化処理しなければならないが、この処理には大規模な装置を必要とするうえ、運転コストなどを考慮すると非常に大きな負担を強いられることとなる。
【０００３】
一方、感染性廃液の処理方法としては、たとえば過酸化水素とオゾンを用いる方法（特許文献１）、高濃度オゾンで病原性廃棄物を処理する方法（特許文献２）、二酸化塩素などの殺菌分解剤で前処理をし、その後オゾン処理をすることを特徴とする感染性廃棄物の処理方法（特許文献３）などが知られている
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−０００９８２号公報
【特許文献２】特開平０５−２９３１６７号公報
【特許文献３】特開２００４−２４９２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載された発明では、実際のＥｍｂａｌｍｉｎｇ廃液（死体保存処理廃液）を用いた処理例が記載されているものの、感染性微生物として記載されているのは、ブドウ球菌に対する効果に過ぎず、病原性微生物の不活性化効果があるかどうかは記載されていない。また、特許文献２に記載された発明では、大腸菌やＢ型肝ウイルスに対して完全に殺菌できるとされているが、具体的データとともに記載されているのは大腸菌のみであるうえ、この発明では高濃度のオゾンを使用するので、そのための大規模な装置が必要となる。
【０００６】
特許文献３に記載された発明では、ウイルスや病原菌についての不活性化効果がほとんど示されていないので、ウイルス不活性化における実効性が担保されていないという問題がある。
【０００７】
一方、感染性物質である病原性微生物は、その感染性・病原性を失わせるための条件に大きな差異があり、簡単な処理で不活性化できるものから、厳しい条件で処理しなければ不活性化できないものまで存在する。
【０００８】
しかも、病原性微生物を含む廃液中には、通常、血液や組織など種々の有機物が含まれており、これらの有機物が病原性微生物の不活性化を阻害するので、よりその不活性化は困難となる。
【０００９】
とりわけ、医療機関からの廃液には、ヒトからの離脱物が多く含まれており、これらの多くはタンパク質であることにより、病原性微生物の不活性化において阻害要因となる。
【００１０】
また、有機物が存在する状況では、確実に病原性微生物を不活性化するためとはいえ、塩素を増加させることはトリハロメタンの生成増につながり、新たな環境問題を惹起するという問題があり、簡便で、確実な病原性微生物の不活性化方法が望まれている。
【００１１】
本発明の目的は、有機物が存在しても病原性微生物を簡単かつ確実に不活性化して、感染性・病原性を失わせることができ、かつ環境への負荷を軽減した病原性微生物の不活性化方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体、二酸化塩素および活性酸素供与体を順次加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化することを特徴とする病原性微生物不活性化方法である。
【００１３】
また本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体および二酸化塩素を順次加えて、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化する病原性微生物の不活性化方法であって、活性酸素供与体を所望の濃度に維持して前記水性媒体を処理しつつ、二酸化塩素を加え、二酸化塩素添加後もさらに前記活性酸素供与体を所望濃度に保って処理することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法である。
【００１４】
さらに、本発明は、活性酸素供与体がオゾンであり、二酸化塩素が安定化二酸化塩素であり、水性媒体が感染性廃液である病原性微生物の不活性化方法であることを特徴とする。
【００１５】
さらに、また本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体および二酸化塩素を加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、活性酸素供与体と二酸化塩素で病原性微生物を不活性化できるので、大規模な装置が不要であり、感染性廃棄物を取り扱う施設の規模に応じて実施できる。
【００１７】
また本発明によれば、処理後の廃液中に病原性微生物の不活性化のための薬剤またはこれに起因する副生物がなく、トリハロメタンなど環境に対して負荷をかける物質の産生もないため、環境問題がない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の病原性微生物の不活性化方法の処理工程を示したものである。
【図２】先行技術文献のうち特許文献３と本発明の実施形態１および２について、オゾンと二酸化塩素が水性媒体中で存在する状態の相違を模式的に示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体および二酸化塩素を加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化する病原性微生物の不活性化方法である。
【００２０】
本発明の作用機作については、明らかではないが、まず最初の活性酸素供与体による活性酸素が、病原性微生物の細胞壁を破壊ないし損傷させ、二酸化塩素が病原性微生物の内部により深く浸透しやすくなるためと推測される。
【００２１】
本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体、二酸化塩素および活性酸素供与体を順次加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化する病原性微生物の不活性化方法（実施形態１）である。
【００２２】
また、本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体を所望の濃度に維持して水性媒体を処理しつつ、二酸化塩素を加え、二酸化塩素添加後もさらに前記活性酸素供与体を所望濃度に保って処理することによって、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化する病原性微生物の不活性化方法（実施形態２）である。
【００２３】
図１にしたがって本発明方法を説明する。まず、有機物と病原性微生物を含む廃液に活性酸素供与体を添加し（Ｓ１）、二酸化塩素を添加し（Ｓ２）、さらに活性酸素供与体を添加する（Ｓ３）ことによって好適に実施することができる。
【００２４】
本発明において不活性化とは、病原性微生物が有する自己複製能力もしくは感染力またはその両方の能力を実質的に失なわせることを意味し、その対象となる病原性微生物としては、宿主である人、家畜、家禽に感染する能力を有し、かつ疾病を発症させる能力を有するウイルス、真正細菌、菌類および原生動物などがあげられる。
【００２５】
本発明においては、後記、実施例に具体的に示すとおり、インフルエンザ病原性微生物（ＲＮＡ型でエンベロープ有）、ヘルペス病原性微生物（ＤＮＡ型でエンベロープ有）、ネコカリシ病原性微生物（ＲＮＡ型でエンベロープ無）および芽胞菌という病原性微生物構造がそれぞれ異なる病原性微生物に有効であるから、殆どの病原性微生物に対して本発明を適用することができる。
【００２６】
かかる病原性微生物のうち、ウイルスとしては、たとえば、「感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律」（平成十年十月二日法律第百十四号）に定める１類，２類，４類，５類感染症ウイルスがあげられ、具体的には、エボラウイルス（エボラ出血熱の原因病原性微生物、以下、かっこ内は病原性微生物によって発症する疾病を示す）、クリミア・コンゴウイルス（クリミア・コンゴ出血熱）、痘瘡ウイルス（天然痘）、フニンウイルス、サビアウイルス、ガナリトウイルスまたはマチュポウイルス（南米出血熱）、マールブルグウイルス（マールブルグ熱）、ラッサウイルス（ラッサ熱）などの１類感染症ウイルス、ポリオウイルス（急性灰白髄炎）、ＳＡＲコロナウイルス（重症急性呼吸器症候群）、Ｈ５Ｎ１ウイルス（鳥インフルエンザ）などの２類感染症ウイルス、ＨＥＶウイルス（Ｅ型肝炎）、ウエストナイルウイルス（ウエストナイル熱）、ＨＡＶウイルス（Ａ型肝炎）、黄熱ウイルス（黄熱）、オムスクウイルス（オムスク出血熱）、キャサヌル森林病ウイルス（キャサヌル森林病）、狂犬病ウイルス（狂犬病）、サル痘ウイルス（サル痘）、ハンタウイルス（腎症候群性出血熱）、西部ウマ脳炎ウイルス（西部ウマ脳炎）、ダニ媒介脳炎ウイルス（ダニ媒介脳炎）、デングウイルス（デング熱）、東部ウマ脳炎ウイルス（東部ウマ脳炎）、鳥インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１を除く）ウイルス（鳥インフルエンザ）、ニパウイルス（ニパウイルス感染症）、日本脳炎ウイルス（日本脳炎）、ハンタウイルス（ハンタウイルス肺症候群）、Ｂウイルス（Ｂウイルス病）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ベネズエラウマ脳炎）、ヘンドラウイルス（ヘンドラ病原性微生物感染症）、リッサウイルス（リッサ病原性微生物感染症）、リフトバレー熱ウイルス（リフトバレー熱）などの４類感染症病原性微生物、さらには、肝炎（Ｅ，Ａを除く）ウイルス（Ｂ、Ｃその他の肝炎ウイルス）、急性脳炎ウイルス（急性脳炎）、風疹ウイルス（風疹）、麻疹ウイルス（麻疹）などの５類感染症ウイルスがあげられる。
【００２７】
上記以外の感染症原因ウイルス、たとえば、ヒト免疫不全ウイルス（後天性免疫不全症候群）、高病原性インフルエンザ以外の季節性インフルエンザ、水痘・疱疹ウイルス（水痘、帯状疱疹）、などのほか、サイトロメガウイルス、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）（単純疱疹）、単純ヘルペスウイルスや、無菌性髄膜炎の原因となるエンテロウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルスなどのウイルスも不活性化することができる。
【００２８】
また、本発明は、対象となるウイルスがヒト免疫不全、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、風疹、ＨＳＶ、インフルエンザ、ワクシニアなどのエンベロープを有するウイルスであっても、またロタ、アデノ、ポリオ、コクサッキー、エコー、ライノ、Ａ型肝炎、牛ロタなどエンベロープを有しないウイルスであっても不活性化でき、さらにはウイルスがＲＮＡ型ウイルスであってもＤＮＡ型ウイルスであっても不活性化することができる。
【００２９】
さらに、家畜・家禽に感染し、発症させるウイルスとしては、たとえば、上記ウイルスのうち、家畜・家禽に伝染・発症するもの、たとえば典型的なものとしてトリインフルエンザ、ブタインフルエンザなどのほか、ウシ、ウマ、ブタ、トリなどに感染して、呼吸疾患や伝染性下痢をおこさせる各種コロナ病原性微生物のほか、ウシ病原性微生物性下痢病原性微生物（ウシ病原性微生物性下痢・粘膜病）、ウシヘルペス病原性微生物（ウシ伝染性鼻気管炎）、ウシ白血病病原性微生物（ウシ白血病）、ニューカッスル病病原性微生物（トリニューカッスル病）などがあげられる。
【００３０】
また、病原性微生物のうち、病原性細菌としては、例えば、結核菌、コレラ菌、梅毒トレポネーマ、淋菌、赤痢菌、劇症型溶血性連鎖球菌、チフス菌、パラチフス菌、鼻疽菌、類鼻疽菌、炭疽菌、髄膜炎菌、破傷風菌、レンサ球菌、突発性発しん、百日咳、肺炎球菌、肺炎桿菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ジフテリア菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、薬剤耐性緑膿菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、ベロ毒素産生大腸菌などの病原性大腸菌、ペスト菌、野兎病菌、ブルセラ菌、ボツリヌス菌、レジオネラ菌、回帰熱菌、オウム病クラミジア、ライム病菌などの細菌のほか、Ｑ熱リケッチャ、コクシジオイデス症真菌、マラリア原虫、クリプトスポリジウム原虫などに対しても不活性化効果を有する。
【００３１】
さらに本発明において、有機物とは、ヒトまたは動物由来のものであって、細菌や病原性微生物などの感染性物質の不活性化を阻害するものをいい、具体的には、ヒトまたは家畜、家禽、ペットから離脱した物質をいう。
【００３２】
ヒトからの離脱物としては、骨、毛髪、爪、皮膚、臓器、筋肉などのヒトを構成する組織、細胞もしくは成分、血液、リンパ液などのヒト体液、糞便などのヒト排せつ物があげられる。
【００３３】
また家畜・家禽からの離脱物としては、体毛、筋肉、臓器、血液などの諸組織のほか、糞便などの排せつ物があげられる。
【００３４】
さらに、本発明における水性媒体としては、病原性微生物および有機物を含む水溶液または感染性廃液があげられ、具体的には、たとえば実験室規模ないしは比較的小規模で使用された病原性微生物および有機物を含む廃液のほか、微生物関連の施設や医療機関、とりわけ感染症を対象とした医療機関や施設からの廃液があげられる。
【００３５】
これらの水性媒体には、本発明の対象となる病原性微生物および有機物以外の成分や微生物が含まれていても、本発明を実施することができる。また、当然のことながら、有機物を含まず病原性微生物を含む水溶液または感染性廃液であっても本発明を実施することができる。
【００３６】
本発明において、病原性微生物および有機物を含む水性媒体（以下、単に水性媒体という）に、最初に加える活性酸素供与体（以下、第１活性酸素という）としては、水性媒体中で活性酸素を発生するものであればよく、特に限定されないが、具体的にはたとえばオゾン、過酸化水素などがあげられる。これらのうち、とりわけオゾンが好ましい。これらの第１活性酸素は市販のものを好適に使用することができる。
【００３７】
さらに、本発明において用いられる二酸化塩素（ＣｌＯ２）としては、塩素酸に酸を溶解して製造される二酸化塩素のほか、二酸化塩素をアルカリ性水溶液または水溶液に溶存させて貯蔵を可能にした安定化二酸化塩素を好適に使用することができる。また、二酸化塩素をゲル状にしたゲル化二酸化塩素も知られているが、このような二酸化塩素も好適に使用することができる。
【００３８】
本発明においては、取り扱い容易性や安全性の面で優れている安定化二酸化塩素を用いるのが好ましい。
【００３９】
また、二酸化塩素に続いて用いられる活性酸素供与体（以下、第２活性酸素という）としては、前記、第１活性酸素としてあげたものを用いることができ、とりわけオゾンが好ましい。
【００４０】
本発明方法においては、第１および第２活性酸素としてオゾン、二酸化塩素として安定化二酸化塩素を用いることが好ましい。
【００４１】
また、これら第１および第２活性酸素と二酸化塩素は、各成分を適宜組み合わせて用いることもでき、たとえば、第１、第２活性酸素としてオゾンと過酸化水素を併用してもよく、また二酸化塩素として二酸化塩素と安定化二酸化塩素を併用するなどしてもよい。
【００４２】
第１活性酸素の前記水性媒体への添加は、有機物および病原性微生物を含む水性媒体に、所望の濃度となるように第１活性酸素を直接加えてもよく、また前記水性媒体中で所望の濃度となる量の第１活性酸素を水溶液に溶解して加えてもよく、または第１活性酸素がオゾンのような気体であるときは、所望の濃度となるよう前記水性媒体中に直接オゾンを吹き込むようにして加えてもよい。
【００４３】
第１活性酸素の添加量は、水性媒体中の有機物の種類や含有量、病原性微生物の種類や含有量によっても変動するが、上記いずれの場合も、概ね病原性微生物および有機物を含む媒体に対して、活性酸素として０．５〜２０ｐｐｍ含まれる量を添加すればよく、好ましくは０．５〜１０ｐｐｍ、さらに好ましくは１〜５ｐｐｍであり、もっとも好ましくは２〜３ｐｐｍとなるよう添加すればよい。
【００４４】
第１活性酸素を前記水性媒体中に加えたのち、活性酸素を前記水性媒体中に拡散させるには、静置してもよいが、効率的に拡散させるため前記水性媒体を攪拌または循環して混合すればよい。該混合は特に加熱や冷却を必要とせず、常温で実施することができる。第１活性酸素による処理は、水性媒体中の有機物の種類や含有量、病原性微生物の種類や含有量によっても変動するが、概ね数分程度から１時間で完了する。
【００４５】
第１活性酸素に続く、二酸化塩素の添加は、前記水性媒体に、所望の濃度となるように、二酸化塩素を直接加えてもよく、また前記水性媒体中で所望の濃度となる量の二酸化塩素を水溶液に溶解して加えてもよく、または二酸化塩素を気体のまま所望の濃度となるよう前記水性媒体中に直接吹き込むようにしてもよい。
【００４６】
二酸化塩素として安定化二酸化塩素を用いるときは、通常アルカリ溶液として保存されているので、そのまま所望の濃度となるよう前記水性媒体に加えることによって実施できる。
【００４７】
二酸化塩素を前記水性媒体中に加える場合、前記水性媒体に最初に加えた第１活性酸素は、水性媒体中に残存していてもよく、あるいは消費され残存していなくともよい。
【００４８】
二酸化塩素は、前記いずれの場合であっても、前記水性媒体に対して、濃度が５〜１０００ｐｐｍとなるよう添加すればよく、好ましくは５〜６００ｐｐｍ、とりわけ好ましくは５〜２００ｐｐｍとなるよう添加すればよい。
【００４９】
二酸化塩素による処理は、前記第１活性酸素で前記水性媒体を処理する条件と同様の条件で実施することができる。処理時間は、前記水性媒体中の有機物の種類や含有量、病原性微生物の種類や含有量によっても変動するが、概ね１分程度から１時間で二酸化塩素による処理は完了する。
【００５０】
第２活性酸素は、前記水性媒体中の有機物の種類や含有量、病原性微生物の種類や含有量によっても変動するが、前記水性媒体に対して、第１活性酸素と同様の濃度となるよう添加すればよい。また、第２活性酸素の添加時には、第１活性酸素が残存していてもよく、また残存していなくてもよい。
【００５１】
第２活性酸素は、第１活性酸素と同様、前記水性媒体中に直接加えてもよく、あるいは所定濃度となるように水などの媒体に溶解、混合または懸濁して加えてもよく、さらには第２活性酸素がオゾンのような場合には気体のままで前記水性媒体中に吹き込むようにしてもよい。第２活性酸素による処理は、前記第１活性酸素による処理と同様の条件で実施することができる。
【００５２】
また、本発明においては、前記水性媒体に、第１活性酸素を所望の濃度に維持して前記水性媒体を処理しつつ、二酸化塩素を加え、二酸化塩素添加後もさらに第２活性酸素を所望濃度に保って処理すること、すなわち第１、第２活性酸素が連続して前記水性媒体中に存在させることによって、病原性微生物を不活性化することができる。
【００５３】
図２は、本発明の実施形態１，２と特許文献３に係る方法とを表１のように図２（１）〜図２（３）として模式的に示す図である。
【表１】
【００５４】
図２（１）および図２（２）に実施形態１，２として模式的に示すように、最初から前記水性媒体に、参照符２ａ，２ｂで示すように、オゾンのような第１活性酸素を一定濃度としておき、処理中の適宜の時点で、参照符１ａ，１ｂで示すように、二酸化塩素を添加し、さらに第２活性酸素を一定濃度に維持して処理することによって、病原性微生物を不活性化することができる。
【００５５】
この方法によるときは、第１活性酸素は第２活性酸素、および二酸化塩素は前記のものを好適に使用することができ、その使用量や添加方法などは、前記した範囲で適宜選択して実施することができる。
【００５６】
これに対して図２（３）に示す特許文献３の方法では、参照符１ｃで示すように、先に水性媒体中に二酸化塩素を添加した後、活性酸素を参照符２ｃで示すように溶解させているため、有効に病原性微生物の不活性化を実現することができない。
【実施例】
【００５７】
（実施例１）
本発明の不活性化対象ウイルスとして、インフルエンザウイルス、ヒト単純疱疹ウイルス、ネコカリシウイルス（ロタウイルスの代用ウイルス）の３種類のウイルスを用いた。
【００５８】
有機物としてＦＢＳ（ウシ胎児血清）１％を含む蒸留水に、オゾンを濃度が２ｐｐｍを維持するよう通気したのち、安定化二酸化塩素を１０ｐｐｍとなるように添加し、さらにオゾンが２ｐｐｍとなるようオゾンを通気した処理水をウイルス含有液に加えて３０分間静置したのち、ウイルスの感染価を測定した。
【００５９】
このとき、用いたウイルスの感染価は、インフルエンザウイルスが１．１×１０７ＰＦＵ／ｍｌ、ヒト単純疱疹ウイルスが２．６×１０６ＰＦＵ／ｍｌ、ネコカリシウイルス４．２×１０６ＰＦＵ／ｍｌである。
【００６０】
なお、ウイルス感染価は、それぞれの細胞を用いて以下のとおり、プラック感染価測定を行った。
【００６１】
［プラック感染価測定］
＜ウイルス＞
インフルエンザウイルスＰＲ８株を、ニワトリ受精卵（１０日卵）の漿尿膜腔に接種し、２日間培養した後、漿尿液を採取し、４℃で３，０００ｒｐｍ１０分間遠心分離した上清を３０％、６０％ショ糖のうえに重層し、２５，０００ｒｐｍ９０分間遠心分離し、ウイルスを精製した。ヒト単純疱疹ウイルスＩ型Ｆ株（ＨＳＶ）は、Ｖｅｒo細胞で増殖させた上清を用いた。また、ネコカリシウイルスＦ９株（ＦＣＶ）は、ＣＲＦＫ細胞で増殖させた上清を用いた。
【００６２】
＜細胞＞
インフルエンザウイルスの感染価測定用細胞として、ヒト大腸癌由来ＣａＣo２細胞を
用いた。ネコカリシウイルスの感染価測定用細胞は、ネコ腎臓由来ＣＲＦＫ細胞を用いた。ＨＳＶの感染価測定用細胞はミドリザル腎臓由来Ｖｅｒo細胞を用いた。
【００６３】
＜二酸化塩素の検定＞
安定化二酸化塩素（５０，０００ｐｐｍ）を最終希釈濃度１００ｐｐｍとなるように滅菌蒸留水で希釈した。有効塩素濃度１０ｐｐｍの水溶液９９０μＬにウイルス原液１０μＬを加え１〜６０分間室温で処理した。処理時間経過後、１０％（Ｗ／Ｖ）チオ硫酸ナトリウム１０μＬを加え反応を停止した後、ウイルスを血清不含のＤＭＥＭで希釈し０．１ｍＬずつ４ウェルのそれぞれの感受性細胞に接種し、３７℃で６０分間吸着させた。吸着後、０．８％アガロースゲルまたはメチルセルロースを含む培養液を加え、４８〜９６時間培養した。培養４８〜９６時間培養後にメタノール又は１０％ホルマリンでウイルス細胞を固定し、０．１％クリスタルバイオレットを含む２０％エタノール液を加え、プラックを算定し、感染価を算出した。
【００６４】
＜オゾン存在下での安定化二酸化塩素の殺ウイルス効果＞
ウイルス１０μＬに２００ｐｐｍ安定化二酸化塩素５０μＬを加え、２．２ｐｐｍになるようにオゾンを通気したオゾン水９４０μＬを加え１〜５分間処理した。処理時間経過後、１０％（Ｗ／Ｖ）チオ硫酸ナトリウム１０μＬを加え反応を停止した後、ウイルスを血清不含のＤＭＥＭで希釈し０．１ｍＬずつ４ウェルのそれぞれの感受性細胞に接種し、３７℃で６０分間吸着させた。吸着後、０．８％アガロースゲルまたはメチルセルロースを含む培養液を加え、４８〜９６時間培養した。培養４８〜９６時間培養後にメタノール又は１０％ホルマリンでウイルス細胞を固定し、０．１％クリスタルバイオレットを含む２０％エタノール液を加え、プラックを算定し、感染価を算出した。
【００６５】
＜結果＞
結果は、表１に示すとおりであり、インフルエンザウイルス、ＨＳＶは、感染価がいずれも５ＰＦＵ／ｍｌ以下で感染価は検出できず、ウイルスを１００％不活性化していることが明らかである。またＦＣＶの感染価は１６ＰＦＵ／ｍｌであり、不活性化前の感染価（４．２×１０６）に比べて９９．９９９％の感染価減衰率を示した。
【００６６】
（比較例１）
実施例１のインフルエンザウイルスを用い、オゾン２ｐｐｍを含む蒸留水にＦＢＳを最終濃度１．０％となるよう添加し、安定化二酸化塩素を１０ｐｐｍとなるように添加して、ウイルスを１分間処理してウイルスの不活性化を行った。
【００６７】
＜結果＞
結果は、表２に示すとおりである。
【００６８】
（比較例２）
実施例１で使用したインフルエンザウイルスを用い、オゾン２ｐｐｍを含む蒸留水にＦＢＳを最終濃度１．０％となるよう添加し、ウイルスを加え１分間処理してウイルスの不活性化を行った。
【００６９】
＜結果＞
結果は、表２に示すとおりである。なお、上記実施例１、比較例１および比較例２の実験は、北里大学医療衛生学部にて行われたものである。
【００７０】
【表２】
【００７１】
（実施例２）
＜供試菌株＞
使用菌株としてバチルスズブチリスＡＴＣＣ１９６５９（以下、供試菌株という）を用い、使用培地としてバクトトリプチカーゼソイアガー（ＴＳＡ）（ディフコ社製）およびティピコソイブロスＴＳＢ−ＢＰ１３（ＴＳＢ）（レーベンラボラトリー社製）を用いた。
【００７２】
＜培養方法＞
供試菌株の芽胞形成を促進させるための硫酸マンガン５μｇ／ｍｌを添加したＴＳＡ培地に供試菌株を培養し、Ｒｏｔｈらの方法（Ｒｏｔｈ，Ｓ．，Ｊ．Ｆｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒ，Ｃ．，Ｈｅｒｔｅｌ．２０１０，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １０８，５２１−５３２）によって、芽胞菌液を作製した。
菌液は４℃で保存した。
【００７３】
また、培養に際して、使用した試薬は次のとおりである。
安定化二酸化塩素（インターナショナルジオキシドインク社製）
１０ｍＭリン酸緩衝溶液（シグマ社製）
中和剤：１０％トゥイーン８０、０．１％ヒスチジン、０．５％チオ硫酸ナトリウム ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（シグマ社製）
消泡剤：ＫＭ−７３Ｅ（信越化学社製）
【００７４】
＜試験方法＞
有機物である０．３％ウシアルブミンを含む滅菌蒸留水２００ｍｌに終濃度１〜９×１０６ＣＦＵ／ｍｌとなるよう芽胞菌液２ｍｌを添加した。そこに終濃度３ｐｐｍとなるようにオゾンを供給し、６０分間供給を継続した。ついで、終濃度１０ｐｐｍとなるよう安定化二酸化塩素原液（５００ｐｐｍ）を４ｍｌ添加し、２０℃にて1分間インキュベートし、その後、さらにオゾンを終濃度３ｐｐｍで、６０分間供給した。終了後、処理菌液１に対して中和剤９の割合で混和し、二酸化塩素の中和とオゾンの蒸散を促すために、室温にて処理液を１０分間放置し、その後生存する菌数を算定した。
【００７５】
＜判定＞
芽胞菌の残存の確認は、採取した菌液からＰＢＳにて１０倍希釈系列（１０−１〜１０−４）を作製し、希釈液の各々を１００μｌずつＴＳＡ培地に接種した。３７℃、４８時間培養後、培地上に発育したコロニー数（ＣＦＵ）を数えて生存菌数を算出することによって行った。
【００７６】
また、同時に液体培地による増菌も行い、残存菌の有無を確認した。具体的には、採取した菌液の２００μｌをＴＳＢ２ｍｌに接種し、３７℃で４８時間培養した。培地の指示薬の色の変化、もしくは濁りが生じた場合を殺菌不可、いずれも認められない場合を菌の発育なしと判定した。
【００７７】
＜結果＞
ＴＳＡ培地上に発育したコロニーはなく、またＴＳＢ培地における指示薬の色の変化ならびに濁りはみられず、前記有機物を含むオゾン処理液中の芽胞菌を１００％不活性化することができた。なお、上記実施例２の実験は、名古屋大学医学部保健学科にて行われたものである。
【００７８】
以上のとおり、本発明は、活性酸素供与体、安定化二酸化塩素、活性酸素供与体の順に使用することによって、有機物を含む水性媒体中の病原性微生物を、前記成分の相乗効果によって、効率的に不活性化することができる。
【００７９】
前記実施例１および２に示すように、０．３％または１．０％という通常より高い濃度の有機物を含む水性媒体中の病原性微生物をオゾン２〜３ｐｐｍ、安定化二酸化塩素１０ｐｐｍ、オゾン２〜３ｐｐｍといった低濃度で不活性化できることは極めて高い効果であり、通常の病院廃液中の有機物濃度が０．０２％程度であること、安定化二酸化塩素を消毒剤として使用する場合の通常濃度が３００〜４００ｐｐｍであることからすれば、極めて驚異的な効果であることが明らかである。
【符号の説明】
【００８０】
１ａ，１ｂ 病原性微生物および有機物を含む水性媒体中の二酸化塩素
２ａ，２ｂ 病原性微生物および有機物を含む水性媒体中のオゾン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体中の病原性微生物を不活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原性細菌やウイルスなどの病原性微生物を不活性化することは、医療機関などの感染性物質を取り扱う施設にとって非常に重要なことである。とりわけ、病原性細菌やウイルスなどにより発病した患者や保菌者からの分泌物や排泄物もしくはこれらを含む排水、治療に使用した医療機器の洗浄液などの感染性物質を外部に排出する場合には、当該廃液が感染性をもたない程度にまで病原性微生物などを不活性化処理しなければならないが、この処理には大規模な装置を必要とするうえ、運転コストなどを考慮すると非常に大きな負担を強いられることとなる。
【０００３】
一方、感染性廃液の処理方法としては、たとえば過酸化水素とオゾンを用いる方法（特許文献１）、高濃度オゾンで病原性廃棄物を処理する方法（特許文献２）、二酸化塩素などの殺菌分解剤で前処理をし、その後オゾン処理をすることを特徴とする感染性廃棄物の処理方法（特許文献３）などが知られている
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−０００９８２号公報
【特許文献２】特開平０５−２９３１６７号公報
【特許文献３】特開２００４−２４９２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載された発明では、実際のＥｍｂａｌｍｉｎｇ廃液（死体保存処理廃液）を用いた処理例が記載されているものの、感染性微生物として記載されているのは、ブドウ球菌に対する効果に過ぎず、病原性微生物の不活性化効果があるかどうかは記載されていない。また、特許文献２に記載された発明では、大腸菌やＢ型肝ウイルスに対して完全に殺菌できるとされているが、具体的データとともに記載されているのは大腸菌のみであるうえ、この発明では高濃度のオゾンを使用するので、そのための大規模な装置が必要となる。
【０００６】
特許文献３に記載された発明では、ウイルスや病原菌についての不活性化効果がほとんど示されていないので、ウイルス不活性化における実効性が担保されていないという問題がある。
【０００７】
一方、感染性物質である病原性微生物は、その感染性・病原性を失わせるための条件に大きな差異があり、簡単な処理で不活性化できるものから、厳しい条件で処理しなければ不活性化できないものまで存在する。
【０００８】
しかも、病原性微生物を含む廃液中には、通常、血液や組織など種々の有機物が含まれており、これらの有機物が病原性微生物の不活性化を阻害するので、よりその不活性化は困難となる。
【０００９】
とりわけ、医療機関からの廃液には、ヒトからの離脱物が多く含まれており、これらの多くはタンパク質であることにより、病原性微生物の不活性化において阻害要因となる。
【００１０】
また、有機物が存在する状況では、確実に病原性微生物を不活性化するためとはいえ、塩素を増加させることはトリハロメタンの生成増につながり、新たな環境問題を惹起するという問題があり、簡便で、確実な病原性微生物の不活性化方法が望まれている。
【００１１】
本発明の目的は、有機物が存在しても病原性微生物を簡単かつ確実に不活性化して、感染性・病原性を失わせることができ、かつ環境への負荷を軽減した病原性微生物の不活性化方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体、二酸化塩素および活性酸素供与体を順次加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化することを特徴とする病原性微生物不活性化方法である。
【００１３】
また本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体および二酸化塩素を順次加えて、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化する病原性微生物の不活性化方法であって、活性酸素供与体を所望の濃度に維持して前記水性媒体を処理しつつ、二酸化塩素を加え、二酸化塩素添加後もさらに前記活性酸素供与体を所望濃度に保って処理することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法である。
【００１４】
さらに、本発明は、活性酸素供与体がオゾンであり、二酸化塩素が安定化二酸化塩素であり、水性媒体が感染性廃液である病原性微生物の不活性化方法であることを特徴とする。
【００１５】
さらに、また本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体および二酸化塩素を加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、活性酸素供与体と二酸化塩素で病原性微生物を不活性化できるので、大規模な装置が不要であり、感染性廃棄物を取り扱う施設の規模に応じて実施できる。
【００１７】
また本発明によれば、処理後の廃液中に病原性微生物の不活性化のための薬剤またはこれに起因する副生物がなく、トリハロメタンなど環境に対して負荷をかける物質の産生もないため、環境問題がない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の病原性微生物の不活性化方法の処理工程を示したものである。
【図２】先行技術文献のうち特許文献３と本発明の実施形態１および２について、オゾンと二酸化塩素が水性媒体中で存在する状態の相違を模式的に示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体および二酸化塩素を加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化する病原性微生物の不活性化方法である。
【００２０】
本発明の作用機作については、明らかではないが、まず最初の活性酸素供与体による活性酸素が、病原性微生物の細胞壁を破壊ないし損傷させ、二酸化塩素が病原性微生物の内部により深く浸透しやすくなるためと推測される。
【００２１】
本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体、二酸化塩素および活性酸素供与体を順次加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化する病原性微生物の不活性化方法（実施形態１）である。
【００２２】
また、本発明は、病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体を所望の濃度に維持して水性媒体を処理しつつ、二酸化塩素を加え、二酸化塩素添加後もさらに前記活性酸素供与体を所望濃度に保って処理することによって、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化する病原性微生物の不活性化方法（実施形態２）である。
【００２３】
図１にしたがって本発明方法を説明する。まず、有機物と病原性微生物を含む廃液に活性酸素供与体を添加し（Ｓ１）、二酸化塩素を添加し（Ｓ２）、さらに活性酸素供与体を添加する（Ｓ３）ことによって好適に実施することができる。
【００２４】
本発明において不活性化とは、病原性微生物が有する自己複製能力もしくは感染力またはその両方の能力を実質的に失なわせることを意味し、その対象となる病原性微生物としては、宿主である人、家畜、家禽に感染する能力を有し、かつ疾病を発症させる能力を有するウイルス、真正細菌、菌類および原生動物などがあげられる。
【００２５】
本発明においては、後記、実施例に具体的に示すとおり、インフルエンザ病原性微生物（ＲＮＡ型でエンベロープ有）、ヘルペス病原性微生物（ＤＮＡ型でエンベロープ有）、ネコカリシ病原性微生物（ＲＮＡ型でエンベロープ無）および芽胞菌という病原性微生物構造がそれぞれ異なる病原性微生物に有効であるから、殆どの病原性微生物に対して本発明を適用することができる。
【００２６】
かかる病原性微生物のうち、ウイルスとしては、たとえば、「感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律」（平成十年十月二日法律第百十四号）に定める１類，２類，４類，５類感染症ウイルスがあげられ、具体的には、エボラウイルス（エボラ出血熱の原因病原性微生物、以下、かっこ内は病原性微生物によって発症する疾病を示す）、クリミア・コンゴウイルス（クリミア・コンゴ出血熱）、痘瘡ウイルス（天然痘）、フニンウイルス、サビアウイルス、ガナリトウイルスまたはマチュポウイルス（南米出血熱）、マールブルグウイルス（マールブルグ熱）、ラッサウイルス（ラッサ熱）などの１類感染症ウイルス、ポリオウイルス（急性灰白髄炎）、ＳＡＲコロナウイルス（重症急性呼吸器症候群）、Ｈ５Ｎ１ウイルス（鳥インフルエンザ）などの２類感染症ウイルス、ＨＥＶウイルス（Ｅ型肝炎）、ウエストナイルウイルス（ウエストナイル熱）、ＨＡＶウイルス（Ａ型肝炎）、黄熱ウイルス（黄熱）、オムスクウイルス（オムスク出血熱）、キャサヌル森林病ウイルス（キャサヌル森林病）、狂犬病ウイルス（狂犬病）、サル痘ウイルス（サル痘）、ハンタウイルス（腎症候群性出血熱）、西部ウマ脳炎ウイルス（西部ウマ脳炎）、ダニ媒介脳炎ウイルス（ダニ媒介脳炎）、デングウイルス（デング熱）、東部ウマ脳炎ウイルス（東部ウマ脳炎）、鳥インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１を除く）ウイルス（鳥インフルエンザ）、ニパウイルス（ニパウイルス感染症）、日本脳炎ウイルス（日本脳炎）、ハンタウイルス（ハンタウイルス肺症候群）、Ｂウイルス（Ｂウイルス病）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ベネズエラウマ脳炎）、ヘンドラウイルス（ヘンドラ病原性微生物感染症）、リッサウイルス（リッサ病原性微生物感染症）、リフトバレー熱ウイルス（リフトバレー熱）などの４類感染症病原性微生物、さらには、肝炎（Ｅ，Ａを除く）ウイルス（Ｂ、Ｃその他の肝炎ウイルス）、急性脳炎ウイルス（急性脳炎）、風疹ウイルス（風疹）、麻疹ウイルス（麻疹）などの５類感染症ウイルスがあげられる。
【００２７】
上記以外の感染症原因ウイルス、たとえば、ヒト免疫不全ウイルス（後天性免疫不全症候群）、高病原性インフルエンザ以外の季節性インフルエンザ、水痘・疱疹ウイルス（水痘、帯状疱疹）、などのほか、サイトロメガウイルス、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）（単純疱疹）、単純ヘルペスウイルスや、無菌性髄膜炎の原因となるエンテロウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルスなどのウイルスも不活性化することができる。
【００２８】
また、本発明は、対象となるウイルスがヒト免疫不全、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、風疹、ＨＳＶ、インフルエンザ、ワクシニアなどのエンベロープを有するウイルスであっても、またロタ、アデノ、ポリオ、コクサッキー、エコー、ライノ、Ａ型肝炎、牛ロタなどエンベロープを有しないウイルスであっても不活性化でき、さらにはウイルスがＲＮＡ型ウイルスであってもＤＮＡ型ウイルスであっても不活性化することができる。
【００２９】
さらに、家畜・家禽に感染し、発症させるウイルスとしては、たとえば、上記ウイルスのうち、家畜・家禽に伝染・発症するもの、たとえば典型的なものとしてトリインフルエンザ、ブタインフルエンザなどのほか、ウシ、ウマ、ブタ、トリなどに感染して、呼吸疾患や伝染性下痢をおこさせる各種コロナ病原性微生物のほか、ウシ病原性微生物性下痢病原性微生物（ウシ病原性微生物性下痢・粘膜病）、ウシヘルペス病原性微生物（ウシ伝染性鼻気管炎）、ウシ白血病病原性微生物（ウシ白血病）、ニューカッスル病病原性微生物（トリニューカッスル病）などがあげられる。
【００３０】
また、病原性微生物のうち、病原性細菌としては、例えば、結核菌、コレラ菌、梅毒トレポネーマ、淋菌、赤痢菌、劇症型溶血性連鎖球菌、チフス菌、パラチフス菌、鼻疽菌、類鼻疽菌、炭疽菌、髄膜炎菌、破傷風菌、レンサ球菌、突発性発しん、百日咳、肺炎球菌、肺炎桿菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ジフテリア菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、薬剤耐性緑膿菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、ベロ毒素産生大腸菌などの病原性大腸菌、ペスト菌、野兎病菌、ブルセラ菌、ボツリヌス菌、レジオネラ菌、回帰熱菌、オウム病クラミジア、ライム病菌などの細菌のほか、Ｑ熱リケッチャ、コクシジオイデス症真菌、マラリア原虫、クリプトスポリジウム原虫などに対しても不活性化効果を有する。
【００３１】
さらに本発明において、有機物とは、ヒトまたは動物由来のものであって、細菌や病原性微生物などの感染性物質の不活性化を阻害するものをいい、具体的には、ヒトまたは家畜、家禽、ペットから離脱した物質をいう。
【００３２】
ヒトからの離脱物としては、骨、毛髪、爪、皮膚、臓器、筋肉などのヒトを構成する組織、細胞もしくは成分、血液、リンパ液などのヒト体液、糞便などのヒト排せつ物があげられる。
【００３３】
また家畜・家禽からの離脱物としては、体毛、筋肉、臓器、血液などの諸組織のほか、糞便などの排せつ物があげられる。
【００３４】
さらに、本発明における水性媒体としては、病原性微生物および有機物を含む水溶液または感染性廃液があげられ、具体的には、たとえば実験室規模ないしは比較的小規模で使用された病原性微生物および有機物を含む廃液のほか、微生物関連の施設や医療機関、とりわけ感染症を対象とした医療機関や施設からの廃液があげられる。
【００３５】
これらの水性媒体には、本発明の対象となる病原性微生物および有機物以外の成分や微生物が含まれていても、本発明を実施することができる。また、当然のことながら、有機物を含まず病原性微生物を含む水溶液または感染性廃液であっても本発明を実施することができる。
【００３６】
本発明において、病原性微生物および有機物を含む水性媒体（以下、単に水性媒体という）に、最初に加える活性酸素供与体（以下、第１活性酸素という）としては、水性媒体中で活性酸素を発生するものであればよく、特に限定されないが、具体的にはたとえばオゾン、過酸化水素などがあげられる。これらのうち、とりわけオゾンが好ましい。これらの第１活性酸素は市販のものを好適に使用することができる。
【００３７】
さらに、本発明において用いられる二酸化塩素（ＣｌＯ２）としては、塩素酸に酸を溶解して製造される二酸化塩素のほか、二酸化塩素をアルカリ性水溶液または水溶液に溶存させて貯蔵を可能にした安定化二酸化塩素を好適に使用することができる。また、二酸化塩素をゲル状にしたゲル化二酸化塩素も知られているが、このような二酸化塩素も好適に使用することができる。
【００３８】
本発明においては、取り扱い容易性や安全性の面で優れている安定化二酸化塩素を用いるのが好ましい。
【００３９】
また、二酸化塩素に続いて用いられる活性酸素供与体（以下、第２活性酸素という）としては、前記、第１活性酸素としてあげたものを用いることができ、とりわけオゾンが好ましい。
【００４０】
本発明方法においては、第１および第２活性酸素としてオゾン、二酸化塩素として安定化二酸化塩素を用いることが好ましい。
【００４１】
また、これら第１および第２活性酸素と二酸化塩素は、各成分を適宜組み合わせて用いることもでき、たとえば、第１、第２活性酸素としてオゾンと過酸化水素を併用してもよく、また二酸化塩素として二酸化塩素と安定化二酸化塩素を併用するなどしてもよい。
【００４２】
第１活性酸素の前記水性媒体への添加は、有機物および病原性微生物を含む水性媒体に、所望の濃度となるように第１活性酸素を直接加えてもよく、また前記水性媒体中で所望の濃度となる量の第１活性酸素を水溶液に溶解して加えてもよく、または第１活性酸素がオゾンのような気体であるときは、所望の濃度となるよう前記水性媒体中に直接オゾンを吹き込むようにして加えてもよい。
【００４３】
第１活性酸素の添加量は、水性媒体中の有機物の種類や含有量、病原性微生物の種類や含有量によっても変動するが、上記いずれの場合も、概ね病原性微生物および有機物を含む媒体に対して、活性酸素として０．５〜２０ｐｐｍ含まれる量を添加すればよく、好ましくは０．５〜１０ｐｐｍ、さらに好ましくは１〜５ｐｐｍであり、もっとも好ましくは２〜３ｐｐｍとなるよう添加すればよい。
【００４４】
第１活性酸素を前記水性媒体中に加えたのち、活性酸素を前記水性媒体中に拡散させるには、静置してもよいが、効率的に拡散させるため前記水性媒体を攪拌または循環して混合すればよい。該混合は特に加熱や冷却を必要とせず、常温で実施することができる。第１活性酸素による処理は、水性媒体中の有機物の種類や含有量、病原性微生物の種類や含有量によっても変動するが、概ね数分程度から１時間で完了する。
【００４５】
第１活性酸素に続く、二酸化塩素の添加は、前記水性媒体に、所望の濃度となるように、二酸化塩素を直接加えてもよく、また前記水性媒体中で所望の濃度となる量の二酸化塩素を水溶液に溶解して加えてもよく、または二酸化塩素を気体のまま所望の濃度となるよう前記水性媒体中に直接吹き込むようにしてもよい。
【００４６】
二酸化塩素として安定化二酸化塩素を用いるときは、通常アルカリ溶液として保存されているので、そのまま所望の濃度となるよう前記水性媒体に加えることによって実施できる。
【００４７】
二酸化塩素を前記水性媒体中に加える場合、前記水性媒体に最初に加えた第１活性酸素は、水性媒体中に残存していてもよく、あるいは消費され残存していなくともよい。
【００４８】
二酸化塩素は、前記いずれの場合であっても、前記水性媒体に対して、濃度が５〜１０００ｐｐｍとなるよう添加すればよく、好ましくは５〜６００ｐｐｍ、とりわけ好ましくは５〜２００ｐｐｍとなるよう添加すればよい。
【００４９】
二酸化塩素による処理は、前記第１活性酸素で前記水性媒体を処理する条件と同様の条件で実施することができる。処理時間は、前記水性媒体中の有機物の種類や含有量、病原性微生物の種類や含有量によっても変動するが、概ね１分程度から１時間で二酸化塩素による処理は完了する。
【００５０】
第２活性酸素は、前記水性媒体中の有機物の種類や含有量、病原性微生物の種類や含有量によっても変動するが、前記水性媒体に対して、第１活性酸素と同様の濃度となるよう添加すればよい。また、第２活性酸素の添加時には、第１活性酸素が残存していてもよく、また残存していなくてもよい。
【００５１】
第２活性酸素は、第１活性酸素と同様、前記水性媒体中に直接加えてもよく、あるいは所定濃度となるように水などの媒体に溶解、混合または懸濁して加えてもよく、さらには第２活性酸素がオゾンのような場合には気体のままで前記水性媒体中に吹き込むようにしてもよい。第２活性酸素による処理は、前記第１活性酸素による処理と同様の条件で実施することができる。
【００５２】
また、本発明においては、前記水性媒体に、第１活性酸素を所望の濃度に維持して前記水性媒体を処理しつつ、二酸化塩素を加え、二酸化塩素添加後もさらに第２活性酸素を所望濃度に保って処理すること、すなわち第１、第２活性酸素が連続して前記水性媒体中に存在させることによって、病原性微生物を不活性化することができる。
【００５３】
図２は、本発明の実施形態１，２と特許文献３に係る方法とを表１のように図２（１）〜図２（３）として模式的に示す図である。
【表１】
【００５４】
図２（１）および図２（２）に実施形態１，２として模式的に示すように、最初から前記水性媒体に、参照符２ａ，２ｂで示すように、オゾンのような第１活性酸素を一定濃度としておき、処理中の適宜の時点で、参照符１ａ，１ｂで示すように、二酸化塩素を添加し、さらに第２活性酸素を一定濃度に維持して処理することによって、病原性微生物を不活性化することができる。
【００５５】
この方法によるときは、第１活性酸素は第２活性酸素、および二酸化塩素は前記のものを好適に使用することができ、その使用量や添加方法などは、前記した範囲で適宜選択して実施することができる。
【００５６】
これに対して図２（３）に示す特許文献３の方法では、参照符１ｃで示すように、先に水性媒体中に二酸化塩素を添加した後、活性酸素を参照符２ｃで示すように溶解させているため、有効に病原性微生物の不活性化を実現することができない。
【実施例】
【００５７】
（実施例１）
本発明の不活性化対象ウイルスとして、インフルエンザウイルス、ヒト単純疱疹ウイルス、ネコカリシウイルス（ロタウイルスの代用ウイルス）の３種類のウイルスを用いた。
【００５８】
有機物としてＦＢＳ（ウシ胎児血清）１％を含む蒸留水に、オゾンを濃度が２ｐｐｍを維持するよう通気したのち、安定化二酸化塩素を１０ｐｐｍとなるように添加し、さらにオゾンが２ｐｐｍとなるようオゾンを通気した処理水をウイルス含有液に加えて３０分間静置したのち、ウイルスの感染価を測定した。
【００５９】
このとき、用いたウイルスの感染価は、インフルエンザウイルスが１．１×１０７ＰＦＵ／ｍｌ、ヒト単純疱疹ウイルスが２．６×１０６ＰＦＵ／ｍｌ、ネコカリシウイルス４．２×１０６ＰＦＵ／ｍｌである。
【００６０】
なお、ウイルス感染価は、それぞれの細胞を用いて以下のとおり、プラック感染価測定を行った。
【００６１】
［プラック感染価測定］
＜ウイルス＞
インフルエンザウイルスＰＲ８株を、ニワトリ受精卵（１０日卵）の漿尿膜腔に接種し、２日間培養した後、漿尿液を採取し、４℃で３，０００ｒｐｍ１０分間遠心分離した上清を３０％、６０％ショ糖のうえに重層し、２５，０００ｒｐｍ９０分間遠心分離し、ウイルスを精製した。ヒト単純疱疹ウイルスＩ型Ｆ株（ＨＳＶ）は、Ｖｅｒo細胞で増殖させた上清を用いた。また、ネコカリシウイルスＦ９株（ＦＣＶ）は、ＣＲＦＫ細胞で増殖させた上清を用いた。
【００６２】
＜細胞＞
インフルエンザウイルスの感染価測定用細胞として、ヒト大腸癌由来ＣａＣo２細胞を
用いた。ネコカリシウイルスの感染価測定用細胞は、ネコ腎臓由来ＣＲＦＫ細胞を用いた。ＨＳＶの感染価測定用細胞はミドリザル腎臓由来Ｖｅｒo細胞を用いた。
【００６３】
＜二酸化塩素の検定＞
安定化二酸化塩素（５０，０００ｐｐｍ）を最終希釈濃度１００ｐｐｍとなるように滅菌蒸留水で希釈した。有効塩素濃度１０ｐｐｍの水溶液９９０μＬにウイルス原液１０μＬを加え１〜６０分間室温で処理した。処理時間経過後、１０％（Ｗ／Ｖ）チオ硫酸ナトリウム１０μＬを加え反応を停止した後、ウイルスを血清不含のＤＭＥＭで希釈し０．１ｍＬずつ４ウェルのそれぞれの感受性細胞に接種し、３７℃で６０分間吸着させた。吸着後、０．８％アガロースゲルまたはメチルセルロースを含む培養液を加え、４８〜９６時間培養した。培養４８〜９６時間培養後にメタノール又は１０％ホルマリンでウイルス細胞を固定し、０．１％クリスタルバイオレットを含む２０％エタノール液を加え、プラックを算定し、感染価を算出した。
【００６４】
＜オゾン存在下での安定化二酸化塩素の殺ウイルス効果＞
ウイルス１０μＬに２００ｐｐｍ安定化二酸化塩素５０μＬを加え、２．２ｐｐｍになるようにオゾンを通気したオゾン水９４０μＬを加え１〜５分間処理した。処理時間経過後、１０％（Ｗ／Ｖ）チオ硫酸ナトリウム１０μＬを加え反応を停止した後、ウイルスを血清不含のＤＭＥＭで希釈し０．１ｍＬずつ４ウェルのそれぞれの感受性細胞に接種し、３７℃で６０分間吸着させた。吸着後、０．８％アガロースゲルまたはメチルセルロースを含む培養液を加え、４８〜９６時間培養した。培養４８〜９６時間培養後にメタノール又は１０％ホルマリンでウイルス細胞を固定し、０．１％クリスタルバイオレットを含む２０％エタノール液を加え、プラックを算定し、感染価を算出した。
【００６５】
＜結果＞
結果は、表１に示すとおりであり、インフルエンザウイルス、ＨＳＶは、感染価がいずれも５ＰＦＵ／ｍｌ以下で感染価は検出できず、ウイルスを１００％不活性化していることが明らかである。またＦＣＶの感染価は１６ＰＦＵ／ｍｌであり、不活性化前の感染価（４．２×１０６）に比べて９９．９９９％の感染価減衰率を示した。
【００６６】
（比較例１）
実施例１のインフルエンザウイルスを用い、オゾン２ｐｐｍを含む蒸留水にＦＢＳを最終濃度１．０％となるよう添加し、安定化二酸化塩素を１０ｐｐｍとなるように添加して、ウイルスを１分間処理してウイルスの不活性化を行った。
【００６７】
＜結果＞
結果は、表２に示すとおりである。
【００６８】
（比較例２）
実施例１で使用したインフルエンザウイルスを用い、オゾン２ｐｐｍを含む蒸留水にＦＢＳを最終濃度１．０％となるよう添加し、ウイルスを加え１分間処理してウイルスの不活性化を行った。
【００６９】
＜結果＞
結果は、表２に示すとおりである。なお、上記実施例１、比較例１および比較例２の実験は、北里大学医療衛生学部にて行われたものである。
【００７０】
【表２】
【００７１】
（実施例２）
＜供試菌株＞
使用菌株としてバチルスズブチリスＡＴＣＣ１９６５９（以下、供試菌株という）を用い、使用培地としてバクトトリプチカーゼソイアガー（ＴＳＡ）（ディフコ社製）およびティピコソイブロスＴＳＢ−ＢＰ１３（ＴＳＢ）（レーベンラボラトリー社製）を用いた。
【００７２】
＜培養方法＞
供試菌株の芽胞形成を促進させるための硫酸マンガン５μｇ／ｍｌを添加したＴＳＡ培地に供試菌株を培養し、Ｒｏｔｈらの方法（Ｒｏｔｈ，Ｓ．，Ｊ．Ｆｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒ，Ｃ．，Ｈｅｒｔｅｌ．２０１０，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １０８，５２１−５３２）によって、芽胞菌液を作製した。
菌液は４℃で保存した。
【００７３】
また、培養に際して、使用した試薬は次のとおりである。
安定化二酸化塩素（インターナショナルジオキシドインク社製）
１０ｍＭリン酸緩衝溶液（シグマ社製）
中和剤：１０％トゥイーン８０、０．１％ヒスチジン、０．５％チオ硫酸ナトリウム ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（シグマ社製）
消泡剤：ＫＭ−７３Ｅ（信越化学社製）
【００７４】
＜試験方法＞
有機物である０．３％ウシアルブミンを含む滅菌蒸留水２００ｍｌに終濃度１〜９×１０６ＣＦＵ／ｍｌとなるよう芽胞菌液２ｍｌを添加した。そこに終濃度３ｐｐｍとなるようにオゾンを供給し、６０分間供給を継続した。ついで、終濃度１０ｐｐｍとなるよう安定化二酸化塩素原液（５００ｐｐｍ）を４ｍｌ添加し、２０℃にて1分間インキュベートし、その後、さらにオゾンを終濃度３ｐｐｍで、６０分間供給した。終了後、処理菌液１に対して中和剤９の割合で混和し、二酸化塩素の中和とオゾンの蒸散を促すために、室温にて処理液を１０分間放置し、その後生存する菌数を算定した。
【００７５】
＜判定＞
芽胞菌の残存の確認は、採取した菌液からＰＢＳにて１０倍希釈系列（１０−１〜１０−４）を作製し、希釈液の各々を１００μｌずつＴＳＡ培地に接種した。３７℃、４８時間培養後、培地上に発育したコロニー数（ＣＦＵ）を数えて生存菌数を算出することによって行った。
【００７６】
また、同時に液体培地による増菌も行い、残存菌の有無を確認した。具体的には、採取した菌液の２００μｌをＴＳＢ２ｍｌに接種し、３７℃で４８時間培養した。培地の指示薬の色の変化、もしくは濁りが生じた場合を殺菌不可、いずれも認められない場合を菌の発育なしと判定した。
【００７７】
＜結果＞
ＴＳＡ培地上に発育したコロニーはなく、またＴＳＢ培地における指示薬の色の変化ならびに濁りはみられず、前記有機物を含むオゾン処理液中の芽胞菌を１００％不活性化することができた。なお、上記実施例２の実験は、名古屋大学医学部保健学科にて行われたものである。
【００７８】
以上のとおり、本発明は、活性酸素供与体、安定化二酸化塩素、活性酸素供与体の順に使用することによって、有機物を含む水性媒体中の病原性微生物を、前記成分の相乗効果によって、効率的に不活性化することができる。
【００７９】
前記実施例１および２に示すように、０．３％または１．０％という通常より高い濃度の有機物を含む水性媒体中の病原性微生物をオゾン２〜３ｐｐｍ、安定化二酸化塩素１０ｐｐｍ、オゾン２〜３ｐｐｍといった低濃度で不活性化できることは極めて高い効果であり、通常の病院廃液中の有機物濃度が０．０２％程度であること、安定化二酸化塩素を消毒剤として使用する場合の通常濃度が３００〜４００ｐｐｍであることからすれば、極めて驚異的な効果であることが明らかである。
【符号の説明】
【００８０】
１ａ，１ｂ 病原性微生物および有機物を含む水性媒体中の二酸化塩素
２ａ，２ｂ 病原性微生物および有機物を含む水性媒体中のオゾン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体、二酸化塩素および活性酸素供与体を順次加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法。
【請求項２】
病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体および二酸化塩素を順次加えて、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化する病原性微生物の不活性化方法であって、活性酸素供与体を所望の濃度に維持して前記水性媒体を処理しつつ、二酸化塩素を加え、二酸化塩素添加後もさらに前記活性酸素供与体を所望濃度に保って処理することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法。
【請求項３】
活性酸素供与体がオゾンであり、二酸化塩素が安定化二酸化塩素であり、前記水性媒体が感染性廃液であることを特徴とする請求項１または２に記載の病原性微生物の不活性化方法。
【請求項４】
病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体および二酸化塩素を加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法。
【請求項１】
病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体、二酸化塩素および活性酸素供与体を順次加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法。
【請求項２】
病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体および二酸化塩素を順次加えて、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化する病原性微生物の不活性化方法であって、活性酸素供与体を所望の濃度に維持して前記水性媒体を処理しつつ、二酸化塩素を加え、二酸化塩素添加後もさらに前記活性酸素供与体を所望濃度に保って処理することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法。
【請求項３】
活性酸素供与体がオゾンであり、二酸化塩素が安定化二酸化塩素であり、前記水性媒体が感染性廃液であることを特徴とする請求項１または２に記載の病原性微生物の不活性化方法。
【請求項４】
病原性微生物および有機物を含む水性媒体に、活性酸素供与体および二酸化塩素を加えて水性媒体を処理し、前記水性媒体中の病原性微生物を不活性化することを特徴とする病原性微生物の不活性化方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１６１７８５（Ｐ２０１２−１６１７８５Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２８６９５０（Ｐ２０１１−２８６９５０）
【出願日】平成２３年１２月２７日（２０１１．１２．２７）
【出願人】（３９００１０３４２）エア・ウォーター防災株式会社 (56)
【出願人】（５０２１８５１６８）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月２７日（２０１１．１２．２７）
【出願人】（３９００１０３４２）エア・ウォーター防災株式会社 (56)
【出願人】（５０２１８５１６８）
【Ｆターム（参考）】
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