癌を検出するための検査キット
アリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性を測定するための検査キットであり、４−メチルウンベリフェリルスルフェート及び４−メチルウンベリフェロンを含む。この検査キットは、早期癌のスクリーニング、治療効果及び癌再発の監視のために使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌又は他の疾患を検査するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の致死率は高い。癌生存率を改善する１つの要因は、早期発見である。しかしながら、癌に対する現在の早期発見のための検査及び有効治療には、多くの限界がある。
【０００３】
癌の発生及び成長は、酵素の不規則な発現と大いに相関している。細胞が癌化する間、細胞増殖に関係する酵素及びそのアイソザイムの活性は、高く調節される。アリールスルフェートを加水分解するアリールスルファターゼ（ＡＲＳ）及びそのアイソザイムは、生体における解毒に関係している。血清ＡＲＳ活性の上昇は、腫瘍か非腫瘍かを判別することができる炎症に関連していることは、一般的に認められている。血清中のＡＲＳ濃度の測定は、疾患の臨床診断、治療及び予後に非常に有用な情報を提供し得る。
【０００４】
いくつかの研究において、アリールスルファターゼ（ＡＲＳ）及びそのアイソザイムは、アリールスルフェートの加水分解を触媒する加水分解酵素であることが示されており、これは、健康な人の血清中よりも、肺癌患者の血清中においてより活性であることが証明されている。また、その活性は治療により低下することが示されている。ＡＲＳを含むリソソーム酵素の活性の上昇を、有効な診断及び治療効果の監視のために使用することができる（非特許文献１参照）。さらに、ヒト原発性及び続発性腫瘍の異なる組織学的種類であるＡＲＳＡ及びＡＲＳＢの活性が、ほぼ全ての原発性肺癌で著しく上昇する（非特許文献２参照）。乳癌患者におけるＡＲＳ活性は、健康な女性におけるＡＲＳ活性の２〜５倍である。手術又は化学療法の後では、活性は正常レベルまで低下する。酵素の活性は、腫瘍の大きさ及びその転移と相関している（非特許文献３参照）。また、乳癌組織でのスルファターゼの活性は、正常な組織での活性のおよそ２倍であることも分かっている（非特許文献４参照）。さらに、胃癌、直腸癌、乳癌及び皮膚癌でのＡＲＳ活性は、特異でない基質を用いることにより上昇することが分かっている（非特許文献５参照）。
【０００５】
４−メチルウンベリフェロンスルフェート（４−ＭＵＳ）は、ＡＲＳの活性を試験するための適切な基質として使用することができる（非特許文献６参照）。さらに、４−ＭＵＳは、他の基質よりも良好なＫｍ、Ｖｍａｘ、感度及び安定性を有し、その加水分解物である４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）は、アルカリ溶液中でより高い蛍光性を有し、測定に便利である。現在の技術では全て、ＡＲＳ Ａ又はＡＲＳ Ｂのいずれかを検査する方法が取られているが、４−ＭＵＳは、Ａ／Ｂを区別することができないことから（非特許文献７）、本発明ではＡＲＳ Ａ及びＢ酵素活性を一緒に、１回の分析で検査する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｏｚｎｉａｋ，Ａ．ら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ、２００２年、４９（１）：ｐ．１０〜５
【非特許文献２】Ｇａｓａ，Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１９８０年、４０（１０）：ｐ．３８０４〜９
【非特許文献３】Ｒｏｚｗｏｄｏｗｓｋａ，Ｍ．ら、Ｐｏｌ Ｍｅｒｋｕｒｉｕｓｚ Ｌｅｋ、２００４年、１７（９９）：ｐ．２５２〜４
【非特許文献４】Ｃｈｅｔｒｉｔｅ，Ｇ．Ｓ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００５年、２５（４）：ｐ．２８２７〜３０
【非特許文献５】Ｄｚｉａｌｏｓｚｙｎｓｋｉ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９６６年、１４（４）：ｐ．４５０〜３
【非特許文献６】Ｕｃｈｉｍｕｒａ，Ｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２００６年、４１６：ｐ．２４３
【非特許文献７】Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、１９６７年、１０２：ｐ．９０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＡＲＳ酵素により触媒された４−ＭＵＳの生化学的反応に従い、反応溶液中で生じる酵素活性を反映する４−ＭＵの特質に基づき、３６５ｎｍ励起により、４４５〜４５０ｎｍの波長で４−ＭＵの蛍光強度を検査する。そして、既知の濃度での４−ＭＵ標準生成物に基づく標準曲線を引いて、血清／尿試料中のＡＲＳ活性を定量的に検査する。これによって、初期スクリーニング、治療効果の監視及び再発検査を実施する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、４−ＭＵＳ及び４−ＭＵを含む、癌を検査するためのキットに関する。好ましくは、キット中の４−ＭＵＳの濃度は、１〜１０ｍＭであり、４−ＭＵの濃度は、１００〜５０００ｎＭである。キット中の緩衝液は、酢酸ナトリウムであり、好ましくは、濃度は１〜１００００ｍＭの範囲であり、ｐＨ値は１から１４の間であり、より好ましくは、濃度は１０〜１０００ｍＭの範囲であり、ｐＨ値は２から１４の間である。キット中の停止液は、炭酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウムの混合溶液又は炭酸ナトリウム及びグリシンの混合溶液であり、好ましくは、濃度は１〜５００００ｍＭの範囲であり、ｐＨ値は１から１４の間であり、より好ましくは、濃度は１０〜５０００ｍＭの範囲であり、ｐＨ値は７から１２の間である。キット中の沈殿剤は、酢酸鉛であり、好ましい濃度は１％〜９０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、より好ましい濃度は１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【０００９】
本発明は、スクリーニング、治療効果の監視及び再発検査のために使用することができる：
健康な人でのスクリーニング；症状を伴う患者での診断及び良性腫瘍及び悪性腫瘍の識別；患者の状態の判定及び治療計画の評価；腫瘍の治療効果の監視；再発及び予後の予測。
【００１０】
腫瘍には、肺癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、食道癌、腸癌、鼻咽頭癌、腎臓癌、膀胱癌、リンパ癌、胆嚢癌、膨大部癌、陰茎癌、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、前立腺癌、子宮癌、結腸直腸癌、胆管癌、柔組織肉腫、精原細胞腫瘍、ユーイング肉腫、白血病、骨肉腫、脳腫瘍又は悪性リンパ腫が含まれる。より好ましくは、肺癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、食道癌、腎臓癌、リンパ癌、結腸直腸癌、白血病及び悪性リンパ腫である。
【００１１】
本発明の利点（ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）と比較して）：
酵素と基質との間における反応は、極めて高効率かつ安定であるので、酵素活性の測定において抗原抗体反応方式よりも良好であり、誤った陽性結果がない。同時に、酵素活性の測定は、腫瘍形成における酵素の生物作用をより良好に示し得る。即ち、検査結果がより確かである。また、検査される生成物は、特殊な励起及び検出波長を有し、検査全体を実施可能なものにしている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の原理を示す図である。
【図２】ヒト血清アリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性に対する抗血液凝血剤の影響を示すグラフである。
【図３】ヒト血清アリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性に対する防腐剤の影響を示すグラフである。
【図４】４−ＭＵの標準曲線及び蛍光指数のグラフである。
【図５】３種の血清試料による反応時間を決定するための［４−ＭＵ］−時間曲線のグラフである。
【図６】異なる希釈条件での血清試料の［４−ＭＵ］−時間曲線のグラフである。
【図７】健康な人の血清及び肺癌などの癌患者からの血清におけるアリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性を比較するグラフである。
【図８】健康な人の全血試料及び肺癌などの癌患者からの全血試料におけるアリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性を比較するグラフである。
【図９】健康な人の血清及び肺癌などの癌患者からの血清におけるアリールスルフェート又はそのアイソザイムの活性に対応する感度−特異性を示すグラフである。
【図１０】健康な人の尿試料及び癌患者からの尿試料におけるアリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性を比較するグラフである。
【図１１】様々な種類の癌患者からの尿試料におけるアリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性上昇の感度を示すグラフである。
【図１２】健康な人の尿試料及び治療された癌患者からの尿試料におけるアリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）反応パラメーターの決定
１ 反応パラメーター
１．１ 酵素活性に対する抗血液凝血剤の影響（図２）
抗血液凝血剤の濃度上昇を伴う図２から：
・ＥＤＴＡは、ＡＲＳ活性に影響を及ぼさないようであった。
・ヘパリンナトリウム及びクエン酸ナトリウムは、ＡＲＳ活性に劇的な作用を有し、これは、用量の上昇に伴って低下する。
酵素の活性を確保するために、抗血液凝血剤処理を伴わない血清試料を実験試料として選択する。
【００１４】
１．２ 酵素活性に対する防腐剤の影響（図３）
図３から：
・室温で防腐作用を施した状態では、血清ＡＲＳ酵素の活性は毎日劇的に低下し、前日に比べて毎日約１０％低下する。
・４℃では、血清ＡＲＳ酵素の活性は、時間と共に僅かに変化する。
・１０回の凍結−解凍により、活性は約２０％低下する。
酵素活性に影響を及ぼさないために、−２０℃の温度を選択する。
【００１５】
１．３ 基本的な酵素の実験により決定された反応パラメーター
・ＯＤ−［Ｐ］は、直線的である。
・［Ｐ］−時間は、初期段階では直線的である。
・初期反応速度ｖ−［Ｅ］は、直線的である（［Ｓ］＞＞［Ｅ］０である場合）。
【００１６】
１．３．１ ＯＤ−［４−ＭＵ］標準曲線の決定：蛍光指数が４−ＭＵ濃度と直線的であることを確かめるために、図４を描いた（繰り返し実験で、一貫した結果を得た）。
【００１７】
１．３．２ ［４−ＭＵ］−時間曲線の決定：
最適な反応時間を決定するために、３種の血清試料を選択した。結果を図５に示す。［４−ＭＵ］の指数は、酵素反応時間が３６時間以内であるときに直線的である。
実験測定に基づく［４−ＭＵ］指数値が直線的な範囲内にあり、標準（比較）の値とは明らかに異なることを確かなものにするために、反応時間を２４時間に設定する。したがって、下記の血清試料を使用する実験は全て、他に明記されていなければ反応時間として２４時間を使用した。
【００１８】
１．３．３ 異なる希釈条件での血清試料の［４−ＭＵ］−時間曲線（図６）
血清試料の希釈率が直線的な範囲内にあることを確かなものにするために、１：８の比を選択し、その２０μｌを反応系に加える。
【００１９】
２ 反応パラメーターの決定：血清を１／８に希釈し、２０μｌを酵素反応に入れ、蛍光指数を２４時間後に測定し、同時にＯＤ−［４−ＭＵ］標準曲線を決定し、最後に（ＯＤ試料−ＯＤ対照（水））を［４−ＭＵ］に変換する。
【００２０】
（２）実験ステップ：
１ 血清試料検査
血液５ｍＬを分離ゲルと共に、抗血液凝血剤を入れずに真空キュベットに入れて、室温で約３０分間放置し、次いで水平遠心分離機で１０分間遠心分離する（３０００回転／分）。上澄み血清を、１．５ｍＬのＥＰチューブ／又は他のタイプの未使用管に吸引／注入し、使用前に−２０℃に冷却する。
【００２１】
活性測定では、血清５０μｌを１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）３５０μｌに入れる。
【００２２】
この希釈血清２０μｌを反応系１８０μｌ（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４、８ｍＭの４−ＭＵＳを含む）に加える。
【００２３】
サーマルコンテナ（３７℃）に２４時間入れ、次いで停止液１ｍｌ（５００ｍＭの炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．７）を加えることにより反応を停止させ、最後に各試料の蛍光を測定する（３６５ｎｍ励起、４４５〜４５０ｎｍ放射光線値を記録）。
【００２４】
ＯＤ−［４−ＭＵ］標準曲線のために標準試料４−ＭＵ（純粋な生成物）を使用し、血清での反応指数をこの標準曲線により変換して、各反応での［４−ＭＵ］を得る。
【００２５】
この［４−ＭＵ］に基づき、血清ＡＲＳ又はそのアイソザイムの活性を、１Ｌの血清タンパク質により１分で生成される４−ＭＵの量として測定する。
【００２６】
２ 尿試料検査
早朝尿の試料約３ｍＬを無菌ＥＰチューブに入れる。不純物を伴う場合には、１０分間遠心分離し（３０００回転／分）、不純物を除去して−２０℃で貯蔵する。
【００２７】
活性測定では、尿試料４０μＬをマイクロピペットで反応管に入れ、沈殿剤（３０％酢酸鉛溶液）４０μＬを加え、十分に混合し、試料を４℃で５分間放置する。次いで、室温で５分間遠心分離する（３０００回転／分）。
【００２８】
上澄みをマイクロピペットで除去する。基質調合液（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４、８ｍＭの４−ＭＵＳを含む）４０μＬを反応管に加え、十分に混合し、残留物のない状態にして３７℃で３０〜４０分間培養し、反応時間をＴとして記録する。その後、反応管を氷の上に素早く置き、停止液（５００ｍＭの炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．７）２００μＬを加え、十分に混合する。反応管を室温で１分間遠心分離する（６０００〜８０００回転／分）。
【００２９】
反応済みの混合された尿試料及びゼロ対照溶液（１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．４）をそれぞれ２００μＬ取り、蛍光測定（３６５ｎｍ励起、４４５〜４５０ｎｍ放射光線値を記録）する。
【００３０】
ＯＤ−［４−ＭＵ］標準曲線のために標準試料４−ＭＵ（純粋な生成物）を使用し、尿の反応指数をこの標準曲線により変換して、各反応での［４−ＭＵ］を得る。
【００３１】
上記［４−ＭＵ］に従って、尿ＡＲＳ又はそのアイソザイムの活性を、１Ｌ尿タンパク質により１分で生成される４−ＭＵの量として測定する。
【００３２】
（３） データ処理Ｉ：
上述のように、緩衝液（酢酸ナトリウム及び停止液成分を同じ濃度で含む）中の標準試料、即ち４−ＭＵ（０．００３ｍＭ）のＯＤを測定し、ＯＤｓとして記録する。
対照反応（血清に代わる酢酸ナトリウム緩衝液２０μｌの反応／尿に代わる酢酸ナトリウム緩衝液４０μｌの反応）のＯＤを測定し、これをＯＤ０として記録する。
（ＯＤｎ−ＯＤ０）／［４−ＭＵ］ｎ＝ＯＤｓ／［４−ＭＵ］ｓ
［４−ＭＵ］ｎ＝（ＯＤｎ−ＯＤ０）×０．００３ｍＭ／ＯＤｓ
試料ｎの反応から生成される生成物４−ＭＵの量、即ち、反応に関与する基質４−ＭＵＳの量を算出することが可能である。
【００３３】
試料ｎの活性、即ち１Ｌの酵素タンパク質により１分で変えられ得る基質のモル数を得ることが可能である。
式は、［４−ＭＵ］ｎ／（Ｌ×２４×６０）である。
単位は、ｎｍｏｌ／分／Ｌに変わる。
【００３４】
データ処理ＩＩ：
上述のように、緩衝液（酢酸ナトリウム及び停止液成分を同じ濃度により含む）中の標準試料、即ち４−ＭＵのＯＤ（０．００３ｍＭ）を測定し、ＯＤｓとして記録する。
対照反応（血清に代わる酢酸ナトリウム緩衝液２０μｌの反応／尿に代わる酢酸ナトリウム緩衝液４０μｌの反応）のＯＤを決定し、これをＯＤ０として記録する。
（ＯＤｎ−ＯＤ０）／［４−ＭＵ］ｎ＝ＯＤｓ／［４−ＭＵ］ｓ
［４−ＭＵ］ｎ＝（ＯＤｎ−ＯＤ０）×０．００３ｍＭ／ＯＤｓ
試料ｎの反応から生成される生成物４−ＭＵの量、即ち、反応に関与する基質４−ＭＵＳの量を算出することが可能である。
【００３５】
試料ｎのタンパク質量の測定：対照としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、λ＝２８０ｎｍでの紫外線分光光度計を用いて測定し、試料ｎのタンパク質濃度を得て、これをＭｎとして記録する。そこから、試料ｎのタンパク質量をＭｇｎとして算出することができる。
【００３６】
試料ｎの特異的活性、即ち、１ｍｇの酵素タンパク質により１分で変えられ得る基質のモル数を得ることが可能である。
式：［４−ＭＵ］ｎ／（Ｍｇｎ×２４×６０）
単位は、ｎｍｏｌ／分／ｍｇに変わる。
【００３７】
データ処理ＩＩＩ：
４−ＭＵ標準試料Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４の蛍光値を縦座標（ｙ）、対応する標準溶液の濃度値（単位ｎＭ）を横座標（ｘ）として使用し、原点を通る標準曲線を引く：ｙ＝ｋｘ。
【００３８】
試料の正味蛍光値Ａｉ’＝Ａｉ−Ａ０を算出し、これを前記式にｙとして代入すると、反応後溶液中の４−ＭＵの濃度、即ち、［４−ＭＵ］ｉ（単位ｎＭ）が得られる。
【００３９】
【数１】
【００４０】
試料の酵素活性を、下記の通り算出する：
【００４１】
【数２】
（尿試料に適していて、式中、２４０μＬは反応後溶液の全体積であり、４０μＬは当初尿体積である。）
【００４２】
【数３】
（血清試料に適していて、式中、２４０μＬは、反応後溶液の全体積であり、０．４μＬは、当初血清体積、即ち１／１０希釈血清４μＬを加えた体積である。）
【００４３】
値の単位を、Ｕ／Ｌに変換することができ、１Ｕ＝１μｍｏｌ・分-1である。
【００４４】
（４）実験機器：
水平遠心分離機：Ｈｅｒａｅｕｓ Ｌａｂｏｆｕｇｅ ４００Ｒ
検査機器：励起波長３６５ｎｍ及び検出波長４４５〜４５０ｎｍで蛍光シグナルを検出することができる。
電気恒温インキュベーター：Ｔｉａｎｊｉｎ Ｚｈｏｎｇｈｕａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｌｔｄ．
渦振盪機：ＩＫＡ ＭＳ２ Ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒ
Ｐｉｐｅｔｍａｎ（登録商標）：Ｇｉｌｓｏｎ １ｍＬ、２００μｌ、２０μｌ
【００４５】
（５）実験データ
１．健康な人（１５例）及び癌患者（肺癌７例、胃癌１例、卵巣癌３例、膵臓癌１例、乳癌１例）からの各血清試料でのＡＲＳ活性の測定を３回繰り返した。全てのデータに関しては、図７参照。
【００４６】
【表１】
【００４７】
２．健康な人及び癌患者の血清試料でのＡＲＳ活性の平均
【００４８】
【表２】
【００４９】
Ｔ−試験を健康な人の血清（全部で１５試料）及び癌患者からの血清（全部で１３試料）で完了して、ｐ＝０．００５４１５＜０．０１を得た。
【００５０】
３．実験データに対応する感度−特異性相関に関しては、図２参照のこと。
【００５１】
４．標準の決定：
感度−特異性の相関にしたがって、標準として比較的高い感度及び特異性でのカットオフ値を選択した。
【００５２】
５．健康な人（５４例）及び癌患者（肺癌１２例、胃癌１０例、結腸直腸癌１３例、食道癌９例、腎臓癌５例及び乳癌５例）からの各尿試料でのＡＲＳ活性の測定を３回繰り返した。全てのデータに関しては、図１０参照。
【００５３】
図が示しているように、癌患者からの尿試料でのアリールスルファターゼの活性は、健康な人の尿試料よりも劇的に高く、このことは、尿ＡＲＳ活性が、健康なサンプルから腫瘍を見分けるためのマーカーとして使用することができることを示している。
【００５４】
６．癌患者（食道癌５７例、胃癌８３例、結腸直腸癌７９例、腎臓癌５１例、膀胱６３例、肺癌２１１例、肝臓癌７６例、乳癌１０７例、卵巣癌９１例、造血性腫瘍２８例）からの尿試料でのアリールスルファターゼの活性を検査した。様々な種類の癌での感度（真の陽性例／（真の陽性例＋偽の陽性例））を図１１に示す。
【００５５】
検査された様々な種類の癌患者からの多くの尿試料で、アリールスルファターゼ活性の平均感度は８０％以上であり、このことは、尿試料でのＡＲＳ活性の異常な上昇が癌患者に共通していることを示している。
【００５６】
７．健康な人（２９例）及び治療後の癌患者（肺癌７例、食道癌９例、肝臓癌９例、腎臓癌２例、卵巣癌３例、下咽頭癌１例及び造血腫瘍２例）からの各尿試料でのＡＲＳ活性の測定を３回繰り返した。全てのデータに関しては、図１２参照。
【００５７】
治療処置後の癌患者では、尿ＡＲＳ活性が、健康な対照の尿ＡＲＳ活性に近いレベルまで劇的に低下したことが観察された（図１２）。したがって、尿試料でのＡＲＳ活性レベルの変化を、癌患者で治療効果を監視するために使用することができる。治療が有効であれば、ＡＲＳ活性値が、治療前よりも健康な人のレベル近くまで低下するはずである。また、尿試料でのＡＲＳ活性レベルの変化を、治療後の患者での癌再発を監視するために使用することもできる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌又は他の疾患を検査するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の致死率は高い。癌生存率を改善する１つの要因は、早期発見である。しかしながら、癌に対する現在の早期発見のための検査及び有効治療には、多くの限界がある。
【０００３】
癌の発生及び成長は、酵素の不規則な発現と大いに相関している。細胞が癌化する間、細胞増殖に関係する酵素及びそのアイソザイムの活性は、高く調節される。アリールスルフェートを加水分解するアリールスルファターゼ（ＡＲＳ）及びそのアイソザイムは、生体における解毒に関係している。血清ＡＲＳ活性の上昇は、腫瘍か非腫瘍かを判別することができる炎症に関連していることは、一般的に認められている。血清中のＡＲＳ濃度の測定は、疾患の臨床診断、治療及び予後に非常に有用な情報を提供し得る。
【０００４】
いくつかの研究において、アリールスルファターゼ（ＡＲＳ）及びそのアイソザイムは、アリールスルフェートの加水分解を触媒する加水分解酵素であることが示されており、これは、健康な人の血清中よりも、肺癌患者の血清中においてより活性であることが証明されている。また、その活性は治療により低下することが示されている。ＡＲＳを含むリソソーム酵素の活性の上昇を、有効な診断及び治療効果の監視のために使用することができる（非特許文献１参照）。さらに、ヒト原発性及び続発性腫瘍の異なる組織学的種類であるＡＲＳＡ及びＡＲＳＢの活性が、ほぼ全ての原発性肺癌で著しく上昇する（非特許文献２参照）。乳癌患者におけるＡＲＳ活性は、健康な女性におけるＡＲＳ活性の２〜５倍である。手術又は化学療法の後では、活性は正常レベルまで低下する。酵素の活性は、腫瘍の大きさ及びその転移と相関している（非特許文献３参照）。また、乳癌組織でのスルファターゼの活性は、正常な組織での活性のおよそ２倍であることも分かっている（非特許文献４参照）。さらに、胃癌、直腸癌、乳癌及び皮膚癌でのＡＲＳ活性は、特異でない基質を用いることにより上昇することが分かっている（非特許文献５参照）。
【０００５】
４−メチルウンベリフェロンスルフェート（４−ＭＵＳ）は、ＡＲＳの活性を試験するための適切な基質として使用することができる（非特許文献６参照）。さらに、４−ＭＵＳは、他の基質よりも良好なＫｍ、Ｖｍａｘ、感度及び安定性を有し、その加水分解物である４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）は、アルカリ溶液中でより高い蛍光性を有し、測定に便利である。現在の技術では全て、ＡＲＳ Ａ又はＡＲＳ Ｂのいずれかを検査する方法が取られているが、４−ＭＵＳは、Ａ／Ｂを区別することができないことから（非特許文献７）、本発明ではＡＲＳ Ａ及びＢ酵素活性を一緒に、１回の分析で検査する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｏｚｎｉａｋ，Ａ．ら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ、２００２年、４９（１）：ｐ．１０〜５
【非特許文献２】Ｇａｓａ，Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１９８０年、４０（１０）：ｐ．３８０４〜９
【非特許文献３】Ｒｏｚｗｏｄｏｗｓｋａ，Ｍ．ら、Ｐｏｌ Ｍｅｒｋｕｒｉｕｓｚ Ｌｅｋ、２００４年、１７（９９）：ｐ．２５２〜４
【非特許文献４】Ｃｈｅｔｒｉｔｅ，Ｇ．Ｓ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００５年、２５（４）：ｐ．２８２７〜３０
【非特許文献５】Ｄｚｉａｌｏｓｚｙｎｓｋｉ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９６６年、１４（４）：ｐ．４５０〜３
【非特許文献６】Ｕｃｈｉｍｕｒａ，Ｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２００６年、４１６：ｐ．２４３
【非特許文献７】Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、１９６７年、１０２：ｐ．９０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＡＲＳ酵素により触媒された４−ＭＵＳの生化学的反応に従い、反応溶液中で生じる酵素活性を反映する４−ＭＵの特質に基づき、３６５ｎｍ励起により、４４５〜４５０ｎｍの波長で４−ＭＵの蛍光強度を検査する。そして、既知の濃度での４−ＭＵ標準生成物に基づく標準曲線を引いて、血清／尿試料中のＡＲＳ活性を定量的に検査する。これによって、初期スクリーニング、治療効果の監視及び再発検査を実施する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、４−ＭＵＳ及び４−ＭＵを含む、癌を検査するためのキットに関する。好ましくは、キット中の４−ＭＵＳの濃度は、１〜１０ｍＭであり、４−ＭＵの濃度は、１００〜５０００ｎＭである。キット中の緩衝液は、酢酸ナトリウムであり、好ましくは、濃度は１〜１００００ｍＭの範囲であり、ｐＨ値は１から１４の間であり、より好ましくは、濃度は１０〜１０００ｍＭの範囲であり、ｐＨ値は２から１４の間である。キット中の停止液は、炭酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウムの混合溶液又は炭酸ナトリウム及びグリシンの混合溶液であり、好ましくは、濃度は１〜５００００ｍＭの範囲であり、ｐＨ値は１から１４の間であり、より好ましくは、濃度は１０〜５０００ｍＭの範囲であり、ｐＨ値は７から１２の間である。キット中の沈殿剤は、酢酸鉛であり、好ましい濃度は１％〜９０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、より好ましい濃度は１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【０００９】
本発明は、スクリーニング、治療効果の監視及び再発検査のために使用することができる：
健康な人でのスクリーニング；症状を伴う患者での診断及び良性腫瘍及び悪性腫瘍の識別；患者の状態の判定及び治療計画の評価；腫瘍の治療効果の監視；再発及び予後の予測。
【００１０】
腫瘍には、肺癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、食道癌、腸癌、鼻咽頭癌、腎臓癌、膀胱癌、リンパ癌、胆嚢癌、膨大部癌、陰茎癌、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、前立腺癌、子宮癌、結腸直腸癌、胆管癌、柔組織肉腫、精原細胞腫瘍、ユーイング肉腫、白血病、骨肉腫、脳腫瘍又は悪性リンパ腫が含まれる。より好ましくは、肺癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、食道癌、腎臓癌、リンパ癌、結腸直腸癌、白血病及び悪性リンパ腫である。
【００１１】
本発明の利点（ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）と比較して）：
酵素と基質との間における反応は、極めて高効率かつ安定であるので、酵素活性の測定において抗原抗体反応方式よりも良好であり、誤った陽性結果がない。同時に、酵素活性の測定は、腫瘍形成における酵素の生物作用をより良好に示し得る。即ち、検査結果がより確かである。また、検査される生成物は、特殊な励起及び検出波長を有し、検査全体を実施可能なものにしている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の原理を示す図である。
【図２】ヒト血清アリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性に対する抗血液凝血剤の影響を示すグラフである。
【図３】ヒト血清アリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性に対する防腐剤の影響を示すグラフである。
【図４】４−ＭＵの標準曲線及び蛍光指数のグラフである。
【図５】３種の血清試料による反応時間を決定するための［４−ＭＵ］−時間曲線のグラフである。
【図６】異なる希釈条件での血清試料の［４−ＭＵ］−時間曲線のグラフである。
【図７】健康な人の血清及び肺癌などの癌患者からの血清におけるアリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性を比較するグラフである。
【図８】健康な人の全血試料及び肺癌などの癌患者からの全血試料におけるアリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性を比較するグラフである。
【図９】健康な人の血清及び肺癌などの癌患者からの血清におけるアリールスルフェート又はそのアイソザイムの活性に対応する感度−特異性を示すグラフである。
【図１０】健康な人の尿試料及び癌患者からの尿試料におけるアリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性を比較するグラフである。
【図１１】様々な種類の癌患者からの尿試料におけるアリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性上昇の感度を示すグラフである。
【図１２】健康な人の尿試料及び治療された癌患者からの尿試料におけるアリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）反応パラメーターの決定
１ 反応パラメーター
１．１ 酵素活性に対する抗血液凝血剤の影響（図２）
抗血液凝血剤の濃度上昇を伴う図２から：
・ＥＤＴＡは、ＡＲＳ活性に影響を及ぼさないようであった。
・ヘパリンナトリウム及びクエン酸ナトリウムは、ＡＲＳ活性に劇的な作用を有し、これは、用量の上昇に伴って低下する。
酵素の活性を確保するために、抗血液凝血剤処理を伴わない血清試料を実験試料として選択する。
【００１４】
１．２ 酵素活性に対する防腐剤の影響（図３）
図３から：
・室温で防腐作用を施した状態では、血清ＡＲＳ酵素の活性は毎日劇的に低下し、前日に比べて毎日約１０％低下する。
・４℃では、血清ＡＲＳ酵素の活性は、時間と共に僅かに変化する。
・１０回の凍結−解凍により、活性は約２０％低下する。
酵素活性に影響を及ぼさないために、−２０℃の温度を選択する。
【００１５】
１．３ 基本的な酵素の実験により決定された反応パラメーター
・ＯＤ−［Ｐ］は、直線的である。
・［Ｐ］−時間は、初期段階では直線的である。
・初期反応速度ｖ−［Ｅ］は、直線的である（［Ｓ］＞＞［Ｅ］０である場合）。
【００１６】
１．３．１ ＯＤ−［４−ＭＵ］標準曲線の決定：蛍光指数が４−ＭＵ濃度と直線的であることを確かめるために、図４を描いた（繰り返し実験で、一貫した結果を得た）。
【００１７】
１．３．２ ［４−ＭＵ］−時間曲線の決定：
最適な反応時間を決定するために、３種の血清試料を選択した。結果を図５に示す。［４−ＭＵ］の指数は、酵素反応時間が３６時間以内であるときに直線的である。
実験測定に基づく［４−ＭＵ］指数値が直線的な範囲内にあり、標準（比較）の値とは明らかに異なることを確かなものにするために、反応時間を２４時間に設定する。したがって、下記の血清試料を使用する実験は全て、他に明記されていなければ反応時間として２４時間を使用した。
【００１８】
１．３．３ 異なる希釈条件での血清試料の［４−ＭＵ］−時間曲線（図６）
血清試料の希釈率が直線的な範囲内にあることを確かなものにするために、１：８の比を選択し、その２０μｌを反応系に加える。
【００１９】
２ 反応パラメーターの決定：血清を１／８に希釈し、２０μｌを酵素反応に入れ、蛍光指数を２４時間後に測定し、同時にＯＤ−［４−ＭＵ］標準曲線を決定し、最後に（ＯＤ試料−ＯＤ対照（水））を［４−ＭＵ］に変換する。
【００２０】
（２）実験ステップ：
１ 血清試料検査
血液５ｍＬを分離ゲルと共に、抗血液凝血剤を入れずに真空キュベットに入れて、室温で約３０分間放置し、次いで水平遠心分離機で１０分間遠心分離する（３０００回転／分）。上澄み血清を、１．５ｍＬのＥＰチューブ／又は他のタイプの未使用管に吸引／注入し、使用前に−２０℃に冷却する。
【００２１】
活性測定では、血清５０μｌを１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）３５０μｌに入れる。
【００２２】
この希釈血清２０μｌを反応系１８０μｌ（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４、８ｍＭの４−ＭＵＳを含む）に加える。
【００２３】
サーマルコンテナ（３７℃）に２４時間入れ、次いで停止液１ｍｌ（５００ｍＭの炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．７）を加えることにより反応を停止させ、最後に各試料の蛍光を測定する（３６５ｎｍ励起、４４５〜４５０ｎｍ放射光線値を記録）。
【００２４】
ＯＤ−［４−ＭＵ］標準曲線のために標準試料４−ＭＵ（純粋な生成物）を使用し、血清での反応指数をこの標準曲線により変換して、各反応での［４−ＭＵ］を得る。
【００２５】
この［４−ＭＵ］に基づき、血清ＡＲＳ又はそのアイソザイムの活性を、１Ｌの血清タンパク質により１分で生成される４−ＭＵの量として測定する。
【００２６】
２ 尿試料検査
早朝尿の試料約３ｍＬを無菌ＥＰチューブに入れる。不純物を伴う場合には、１０分間遠心分離し（３０００回転／分）、不純物を除去して−２０℃で貯蔵する。
【００２７】
活性測定では、尿試料４０μＬをマイクロピペットで反応管に入れ、沈殿剤（３０％酢酸鉛溶液）４０μＬを加え、十分に混合し、試料を４℃で５分間放置する。次いで、室温で５分間遠心分離する（３０００回転／分）。
【００２８】
上澄みをマイクロピペットで除去する。基質調合液（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４、８ｍＭの４−ＭＵＳを含む）４０μＬを反応管に加え、十分に混合し、残留物のない状態にして３７℃で３０〜４０分間培養し、反応時間をＴとして記録する。その後、反応管を氷の上に素早く置き、停止液（５００ｍＭの炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．７）２００μＬを加え、十分に混合する。反応管を室温で１分間遠心分離する（６０００〜８０００回転／分）。
【００２９】
反応済みの混合された尿試料及びゼロ対照溶液（１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．４）をそれぞれ２００μＬ取り、蛍光測定（３６５ｎｍ励起、４４５〜４５０ｎｍ放射光線値を記録）する。
【００３０】
ＯＤ−［４−ＭＵ］標準曲線のために標準試料４−ＭＵ（純粋な生成物）を使用し、尿の反応指数をこの標準曲線により変換して、各反応での［４−ＭＵ］を得る。
【００３１】
上記［４−ＭＵ］に従って、尿ＡＲＳ又はそのアイソザイムの活性を、１Ｌ尿タンパク質により１分で生成される４−ＭＵの量として測定する。
【００３２】
（３） データ処理Ｉ：
上述のように、緩衝液（酢酸ナトリウム及び停止液成分を同じ濃度で含む）中の標準試料、即ち４−ＭＵ（０．００３ｍＭ）のＯＤを測定し、ＯＤｓとして記録する。
対照反応（血清に代わる酢酸ナトリウム緩衝液２０μｌの反応／尿に代わる酢酸ナトリウム緩衝液４０μｌの反応）のＯＤを測定し、これをＯＤ０として記録する。
（ＯＤｎ−ＯＤ０）／［４−ＭＵ］ｎ＝ＯＤｓ／［４−ＭＵ］ｓ
［４−ＭＵ］ｎ＝（ＯＤｎ−ＯＤ０）×０．００３ｍＭ／ＯＤｓ
試料ｎの反応から生成される生成物４−ＭＵの量、即ち、反応に関与する基質４−ＭＵＳの量を算出することが可能である。
【００３３】
試料ｎの活性、即ち１Ｌの酵素タンパク質により１分で変えられ得る基質のモル数を得ることが可能である。
式は、［４−ＭＵ］ｎ／（Ｌ×２４×６０）である。
単位は、ｎｍｏｌ／分／Ｌに変わる。
【００３４】
データ処理ＩＩ：
上述のように、緩衝液（酢酸ナトリウム及び停止液成分を同じ濃度により含む）中の標準試料、即ち４−ＭＵのＯＤ（０．００３ｍＭ）を測定し、ＯＤｓとして記録する。
対照反応（血清に代わる酢酸ナトリウム緩衝液２０μｌの反応／尿に代わる酢酸ナトリウム緩衝液４０μｌの反応）のＯＤを決定し、これをＯＤ０として記録する。
（ＯＤｎ−ＯＤ０）／［４−ＭＵ］ｎ＝ＯＤｓ／［４−ＭＵ］ｓ
［４−ＭＵ］ｎ＝（ＯＤｎ−ＯＤ０）×０．００３ｍＭ／ＯＤｓ
試料ｎの反応から生成される生成物４−ＭＵの量、即ち、反応に関与する基質４−ＭＵＳの量を算出することが可能である。
【００３５】
試料ｎのタンパク質量の測定：対照としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、λ＝２８０ｎｍでの紫外線分光光度計を用いて測定し、試料ｎのタンパク質濃度を得て、これをＭｎとして記録する。そこから、試料ｎのタンパク質量をＭｇｎとして算出することができる。
【００３６】
試料ｎの特異的活性、即ち、１ｍｇの酵素タンパク質により１分で変えられ得る基質のモル数を得ることが可能である。
式：［４−ＭＵ］ｎ／（Ｍｇｎ×２４×６０）
単位は、ｎｍｏｌ／分／ｍｇに変わる。
【００３７】
データ処理ＩＩＩ：
４−ＭＵ標準試料Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４の蛍光値を縦座標（ｙ）、対応する標準溶液の濃度値（単位ｎＭ）を横座標（ｘ）として使用し、原点を通る標準曲線を引く：ｙ＝ｋｘ。
【００３８】
試料の正味蛍光値Ａｉ’＝Ａｉ−Ａ０を算出し、これを前記式にｙとして代入すると、反応後溶液中の４−ＭＵの濃度、即ち、［４−ＭＵ］ｉ（単位ｎＭ）が得られる。
【００３９】
【数１】
【００４０】
試料の酵素活性を、下記の通り算出する：
【００４１】
【数２】
（尿試料に適していて、式中、２４０μＬは反応後溶液の全体積であり、４０μＬは当初尿体積である。）
【００４２】
【数３】
（血清試料に適していて、式中、２４０μＬは、反応後溶液の全体積であり、０．４μＬは、当初血清体積、即ち１／１０希釈血清４μＬを加えた体積である。）
【００４３】
値の単位を、Ｕ／Ｌに変換することができ、１Ｕ＝１μｍｏｌ・分-1である。
【００４４】
（４）実験機器：
水平遠心分離機：Ｈｅｒａｅｕｓ Ｌａｂｏｆｕｇｅ ４００Ｒ
検査機器：励起波長３６５ｎｍ及び検出波長４４５〜４５０ｎｍで蛍光シグナルを検出することができる。
電気恒温インキュベーター：Ｔｉａｎｊｉｎ Ｚｈｏｎｇｈｕａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｌｔｄ．
渦振盪機：ＩＫＡ ＭＳ２ Ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒ
Ｐｉｐｅｔｍａｎ（登録商標）：Ｇｉｌｓｏｎ １ｍＬ、２００μｌ、２０μｌ
【００４５】
（５）実験データ
１．健康な人（１５例）及び癌患者（肺癌７例、胃癌１例、卵巣癌３例、膵臓癌１例、乳癌１例）からの各血清試料でのＡＲＳ活性の測定を３回繰り返した。全てのデータに関しては、図７参照。
【００４６】
【表１】
【００４７】
２．健康な人及び癌患者の血清試料でのＡＲＳ活性の平均
【００４８】
【表２】
【００４９】
Ｔ−試験を健康な人の血清（全部で１５試料）及び癌患者からの血清（全部で１３試料）で完了して、ｐ＝０．００５４１５＜０．０１を得た。
【００５０】
３．実験データに対応する感度−特異性相関に関しては、図２参照のこと。
【００５１】
４．標準の決定：
感度−特異性の相関にしたがって、標準として比較的高い感度及び特異性でのカットオフ値を選択した。
【００５２】
５．健康な人（５４例）及び癌患者（肺癌１２例、胃癌１０例、結腸直腸癌１３例、食道癌９例、腎臓癌５例及び乳癌５例）からの各尿試料でのＡＲＳ活性の測定を３回繰り返した。全てのデータに関しては、図１０参照。
【００５３】
図が示しているように、癌患者からの尿試料でのアリールスルファターゼの活性は、健康な人の尿試料よりも劇的に高く、このことは、尿ＡＲＳ活性が、健康なサンプルから腫瘍を見分けるためのマーカーとして使用することができることを示している。
【００５４】
６．癌患者（食道癌５７例、胃癌８３例、結腸直腸癌７９例、腎臓癌５１例、膀胱６３例、肺癌２１１例、肝臓癌７６例、乳癌１０７例、卵巣癌９１例、造血性腫瘍２８例）からの尿試料でのアリールスルファターゼの活性を検査した。様々な種類の癌での感度（真の陽性例／（真の陽性例＋偽の陽性例））を図１１に示す。
【００５５】
検査された様々な種類の癌患者からの多くの尿試料で、アリールスルファターゼ活性の平均感度は８０％以上であり、このことは、尿試料でのＡＲＳ活性の異常な上昇が癌患者に共通していることを示している。
【００５６】
７．健康な人（２９例）及び治療後の癌患者（肺癌７例、食道癌９例、肝臓癌９例、腎臓癌２例、卵巣癌３例、下咽頭癌１例及び造血腫瘍２例）からの各尿試料でのＡＲＳ活性の測定を３回繰り返した。全てのデータに関しては、図１２参照。
【００５７】
治療処置後の癌患者では、尿ＡＲＳ活性が、健康な対照の尿ＡＲＳ活性に近いレベルまで劇的に低下したことが観察された（図１２）。したがって、尿試料でのＡＲＳ活性レベルの変化を、癌患者で治療効果を監視するために使用することができる。治療が有効であれば、ＡＲＳ活性値が、治療前よりも健康な人のレベル近くまで低下するはずである。また、尿試料でのＡＲＳ活性レベルの変化を、治療後の患者での癌再発を監視するために使用することもできる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−メチルウンベリフェロンスルフェート及び４−メチルウンベリフェロンを含む、アリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性を検査するためのキット。
【請求項２】
癌又は他の疾患の検出並びに初期スクリーニング、治療効果の監視及び再発検査のために使用される、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記癌が、肺癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、食道癌、腸癌、鼻咽頭癌、腎臓癌、膀胱癌、リンパ癌、胆嚢癌、膨大部癌、陰茎癌、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、前立腺癌、子宮癌、結腸直腸癌、胆管癌、柔組織肉腫、精原細胞腫瘍、ユーイング肉腫、白血病、骨肉腫、脳腫瘍又は悪性リンパ腫である、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記癌が、肺癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、食道癌、腎臓癌、膀胱癌、リンパ癌、結腸直腸癌、白血病又は悪性リンパ腫である、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
使用される生物学的試料が、ヒト全血、血清、尿、唾液、痰、リンパ液又は他の組織液である、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
使用される前記生物学的試料が、ヒト血清である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
使用される前記生物学的試料が、ヒト尿である、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
前記４−メチルウンベリフェロンスルフェートが、０．１〜１００ｍＭの範囲内である、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
前記４−メチルウンベリフェロンスルフェートが、１〜１０ｍＭの範囲内である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記４−メチルウンベリフェロンスルフェートが、８ｍＭである、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記４−メチルウンベリフェロンが、１〜１００００ｎＭの範囲内である、請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
前記４−メチルウンベリフェロンが、１００〜５０００ｎＭの範囲内である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記４−メチルウンベリフェロンが、１００〜２０００ｎＭの範囲内である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
緩衝液及び停止液を包含する、請求項６に記載のキット。
【請求項１５】
緩衝液、沈殿剤及び停止液を包含する、請求項７に記載のキット。
【請求項１６】
前記緩衝液が酢酸ナトリウムである、請求項１４又は１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記酢酸ナトリウムが１〜１００００ｍＭの範囲内であり、ｐＨ値が１〜１４の範囲内である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記酢酸ナトリウムが１０〜１０００ｍＭの範囲内であり、前記ｐＨ値が２〜７の範囲内である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記酢酸ナトリウムが１００ｍＭであり、前記ｐＨ値が５．４である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記停止液が、炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム／グリシン溶液である、請求項１４又は１５に記載のキット。
【請求項２１】
前記炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム／グリシン溶液が、１〜５００００ｍＭの範囲内であり、ｐＨ値が１〜１４の範囲内である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム／グリシン溶液が、１０〜５０００ｍＭの範囲内であり、前記ｐＨ値が７〜１２の範囲内である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム／グリシン溶液が、５００ｍＭであり、前記ｐＨ値が１０．７である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記沈殿剤が、酢酸鉛である、請求項１５に記載のキット。
【請求項２５】
前記酢酸鉛が、１％〜９０％（ｗ／ｖ）の範囲内である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記酢酸鉛が、１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲内である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記酢酸鉛が、３０％（ｗ／ｖ）である、請求項２５に記載のキット。
【請求項１】
４−メチルウンベリフェロンスルフェート及び４−メチルウンベリフェロンを含む、アリールスルファターゼ又はそのアイソザイムの活性を検査するためのキット。
【請求項２】
癌又は他の疾患の検出並びに初期スクリーニング、治療効果の監視及び再発検査のために使用される、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記癌が、肺癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、食道癌、腸癌、鼻咽頭癌、腎臓癌、膀胱癌、リンパ癌、胆嚢癌、膨大部癌、陰茎癌、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、前立腺癌、子宮癌、結腸直腸癌、胆管癌、柔組織肉腫、精原細胞腫瘍、ユーイング肉腫、白血病、骨肉腫、脳腫瘍又は悪性リンパ腫である、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記癌が、肺癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、食道癌、腎臓癌、膀胱癌、リンパ癌、結腸直腸癌、白血病又は悪性リンパ腫である、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
使用される生物学的試料が、ヒト全血、血清、尿、唾液、痰、リンパ液又は他の組織液である、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
使用される前記生物学的試料が、ヒト血清である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
使用される前記生物学的試料が、ヒト尿である、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
前記４−メチルウンベリフェロンスルフェートが、０．１〜１００ｍＭの範囲内である、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
前記４−メチルウンベリフェロンスルフェートが、１〜１０ｍＭの範囲内である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記４−メチルウンベリフェロンスルフェートが、８ｍＭである、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記４−メチルウンベリフェロンが、１〜１００００ｎＭの範囲内である、請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
前記４−メチルウンベリフェロンが、１００〜５０００ｎＭの範囲内である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記４−メチルウンベリフェロンが、１００〜２０００ｎＭの範囲内である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
緩衝液及び停止液を包含する、請求項６に記載のキット。
【請求項１５】
緩衝液、沈殿剤及び停止液を包含する、請求項７に記載のキット。
【請求項１６】
前記緩衝液が酢酸ナトリウムである、請求項１４又は１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記酢酸ナトリウムが１〜１００００ｍＭの範囲内であり、ｐＨ値が１〜１４の範囲内である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記酢酸ナトリウムが１０〜１０００ｍＭの範囲内であり、前記ｐＨ値が２〜７の範囲内である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記酢酸ナトリウムが１００ｍＭであり、前記ｐＨ値が５．４である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記停止液が、炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム／グリシン溶液である、請求項１４又は１５に記載のキット。
【請求項２１】
前記炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム／グリシン溶液が、１〜５００００ｍＭの範囲内であり、ｐＨ値が１〜１４の範囲内である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム／グリシン溶液が、１０〜５０００ｍＭの範囲内であり、前記ｐＨ値が７〜１２の範囲内である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム／グリシン溶液が、５００ｍＭであり、前記ｐＨ値が１０．７である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記沈殿剤が、酢酸鉛である、請求項１５に記載のキット。
【請求項２５】
前記酢酸鉛が、１％〜９０％（ｗ／ｖ）の範囲内である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記酢酸鉛が、１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲内である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記酢酸鉛が、３０％（ｗ／ｖ）である、請求項２５に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１１−５０９０６９（Ｐ２０１１−５０９０６９Ａ）
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３６５９１（Ｐ２００９−５３６５９１）
【出願日】平成２０年１月１１日（２００８．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００００８１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６７７７７
【国際公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【出願人】（５０９１３５３８２）北京雅康博生物科技有限公司 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１１日（２００８．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００００８１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６７７７７
【国際公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【出願人】（５０９１３５３８２）北京雅康博生物科技有限公司 (2)
【Ｆターム（参考）】
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